WO2012020162A1 - Uso de anticuerpos contra los receptores nk1, nk2 y/o nk3, en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Uso de anticuerpos contra los receptores nk1, nk2 y/o nk3, en el tratamiento del cáncer Download PDF

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Definitions

  • the present invention falls within the field of medicine. More specifically in molecular biology applied to medicine, pharmacology and oncology. Specifically, it is related to the use of therapeutic antibodies for the manufacture of drugs for the treatment of cancer in humans.
  • NK receptors neuropeptide receptors of substance P and tachykinins
  • types NKl, NK2 and NK3 are widely distributed in the body's cells. Its presence has been found in the central and peripheral nervous system of mammals, in the digestive system, in the circulatory system, in hematopoietic and inflammatory and / or immune response cells, as well as in soft tissues and especially, in the vascular endothelium. Many biological processes are currently known in whose regulation the NKl, NK2 and NK3 receptors are involved.
  • Substance P is a naturally occurring undecapeptide, which is produced in mammals whose sequence was described by Veber et al. (US 4,680,283) and which belongs to the tachykinin family. This family also includes other peptides such as Neurokinin A, Neurokinin B, Neuropeptide K, Gamma Neuropeptide and Hemokinin I, among others.
  • the involvement of substance P and other tachykinins in the etiopathogenesis of various diseases has been widely referred to in the scientific literature. In this sense, the action of tachykinins has been related to the etiopathogenesis of diseases of the human nervous system such as Alzheimer's Disease, Multiple Sclerosis, Parkinson's Disease, anxiety and depression (Barker R. et al., 1996 ; Kramer MS, et al. 1998).
  • tachykinins in the etiopathogenesis of various diseases with an inflammatory component such as rheumatoid arthritis, asthma, allergic rhinitis, inflammatory bowel diseases such as ulcerative colitis and Crohn's disease (Maggi CA, et al. 1993).
  • non-peptide antagonists of NK1 receptors have been developed as medications for the treatment of various disorders of the central nervous system such as depression, psychosis and anxiety (WO 95/16679, WO 95/1 8124, WO 95/23798 and WO 01/77100). It has been described that the use of selective NK1 receptor antagonists is useful in the treatment of nausea and vomiting induced by antineoplastic chemotherapeutics, as well as in the treatment of certain forms of urinary incontinence (Quartara L. et al., 1998; Doi T. et al., 1999).
  • astrocytes of the central nervous system express functional receptors for several neurotransmitters including NK1 receptors.
  • NK1 receptors include tachykinins and NK1 receptors.
  • EP 773026 refers to the use of non-peptide antagonists of the NK1 receptor for the treatment of cancers in mammals. Particularly in the treatment of small lung carcinomas, APUDOMAS (tumors of enterochromaffin cells that are predominantly located in the lining of the digestive tract. Its acronym means “Amine Precursors Uptake and Decarboxylation", use and decarboxylation of amines precursors), tumor neuroendocrine and small extra-pulmonary carcinomas.
  • WO 2001001922 describes the use of NK1 receptor antagonists for the treatment of adenocarcinoma and very specifically prostate carcinomas.
  • NK1 and NK2 antagonists such as CP-96341-1 -Pfizer-, MEN 1 1467, SR 48968 -Sanofi- and MEN 11420 -nepadutant- have demonstrated their effectiveness in blocking cell proliferation (Singh D et al., 2000; and Bigioni M. et al., 2005).
  • Non-peptide NK1 receptor antagonists induce apoptosis (cell death) in tumor cells of various tumors such as stomach carcinoma, colon carcinoma (Rosso M, et al., 2008) or melanoma (Mu ⁇ oz M , et al. 2010). Likewise, it has been described that these receptors are overexpressed in cancer cells.
  • Patent ES 2 246 687 claims the "use of non-peptide antagonists of NK1 receptors and substance P in the preparation of a pharmaceutical composition for the production of apoptosis in mammalian tumor cells" and therefore "for the treatment of Cancer".
  • Antibodies are peptide compounds with the ability to bind highly selectively to various organic molecules. Their binding to certain cellular receptors induces a modification in their activity, which can determine a modification in the usual physiological activities of cellular metabolism.
  • trastuzumab is an anti-ErbB2 / HER2 for breast cancer
  • cetuximab which is an anti-ErbBl / EGFR for colon cancer
  • bevacizumab which is a anti-VEGFR (growth factor receptor derived from vascular endothelium) for various types of cancers (Adams GP. et al., 2005).
  • Patent application WO / 2009/125039 claims the "Use of an antibody or a fragment thereof, specific against substance P, for the manufacture of a medicament for the therapeutic treatment of cancers expressing the NK1 receptor and / or a member of the ErbB receptor family, by direct administration to a mammal, including man. "
  • NF-Kb nuclear factor kappa B
  • TGFbeta transforming growth factor beta
  • SPARC from the English term "secreted protein, acidic, cysteine-rich"
  • TGFalfa transforming growth factor alpha
  • TGFbeta can inhibit the passage of precursor forms of CD 8+ lymphocyte to effector cell forms (Berzofsky JA, et al. 2004).
  • SPARC plays an important role related to tumor neoangiogenesis (Carmeliet P and RK
  • Neoangiogenesis is key factors for tumor progression (Hanahan D and Weinberg RA. Cell. 2000).
  • MMPs Metalloproteases
  • MMP-2 (Gelatinase A), MMP-3 (Stromelysin 1), MMP-7 (Matrilisin), MMP-9 (Gelatinase B), MMP-1 1 (Stromelysin 3 ), MMP-13 (Collagenase 3) and MMP-14.
  • Batimastat peptide-mimetic whose targets are MMP-1, 2,3,7 and 9
  • Marimastat peptide-mimetic whose targets are MMP-1, 2, 3,7,9yl2
  • Prinomastat not peptide-mimetic whose targets are MMP-2,3,9,13yl4
  • Bay-129566 non-peptide-mimetic whose targets are MMP-2, 3 and 9
  • Metastat tetracycline whose targets are MMP-2y9
  • BMS 275291 non-peptide-mimetic whose targets are MMP-2y9
  • Neovastat obtained from shark cartilage whose targets are MMP-l, 2,7,9,12yl
  • Marimastat has passed Phase I clinical trials in breast and lung cancer of the non-small cell type
  • Prinomastat has passed Phase I clinical trials in prostate cancer
  • Bay-129566 has passed Phase I clinical trials in various solid tumors
  • BMS 275291 has passed Phase I clinical trials in non-small cell lung cancer.
  • Marimastat has demonstrated efficacy in the treatment of advanced pancreatic cancer (Rosemurgy et al., Procc ASCO 1999), in advanced gastric cancer (Fieldng et al., Procc ASCO 2000), in glioblastoma (Puphanich et al., Procc ASCO 2001) and in breast cancer after first line of chemotherapy treatment (Sparano et al., Procc ASCO 2002).
  • NK1, NK2 and NK3 receptors are widely disseminated in the human body.
  • That said receptors are overexpressed in cancer cells, compared to normal non-cancer cells of the human organism.
  • patent ES 2 246 687 claims the use of non-peptide antagonists of NK1 receptors and substance P (and lists a specific number thereof, specifically). Therefore, it does not include antibodies or fragments derived therefrom, which are naturally, obviously and clearly peptide. This fact has allowed, for example, that the patent application WO / 2009/125039, which claims the use of an antibody or a fragment thereof, specific against substance P for therapeutic treatment of cancer, has been allowed to proceed. Since obviously, as stated in the previous section, the antibodies are of a peptide nature, which has prevented the existence of conflict between both patents (ES 2 246 687 and WO / 2009/125039).
  • NK1, NK2 and / or NK3 receptors has been demonstrated in the blood cells involved in the inflammatory and / or immune response, in the stromal matrix cells and in the vascularization cells that surround the cells Tumor It is known that stromal cells, blood cells involved in the inflammatory and / or immune response and the vascularization cells influence the evolution of the tumor.
  • the object of the present invention as well as the technical advantage which provides, is the use of an antibody or a fragment thereof directed against the NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors themselves, for the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for the therapeutic treatment of cancer by direct administration to A mammal, including man. Since such antibodies can modify the activity of these receptors, inducing apoptosis of tumor cells, changes in peritumoral tissues and modifications in the inflammatory and / or immune response, with beneficial therapeutic effects.
  • the object of the present invention is the use of an antibody or a fragment thereof specific against the NK1, NK2 and / or NK3 receptors of the cells, for the manufacture of a medicament for the therapeutic treatment of human cancer. , through the production of cell death or apoptosis of the tumor cells, the modification of the peritumoral microenvironment (consisting of stromal cells, stromal matrix and intra and peritumoral vascularization) and / or the inflammatory and / or immune response surrounding the tumor.
  • carcinomas especially lung carcinoma, breast carcinoma, digestive tract carcinomas, prostate carcinoma, thyroid carcinoma, uterine cervix carcinomas, endometrial carcinoma, ovarian carcinoma, bladder carcinoma of the urine and choriocarcinoma
  • adenocarcinomas especially of breast colon, ovary, pancreas, lung, digestive system
  • leukemias especially human lymphoblastic leukemia
  • lymphomas especially lymphomas of strain B, strain T, type Human Hodgkin and Burkitt type
  • glial excision neoplasms especially neuroectodermal neoplasms, Edwing human sarcoma, other sarcomas (such as rhabdomyosarcoma and osteosarcoma) and other embryonic origin neoplasms such as neuroblastoma, medulloblastoma and nephroblastoma.
  • Antibodies directed against NK1, NK2 and / or NK3 receptors constitute highly specific antagonists against said receptors, which modify or block their activity and induce death and apoptosis of tumor cells, as well as changes in stromal cells. and the stromal matrix, which surrounds said tumor cells, changes in the cells involved in inflammation and immunity, in addition to changes in the vascularization of the tumor and peritumoral areas (which constitute the tumor microenvironment).
  • these changes of the tumor microenvironment can be summarized in the modification of the immunophenotype of fibroblasts (especially in relation to the production of metalloproteases, NF-Kb, TGFbeta and SPARC - key elements in the progression of tumors-), the modification of immunophenotype of inflammatory cells (for example, TGFbeta and NF-kB - which are also of great importance in tumor progression-) and inhibition of vascular endothelial cell proliferation (neoangiogenesis is a key determinant of progression of tumors).
  • Antibodies against NK1, NK2 and NK3 receptors induce apoptosis in various commercial tumor cell lines.
  • NK1, NK2 and NK3 receptors not only induce death by apoptosis in tumor cells, but also reverse the changes in microenvironment cells (stroma-fibroblasts-, vascular -endothelial vessels- and cells inflammatory) that promote the growth and perpetuation of tumors through the interaction between stromal cells and cancer cells.
  • the present invention is related to the use of an antibody or a fragment thereof, directed against NK1, NK2 and / or NK3 receptors by direct administration to humans, for the treatment of cancer.
  • the invention also comprises a method for the therapeutic treatment of cancer in man, which comprises the administration of an effective amount of an antibody or a fragment thereof against the NK1, NK2 and / or NK3 receptors which modifies their activity. in the cells
  • the term "direct administration” means that the treatment is not done by vaccination with an immunogenic form of the NK1, NK2 and / or NK3 receptors for the production of antibodies by the same patient.
  • the antibody is produced outside the body and is administered to the patient.
  • the treatment proposed by the present invention is useful for cancer patients, in an asymptomatic, symptomatic state, in neoadjuvant treatment (treatment before surgery), in adjuvant treatment (complementary treatment after surgery, when there is no detectable macroscopic tumor) and in treatment of metastatic stage disease.
  • cancer is meant a malignant tumor of unlimited growth potential that expands locally by invasion and systemically by metastasis.
  • the antibody or fragment thereof against NK1, NK2 and / or NK3 receptors are administered to individuals with a cancer.
  • Tumor cells on which antibodies directed against the NK1, NK2 and / or NK3 receptors act are selected from among primary cells of human invasive malignant melanoma, metastatic cells of human melanoma, human melanoma cells located in lymph node, glioma cells human, human breast carcinoma cells, human small cell lung carcinoma cells, human large cell lung carcinoma cells, human pancreatic carcinoma cells, human prostate carcinoma cells, human colon carcinoma cells, cells of human stomach carcinoma, human ovarian carcinoma cells, human endometrial carcinoma cells, human uterine cervix carcinoma cells, human thyroid carcinoma cells, human urine bladder carcinoma cells, human choriocarcinoma cells, acute lymphoblastic leukemia cells human B cells, acute human T-cell lymphoblastic leukemia cells, human Burkitt lymphoma cells, human Hodgkin lymphoma cells, human neuroblastoma cells, human retinoblastoma cells, human Ewing Sarcoma cells, human rhabdomyosarcoma cells and Human
  • antibody against NK1, NK2 and / or NK3 receptors means any polyclonal or monoclonal antibody against NK1, NK2 and / or NK3 receptors.
  • the invention also contemplates the use of fragments of these antibodies.
  • An antibody fragment means a part of an antibody against the NK1, NK2 and / or NK3 receptors that is of sufficient size and conformation suitable for binding to an epitope present on the NK1, NK2 and / or NK3 receptors and thus modifying its functioning. normal, including preventing substance P or other agonists from these receptors from binding to the aforementioned receptors.
  • the term "specific" means that the antibody has no random associations with other antigens.
  • Numerous well-known assay techniques based on immunological reactions between antigens and antibodies can be used using the NK1, NK2 and / or NK3 receptors as an antigen to determine whether a particular antibody or an antibody fragment has the ability to bind to an epitope present in the NK1, NK2 and / or NK3 receptors, and to potentially modify their activity. These techniques can be, for example, "enzyme-linked immunosorbent assays" (ELISA), immunofluorescence assays (IFA), radioimmunoassays, immunoelectrophoresis, and "immunoblotting".
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • IFA immunofluorescence assays
  • radioimmunoassays radioimmunoassays
  • immunoelectrophoresis immunoelectrophoresis
  • an apoptosis induction assay can be used, including staining with DAPI (4'-6-diamidino-2-phenylindole) or with annexin.
  • Another object of the present invention is the use of an antibody or fragment thereof generated to modify the functioning of the NK1, NK2 and / or NK3 receptors, in the preparation of a pharmaceutical composition or medicament for the treatment of cancer.
  • the pharmaceutical composition or medicament, against NK1, NK2 and / or NK3 receptors is in a pharmaceutically acceptable form to be administered to an individual directly, preferably by intravenous, oral, parenteral administration, or by any other route.
  • Intravenous administration refers directly to the application of the antibody or fragment thereof or of a pharmaceutical composition comprising it, directly into the patient's bloodstream.
  • Oral administration may involve swallowing, so that the antibody or fragment thereof, as well as a pharmaceutical composition comprising it, enters the gastrointestinal tract, or the oral or sublingual administration through which the compound enters the bloodstream directly from the mouth.
  • Parenteral administration refers to routes of administration other than enteric, transdermal or inhalation, and is typically by injection or infusion.
  • Parenteral administration includes intravenous, intramuscular and / or subcutaneous injection or infusion.
  • the antibody or fragment thereof, against the NK1, NK2 and / or NK3 receptors of the invention can be administered alone or in a composition with pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients.
  • a person skilled in the art will adapt the composition depending on the particular form of administration.
  • oral administration is the preferred method and is preferably achieved through solid dosage forms, including capsules, tablets, pills, powders and granules, among others, or by liquid dosage forms.
  • Antibody preparations against NK1, NK2 and / or NK3 receptors for parenteral administration preferably include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions or emulsions, among others.
  • pharmaceutically acceptable vehicle refers to a vehicle that must be approved by a federal government regulatory agency or a state government or listed in the United States Pharmacopoeia or the European Pharmacopoeia, or other pharmacopoeia generally recognized for use in animals, and more specifically in humans.
  • suitable pharmaceutically acceptable excipients will vary depending on the particular dosage form selected.
  • suitable pharmaceutically acceptable excipients may be selected for a particular function that they may have in the composition. For example, certain pharmaceutically acceptable excipients may be selected for their ability to facilitate the production of uniform dosage forms. Certain pharmaceutically acceptable excipients can be selected for their ability to facilitate the production of stable dosage forms.
  • Certain pharmaceutically acceptable excipients may be selected for their ability to facilitate the transport of the compound or compounds of the invention once administered to the patient from an organ or part of the body to another organ or part of the body. Certain pharmaceutically acceptable excipients can be selected for their ability to improve patient acceptance. Suitable pharmaceutically acceptable excipients include the following types of excipients, not excluding others known in the state of the art: diluents, fillers, binders, disintegrants, lubricants, glidants, granulating agents, coating agents, moisturizing agents, solvents, co-agents.
  • the dosage of the active ingredient may be selected depending on the desired therapeutic effect, the route of administration and the duration of treatment.
  • the dose of administration and the frequency will depend on the size, age and general health conditions of the individual, taking into account the possibility of side effects. Administration will also depend on the simultaneous treatment with other drugs and the tolerance of each individual to the drug administered. Persons skilled in the art may establish the appropriate dose using standard procedures. It is understood that the dose should be the effective amount of antibody or fragment thereof, in the sense that the treatment has at least the same or better effect than current therapies in these patients.
  • composition may comprise the antibody or fragment thereof as the sole agent against cancer or combinations thereof with other therapeutic agents depending on the condition.
  • Figure 1 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human colon adenocarcinoma cell line (SW-403) obtained from the DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und Zellkultures) cell line collection ) and cultured under the conditions indicated by said company, by treatment with anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the titers of antibody shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 2 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human breast adenocarcinoma cell line (MCF-7) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • MCF-7 commercial human breast adenocarcinoma cell line
  • Figure 3 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human ovarian adenocarcinoma cell line (EFO-27) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 4 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human pancreatic adenocarcinoma cell line (CAPAN-1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), or anti-NK3 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 5 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human pancreatic adenocarcinoma cell line (PA-TU-8902) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 6 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human lung adenocarcinoma cell line (DV-90) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 7 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human gastric adenocarcinoma cell line (23132/87) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treatment with anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-N antibodies NK3 (C) to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 8 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage with respect to control cultures) in the commercial cell line of human uterine cervix carcinoma (KB) obtained from the collection of cell lines of the company DSMZ and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 9 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage with respect to control cultures) in the commercial cell line of human uterine cervix carcinoma (BT-B) obtained from the collection of cell lines of the company DSMZ and cultured under the indicated conditions by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • BT-B human uterine cervix carcinoma
  • Figure 10 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human endometrial carcinoma cell line (AN3-CA) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 11 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human breast carcinoma cell line (MT-3) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 13 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human ovarian carcinoma cell line (COLO-704) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-antibody NK3 (C) to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 14 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human ovarian carcinoma cell line (FU-OV-1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 15 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human prostate carcinoma cell line (22RV1) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 16 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial non-small cell lung carcinoma cell line (HCC-44) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured in the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours .
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 17 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human non-small cell lung carcinoma cell line (COR-L23) obtained from the ECACC (European Collection company cell line collection) of Cell Cultures) and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours .
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 18 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human small cell lung carcinoma cell line (H-209) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured in conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 19 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human small cell lung carcinoma cell line (H- 1963) obtained from the collection of cell lines of the company DSMZ and cultured under the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graphic and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 20 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human small cell lung carcinoma cell line (H69) obtained from the ECACC company cell line collection and cultured under the indicated conditions by said company, by treating with the anti-NK1 (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 21 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial cell line of human lung carcinoma (A-427) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 22 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human thyroid carcinoma cell line (8505C) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK2 (A) or anti-NK3 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • CPAP obtained from the collection of cell lines of the company DSMZ and cultured under the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graphic and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 24 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human bladder carcinoma cell line of human urine (5637) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the indicated conditions by said company, by treating with the anti-NKl antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 25 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human bladder carcinoma cell line of human urine (5637) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the indicated conditions by said company, by treating with the anti-NKl antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 25 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human bladder carcinoma cell line of human urine (5637) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the indicated conditions by said company,
  • Figure 26 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human thyroid follicular carcinoma cell line (TT2609-C02) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the indicated conditions by said company, by treating with the anti-NK1 (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 27 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human transitional bladder carcinoma cell line (RT-4) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured in the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours .
  • RT-4 commercial human transitional bladder carcinoma cell line
  • Figure 28 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial urothelial carcinoma cell line of human urine (647-V) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured in the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NK1 (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 29 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human choriocarcinoma cell line (AC-1M32) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • A anti-NK1
  • B anti-NK2
  • C anti-NK3
  • Figure 30 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human fibrosarcoma cell line (HT-1080) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 31 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human fibrosarcoma cell line (HT-1080) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 32 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human malignant fibrous histiocystoma cell line (U-2197) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 33 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human leukemia T / NK cell line (YT) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the indicated conditions by said company, by treating with the anti-NKl antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 34 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human lymphoblastic leukemia B cell line (SD1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • SD1 commercial human lymphoblastic leukemia B cell line
  • A anti-NK1
  • B anti-NK2
  • C anti-NK3
  • Figure 35 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human T lymphoblastic leukemia cell line (BE-13) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 36 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human B-cell lymphoma cell line (BC-1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 37 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human B-cell lymphoma cell line (BC-1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 37 Inhibition of proliferation (
  • Figure 38 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human Burkitt lymphoma cell line (CA-46) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 39 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human Hodgkin lymphoma cell line (KM-H2) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • KM-H2 commercial human Hodgkin lymphoma cell line
  • B anti-NK2
  • C anti-NK3
  • Figure 40 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human T lymphoma cell line (DERL-7) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 41 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human T lymphoma cell line (SUP-T1) obtained from the DSMZ cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • SUP-T1 commercial human T lymphoma cell line
  • Figure 42 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human melanoma cell line (MEL HO) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • MEL HO commercial human melanoma cell line
  • Figure 44 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human melanoma cell line with lymph node metastasis (COLO 858) obtained from the ICLC (Interlab Cell line collection) cell line collection -CBA- Genova) and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 45 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human multiple myeloma cell line (COLO 677) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 46 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human neuroblastoma cell line (KELLY) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NKl (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 47 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage with respect to control cultures) in the human neuroblastoma commercial cell line (IMR-32) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treatment with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • IMR-32 human neuroblastoma commercial cell line
  • Figure 48 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human neuroblastoma cell line, bone marrow (SKN-BE 2) obtained from the ICLC company cell line collection and cultured under conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 49 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human neuroblastoma cell line, bone marrow (SKN-BE 2) obtained from the ICLC company cell line collection and cultured under conditions indicated by said company, by treating with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 49 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage
  • Figure 50 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human osteosarcoma cell line (CAL-72) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NKl (A) or anti-NK2 (B) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 51 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human rhabdomyosarcoma cell line (A-204) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • A-204 commercial human rhabdomyosarcoma cell line obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 52 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human retinoblastoma cell line (Y-79) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company , by treatment with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 53 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human retinoblastoma cell line (WERI-Rb-1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under the conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours.
  • proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 54 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human Edwing sarcoma cell line (MHH-ES-1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 55 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the commercial human Edwing sarcoma cell line (MHH-ES-1) obtained from the DSMZ company cell line collection and cultured under conditions indicated by said company, by treating with the anti-NK1 (A), anti-NK2 (B) or anti-NK3 (C) antibodies to the antibody titers shown in the graph and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibodies.
  • Figure 55
  • Figure 56 Inhibition of proliferation (expressed as a percentage of control cultures) in the human endothelial cell line (C-12210) by treatment with the anti-NK1 antibody (A) to the antibody titers shown in the graphic and for 48, 72 and 96 hours. As proliferation control cells were cultured in the absence of the aforementioned antibody.
  • One of the embodiments of the invention consists in the use of at least one antibody or a fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof, for the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition. for the treatment of cancer.
  • Another embodiment of the invention consists in the use of at least one antibody or a fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof, for the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition for Production of apoptosis in tumor cells.
  • Another preferred embodiment of the invention comprises the use of at least one antibody or a fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof, for the manufacture of a medicament or pharmaceutical composition.
  • Said reduction of the tumor size is carried out, by means of the modification of the peritumoral microenvironment, which comprises, the modification of the physiology of the stromal matrix and the stromal cells surrounding the tumors, the modification of the physiology of the cells proper to said matrix ( fibroblasts), the modification of the physiology of the cells of the inflammatory and / or immune response, and the modification of the physiology of the vascularization cells, such as the cells of the vascular endothelium, of the tumor and peritumoral areas.
  • Said tumor markers are preferably selected from any of the list: NF-kB, TGF alpha, TGFbeta 1, TGFbeta 2, TGFbeta 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 , MMP-14 and / or any of its combinations.
  • the modification of the physiology of the cells responsible for vascularization comprises the inhibition of neovascularization, preferably by inhibiting the proliferation of vascular endothelial cells. As previously mentioned, all this is aimed at reducing the size of the tumor and preventing its progression.
  • the cancer type to be treated with the use of the compounds of the invention is selected from the group comprising melanoma, glial line tumors, carcinomas, adenocarcinomas, leukemias, lymphomas, myelomas, neuroblastomas (and other germline or neuroectodermal tumors), and / or sarcomas.
  • the carcinoma is selected from any of the following: breast, including ductal, lung, including both small cell and non-small cell, thyroid, including both follicular and papillary, of the apparatus digestive, prostate, uterine cervix, endometrial, ovary, bladder, including both endothelial and transitional and / or choriocarcinoma.
  • adenocarcinoma is selected from any of the following: breast, ovary, pancreas, lung and digestive system including stomach and colon.
  • leukemia is preferably human lymphoblastic leukemia of T cells, B cells, and / or ⁇ 7 ⁇ cells.
  • the lymphomas are preferably of line B, line T, type Hodgkin and / or type Burkitt.
  • the types of sarcoma to be treated by using the antibodies of the invention are preferably osteosarcomas, rhabdomyosarcomas, fibrosarcomas, malignant fibrous histiocytoma, endometrial stromal sarcoma and / or Edwing sarcoma.
  • neoplasms to be treated by using the antibodies of the invention are preferably neuroblastoma, as well as other germ and / neuroectodermal neoplasms.
  • the antibody used in the present invention preferably recognizes at least one sequence of NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • Another preferred embodiment of the invention consists of a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising at least one antibody or fragment thereof specific against NK1, NK2 and / or NK3 receptors, or combinations thereof.
  • the antibody used in the present invention preferably recognizes at least one sequence of NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • the pharmaceutical composition may also comprise pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients.
  • said cancer is selected from the group comprising: melanoma, carcinomas, adenocarcinomas, leukemias, lymphomas, neuroblastomas (or other embryonic or neuroectodermal tumors) and / or sarcomas.
  • the carcinoma is selected from any of the following: breast, including ductal, lung, including both small cell and non-small cell, thyroid, including both follicular and papillary, of the apparatus digestive, prostate, uterine cervix, endometrial, ovary, bladder, including both endothelial and transitional and / or choriocarcinoma.
  • adenocarcinoma is selected from any of the following: breast, ovary, pancreas, lung and digestive system including stomach and colon.
  • leukemia is preferably human lymphoblastic leukemia of T cells, B cells, and / or T / NK cells.
  • the lymphomas are preferably of line B, line T, type Hodgkin and / or type Burkitt.
  • the types of sarcoma to be treated by using the pharmaceutical composition of the invention are preferably osteosarcomas, rhabdomyosarcomas, fibrosarcomas, malignant fibrous histiocytoma, endometrial stromal sarcoma and / or Edwing sarcoma.
  • neoplasms to be treated by using the pharmaceutical composition of the invention are preferably neuroblastoma, as well as other germ and / neuroectodermal neoplasms.
  • Another preferred embodiment of the present invention consists in the use of the pharmaceutical composition mentioned above for the production of apoptosis in tumor cells.
  • An even more preferred form of implementation of the present invention is the use of the pharmaceutical composition mentioned above to reduce the size of the tumors, by modifying the peritumoral microenvironment, which comprises the modification of the stromal matrix's own physiology. and the stromal cells surrounding the tumors, the modification of the own physiology of the own cells of the inflammatory and / or immune response, and / or the modification of the own physiology of the own cells of the vascularization of the tumor zones and peritumoral
  • the modification of the physiology of the stromal matrix and of the stromal cells and / or of the physiology of the cells involved in the inflammatory and immune response comprises the inhibition of tumor markers.
  • Said tumor markers are preferably selected from any of the list: NF-kB, TGF alpha, TGFbeta 1, TGFbeta 2, TGFbeta 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 , MMP-14 and / or any of its combinations.
  • the modification of the physiology of Cells responsible for vascularization comprise the inhibition of neovascularization, preferably by inhibiting the proliferation of vascular endothelial cells.
  • the invention also comprises at least one antibody or fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof, to be used in the treatment of cancer.
  • the antibody used in the present invention preferably recognizes at least one sequence of NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • a preferred embodiment of the invention consists of at least one antibody or fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof, to induce apoptosis in tumor cells.
  • the antibody used in the present invention preferably recognizes at least one sequence of NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • a further embodiment of the present invention comprises at least one antibody or fragment thereof, specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof, to reduce the size of tumors, by modifying the peritumoral microenvironment, which includes the modification of the physiology of the stromal matrix and the stromal cells surrounding the tumors, the modification of the physiology of the cells characteristic of the inflammatory and / or immune response, and / or the modification of the physiology of the cells of vascularization of the tumor and peritumoral areas.
  • the modification of the physiology of the stromal matrix and of the stromal cells and / or of the physiology of the cells involved in the inflammatory and immune response comprises the inhibition of tumor markers.
  • Said tumor markers are preferably selected from any of the list: NF-kB, TGF alpha, TGFbeta 1, TGFbeta 2, TGFbeta 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13 , MMP-14 and / or any of its combinations.
  • the modification of the physiology of the cells responsible for vascularization includes the inhibition of neovascularization, preferably by inhibiting the proliferation of vascular endothelial cells.
  • the antibody used in the present invention preferably recognizes at least one sequence of NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • Another embodiment of the invention consists of a method of cancer treatment comprising the administration to a patient of an effective amount of at least one antibody or fragment thereof specific against NK1, NK2 and / or NK3 cell receptors, or combinations thereof. themselves, or of a pharmaceutical composition as described above comprising said antibodies.
  • the antibody used in the present invention preferably recognizes at least one sequence of NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • said method is characterized in that it increases tumor cell apoptosis by administering to an patient an effective amount of at least one antibody or fragment thereof specific against NK1, NK2 and cell receptors. / or NK3, or combinations thereof, or of a pharmaceutical composition such as those mentioned above, comprising said antibodies.
  • the antibody used in the present invention preferably recognizes at least one sequence of the NK1, NK2 or NK3 receptors, selected from: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
  • said method is characterized in that it reduces tumor size by modifying the peritumoral microenvironment and / or the peritumoral inflammatory and / or immune response, as described above.
  • Example 1 Treatment with antibodies against NK1, NK2 and NK3 receptors inhibits proliferation and induces apoptosis in cell lines of different types of cancer.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's medium, simple modification of the Eagle Basal Medium
  • RPMI 1640 Roswell Park Memorial Institute
  • Ivitrogen antibiotics-antifungals
  • B lymphoblastic leukemia B lymphoblast cells
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • anti-NK2 which recognizes the sequence SEQ ID NO: 2 of the NK2 receptor obtained from Sigma-Aldrich and whose product number is HPA012084.
  • anti-NK3 which recognizes the sequence SEQ ID NO: 3 of the NK3 receptor, obtained from Sigma-Aldrich and whose product number is HPA009418.
  • the membranes were washed with phosphate buffered saline (PBS) and in the presence of Tween-20 detergent (PBST) and incubated with a secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase for 2 hours at room temperature (1: 10000 dilution). To confirm that the same amount of protein had been loaded, the membranes were incubated with the anti-P-tubulin monoclonal antibody. Antibody detection was performed with a chemiluminescence reaction (ECL Western Blot detection; Amersham Life Science, United Kingdom). Development of cell blocks included in paraffin and immunohistochemistry of NKL NK2 and NK3 receptors.
  • PBS phosphate buffered saline
  • PBST Tween-20 detergent
  • the Immunohistochemical technique allows the detection of molecules by the application of a specific primary antibody for an epitope of said molecules that is evidenced by the application of a secondary antibody that recognizes an epitope of the primary antibody and that includes a visualization system that it can be fluorescent or chromogenic (a chromogenic visualization method was used in the present invention). He Imunohistochemical method allows, therefore, to visualize these molecules and assess their exact location in the cells or in the extracellular stroma, when the study can be performed on histological sections. Immunohistochemical techniques were used to verify that all cell lines, both commercial and primary, showed the presence of NK1, NK2 and NK3 receptors.
  • a sample of each of the cell line cultures was centrifuged (5 minutes at 1,500 rpm) and the pellet obtained was dehydrated by treatment at increasing concentrations of ethanol and, finally, in xylol. Then, said dehydrated samples were included in paraffin creating a block of cells. Said paraffin blocks were cut in a microtome to a thickness of 5 microns and deparaffinized by immersion in xylol, to later be hydrated through a series of solutions containing decreasing concentrations of ethanol, to finally immerse them in water. Then, said samples were subjected to a pressure cooker treatment in citrate buffer lOx at pH 6.0, to obtain a greater exposure of the antigens.
  • the samples were allowed to cool to room temperature for 10 minutes.
  • the endogenous peroxidase activity was blocked with 3% hydrogen peroxide for 30 min at room temperature.
  • NK1, NK2 and NK3 receptors were incubated in the presence of anti-NKl, anti-NK2 or anti-NK3 (Sigma-Aldrich) antibodies diluted 1: 500, overnight at 4 ° C. After this time, they were washed in 0.05 M Tris buffer at room temperature. The next step was the addition of the Envision System-HRP (Dako) reagents for 30 min at room temperature. After this time, the samples were washed again in 0.05 M Tris buffer, and the immunoreactivity was visualized by light microscopy with a chromogenic solution with 3,3'-Diaminobenzidine (DAB +; Dako, USA).
  • DAB + 3,3'-Diaminobenzidine
  • Cell proliferation was evaluated by the compound tetrazolium 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) 2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium (MTS) according to the instructions provided by the manufacturer (Kit "CellTiter 96 Aqueous One-Solution Cell Proliferation Assay” Promega, USA; I complete the protocol or use it in url: http://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/ 0 / celltiter-96-aqueous-one- solution-cell-proliferation-assay-system-protocol /).
  • the cell number was quantified using a Coulter counter.
  • a white sample (without cells) and a control sample (containing 10 4 cells / ml) were included in the tumor cell culture plates.
  • Culture plates were cultured in the presence of increasing concentrations of the anti-NKl, anti-NK2 or anti-NK3 monoclonal antibodies.
  • 20 ⁇ of MTS was added to each of the wells of the cell culture plates 90 minutes before reading the samples in a multiscanner spectrophotometer (TECAN Spectra classic, Barcelona, Spain ) at 492 nm (test wavelength) and 690 nm (reference wavelength). The different doses were tested in duplicate and each experiment was performed in triplicate.
  • DAPI staining (4, 6-diamidino-2-phenylindole).
  • DAPI staining was performed. Briefly, after treatment with the antibodies against the NK1, NK2 and NK3 receptors, the cells were fixed in 4% paraformaldehyde. After a second wash in PBS, the cells were incubated in DAPI solution (Sigma-Aldrich) at a concentration of 1/1000 for 30 minutes in the dark. Subsequently, the cells were observed through a fluorescence microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany).
  • Apoptotic cells were identified by typical characteristics of apoptosis (e.g. nuclear condensation, nuclear vacuolization, loss of nuclear membrane integrity and formation of apoptotic bodies). The number of apoptotic cells were counted, repeating the count on three different slides.
  • the antibodies against the NK1, NK2 and NK3 receptors used in the present invention are the mouse polyclonal antibodies obtained from Sigma-Aldrich, cited above.
  • apoptotic morphology was analyzed, identifying apoptotic cells by the typical characteristics of apoptosis, such as nuclear condensation, nuclear vacuolization, loss of nuclear membrane integrity and formation of apoptotic bodies. . All these characteristics were analyzed by fluorescence microscopy after staining with DAPI (Roche).
  • cell culture supernatants from the tumor lines treated with anti-NK1, anti-NK2 or anti-NK3 antibodies which included cells detached from culture plates, were also analyzed.
  • DAPI staining of the precipitates of the supernatants obtained from the culture media was performed. Such precipitates included the presence of cell detritus along with cells that showed clear apoptotic morphology.
  • FIG. 1 shows examples of inhibition of cell culture proliferation of different adenocarcinoma lines, such as colon (Fig 1), breast (Fig 2), ovarian (Fig 3), pancreas ( Fig 4 and 5), lung (Fig 6) and gastric (Fig 7).
  • adenocarcinoma lines such as colon (Fig 1), breast (Fig 2), ovarian (Fig 3), pancreas ( Fig 4 and 5), lung (Fig 6) and gastric (Fig 7).
  • Fig. 25 follicular Human thyroid
  • Fig. 27 transitional urine bladder
  • Fig. 28 urothelial urine bladder
  • Choriocarcinoma cell lines (Fig 29), fibrosarcoma (Fig 30), glioma (Fig 31) and malignant fibrous histiocytoma (Fig 32), also showed inhibition of their proliferation, by treatment with anti-NKl, anti-NK2 or anti-NK3, showing that the treatment of tumor lines with said antibodies leads to a decrease in the tumor.
  • Cell lines of different types of leukemia such as human T / NK cell leukemia (Fig 33), lymphoblastic B leukemia (Fig 34) and T lymphoblastic leukemia (Fig 35), as well as lymphatic cell lines, B lymphoma human (Fig 36 and 37), Burkitt lymphoma (Fig 38), Hodgkin lymphoma (Fig 39), T lymphoma (Fig 40 and 41), melanoma and multiple myeloma cell lines (Figs 42 to 45), also showed inhibition of its proliferation, by treatment with the anti-NK1, anti-NK2 or anti-NK3 antibodies, again showing that said treatment leads to a decrease in the tumor.
  • Fig 33 human T / NK cell leukemia
  • Fig 34 lymphoblastic B leukemia
  • Fig 35 T lymphoblastic leukemia
  • lymphatic cell lines B lymphoma human (Fig 36 and 37), Burkitt lymphoma (Fig 38), Hodgkin lymphoma (Fig 39), T lymphoma (
  • Figs 46 to 48 Additional tests performed on cell cultures of neuroblastomas (Figs 46 to 48), osteosarcomas (Fig 49 and 50), rhabdomyosarcoma (Fig 51), retinoblastoma (Fig 52 and 53), Edwing sarcoma (Fig 54) and Endometrial stromal sarcoma (Fig 55), also showed inhibition of its proliferation, by treatment with anti-NK1, anti-NK2 or anti-NK3 antibodies, causing tumor size decrease.
  • stroma and inflammation McAllister SS, et al 2010; Ikushima H, Miyazono K, 2010.
  • Example 1 it has been shown that treatment with antibodies against NK1, NK2 and NK3 receptors induces apoptosis in various commercial tumor cell lines.
  • the present example shows that, in addition, treatment with said antibodies induces changes and modifications in the physiology of the cells that constitute the tumor microenvironment, which are beneficial for the treatment of cancer, for example in fibroblasts, in inflammation cells (mononuclear and polymorphonuclear) and in the vascular endothelium.
  • physiology involves factors whose importance is well documented in the scientific literature and whose expression is modified in the presence of agonists (for example, substance P) of the NK1, NK2 or NK3 receptors and in the presence of antibodies against said receptors.
  • NK1, NK2 or NK3 receptor agonists for example substance P
  • substance P induce physiological and functional changes in stromal cells - fibroblasts - and in inflammation cells similar to those observed in these same cells in peritumoral areas and that these effects are reversed by antibodies against NK1, NK2 or NK3 receptors
  • the presence of different markers (molecules) in the cells that form the tumor microenvironment has been analyzed (see list below, in Table 2 and in Table 3) in primary cell cultures of human fibroblasts (PFH), cultures of human primary mononuclear and polymorphonuclear blood cells, in the presence of substance P agonist of the NK1, NK2 or NK3 receptors, as well as in the presence of said agonist and anti-NKl, anti-NK2 or anti-NK3 antibodies).
  • PH human fibroblasts
  • PEF human primary fibroblasts
  • PHF PHF were obtained and purified from samples obtained from the skin dermis as described in De Bar ⁇ et al (De Bar ⁇ et al, 2001). Briefly, small pieces of the skin dermis were digested in a solution of hyaluronidase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
  • the adherent cells were separated using 0.5% sterile trypsin (Invitrogen) and were used between steps 3 and 9.
  • sterile trypsin Invitrogen
  • the PHFs were seeded in 24-well plates at a concentration of 25,000 cells per well. Isolation and culture of human mononuclear and polymorphonuclear blood cells.
  • Heparinized blood from healthy donors was centrifuged, so that the different components of it are separated.
  • the red blood cells remain at the bottom of the tube.
  • a small whitish layer that is composed of white blood cells and above, in the upper part of the tube the blood plasma.
  • the white blood cell layer was distributed on a 24-well culture plate, adding in each of them the same concentration of blood plasma supplemented with 1% of antibiotics-antifungals (Invitrogen).
  • Invitrogen antibiotics-antifungals
  • said cells were cultured in the presence of Substance P (NK1, NK2 and NK3 receptor agonist) at a concentration of 1 ⁇ (product No. S6883; Sigma-Aldrich).
  • Substance P NK1, NK2 and NK3 receptor agonist
  • these cells were cultured with Substance P at the same concentration and simultaneously with the anti-NKl, anti-NK2 or anti-NK3 (Sigma-Aldrich) antibodies at a concentration of 1/100.
  • the cells were collected and paraffin cell blocks were constructed for immunohistochemical analyzes, as explained in Example 1.
  • NK1, NK2 and NK3 receptors are capable of reverse the expression of these markers, which, as explained, are typical of the zones peritumoral, characteristic of the peritumoral microenvironment and are involved in the development, enlargement and progression of tumors.
  • the percentage is the average of the percentages found (in each case the immunohistochemical technique was carried out in sextuplicate and 20 large magnification fields were studied).
  • the mononuclear and polymorphonuclear cells were incubated in the presence of PHF obtained by the methods described above and with the presence of Substance P at a concentration of 1 ⁇ or in the presence of Substance P (1 ⁇ ) together with the anti-NKl, anti-NK2 or anti-NK3 antibodies at the concentration of 1/100. After a 48 hour incubation, the cells were collected and for immunohistochemical analyzes they were included in paraffin blocks as described in Example 1. Subsequently, histological sections of each of the blocks were made and the expression was studied, by immunohistochemistry.
  • TGFbeta SAB4502956
  • NF-kB SAB4501992
  • All antibodies used were mouse polyclonal antibodies obtained from Sigma Aldrich and were used at a concentration of 1/1000. Immunohistochemical techniques were performed as described in Example 1.
  • NK1, NK2 and NK3 (substance P) receptor agonists induces expression of TGFbeta and NF-kB that are mediators of proven importance in genesis of the microenvironment necessary for the development, increase in size and progression of tumors.
  • NK1, NK2 and NK3 receptors the expression of these markers can be reversed, which shows the ability of said antibodies to inhibit the genesis of these mediators and, therefore, prevent the development of a tumor microenvironment that allows the increase in size and progression of tumors.
  • the commercial line of microvascular endothelial cells called C-12210 was exposed to increasing concentrations of anti-NK1, NK2 or NK3 antibodies and an inhibition of the proliferation thereof, which turned out to be time and dose dependent (Figure 56). Therefore, anti-NKl, anti-NK2 or anti-NK3 antibodies inhibit the proliferation of endothelial cells.
  • the proliferation of the same is a key element in the development of the neovascularization necessary so that the tumors can receive a sufficient blood supply (and therefore of oxygen, nutrients among other necessary elements) that allows it to maintain its growth and progression.
  • Tachykinins, neurotrophism and neurodegenerative diseases a critical review on the possible role of tachykinins in the aetiology of CNS diseases. Neurosci. Res., 1996, 7, 187-214.
  • NK-1 receptor is expressed in human melanoma and is involved in the antitumor action of the NK-1 receptor antagonist aprepitant on melanoma cell lines.
  • NK-1 receptor is expressed in human primary gastric and colon adenocarcinomas and is involved in the antitumor action of L-733,060 and the mitogenic action of substance P on human gastrointestinal cancer cell lines. Tumour Biol. 2008; 29 (4): 245-54.

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Abstract

El objeto de la presente invención es la utilización de un anticuerpo o un fragmento del mismo específico contra los receptores NK1, NK2 y/o NK3 de las células, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico del cáncer humano, por administración directa a un mamífero, incluyendo el hombre mediante la producción de muerte celular o apoptosis de las células tumorales, la modificación del microambiente peritumoral (que consiste en las células estromales, matriz estromal y vascularización intra y peritumoral) y/o la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria circundante al tumor. En especial, en el caso del melanoma, carcinomas (sobre todo carcinoma de mama, de pulmón, del aparato digestivo, de próstata, de cérvix uterino, de endometrio, de ovario y de vejiga de la orina), leucemias, linfomas, neoplasias como el neuroblastoma y sarcomas como el osteosarcoma.

Description

USO DE ANTICUERPOS CONTRA LOS RECEPTORES NKl, NK2 Y/O NK3, EN EL
TRATAMIENTO DEL CÁNCER.
SECTOR DE LA TÉCNICA.
La presente invención se encuadra en el sector de la medicina. Más en concreto en la biología molecular aplicada a la medicina, la farmacología y la oncología. Específicamente, está relacionada con el uso de anticuerpos terapéuticos para la fabricación de medicamentos para el tratamiento del cáncer en los seres humanos.
ESTADO DE LA TÉCNICA.
Los receptores NK (receptores neuropeptídicos de la sustancia P y de las taquicininas), tipos NKl, NK2 y NK3 están ampliamente distribuidos en las células del organismo. Se ha constatado su presencia en el sistema nervioso central y periférico de los mamíferos, en el aparato digestivo, en el sistema circulatorio, en las células de estirpe hematopoyética y de respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, así como en los tejidos blandos y especialmente, en el endotelio vascular. Actualmente se conocen numerosos procesos biológicos en cuya regulación están involucrados los receptores NKl , NK2 y NK3.
La sustancia P es un undecapéptido de origen natural, que se produce en los mamíferos cuya secuencia fue descrita por Veber et al. (US 4,680,283) y que pertenece a la familia de las taquicininas. Esta familia también incluye otros péptidos como Neurokinina A, Neurokinina B, Neuropéptido K, Neuropéptido Gamma y Hemokinina I, entre otros. La implicación de la sustancia P y de otras taquicinas en la etiopatogenia de diversas enfermedades ha sido ampliamente referida en la bibliografía científica. En este sentido, la acción de las taquicininas se ha relacionado con la etiopatogenia de enfermedades del sistema nervioso humano como la Enfermedad de Alzheimer, la Esclerosis Múltiple, la Enfermedad de Parkinson, la ansiedad y la depresión (Barker R. et al., 1996; Kramer MS, et al. 1998).
También se ha constatado la implicación de las taquicininas en la etiopatogenia de diversas enfermedades con componente inflamatorio como la artritis reumatoide, el asma, la rinitis alérgica, las enfermedades inflamatorias intestinales como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn (Maggi CA, et al. 1993).
En este sentido se han desarrollado antagonistas no peptídicos de los receptores NKl como medicamentos para el tratamiento de diversos desórdenes del sistema nervioso central como la depresión, la psicosis y la ansiedad (WO 95/16679, WO 95/1 8124, WO 95/23798 y WO 01/77100). Se ha descrito que el uso de antagonistas selectivos del receptor NKl es útil en el tratamiento de las náuseas y el vómito inducido por quimioterápicos antineoplásicos, así como en el tratamiento de ciertas formas de incontinencia urinaria (Quartara L. et al., 1998; Doi T. et al., 1999).
En un trabajo publicado en 2003 (Giardina G, et al., 2003), se hace una revisión de las patentes más recientes sobre antagonistas de receptores NKl, NK2 y NK3. Se describen las moléculas de los más importantes fabricantes mundiales con indicación de sus posibles aplicaciones entre las que cabe destacar: antidepresivo, antinflamatorio, ansiolítico, antiemético, tratamiento de la colitis ulcerosa y otros.
En el artículo publicado por Antal Orosz et al. (Orosz A, et al., 1995), se describe el uso de diversos antagonistas de la sustancia P (SP) para inhibir la proliferación de carcinoma de células pulmonares (por ejemplo en células designadas NCI-H69). De otra parte, en el artículo publicado por Bunn PA Jr (Bunn PA Jr. et al., 1994), se describen antagonistas de la Sustancia P capaces de inhibir el crecimiento in Vitro de varias líneas celulares comerciales pulmonares cancerosas (por ejemplo las células designadas NCI-H510, NCI-H345 y SHP-77).
En el artículo publicado por Palma C y cois. (Palma C. et al., 2000), se describe que los astrocitos del sistema nervioso central expresan receptores funcionales para varios neurotransmisores incluidos los receptores NKl . En los tumores cerebrales, las células gliales malignas derivadas de astrocitos desencadenan bajo la acción de las taquicininas y por mediación de los receptores NKl , la secreción de mediadores que aumentan su velocidad de proliferación. Consecuentemente, los antagonistas selectivos del NKl pueden ser muy útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de gliomas malignos.
En la patente EP 773026 (Pfizer) se hace referencia a la utilización de antagonistas no peptídicos del receptor NKl para el tratamiento de cánceres en mamíferos. Particularmente en el tratamiento de pequeños carcinomas pulmonares, APUDOMAS (tumores de células enterocromafines que se localizan de modo predominante en la mucosa del tubo digestivo. Sus siglas significan "Amine Precursos Uptake and Decarboxylation", utilización y decarboxilación de los precursores de aminas), tumor neuroendocrino y pequeños carcinomas extra-pulmonares.
Por otro lado en la patente WO 2001001922 se describe el uso de antagonistas de receptores NKl para el tratamiento de adenocarcinoma y muy específicamente los carcinomas prostáticos.
Diversos estudios con antagonistas específicos de NKl y NK2 (como CP-96341-1 -Pfizer-, MEN 1 1467, SR 48968 -Sanofi- y MEN 11420 -nepadutant-) han demostrado la eficacia de los mismos en el bloqueo de la proliferación celular (Singh D et al., 2000; y Bigioni M. et al., 2005).
Se ha descrito que los antagonistas no peptídicos de receptores NKl inducen apoptosis (muerte celular) en las células tumorales de diversos tumores como el carcinoma de estómago, el carcinoma de colon (Rosso M, et al., 2008) o el melanoma (Muñoz M, et al. 2010). Así mismo, se ha descrito que estos receptores están sobre-expresados en las células cancerosas. La patente ES 2 246 687 reivindica la "utilización de los antagonistas no peptídicos de receptores NKl y de la sustancia P en la elaboración de una composición farmacéutica para la producción de apoptosis en células tumorales de mamíferos" y por lo tanto "para el tratamiento del cáncer".
Los anticuerpos son compuestos peptídicos con capacidad para unirse de forma altamente selectiva a diversas moléculas orgánicas. Su unión a determinados receptores celulares induce una modificación en la actividad de los mismos, lo que puede determinar una modificación en las actividades fisiológicas habituales del metabolismo celular.
El uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular de diversos receptores celulares, como tratamiento para el cáncer, está ampliamente difundido en la clínica. Entre estos anticuerpos monoclonales terapéuticos aprobados para su uso en oncología, destacan el trastuzumab que es un anti-ErbB2/HER2 para el cáncer de mama, el cetuximab que es un anti- ErbBl/EGFR para el cáncer de colon y el bevacizumab que es un anti-VEGFR (receptor del factor de crecimiento derivado del endotelio vascular) para diversos tipos de cánceres (Adams GP. et al., 2005).
La solicitud de patente WO/2009/125039 reivindica el "Uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra la sustancia P, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cánceres que expresen el receptor NKl y/o un miembro de la familia de receptores ErbB, por administración directa a un mamífero, incluyendo el hombre".
Además, en la génesis y el desarrollo del cáncer no sólo intervienen mecanismos moleculares propios de las células tumorales, sino que tienen gran importancia las células del estroma y la inflamación y las interacciones entre las células tumorales y las del estroma y la inflamación (McAllister SS, et al. 2010; Ikushima H, et al. 2010).
Además, algunas sustancias, por ejemplo NF-Kb (factor nuclear kappa B), TGFbeta (factor de crecimiento transformante beta) y SPARC (del término en inglés "secreted protein, acidic, cysteine-rich") o TGFalfa (factor de crecimiento transformante alfa) se ha demostrado que están presentes en el microambiente tumoral y que son de gran importancia en la génesis y la progresión de los tumores (Coussens L and Werb Z. 2002). TGFbeta puede inhibir el paso de las formas precursoras de linfocito CD 8+ a formas de células efectoras (Berzofsky JA, et al. 2004). SPARC desempeña un papel importante relacionado con la neoangiogénesis tumoral (Carmeliet P and RK
Jain. 2000). La neoangiogénesis, la inmunidad y la inflamación son factores claves para la progresión de los tumores (Hanahan D y Weinberg RA. Cell. 2000).
Es conocida la importancia de algunas moléculas producidas por los fibroblastos en la progresión del cáncer e, incluso, se ha propuesto el uso de algunas de ellas como dianas terapéuticas en el tratamiento del cáncer mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos contra las mismas (Welt S, et al. 1994). En concreto, y relacionadas con el microambiente peritumoral, las Metaloproteasas (MMPs) son enzimas que contienen un metal (zinc) y degradan proteínas de la matriz extracelular (colágeno IV, lamininas, elastinas, fibronectinas, proteoglicanos, etc). Se expresan de forma fisiológica en algunas situaciones como la cicatrización de heridas, la transición de cartílago a hueso y el desarrollo placentario. Se expresan de forma patológica en el proceso de la invasión y el desarrollo de metástasis en tumores (Cox G. et al. 2000). Las MMPs más frecuentemente implicadas en el desarrollo de tumores son: MMP-2 (Gelatinasa A), MMP-3 (Estromelisina 1), MMP-7 (Matrilisina), MMP-9 (Gelatinasa B), MMP-1 1 (Estromelisina 3), MMP-13 (Colagenasa 3) y MMP-14. Existen diversos fármacos conocidos como inhibidores de las metaloproteasas que se están estudiando en el tratamiento del cáncer: Batimastat (péptidomimético cuyas dianas son las MMP-l ,2,3,7y9), Marimastat (péptidomimético cuyas dianas son las MMP-l,2,3,7,9yl2), Prinomastat (no péptidomimético cuyas dianas son las MMP-2,3,9,13yl4), Bay- 129566 (no péptidomimético cuyas dianas son las MMP-2, 3y9), Metastat (tetraciclina cuyas dianas son las MMP-2y9), BMS 275291 (no péptidomimético cuyas dianas son las MMP-2y9) y Neovastat (obtenido de cartílago de tiburón cuyas dianas son las MMP-l,2,7,9,12yl3). En concreto Marimastat ha superado ensayos clínicos en Fase I en cáncer de mama y de pulmón del tipo no microcítico, Prinomastat ha superado ensayos clínicos en Fase I en cáncer de próstata, Bay- 129566 ha superado ensayos clínicos en Fase I en diversos tumores sólidos y BMS 275291 ha superado ensayos clínicos en Fase I en cáncer pulmón del tipo no microcítico. Además, se ha comunicado que el uso de Marimastat ha demostrado eficacia en el tratamiento del cáncer en estadio avanzado de páncreas (Rosemurgy et al., Procc ASCO 1999), en el cáncer gástrico avanzado (Fieldng et al., Procc ASCO 2000), en el glioblastoma (Puphanich et al., Procc ASCO 2001) y en el cáncer de mama tras primera línea de tratamiento de quimioterapia (Sparano et al., Procc ASCO 2002).
Por lo tanto y en conclusión, en la actualidad son conocidos en el estado del arte, los siguientes hechos:
1. Que los receptores NK1 , NK2 y NK3 están ampliamente difundidos en el organismo del ser humano.
2. Que las taquicininas y en concreto la sustancia P actúan sobre el receptor NK1.
3. Que es posible la utilización de antagonistas no peptídicos de los receptores NK1 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de diversos desórdenes del sistema nervioso central como la depresión, la psicosis y la ansiedad lo que ha sido objeto de reivindicación en diversas solicitudes de patentes (WO 95/16679, WO 95/18124, WO 95/23798 y WO 01/77100).
4. Que dichos receptores están sobre-expresados en las células cancerosas, respecto a las células no cancerosas normales del organismo humano.
5. Que la utilización de antagonistas no peptídicos del receptor NK1 ha demostrado efectos sobre las células tumorales, que se traducen en la apoptosis (muerte celular) de las mismas. En este sentido se ha reivindicado la "utilización de los antagonistas no peptídicos de receptores NKl y de la sustancia P en la elaboración de una composición farmacéutica para la producción de apoptosis en células tumorales de mamíferos" y por lo tanto "para el tratamiento del cáncer" en la patente ES 2 246 687.
6. Que la "administración directa de un anticuerpo contra la sustancia P a diferentes líneas celulares tumorales disminuye la proliferación de la célula tumoral e induce su muerte", como se recoge en el documento de solicitud de patente WO/2009/125039, en el que se reivindica el "uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra la sustancia P, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico de cánceres que expresen el receptor NKl y/o un miembro de la familia de receptores ErbB, por administración directa a un mamífero, incluyendo el hombre".
7. Que, como ha quedado dicho, la patente ES 2 246 687 reivindica el uso de antagonistas no peptídicos de receptores NKl y de la sustancia P (y enumera un determinado número de los mismos, de forma concreta). Por lo tanto, no incluye a los anticuerpos o fragmentos derivados de los mismos, que son de naturaleza, obviamente y claramente peptídica. Este hecho ha permitido, por ejemplo, que se haya podido dar curso a la solicitud de patente WO/2009/125039, que reivindica el uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra la sustancia P para el tratamiento terapéutico del cáncer. Ya que obviamente, como ha quedado expuesto en el anterior apartado, los anticuerpos son de naturaleza peptídica, lo que ha evitado la existencia de conflicto entre ambas patentes (ES 2 246 687 y WO/2009/125039).
8. Se ha demostrado la presencia de receptores NKl, NK2 y/o NK3 en las células hemáticas involucradas en la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, en las células de la matriz estromal y en las células propias de la vascularización que rodean a las células tumorales. Se sabe que las células estromales, las células hemáticas involucradas en la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria y las células propias de la vascularización influyen en la evolución del tumor.
No obstante, las anterioridades conocidas, que incluyen la utilización de los antagonistas no peptídicos de receptores NKl y de un anticuerpo o un fragmento del mismo específicos contra la Sustancia P, como tratamiento del cáncer, el objeto de la presente invención así como la ventaja técnica que aporta, es la utilización de un anticuerpo o un fragmento del mismo dirigido contra los propios receptores celulares NKl, NK2 y/o NK3, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico del cáncer por administración directa a un mamífero, incluyendo el hombre. Ya que dichos anticuerpos pueden modificar la actividad de estos receptores, induciendo apoptosis de las células tumorales, cambios en los tejidos peritumorales y modificaciones en la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, con efectos terapéuticos beneficiosos.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN. Breve descripción de la invención El objeto de la presente invención es la utilización de un anticuerpo o un fragmento del mismo específico contra los receptores NK1, NK2 y/o NK3 de las células, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento terapéutico del cáncer humano, mediante la producción de muerte celular o apoptosis de las células tumorales, la modificación del microambiente peritumoral (que consiste en las células estromales, matriz estromal y vascularización intra y peritumoral) y/o la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria circundante al tumor. Especialmente en el caso del melanoma, carcinomas (sobre todo carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinomas del aparato digestivo, carcinoma de próstata, carcinoma de tiroides, carcinomas de cérvix uterino, carcinoma de endometrio, carcinoma de ovario, carcinoma de vejiga de la orina y coriocarcinoma), adenocarcinomas (especialmente de colón de mama, de ovario, de páncreas, de pulmón, del aparato digestivo), leucemias (especialmente Leucemia Linfoblástica humana), linfomas (especialmente los linfomas de estirpe B, de estirpe T, de tipo Hodgkin y de tipo Burkitt humanos), neoplasias de extirpe glial, neoplasias de origen neuroectodérmico, sarcoma humano de Edwing, otros sarcomas (como rabdomiosarcoma y osteosarcoma) y otras neoplasias de origen embrionario como neuroblastoma, meduloblastoma y nefroblastoma.
Los anticuerpos dirigidos contra los receptores NK1 , NK2 y/o NK3 constituyen unos antagonistas altamente específicos contra dichos receptores, que modifican o bloquean la actividad de los mismos e inducen la muerte y apoptosis de las células tumorales, así como cambios en las células del estroma y la matriz estromal, que circundan a dichas células tumorales, cambios en las células involucradas en la inflamación y en la inmunidad, además de cambios en la vascularización de las zonas tumorales y peritumorales (que constituyen el microambiente tumoral).
Brevemente, estos cambios del microambiente tumoral pueden resumirse en la modificación del inmunofenotipo de los fibroblastos (especialmente en lo relacionado con la producción de metaloproteasas, NF-Kb, TGFbeta y SPARC - elementos claves en la progresión de los tumores-), la modificación del inmunofenotipo de las células inflamatorias (por ejemplo, TGFbeta y NF-kB - que también resultan de gran importancia en la progresión de los tumores-) e inhibición de la proliferación de las células endoteliales vasculares (la neoangiogénesis es un factor clave determinante de la progresión de los tumores). Los anticuerpos contra los receptores NKl, NK2 y NK3 inducen apoptosis en diversas líneas celulares tumorales comerciales. Además inducen cambios en las células que componen el microambiente tumoral que son beneficiosos para el tratamiento del cáncer: en los fibroblastos, en las células de la inflamación (mononuclerares y polimorfonucleares) y en el endotelio vascular. Es decir, que los anticuerpos contra los receptores NKl, NK2 y NK3 no sólo inducen la muerte por apoptosis en las células tumorales, sino que también revierten los cambios en las células del microambiente (estroma -fibroblastos-, vasos -endotelio vascular- y células inflamatorias) que propician el crecimiento y la perpetuación de los tumores mediante la interacción entre las células del estroma y las del cáncer.
La muerte de las células tumorales y los cambios en el microambiente tumoral se traducen en una reducción del tamaño tumoral o eliminación total de los tumores. Así, la presente invención está relacionada con el uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, dirigido contra los receptores NKl , NK2 y/o NK3 por administración directa al ser humano, para el tratamiento del cáncer.
La invención también comprende un método para el tratamiento terapéutico del cáncer en el hombre, que comprende la administración de una cantidad efectiva de un anticuerpo o un fragmento del mismo contra los receptores NKl, NK2 y/o NK3 lo que modifica la actividad de los mismos en las células.
En esta invención, el término "administración directa" significa que el tratamiento no se hace mediante vacunación con una forma inmunogénica de los receptores NKl, NK2 y/o NK3 para la producción de anticuerpos por el mismo paciente. En la presente invención, el anticuerpo se produce fuera del cuerpo y se administra al paciente.
El tratamiento propuesto por la presente invención es útil para pacientes afectos de cáncer, en estado asintomático, sintomático, en tratamiento neoadyuvante (tratamiento antes de cirugía), en tratamiento adyuvante (tratamiento complementario después de la cirugía, cuando no hay tumor macroscópico detectable) y en tratamiento de la enfermedad en estadio metastático.
Por "cáncer" se entiende un tumor maligno de potencial crecimiento ilimitado que se expande localmente por invasión y sistémicamente por metástasis. De acuerdo con la presente invención, el anticuerpo o el fragmento del mismo contra los receptores NKl , NK2 y/o NK3, se administran a individuos con un cáncer.
Las células tumorales sobre las que actúan los anticuerpos dirigidos contra los receptores NKl, NK2 y/o NK3 se seleccionan de entre células primarias de melanoma maligno invasivo humano, células metastásicas de melanoma humano, células de melanoma humano localizadas en ganglio linfático, células de glioma humano, células de carcinoma de mama humano, células de carcinoma de pulmón de células pequeñas humano, células de carcinoma de pulmón de células grandes humano, células de carcinoma pancreático humano, células de carcinoma de próstata humano, células de carcinoma de colon humano, células de carcinoma de estómago humano, células de carcinoma de ovario humano, células de carcinoma de endometrio humano, células de carcinoma de cérvix uterino humano, células de carcinoma de tiroides humano, células de carcinoma de vejiga de la orina humano, células de coriocarcinoma humano, células de leucemia linfoblástica aguda de células B humana, células de leucemia linfoblástica aguda de células T humana, células de linfoma de Burkitt humano, células de linfoma de Hodgkin humano, células de neuroblastoma humano, células de retinoblastoma humano, células de Sarcoma de Ewing humano, células de Rabdomiosarcoma humano y células de Osteosarcoma humano, entre otras (Ver Tabla i).
Como se usa aquí "anticuerpo contra los receptores NK1 , NK2 y/o NK3" significa cualquier anticuerpo policlonal o monoclonal contra los receptores NK1 , NK2 y/o NK3. La invención también contempla el uso de fragmentos de estos anticuerpos. Un fragmento de anticuerpo significa una parte de un anticuerpo contra los receptores NK1, NK2 y/o NK3 que es de un tamaño suficiente y conformación adecuada para unirse a un epítopo presente en los receptores NK1, NK2 y/o NK3 y así modificar su funcionamiento normal, incluyendo el hecho de evitar que la sustancia P u otros agonistas de estos receptores, se unan a los mencionados receptores.
Como se usa aquí, el término "específico" significa que el anticuerpo no tiene asociaciones al azar con otros antígenos. Numerosas técnicas de ensayo bien conocidas basadas en reacciones inmunológicas entre antígenos y anticuerpos pueden ser utilizadas usando los receptores NK1, NK2 y/o NK3 como antígeno para determinar si un anticuerpo particular o un fragmento de anticuerpo tiene la capacidad de unirse a un epítopo presente en los receptores NK1, NK2 y/o NK3, y para, potencialmente, modificar la actividad de los mismos. Estas técnicas pueden ser, por ejemplo, "enzyme-linked immunosorbent assays" (ELISA), ensayos de inmunofluorescencia (IFA), radioinmunoensayos, inmunoelectroforesis, e "inmunoblotting". Además, para determinar si un anticuerpo particular o un fragmento de anticuerpo tiene la capacidad de tratar el cáncer, se puede usar un ensayo de inducción de apoptosis, que incluya la tinción con DAPI (4'-6-diamidino-2- fenilindol) o con anexina.
Constituye otro objeto de la presente invención la utilización de un anticuerpo o fragmento del mismo generado para modificar el funcionamiento de los receptores NK1, NK2 y/o NK3, en la elaboración de una composición farmacéutica o medicamento para el tratamiento del cáncer. Debe entenderse que la composición farmacéutica o medicamento, contra los receptores NK1, NK2 y/o NK3 está en una forma aceptable farmacéuticamente para ser administrado a un individuo de forma directa, preferentemente mediante administración intravenosa, oral, parenteral, o por cualquier otra vía. La administración intravenosa se refiere directamente a la aplicación del anticuerpo o fragmento del mismo o de una composición farmacéutica que lo comprenda, directamente en el torrente sanguíneo del paciente. La administración oral puede implicar la deglución, de modo que el anticuerpo o fragmento del mismo, así como una composición farmacéutica que lo comprenda entra en el tracto gastrointestinal, o puede utilizarse la administración bucal o sublingual mediante las cuales el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca. La administración parenteral se refiere a vías de administración distintas de la entérica, transdérmica o por inhalación, y típicamente es por inyección o infusión. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intramuscular y/o subcutánea.
Además, el anticuerpo o fragmento del mismo, contra los receptores NKl, NK2 y/o NK3 de la invención, puede ser administrado sólo o en una composición con vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. Una persona experta en la materia adaptará la composición dependiendo de la forma particular de administración. En el caso de administrar un anticuerpo purificado, la administración oral es el método preferido y se consigue preferiblemente a través de formas de dosificación sólidas, que incluyen cápsulas, tabletas, pastillas, polvos y gránulos, entre otros, o por formas de dosificación líquida. Las preparaciones del anticuerpo contra los receptores NKl, NK2 y/o NK3 para la administración parenteral preferentemente incluyen soluciones acuosas o no acuosas estériles, suspensiones o emulsiones, entre otras.
El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos. De la misma manera, los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados variarán dependiendo de la forma de dosificación particular seleccionada. Además, los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados pueden seleccionarse para una función particular que pueden tener en la composición. Por ejemplo, ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para facilitar la producción de formas de dosificación uniformes. Ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para facilitar la producción de formas de dosificación estables. Ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para facilitar el transporte del compuesto o compuestos de la invención una vez administrados al paciente desde un órgano o parte del cuerpo a otro órgano o parte del cuerpo. Ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden seleccionarse por su capacidad para mejorar la aceptación por parte del paciente. Los excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen los siguientes tipos de excipientes, sin excluir otros conocidos en el estado de la técnica: diluyentes, cargas, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, deslizantes, agentes de granulación, agentes de recubrimiento, agentes hidratantes, disolventes, co-disolventes, agentes de suspensión, emulsionantes, edulcorantes, aromatizantes, agentes para enmascarar el sabor, agentes colorantes, agentes contra la formación de tortas, humectantes, agentes quelantes, plastificantes, agentes para aumentar la viscosidad, antioxidantes, conservantes, estabilizantes, tensioactivos y agentes tamponantes. El especialista en la técnica apreciará que ciertos excipientes farmacéuticamente aceptables pueden realizar más de una función y pueden realizar funciones alternativas dependiendo de la cantidad de excipiente que esté presente en la formulación y qué otros ingredientes estén presentes en la formulación. Los especialistas tienen el conocimiento y habilidad en la técnica que les permite seleccionar excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados en las cantidades apropiadas para uso en la invención. Además, hay varios recursos disponibles para el especialista en la técnica que describen excipientes farmacéuticamente aceptables y pueden ser útiles en la selección de excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados. Los ejemplos incluyen Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company), The Handbook of Pharmaceutical Additives (Gower Publishing Limited), y The Handbook of Pharmaceutical Excipients (the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press).
La dosificación del ingrediente activo podrá ser seleccionada dependiendo del efecto terapéutico deseado, la vía de administración y la duración del tratamiento. La dosis de administración y la frecuencia dependerán del tamaño, edad y condiciones de salud generales del individuo, teniendo en cuenta la posibilidad de efectos secundarios. La administración también dependerá del tratamiento simultáneo con otros fármacos y la tolerancia de cada individuo al fármaco administrado. Las personas expertas en la materia podrán establecer la dosis apropiada usando procedimientos estándares. Se entiende que la dosis deberá ser la cantidad efectiva de anticuerpo o fragmento del mismo, en el sentido de que el tratamiento tenga como mínimo el mismo o mejor efecto que las terapias actuales en estos pacientes.
La composición puede comprender el anticuerpo o fragmento del mismo como único agente contra el cáncer o combinaciones del mismo con otros agentes terapéuticos dependiendo de la condición.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los habitualmente entendidos por una persona experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
Descripción de las figuras
Figura 1. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de adenocarcinoma de colon humano (SW-403) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und Zellkultures) y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 2. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de adenocarcinoma de mama humano (MCF-7) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 3. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de adenocarcinoma de ovario humano (EFO-27) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 4. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de adenocarcinoma de páncreas humano (CAPAN-1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), o anti- NK3 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 5. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de adenocarcinoma de páncreas humano (PA-TU-8902) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 6. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de adenocarcinoma de pulmón humano (DV-90) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 7. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de adenocarcinoma gástrico humano (23132/87) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 8. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de cérvix uterino humano (KB) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 9. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de cérvix uterino humano (BT-B) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 10. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de endometrio humano (AN3-CA) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 11. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de mama humano (MT-3) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 12. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de mama humano (MDA-MB-468) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 13. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de ovario humano (COLO-704) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 14. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de ovario humano (FU-OV-1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 15. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de próstata humano (22RV1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 16. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano (HCC-44) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 17. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano (COR-L23) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa ECACC (European Collection of Cell Cultures) y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 18. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de pulmón de células pequeñas humano (H- 209) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 19. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de pulmón de células pequeñas humano (H- 1963) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 20. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de pulmón de células pequeñas humano (H69) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa ECACC y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 21. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de pulmón humano (A-427) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 22. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de tiroides humano (8505C) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NK2 (A) o anti-NK3 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 23. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de tiroides papilar humano metastatizante (B-
CPAP) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 24. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma de vejiga de la orina humano (5637) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados. Figura 25. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma ductal de mama humano (BT-474) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 26. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma folicular de tiroides humano (TT2609-C02) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 27. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma transicional de vejiga de la orina humano (RT- 4) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 28. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de carcinoma urotelial de vejiga de la orina humano (647-V) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 29. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de coriocarcinoma humano (AC-1M32) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 30. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de fibrosarcoma humano (HT-1080) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados. Figura 31. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de glioma humano (GAMG) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 32. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de histiocistoma fibroso maligno humano (U-2197) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 33. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de leucemia humana de células T/NK (YT) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 34. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de leucemia linfoblástica B humana (SD1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 35. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de leucemia linfoblástica T humana (BE- 13) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 36. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de linfoma B humano (BC-1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados. Figura 37. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de linfoma B humano (SU-DHL-16) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 38. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de linfoma de Burkitt humano (CA-46) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 39. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de linfoma de Hodgkin humano (KM-H2) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 40. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de linfoma T humano (DERL-7) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 41. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de linfoma T humano (SUP-T1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 42. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de melanoma humano (MEL HO) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados. Figura 43. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de melanoma humano (COLO 679) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 44. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de melanoma humano con metástasis en ganglio linfático (COLO 858) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa ICLC (Interlab Cell line collection -CBA- Genova) y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 45. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de mieloma múltiple humano (COLO 677) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 46. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de neuroblastoma humano (KELLY) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 47. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial neuroblastoma humano (IMR-32) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 48. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de neuroblastoma humano, médula ósea (SKN-BE 2) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa ICLC y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados. Figura 49. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de osteosarcoma humano (MG-63) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa ICLC y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 50. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de osteosarcoma humano (CAL-72) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 51. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de rabdomiosarcoma humano (A-204) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 52. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de retinoblastoma humano (Y-79) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti-NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 53. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de retinoblastoma humano (WERI-Rb-1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 54. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de sarcoma de Edwing humano (MHH-ES-1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A), anti-NK2 (B) o anti- NK3 (C) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados. Figura 55. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea celular comercial de sarcoma del estroma endometrial humano (ESS-1) obtenida de la colección de líneas celulares de la empresa DSMZ y cultivadas en las condiciones indicadas por dicha empresa, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl (A) o anti-NK2 (B) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia de los anticuerpos mencionados.
Figura 56. Inhibición de la proliferación (expresado en porcentaje respecto a los cultivos control) en la línea de células de endotelio humano (C- 12210) mediante el tratamiento con el anticuerpo anti-NKl (A) a los títulos de anticuerpo mostrados en la gráfica y durante 48, 72 y 96 horas. Como control de proliferación las células se cultivaron en ausencia del anticuerpo mencionado.
Descripción detallada de la invención. Una de las realizaciones de la invención consiste en el uso de al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.
Otra realización de la invención consiste en el uso de al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para la producción de apoptosis en las células tumorales.
Otra forma preferida de realización de la invención comprende el uso de al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para reducir el tamaño los tumores. Dicha reducción del tamaño tumoral se realiza, mediante la modificación del microambiente peritumoral, que comprende, la modificación de la fisiología de la matriz estromal y las células estromales que rodean a los tumores, la modificación de la fisiología de las células propias de dicha matriz (fibroblastos), la modificación de la fisiología de las células de la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, y la modificación de la fisiología de las células propias de la vascularización, como por ejemplo las células del endotelio vascular, de las zonas tumorales y peritumorales. Todo ello dirigido a modificar la fisiología de las zonas peritumorales que presenta unas características peculiares y distintas a la fisiología de las mismas en ausencia del tumor, que condicionan el microambiente peritumoral y que promueven el desarrollo y la progresión de los tumores. La modificación de dicha fisiología peculiar de las zonas peritumorales mediante el uso de anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 y anti NK-3, está encaminada a que reducir el tamaño de los tumores y a evitar su progresión. En este sentido la modificación de la fisiología de la matriz estromal y de las células estromales y/o de la fisiología de las células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune comprende la inhibición de marcadores tumorales. Dichos marcadores tumorales se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de la lista: NF-kB, TGF alfa, TGFbeta 1 , TGFbeta 2, TGFbeta 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13, MMP-14 y/o cualquiera de sus combinaciones. Además, la modificación de la fisiología de las células responsables de la vascularización comprende la inhibición de la neovascularización, preferentemente mediante la inhibición de la proliferación de las células del endotelio vascular. Como se ha comentado anteriormente, todo ello va dirigido a reducir el tamaño del tumor y evitar su progresión.
El tipo cáncer a tratar con el uso de los compuestos de la invención se selecciona del grupo que comprende melanoma, tumores de estirpe glial, carcinomas, adenocarcinomas, leucemias, linfomas, mielomas, neuroblastomas (y otros tumores de tipo germinal o neuroectodérmico), y/o sarcomas.
Más preferentemente, el carcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: de mama, incluyendo el ductal, de pulmón, incluyendo tanto el de células pequeñas como el de células no pequeñas, de tiroides, incluyendo tanto el folicular como el papilar, del aparato digestivo, de próstata, de cérvix uterino, de endometrio, de ovario, de vejiga, incluyendo tanto el endotelial como el transicional y/o de coriocarcinoma.
A su vez, el adenocarcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: mama, ovario, páncreas, pulmón y del aparato digestivo incluido el de estómago y el de colon.
Por su parte la leucemia es preferentemente la leucemia linfoblástica humana de células T, de células B, y/o de células Ί7ΝΚ. Los linfomas son preferentemente de estirpe B, de estirpe T, de tipo Hodgkin y/o de tipo Burkitt.
Los tipos de sarcoma a tratar mediante el uso de los anticuerpos de la invención son preferentemente osteosarcomas, rabdomiosarcomas, fibrosarcomas, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma del estroma endometrial y/o sarcoma de Edwing.
Por otra parte, otras neoplasias a tratar mediante el uso de los anticuerpos de la invención son preferentemente el neuroblastoma, así como otras neoplasias de origen germinal y/ neuroectodérmico.
El anticuerpo usado en la presente invención, preferentemente, reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1, NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3.
Otra forma preferida de realización de la invención consiste en una composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo específico contra los receptores NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos. El anticuerpo usado en la presente invención, preferentemente, reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1 , NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO : l , SEQ ID NO : 2 o SEQ ID NO : 3. Dicha composición farmacéutica, además, puede comprender también vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Dentro del ámbito de la presente invención se encuentra también el uso de dicha composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer. Más particularmente, dicho cáncer se selecciona de entre el grupo que comprende: melanoma, carcinomas, adenocarcinomas, leucemias, linfomas, neuroblastomas (u otros tumores embrionarios o neuroectodérmicos) y/o sarcomas.
Más preferentemente, el carcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: de mama, incluyendo el ductal, de pulmón, incluyendo tanto el de células pequeñas como el de células no pequeñas, de tiroides, incluyendo tanto el folicular como el papilar, del aparato digestivo, de próstata, de cérvix uterino, de endometrio, de ovario, de vejiga, incluyendo tanto el endotelial como el transicional y/o de coriocarcinoma.
A su vez, el adenocarcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: mama, ovario, páncreas, pulmón y del aparato digestivo incluido el de estómago y el de colon.
Por su parte la leucemia es preferentemente la leucemia linfoblástica humana de células T, de células B, y/o de células T/NK. Los linfomas son preferentemente de estirpe B, de estirpe T, de tipo Hodgkin y/o de tipo Burkitt.
Los tipos de sarcoma a tratar mediante el uso de la composición farmacéutica de la invención son preferentemente osteosarcomas, rabdomiosarcomas, fibrosarcomas, histiocitoma fibroso maligno, sarcoma del estroma endometrial y/o sarcoma de Edwing.
Por otra parte, otras neoplasias a tratar mediante el uso de la composición farmacéutica de la invención son preferentemente el neuroblastoma, así como otras neoplasias de origen germinal y/ neuroectodérmico.
Otra forma preferida de realización de la presente invención consiste en el uso de la composición farmacéutica anteriormente mencionada para la producción de apoptosis en las células tumorales.
Una forma todavía más preferida de puesta en práctica de la presente invención consiste en el uso de la composición farmacéutica anteriormente mencionada para reducir el tamaño de los tumores, mediante la modificación del microambiente peritumoral, que comprende la modificación de la fisiología propia de la matriz estromal y las células estromales que rodean a los tumores, la modificación de la fisiología propia de las células propias de la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, y/o la modificación de la fisiología propia de las células propias de la vascularización de las zonas tumorales y peritumorales. En este sentido la modificación de la fisiología de la matriz estromal y de las células estromales y/o de la fisiología de las células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune comprende la inhibición de marcadores tumorales. Dichos marcadores tumorales se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de la lista: NF-kB, TGF alfa, TGFbeta 1 , TGFbeta 2, TGFbeta 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13, MMP-14 y/o cualquiera de sus combinaciones. Además la modificación de la fisiología de las células responsables de la vascularización comprende la inhibición de la neovascularización, preferentemente mediante la inhibición de la proliferación de las células del endotelio vascular.
La invención también comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para ser usado en el tratamiento del cáncer. El anticuerpo usado en la presente invención, preferentemente, reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1, NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3.
Una forma preferida de realización de la invención consiste en al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para inducir apoptosis en las células tumorales. El anticuerpo usado en la presente invención, preferentemente, reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1, NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO: l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3.
Una forma adicional de realización de la presente invención comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para reducir el tamaño de los tumores, mediante la modificación del microambiente peritumoral, que comprende la modificación de la fisiología propia de la matriz estromal y las células estromales que rodean a los tumores, la modificación de la fisiología propia de las células propias de la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria, y/o la modificación de la fisiología propia de las células propias de la vascularización de las zonas tumorales y peritumorales. En este sentido la modificación de la fisiología de la matriz estromal y de las células estromales y/o de la fisiología de las células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune comprende la inhibición de marcadores tumorales. Dichos marcadores tumorales se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de la lista: NF-kB, TGF alfa, TGFbeta 1, TGFbeta 2, TGFbeta 3, SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13, MMP-14 y/o cualquiera de sus combinaciones. Además la modificación de la fisiología de las células responsables de la vascularización comprende la inhibición de la neovascularización, preferentemente mediante la inhibición de la proliferación de las células del endotelio vascular. El anticuerpo usado en la presente invención, preferentemente, reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1 , NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3.
Otra realización de la invención consiste en un método de tratamiento del cáncer que comprende la administración a un paciente de una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o fragmento del mismo específico contra los receptores celulares NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, o de una composición farmacéutica según lo descrito con anterioridad que comprenda dichos anticuerpos. El anticuerpo usado en la presente invención, preferentemente, reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1, NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3. Los tipos de cánceres que pueden ser tratados mediante el método descrito en la presente invención, son los mismos que se han descrito anteriormente.
En una realización todavía más preferida de la presente invención dicho método está caracterizado por que incrementa la apoptosis de células tumorales mediante la administración a un paciente de una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo o fragmento del mismo específico contra los receptores celulares NKl, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, o de una composición farmacéutica como las mencionadas anteriormente, que comprenda dichos anticuerpos. El anticuerpo usado en la presente invención, preferentemente, reconoce al menos una secuencia de los receptores NKl, NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO: l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3.
En otra forma adicional de puesta en práctica de la invención dicho método está caracterizado por que reduce el tamaño tumoral mediante la modificación del microambiente peritumoral y/o la respuesta inflamatoria y/o inmunitaria peritumoral, según se ha descrito anteriormente.
La forma preferida de administración de los anticuerpos o de las composiciones farmacéuticas que los contienen en humanos es la directa.
Las realizaciones particulares y los datos presentados, se proporcionan a modo de ilustración y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Ejemplo 1. El tratamiento con anticuerpos frente a los receptores de NKl, NK2 y NK3 inhibe la proliferación e induce apoptosis en líneas celulares de diferentes tipos de cáncer.
Líneas Celulares Tumorales Comerciales A continuación en la Tabla 1 se detalla una selección de las líneas celulares tumorales comerciales específicas sobre las que actúan los anticuerpos dirigidos hacia los receptores NKl, NK2 y/o NK3. Dichas líneas celulares comerciales se cultivaron de acuerdo a las instrucciones proporcionadas por las diferentes empresas comercializadoras, DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und Zellkulturen), ICLC (Interlab Cell line collection -CBA- Génova) y ECACC (European Collection of Cell Cultures). Brevemente, las líneas celulares comerciales tumorales se mantuvieron en cultivo en medio DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium, modificación simple del Medio Basal de Eagle) o RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute) (Gibco, Barcelona, España) suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) inactivado mediante tratamiento con calor. Además se añadieron al medio de cultivo un 1 % de antibióticos- antimicóticos (Invitrogen). Las líneas celulares se sembraron en frascos de cultivo con una superficie de 75-cm2 (Falcon, Heidelberg, Alemania). El medio de cultivo se renovaba cada dos días. Las células se incubaban en cámaras de cultivo a una temperatura de 37°C y en una atmósfera humidificada con un 95% de aire y un 5% de CO2. Transcurridos 6 días a partir de la siembra de las células, éstas se recogían mediante tratamiento con tripsina (0.05 y 0.02% EDTA sin calcio ni magnesio; Sigma-Aldrich, Madrid, España). Todas las células se privaron de suero durante la noche anterior a la realización de los experimentos si no se indica lo contrario. En todas estas líneas celulares se comprobó la presencia de receptores NKl, NK2 y NK3 y se constató la acción antitumoral de los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 y anti-NK3.
Tabla 1. Líneas celulares tumorales humanas utilizadas para demostrar la acción antitumoral de los anticuerpos contra los receptores NKl , NK2 y NK3.
Empresa
Tipo de tumor Línea celular
comercializadora
Adenocarcinoma de colon humano SW-403 DSMZ
Adenocarcinoma de mama humano MCF-7 DSMZ
Adenocarcinoma de ovario humano EFO-27 DSMZ
Adenocarcinoma de páncreas humano CAPAN- 1 DSMZ
Adenocarcinoma de páncreas humano PA-TU 8902 DSMZ
Adenocarcinoma de pulmón humano DV-90 DSMZ
Adenocarcinoma gástrico humano 23132/87 DSMZ
Carcinoma de cérvix uterino humano KB DSMZ
Carcinoma de cérvix uterino humano BT-B DSMZ
Carcinoma de endometrio humano AN3-CA DSMZ
Carcinoma de mama humano MT-3 DSMZ
Carcinoma de mama humano MDA-MB-468 DSMZ
Carcinoma de ovario humano COLO-704 DSMZ
Carcinoma de ovario humano FU-OV-1 DSMZ
Carcinoma de próstata humano 22RV1 DSMZ
Carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano HCC-44 DSMZ
Carcinoma de pulmón de célula no pequeña humano COR-L23 ECACC
Carcinoma de pulmón de células pequeñas humano H-209 DSMZ
Carcinoma de pulmón de células pequeñas humano H-1963 DSMZ
Carcinoma de pulmón de células pequeñas humano H69 ECACC
Carcinoma de pulmón humano A-427 DSMZ
Carcinoma de tiroides humano 8505C DSMZ
Carcinoma de tiroides papilar humano
B-CPAP DSMZ
metastatizante
Carcinoma de vejiga de la orina humano 5637 DSMZ
Carcinoma ductal de mama BT-474 DSMZ Tabla 1 (continuación)
Empresa
Tipo de tumor Línea celular
comercializadora
Carcinoma folicular de tiroides humano TT2609-C02 DSMZ
Carcinoma transicional de vejiga de la orina
RT-4 DSMZ
humano
Carcinoma urotelial de vejiga de la orina humano 647-V DSMZ
Coriocarcinoma humano AC-1M32 DSMZ
Fibrosarcoma humano HT-1080 DSMZ
Glioma humano GAMG DSMZ
Histiocitoma fibroso maligno humano U-2197 DSMZ
Leucemia humana de células T/NK YT DSMZ
Leucemia linfoblástica B (células linfoblastoides B
SD1 DSMZ
humanas periféricas)
Leucemia linfoblástica T humana BE- 13 DSMZ
Linfoma B humano BC-1 DSMZ
Linfoma B humano SU-DHL-16 DSMZ
Linfoma de Burkitt humano CA-46 DSMZ
Linfoma de Hodgkin humano KM-H2 DSMZ
Linfoma T humano DERL-7 DSMZ
Linfoma T humano SUP-T1 DSMZ
Melanoma humano MEL HO DSMZ
Melanoma humano COLO 679 DSMZ
Melanoma humano, metástasis en ganglio linfático COLO 858 ICLC
Mieloma múltiple humano COLO-677 DSMZ
Neuroblastoma humano KELLY DSMZ
Neuroblastoma humano IMR-32 DSMZ
Neuroblastoma humano, médula ósea. SKN-BE 2 ICLC
Osteosarcoma humano MG-63 ICLC
Osteosarcoma humano CAL-72 DSMZ
Rabdomiosarcoma humano A-204 DSMZ
Retinoblastoma humano Y-79 DSMZ
Retinoblastoma humano WERI-Rb-1 DSMZ
Sarcoma de Edwing humano MHH-ES-1 DSMZ
Sarcoma del estroma endometrial humano ESS-1 DSMZ
DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikrorganismen und Zellkulturen. ICLC: Interlab Cell line collection -CBA- Génova. ECACC: European Collection of Cell Cultures. Western Blot
Para los análisis de Western Blot, se estudiaron muestras de cada una de las líneas celulares comerciales que se muestran en la Tabla 1. Dicha técnica se empleó para comprobar que todas las líneas celulares, tanto las comerciales como las obtenidas directamente de muestras humanas (cultivos primarios), mostraban presencia de receptores NKl, NK2 y NK3. Brevemente, la extracción de las proteínas totales se realizó a partir de las muestras obtenidas de los cultivos celulares tumorales. Las células se Usaron mediante métodos comúnmente conocidos en el estado de la técnica y se cuantificó su concentración mediante un kit comercial "Protein Assay" de Bio- Rad (Bio-Rad Laboratories, S.A. Madrid), siguiendo para ello las instrucciones del fabricante. De cada muestra, 50 mg de proteína se separaron por electroforesis en geles al 10% SDS- poliacrilamida y se transfirieron electroforéticamente a membranas de fluoruro de polivinilideno (PVDF). Dichas membranas fueron incubadas durante toda la noche en una solución de bloqueo (5% de leche descremada en tampón fosfato (PBS) con un 0,1% de Tween-PBST), seguido de una incubación durante la noche con los anticuerpos primarios diluidos 1/4000 en tampón PBST: anti-NKl : anticuerpo que reconoce el dominio correspondiente a la región carboxilo terminal del receptor NKl entre los aminoácidos 393-407 (SEQ ID NO: 1), obtenido de la empresa Sigma-Aldrich y cuyo número de producto es S8305.
anti-NK2: que reconoce la secuencia SEQ ID NO: 2 del receptor NK2 obtenido de Sigma- Aldrich y cuyo número de producto es HPA012084.
anti-NK3 : que reconoce la secuencia SEQ ID NO:3 del receptor NK3, obtenido de Sigma- Aldrich y cuyo número de producto es HPA009418.
A continuación, las membranas fueron lavadas con tampón fosfato salino (PBS) y en presencia del detergente Tween-20 (PBST) y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano durante 2 horas a temperatura ambiente (dilución 1 :10000). Para confirmar que se había cargado la misma cantidad de proteína, las membranas se incubaron con el anticuerpo monoclonal anti-P-tubulina. La detección de anticuerpos se realizó con una reacción de quimioluminiscencia (ECL Western Blot detección; Amersham Life Science, Reino Unido). Elaboración de bloques celulares incluidos en parafina y realización de inmunohistoquímica de los receptores NKL NK2 y NK3.
La técnica de Inmunohistoquímica permite la detección de moléculas mediante la aplicación de un anticuerpo primario específico para un epítopo de dichas moléculas que se pone en evidencia mediante la aplicación de un anticuerpo secundario que reconoce un epítopo del anticuerpo primario y que incluye un sistema de visualización que puede ser fluorescente o cromogénico (en la presente invención se utilizó un método de visualización cromogénico). El método de imunohistoquímica permite, por lo tanto, visualizar estas moléculas y valorar su ubicación exacta en las células o en el estroma extracelular, al poderse realizar el estudio sobre secciones histológicas. Las técnicas inmunohistoquímicas se emplearon para comprobar que todas las líneas celulares, tanto comerciales, como las primarias, mostraban la presencia de receptores NK1, NK2 y NK3.
Una muestra de cada uno de los cultivos de las líneas celulares se centrifugó (5 minutos a 1.500 rpm) y el pellet obtenido se deshidrató mediante un tratamiento a concentraciones crecientes de etanol y, finalmente, en xilol. A continuación, dichas muestras deshidratadas se incluyeron en parafina creándose un bloque de células. Dichos bloques de parafina se cortaron en un microtomo a un grosor de 5 mieras y se desparafinizaron mediante su inmersión en xilol, para posteriormente ser hidratados a través de una serie de soluciones que contienen concentraciones decrecientes de etanol, para finalmente, sumergirlos en agua. Después, dichas muestras se sometieron a un tratamiento en olla a presión en tampón citrato lOx a pH 6.0, para obtener una mayor exposición de los antígenos. Posteriormente, las muestras se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos. La actividad peroxidasa endógena fue bloqueada con peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar las muestras con 0,05 M de tampón Tris, se incubaron con suero de cerdo no-inmune al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Posteriormente, y para comprobar la expresión de receptores NK1 , NK2 y NK3, las muestras celulares se incubaron en presencia de los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3 (Sigma-Aldrich) diluidos 1 :500, durante toda la noche a 4°C. Transcurrido dicho tiempo se lavaron en tampón Tris 0,05 M a temperatura ambiente. El siguiente paso fue la adición de los reactivos Envision System-HRP (Dako) durante 30 min a temperatura ambiente. Trascurrido dicho tiempo, se lavaron nuevamente las muestras en tampón Tris 0,05 M, y la inmunorreactividad fue visualizada mediante microscopía de luz con una solución cromogénica con 3,3'-Diaminobencidina (DAB+; Dako, USA). Para diferenciar los núcleos celulares, éstos se tiñeron ligeramente con hematoxilina. Como control negativo, se utilizaron muestras a las que no se les incubó con el anticuerpo primario anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3, respectivamente, siendo reemplazado por suero no inmune. Todas las muestras fueron evaluadas. Además, se incluyó un control negativo, en el que el anticuerpo primario fue omitido, siendo reemplazado por suero no inmune.
Ensayos de Proliferación
La proliferación celular se evaluó mediante el compuesto tetrazolium 3-(4, 5-dimetiltiazol- 2-il)-5-(3-carboximetoxifenil) 2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolium (MTS) de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Kit "CellTiter 96 Aqueous One-Solution Cell Proliferation Assay" Promega, USA; protoco lo completo de us o disp onib le en url : http://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/0/celltiter-96-aqueous-one- solution-cell-proliferation-assay-system-protocol/). El número de células se cuantificó usando un contador Coulter. En las placas de cultivos celulares tumorales se incluyó una muestra blanco (sin células) y una muestra control (que contenía 104 cel/ml). Las placas de cultivo se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de los anticuerpos monoclonales anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3. Para obtener la tinción en los ensayos de proliferación, se añadieron 20 μΐ de MTS a cada uno de los pocilios de las placas de cultivo celular 90 minutos antes de realizar la lectura de las muestras en un espectrofotómetro multiescaner (TECAN Spectra classic, Barcelona, España) a 492 nm (longitud de onda del ensayo) y 690 nm (longitud de onda de referencia). Las diferentes dosis se ensayaron por duplicado y cada experimento se realizó por triplicado.
Determinación de apoptosis: tinción con DAPI (4,,6-diamidino-2-fenilindol).
La morfología apoptótica se valoró por microscopía de fluorescencia después de hacer una tinción con DAPI. Para determinar si los anticuerpos frente a los receptores NK1, NK2 y NK3 son capaces de inducir apoptosis en cultivos de células tumorales, se llevó a cabo una tinción con DAPI. Brevemente, después del tratamiento con los anticuerpos frente a los receptores NK1 , NK2 y NK3, las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4%. Tras un segundo lavado en PBS, las células fueron incubadas en solución de DAPI (Sigma-Aldrich) a una concentración de 1/1000 durante 30 minutos en oscuridad. Posteriormente, se observaron las células a través de un microscopio de fluorescencia (Zeiss, Oberkochen, Alemania). Las células apoptóticas se identificaron por características típicas de apoptosis (p.e. condensación nuclear, vacuolización nuclear, pérdida de la integridad de la membrana nuclear y formación de cuerpos apoptóticos). Se contaron el número de células apoptóticas, repitiendo el contaje en tres portaobjetos distintos.
Los anticuerpos frente a los receptores NK1, NK2 y NK3 utilizados en la presente invención son los anticuerpos policlonales de ratón obtenidos de Sigma-Aldrich, citados anteriormente.
Con el objetivo de analizar si se producía muerte celular o apoptosis como resultado de la modificación de la actividad de los receptores NK1, NK2 y/o NK3 mediante el tratamiento con los anticuerpo anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3, en primer lugar se procedió a la siembra de los cultivos celulares de las líneas celulares comerciales relacionadas con cánceres humanos según recomendaciones de los fabricantes y usos habituales de laboratorio (ver apartado "Líneas Celulares Tumorales Comerciales"). Cuando los cultivos celulares presentaban una confluencia - las células dejan de dividirse, el cultivo se ha saturado, se produce inhibición por contacto en las células en monocapa y consumo del medio en las células en suspensión- de aproximadamente un 85%, se les retiraba el suero y se cultivaban durante una noche en medio de cultivo sin suero. A continuación, dichos cultivos eran tratados con los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3 a diferentes concentraciones. Para determinar la presencia de apoptosis, se analizó la morfología apoptótica, identificándose las células apoptóticas por las características típicas de la apoptosis, como son la condensación nuclear, la vacuolización nuclear, la pérdida de la integridad de la membrana nuclear y la formación de cuerpos apoptóticos. Todas estas características se analizaron mediante microscopía de fluorescencia después de hacer una tinción con DAPI (Roche).
Para confirmar la presencia de apoptosis, también se analizaron los sobrenadantes de los cultivos celulares de las líneas tumorales tratadas con los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti- NK3, que incluían las células desprendidas de las placas de cultivo. Para comprobar si dichas células se habían desprendido de la placa de Petri a causa de la apoptosis de las mismas, se realizó, la tinción de DAPI de los precipitados de los sobrenadantes obtenidos de los medios de cultivo. Dichos precipitados incluían la presencia de detritus celulares junto con células que mostraron clara morfología apoptótica.
El análisis de la morfología nuclear y de la apoptosis, que se realizó cada 24 horas durante 96 horas. Las diferentes dosis se ensayaron por sextuplicado y cada experimento se realizó por triplicado. En cada caso se realizó de forma paralela una siembra control que se sometió a las mismas condiciones que las tratadas con anticuerpo anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3, excepto la exposición a dicho tratamiento.
Todas las líneas celulares comerciales de cáncer humano analizadas (ver listado completo en la Tabla 1) mostraron expresión para los receptores NK1, NK2 y NK3, comprobada tanto mediante la técnica de Westerm-Blot como por inmunohistoquímica.
Todas las líneas celulares comerciales de cáncer humano analizadas (ver listado completo en la Tabla 1) fueron sometidas a tratamiento con diferentes concentraciones de los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3 y en todas se constató la presencia de células con características típicas de apoptosis, mediante tinción con DAPI. Se comprobó el incremento en la apoptosis de dichas líneas celulares tumorales comerciales de forma dosis-dependiente, puesto que cantidades crecientes de anticuerpo anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3 incrementaron el número de células con características típicas de apoptosis. El número de células con características típicas de apoptosis se incrementó a lo largo del periodo de observación (de forma tiempo- dependiente). Estos resultados no se observaron en los cultivos control (que fueron sometidos a un procedimiento en idénticas condiciones a las anteriores, excepto la exposición al tratamiento con anticuerpo anti-NKl, anti- NK2 o anti-NK3).
En todas las líneas celulares comerciales de tumores humanos analizadas (ver listado completo en la Tabla 1 ) y sometidas a tratamiento con diferentes concentraciones de los anticuerpos anti-NKl , anti-NK2 o anti-NK3 durante diferentes tiempos, 48, 72 y 96 horas, se comprobó una inhibición de la proliferación, que resultó ser dependiente del tiempo y la dosis de tratamiento: se constató una mayor inhibición a medida que se incrementaba la dosis de los anticuerpos anticuerpos anti-NKl , anti-NK2 o anti-NK3 y el tiempo de exposición a los mismos. Las Figuras 1 a 7 se muestran ejemplos de inhibición de la proliferación de cultivos celulares de diferentes líneas de adenocarcinoma, como por ejemplo, de colon (Fig 1), de mama (Fig 2), de ovario (Fig 3), de páncreas (Fig 4 y 5), de pulmón (Fig 6) y gástrico (Fig 7).
También se llevaron a cabo análisis de la inhibición de la proliferación de cultivos celulares de líneas de diferentes carcinomas mediante el tratamiento de las mismas con los anticuerpos anti-NKl , anti-NK2 o anti-NK3 a diferentes concentraciones y durante los tiempos mencionados anteriormente, 48, 72 y 96 horas. Los resultados obtenidos se muestran en las figuras 8 a 28. Las líneas celulares tumorales comerciales de carcinomas utilizados para la obtención de dichos resultados han sido: de cérvix uterino (Fig. 8 y 9), de endometrio (Fig. 10), de mama (Fig. 11 y 12), de ovario (Fig. 13 y 14), de próstata (Fig. 15), de pulmón de células no pequeñas (Fig. 16 y 17), de pulmón de células pequeñas (Fig. 18-20), de pulmón (Fig. 21), de tiroides (Fig. 22), de tiroides papilar humano metastatizante (Fig. 23), de vejiga de la orina (Fig. 24), ductal (Fig. 25), folicular de tiroides humano (Fig. 26), transicional de vejiga de la orina (Fig. 27) y urotelial de vejiga de la orina (Fig. 28). Como se puede observar en dicha figuras, todas las líneas celulares de carcinoma muestran una inhibición de su proliferación en presencia de anticuerpos anti-NKl, anti- NK2 o anti-NK3.
Líneas celulares de coriocarcinoma (Fig 29), fibrosarcoma (Fig 30), glioma (Fig 31) e histiocitoma fibroso maligno (Fig 32), también mostraron inhibición de su proliferación, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3, poniendo de manifiesto que el tratamiento de líneas tumorales con dichos anticuerpos conduce a una disminución del tumor.
Líneas celulares de diferentes tipos de leucemias, como por ejemplo, leucemia humana de células T/NK (Fig 33), leucemia linfoblástica B (Fig 34) y leucemia linfoblástica T (Fig 35), así como líneas celulares de linf ornas, linfoma B humano (Fig 36 y 37), linfoma de Burkitt (Fig 38), linfoma de Hodgkin (Fig 39), linfoma T (Fig 40 y 41), líneas celulares de melanoma y mieloma múltiple (Figs 42 a 45), también mostraron inhibición de su proliferación, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3, mostrando nuevamente que dicho tratamiento conduce a una disminución del tumor.
Ensayos adicionales realizados en cultivos celulares de neuroblastomas (Figs 46 a 48), de osteosarcomas (Fig 49 y 50), de rabdomiosarcoma (Fig 51), de retinoblastoma (Fig 52 y 53), de sarcoma de Edwing (Fig 54) y de sarcoma del estroma endometrial (Fig 55), también mostraron inhibición de su proliferación, mediante el tratamiento con los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3, provocando la disminución del tamaño tumoral.
Además, como se ha mencionado antes, mediante tinción con DAPI, se comprobó, en todas las líneas celulares mencionadas anteriormente que el incremento en la apoptosis de dichas líneas celulares tumorales comerciales que resultó ser tiempo y dosis-dependiente puesto que cantidades crecientes de anticuerpo anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3, así como periodos crecientes de exposición, incrementaron el número de células con características típicas de apoptosis. Ejemplo 2. Modificación del microambiente peritumoral mediante el tratamiento con anticuerpos anti-NKl, NK2 y/o NK3.
Como se ha comentado en la presente invención, en la génesis y el desarrollo del cáncer no sólo intervienen mecanismos moleculares propios de las células tumorales, sino que tiene gran importancia las células del estroma, la inflamación y las interacciones entre las células tumorales y las del estroma y la inflamación (McAllister SS, et al 2010; Ikushima H, Miyazono K, 2010). En el Ejemplo 1 se ha puesto de manifiesto que el tratamiento con anticuerpos contra los receptores NKl, NK2 y NK3 induce apoptosis en diversas líneas celulares tumorales comerciales. En el presente ejemplo se pone de manifiesto que, además, el tratamiento con dichos anticuerpos induce cambios y modificaciones en la fisiología propia de las células que constituyen el microambiente tumoral, que son beneficiosos para el tratamiento del cáncer, por ejemplo en los fibroblastos, en las células de la inflamación (mononucleares y polimorfonucleares) y en el endotelio vascular. En dicha fisiología intervienen factores cuya importancia está bien documentada en la literatura científica y cuya expresión se modifica en presencia de agonistas (por ejemplo, sustancia P) de los receptores NKl, NK2 o NK3 y en presencia de anticuerpos contra dichos receptores.
Para comprobar que los agonistas de los receptores NKl, NK2 o NK3, por ejemplo la sustancia P, inducen cambios fisiológicos y funcionales en las células del estroma -fibroblastos- y en las células de la inflamación similares a los observados en estas mismas células en las zonas peritumorales y que estos efectos son revertidos por los anticuerpos contra los receptores NKl, NK2 o NK3, se ha analizado la presencia de diferentes marcadores (moléculas) en las células que forman el microambiente tumoral (ver listado más adelante, en la Tabla 2 y en la Tabla 3) en cultivos celulares primarios de fibroblastos humanos (PFH), cultivos de células sanguíneas mononucleares y polimorfonucleares primarias humanas, en presencia del agonista sustancia P de los receptores NKl, NK2 o NK3, así como en presencia de dicho agonista y de los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3 ). También se comprobó que los anticuerpos contra dichos receptores, inhiben la proliferación de las células endoteliales microvasculares de la línea comercial procedentes de prepucio juvenil (PromoCell GmH, SickingenstraBe 63/65, D-69126 Heidelberg, Germany; referencia C- 12210).
Aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios humanos (PHF).
Los PHF fueron obtenidos y purificados a partir de muestras obtenidas de la dermis de la piel de como se describe en De Barí et al (De Barí et al, 2001). Brevemente, pequeños trozos de la dermis de la piel fueron digeridos en una solución de hialuronidasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,
EE.UU.) a una concentración de 1 mg/ml durante 15 minutos a 37°C y posteriormente tratados con 6 mg/ml de colagenasa tipo IV (Invitrogen) durante 2 horas a 37°C. A continuación, se lavaron las células, se resuspendieron en medio de cultivo DMEM con alta concentración de glucosa (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, Invitrogen) suplementado con 1% de antibióticos- antimicóticos (Invitrogen) y con un 1% de piruvato de sodio (Invitrogen), y se sembraron en placas de cultivo de 6 pocilios a una concentración de 10.000 células por centímetro cuadrado. Cuando las células alcanzaron la confluencia, las células adherentes fueron separadas utilizando tripsina estéril al 0,5% (Invitrogen) y se utilizaron entre los pases 3 y 9. Para la estimulación de la sustancia P y la exposición a los anticuerpos anti-NKl , anti-NK2 y anti-NK3, los PHF se sembraron en placas de 24 pocilios a una concentración de 25.000 células por pocilio. Aislamiento y cultivo de células sanguíneas mononucleares y polimorfonucleares humanas.
La sangre heparinizada de donantes sanos se centrifugó, de forma que se separan los distintos componentes de la misma. Los glóbulos rojos quedan en el fondo del tubo. Por encima de ellos una pequeña capa blanquecina que está compuesta por los glóbulos blancos y por encima, en la parte superior del tubo el plasma sanguíneo. La capa de glóbulos blancos se distribuyó en una placa de cultivo de 24 pocilios añadiéndole en cada uno de ellos la misma concentración de plasma sanguíneo suplementado con un 1% de antibióticos-antimicóticos (Invitrogen). En cada pocilio se añadieron además, aproximadamente 1000 células (PHF) procedentes de la dermis cutánea, obtenidas según se ha descrito previamente.
Cultivo y estudios de proliferación de células endoteliales en presencia de los anticuerpos contra los receptores NK1, NK2 y NK3.
Se utilizaron también cultivos celulares de una línea celular comercial constituida por células endoteliales microvasculares procedentes de prepucio juvenil (PromoCell GmbH,
SickingenstraBe 63/65, D-69126 Heidelberg, Germany; referencia C-12210). Se realizaron estudios de proliferación, de manera similar a la explicada en el ejemplo 1 (ver apartado "ensayos de proliferación"), en presencia de los anticuerpos contra los receptores NK1, NK2 y NK3.
Como se ha comentado previamente, para analizar la modificación del microambiente peritumoral mediante el tratamiento con anticuerpos anti-NKl , NK2 y/o NK3, se han analizado, por un lado en PHF, la presencia de marcadores celulares específicos. Dichos marcadores, como por ejemplo el TGFalfa, el SPARC y las metaloproteasas (MMPs) se han asociado a la progresión tumoral (Coussens L y Werb Z. 2002; Carmeliet P y RK Jain. 2000). Específicamente, en relación a las MMPs, existen diversos fármacos conocidos como inhibidores de las mismas que se están estudiando en el tratamiento del cáncer.
Con el objetivo de analizar la expresión de dichos marcadores celulares en cultivos de PHF en presencia del agonista de los receptores NK1, NK2 y NK3 y en presencia de anticuerpos anti- NKl, NK2 o NK3, se procedió al cultivo de dichas células en presencia de la Sustancia P (agonista de los receptores NKl, NK2 y NK3) a una concentración de 1 μΜ (N° producto S6883; Sigma- Aldrich). En otros pocilios y de manera simultánea se cultivaron estas células con Sustancia P a la misma concentración y de manera simultánea conjuntamente con los anticuerpos anti- NKl, anti- NK2 o anti-NK3 (Sigma- Aldrich) a una concentración 1/100. Transcurridas 48 horas de cultivo, las células fueron recolectadas y se construyeron bloques celulares de parafina para los análisis inmunohistoquímicos, según se ha explicado en el Ejemplo 1. En los ensayos inmunohistoquímicos se estudió la expresión de los marcadores: TGF-alfa (SAB4502953), TGF )eta 1 (SAB4502954), TGF-b eta 2 (SAB4502956), TGF-beta 3 (SAB4502957), SPARC (HPA002989) MMP-3 (HPA007875); MMP-7 (SAB4501894), MMP-9 (SAB4501896), MMP-11 (SAB4501898), MMP- 13 (SAB4501900) y MMP-14 (SAB4501901), mediante anticuerpos específicos frente a los mismos. Para la realización de estos estudios inmunohistoquímicos todos los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos policlonales de ratón obtenidos de Sigma Aldrich y se utilizaron a una concentración 1/1000. Las técnicas inmunohistoquímicas se realizaron según se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se resumen en la Tabla 2, en la que se indica el tipo de marcador y el porcentaje medio de células que presentaban inmunotinción para dicho marcador.
Para valorar la inmunotinción se realizaron seis cortes seriados de cada uno de los bloques que se depositaron sobre portaobjetos para la realización de la técnica de inmunohistoquímica para cada marcador. De este modo, la determinación inmunohistoquímica se realizó en seis ocasiones para cada marcador en cada uno de los casos. En cada uno de los seis cortes se realizó un contaje de las células en 20 campos de gran aumento (400x) mediante un microscopio de la marca Olympus (modelo CX31). En cada uno de los campos se contó el número de células total y el número de células que presentaban inmunotinción, hallándose posteriormente el porcentaje de células que presentaban dicha inmunotinción. En las Tablas 2 y 3 se expresa el porcentaje medio de células con inmunotinción para cada marcador en cada uno de los bloques realizados.
Los resultados pusieron de manifiesto la presencia de todos los marcadores estudiados en las muestras procedentes de los cultivos celulares de PHF tratados únicamente con la sustancia P (agonista de los receptores NKl, NK2 y NK3). Lo que pone de manifiesto que el agonista de los receptores NKl, NK2 y NK3 induce en los fibroblastos primarios humanos cambios inmunofenotípicos similares a los que se encuentran en las zonas peritumorales. Por el contrario, no se observó inmunotinción, signo de ausencia de expresión, para los cultivos celulares tratados de manera conjunta con la sustancia P y con cada uno de los anticuerpos anti-NKl, NK2 o NK3. Lo que demuestra que la exposición al agonista de los receptores NK sustancia P puede inducir en los PHF expresión de marcadores que son propios de dichas células en las zonas peritumorales y que el uso de los anticuerpos contra los receptores NKl, NK2 y NK3 son capaces de revertir la expresión de estos marcadores, que, como ha quedado explicado, son propios de las zonas peritumorales, característicos del microambiente peritumoral y están involucrados en el desarrollo , aumento de tamaño y la progresión de los tumores.
TABLA 2. Porcentaje (*) de células fibroblásticas con expresión para marcadores inmunohistoquímicos con importancia en el microambiente tumoral tras exposición a sustancia P y anticuerpo anti-NKl, NK2 y NK3.
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(*)E1 porcentaje es la media de los porcentajes encontrados (en cada caso la técnica de inmunohistoquímica se realizó por sextuplicado y se estudiaron 20 campos de gran aumento).
La modificación del microambiente peritumoral mediante el tratamiento con anticuerpos anti-NKl, NK2 y/o NK3, también se ha analizado estudiando la implicación de las células mononucleares y polimorfonucleares de la sangre, en dicho microambiente tumoral. Existen evidencias de la influencia de la inflamación en la génesis y en el desarrollo del cáncer (De Visser KE, et al. 2006; McAllister SS, et al. 2010; Ikushima H, et al. 2010). Se conocen, además, diversos mediadores que propician la interacción entre el estroma, las células inflamatorias y las células tumorales, que contribuyen al desarrollo de estas últimas (Li W, et al. 2007). Entre estos mediadores destacan TGFbeta y NF-kB. Con el objetivo de analizar la presencia de marcadores celulares específicos de dichas células y su modificación en presencia de anticuerpos anti-NKl, NK2 y/o NK3, en la presente invención se incubaron las células mononucleares y polimorfonucleares en presencia de PHF obtenidos mediante los métodos descritos anteriormente y con la presencia de la Sustancia P a una concentración de 1 μΜ o en presencia de la Sustancia P (1 μΜ) junto con los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3 a la concentración de 1/100. Tras una incubación de 48 horas, las células fueron recolectadas y para los análisis inmunohistoquímicos se las incluyó en bloques de parafina según se describe en el Ejemplo 1. Posteriormente se realizaron cortes histológicos de cada uno de los bloques y se estudió la expresión, mediante inmunohistoquímica de los marcadores celulares TGFbeta (SAB4502956) y NF-kB (SAB4501992) mediante anticuerpos específicos frente a los mismos. Todos los anticuerpos utilizados fueron anticuerpos policlonales de ratón obtenidos de Sigma Aldrich y se utilizaron a una concentración 1/1000. Las técnicas inmunohistoquímicas se realizaron según se describe en el Ejemplo 1.
Los resultados se resumen en la tabla 3 y demostraron la presencia de TGFbeta y NF-kB en las células mononucleares y polimorfonucleares de las muestras procedentes de los cultivos de tratados únicamente con la Sustancia P (agonista de los receptores NKl, NK2 y NK3). Por el contrario, no se observó inmunotinción para los diferentes marcadores en las muestras de cultivos de células mononucleares y polimorfonucleares tratados con la Sustancia P y con los anticuerpos contra los receptores NKl , NK2 o NK3. Lo que demuestra que la exposición de las células de la inflamación mono y polimorfonucleares de la sangre a agonistas de los receptores NKl, NK2 y NK3 (sustancia P) les induce expresión de TGFbeta y NF-kB que son mediadores de probada importancia en la génesis del microambiente necesario para el desarrollo, aumento de tamaño y progresión de los tumores. Por el contrario, con el uso de anticuerpos contra los receptores NKl, NK2 y NK3 se puede revertir la expresión de estos marcadores, lo que muestra la capacidad de dichos anticuerpos para inhibir la génesis de estos mediadores y, por lo tanto, impedir el desarrollo de un microambiente tumoral que permita el aumento de tamaño y la progresión de los tumores.
TABLA 3. Porcentaje (*) de células hemáticas de la inflamación (mono y polimorfoncleares) con expresión para marcadores inmunohistoquímicos con importancia en el microambiente tumoral tras exposición a sustancia P y anticuerpo anti-NKl, NK2 y NK3.
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(*)E1 porcentaje es la media de los porcentajes encontrados (en cada caso la técnica de inmunohistoquímica se realizó por quintuplicado). Por último, se sabe que la angiogénesis es fundamental para el desarrollo y mantenimiento de los tumores (Hanahan D, Weinberg RA. Cell. 2000). En este sentido, el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el dominio extracelular del VEGFR está aprobado en clínica para el tratamiento de diversos tipos de cánceres. En este sentido también se ha analizado la modificación del microambiente peritumoral mediante la inhibición del crecimiento de las células endoteliales vasculares con el tratamiento con anticuerpos anti-NKl , anti-NK2 y/o anti-NK3. Para ello y siguiendo la metodología explicada en el ejemplo 1 (apartado de ensayos de proliferación) se expuso la línea comercial de células endoteliales microvasculares denominada C-12210 a concentraciones crecientes de anticuerpos anti-NKl, NK2 o NK3 y se observó una inhibición de la proliferación de las mismas, que resultó ser tiempo y dosis dependiente (Figura 56). Por lo tanto, los anticuerpos anti-NKl, anti-NK2 o anti-NK3 inhiben la proliferación de las células endoteliales. La proliferación de las mismas es un elemento clave en el desarrollo de la neovascularización necesaria para que los tumores puedan recibir un aporte de sangre (y por lo tanto de oxígeno, nutrientes entre otros elementos necesarios) suficiente que le permita mantener su crecimiento y progresión.
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Claims

REIVINDICACIONES.
1. Uso de al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1 , NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer.
2. Uso de al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1 , NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para la producción de apoptosis en las células tumorales.
3. Uso de al menos un anticuerpo o un fragmento del mismo, específico contra los receptores celulares NK1 , NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos, para la fabricación de un medicamento o composición farmacéutica para reducir el tamaño de los tumores.
4. Uso según la reivindicación 3 caracterizado por que la reducción del tamaño tumoral se lleva a cabo mediante la modificación del microambiente peritumoral.
5. Uso según la reivindicación 4 caracterizado por que la modificación del microambiente peritumoral comprende la modificación de la fisiología de la matriz estromal y de las células estromales y/o la modificación de la fisiología de las células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune y/o la modificación de la fisiología de las células responsables de la vascularización.
6. Uso según la reivindicación 5 caracterizado por que la modificación de la fisiología de la matriz estromal y de las células estromales y/o de la fisiología de las células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune comprende la inhibición de marcadores tumorales.
7. Uso según la reivindicación 6 donde los marcadores tumorales se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de la lista: NF4ÍB, TGF alfa, TGFbeta 1 , TGFbeta 2, TGFbeta 3 , SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-1 1, MMP-13, MMP-14 y/o cualquiera de sus combinaciones.
8. Uso según la reivindicación 5 caracterizado por que la modificación de la fisiología de las células responsables de la vascularización comprende la inhibición de la neovascularización, preferentemente, mediante la inhibición de la proliferación de las células de endotelio vascular.
9. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde el cáncer se selecciona del grupo que comprende melanoma, gliomas, carcinomas, adenocarcinomas, leucemias, linfomas, mieloma, neoplasias de tipo embrionario o neuroectodérmico y/o sarcomas.
10. Uso, según la reivindicación 9 caracterizado por que el carcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: de mama, incluyendo el ductal, de pulmón, incluyendo tanto el de células pequeñas como el de células no pequeñas, de tiroides, incluyendo tanto el folicular como el papilar, de próstata, de cérvix uterino, de endometrio, de ovario, de vejiga, incluyendo tanto el endotelial como el transicional y/o coriocarcinoma.
11. Uso, según la reivindicación 9 caracterizado por que el adenocarcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: colon, mama, ovario, páncreas, pulmón y gástrico.
12. Uso, según la reivindicación 9 caracterizado por que la leucemia se selecciona entre la linfoblástica de células T, la linfoblástica de células B y la leucemia de células T/NK.
13. Uso, según la reivindicación 9 caracterizado porque el linfoma se selecciona entre el linfoma de tipo B, de tipo T, de tipo Hodking o del tipo Burkitt.
14. Uso, según la reivindicación 9 caracterizado por que los sarcomas son preferentemente osteosarcomas, rabdomiosarcomas, sarcomas del estroma endometrial, fibrosarcomas, histiocistoma fibroso maligno o sarcoma de Edwing.
15. Uso, según la reivindicación 9 caracterizado por que las neoplasias son preferentemente neuroblastomas o retinoblastomas.
16. Uso, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en que el anticuerpo reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1, NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3.
17. Composición farmacéutica que comprende al menos un anticuerpo o fragmento del mismo específico contra los receptores NK1, NK2 y/o NK3, o combinaciones de los mismos.
18. Composición según la reivindicación 17 en que el anticuerpo reconoce al menos una secuencia de los receptores NK1, NK2 o NK3, seleccionada entre: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO: 3.
19. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 17 o 18 que además comprende vehículos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
20. Uso de la composición farmacéutica de las reivindicaciones 17 a 19 para el tratamiento del cáncer.
21. Uso según la reivindicación 20 donde el cáncer se selecciona de entre el grupo que comprende: melanoma, gliomas, carcinomas, adenocarcinomas, leucemias, neoplasias de tipo embrionario o neuroectodérmico y/o sarcomas.
22. Uso, según la reivindicación 21 caracterizado por que el carcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: de mama, incluyendo el ductal, de pulmón, incluyendo tanto el de células pequeñas como el de células no pequeñas, de tiroides, incluyendo tanto el folicular como el papilar, de próstata, de cérvix uterino, de endometrio, de ovario, de vejiga, incluyendo tanto el endotelial como el transicional y/o coriocarcinoma.
23. Uso, según la reivindicación 21 caracterizado por que el adenocarcinoma se selecciona de entre cualquiera de los siguientes: colon, mama, ovario, páncreas, pulmón y gástrico.
24. Uso, según la reivindicación 21 caracterizado por que la leucemia se selecciona entre la linfoblástica de células T, la linfoblástica de células B y la leucemia de células T/NK.
25. Uso, según la reivindicación 21 caracterizado porque el linfoma se selecciona entre el linfoma de tipo B, de tipo T, de tipo Hodking o del tipo Burkitt.
26. Uso, según la reivindicación 21 caracterizado por que los sarcomas son preferentemente osteosarcomas, rabdomiosarcomas, sarcomas del estroma endometrial, fibrosarcomas, histiocistoma fibroso maligno o sarcoma de Edwing.
27. Uso, según la reivindicación 21 caracterizado por que las neoplasias son preferentemente neuroblastomas o retinoblastomas.
28. Uso de la composición farmacéutica de las reivindicaciones 17 a 19 para la producción de apoptosis en las células tumorales.
29. Uso de la composición farmacéutica de las reivindicaciones 17 a 19 para reducir el tamaño de los tumores.
30. Uso según la reivindicación 29 caracterizado por que la reducción del tamaño tumoral se lleva a cabo mediante la modificación del microambiente peritumoral.
31. Uso según la reivindicación 30 caracterizado por que la modificación del microambiente peritumoral comprende la modificación de la fisiología de la matriz estromal y de las células estromales y/o la modificación de la fisiología de las células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune y/o la modificación de la fisiología de las células responsables de la vascularización.
32. Uso según la reivindicación 31 caracterizado por que la modificación de la fisiología de la matriz estromal y de las células estromales y/o de la fisiología de las células implicadas en la respuesta inflamatoria e inmune comprende la inhibición de marcadores tumorales.
33. Uso según la reivindicación 32 donde los marcadores tumorales se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de la lista: NF-kB, TGF alfa, TGFbeta 1, TGFbeta 2, TGFbeta 3 , SPARC, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-11, MMP-13, MMP-14 y/o cualquiera de sus combinaciones.
34. Uso según la reivindicación 31 caracterizado por que la modificación de la fisiología de las células responsables de la vascularización comprende la inhibición de la neovascularización, preferentemente, mediante la inhibición de la proliferación de las células de endotelio vascular.
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