ES2350320T3 - Fitasa de debaryomyces castellii. - Google Patents
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Abstract
Polipéptido, caracterizado porque comprende un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos siguientes: - el polipéptido de la SEC ID nº 2, - un fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2 que tiene una actividad fitasa, - un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que presenta por lo menos 90% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2.
Description
Fitasa de Debaryomyces castellii.
La presente invención se refiere a una fitasa de
Debaryomyces castellii, al gen que codifica esta fitasa, a
unos organismos hospedantes recombinantes que expresan esta fitasa,
así como a sus aplicaciones en el campo de la nutrición animal en
particular.
Las sales del ácido fítico
(myo-inositol hexakis fosfato) o fitatos
(myo-inositol hexakis(dihidrógeno fosfato)
son la forma principal de almacenamiento del fósforo en los
cereales, las plantas leguminosas y oleaginosas. Constituyen así la
fuente principal de fósforo en los alimentos para animales a base de
plantas, componentes principales de los regímenes de los animales
monogástricos (aves de corral y cerdos). Sin embargo, la
biodisponibilidad de este fósforo en los alimentos está limitada
para estos animales. En efecto, éstos no poseen las enzimas
intestinales que degradan los fitatos en cantidad suficiente para
permitir la hidrólisis de los fitatos y suministrar así las
cantidades de fosfato inorgánico que les son necesarias. En el
contexto de la nutrición animal, dos características del ácido
fítico desempeñan una función importante: (1) los animales
monogástricos son poco capaces de degradar el ácido fítico en el
aparato digestivo; (2) el ácido fítico es un factor
anti-nutricional, que forma unos complejos con las
proteínas y los iones (Fe^{3+}, Ca^{2+}, Zn^{2+}, Mg^{2+}) y
disminuye por lo tanto la disponibilidad de estos elementos.
Las raciones alimenticias de las aves de corral
y de los cerdos deben por lo tanto ser suplementadas con fosfato
inorgánico mientras que el fósforo de los fitatos es excretado y
contribuye a la eutrofización de las aguas de superficie en las
zonas de cría intensiva de animales monogástricos.
La complementación de las raciones de los
animales monogástricos mediante unas enzimas es una solución
utilizada actualmente para mejorar la biodisponibilidad del fósforo
unido al fitato y para disminuir la suplementación de los alimentos
con fósforo inorgánico y reducir así la excreción de fósforo en las
zonas de cría intensiva.
Las fitasas (myo-inositol
hexakis fosfato 3- y 6-fosfohidrolasas EC 3.1.3.8 y
3.1.3.26) forman parte de la familia de las histidinas fosfatasas
ácidas. Éstas catalizan la hidrólisis del myo-inositol
hexakisfosfato (ácido fítico, InsP_{6}) en monofosfato inorgánico
y en myo-inositol fosfato de grado de fosforilación inferior
(InsP_{5} a InsP_{1}) y en myo-inositol libre en algunos
casos.
Estas enzimas utilizadas como aditivo en la
alimentación animal, permiten por un lado aumentar la disponibilidad
del fósforo fítico y, por otro lado, mejorar la digestibilidad de
los alimentos. Además, la liberación de fosfato fítico disminuye
considerablemente los costes debidos a la suplementación con
fosfato, así como la contaminación provocada por un exceso de
fosfatos excretados.
Las fitasas son producidas por una gran variedad
de organismos: plantas, animales y sobre todo microorganismos.
Entre los microorganismos productores de fitasas se citarán en
particular: Los hongos de los géneros Aspergillus,
Penicillium, Mucoret Rhizopus, las bacterias:
Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Escherichia
coli, Enterobacter sp., Bacillus subtilis, y
levaduras: Saccharomyces cerevisiae, Candida
tropicalis, Torulopsis candida, Debaryomyces
castellii, Debaryomyces occidentalis, Kluyveromyces
fragilis y Schwanniomyces castellii.
En lo que se refiere a las levaduras, Lambrechts
et al. (Biotechnology Letters, Vol. 14, nº 1,
61-66, 1992) han identificado diferentes cepas que
tienen una actividad fitasa pero no han caracterizado las fitasas
correspondientes. La actividad más elevada ha sido medida para la
cepa CBS2863 de Schwanniomyces castellii. Unas actividades
fitasas han sido observadas asimismo para Candida brumptii
CBS 6145, C. tropicalis CBS5696, Debaryomyces
castellii CBS 2923, Kluyveromyces fragilis nº 111, K.
fragilis CBS 1555, K. fragilis CBS5795, Saccharomyces
cerevisiae CBS 1253, Schwanniomyces castellii CBS 2863,
Torulopsis candida CBS 940, C. melibiosica CBS 584,
K. lactis CBS 2359, T. bovina CBS 2760 y
Zygosaccharomyces fennentati CBS6772.
Asimismo, Nakamura Yoshihiro et al.
(Biosci. Biotechnol. Biochem., Vol. 64, nº 4,
841-844, 2000) han identificado diferentes fitasas,
pero no las han caracterizado.
Se debe observar además que la clasificación de
las levaduras ha sido revisada. Según la nueva clasificación
(Nakase T., Suzuki M., Phaff H. J. y Kurtzman C.P., 1998
p157-167 en C. P. Kurtzman y J.W. Fell (ed.), The
Yeasts, A taxonomic study, 4ª Ed. Elsevier Sci. Publication
Amsterdam), la cepa CBS 2923 corresponde a Debaryomyces
castellii Capriotti y la cepa CBS 2863 corresponde a
Debaryomyces occidentalis Klocker var. occidentalis,
sinónimos Schwanniomyces castellii Capriotti y
Schwanniomyces occidentalis Kloker. Los inventores han
demostrado que la alineación del polipéptido de la SEC ID nº 2, es
decir, la secuencia de la fitasa de Debaryomyces castellii
CBS 2923, conduce a un porcentaje de identidad de 69,2% con la
secuencia de la fitasa de Schwanniomyces occidentalis CBS
2863.
Numerosas fitasas de microorganismos han sido ya
estudiadas y utilizadas en diversas aplicaciones
agro-industriales. Sin embargo, la utilización
creciente de fitasas como aditivo en numerosas aplicaciones
bio-tecnológicas, tal como la alimentación animal
aumenta el interés: (1) de aislar nuevos microorganismos productores
eficaces de fitasas, (2) de obtener unas fitasas competentes, es
decir, que presentan una eficacia para liberar unos fosfatos del
alimento en el tracto digestivo, una estabilidad al calor durante el
proceso de fabricación del alimento y durante el almacenamiento, y
un bajo coste de producción.
Además, la mayoría de las fitasas descritas en
la actualidad hidrolizan sólo parcialmente el ácido fítico y
algunas con unas cinéticas muy lentas. Además, su actividad de
hidrólisis depende en gran medida de sus condiciones de
utilización.
En la actualidad, entre las levaduras, sólo la
fitasa de la levadura Schwanniomyces occidentalis ha sido
descrita como hidrolizante de todos los grupos fosfato del fitato
(EP 0 699 762 y Segueilha L., Lambrechts C., Boze H., Moulin G.,
Galzy P., (1992) Purification and properties of a phytase from
Schwanniomyces Castelli, J. Ferm. Bioeng., 74,
7-11). Sin embargo, la fitasa de Schwanniomyces
occidentalis es sensible a los cationes (ZnCl_{2} y
CuCl_{2} en particular) lo cual no es favorable para una
utilización en la alimentación animal puesto que estos cationes
están presentes en el bolo alimenticio (Segueilha et al.,
1992). Además, esta enzima es activa en una gama de pH de 2,7 a 5
(EP 0 699 762) y el pCMB inhibe en gran medida la actividad de la
fitasa de Schwanniomyces occidentalis, lo cual sugiere que
unos grupos SH (puentes disulfuros) están implicados en el sitio
activo de la enzima (Segueilha et al., 1992). Además, la
biosíntesis de esta fitasa necesita la presencia de fitatos y de
sales de calcio (EP 0 699 762). La actividad de esta enzima depende
por lo tanto en gran medida del entorno en el que se encuentra. El
problema que se propone resolver la presente invención consiste en
proponer una fitasa que hidroliza todos los grupos fosfato del
fitato y cuya actividad depende poco de las condiciones de
utilización de la enzima.
Este inconveniente se resuelve mediante la
fitasa de la SEC ID nº 2. De manera ventajosa, esta fitasa es capaz
de hidrolizar la totalidad de los grupos fosfato del fitato hasta la
liberación del myo-inositol. Posee asimismo un
amplio espectro de actividad e hidroliza así numerosos sustratos. De
manera ventajosa, la biosíntesis de esta fitasa está inducida por
los fitatos, incluso en ausencia de sales de calcio. Ventajosamente,
esta fitasa es activa en un intervalo de pH amplio (pH 3 a 6,5) y
no es sensible a los cationes o al pCMB. La enzima es asimismo
termoestable hasta 66ºC. La enzima de la presente invención es por
lo tanto extremadamente robusta, lo cual es favorable para una
utilización en alimentación animal pero también en otras
aplicaciones industriales.
La invención se refiere asimismo a unas fitasas
similares u homólogas, a unas variantes y a unos fragmentos de la
fitasa de la SEC ID nº 2 que conservan las mismas propiedades.
- SEC ID nº 1:
- Secuencia genómica del gen de la fitasa de Debaryomyces castellii CBS 2923.
- SEC ID nº 2:
- Secuencia de la fitasa de Debaryomyces castellii CBS 2923.
- SEC ID nº 3:
- Secuencia de consenso de las fosfatasas ácidas.
- SEC ID nº 4:
- Motivo de la fitasa de Debaryomyces castellii que corresponde a la secuencia de consenso de las fosfatasas ácidas de la SEC ID nº 3.
- SEC ID n^{os} 5-16:
- Cebadores para clonación.
- SEC ID n^{os} 17-18:
- Péptidos de la fitasa de Debaryomyces castellii utilizados para la clonación del gen.
La invención tiene por objeto unos polipéptidos
que comprenden un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos
siguientes:
- -
- el polipéptido de la SEC ID nº 2
- -
- un fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2 que tiene una actividad fitasa,
- -
- un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que presenta por lo menos 90% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención tiene asimismo por objeto unos
polinucleótidos que codifican para una actividad fitasa
seleccionados de entre los polinucleótidos siguientes:
- -
- el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEC ID nº 1,
- -
- un polinucleótido que codifica para un polipéptido según la reivindicación 1.
\newpage
La invención se refiere asimismo a los
polinucleótidos que tienen la secuencia de la SEC ID nº 1 o la
secuencia complementaria a la SEC ID nº 1.
La invención se refiere asimismo a unos casetes
de expresión que comprenden en el sentido de la transcripción:
- -
- un promotor funcional en un organismo hospedante;
- -
- un polinucleótido según la invención; y
- -
- una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedante.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere asimismo a unos vectores
que comprenden un polinucleótido según la invención y/o un casete
de expresión según la invención.
Otro objetivo de la presente invención consiste
en un organismo hospedante transformado con un polinucleótido según
la invención, un casete de expresión según la invención y/o un
vector según la invención.
El organismo hospedante es Pichia
pastoris.
La invención tiene por objeto unos aditivos
nutricionales para animales que comprenden un polipéptido según la
invención.
La invención tiene asimismo por objeto unos
aditivos nutricionales para animales que comprenden un organismo
hospedante según la invención y/o un mosto de fermentación de un
organismo hospedante según la invención.
En un modo de realización de la invención, el
aditivo nutricional para animales se presenta en forma líquida o en
forma de polvo.
La invención se refiere a los alimentos para
animales que comprenden una base nutricional para animales y un
aditivo nutricional para animales según la invención.
La invención se refiere asimismo a unos
alimentos para animales que comprenden un polipéptido según la
invención, un organismo hospedante según la invención y/o un mosto
de fermentación de un organismo hospedante según la invención.
La invención se refiere asimismo a la
utilización de un polipéptido según la invención o de un organismo
hospedante según la invención para la fabricación de un aditivo
nutricional para animales o de un alimento para animales.
Otro objeto de la presente invención es la
utilización de un polipéptido según la invención o de un organismo
hospedante según la invención para la hidrólisis del
myo-inositol hexakisfosfato en monofosfato
inorgánico, en myo-inositol de grado de
fosforilación inferior y en myo-inositol libre.
La presente invención se refiere por lo tanto a
unos polipéptidos que tienen una actividad fitasa. Preferentemente,
estos polipéptidos son aislados de Debaryomyces
castellii.
La fitasa de Debaryomyces castellii CBS
2923 se representa en la SEC ID nº 2.
Por el término "fitasa" se entienden las
myo-inositol hexakis fosfato 3- y
6-fosfohidrolasas (EC 3.1.3.8 y 3.1.3.26). Estas
enzimas catalizan la hidrólisis del
myo-inositolhexakisfosfato (ácido fítico,
InsP_{6}) en monofosfato inorgánico y en
myo-inositolfosfato de grado inferior (InsP_{5} a
InsP_{1}) y en myo-inositol libre para algunas
fitasas.
La fitasa de Debaryomyces castellii de la
SEC ID nº 2 es una 3-fitasa. Además, posee la
capacidad destacable de hidrolizar la totalidad de los enlaces
fosfato del ácido fítico.
La fitasa de la SEC ID nº 2 comprende el motivo
RHGERYP (SEC ID nº 4) que corresponde a la secuencia de consenso
RHGXRXP (SEC ID nº 3) presente en el sitio activo de numerosas
fosfatasas ácidas. Este motivo se vuelve a encontrar en los
aminoácidos 72-78 de la SEC ID nº 2. La fitasa de la
SEC ID nº 2 posee asimismo el motivo HD presente en numerosas
fitasas. Este motivo se vuelve a encontrar en la parte
C-terminal en los aminoácidos
335-336 de la SEC ID nº 2.
En un modo de realización preferido de la
invención, los polipéptidos según la invención poseen el motivo
RHGERYP u otro motivo que corresponde a la secuencia de consenso
RHGXRXP. Preferentemente, los polipéptidos según la invención
poseen asimismo un motivo HD.
\newpage
En un modo de realización preferido, los
polipéptidos según la invención están glicosilados. El polipéptido
de la SEC ID nº 2 posee en particular unos sitios putativos de
N-glicosilación a los aminoácidos Asn 97, Asn 158,
Asn 189, Asn 249, Asn 303, Asn 314, Asn 387, Asn 439 y Asn 453; y
unos sitios putativos de O-glicosilación a los
aminoácidos Thr 165, Ser 168, Thr 360 y Ser 364. En un modo de
realización preferido, el polipéptido de la SEC ID nº 2 está
glicosilado a uno o varios de estos sitios putativos de
N-glicosilación y de
O-glicosilación. En un modo de realización, los
polipéptidos según la invención están glicosilados.
La fitasa de la SEC ID nº 2 presenta asimismo 8
cisteínas susceptibles de formar 4 puentes disulfuros: Cys 62, Cys
214, Cys 262, Cys 275, Cys 385, Cys 405, Cys 413 y Cys 435. En un
modo de realización, los polipéptidos según la invención contienen
por lo menos un puente disulfuro.
La fitasa de Debaryomyces castellii es
una enzima segregada por esta levadura en su entorno
extracelular.
Para la expresión y la secreción mediante un
organismo hospedante recombinante, la fitasa de la SEC ID nº 2
puede ser fusionada en su extremo N-terminal con un
péptido señal reconocido por este organismo hospedante.
La invención se refiere asimismo a unos
fragmentos del polipéptido de la SEC ID nº 2 que conservan una
actividad fitasa.
El término "fragmento" de un polipéptido
designa un polipéptido que comprende una parte pero no la totalidad
del polipéptido del que se deriva. La invención se refiere asimismo
a un polipéptido que comprende un fragmento de por lo menos 100,
200, 300 ó 400 aminoácidos del polipéptido de la SEC ID nº 2.
Este fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2
conserva su actividad fitasa. La invención se refiere por lo tanto
a los fragmentos biológicamente activos del polipéptido de la SEC ID
nº 2.
La expresión "fragmento biológicamente
activo" designa un fragmento de un polipéptido que conserva la
función del polipéptido del que se deriva. Los fragmentos
biológicamente activos del polipéptido de la SEC ID nº 2 conservan
así las propiedades catalíticas de la fitasa de Debaryomyces
castellii de la SEC ID nº 2. Los métodos de preparación de
fragmentos de un polipéptido así como las técnicas de medición de la
actividad fitasa son bien conocidos por el experto en la
materia.
La invención tiene por objeto unos polipéptidos
que tienen una actividad fitasa y que presentan por lo menos 90% de
identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2. La invención tiene
asimismo por objeto unos polipéptidos que presentan por lo menos
80%, 90%, 95%, 98% y preferentemente por lo menos 99% de aminoácidos
idénticos con el polipéptido de la SEC ID nº 2.
Preferentemente, estos polipéptidos tienen las
mismas propiedades y en particular las mismas propiedades
catalíticas que los polipéptidos de la SEC ID nº 2.
Preferentemente, estos polipéptidos están aislados de otras cepas
de Debaryomyces castellii o de otras levaduras.
Alternativamente, estos polipéptidos se pueden obtener mediante
unas técnicas de mutagénesis dirigida por ejemplo.
Mediante la expresión "aminoácidos
idénticos" se entienden unos aminoácidos invariables entre dos
secuencias. Estos polipéptidos pueden presentar una deleción, una
adición o una sustitución de por lo menos un aminoácido con
respecto al polipéptido de la SEC ID nº 2.
La invención tiene asimismo por objeto unos
polipéptidos que presentan por lo menos 90%, 95%, 98% y
preferentemente por lo menos 99% de similitud con el polipéptido de
la SEC ID nº 2. Preferentemente, estos polipéptidos tienen las
mismas propiedades y en particular las mismas propiedades
catalíticas que los polipéptidos de la SEC ID nº 2.
Preferentemente, estos polipéptidos están aislados de otras cepas de
Debaryomyces castellii o de otras levaduras.
Alternativamente, estos polipéptidos se pueden obtener mediante unas
técnicas de mutagénesis dirigida por ejemplo.
Por el término "similitud" se entiende la
medición del parecido entre secuencias proteicas o nucleicas. Estos
polipéptidos pueden presentar una deleción, una adición o una
sustitución de por lo menos un aminoácido con respecto al
polipéptido de la SEC ID nº 2. El grado de similitud entre dos
secuencias, cuantificado por una puntuación, se basa en el
porcentaje de identidades y/o de sustitución conservadoras de las
secuencias.
Los métodos de medición y de identificación del
grado de identidad y del grado de similitud entre polipéptidos son
conocidos por el experto en la materia. Se puede utilizar, por
ejemplo, Vector NTi 9.1.0, el programa de alineación AlignX
(Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX,
http://www.invitrogen.com). Preferentemente, se utilizan los
parámetros por defecto.
Los polipéptidos según la invención están
aislados o purificados de su entorno natural. Los polipéptidos se
pueden preparar por medio de diferentes procedimientos. Estos
procedimientos son en particular la purificación a partir de
fuentes naturales tales como unas células que expresan naturalmente
estos polipéptidos, la producción de polipéptidos recombinantes por
unas células hospedantes apropiadas y su purificación ulterior, la
producción mediante síntesis química o, por último, una combinación
de estos diferentes enfoques. Estos diferentes procedimientos de
producción son bien conocidos por el experto en la materia. Así, las
fitasas de la presente invención se pueden aislar a partir de
Debaryomyces Castelli. En otro modo de realización, las
fitasas de la presente invención son aisladas a partir de
organismos hospedantes recombinantes que expresan una fitasa según
la invención.
La invención tiene asimismo por objeto unas
proteínas de fusión, unas proteínas recombinantes o unas proteínas
quiméricas que comprenden los polipéptidos según la invención. El
término "polipéptido" designa asimismo unas proteínas así como
unos polipéptidos modificados.
Los polipéptidos según la presente invención
tienen una actividad fitasa. Preferentemente, los polipéptidos
presentan una actividad 3-fitasa y poseen la
capacidad de hidrolizar la totalidad de los enlaces fosfato del
ácido fítico.
La invención se refiere asimismo a unos
polinucleótidos que codifican para una fitasa según la invención.
Preferentemente, estos polinucleótidos codifican la fitasa de la SEC
ID nº 2 de Debaryomyces Castelli.
Según la presente invención, por el término
"polinucleótido" se entiende una cadena nucleotídica
monocatenaria o su complementaria o una cadena nucleotídica
bicatenaria que puede ser de tipo ADN o ARN. Preferentemente, los
polinucleótidos de la invención son de tipo ADN, en particular de
ADN bicatenario. El término "polinucleótido" designa asimismo
los polinucleótidos modificados.
Los polinucleótidos de la presente invención
están aislados o purificados de su entorno natural. Preferentemente,
los polinucleótidos de la presente invención se pueden preparar
mediante las técnicas habituales de biología molecular tales como
las descritas por Sambrook et al. (Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 1989) o mediante síntesis química.
En un primer modo de realización, la invención
se refiere al polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre
la posición 1538 y la posición 2923 de la SEC ID nº 1. Este
polinucleótido codifica la fitasa de la SEC ID nº 2 de
Debaryomyces Castelli.
Mediante la expresión "nucleótidos
idénticos" se entienden unos nucleótidos invariables entre dos
secuencias. Estos polinucleótidos pueden presentar una deleción,
una adición o una sustitución de por lo menos un nucleótido con
respecto al polinucleótido de referencia.
Por el término "similitud" se entiende la
medición del parecido entre secuencias proteicas o nucleicas. Estos
polinucleótidos pueden presentar una deleción, una adición o una
sustitución de por lo menos un nucleótido con respecto al
polinucleótido de referencia. El grado de similitud entre dos
secuencias, cuantificado mediante una puntuación, se basa en el
porcentaje de identidades y/o de sustitución conservadoras de las
secuencias.
Los métodos de medición y de identificación del
grado de identidad y del grado de similitud entre las secuencias de
ácidos nucleicos son bien conocidos por el experto en la materia. Se
puede utilizar, por ejemplo, Vector NTi Vector NTi 9.1.0, el
programa de alineación AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen
INFORMAX, http://www.invitrogen.com). Preferentemente, se utilizan
los parámetros por defecto.
Preferentemente, los polinucleótidos que
presentan un grado de identidad o un grado de similitud con un
polinucleótido de referencia conservan la función de la secuencia
de referencia. En el presente caso, los polinucleótidos codifican
para una actividad fitasa.
Mediante la expresión "secuencia capaz de
hibridarse de manera selectiva" se entiende, según la invención,
las secuencias que se hibridan con la secuencia de referencia a un
nivel superior al ruido de fondo de manera significativa. El nivel
de la señal generada por la interacción entre la secuencia capaz de
hibridarse de manera selectiva y las secuencias de referencia es
generalmente 10 veces, preferentemente 100 veces más intenso que el
de la interacción de otras secuencias de ADN que generan el ruido de
fondo. Las condiciones de hibridación astringentes que permiten una
hibridación selectiva son bien conocidas por el experto en la
materia. Generalmente, la temperatura de hibridación y de lavado es
inferior por lo menos 5ºC al Tm de la secuencia de referencia a un
pH dado y para una fuerza iónica dada. Típicamente, la temperatura
de hibridación es de por lo menos 30ºC para un polinucleótido de 15
a 50 nucleótidos y de por lo menos 60ºC para un polinucleótido de
más de 50 nucleótidos. A título de ejemplo, la hibridación se
realiza en el tampón siguiente: 6X SSC, 50 mM de
Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 0,02% de PVP,
0,02% de Ficoll, 0,02% de BSA, 500 \mug/ml de esperma de salmón
desnaturalizado DNA. Los lavados se realizan, por ejemplo,
sucesivamente a baja astringencia en un tampón 2X de SSC, 0,1% de
SDS, a media astringencia en un tampón 0,5X de SSC, 0,1% de SDS, y a
fuerte astringencia en un tampón 0,1X de SSC, 0,1% de SDS. La
hibridación se puede llevar a cabo evidentemente según otros métodos
habituales bien conocidos por el experto en la materia (véase en
particular Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 1989).
La invención se refiere de manera general a los
polinucleótidos que codifican para los polipéptidos según la
invención. Debido a la degenerescencia del código genético,
diferentes polinucleótidos pueden codificar para un mismo
polipéptido.
\newpage
Otro objeto de la presente invención es un
polinucleótido cuya secuencia se representa en la SEC ID nº 1. El
polinucleótido de la SEC ID nº 1 comprende unas secuencias que
flanquean el marco abierto de lectura (ORF) del gen de la fitasa de
Debaryomyces Castelli. Se trata en particular de las
secuencias promotoras y terminadoras de este gen. Este gen puede
ser expresado a partir de sus secuencias reguladoras homólogas en
particular para una sobreexpresión en Debaryomyces Castellii
o en otras levaduras.
En otro modo de realización, este gen puede ser
expresado en diferentes organismos hospedantes tales como las
bacterias, las levaduras y los hongos por ejemplo. El gen que
codifica la fitasa de la SEC ID nº 2 puede ser expresado en un
organismo hospedante bajo el control del promotor de la SEC ID nº 1
de la presente invención o bajo el control de un promotor
heterólogo.
Según un modo de realización de la invención, un
polinucleótido que codifica para un polipéptido según la invención
se inserta en un casete de expresión utilizando unas técnicas de
clonación bien conocidas por el experto en la materia. Este casete
de expresión comprende los elementos necesarios para la
transcripción y para la traducción de las secuencias que codifican
para los polipéptidos según la invención.
Ventajosamente, este casete de expresión
comprende al mismo tiempo unos elementos que permiten hacer producir
un polipéptido por una célula hospedante y unos elementos
necesarios para la regulación de esta expresión.
Estos casetes de expresión comprenden en el
sentido de la transcripción:
- -
- un promotor funcional en un organismo hospedante;
- -
- un polinucleótido según la invención; y
- -
- una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se puede utilizar cualquier tipo de secuencia
promotora en los casetes de expresión según la invención. La
elección del promotor dependerá en particular del organismo
hospedante seleccionado para la expresión del gen de interés.
Algunos promotores permiten una expresión constitutiva mientras que
otros promotores son, por el contrario inducibles. Entre los
promotores funcionales en los hongos, se citará en particular el de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (Roberts et
al., Current Genet. 15:177-180, 1989). Entre
los promotores funcionales en las bacterias, se citará en particular
el de la ARN polimerasa del bacteriófago T7 (Studier et al.,
Methods in enzymology 185:60-89, 1990). Entre los
promotores funcionales en las levaduras, se citará en particular el
del gen Gal1 (Elledge et al., Proc Natl Acad Sciences, USA.
88:1731-1735, 1991) o los promotores GAL4 y ADH de
S. cerevisiae. Todos estos promotores están descritos en la
bibliografía y son bien conocidos por el experto en la materia.
Para la expresión en Penicillium
funiculosum, se seleccionarán por ejemplo unos casetes de
expresión que comprenden un promotor histona Ha.B, un promotor
ácido aspartilo proteasa o un promotor csl13 (WO 00/68401).
Para la expresión en la levadura Pichia
pastoris, se seleccionarán por ejemplo unos casetes de expresión
que comprenden el promotor AOX1 inducible por el metanol (Tschopp,
J. F., Sverlow, G., Kosson, R., Craig, W. y Grinna, L. (1987)
High-level secretion of glycosylated invertase in
the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Biotechnology 5,
1305-1308) o el promotor constitutivo fuerte GAP
(Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V. y Cregg,
J. M. (1997) Isolation of the Pichia pastoris
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene 186,
37-44).
Para la expresión en Schizosaccharomyces
pombe, se seleccionarán por ejemplo unos casetes de expresión
que comprenden el promotor de regulación Nmt1 reprimido por
la tiamina y activado en ausencia de tiamina (Maundrell, K., (1989)
Nmt1 of fission yeast. A highly transcribed gene completely
repressed by thiamine. J. Biol. Chem. 265,
10857-10864.)
Los casetes de expresión, según la presente
invención, pueden incluir además cualquier otra secuencia necesaria
para la expresión de los polipéptidos o de los polinucleótidos tales
como por ejemplo unos elementos de regulación o unas secuencias
señal que permiten la secreción de los polipéptidos producidos por
el organismo hospedante. Se puede utilizar en particular cualquier
secuencia de regulación que permite aumentar el nivel de expresión
de la secuencia codificante insertada en el casete de expresión.
Según la invención, se pueden utilizar en particular, en asociación
con la secuencia de regulación promotora, otras secuencias de
regulación, que están situadas entre el promotor y la secuencia
codificante, tales como unos activadores de transcripción
("enhancer").
Además, los casetes de expresión, según la
presente invención, pueden incluir cualquier otra secuencia
necesaria para la secreción de los polipéptidos producidos por el
organismo hospedante tales como unas secuencias señal. Para la
secreción por Pichia pastoris, se puede utilizar por ejemplo
la secuencia del factor \alpha como señal de secreción.
\newpage
Se puede utilizar una gran variedad de
secuencias terminadoras en los casetes de expresión según la
invención, permitiendo estas secuencias la terminación de la
transcripción y la poliadenilación del ARNm. Se puede utilizar
cualquier secuencia terminadora funcional en el organismo hospedante
seleccionado.
Para la expresión en Penicillium
funiculosum, se seleccionarán por ejemplo unos casetes de
expresión que comprenden un terminador histona H4.B, un terminador
ácido aspartilo proteasa o un terminador csl13 (WO 00/68401).
La presente invención tiene asimismo por objeto
un polinucleótido que comprende un casete de expresión según la
invención, estando ventajosamente los casetes de expresión según la
invención insertados en un vector.
La presente invención se refiere por lo tanto
asimismo a unos vectores de replicación o de expresión para la
transformación de un organismo hospedante que comprende por lo menos
un polinucleótido o un casete de expresión según la presente
invención. Este vector puede estar constituido en particular por un
plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus en el que se
inserta un polinucleótido o un casete de expresión según la
invención. Las técnicas de construcción de estos vectores y de
inserción de un polinucleótido de la invención en estos vectores
son bien conocidas por el experto en la materia. De manera general,
se puede utilizar cualquier vector capaz de mantenerse, de
autoreplicarse o de propagarse en una célula hospedante y en
particular con el fin de inducir la expresión de un polinucleótido
o de un polipéptido. El experto en la materia seleccionará los
vectores apropiados en particular en función del organismo
hospedante a transformar y en función de la técnica de
transformación utilizada.
Los vectores de la presente invención se
utilizan en particular para transformar un organismo hospedante con
vistas a la replicación del vector y/o a la expresión de un
polipéptido según la invención en el organismo hospedante.
La invención se refiere asimismo a un método
para preparar un polipéptido según la invención que comprende las
etapas siguientes:
- -
- transformar un organismo hospedante con un vector de expresión que comprende un casete de expresión según la invención y/o con un polinucleótido según la invención,
- -
- aislar los polipéptidos producidos por el organismo hospedante.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un procedimiento de transformación de un organismo hospedante
mediante la integración en dicho organismo hospedante de por lo
menos un polinucleótido o de un casete de expresión o de un vector
según la invención. El polinucleótido puede ser integrado en el
genoma del organismo hospedante o replicarse de manera estable en
el organismo hospedante. Los métodos de transformación de los
organismos hospedantes son bien conocidos por el experto en la
materia y están ampliamente descritos en la bibliografía.
La presente invención se refiere asimismo a un
organismo hospedante transformado con un polinucleótido, un casete
de expresión o un vector según la invención.
Mediante la expresión "organismo
hospedante" se entiende Pichia pastoris.
En un modo de realización preferido de la
invención, el organismo hospedante es una cepa de Pichia
pastoris en la que se expresa una fitasa según la
invención.
Según la presente invención, el organismo
hospedante se transforma con el polinucleótido seleccionado de entre
los polinucleótidos siguientes:
- a)
- el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEC ID nº 1,
- b)
- un polinucleótido que codifica para un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos siguientes:
- -
- el polipéptido de la SEC ID nº 2,
- -
- un fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2 que tiene una actividad fitasa,
- -
- un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que presenta por lo menos 90% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque puede ser que el organismo hospedante en
estado salvaje posea el polinucleótido definido anteriormente, la
presente invención tiene por objeto el organismo hospedante
transformado. Según un modo de realización de la presente
invención, el organismo hospedante está transformado con un
polinucleótido de la invención, con vistas a la expresión del
polipéptido de la invención. Según otro modo de realización de la
presente invención, el organismo hospedante está transformado con
un polinucleótido de la invención, con vistas a la sobreexpresión
del polipéptido de la invención.
Las técnicas de construcción de vectores, de
transformación de organismos hospedantes y de expresión de proteínas
heterólogas en estos organismos están ampliamente descritas en la
bibliografía (Ausubel F.M. et al., "Current Protocols in
Molecular Biology" Volúmenes 1 y 2, Greene Publishing Associates
y Wiley - Interscience, 1989; T. Maniatis, E.F. Fritsch, J.
Sambrook, Molecular Cloning A laboratory Handbook, 1982).
La presente invención se refiere asimismo a unos
aditivos alimenticios que aportan una actividad fitasa. La
aportación de este tipo de actividad enzimática permite mejorar la
digestibilidad del alimento y mejorar su valor nutricional.
Se entiende por aditivo nutricional una
sustancia añadida intencionadamente a un alimento, generalmente en
pequeñas cantidades, para mejorar sus características nutricionales
o su digestibilidad. Los aditivos nutricionales para animales
pueden contener por ejemplo unas vitaminas, unas sales minerales,
unos aminoácidos y unas enzimas.
Típicamente, los aditivos nutricionales para
animales comprenden un polipéptido según la invención, un organismo
hospedante según la invención o un sobrenadante de cultivo/mosto de
fermentación de un organismo hospedante según la invención. Así,
los polipéptidos que tienen una actividad fitasa según la invención
pueden ser purificados o aislados de una cepa de Debaryomyces
Castellii o de un organismo hospedante recombinante para la
fabricación de un aditivo nutricional para animales.
Alternativamente, una cepa de Debaryomyces Castellii o un
organismo hospedante que producen unas fitasas según la invención
pueden ser utilizados directamente para la fabricación de un
aditivo nutricional para animales. En un modo de realización
preferido de la invención, el sobrenadante de cultivo o mosto de
fermentación de un organismo hospedante según la invención se
utiliza para la fabricación de aditivos nutricionales para
animales. Este modo de realización es particularmente ventajoso
cuando la fitasa es segregada en el medio extracelular por un
organismo hospedante. Habitualmente, este sobrenadante de cultivo
está concentrado o liofilizado para la fabricación del aditivo
nutricional.
Así, la invención se refiere asimismo a un
procedimiento de preparación de fitasa que comprende las etapas
siguientes:
- a)
- cultivar un organismo hospedante transformado según la invención en unas condiciones de inducción de la expresión de la fitasa,
- b)
- separar el sobrenadante de cultivo que comprende la fitasa.
Este sobrenadante de cultivo o mosto de
fermentación puede ser concentrado o liofilizado a continuación para
la formulación de un aditivo alimenticio o de un alimento para
animales. El procedimiento puede comprender unas etapas
suplementarias de purificación de la fitasa a partir del
sobrenadante de cultivo.
Si el organismo hospedante no segrega la fitasa
en el medio de cultivo, una etapa suplementaria de ruptura de las
células y de purificación del extracto celular puede resultar
necesaria.
Los aditivos nutricionales de la presente
invención comprenden por lo menos una fitasa según la invención
pero pueden comprender asimismo otras sustancias nutricionales tales
como unas vitaminas, unos aminoácidos o unas sales minerales.
Los aditivos según la invención aumentan la
digestibilidad de los alimentos, contribuyendo así a una mejor
valorización nutricional de los regímenes a base de cereales (trigo,
cebada, maíz, avena, centeno, etc.) y de tortas oleaginosas (soja,
girasol, colza, etc.) en particular.
La presente invención se refiere asimismo a los
alimentos para animales que comprenden una base nutricional y un
aditivo nutricional según la invención. Estos alimentos se presentan
habitualmente en forma de harinas o de gránulos en los que se
incorporan los aditivos según la invención.
La presente invención tiene asimismo por objeto
unos alimentos para animales que comprenden un polipéptido según la
invención, un organismo hospedante según la invención o un mosto de
fermentación/sobrenadante de cultivo de un organismo hospedante
según la invención.
Se entiende por "alimento" todo lo que
puede servir para la alimentación de los animales.
En un modo de realización de la invención, los
aditivos nutricionales y los alimentos para animales según la
invención comprenden una asociación de por lo menos dos fitasas que
tienen unas actividades complementarias. Estos aditivos y estos
alimentos comprenden así por lo menos una fitasa según la invención
asociada a otra fitasa. La fitasa asociada a la fitasa según la
invención se puede seleccionar por ejemplo de entre las fitasas de
los organismos siguientes: Schwanniomyces occidentalis,
Aspergillus awamori (fitasa A y fitasa B), Aspergillus
niger (fitasa A y fitasa B), Penicillium funiculosum,
Aspergillus oryzae, Peniophora lycii, Aspergillus
ficuum, Aspergillus nidulans, Talaromyces
thermophilus, Aspergillus fumigatus y Aspergillus
terreus.
De manera ventajosa, la fitasa según la presente
invención hidroliza todos los grupos fosfato del ácido fítico.
Puede por lo tanto ser utilizada en particular para mejorar o
completar la actividad de fitasas que no hidrolizan todas los
grupos fosfatos. Preferentemente, la fitasa según la presente
invención se asocia a la fitasa de Aspergillus niger (Ullah,
A. H. J y Sethumadhavan, K., (2003) PhyA gene product of
Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces
dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research
Communications 303: 463-468) o a una fitasa de una
cepa de Penicillium funiculosum (WO 03/054199, WO
99/57325).
Preferentemente, los aditivos y los alimentos
comprenden una fitasa según la presente invención asociada a una
fitasa de Aspergillus niger o a una fitasa de Penicillium
funiculosum.
Para la cría intensiva de los animales, los
alimentos para animales comprenden habitualmente una base
nutricional y unos aditivos nutricionales.
Se entiende por "base nutricional", lo que
constituye lo esencial de la ración alimenticia del animal,
constituido a título de ejemplo por una mezcla de cereales, de
proteínas y de materias grasas de origen animal y/o vegetal.
Las bases nutricionales para animales se adaptan
a la alimentación de estos animales y son bien conocidas por el
experto en la materia. Habitualmente, estas bases nutricionales
comprenden por ejemplo maíz, trigo, guisantes y soja. Estas bases
nutricionales están adaptadas a las necesidades de las diferentes
especies animales a las que están destinadas. Estas bases
nutricionales pueden contener ya unos aditivos nutricionales tales
como unas vitaminas, unas sales minerales y unos aminoácidos.
En un modo de realización preferido, la
invención se refiere a unos alimentos para animales monogástricos y
en particular para las aves de corral y los cerdos. Las aves de
corral comprenden en particular las gallinas ponedoras, los pollos,
los pavos y los patos. Los cerdos comprenden en particular los
cerdos en crecimiento y finalización así como los lechones.
Figura 1: Actividad de la fitasa de D.
Castellii en función del pH (pH 3 a 3,5 Tampón glicina 200 mM,
pH 3,5 a 7 tampón acetato de sodio 200 mM, pH 7 a 7,5 tampón tris
HCl 200 mM). Los diferentes valores obtenidos a pH 3,5 con 2
tampones diferentes, muestra el efecto de la naturaleza del tampón
sobre la actividad fitásica.
Figura 2: Actividad de la fitasa de D.
Castellii en función de la temperatura. La actividad se mide a
pH 4, a 37ºC durante 20 minutos.
Figura 3: Desnaturalización térmica de la fitasa
de D. Castellii. El extracto se preincuba a diferentes
temperaturas durante
1-10-20-40-60-120
minutos o bien en agua (líneas llenas), o bien en tampón acetato
125 mM, pH 4 (líneas de puntos). La actividad se mide después a 37ºC
durante 20 minutos.
Figura 4: Estudio de la estabilidad al pH y a la
temperatura. La actividad fitásica de D. Castellii se mide
después del tratamiento del extracto a diferentes pH durante 1 hora
a dos temperaturas (40ºC o 60ºC). La actividad se mide a pH 4.
Figura 5: Esquema de hidrólisis del ácido fítico
por la fitasa de D. Castellii.
Figura 6: Evolución del rendimiento en fitasa
recombinante (círculos) y en biomasa (cuadros) en función del
índice de crecimiento durante unos cultivos en modo
"fed-batch" (A) y continuo (B).
Figura 7: Seguimiento de la aparición de
diversos inositoles fosfatos mediante cromatografía después de la
hidrólisis química y de la hidrólisis enzimática del InsP_{6} por
la fitasa de D. Castellii después de 15, 75, 120 minutos de
hidrólisis.
Figura 8: Ensamblaje y comparación de los
espectros de las 4 fracciones de hidrólisis que contienen InsP1,
InsP2, InsP3 e InsP4. Las atribuciones alternativas están en
cursiva. Con el fin de completar esta comparación, bajo la escala
de los desplazamientos químicos, se representa asimismo el espectro
del InsP5 obtenido por diferencia al inicio de la cinética. Las
señales positivas son las del InsP5 y las dos señales negativas
corresponden al InsP6 de partida. Estos espectros, característicos
de los diferentes inositoles fosfatos permiten seguir la aparición
y la desaparición de los diferentes productos durante la cinética de
hidrólisis.
Figura 9: Cinética lenta seguida a 500 MHz y a
17ºC con una disolución de 1,7 mM de InsP6, 10 mM de tampón
acetato, pH 4,0 (500 \mul de H2O/D2O, 16/84 v/v) y 1 \mul de la
disolución de enzima. El intervalo de tiempo entre dos espectros es
de 23 minutos. Después de una noche, se añaden 20 \mul de enzima
para acelerar la reacción. Después de 16 horas, la hidrólisis se
completa y se obtiene el espectro característico del inositol
(espectro de arriba). Esta cinética muestra claramente la aparición
sucesiva del InsP5, del InsP4 y del InsP3.
Figura 10: Cinética más rápida que permite un
seguimiento de la hidrólisis completa del InsP6 (600 MHz, 17ºC, 500
\mul D2O, 3,8 mM en InsP6 pH 4,0, 5 \mul de enzima). Un espectro
ha sido registrado cada 3 minutos durante 20 horas (400 espectros).
Después de 10 horas, la hidrólisis está prácticamente completa. Los
espectros trazados corresponden a un espectro de 10 (30 minutos
entre dos espectros). Se observan algunas señales
características.
Figura 11: Evolución de las concentraciones en 5
horas de los diferentes productos durante la hidrólisis. Este
gráfico permite conocer en qué momento se obtiene la concentración
óptima para cada producto. Observación: la altura de la señal RMN
característica de cada uno de los compuestos ha sido utilizada para
evaluar las variaciones de concentraciones. Las señales utilizadas
no representan siempre el mismo número de protones y no tienen
siempre la misma multiplicidad. De hecho, las concentraciones no se
pueden comparar entre sí.
La cepa utilizada está clasificada en Centraal
Bureau voor Schimmelculture (Delft) con el nombre de Debaryomyces
Castellii CBS 2923.
- Medio sintético para los cultivos en Batch (MSA-B): Glucosa (10 g/l); Fitato de sodio C_{6}H_{6}O_{24}P_{6}Na_{12} (0,4 g/l)
- Sales minerales: (NH_{4})_{2}SO_{4} (3 g/l), MnSO_{4}, H_{2}O (7,5 mg/l), KCl (0,5 g/l), MgSO_{4}, 7H_{2}O (0,5 g/l), CaCl_{2}, 2H_{2}O (0,1 g/l)
- Oligoelementos: H_{3}BO_{4} (500 \mug/l), CuSO_{4}, 5H_{2}O (40 \mug/l), Kl (100 \mug/l), Na_{2}MoO_{4}, 2H_{2}O (200 \mug/l), ZnSO_{4}, 7H_{2}O (400 \mug/l), FeCl_{3}, 6H_{2}O (200 \mug/l).
- Vitaminas: Pantotenato Ca (2 mg/l), Tiamina (B1) (2 mg/l), Myo-inositol (2 mg/l), Piridoxina (B6) (2 mg/l), Ac. Nicotínico (PP) (0,5 mg/l), Biotina (0,02 mg/l).
- Medio sintético para los cultivos en continuo (MSA-C): Composición del medio MSA-B, los diversos componentes están 10 veces más concentrados.
El primer precultivo se lleva a cabo en
presencia de YMPG (glucosa 10 g/l, yeast extract 3 g/l, bacto
peptone 5 g/l, malt extract 3 g/l). Los cultivos se realizan en
unos frascos de Erlenmeyer llenos a 1/10ª de su volumen en
presencia de medio MSA-B tamponado a pH 5,4 con
tampón tartrato 0,2 M. Éstos se llevan en medio ventilado a un
agitador de vaivén (80 oscilaciones por minuto, amplitud 7 cm), a
28ºC.
Los cultivos se realizan en un fermentador
Applikon (Holanda) (1,5 l de volumen útil) o Beaun Biostat E (3 l
de volumen útil). El pH se mide mediante una sonda Ingold. Se regula
mediante adición de sosa 2M o de ácido sulfúrico 1M. La ventilación
está asegurada por insuflación de 2 v.v.m (volumen de aire.(volumen
de cultivo)^{-1}.(minuto)^{-1}) de aire
esterilizado por filtración. La presión parcial en oxígeno disuelto
se mide con la ayuda de una sonda polarográfica Ingold. Se mantiene
a un valor superior a 30% mediante variación de la velocidad de
agitación. La temperatura se mantiene a 28ºC. El control y la
adquisición de los datos se efectúan en línea gracias a un programa
de adquisición Bioexpert (Applikon).
La concentración en CO_{2} en los gases
efluentes se mide con la ayuda de un analizador con infrarrojos
Beckman Industrial 870. La concentración en O_{2} se mide con la
ayuda de un analizador Beckman Industrial 775A cuyo detector
utiliza la susceptibilidad paramagnética del oxígeno molecular.
Los sustratos y los metabolitos presentes en el
medio de cultivo (glucosa, acetato, etanol) se separan y se
cuantifican mediante cromatografía líquida de alto rendimiento
(CLPH) con la ayuda de una columna FFJ (Waters) de exclusión de
iones. La fase móvil es ácido fosfórico 3 mM, cuyo caudal es de 1
ml/minuto. Una muestra del medio de cultivo se extrae en continuo
cada dos horas y se filtra estérilmente de manera tangencial (filtro
Millipore 0,22 \mum GV) con la ayuda del módulo de filtración
A-SEP Applikon y del módulo FAM de adquisición y de
filtración Waters. Los sustratos carbonados son detectados mediante
refractometría (Waters 410). El conjunto se controla mediante el
sistema de control Waters 600 E. Los cromatógrafos son analizados
gracias al programa Millenium (Waters).
Unas gamas patrones han sido realizadas para
cada sustrato en una escala de 1 a 50 g/l.
El sobrenadante de cultivo obtenido después de
la centrifugación se filtra sobre una membrana de umbral de corte
de 0,22 \mum (Millipore) antes de ser ultrafiltrado sobre un
casete de ultrafiltración de flujo tangencial Filtron (superficie:
836 cm^{2}) cuyo umbral de exclusión es de 10 kDa. El concentrado
se lava 3 veces (VN) con agua ultra pura y después se concentra por
un factor 25. El extracto obtenido se utiliza para la
purificación.
La separación de las proteínas se realiza a 20ºC
sobre una columna HiPrep 16/10 Phenyl FF (Amersham) de diámetro
interno de 16 mm y de longitud de 100 mm (volumen de 20 ml).
Antes de la inyección sobre el gel de
purificación, las muestras se equilibran en sulfato de amonio 2M. La
mezcla se deja durante 2 a 16 horas a 4ºC y después se centrifuga
(12.000 g, 20 minutos) con el fin de eliminar las proteínas
precipitadas. El sobrenadante de la centrifugación constituye el
extracto depositado sobre el gel.
El gel se equilibra en primer lugar con el
equivalente de 5 volúmenes de columna con la ayuda de una disolución
tampón Tris-HCl 50 mM, pH 6,1 y de sulfato de
amonio 2M. Se inyectan 1 a 5 ml de muestra.
Las proteínas no fijadas se eliminan mediante un
lavado equivalente a 5 volúmenes de columna con la disolución
tampón sulfato de amonio de equilibrado.
La elución se realiza efectuando un gradiente de
tres segmentos lineales: (1) sulfato de amonio de 2 a 1,7 M, en una
duración equivalente a 1,5 volúmenes de columna, (2) sulfato de
amonio 1,7 M, en una duración equivalente a 4 volúmenes de columna,
(3) sulfato de amonio de 1,7 a 0 M, en una duración equivalente a
0,1 volúmenes de columna. La fitasa se eluye a 1,7 M de sulfato de
amonio.
El caudal se fija a 5 ml/min. Unas fracciones de
4 ml se recogen a la salida de la columna, la absorbancia se mide a
280 nm.
Las fracciones activas se reúnen, se lavan con
agua ultra pura y se concentran mediante ultrafiltración (membrana
Millipore, umbral de corte 10 kDa).
Las electroforesis en condiciones
desnaturalizantes y no desnaturalizantes se realizan sobre unos
geles prevertidos de 4 a 15% de acrilamida (Biorad). Las proteínas
se detectan con azul de Coomassie.
La revelación específica de las fitasas se
realiza incubando los geles en 100 ml de una disolución tampón
acetato de sodio 250 mM pH 5,5 que contiene 200 mg de \alpha
naftil P (Sigma) y 100 mg de Fast Garnet GBC (Sigma) y 92 mg de
fitato de sodio. Después de la hidrólisis del \alpha naftil P, se
forma un complejo \alpha naftil/Fast Garnet GBC de color
marrón.
Desglicosilación: se añaden 1.000 unidades de
endoglicosidasa H (Biolab Ozyme P0702S) a la muestra desnaturalizada
que contiene aproximadamente 20 \mug de proteínas. La mezcla se
incuba durante 2 horas a 37ºC al baño maría.
El análisis se lleva a cabo sobre la fitasa
purificada sobre SDS-PAGE con la ayuda de un
espectrómetro MALDL-TOF Biflex III scout 384
(Bruker, Breme, Germany).
\newpage
La concentración celular se obtiene mediante la
medición de la densidad óptica (DO) con la ayuda de un espectrómetro
Beckman DU530. Una unidad de DO corresponde a 0,570 g/l de
biomasa.
El contenido en proteínas se determina mediante
el método de Bradford (Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive
method for the quantification of microgram quantities of proteins
utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72, 248-254). (Biorad Protein Assay
Dye Reagent Concentrate, BIORAD 500-0006), y la
absorbancia se mide a 595 nm (espectrofotómetro UV/visible Beckman
DU 530). El calibrado se efectúa con una gama de suero de albúmina
bovina.
La actividad fitásica se mide siguiendo la
liberación de fosfato inorgánico a lo largo del tiempo.
La actividad se mide en presencia de 8 mM de
fitato de sodio (Sigma) disuelto en un tampón acetato de sodio pH
5,5 o pH 4, 250 mM, 1 mM de CaCl_{2}, a 37ºC (5 volúmenes). La
reacción se inicia mediante la adición del extracto enzimático (1
volumen). La reacción se detiene mediante acidificación del medio
por el ácido tricloroacético 20% (1 volumen de medio de reacción +
1 volumen de ácido). La cantidad de fosfato liberado se determina
después de diferentes tiempos de incubación.
Una unidad enzimática (U) se define como la
cantidad de enzima que libera un \mumol de fosfato inorgánico en
un minuto.
El efecto del pH sobre la actividad fitásica se
determina utilizando las disoluciones tampón siguientes:
Glicina-HCl 200 mM, pH 2-3,5;
Acetato de sodio-ácido acético 200 mM, pH 3,5-7; y
Tris-HCl 200 mM, pH 7-9. Las
reacciones se llevan a cabo a +37ºC utilizando el fitato como
sustrato. La temperatura óptima se determina haciendo variar la
temperatura de +30 a +80ºC. Las reacciones se llevan a cabo a pH 4
(tampón acetato de sodio 200 mM) utilizando el fitato como
sustrato. La estabilidad térmica se determina mediante la incubación
de la muestra enzimática en un tampón acetato de sodio 125 mM, pH
4, durante diferentes duraciones a unas temperaturas comprendidas
entre +37 y +70ºC. Después del tratamiento térmico, le mezcla se
enfría en hielo y la actividad fitásica se determina utilizando el
fitato como sustrato. Los parámetros cinéticos se determinan a +37ºC
y a pH 4 para los experimentos con el fitato de sodio y a pH 5,5
para los experimentos con el p-NPP.
La cantidad de fosfato liberado se mide mediante
colorimetría. La disolución de revelación, preparada
extemporáneamente, contiene sulfato de hierro (380 mM, 1 volumen) y
heptamolibdato de amonio (12 mM, 4 volúmenes). La medición de la
absorbancia, a 700 nm, se lleva a cabo después de 30 minutos de
revelación a temperatura ambiente (1 volumen de medio de reacción +
1 volumen de disolución de revelación), con la ayuda de un
espectrofotómetro UV/visible (Beckman DU 530).
Se establece previamente una recta de calibrado
con potasio dihidrogenofosfato.
El tubo de reacción contiene 2 volúmenes de
fitato de sodio (20 mM), 2 volúmenes de tampón acetato pH 4 (0,25
M) y 1 volumen de enzima diluida (0,6 U/ml al final).
Se realizan unas extracciones a diferentes
tiempos durante 6 horas. La reacción se detiene mediante
calentamiento a 100ºC (durante 10 minutos).
Se trata de un método que utiliza la
cromatografía iónica de alto rendimiento (HPIC) para separar y
determinar los inositoles mono- a hexafosfatos obtenidos mediante
la degradación del ácido fítico por las fitasas estudiadas
(Hatzack, F., Hübel, F., Zhang, W., Hansen, P.E. y Rasmussen, S.K.
(2001) Inositol phosphates from barley low-phytate
grain mutants analysed by metal-dye detection HPLC
and NMR. Biochem. J. 354, 473-480; Skoglund, E.,
Carlsson, N.G. y Sanberg, A.S. (1997) Determination of isomers of
inositol mono- to hexaphosphates in selected foods and intestinal
contents using High-Performance Ion Chromatography.
J. Agric. Food Chem. 45, 431-436; Türk, M.,
Sandberg, A.S., Carlsson, N.G. y Andlid, T. (2000) Inositol
hexaphosphate hydrolysis by baker's yeast. Capacity, kinetics, and
degradation products. J. Agric. Food Chem. 48,
100-104). El método incluye la separación de los
diferentes InsP_{n} sobre columna intercambiadora de iones en HPLC
con un gradiente de elución y la reacción
post-columna durante la cual los inositoles fosfatos
se complejan con hierro y se detectan mediante UV a 290 nm. Este
sistema permite detectar del InsP_{2} al InsP_{6} pero sólo los
diferentes isómeros del InsP_{4} e InsP_{5} pueden ser
separados.
Los picos se identifican después de una
hidrólisis química. Se disponen 50 mg de fitato de sodio en 5 ml de
HCl (6 M) a 100ºC durante 16 horas. Unos alícuotas de 25 \mul se
secan con Speed Vac y después se recogen en 100 \mul de HCl 0,025
M para obtener aproximadamente 300 nmoles por inyección.
La separación de los diferentes picos se realiza
mediante cromatografía de intercambio de aniones fuertes sobre una
columna analítica Omni Pac PAX-100 (4 x 250 mm) y
una precolumna de guardia PAX-100 (4 x 50 mm)
(Dionex Corp., Sunnyvale CA). El caudal es de 0,8 ml/min., el bucle
de inyección es de 100 \mul. Los InsP_{n} se eluyen con un
gradiente de 5-98% HCl (0,5 M) en conjugación con
agua ultra pura y un disolvente orgánico (50% de
2-propanol). Los eluyentes se combinan según la
Tabla 1 siguiente:
Se necesita un tiempo de 15 minutos para
equilibrar la columna después de cada cromatografía.
Los inositoles fosfatos se detectan después de
una reacción post-columna por la medición de la
absorbancia a 290 nm con la ayuda de un espectrofotómetro UV
(Biocad, Sprint). El eluyente se mezcla, en una reacción
post-columna, con 0,1% de
Fe(NO_{3})_{3}.9H_{2}O en una disolución al 2%
de HClO_{4}. El caudal de la bomba del reactivo (Minipuls 3,
Gilson) es de 0,4 ml/min. El paso por un serpentín de teflón (0,25
mm, 4 m) permite complejar los InsP_{n} y el hierro para la
detección (Phillippy, B.Q. y Bland, J.M. (1988) Gradient ion
chromatography of inositol phosphates. Anal. Biochem. 175,
162-166).
Después de la liofilización, las diferentes
muestras de inositoles aislados por HPIC (50-200
\mug) son solubilizadas en 500 \mul de D2O.
Los espectros de protones han sido registrados a
500 ó 600 MHz sobre unos espectrómetros Avance Bruker equipados con
una criosonda (1H, 13C y 15N) y con gradientes sobre el eje z. Los
espectros de protones desacoplados del fósforo y los espectros de
correlación 1H-31P (HMQC) han sido registrados sobre
un espectrómetro Avance Bruker 400 MHz con una sonda TBI. La señal
residual del agua ha sido suprimida por una presaturación selectiva
de una duración de 1 s. Todos los espectros han sido registrados a
17ºC. Los espectros de protones son calibrados con respecto al
(trimetilsilil)-3-propionato de
sodio-d4 (TSP, 0 ppm) o a la señal residual del agua (4.914
ppm a 17ºC). Para la atribución de las resonancias de protón, los
experimentos COSY y TOCSY han sido registrados con 512 incrementos
de tiempo. El tiempo de contacto utilizado para el TOCSY es de 50
ms. Los experimentos HMQC han sido obtenidos con 64 incrementos de
tiempo.
La atribución de los espectros de protones se
realizará mediante el análisis de los experimentos COSY y TOCSY. Se
debe apreciar que para algunos isómeros que poseen un plano de
simetría, los protones H1 y H3 y los protones H4 y H6 no se pueden
diferenciar. En este caso, se anotarán H1 (o H3) y H4 (o H6). Una
vez obtenida la atribución, queda por determinar las posiciones
fosforiladas. Éstas se determinarán con la ayuda de dos experimentos
diferentes, por un lado con la ayuda del espectro de protón
desacoplado del fósforo y, por otro lado mediante el experimento
HMQC. La comparación del espectro de protón sin y con
desacoplamiento del fósforo permite identificar las señales que
poseen un acoplamiento ^{3}J_{HCOP} 8,5-10 Hz y
así la(s) posición(es) de fosforilación.
El experimento ^{1}H-^{31}P
HMQC, por medio de la constante de acoplamiento ^{3}J_{HCOP},
permite a su vez identificar las correlaciones
protón-fósforo. Cuando se conoce la atribución de
las resonancias de protones, los espectros desacoplados del fósforo
y HMQC permiten identificar las posiciones fosforiladas sin ninguna
ambigüedad. La posición de los grupos fosfatos se verifica asimismo
mediante el análisis de las constantes de acoplamiento del espectro
de protón.
La muestra utilizada para seguir la hidrólisis
por RMN se prepara a partir de una disolución madre de InsP6/tampón
fosfato, 96/700 mM en D2O. Típicamente, 20 \mul de esta disolución
son añadidos a 480 \mul de D2O (dilución 25) para conducir a una
muestra que contiene 3,8 mM de InsP6 y 28 mM de tampón acetato de
sodio y TSP como referencia interna. En función de la velocidad de
hidrólisis deseada, se añade una mayor o menor cantidad de enzima
(1 a 20 \mul de la disolución madre a 3 U/ml). La cinética se
sigue a 17ºC por medio del registro de un espectro (32 escaneos)
cada 3 minutos durante 20 horas (400 espectros). A partir de los
espectros característicos de los diferentes inositoles fosfatos
determinados anteriormente, su aparición y desaparición pueden ser
seguidas en el conjunto de la cinética.
La biosíntesis de la fitasa ha sido seguida en
cultivo batch y continuo con el fin de determinar las condiciones
óptimas de producción. Los cultivos se realizan sobre un medio
sintético (véase Materiales y métodos). Un estudio previo ha
permitido determinar una concentración óptima en fitato de 0,4 g/l
para producir 5 g/l de biomasa. Esta concentración es necesaria y
suficiente para asegurar el crecimiento celular máximo y no reprimir
la biosíntesis de las fitasas. Se efectúan unas extracciones a lo
largo del tiempo; se mide la biomasa y la actividad fitásica.
Cinco cultivos Batch se realizan a pH 3, 4, 5,
6, y 7 en presencia de 10 g/l de glucosa y de medio
MSA-B. La biomasa máxima se obtiene a pH 5, el
índice de crecimiento disminuye 20% a pH 3 y a pH 7. La actividad
fitásica máxima, medida en los sobrenadantes de cultivo, se obtiene
a pH 4, y no se detecta ninguna actividad a pH 3. La actividad
fitásica aumenta aproximadamente 20%, 12 horas después del inicio de
la fase estacionaria. Es posible que ninguna parte de la fitasa sea
parietal y liberada en el medio en fase de no crecimiento. Se ha
verificado que se obtenía un mismo nivel de inducción en presencia o
en ausencia de sal de calcio.
El cultivo continuo se realiza a pH 4, en
presencia de 100 g/l de glucosa y de medio MSA-C.
Las mediciones de biomasa y de actividades fitásicas se efectúan
después de por lo menos 3 renovaciones del fermentador.
La producción de biomasa es constante hasta un
índice de dilución de 0,20 h^{-1}, con un rendimiento
Y_{biomasa/sustrato} (g/g) de 50%, el metabolismo celular es
oxidativo, y el coeficiente respiratorio (QR) es igual a 1. La
producción de fitasa aumenta con el índice de dilución. Para un
índice de dilución (D) de 0,25 h^{-1}, el rendimiento de
crecimiento disminuye 40%, el QR es superior a 1, el metabolismo
celular es oxido-fermentador, y se produce la
formación de metabolitos secundarios tales como acetato y etanol. La
producción de fitasa disminuye asimismo en un factor 5.
La mejor producción (1487 U/l) se obtiene con
D=0,20 h^{-1}. Se debe observar que 20% de fitasa está unida a
las células, y el mantenimiento del cultivo a 4ºC durante por lo
menos 4 horas permite la liberación de la enzima en el medio de
cultivo.
Las diferentes etapas de purificación de la
fitasa de D. Castellii se resumen en la tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El extracto bruto tiene una actividad específica
de 11,4 U/ml. Después de una etapa de concentración y de
ultrafiltración, el extracto se purifica mediante cromatografía
hidrófoba. La fitasa se purifica en una sola etapa por un factor 13
con un rendimiento de 59%. La actividad específica es de 156 U/mg.
La presencia de una sola banda proteica sobre una electroforesis
SDS-PAGE muestra que la enzima es pura.
Una electroforesis SDS-PAGE
permite estimar la masa molecular de la fitasa a 77 kDa y de la
enzima desglicosilada por tratamiento con endoglicosidasa H a 51
kDa, es decir, 34% de glicosilación. En condición no
desnaturalizante, la masa molar de la fitasa es más difícil de
determinar debido a la presencia de corrientes, y se sitúa entre
440 y 150 kDa. La de la enzima desglicosilada es de 87 kDa. Una
coloración específica permite mostrar que la fitasa desglicosilada
es activa.
La masa molar determinada mediante cromatografía
de gel de permeación (columna HR 200 Pharmacia) es de 318 kDa para
la fitasa glicosilada y de 218 kDa para la fitasa
desglicosilada.
La determinación de la masa mediante
espectrometría de masa confirma los resultados obtenidos por
electroforesis SDS-PAGE, es decir 74 kDa para la
fitasa y 53 kDa para la enzima desglicosilada, es decir, 28,4% de
glicosilación.
La fitasa nativa estaría por lo tanto
constituida por 4 monómeros de masa idéntica.
Durante el año de prioridad, la estructura de la
fitasa de Debaryomyces Castellii (461 residuos) ha sido
determinada mediante cristalografía con una resolución de 2,3
\ring{A}.
Es un tetrámero que contiene 10 moléculas de
N-acil glucosamina y 1.256 moléculas de agua.
La estructura es accesible en el sitio del RCSB
Protein Data Bank con el código pdb siguiente: 2GFl.
El efecto del pH sobre la fitasa se determinó
midiendo la actividad enzimática en presencia de diferentes
tampones: para los pH comprendidos entre 2 y 3,5 (tampón glicina),
para los pH de 3,5 a 7 (tampón acetato de sodio) y para los pH de 7
a 7,5 (tampón tris HCl) (figura 1). La fitasa es activa entre unos
valores de pH de 2,5 a 6,5, con un valor óptimo entre pH 4 y 4,5.
Se puede observar un efecto de la naturaleza del tampón sobre la
actividad fitásica, a pH 3,5, siendo el tampón acetato de sodio
inhibidor con respecto al tampón glicina.
La temperatura óptima se determina sobre la
fitasa nativa, efectuando una medición de la actividad fitásica a
diferentes temperaturas: de 30 a 80ºC (figura 2).
La temperatura óptima de la fitasa está
comprendida entre 55 y 60ºC. La energía de activación calculada
según la representación de Arrhenuis es de 38 kJ/mol.
Entre los diferentes cationes ensayados, sólo el
Mn^{2+} provoca una fuerte inhibición de 72%. En presencia de los
cationes Co^{2+}, Zn^{2+}, Cu^{2+} y Mg^{2+}, la actividad
está inhibida de 58 a 22%. Se puede observar que la presencia de
calcio no es necesaria para la actividad de esta enzima (tabla
3).
Entre los 6 inhibidores ensayados, sólo la
N-bromosuccinimida que actúa sobre los grupos
triptófano, tirosina e histidina inhibe totalmente la actividad
fitásica. La adición de triptófano restablece la actividad. El
yodo, específico de grupos tirosina, inhibe asimismo en gran medida
(75%). El triptófano y la tirosina parecen estar altamente
implicados en el sitio catalítico de la enzima.
Por el contrario, el ácido yodoacético que actúa
sobre los grupos cisteína e histidina no provoca ninguna inhibición
de la actividad.
La ausencia de efecto del
2-mercaptoetanol, del yodoacetato y del pCMB muestra
que los grupos -SH no están probablemente implicados en el sitio
catalítico.
Un estudio de la desnaturalización térmica a
diversas temperaturas muestra que la enzima es estable durante una
hora a 60ºC cuando está en agua y una hora a 66ºC cuando está en un
tampón acetato 125 mM, pH 4 (figura 3). Está desnaturalizada por
encima de 68ºC, con una pérdida de actividad de 70% después de una
hora a 70ºC. La energía de activación de la desnaturalización
calculada por la representación de Arrhenius es de 606 kJ/mol.
La fitasa está totalmente desnaturalizada
después de 21 días de conservación a -20ºC para los pH inferiores a
5. Por el contrario, no se observa ninguna desnaturalización después
de 67 días de conservación a esta misma temperatura para los pH
comprendidos entre 5 y 7.
La actividad fitásica se mide después de la
incubación de la enzima a 2 temperaturas (40 y 60ºC) en unos
tampones cuyo pH está comprendido entre 2 y 8 (figura 4). Para los
dos pH extremos (2 y 8) se observa una pérdida total de actividad
después de 1 hora de contacto. Por el contrario, en la gama de 3 a
7, de 80 a 100% de actividad se conserva a 40ºC. A 60ºC, la fitasa
se desnaturaliza en mayor medida a los pH 3 y 8. Se puede apreciar
que existe un fuerte efecto debido a la naturaleza del tampón a pH
8; en presencia de tampón acetato, la desnaturalización es total
mientras que en presencia de un tampón tris HCL, la
desnaturalización es de sólo 50%.
La enzima se pre-incuba en
tampón acetato 250 mM, pH 4 que contiene cloruro de calcio 1 mM, a
20ºC y 66,5ºC, durante 60 minutos en presencia de diferentes
aditivos. Al final del tratamiento, el extracto se enfría en agua a
+4ºC. La actividad se mide después a 37ºC durante 20 minutos a pH 4,
tampón 250 mM (tabla 4).
Se ensayan tres tipos de elementos:
- -
- azúcares o azúcar alcohol: sacarosa, lactosa, trehalosa, arabinosa, glicerol.
- -
- la ausencia de calcio,
- -
- la molaridad del tampón.
La enzima se pre-incuba en un
tampón acetato 250 mM, calcio 1 mM, pH 4, a 20ºC y 66,5ºC, durante
60 minutos en presencia de diferentes aditivos. Al final del
tratamiento, el extracto se enfría en agua a +4ºC.
La actividad se mide a continuación a 37ºC
durante 20 minutos a pH 4, tampón 250 mM, 1 mM de calcio (véase
Materiales y Métodos).
\vskip1.000000\baselineskip
Dos elementos son muy importantes, el calcio y
la fuerza iónica. El calcio, a pesar de que no tiene ninguna
influencia sobre la actividad enzimática, desempeña una función
protectora muy importante; la desnaturalización es total en
ausencia de calcio. El aumento de la fuerza iónica del tampón
aumenta la desnaturalización por la temperatura hasta 50% a 250
mM.
Las constantes cinéticas se determinan sobre 2
sustratos. La afinidad de la fitasa es 4 veces más fuerte en
presencia de fitato de calcio que de
p-nitro-fenil-fosfato
(pNPP) (tabla 5).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Esta fitasa posee un amplio espectro de
actividad, con una hidrólisis preferencial del pNPP, del fosfoenol
piruvato, del ATP y del ADP (tabla 6A). Se clasifica en las fitasas
de espectro amplio tales como las fitasas de A. fumigatus,
E. nidulans.
Degrada asimismo el Ins (2) P_{1}, (tabla 6B)
que es raramente hidrolizado por las fitasas debido a su posición
axial sobre la molécula de ácido fítico. Su funcionamiento es
inhibido por los fosfatos con un Ki de 1, 3 mM.
(A) La concentración en sustratos es de 4 mM.
Las cinéticas de liberación de fosfato se realizan en tampón
acetato de sodio 250 mM, CaCl_{2} 1 mM, pH 4, a 37ºC
(B) Hidrólisis de diversos
inositoles fosfatos por la fitasa de D. Castellii. Las
cinéticas de liberación de fosfatos se realizan en tampón acetato
de sodio 250 mM, CaCl_{2} 1 mM, pH 4. Las mediciones se realizan
después de 30 minutos de hidrólisis a
37ºC
Los isómeros de myo-inositol
fosfato se separan sobre una columna analítica Omni
Pac-100 utilizando un gradiente de 5% a 98% de HCl
(0,5 M) y H_{2}O/2-propanol (v/v). Los eluyentes
se mezclan en un reactor post-columna con una
disolución de 0,1% Fe(NO_{3})_{3}, 9H_{2}O y
HClO_{4} 2% (Phillippy, B.Q. y Bland, J.M. (1988) Gradient ion
chromatography of inositol phosphates. Anal. Biochem. 175,
162-166). El caudal total es de 1,2 ml/min. Estas
condiciones permiten separar los diferentes Ins Ps (Ins P_{6} al
Ins P_{1}) e identificar diferentes isómeros del Ins P_{5} y
del Ins P_{4}.
Los diferentes isómeros se identifican mediante
la comparación de los cromatogramas obtenidos con (1) los descritos
en la bibliografía, obtenidos en unas condiciones idénticas
(Skoglund, E., Carlsson, N.G. y Sanberg, A.S. (1997) Determination
of isomers of inositol mono- to hexaphosphates in selected foods and
intestinal contents using High-Performance Ion
Chromatography. J. Agric. Food Chem. 45, 431-436),
(2) con los compuestos obtenidos mediante hidrólisis química (Türk,
M., Sandberg, A.S., Carlsson, N.G. y Andlid, T. (2000) Inositol
hexaphosphate hydrolysis by baker's yeast. Capacity, kinetics, and
degradation products. J. Agric. Food Chem. 48,
100-104), y (3) con los productos de hidrólisis del
ácido fítico por las fitasas de A. niger y P lycii
(Lassen, S. F., Bech, L., Fuglsang, C.C., Ohmann, A., Breinholt, J.
y Stergaard, P.R. (2000), patente US nº 6.060.298).
Después de una hidrólisis química (HCl 6M,
100ºC, 16 horas), el cromatograma obtenido permite identificar 12
isómeros entre los Ins P_{5} e Ins P_{4}. Los isómeros del Ins
P_{3}, Ins P_{2} e Ins P_{1} no son separados mediante este
método.
Las condiciones de hidrólisis se describen en
Materiales y Métodos. La aparición de los diversos Ins P_{n} se
sigue a lo largo del tiempo. Después de 15 minutos de hidrólisis, el
Ins P_{6} ha desaparecido prácticamente, se detectan 4 picos
mayoritarios y corresponden al Ins (1, 2, 4, 5, 6) P_{5}, al Ins
(1, 2, 5, 6) P_{4}, y unos picos del Ins P_{3}, Ins P_{2} e
Ins P_{1} no identificados mediante este método (figura 7). La
atribución de los Ins P_{5} e Ins P_{4} se confirma mediante la
adición de muestras auténticas de inositoles. Después de 120
minutos de hidrólisis, los picos del Ins P_{3} y del Ins P_{1}
son mayoritarios. Esto podría traducir una velocidad de hidrólisis
claramente más baja del Ins P_{3} con respecto a los Ins P_{4,
5} y _{6}. Después de 300 minutos de hidrólisis, la cantidad de
fosfato dosificado corresponde a 100% de los fosfatos potenciales
de la molécula de fitato. La enzima libera la totalidad de los
fosfatos. La caracterización de las fracciones del Ins P_{n}
separadas mediante cromatografía se lleva a cabo mediante análisis
RMN.
Los diferentes productos de hidrólisis del Ins
P_{6} por la fitasa de D. Castellii son separados mediante
cromatografía de intercambio de iones según el método utilizado en
el párrafo anterior. La cantidad inyectada corresponde a 369,5
\mug del Ins P_{6}. El agente reactivo
post-columna se sustituye por agua, y se realizan
12 cromatografías.
Las fracciones que corresponden a los Ins
P_{5}, Ins P_{4}, Ins P_{3}, Ins P_{2}, Ins P_{1}, se
recogen, se reúnen y se liofilizan. Los liofilizados se rehidratan
con 0,5 ml de D_{2}O y se analizan mediante RMN a 17ºC.
Tal como se ha detallado en Materiales y
Métodos, las diferentes fracciones de inositoles se caracterizan
mediante el análisis de los espectros de protones (1D y 2D COSY y
TOCSY) y de sus espectros de correlación 31P-1H
(HMQC). Si es posible distinguir los estereoisómeros, que son unas
imágenes no espejo, no se pueden distinguir los enantiómeros, que
proporcionan unas imágenes espejo y unos espectros idénticos.
Así, la caracterización RMN de los productos de
hidrólisis no permite distinguir una 3-fitasa de una
1-fitasa, y una 6-fitasa de una
4-fitasa. Convencionalmente, según la bibliografía,
cuando los enlaces 3 ó 1 son hidrolizados en primer lugar, se da el
nombre de 3-fitasa, al igual que para los enlaces 6
ó 4 se da el nombre de 6-fitasa.
El espectro de protón indica la presencia de una
mezcla de tres productos cuyos sistemas de espín han sido
identificados con la ayuda de los experimentos TOCSY y COSY. Estos
tres productos son: el Ins (2) P1 (36%), el Ins (1 ó 3) P1 (16%) y
el inositol (48%). El espectro fósforo indica la presencia de
fósforo inorgánico que se caracteriza por una señal fina. El HMQC
confirma que dos de ellos son monofosforilados y que el 3º no lo
es, es el inositol.
El espectro de protón indica la presencia de un
producto mayoritario (\approx 90%). Partiendo de la señal que
corresponde al protón H2 (4,741 ppm), el COSY permite la atribución
del espectro. El análisis de las constantes de acoplamiento indica
que las posiciones 2 y 1 (o 2 y 3) están fosforiladas y que el
producto mayoritario corresponde al Ins P (2, 1 ó 2, 3) P2. El
espectro desacoplado del 31 P y el HMQC confirman esta atribución.
Los productos minoritarios, por lo menos 2, no han sido
identificados.
El espectro de protón indica la presencia de un
producto prácticamente puro. El análisis del espectro indica que
corresponde al Ins (2, 1, 6 ó 2, 3, 4) P3. La fosforilación de estas
tres posiciones consecutivas se confirma mediante el espectro
desacoplado de 31 P y mediante HMQC.
El espectro de protón indica la presencia de un
producto mayoritario (\approx 90%) que resulta ser el Ins (2, 1,
6, 5 ó 2, 3, 4, 5) P4. Las posiciones de los grupos fosfatos
deducidas del análisis de las constantes de acoplamientos (3JHCOP =
8-10 Hz) se confirman por los experimentos de
desacoplamiento 31 P y por el experimento HMQC. Los productos
minoritarios no han sido identificados.
Teniendo en cuenta que InsP5 es el primer
producto formado y que se encuentra tan pronto degradado en InsP4,
no ha sido posible aislarlo suficientemente mediante HPLC para poder
caracterizarlo mediante RMN.
Con el fin de evitar esta dificultad, el Ins P5
ha sido caracterizado in situ durante una cinética de
hidrólisis realizada a 17ºC con una baja densidad de fitasa (véase a
continuación). En estas condiciones, se han podido obtener los
espectros de protones (espectro de diferencia 1D, TOCSY y COSY) del
Ins P5. El conjunto de estos espectros permite caracterizar el Ins
(1, 2, 4, 5, 6) P5 indicando que la posición 3 (o 1) es la primera
posición en ser defosforilada. El espectro 31P del Ins P5 no ha sido
registrado (figura 8).
Unos estudios preliminares han permitido por un
lado mostrar que la enzima era insensible a la presencia de
deuterio y, por otro lado, ajustar la concentración de enzima para
obtener una cinética ni demasiado rápida ni demasiado lenta con
respecto a las limitaciones técnicas de observación.
En función de la temperatura (en este caso 17ºC)
y de la concentración en enzima, una cinética puede ser lenta (1
\mul de enzima) y la aparición de los primeros intermediarios
fácilmente observada. En estas condiciones se han obtenido las
características espectrales del InsP5 y se observa claramente la
aparición sucesivamente del Ins P5, Ins P4 e Ins P3.
En presencia de 5 \mul de enzima, se observa
la formación de los Ins P2, Ins P1 y del inositol. En la fase
intermedia, la complejidad de los espectros obtenidos demuestra la
mezcla de los Ins Pn. Después de 10 horas, la hidrólisis no es
total. En presencia de 20 \mul de enzima, se ha obtenido una
hidrólisis total en aproximadamente 4 horas. Estos resultados
cinéticos confirman la hidrólisis de los 6 enlaces fosfato observada
anteriormente. Muestran claramente que la hidrólisis de los 2
últimos enlaces es claramente más lenta que las demás. El efecto
inhibidor del fosfato que se acumula en el medio sería en parte el
responsable (figuras 9, 10, 11).
En este estudio, se han descrito las vías de
hidrólisis del ácido fítico mediante la fitasa de D.
Castellii. El análisis mediante cromatografía y mediante RMN
homo y heteronuclear ha permitido determinar sin ninguna ambigüedad
la estructura de los principales y de los diferentes Ins Ps
formados: Ins P5, Ins P4, Ins P3, Ins P2, Ins P1. La secuencia de
desfosforilación se presenta en la figura 5. Se puede resumir en la
forma 3/4/5/6/1,2. A pesar de que los isómeros de la posición 1 y
3, y 4 y 6 no se puedan discernir mediante RMN, se ha podido
determinar sin embargo gracias a los análisis en HPIC que los grupos
fosfato en posición 3 y después en 4 son los dos primeros en ser
hidrolizados. La cinética seguida por RMN confirma esta observación.
Las hidrólisis siguientes se sitúan sobre el fosfato adyacente al
grupo hidroxilo. La hidrólisis de los 2 últimos enlaces fosfato Ins
(1, 2) P2 se realiza simultáneamente. Sin embargo, la velocidad de
hidrólisis de la posición 2 parece dos veces más baja que la de la
posición 1 (o 3). Por último, sea cual sea el método utilizado
(enzimático, HPLC o RMN), la obtención cuantitativa de inositol al
final de la hidrólisis muestra que los seis enlaces fosfato son
hidrolizados por la fitasa de la levadura D. Castellii. Esta
fitasa se puede clasificar como una 3-fitasa (EC
3.1.3.8) parecida a numerosas fitasas de microorganismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas, plásmidos y cebadores utilizados en
este estudio se describen en la tabla 7.
La levadura Debaryomyces Castellii CBS
2923 se cultiva en Erlenmeyer llenos a 1/10ª de su volumen en
condiciones aerobias y a 28ºC. Durante la extracción del ADN
genómico, la cepa se cultiva en presencia de 500 ml de medio YPD o
de 20 ml de medio MSA.
La cepa E. coli XL1-Blue
MRF', utilizada durante la amplificación del ADN, se cultiva en
Erlenmeyer llenos a 1/10ª de su volumen en condiciones aerobias y a
37ºC, en presencia de medio Luria-Bertani (Sambrook;
J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a
laboratory manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York, USA) adicionado con ampicilina (100 mg/l) o
con medio Luria-Bertani "low salt" (NaCl 5
g/l) cuyo pH se ajusta a 7,5 con sosa y adicionado con zeocina (25
mg/l). Durante el cultivo en medio sólido, los medios anteriores
son adicionados con 15 g/l de Bacto agar.
La cepa de levadura Pichia Pastoris X33
se utiliza para la expresión heteróloga del gen que codifica la
fitasa. Los transformantes son seleccionados, en condiciones
aerobias, a 28ºC, sobre medio gelosado YPDS, adicionado con zeocina
(100 mg/l).
El vector pGEM-T (Promega) se
utiliza para la clonación en E. coli de fragmentos
amplificados mediante la reacción de polimerización en cadena (RPC)
y para la secuenciación del ADN. El marcador de selección de este
plásmido es el gen de resistencia a la ampicilina. Se utilizan dos
vectores de expresión, pPICZaB y pGAPZaB (tabla 7). El vector
pPICZaB contiene el promotor del gen del alcohol (metanol) oxidasa
(AOX1) que permite obtener fuertes índices de expresión del gen de
interés en P. Pastoris y la expresión de la proteína
recombinante es inducible por el metanol (Cereghino, J. L. y Cregg,
J. M. (2000) Heterologous protein expression in the methylotrophic
yeast Pichia pastoris. Fems Microbiology Reviews 24,
45-66). El vector pGAPZ\alphaB contiene el
promotor del gen de la
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa (GAP) que permite una expresión constitutiva y de
fuerte índice de la proteína recombinante en P. Pastoris
(Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V. y Cregg,
J. M. (1997) Isolation of the Pichia pastoris
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene
186, 37-44). Estos dos vectores poseen asimismo las
secuencias necesarias para la replicación en las bacterias. La
selección de los clones transformados por estos vectores se basa en
un marcador de selección, la zeocina, y esta selección es aplicable
al mismo tiempo en P. Pastoris y en E. coli. Además,
las proteínas recombinantes son expresadas en función con la
secuencia señal del factor \alpha de S. cerevisiae.
Se cultiva D. Castellii CBS 2923 en
presencia de medio YPD (extracto de levaduras 10 g/l, peptona 20
g/l, glucosa 20 g/l) o de medio MSA-B (véase en el
ejemplo 1 Materiales y métodos) tamponado a pH 5,4 mediante un
tampón ftalato 100 mM. Después de la transformación, los
transformantes P. Pastoris X33 se seleccionan sobre medio
YPDS sólido (extracto de levaduras 10 g/l, peptona 20 g/l, glucosa
20 g/l, sorbitol 1 M, Bacto agar 20 g/l). Durante la selección de
los clones productores en medio gelosado, los transformantes P.
pastoris son cultivados sobre un medio sólido sintético que
contiene glucosa o metanol al 0,5%, Bacto agar 20 g/l, sales FM21
100 ml/l (FM21 10X: CaSO_{4}2H_{2}O 1,5 g/l, K_{2}SO_{4}
23,8 g/l, MgSO_{4}7H_{2}O 19,5 g/l, KOH 6,5 g/l,
H_{3}PO_{4} 85% 3,5% v/v), oligoelementos PTM1 10 ml/l (PTM1
100X: ZnCl_{2} 2 g/l, Fe(SO_{4})7H_{2}O 6,5
g/l, CuSO_{4}5H_{2}O 0,6 g/l, MnSO_{4}H_{2}O 0,3 g/l, KI 10
mg/l, H_{3}BO_{4} 2 mg/l, Na_{2}MoO_{4} 20 mg/l,
H_{2}SO_{4} 96% 0,2%), (NH_{4})_{2}SO_{4} 4 g/l,
H2PO_{4}NH4 12 g/l y D-biotina 80 \mug/l,
tamponado a pH 5,4 mediante un tampón
tartrato-fosfato 200 mM. Durante la selección de
los clones productores en medio líquido, los transformantes P.
pastoris son cultivados en presencia de un medio sintético que
contiene una fuente de carbono (glucosa 10 g/l, glicerol 20 g/l o
metanol 3,9 g/l), sales FM21 100 ml/l, oligoelementos PTM1 10 ml/l,
(NH_{4})_{2}SO_{4} 4 g/l, H_{2}PO_{4}NH_{4} 12
g/l y D-biotina 80 \mug/l, tamponado a pH 5,4
mediante tampón tartrato-fosfato 200 mM. Durante los
cultivos en biorreactor, los precultivos se realizan en presencia
de medio YMPG (extracto de levaduras 3 g/l, extracto de malta 3
g/l, peptona 5 g/l, glucosa 10 g/l) y después en presencia de medio
sintético: glicerol 40 g/l, sales FM21 100 ml/l, oligoelementos
PTM1 10 ml/l, (NH_{4})_{2}SO_{4} 4 g/l,
H_{2}PO_{4}NH_{4} 12 g/l y D-biotina 80
\mug/l, tamponado a pH 5,4 mediante tampón
tartrato-fosfato 200 mM (Klein et al.,
1998). Los cultivos en modo batch se llevan a cabo en presencia de
medio sintético que contiene glicerol 40 g/l o glucosa 20 g/l,
sales FM21 100 ml/l, oligoelementos PTM1 10 ml/l y
D-biotina 80 \mug/l. Cuando se realiza un segundo
cultivo en batch, se añade una disolución de glicerol en el
fermentador de manera que se obtiene una concentración final de
glicerol de 40 g/l. Esta adición se realiza después del consumo
total del glicerol inicialmente presente, siendo esto visualizable
mediante un aumento brusco del índice de oxígeno disuelto. Los
cultivos en modo fed-batch son alimentados por un
medio sintético que contiene glicerol a 400 g/l, glucosa a 400 g/l
o metanol a 780 g/l, oligoelementos PTM1 50 ml/l y
D-biotina a 1 mg/l. El cultivo en modo continuo
está alimentado por un medio sintético: metanol 66,67 g/l, sales
FM21 50 ml/l, oligoelementos PTM1 25 ml/l y
D-biotina 500 \mug/l.
Las células procedentes de un cultivo de D.
castellii CBS 2923 en presencia de medio MSA son recogidas
después de 9 h de cultivo, centrifugadas (3.500 x g, 20 min., +4ºC)
y lavadas en 10 ml de agua esterilizada. Las células se resuspenden
a continuación en 200 \mul de tampón de lisis
(Tris-HCl 10 mM, pH 8, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM,
triton X-100 2% v/v, SDS 1% p/v), 200 \mul de
bolas de vidrio (diámetro 0,45-0,5 mm) y 200 \mul
de mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25/24/1; v/v/v). La
lisis de las células se lleva a cabo por agitación vigorosa durante
3 minutos y después se añaden 200 \mul de tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). La disolución se
centrifuga (8.000 x g, 5 minutos, +4ºC). Las proteínas se extraen de
la fase acuosa con un volumen de mezcla de cloroformo/alcohol
isoamílico (24/1; v/v), y se centrifugan (8.000 x g, 2 minutos,
+4ºC). El ADN genómico se precipita con 1 ml de etanol absoluto
(-20ºC), se centrifuga (12.000 x g, 5 minutos, +4ºC) y se vuelve a
poner en disolución en 370 \mul de tampón TE. El ARN se elimina
mediante incubación durante 15 minutos a +37ºC en presencia de 75
\mug/ml de ARNasa A. Después, el ADN se precipita con etanol
absoluto (-20ºC), se resuspende en 50 \mul de tampón TE y se
conserva a -20ºC.
Las células procedentes de un cultivo de D.
castellii CBS 2923 en presencia de 500 ml de medio YPD se
recogen durante la fase exponencial, se centrifugan (6.000 x g, 15
minutos, +4ºC) y se lavan en 40 ml de agua estéril. El residuo de
vuelve a poner en disolución en 3,5 ml de disolución SCE (sorbitol 1
M, citrato de sodio 0,1 M, EDTA 60 mM) que contiene 40 \mul de
ditiotreitol 2 M y 5 mg (5.000 unidades) de zimolasa
100-T (ICN Biomedical, 32093) y se incuba durante 1
hora a +37ºC. Se añaden a continuación 7 ml de la disolución de
lisis (Tris-HCl 0,5 M, pH 6,5, sarcosil sodio 3,2%
p/v, EDTA 0,2 M, proteinasa K 100 \mug/ml (Roche Diagnostics,
Meylan, Francia) y la suspensión se incuba durante 15 minutos a
+65ºC, y después se enfría rápidamente hasta temperatura
ambiente.
Se prepara un gradiente de sacarosa vertiendo
sucesivamente en un tubo de ultracentrifugación 11 ml de sacarosa
al 20% p/v, 11 ml de sacarosa al 15% p/v y después 3 ml de sacarosa
al 50% p/v. La suspensión celular lisada se deposita delicadamente
sobre el gradiente y después se ultracentrifuga durante 3 horas a
26.000 rpm a +20ºC (ultracentrifugadora Centrikon
T-1075, Kontron Instrument). El ADN, que forma un
velo en el gradiente, se recupera con una pipeta, se precipita con
etanol y se resuspende en 100 \mul de tampón TE
(Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8). El ARN se
elimina mediante incubación durante 3 horas a +37ºC en presencia de
50 \mug/l de ARNasa A. El ADNg se precipita nuevamente con etanol
y después se resuspende en 200 \mul de tampón TE y se conserva a
-20ºC.
Una reacción de polimerización en cadena (RPC)
se realiza utilizando como matriz el ADNg de D. castellii
CBS 2923, obtenido mediante el método de extracción rápida de ADN
genómico. El par de cebadores
phyt-Nter-for/phyt-pep1-rev
se dibuja a partir de secuencias de la proteína limitando al máximo
el índice de degenerescencia (tabla 7). El ADN se amplifica gracias
a la polimerasa Taq (Promega) con la ayuda del termociclador
Minicycler (MJ Research). Después de una primera desnaturalización
del ADNg durante 3 minutos a +94ºC, la amplificación se lleva a cabo
en 30 ciclos según el programa de temperatura siguiente: 1 minuto
de desnaturalización a +94ºC, 1 minuto de hibridación a +45ºC y
después 1 minuto de polimerización a +72ºC. Estos ciclos son
seguidos de un intervalo de 10 minutos a +72ºC.
La secuencia completa del gen se obtiene
utilizando la técnica de "paseo genómico" (Universal Genome
Walker Kit, BD Biosciences) según las instrucciones del proveedor.
El ADNg de D. castellii CBS 2923 (2,5 \mug), extraído
mediante el método "preparación de ADN líquido de alto peso
molecular de levadura", es digerido durante 16 horas a +37ºC por
cuatro enzimas de restricción separadamente (50 unidades de
DraI, EcoRV, PvuII o StuI). Cada
fragmento presenta así unos extremos libres. Los fragmentos son
purificados mediante extracción con fenol/cloroformo y se
precipitan con etanol. Los fragmentos se unen después a los
adaptadores suministrados con el kit de "paseo genómico"
durante 16 horas a +16ºC. La ligación se detiene mediante
calentamiento a +70ºC durante 5 minutos y después adición de 9
volúmenes de tampón TE. Cuatro bancos son así construidos y
denominados "banco DraI, EcoRV, PvuII o
StuI". Un primer ciclo de paseo genómico se realiza
utilizando cada banco como matriz y un par de cebadores que
comprenden el cebador AP1 específico del adaptador y los cebadores
5phyt-spe-1/3phyt-spe-1
específicos del gen (tabla 7). La eficacia de este primer ciclo de
RPC se verifica sobre gel de electroforesis de agarosa LE 1,5%. La
mezcla, procedente de la primera RPC, se diluye 50 veces y sirve de
matriz para el segundo ciclo de RPC. Este segundo ciclo se realiza
utilizando el cebador AP2 específico del segundo adaptador y los
cebadores
5phyt-spe-2/3phyt-spe-2
específicos del gen (tabla 7). Los fragmentos así amplificados son
separados sobre gel de electroforesis de agarosa 1,2% de bajo punto
de fusión, purificados con la ayuda de un kit "GeneClean" y
clonados en el vector pGEM-T con el fin de ser
secuenciados. Un segundo ciclo de paseo genómico ha sido necesario
para obtener la secuencia completa del gen. Para cada banco, dos
ciclos de amplificación por RPC son realizados como anteriormente
utilizando los cebadores
AP1/3bisphyt-spe-1 para el primer
ciclo y AP2/3bisphyt-spe-2 para el
segundo ciclo (tabla 7).
De manera que se clone el gen phytDc en
P. pastoris con la ayuda de los vectores de expresión
pPICZ\alphaB y pGAPZ\alphaB, la secuencia completa del gen se
amplifica mediante RPC. Esta RPC se realiza utilizando como matriz
el ADNg de D. castellii CBS 2923, extraído mediante el método
de extracción rápida de ADN genómico, con la ayuda de la polimerasa
Pfu Turbo (Stratagene). Durante esta amplificación, el par de
cebadores utilizado,
phytDc-PstI-for y
phytDc-XbaI-rev (tabla 7), ha
permitido la creación de sitios de restricción PstI y
XbaI respectivamente en 5' y en 3' del gen. Después de una
primera desnaturalización del ADNg durante 2 minutos a +95ºC, la
amplificación se efectúa en 25 ciclos según el programa de
temperatura siguiente: 30 s de desnaturalización a +95ºC, 30 s de
hibridación a +55ºC y después 1,5 minutos de polimerización a +72ºC.
Estos ciclos son seguidos de un intervalo de 10 minutos a +72ºC. La
ausencia de mutación se verifica mediante secuenciación.
Las células de E. coli
XL1-blue MRF' son transformadas mediante choque
térmico tal como se ha descrito por Sambrook et al.
(Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989) Molecular
cloning: a laboratory manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York, USA). Las células de P.
pastoris X33 son transformadas mediante electroporación (Manual
de instrucción Invitrogen pPICZaA, B y C, versión E o manual de
instrucción Invitrogen pGAPZaA, B y C, versión F, Invitrogen Ltd,
UK). Las transformaciones se llevan a cabo con la ayuda de un
aparato Gene Pulseur (Biorad) ajustado a un voltaje de 1,5 kV y una
capacitancia de 25 \muF y un Pulse Controller (Biorad) ajustado a
200 ohms.
Los oligonucleótidos utilizados como cebadores
de RPC han sido sintetizados por la compañía
MWG-Biotech (Alemania). La microsecuenciación de la
secuencia N-terminal y de péptidos internos de la
fitasa ha sido efectuada con la ayuda de un microsecuenciador de
proteínas (Beckman/porton LF 3000) utilizando los agentes reactivos
y los métodos recomendados por el fabricante. El microsecuenciador
estaba conectado directamente a un sistema cromatográfico de tipo
RP-HPLC (Beckman 125S) con un detector UV a 268 nm
(Beckman 166). Los datos se tratan con el programa Gold V8.20. La
búsqueda de alineaciones locales entre unas secuencias nucleotídicas
o proteicas y unos bancos de datos generalistas se efectúa con los
programas BLAST2 (Basic Local Alignment Search Tool) y FASTA. La
comparación entre dos secuencias se lleva a cabo con los programas
LALIGN y LFASTA, nucleico o proteico, del package FASTA. Estos
programas están disponibles en el servidor de Infobiogen
(http://www.infobiogen.fr). La predicción de péptido señal y el
cálculo de los pHi teóricos a partir de secuencias proteicas se
efectúan con el programa Antheprot 2000 V5.2 release 1.1.6. Los
sitios de glicosilación se predicen con la ayuda de los servidores
NetNGlyc 1.0, DictyOGlyc 1.1 et NetOGlyc 2.0, Center for Biological
Sequence Analysis, Technical University of Denmark.
Los transformantes P. pastoris pGAPphyt
son cultivados a +28ºC en presencia de 5 ml de medio sintético que
contiene 10 g/l de glucosa. Después de 48 h, los cultivos se
centrifugan durante 5 minutos a 1.676 x g. Los sobrenadantes
se conservan a +4ºC. Los transformantes P. pastoris pPICphyt
son cultivados a +28ºC en presencia de 5 ml del mismo medio que
contiene 20 g/l de glicerol en lugar de glucosa. Después de 48 h,
los cultivos se centrifugan durante 5 minutos a 1.676 x g. La
producción de recPhyt se induce añadiendo 2,5 ml del mismo medio
que contiene 3,9 g/l de metanol en lugar de glucosa en los tubos que
contienen las células. Después de 24 horas de inducción, los
cultivos se centrifugan durante 5 minutos a 1.676 x g. Se
añaden 2,5 ml del mismo medio que contiene 3,9 g/l de metanol en
lugar de glucosa en los tubos que contienen las células. Después de
24 horas de incubación, los cultivos son centrifugados durante 5
minutos a 1.676 x g. Los sobrenadantes se conservan a +4ºC.
Estos cultivos se llevan a cabo en unos tubos estériles de 13
ml.
Los precultivos se llevan a cabo en presencia de
medio YMPG en Erlenmeyer llenos a 1/10ª de su volumen. Éstos se
incuban a +28ºC bajo agitación (80 oscilaciones por minutito,
amplitud 7 cm) durante 24 horas. Los precultivos se realizan a
continuación en presencia de medio sintético durante 24 horas.
Los cultivos en modo batch,
fed-batch y continuo se llevan a cabo en unos
fermentadores Applikon de 1 ó 3 l (Holanda). El pH se ajusta a 4
mediante unas adiciones automáticas de NH_{3} 16% (v/v) o de
H_{2}SO_{4} 2 N, y la temperatura se mantiene a +28ºC. Con el
fin de evitar la formación de espuma, se añade
anti-espuma Biospumex 153K (Cognis Dusseldorf,
Alemania) durante el cultivo: anti-espuma al 5%
(v/v) para los cultivos en modo fed-batch o al 1%
(v/v) para los cultivos en modo continuo. La presión parcial en
oxígeno disuelto se mide con la ayuda de una sonda Applisens
(Holanda) y se mantiene a un valor superior a 30% mediante la
regulación de la agitación y de la ventilación. La adquisición de
los datos y el control de los cultivos se efectúan gracias al
programa BioExpert de Applikon.
Véase el ejemplo 1, cultivo en fermentador.
Las concentraciones celulares se miden mediante
densidad óptica (DO) con la ayuda de un espectrofotómetro (DU530,
Beckman Instruments Inc., Fullerton, CA, USA) a 600 nm.
Una unidad de DO corresponde a 0,462 g de
materia seca/l (g MS/l) sobre glicerol, 0,442 g MS/l sobre metanol
y 0,491 g MS/l sobre glucosa.
Véase el ejemplo 1, Materiales y Métodos 3.
Véase el ejemplo 1, Materiales y Métodos 4.
Véase el ejemplo 1, Materiales y Métodos
7.2.
La actividad fitásica se detecta utilizando el
método de Kim et al. (Kim, Y. O., Kim, H. K., Bae, K. S.,
Yu, J. H. y Oh, T. K. (1998) Purification and properties of a
thermostable phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme Microb.
Technol. 22, 2-7) modificado para la revelación
específica de las fosfatasas en gel de poliacrilamida. Los
transformantes P. Pastoris se cultivan en condiciones
aerobias a +30ºC sobre un medio sintético sólido que contiene 0,5%
de glucosa o de metanol según el vector utilizado. Estos cultivos se
incuban durante 3 días. En el caso de los clones P. Pastoris
transformados con el vector pPICZaB modificado, se añaden 50 \mul
de metanol diariamente en la tapa de las cajas de Petri a partir del
tercer día. La disolución de revelación (Bacto agar 10 g/l,
\alpha-naftilfosfato 2 g/l, FastGarnetGBC 1 g/l,
fitato de sodio 0,92 g/l, tamponado a pH 5,5 mediante tampón
acetato de sodio 0,25 M) se prepara justo antes de su utilización,
se enfría a 45ºC y se vierte en capa fina sobre las colonias. La
coloración (marrón, rojo oscuro) de los clones productores de
fitasa aparece inmediatamente.
Véase el ejemplo 1, Materiales y Métodos
7.3.
La determinación de la actividad se efectúa
mediante la realización de cinéticas enzimáticas. El medio de
reacción (2 volúmenes en total), tamponado a pH 5,5 (acetato de
sodio 125 mM) contiene 6 mM de p-nitrofenilfosfato
y el extracto enzimático diluido o no (1 volumen). Después de
diferentes duraciones de incubación a temperatura ambiente, la
reacción se detiene mediante la adición de hidróxido de sodio 0,3 N
(1 volumen) para basificar el medio y revelar la coloración. La
absorbancia se mide a 450 nm con la ayuda de un espectrofotómetro
lector de microplaca Sanofi Pasteur PR 2100. La unidad enzimática
(U) se define como la cantidad de enzima que libera un micromol de
p-nitrofenol por minuto a partir de la disolución de
p-nitrofenilfosfato en unas condiciones definidas:
temperatura ambiente, pH 5,5. Una recta de calibrado ha sido
previamente establecida con p-nitrofenilfosfato
(0,012-0,12 \mumol).
Véase el ejemplo 1, 7.5 y 7.6.
Un péptido interno y el péptido
N-terminal de la fitasa pura de D. Castellii
han sido secuenciados. A partir de estas secuencias peptídicas, se
dibujan unos cebadores de RPC, limitando al máximo el índice de
degenerescencia (tabla 7). Se realiza una RPC utilizando como matriz
el ADNg de D. Castellii CBS 2923. Un fragmento de
aproximadamente 300 pares de bases (pb) ha podido así ser
amplificado. De manera que se clone la secuencia completa del gen
de la fitasa de D. Castellii CBS 2923, se ha elegido utilizar
la técnica de "paseo genómico". A partir de la secuencia del
fragmento de 300 pb obtenido anteriormente, se sintetizan unos
cebadores que corresponden a los extremos del fragmento y que
permiten amplificar las secuencias adyacentes de este fragmento
(tabla 7). Una RPC se realiza utilizando los bancos de ADNg de D.
Castellii CBS 2923 como matrices. El primer ciclo ha permitido
amplificar un fragmento de aproximadamente 1.600 pb corriente
arriba y de aproximadamente 1.100 pb corriente abajo de la secuencia
de 300 pb a partir de los bancos EcoRV y PvuII
respectivamente. Así, se ha podido reconstituir un fragmento de
aproximadamente 3.000 pb que comprende una fase abierta de lectura
(ORF) de 1.325 pb truncada en 3'. Se ha realizado un segundo ciclo
de RPC utilizando nuevos cebadores dibujados a partir del extremo
3' del fragmento obtenido durante la primera RPC. Esta RPC ha
permitido amplificar un fragmento de aproximadamente 100 pb a partir
del banco EcoRV. Se ha podido así reconstituir la fase
abierta de lectura de 1.386 pb. La secuencia proteica deducida de
esta ORF contiene los dos péptidos secuenciados anteriormente, lo
cual permite confirmar que este gen corresponde al gen que codifica
la fitasa de D. Castellii CBS 2923 (véase la SEC ID nº 1).
Con el fin de verificar la secuencia, se han sintetizado unos
cebadores que corresponden a los extremos del gen (tabla 7). El gen
completo ha sido amplificado mediante RPC y la secuenciación ha
confirmado los resultados obtenidos anteriormente.
Gracias a los experimentos de "paseo
genómico", un fragmento de 2.990 pb ha podido ser reconstituido.
Este fragmento contiene una fase abierta de lectura de 1.386 pb
denominada "secuencia phytDc". La secuencia proteica de
461 aminoácidos correspondiente contiene varios motivos (SEC ID nº
2). Un motivo RHGERYP corresponde a la secuencia de consenso
RHGXRXP presente en el sitio activo de numerosas fosfatasas ácidas
de alto peso molecular. La secuencia presenta asimismo el motivo HD
en la parte C-terminal, motivo presente en numerosas
secuencias de fitasas. La secuencia N-terminal
empieza a partir del segundo aminoácido de la proteína deducida, lo
cual parece indicar que esta proteína, a pesar de ser excretada, no
presenta ningún péptido señal. Esta observación está apoyada por la
obtención de un resultado negativo durante la búsqueda de un sitio
potencial de escisión de péptido señal con la ayuda del programa
Antheprot. La proteína deducida tiene una masa molecular estimada
de 51,2 kDa, parecida a la masa obtenida experimentalmente (53/55
kDa) por espectrometría de masa a partir de la proteína expresada
en D. Castellii CBS 2923, purificada y desglicosilada
mediante la endoglicosidasa H. La diferencia de masa se puede
explicar por la presencia de residuos de N-acetil
glucosamina o de motivos de O-glicosilación que no
están eliminados por la endoglicosidasa H. El análisis de la
secuencia proteica muestra la presencia de 9 sitios potenciales de
N-glicosilación y 4 sitios potenciales de
O-glicosilación. El pHi de esta proteína se estima
en 4,3. La búsqueda de homologías con unos bancos de datos muestra
que la fitasa de D. Castellii CBS 2923 presenta de 21 a 36%
de homologías con diversas fitasas de origen de levadura o fúngico.
Los tamaños de las secuencias de estas fitasas son muy parecidos
(440-480 aminoácidos) pero la fitasa de D.
Castellii CBS 2923 no se alinea perfectamente sobre toda la
longitud de su secuencia. La secuencia phytDc comparte,
sobre toda su longitud, 69,2% de homología con la secuencia de la
fitasa de S. Occidentalis. Como la secuencia del gen que
codifica la fitasa de S. Occidentalis se ha obtenido a
partir del ADN complementario, esta alineación permite pensar que el
gen que codifica la fitasa de D. Castellii no posee ningún
intrón. Por otro lado, esta secuencia posee unas homologías con unas
fosfatasas.
El gen phytDc ha sido amplificado
mediante RPC e insertado en los vectores de expresión pPICZaB y
pGAPZaB. Los transformantes han sido seleccionados en medio YPDS
que contiene zeocina. El índice de transformación es de 10^{2}
transformantes por \mug de ADN. Los clones obtenidos con el vector
pPICZ\alphaB se denominan "clones PIC" y los clones
obtenidos con el vector pGAPZaB se denominan "clones GAP". Para
cada transformación, se han extraído 100 clones al azar y su
producción de fitasa recombinante (recPhyt) ha sido evaluada en
medio gelosado. Después de la revelación, los clones más
productores presentan un halo marrón alrededor de las colonias. El
96% de los clones PIC y 66% de los clones GAP son productores. Entre
los clones más productores, 10 clones GAP y 10 clones PIC han sido
ensayados sobre un medio sintético en Erlenmeyer. Para cada clon, se
ha determinado la relación entre la biomasa (evaluada mediante la
medición de la D.O.) y la actividad fitásica en el sobrenadante de
cultivo (medida mediante la hidrólisis del p-NPP).
La relación varía de 0 a 0,48 entre los clones PIC y de 1,28 a 6,07
para los clones GAP. En estas condiciones de cultivo, los clones GAP
son los mejores productores. Según Waterham et al.
(Waterham, H. R., Digan, M. E., Koutz, P. J., Lair, S. V. y Cregg,
J. M. (1997) Isolation of the Pichia pastoris
glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene
186, 37-44), el promotor GAP en cultivo sobre
glucosa parece más fuerte que el promotor AOX1 en cultivo sobre
metanol, durante unos cultivos en Erlenmeyer.
Para completar esta fase de selección, los
clones PIC81 y PIC61 por un lado, y GAP29 y GAP66 por otro lado han
sido ensayados en un fermentador. Para los clones PIC, dos batch
sucesivos sobre glicerol (40 g/l) permiten obtener una biomasa
elevada antes de la inducción por el metanol (780 g/l) en modo
feed-batch. Para los clones GAP, un primer cultivo
batch sobre glucosa (20 g/l) está seguido de una fase de producción
en modo fed-batch sobre glucosa 400 g/l. El clon
PIC81 permite obtener una biomasa final de 81 g MS/l mientras que la
biomasa final del clon PIC61 es sólo de 65 g MS/l. Por el
contrario, los dos clones producen sustancialmente la misma
cantidad de recPhyt (100 U/ml). Los clones GAP presentan unos
crecimientos idénticos (100 g MS/l) al final del cultivo pero las
producciones obtenidas son de 11 U/ml para el clon GAP29 y 9 U/ml
para el clon GAP66. Las cepas recombinantes obtenidas producen
respectivamente 100 (cepas PIC) y 10 (cepas GAP) veces más de fitasa
que la cepa salvaje de D. Castellii CBS 2923. La producción
por los clones PIC81 y GAP29 ha sido optimizada en un
fermentador.
La producción de recPhyt ha sido estudiada en
cultivo sobre glucosa (400 g/l), glicerol (400 g/l) y metanol (780
g/l) en modo fed-batch. Los resultados se presentan
en la tabla 8.
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Para los dos primeros sustratos, un solo batch
sobre glicerol (40 g/l) permite alcanzar 20 g/l de biomasa y una
velocidad específica de crecimiento de 0,2 h^{-1}. Según la
duración de la fase estacionaria antes del
fed-batch, la producción de recPhyt es diferente:
próxima a 7 U/ml, es decir, 340 U/g MS para una fase estacionaria
de 12 h, próxima a 5,5 U/ml, es decir, 275 U/g MS para una fase
estacionaria de 3 h. La producción en modo
fed-batch sobre glucosa y glicerol con una velocidad
específica de crecimiento impuesta de 0,01 h^{-1} permite
alcanzar 55 g/l de biomasa, y una producción de fitasa de 16,5 U/ml,
es decir, 280 U/g MS. Durante el cultivo fed-batch
sobre metanol después de dos batch sobre glicerol (40 g/l) y una
velocidad específica de crecimiento impuesta de 0,01 h^{-1}, la
biomasa alcanzada es de 84 g/l, y la producción de fitasa de 14,5
U/ml, es decir, 112 U/g MS. La producción en modo
fed-batch sobre glucosa y glicerol con una velocidad
específica de crecimiento impuesta de 0,04 h^{-1} permite
alcanzar 80 g/l de biomasa, una producción de fitasa de 16,5 U/ml,
es decir, 200 U/g MS.
En el caso en el que la producción de fitasa
está bajo el control del promotor GAP, la glucosa y el glicerol son
mejores sustratos para la producción de fitasa recombinante con
respecto al metanol, más favorable para el crecimiento.
La producción por el clon PIC81 ha sido
estudiada en modo fed-batch (figura 6 y tabla 9) y
en modo continuo (figura 6 y tabla 9).
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En cultivo fed-batch, se han
impuesto dos valores de velocidad específica de crecimiento (\mu)
(0,01 h^{-1} y 0,03 h^{-1}). La biomasa obtenida es 1,5 veces
más elevada con \mu = 0,03 h^{-1} (82 g/l) que con \mu = 0,01
h^{-1} (52 g/l). La producción de fitasa se efectúa en dos fases
(tabla 9). Para una velocidad específica de crecimiento impuesta de
0,01 h^{-1}, una primera fase conduce a la producción de 28,8 g/l
de biomasa con una producción de fitasa de 1.105 U/g MS. Durante la
segunda fase, se obtienen 22,9 g/l de biomasa y la producción de
fitasa alcanza 2.342 U/g MS, es decir, 107 U/ml. Unos resultados
similares se obtienen con \mu = 0,03 h^{-1}, en el que la
producción de fitasa pasa de 472 U/g MS durante la primera fase a
880 U/g MS durante la segunda fase, es decir, 64 U/ml. El aumento de
la velocidad específica de crecimiento es más favorable para el
crecimiento celular que para la producción de fitasa recombinante.
En cultivo continuo, se han impuesto cuatro índices de dilución
(tabla 9). Para unos valores de índice de dilución superiores a
0,053 h^{-1}, la biomasa en equilibrio es de 27 g/l mientras que
es sólo de 21,6 g/l a un índice de dilución de 0,032 h^{-1}. Tal
como en el cultivo en modo fed-batch, el aumento del
índice de dilución es favorable para la producción de biomasa en
detrimento de la producción de proteínas recombinantes. Los valores
máximos, 2.700 U/g MS, es decir, 57,7 U/ml, se obtienen para un
índice de dilución de 0,032 h^{-1}. La comparación de la
producción de fitasa por un sistema inducible (promotor AOX1, clon
PIC81) y por un sistema constitutivo (promotor GAP, clon GAP29)
muestra que el promotor AOX1 es claramente superior al promotor GAP.
La cepa PIC81 ha permitido obtener 107 U/ml de fitasa recombinante,
es decir, 7 veces más que la cepa GAP29 (16 U/ml). La producción
específica es de respectivamente 2.700 U/g MS (PIC81) y 340 U/g Ms
(GAP29), es decir, 100 y 10 veces superior a la de la cepa D.
Castellii.
El sobrenadante obtenido después de uno de los
cultivos en modo fed-batch del clon PIC81 ha sido
purificado en una etapa tal como se ha descrito en la parte
Materiales y Métodos. La actividad fitásica específica es de 101
U/mg de proteínas en el extracto bruto, y de 182 U/mg de proteínas
en el extracto purificado. Así, el factor de purificación es de
1,8. Este valor relativamente bajo sugiere que la fitasa
recombinante es la proteína mayoritaria en el extracto bruto. Esta
hipótesis se ha confirmado realizando una electroforesis
SDS-PAGE. Sobre el gel, la banda que corresponde a
la fitasa recombinante representa 60% de las proteínas totales. Por
otra parte, después de la purificación, se observa una sola banda
que confirma así la purificación con homogeneidad de la
proteína.
La actividad específica obtenida después de la
purificación es superior a la obtenida durante la expresión de la
fitasa de Aspergillus fumigatus en P. pastoris (43
U/mg de proteínas) (Rodriguez, E., Mullaney, E. J. y Lei, X. G.
(2000) Expression of the Aspergillus fumigatus phytase gene
in Pichia pastoris and characterization of the recombinant
enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 268,
373-378).
RecPhyt es activa para unos valores de pH
comprendidos entre 2 y 6,5, y el valor óptimo se sitúa entre 4 y
4,5. La fitasa de D. Castellii CBS 2923 presenta unas
características similares.
Las determinaciones de la actividad fitásica a
diferentes temperaturas muestran que la fitasa recombinante es más
activa para las temperaturas elevadas, con un valor óptimo a +60ºC,
tal como la fitasa de D. Castellii CBS 2923. La mayoría de
los valores citados para la temperatura óptima son inferiores a
+45ºC, salvo para algunos hongos y levaduras tales como
Aspergillus ficuum (+58ºC) (Ullah, A. H. J. y Gibson, D. M.
(1987) Extracellular phytase (EC 3.1.3.8) from Aspergillus
ficuum NRRL 3135: purification and characterization. Prep.
Biochem. 17, 63-91), Aspergillus terreus
(+70ºC) (Yamada, K., Minoda, Y. y Yamamoto, S. (1968) Phytase from
Aspergillus terreus. 1. Production, purification and some
general properties of the enzyme. Agric. Biol. Chem. 32,
1275-1282) y S. castellii (+77ºC) (Segueilha,
L., Lambrechts, C., Boze, H., Moulin, G. y Galzy, P. (1992)
Purification and properties of the phytase from Schwanniomyces
castellii. J. Ferment. Bioeng. 74, 7-11). La
representación de Arrhenius permite calcular la energía de
activación de la reacción, E=37,9 kJ/mol. El estudio de la
desnaturalización térmica muestra que la fitasa recombinante es
estable para unas temperaturas inferiores a +67ºC y fuertemente
desnaturalizada para unas temperaturas superiores a +70ºC. La
energía de activación calculada gracias a la representación de
Arrhenius es de E=794,2 kJ/mol. La fitasa de D. Castellii
CBS 2923 presenta unas características de
termo-resistencia similares.
La fitasa recombinante sigue una cinética de
Michaelis-Menten, con un K_{m} de 0,24 mM y una
V_{m} de 137,8 U/mg sobre el fitato de sodio, y un K_{m} de
2,05 mM y una V_{m} de 274,6 U/mg sobre el p-NPP
(determinación gracias a la representación de
Lineweaver-Burk; datos no publicados). Así, la
enzima tiene una mayor afinidad para el fitato. La fitasa de D.
castellii CBS 2923 tiene unos valores de K_{m} similares.
Los productos principales de la degradación del
InsP_{6} son el
DL-Ins(1,2,4,5,6)P_{5} y el
DL-Ins(1,2,5,6)P_{4}. La fitasa
recombinante es por lo tanto una 3-fitasa. Por otra
parte, el cromatograma muestra que la degradación de los
InsP_{5}, InsP_{4}, InsP_{3} e InsP_{2} empieza antes
incluso de que el InsP_{6} se agote, y que existe una acumulación
del InsP_{3}. Esto sugiere que la fitasa recombinante tiene una
afinidad menos fuerte para InsP_{3} que para InsP_{4},
InsP_{5} e InsP_{6}. La fitasa de D. castellii CBS 2923
muestra los mismos perfiles cromatográficos.
<110> ADISSEO FRANCE SAS
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Fitasa de Debaryomyces
castellii
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> HL/SG/EP-49825
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR05.07336
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2005-08-07
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 18
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.2
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<210> 1
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<211> 2973
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<212> ADN
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<213> Debaryomyces castellii
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (782)..(782)
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<223> n es a, c, g, o t
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1538)..(2923)
\newpage
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<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 461
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<212> PRT
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<213> Debaryomyces castellii
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (4)..(4)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
natural
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (6)..(6)
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<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
natural
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<400> 3
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\hskip1cm
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<210> 4
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<211> 7
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<212> PRT
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<213> Debaryomyces castellii
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<400> 4
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\hskip1cm
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador
Phyt-Nter-for
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<400> 5
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\hskip1cm
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<210> 6
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador
Phyt-pepl-rev
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<220>
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<221> misc_feature
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<222> (3)..(3)
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<223> n es a, c, g, o t
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<400> 6
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\hskip1cm
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<210> 7
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador AP1
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<400> 7
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\hskip1cm
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<210> 8
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<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador AP2
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<400> 8
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<210> 9
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador
5phyt-spe-1
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<400> 9
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\hskip1cm
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<210> 10
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador
5phyt-spe-2
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<400> 10
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<210> 11
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<211> 27
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<221> misc_feature
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<223> Cebador
3phyt-spe-1
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<400> 11
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\hskip1cm
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<210> 12
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<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<223> Cebador
3phyt-spe-2
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<400> 12
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<220>
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<221> misc feature
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<223> Cebador
3bisphyt-spe-1
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\hskip1cm
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<223> Cebador
3bisphyt-spe-2
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<400> 14
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\hskip1cm
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<223> Cebador
phytDC-PstI-for
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<400> 15
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\hskip1cm
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<211> 33
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
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<223> Cebador
phytDC-XbaI-rev
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<400> 16
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\hskip1cm
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<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces castellii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Debaryomyces castellii
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (13)
1. Polipéptido, caracterizado porque
comprende un polipéptido seleccionado de entre los polipéptidos
siguientes:
- -
- el polipéptido de la SEC ID nº 2,
- -
- un fragmento del polipéptido de la SEC ID nº 2 que tiene una actividad fitasa,
- -
- un polipéptido que tiene una actividad fitasa y que presenta por lo menos 90% de identidad con el polipéptido de la SEC ID nº 2.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Polinucleótido que codifica para una
actividad fitasa, caracterizado porque se selecciona de entre
los polinucleótidos siguientes:
- -
- el polinucleótido cuya secuencia está comprendida entre la posición 1538 y la posición 2923 de la SEC ID nº 1,
- -
- un polinucleótido que codifica para un polipéptido según la reivindicación 1.
\vskip1.000000\baselineskip
3. Polinucleótido, caracterizado porque
tiene la secuencia de la SEC ID nº 1 o la secuencia complementaria
a la SEC ID nº 1.
4. Casete de expresión, caracterizado
porque comprende, en el sentido de la transcripción:
- -
- un promotor funcional en un organismo hospedante;
- -
- un polinucleótido según la reivindicación 2; y
- -
- una secuencia terminadora en el mismo organismo hospedante.
\vskip1.000000\baselineskip
5. Vector que comprende un polinucleótido según
una de las reivindicaciones 2 a 3, y/o un casete de expresión según
la reivindicación 4.
6. Procedimiento de transformación de un
organismo hospedante mediante la integración en dicho organismo
hospedante
- -
- de por lo menos un polinucleótido según una de las reivindicaciones 2 ó 3,
- -
- de un casete de expresión según la reivindicación 4, o
- -
- de un vector según la reivindicación 5,
siendo dicho organismo hospedante Pichia
Pastoris.
\vskip1.000000\baselineskip
7. Aditivo nutricional para animales,
caracterizado porque comprende un polipéptido según la
reivindicación 1.
8. Aditivo nutricional para animales,
caracterizado porque comprende un organismo hospedante según
la reivindicación 6 y/o un mosto de fermentación de un organismo
hospedante según la reivindicación 6.
9. Aditivo nutricional para animales según una
de las reivindicaciones 7 u 8, caracterizado porque se
presenta en forma líquida o en forma de polvo.
10. Alimento para animales, caracterizado
porque comprende una base nutricional para animales y un aditivo
nutricional para animales según una de las reivindicaciones 7 a
9.
11. Alimento para animales, caracterizado
porque comprende un polipéptido según la reivindicación 1, un
organismo hospedante obtenido mediante el procedimiento según la
reivindicación 6 y/o un mosto de fermentación de un organismo
hospedante obtenido mediante el procedimiento según la
reivindicación 6.
12. Utilización de un polipéptido según la
reivindicación 1 o de un organismo hospedante obtenido mediante el
procedimiento según la reivindicación 6 para la fabricación de un
aditivo nutricional para animales o de un alimento para
animales.
\newpage
13. Utilización de un polipéptido según la
reivindicación 1 o de un organismo hospedante obtenido mediante el
procedimiento según la reivindicación 6 para la hidrólisis del
myo-inositol hexakisfosfato en monofosfato
inorgánico, en myo-inositol de grado de
fosforilación inferior y en myo-inositol libre.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR0507336 | 2005-07-08 | ||
| FR2005007336 | 2005-07-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2350320T3 true ES2350320T3 (es) | 2011-01-21 |
Family
ID=43431265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES06778826T Expired - Lifetime ES2350320T3 (es) | 2005-07-08 | 2006-07-07 | Fitasa de debaryomyces castellii. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2350320T3 (es) |
-
2006
- 2006-07-07 ES ES06778826T patent/ES2350320T3/es not_active Expired - Lifetime
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