ES2747836T3 - Métodos y productos para prevenir y/o tratar el cáncer metastásico - Google Patents

Abstract

Un inhibidor que actúa directamente para alterar la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso en la prevención y/o tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto, en el que el inhibidor comprende uno o más de un ARN de interferencia pequeño, un microARN, un ARN antisentido, un ligando para un receptor de quimiocinas CCX-CKR, y un anticuerpo neutralizante y/o una parte de unión a antígeno del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y productos para prevenir y/o tratar el cáncer metastásico

Campo

La presente divulgación se refiere a métodos y productos para prevenir y/o tratar el cáncer metastásico.

Antecedentes

El cáncer metastásico, o enfermedad metastásica, es la propagación de un cáncer de un órgano a otro órgano u otro sitio en un sujeto. La metástasis es una serie compleja de etapas biológicas en las que las células cancerosas abandonan un sitio original y migran a otro sitio en un sujeto a través de varias posibles rutas diferentes, tales como el torrente sanguíneo, el sistema linfático o por extensión directa.

Una vez que el cáncer ha hecho metástasis, el tratamiento del cáncer metastásico se basa en las mismas técnicas tradicionales para tratar el cáncer primario, tales como radiocirugía, quimioterapia, radioterapia y cirugía, o una combinación de estas intervenciones. En muchos casos, sin embargo, las opciones de tratamiento que están disponibles actualmente no son capaces de curar el cáncer metastásico, aunque el cáncer testicular metastásico y el cáncer de tiroides son excepciones notables.

El cáncer metastásico también es especialmente preocupante, ya que la incidencia de algunos tipos de cáncer, como el cáncer de mama o el melanoma, sigue siendo alta en las personas más jóvenes, lo que tiene un profundo efecto en la cantidad de años productivos perdidos debido a la enfermedad.

El melanoma, por ejemplo, es un cáncer que tiene una tasa de incidencia y mortalidad muy alta. En algunos países, el melanoma es el tipo de cáncer más común en adultos jóvenes. La edad media al diagnóstico del melanoma es de alrededor de 50 años, que es 10-15 años antes que los diagnósticos más comunes de cáncer de próstata, intestino y pulmón. Por lo tanto, el melanoma solo es superado por el cáncer de mama en la cantidad de años productivos perdidos.

Las tasas de supervivencia a 15 años para el melanoma localizado exceden el 50 %, pero caen al 30 % cuando hay implicación nodular, y a menos del 2 % cuando es evidente la implicación sistémica. El melanoma metastásico es esencialmente incurable y, como tal, el tratamiento del melanoma pone un gran énfasis en prevenir la metástasis del cáncer primario.

La quimioterapia con un solo agente de dacarbazina, con tasas de respuesta moderadas del 15-20 %, sigue siendo el cuidado de referencia para el tratamiento del melanoma metastásico, ya que ninguna combinación de quimioterapia o bioquimioterapia ha demostrado una mejor supervivencia general en ensayos controlados aleatorios de fase III. Por ejemplo, si bien algunas bioterapias de vacunas propuestas se han dirigido a la respuesta inmunitaria como un medio para prevenir y/o tratar el melanoma, ninguna de estas bioterapias produce tasas de respuesta o supervivencia más altas que las de la quimioterapia.

El cáncer de mama metastásico generalmente ocurre varios años después de la resección del cáncer de mama primario. Las células metastásicas del cáncer de mama con frecuencia difieren del cáncer de mama primario anterior en propiedades y a menudo pueden desarrollar resistencia a varias líneas de tratamiento previo y adquirir un potencial metastásico aumentado. El pronóstico del cáncer de mama metastásico es a menudo pobre, ya que las metástasis a distancia son la causa de aproximadamente el 90 % de las muertes por cáncer de mama.

También se debe añadir que una complicación adicional con respecto al tratamiento de los cánceres primarios y metastásicos es que se sabe que los regímenes de tratamiento que implican agentes quimioterapéuticos estándar tienen efectos variables e impredecibles, incluida la eficacia y el alcance de los efectos secundarios no deseados.

Por consiguiente, existe una necesidad de proporcionar métodos y/o productos mejorados para abordar uno o más problemas en la prevención y/o tratamiento del cáncer metastásico y/o proporcionar una o más ventajas.

La presente invención se refiere al uso de inhibidores del receptor de quimiocinas CCX-CKR en la prevención y el tratamiento del cáncer metastásico. El documento US 2004/0146926 identificó a CCX-CKR como una diana para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, este documento propuso el uso de un agonista de CCX-CKR en el tratamiento del cáncer. El documento WO 01/66598 enseña que los inhibidores de CCX-CKR pueden usarse en el tratamiento de una cantidad de enfermedades que incluyen enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide y enfermedades vasculares tales como aterosclerosis e hipertensión, pero no proporciona ninguna indicación de que la inhibición de CCX-CKR sea eficaz en la lucha contra el cáncer metastásico. Takatsuka et al. (J Pharmacol Toxicol Methods, Vol. 63, págs. 250-257, 2011) demostraron que CCX-CKR se expresa constitutivamente en líneas celulares de tumores hepáticos, pero no identificó que su inhibición fuera eficaz para combatir el cáncer metastásico. El documento US 2003/0186889 enseñó que los antagonistas de quimiocinas se pueden usar para inhibir el crecimiento de células cancerosas y la diseminación metastásica, y desveló un medicamento que contiene al menos un inhibidor de al menos dos receptores de quimiocinas para su uso en el tratamiento de tumores, pero no demostró que un inhibidor de CCX-CKR fuera eficaz en la lucha contra el cáncer metastásico.

Sumario

La presente divulgación se refiere a la prevención y/o tratamiento del cáncer metastásico.

La presente invención proporciona un inhibidor que actúa directamente para alterar la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso en la prevención y/o tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto, en el que el inhibidor comprende uno o más de un ARN de interferencia pequeño, un microARN, un ARN antisentido, un ligando para un receptor de quimiocinas CCX-CKR, y un anticuerpo neutralizante y/o una parte de unión a antígeno del mismo. También se proporciona dicho inhibidor para inducir una respuesta inmunitaria al cáncer en un sujeto.

Breve descripción de las figuras

Determinadas realizaciones se ilustran con las siguientes figuras:

La Figura 1 muestra el ARNi de CCX-CKR en células de melanoma B16 que da como resultado el rechazo completo del melanoma en ratones inoculados con las células.

La Figura 2 muestra la atenuación de ARNi de CCX-CKR que inhibe la metástasis linfática de células de melanoma B16 en ratones inoculados con las células.

La Figura 3 muestra la pérdida de CCX-CKR que da como resultado la generación de una respuesta inmunitaria anti-melanoma.

La Figura 4 muestra que ratones con inactivación génica de CCX-CKR son resistentes al crecimiento y metástasis del melanoma.

La Figura 5 muestra el efecto de los anticuerpos anti-CCX-CKR sobre la colonización pulmonar por las células de melanoma B16.

La Figura 6 muestra que ratones con inactivación génica de CCX-CKR son resistentes al crecimiento y la metástasis del cáncer de mama. (A) Efecto sobre el volumen tumoral. (A) Efecto sobre el peso tumoral. C. Efecto sobre las metástasis pulmonares.

La Figura 7 muestra que la atenuación de CCX-CKR en células de melanoma B16 restaura la supervivencia en ratones inoculados con células de melanoma.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere a la prevención y/o tratamiento del cáncer metastásico.

Determinados aspectos de la presente divulgación están dirigidos a métodos y productos que tienen una o más combinaciones de ventajas. Por ejemplo, algunas de las ventajas de las realizaciones desveladas en el presente documento incluyen uno o más de las siguientes: proporcionar una eficacia mejorada del tratamiento de un cáncer metastásico; proporcionar una eficacia mejorada del tratamiento para tipos específicos de cánceres metastásicos; proporcionar un tratamiento para el cáncer metastásico que puede utilizar una respuesta inmunitaria; proporcionar un tratamiento del cáncer metastásico que tiene efectos secundarios reducidos; proporcionar nuevos productos para prevenir y/o tratar el cáncer metastásico; proporcionar productos anticáncer metastásico con mayor eficacia; proporcionar agentes anticáncer metastásico con eficacia mejorada para tipos específicos de cánceres; proporcionar productos que promueven una respuesta inmunitaria a un cáncer metastásico en el sujeto; y proporcionar productos antimetastásicos que tienen efectos secundarios reducidos. Otras ventajas de determinadas realizaciones de la presente divulgación también se desvelan en el presente documento.

Determinadas realizaciones de la presente invención proporcionan un inhibidor que actúa directamente para alterar la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso en la prevención y/o tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto, en el que el inhibidor comprende uno o más de un ARN de interferencia pequeño, un microARN, un ARN antisentido, un ligando para un receptor de quimiocinas CCX-CKR, y un anticuerpo neutralizante y/o una parte de unión a antígeno del mismo.

La presente divulgación está basada, al menos en parte, en la determinación de que la inhibición de la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR inhibe el crecimiento y la metástasis de cánceres, como el cáncer de melanoma y el cáncer de mama. Sin quedar ligados a teoría alguna, al menos parte del efecto parece implicar una respuesta inmunitaria al cáncer que se induce en el sujeto.

El término "que previene" y los términos relacionados como "prevención" y "prevenir", se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado en términos de detener o suprimir la aparición de uno o más síntomas en el sujeto.

El término "tratamiento" y términos relacionados como "que trata" y "tratar", se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado en términos de mejorar la afección del sujeto, mejorar, interrumpir, suprimir, aliviar y/o ralentizar la progresión de uno o más síntomas en el sujeto, una estabilización parcial o completa del sujeto, una regresión de uno o más síntomas, o una cura de una enfermedad, afección o estado en el sujeto.

En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un cáncer sólido. En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un carcinoma. En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un sarcoma. En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un linfoma. En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un cáncer de células germinales. En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un blastoma. Se contemplan otros cánceres metastásicos.

En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de ovario, un cáncer de pulmón, un cáncer colorrectal, un cáncer gástrico, un cáncer pancreático, un cáncer de vejiga, un cáncer de esófago, un cáncer urotelial, un cáncer de pulmón no microcítico, un cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de testículo, un cáncer uterino, un cáncer de hígado, un cáncer renal, un cáncer de estómago, un tumor cerebral, un mieloma maligno, un tumor linfoproliferativo, un cáncer hematológico, una LMC, una LMA o un linfoma de linfocitos B. Se contemplan otros tipos de cánceres metastásicos.

En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es un melanoma metastásico, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario o cáncer colorrectal. En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es una metástasis de un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de ovario o un cáncer colorrectal.

En determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto humano.

En determinadas realizaciones, el sujeto es un sujeto mamífero, por ejemplo, un animal de ganadería (como un caballo, una vaca, una oveja, una cabra, un cerdo), un animal doméstico (como un perro o un gato) u otro tipo de animal tal como monos, conejos, ratones y animales de laboratorio. Se contemplan aplicaciones veterinarias de la presente divulgación. También se contempla el uso de cualquiera de los animales mencionados anteriormente como modelos animales.

En determinadas realizaciones, el sujeto padece un cáncer. Se describen en el presente documento ejemplos de cánceres. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un cáncer sólido. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un carcinoma. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un sarcoma. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un linfoma. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un cáncer de células germinales. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un blastoma. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un cáncer hematológico. En determinadas realizaciones, el sujeto padece un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de ovario, cáncer pulmonar, un cáncer colorrectal, un cáncer gástrico, un cáncer pancreático, un cáncer de vejiga, un cáncer de esófago, un cáncer urotelial, un cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de testículo, un cáncer uterino, un cáncer de hígado, un cáncer renal, un cáncer de estómago, un tumor cerebral, un mieloma maligno, una LMC, una LMA o un tumor linfoproliferativo. Se contemplan otros tipos de cánceres.

En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un cáncer. Se describen en el presente documento ejemplos de cánceres. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un cáncer sólido. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un carcinoma. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un sarcoma. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un linfoma. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un cáncer de células germinales. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un blastoma. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un cáncer hematológico. En determinadas realizaciones, el sujeto es susceptible a un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de ovario, cáncer pulmonar, un cáncer colorrectal, un cáncer gástrico, un cáncer pancreático, un cáncer de vejiga, un cáncer de esófago, un cáncer urotelial, un cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de testículo, un cáncer uterino, un cáncer de hígado, un cáncer renal, un cáncer de estómago, un tumor cerebral, un mieloma maligno, una LMC, una LMA o un tumor linfoproliferativo. Se contemplan otros tipos de cánceres.

En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un cáncer. Se describen en el presente documento ejemplos de cánceres. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un cáncer sólido. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un carcinoma. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un sarcoma. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un linfoma. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un cáncer de células germinales.

En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un blastoma. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un cáncer hematológico. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene un mayor riesgo o probabilidad de sufrir un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de ovario, cáncer pulmonar, un cáncer colorrectal, un cáncer gástrico, un cáncer pancreático, un cáncer de vejiga, un cáncer de esófago, un cáncer urotelial, un cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de cabeza y cuello, un cáncer de testículo, un cáncer uterino, un cáncer de hígado, un cáncer renal, un cáncer de estómago, un tumor cerebral, un mieloma maligno, una LMC, una LMA o un tumor linfoproliferativo. Se contemplan otros tipos de cánceres.

En determinadas realizaciones, el sujeto no está recibiendo tratamiento para un cáncer como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el sujeto está recibiendo tratamiento para un cáncer como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el sujeto está recibiendo tratamiento quimioterapéutico para un cáncer como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el inhibidor, como se describe en el presente documento, puede usarse para reducir el crecimiento y/o volumen de un cáncer metastásico en un sujeto.

En determinadas realizaciones, el peso y/o volumen de un tumor asociado con el cáncer metastásico se reduce tras la administración del inhibidor. Los métodos para determinar el peso y/o el volumen del tumor son conocidos e incluyen, por ejemplo, imágenes de un sujeto para determinar estos parámetros in situ. En determinadas realizaciones, el peso del tumor asociado con el cáncer metastásico se reduce en un 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, o 90 % o más. En determinadas realizaciones, el volumen del tumor asociado con el cáncer metastásico se reduce en un 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, o 90 % o más.

En determinadas realizaciones, el peso y/o volumen de un tumor asociado con el cáncer metastásico se reduce tras la administración del inhibidor en combinación con uno o más agentes farmacológicos, tales como un agente quimioterapéutico. En determinadas realizaciones, el peso del tumor asociado con el cáncer metastásico que usa dicho tratamiento combinado se reduce en un 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, o 90 % o más. En determinadas realizaciones, el volumen del tumor asociado con el cáncer metastásico se reduce en un 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, o 90 % o más.

En determinadas realizaciones, el inhibidor, como se describe en el presente documento, puede usarse para reducir el crecimiento de metástasis en un sujeto. En determinadas realizaciones, se reduce el crecimiento de metástasis en el sujeto.

En determinadas realizaciones, el inhibidor, como se describe en el presente documento, puede usarse para reducir la carga o peso metastásico en un sujeto. En determinadas realizaciones, se reduce la carga o peso metastásico en el sujeto.

En determinadas realizaciones, se reduce la cantidad de metástasis. En determinadas realizaciones, se reduce la cantidad de metástasis en un 20 % o más, 30 % o más, 40 % o más, 50 % o más, 60 % o más, 70 % o más, 80 % o más, o 90 % o más. Los métodos para determinar la carga o peso metastásico son conocidos e incluyen, por ejemplo, imágenes de un sujeto para determinar este parámetro in situ.

En determinadas realizaciones, el inhibidor, como se describe en el presente documento, puede usarse para reducir la cantidad de metástasis en un sujeto. En determinadas realizaciones, se reduce la cantidad de metástasis en el sujeto.

En determinadas realizaciones, el inhibidor, como se describe en el presente documento, puede usarse para inducir un respuesta inmunitaria a un cáncer metastásico en un sujeto.

La administración del inhibidor, como se describe en el presente documento, al sujeto puede inducir una respuesta inmunitaria al cáncer metastásico en el sujeto.

Determinadas realizaciones de la presente invención proporcionan un inhibidor que actúa directamente para alterar la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria a un cáncer en un sujeto, en el que el inhibidor comprende uno o más de un ARN de interferencia pequeño, un microARN, un ARN antisentido, un ligando para un receptor de quimiocinas CCX-CKR, y un anticuerpo neutralizante y/o una parte de unión a antígeno del mismo.

En determinadas realizaciones, el inhibidor, como se describe en el presente documento, puede usarse para inducir células CD4+ y/o CD8+ antitumorales en un sujeto. En determinadas realizaciones, la administración del inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR al sujeto induce células CD4+ y/o CD8+ antitumorales.

El gen CCX-CKR (también denominado CCRL1 o CCR11) codifica un receptor de la familia de receptores acoplados a proteína G y es un receptor para quimiocinas de tipo C-C. En seres humanos, el receptor está codificado por el gen con el número de referencia de Genbank AF110640. El receptor equivalente en otras especies puede determinarse mediante un método conocido. La secuencia de aminoácidos del receptor humano tiene el número de referencia de Genbank AF110640_1. Los métodos para determinar el gen y el receptor CCX-CKR en otras especies son conocidos e incluyen, por ejemplo, programas de alineamiento de ácidos nucleicos y proteínas, tales como BLAST.

En determinadas realizaciones, el receptor de quimiocinas CCX-CKR es un receptor humano. En determinadas realizaciones, el receptor de quimiocinas CCX-CKR es un receptor animal. En determinadas realizaciones, el receptor de quimiocinas CCX-CKR es un receptor de mamífero.

En determinadas realizaciones, el receptor de quimiocinas CCX-CKR es un receptor de longitud completa. En determinadas realizaciones, el receptor de quimiocinas CCX-CKR es una parte de un receptor. En determinadas realizaciones, el receptor de quimiocinas CCX-CKR es un homólogo, parálogo u ortólogo de un receptor. En determinadas realizaciones, el receptor de quimiocinas CCX-CKR es una variante y/o fragmento del receptor, tal como una variante del receptor que surge de un transcrito empalmado alternativamente.

El término "inhibidor", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente, tratamiento o intervención que da como resultado directamente una reducción de la expresión, actividad o función del receptor de quimiocinas c CX-CKR, que incluye, por ejemplo, una disminución de la expresión, una disminución de la actividad, una alteración inhibidora en el momento y/o ubicación de la actividad, o de otro modo proporciona control inhibidor sobre la actividad.

Un inhibidor, como se define en el presente documento, actúa directamente para alterar la actividad de un receptor, por ejemplo, alterando el nivel de expresión del receptor, alterando la localización del receptor, eliminando parcial o completamente el gen para el receptor, alterando la internacionalización del receptor o alterando el tiempo de la función del receptor. En determinadas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor selectivo. En determinadas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor no selectivo.

El inhibidor de acuerdo con la invención comprende uno o más de un ligando para el receptor de quimiocinas CCX-CKR, un ARN antisentido, un microARN, un ARNip y un anticuerpo neutralizante o parte de unión a antígeno del mismo.

El término "actividad", como se usa en el presente documento, se refiere a la función de una especie e incluye, por ejemplo, el nivel, la especificidad, la capacidad de interactuar (directa y/o indirectamente) con y/o modificar otras especies, la capacidad de señalizar y la capacidad de causar cambios (directa y/o indirectamente) en otros eventos celulares y/o no celulares. Ejemplos de modulación de la actividad de una especie incluyen, por ejemplo, cambios en el nivel de la especie, cambios en la localización de la especie, cambios en las tasas de síntesis y/o degradación de la especie, cambios en el momento de la actividad, cambios en la capacidad de interactuar con otras especies (como un cambio en la capacidad de un ligando y un receptor para interactuar), cambios en la composición química de la especie, cambios en la señalización y cambios en eventos celulares y/o no celulares afectados por la especie.

Un inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR puede sintetizarse, producirse u obtenerse comercialmente.

En determinadas realizaciones, el inhibidor es un modulador de la unión de ligando a un receptor de quimiocinas CCX-CKR, es decir, un antagonista de ligando o un antagonista de anticuerpo (o la parte de unión a antígeno de un antagonista de anticuerpo). En determinadas realizaciones, el inhibidor reduce la unión de un ligando a un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el inhibidor modula la unión de un ligando a un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el inhibidor es un modulador de uno o más de la unión a CCL25, la unión a CCL19 y la unión a CCL21. En determinadas realizaciones, el inhibidor inhibe la unión de un ligando a un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de uno o más de la unión a CCL25, la unión a CCL19 y la unión a CCL21.

En determinadas realizaciones, el inhibidor es un inhibidor de una expresión de receptor de quimiocina CCX-CKR. Ejemplos de dichos inhibidores incluyen un ARN antisentido para un ARNm del receptor de quimiocina CCX-CKR o un a Rn de interferencia pequeño para un receptor de quimiocina CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el inhibidor promueve la internalización de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

El término "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido o un polinucleótido e incluye, por ejemplo, ADN, ARN, DNA/RNA, una variante de ADN y/o ARN (por ejemplo, una variante de la cadena principal de azúcar-fosfato y/o una variante de una o más bases, tal como metilación), y puede ser monocatenario, bicatenario, no metilado, metilado u otras formas de los mismos. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico es un ácido nucleico de origen no natural, un ácido nucleico de origen natural, un ácido nucleico de origen genómico, un ácido nucleico mitocondrial, un ácido nucleico de origen de ADNc (procedente de un ARNm), un ácido nucleico procedente de un virus, un ácido nucleico de origen sintético, un ADN monocatenario, un ADN bicatenario, un análogo de ADN y/o ARN, y/o un derivado, fragmento y/o combinación de cualquiera de los mencionados anteriormente. Ejemplos de derivados también incluyen ácidos nucleicos que tienen un grupo de bloqueo en los extremos 5' y/o 3', por ejemplo, para mejorar la estabilidad, y/o ácidos nucleicos fusionados a otras moléculas. Se contemplan otros tipos de ácidos nucleicos. Los métodos para producir ácidos nucleicos son conocidos e incluyen, por ejemplo, ácidos nucleicos producidos mediante tecnología de ADN recombinante o ácidos nucleicos producidos mediante síntesis química.

El término "ácido nucleico", como se usa en el presente documento, también se refiere a un ácido nucleico específico, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es el complemento del ácido nucleico, un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con más de un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90% o 95 % de identidad de secuencia con el ácido nucleico especificado, o un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos con más de un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con el complemento del ácido nucleico especificado. Se contemplan otros niveles de identidad de secuencia.

En determinadas realizaciones, el inhibidor es un ARN antisentido. En determinadas realizaciones, el inhibidor es un ARN de interferencia pequeño. En determinadas realizaciones, el inhibidor es un microARN. Se conocen métodos para producir y administrar ARN antisentido, microARN y ARNip. Por ejemplo, los ácidos nucleicos terapéuticos para tratar el cáncer se describen en "Nucleic Acid Therapeutics in Cancer" 2004 ed. Alan M. Gewirtz, Humana Press Inc.

Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un ARN de interferencia pequeño a un receptor de quimiocina CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el ARN de interferencia pequeño comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 1, el complemento de SEQ ID NO. 1, un ARN equivalente de SEQ ID NO. 1, una forma modificada de SEQ ID NO.1, y/o una variante funcional o fragmento funcional de la misma. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 es la siguiente: 5'-TATGCAGATCACTTCGTACTG-3' (SEQ ID NO. 1).

En determinadas realizaciones, el ARN de interferencia pequeño comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 2, el complemento de SEQ ID NO. 2, un ARN equivalente de SEQ ID NO. 2, una forma modificada de SEQ ID NO. 2, y/o una variante funcional o fragmento funcional de la misma. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2 es la siguiente: 5'-CCGGCAGTACGAAGTGATCTGCATACTCGAGTATGCAGATCACTTCGTACTGT TTTT-3' (SEQ ID NO. 2).

En determinadas realizaciones, el ARN de interferencia pequeño consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2, el complemento de SEQ ID NO. 1 o 2, un ARN equivalente de SEQ ID NO. 1 o 2, una forma modificada de SEQ ID NO. 1 o 2, y/o una variante funcional o fragmento funcional de las secuencia de nucleótidos anteriormente mencionadas.

El término "variante", como se usa en el presente documento, en referencia a un ácido nucleico se refiere a un ácido nucleico con un 70 % o más, 75 % o más, 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 95 % o más, 96 % o más, 97 % o más, 98 % o más, o 99 % o más de identidad de secuencia con el ácido nucleico de referencia.

En determinadas realizaciones, el ARN de interferencia pequeño comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 3, el complemento de SEQ ID NO. 3, un ARN equivalente de SEQ ID NO. 3, una forma modificada de SEQ ID NO. 3, y/o una variante funcional o fragmento funcional de la misma. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3 es la siguiente: 5'-ATGCGTTTGCTCATATCGCAG-3' (SEQ ID NO. 3).

En determinadas realizaciones, el ARN de interferencia pequeño comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 4, el complemento de SEQ ID NO. 4, un ARN equivalente de s Eq ID NO. 4, una forma modificada de SEQ ID NO. 4, y/o una variante funcional o fragmento funcional de la misma. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 4 es la siguiente: 5'-CCGGCTGCGATATGAGCAAACGCATCTCGAGATGCGTTTGCTCATATCGCAGT TTTT-3' (SEQ ID NO. 4).

En determinadas realizaciones, el ARN de interferencia pequeño consiste en una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 4, el complemento de SEQ ID NO. 3 o 4, un ARN equivalente de SEQ ID NO. 3 o 4, una forma modificada de SEQ ID NO. 3 o 4, y/o una variante funcional o fragmento funcional de las secuencia de nucleótidos anteriormente mencionadas.

En determinadas realizaciones, el inhibidor comprende un anticuerpo neutralizante para un receptor de quimiocina CCX-CKR, y/o una parte de unión a antígeno del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo antagonista contra un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo neutralizante es un anticuerpo que promueve la internalización de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina con la capacidad de unirse a una región antigénica de otra molécula, e incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes, anticuerpos quiméricos, anticuerpos multiespecíficos, diacuerpos y fragmentos de una molécula de inmunoglobulina o combinaciones de los mismos que tienen la capacidad de unirse a la región antigénica de otra molécula con la afinidad deseada que incluye un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) o un polipéptido que contiene al menos una porción de una inmunoglobulina (o una variante de una inmunoglobulina) que es suficiente para conferir una unión específica a antígeno, como una molécula que incluye una 0 más CDR.

En este sentido, una inmunoglobulina es una molécula tetramérica, estando compuesto cada tetrámero por dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, teniendo cada par una cadena ligera y una cadena pesada. La porción aminoterminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que es principalmente responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante responsable principalmente de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras K y A. Las cadenas pesadas se clasifican como |j, A, y, a, o £ y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas, las regiones variable y constante están unidas por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, con la cadena pesada que también incluye una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo, con el resultado de que una inmunoglobulina intacta tiene dos sitios de unión. Las regiones variables incluyen además regiones hipervariables que están directamente implicadas en la formación del sitio de unión al antígeno. Estas regiones hipervariables generalmente se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR, de sus siglas en inglés). Los segmentos intermedios se denominan regiones marco (FR, de sus siglas en inglés). Tanto en las cadenas ligeras como en las pesadas hay tres CDR (CDR-1 a CDR-3) y cuatro FR (FR-I a FR-4).

En determinadas realizaciones, el fragmento de unión a antígeno comprende un Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, un anticuerpo monocatenario (scFv), un anticuerpo quimérico, un diacuerpo o un polipéptido que contiene al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión a antígeno específica.

Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH I. Un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región bisagra. Un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH I. Un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo. Un dAb consiste en un dominio VH. Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv,de sus siglas en inglés) es un anticuerpo en el que las regiones VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente a través de un enlazador sintético que les permite formarse como una cadena de proteína única. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero que usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, lo que obliga a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión a antígeno.

Los fragmentos de anticuerpos que contienen sitios de unión específicos pueden generarse mediante un método conocido. Los métodos para producir fragmentos de unión a antígeno o porciones de anticuerpos son conocidos en la materia, por ejemplo, como se describe en "Antibody Engineering: Methods and Protocols" (2004) ed. por B.K.C. Lo Humana Press; y "Antibody Engineering: A Practical Approach" (1996) ed. por J. McCafferty, H.R. Hoogenboom y DJ. Chriswell Oxford University Press. Por ejemplo, los fragmentos F(ab> se pueden producir mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y los fragmentos Fab se pueden generar mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. Alternativamente, las bibliotecas de expresión de Fab pueden construirse para permitir la identificación rápida y fácil de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada, como se describe, por ejemplo, en Huse, W. D. et al. (1989) Science 254: 1275-1281.

Los anticuerpos pueden generarse usando métodos conocidos. Para la producción de anticuerpos, varios hospedadores, incluidos cabras, conejos, ratas, ratones, seres humanos y otros, pueden inmunizarse mediante inyección con un antígeno apropiado. Dependiendo de la especie hospedadora, se pueden usar varios adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica. Dichos adyuvantes incluyen el adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana y dinitrofenol. Los adyuvantes están disponibles comercialmente.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. Un anticuerpo policlonal es una mezcla de anticuerpos que tienen diferentes especificidades de antígeno. Se conocen métodos para producir y aislar anticuerpos policlonales. En general, los anticuerpos policlonales se producen a partir de linfocitos B. Normalmente, los anticuerpos policlonales se obtienen directamente de un sujeto inmunizado, tal como un animal inmunizado.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando una técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante células aisladas continuas en cultivo. Estas incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos y la técnica de hibridoma EBV. Los métodos para la preparación de anticuerpos monoclonales incluyen, por ejemplo, Kohler et al. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor et al. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. ScL 80:2026-2030; y Cole et al. (1984) Mol. Cell Biol. 62: 109-120.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un anticuerpo aislado. Se conocen métodos para producir y aislar anticuerpos policlonales y monoclonales.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo, como se describe en el presente documento, tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM e IgA. La determinación del isotipo de un anticuerpo puede realizarse mediante un método conocido.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo de ratón y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un anticuerpo humano y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un anticuerpo humanizado y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

Los anticuerpos humanizados, o los anticuerpos adaptados para el no rechazo por otros mamíferos, pueden producirse mediante un método adecuado conocido en la materia, que incluye, por ejemplo, el rechapado o el injerto de CDR. En la tecnología de rechapado, el modelado molecular, el análisis estadístico y la mutagénesis se combinan para ajustar las superficies no c Dr de regiones variables para parecerse a las superficies de anticuerpos conocidos del hospedador diana. Se conocen estrategias y métodos para el rechapado de anticuerpos y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos dentro de un hospedador diferente, por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. 5.639.641. Las formas humanizadas de los anticuerpos también pueden prepararse mediante injerto de CDR, mediante la sustitución de las regiones determinantes de complementariedad de, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, en un dominio marco humano.

Se conocen métodos para humanizar anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede generarse como se describe en la patentes de EE.u U. N.° 6.180.370; el documento WO 92/22653; Wright et al. (1992) Critical Rev. in Immunol.

12(3,4): 125-168; y Gu et al. (1997) Thrombosis and Hematocyst 77(4):755-759).

Los anticuerpos humanizados normalmente tienen regiones constantes y regiones variables distintas de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) procedentes sustancial o exclusivamente de un anticuerpo humano y CDR procedentes sustancial o exclusivamente del anticuerpo no humano de interés.

Las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", por ejemplo, la unión de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno y actividad biológica apropiadas, se pueden realizar mediante un método adecuado. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos se pueden producir como se describe en Morrison, S. L. et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855; Neuberger, M. S. et al. (1984) Nature 312:604-608; y Takeda, S. et al. (1985) Nature 314:452-454.

Los inmunoensayos pueden usarse para el análisis para identificar anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que tienen la especificidad deseada. Se conocen protocolos para la unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales.

Las moléculas de anticuerpo y fragmentos de unión a antígeno de los mismos también se pueden producir de forma recombinante mediante métodos conocidos en la materia, por ejemplo, mediante expresión en sistemas de expresión de E. coli. Por ejemplo, un método para la producción de anticuerpos recombinantes es como se describe en la patente de EE.UU. 4.816.567. Los fragmentos de unión a antígeno también pueden producirse mediante tecnologías de presentación en fagos, que son conocidas.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un receptor de quimiocinas CCX-CKR humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un receptor de quimiocinas CCX-CKR de mamífero. Se conocen métodos para evaluar la unión de anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo modula la unión de un ligando a un receptor de quimiocinas CCX-CKR. La determinación de la capacidad de un anticuerpo para modular la unión del ligando puede realizarse mediante un método conocido.

La secuencia de aminoácidos del CCX-CKR humano es proporcionada por el N.° de referencia de Genbank NP_057641.1. Las secuencias de aminoácidos del receptor de quimiocinas CCX-CKR de otras especies están disponibles o pueden ser identificadas por un experto en la materia.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a un epítopo en una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una o más de las siguientes regiones del receptor de quimiocinas CCX-CKR humano: aminoácidos 1 a 42, aminoácidos 109 a 113, aminoácidos 176 a 201 y aminoácidos 262 a 289; o una región equivalente del receptor en otra especie.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión del anticuerpo del mismo se une a una región amino terminal del receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a la región extracelular amino-terminal de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a una región que comprende uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 1 a 42 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 1 a 42 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en la siguiente secuencia polipeptídica: CCX-CKR: MALEQNQSTDYYYEENEMNGTYDYSQYELICIKEDVREFAKV (SEQ ID NO. 5) o una variante de la misma.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en las siguientes secuencias polipeptídicas: MALEQNQSTDYYYEENEMNG (SEQ ID NO. 6); TYDYSQYELICIKEDVREFAK (SEQ ID NO. 7); MALELNQSAEYY (SEQ ID NO. 13); NYTHDYSQYEVI (SEQ ID NO. 14), MALEQNQSTDYY (SEQ ID NO.19), NGTYDYSQYELI (SEQ ID NO.20) o una variante de una de las secuencias mencionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a una región que comprende uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 100 a 111 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en las siguientes secuencias polipeptídicas: NAVHGWILGKMM (SEQ ID NO. 15), NAVHGWVLGKIM (SEQ ID NO. 21) o una variante de las mismas.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a una región que comprende uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 109 a 113 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en la siguiente secuencia polipeptídica: KIMCK (SEQ ID NO. 8) o una variante de la misma.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a una región que comprende uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 176 a 201 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a una región que comprende uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 180 a 191 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a una región que comprende uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 186 a 197 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en la siguiente secuencia polipeptídica: YTVNDNARCIPIFPRYLGTSMKALIQ (SEQ ID NO. 9) o una variante de la misma. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en las siguientes secuencias polipeptídicas: QNARCTPIFPHH (SEQ ID NO. 16), DNARCIPIFPRY (SEQ ID NO.22) o una variante de las mismas. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en las siguientes secuencias polipeptídicas: PIFPHHLGTSLK (SEQ ID NO. 17), PIFPRYLGTSMK (SEQ ID NO. 23) o una variante de las mismas.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 262 a 289 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una región de los aminoácidos 276 a 287 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en la siguiente secuencia polipeptídica: CRAIDIIYSLITSCNMSKRMDIAIQVTE (SEQ ID NO. 10) o una variante de la misma. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en las siguientes secuencias polipeptídicas: DMSKRMDVAIQV (SEQ ID NO. 18), NMSKRMDIAIQV (SEQ ID NO.24) o una variante de las mismas.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo ubicado en una o más de las siguientes regiones del receptor de quimiocinas CCX-CKR humano: aminoácidos 1 a 42, aminoácidos 109 a 113, aminoácidos 176 a 201, y aminoácidos 262 a 289, o una región equivalente del receptor en otra especie.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en una o más de las secuencias polipeptídicas SEQ ID NO 5 a 24.

Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un anticuerpo neutralizante generado contra polipéptidos como se describe en el presente documento para su uso en la prevención y/o tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto.

Un anticuerpo para su uso de acuerdo con la presente invención puede generarse contra un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre uno o más de las SEC ID NO. 5 a 24, o una variante o fragmento de la misma. Alternativamente, un anticuerpo para su uso de acuerdo con la presente invención puede generarse contra un epítopo presente en una o más de las SEQ ID NO. 5 a 24, o una variante o fragmento de la misma, o un epítopo presente en una secuencia polipeptídica como se describe en el presente documento.

El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a oligopéptidos y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden, por ejemplo, dos o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más o 50 o más aminoácidos unidos covalentemente mediante enlaces peptídicos. El término "proteína" normalmente se refiere a un polipéptido grande, pero en general los términos "polipéptidos" y "proteínas" son sinónimos y se usan indistintamente en el presente documento.

En determinadas realizaciones, los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en el presente documento están aislados. El término "aislado" se refiere a un ácido nucleico o un polipéptido que se ha separado de su entorno natural. Por ejemplo, un ácido nucleico o polipéptido aislado puede estar en un estado sustancialmente purificado, estando sustancialmente libre de otras sustancias con las que está asociado en la naturaleza o in vivo.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden aislarse de muestras biológicas (tales como homogeneizados de tejidos o células), pueden expresarse de forma recombinante en una multiplicidad de sistemas de expresión pro o eucariotas, o sintetizarse por medios químicos conocidos.

El término "variante" de un polipéptido o de una secuencia de aminoácidos se refiere a una o más variantes de inserción de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos, variantes de sustitución de aminoácidos y variantes de modificación de aminoácidos (naturales y/o sintéticas).

Por ejemplo, las variantes de inserción de aminoácidos pueden comprender fusiones amino y/o carboxi-terminales y también inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de las variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, uno o más restos de aminoácidos pueden insertarse en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible la inserción aleatoria con la selección apropiada del producto resultante.

Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia. Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por que al menos un resto en la secuencia se elimina y otro resto se inserta en su lugar. Los cambios de aminoácidos en las variantes pueden ser cambios de aminoácidos no conservativos y/o no conservativos, es decir, sustituciones de aminoácidos con carga similar o sin carga. Un cambio conservativo de aminoácidos implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural generalmente se dividen en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), apolares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

En determinadas realizaciones, el grado de similitud, por ejemplo, la identidad, entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, incluso al menos un 90 % o al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %. El grado de similitud o identidad puede ser para una región de al menos aproximadamente 10, al menos 20, al menos 40, al menos 60, al menos 80, al menos 100, al menos 120, al menos 140, al menos 160 o al menos 200 aminoácidos.

Los polipéptidos y las variantes de aminoácidos descritas en el presente documento pueden prepararse fácilmente con la ayuda de técnicas de síntesis de péptidos conocidas tales como, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida y métodos similares o mediante manipulación de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para preparar proteínas y péptidos que tienen sustituciones, inserciones o deleciones, se describe en detalle en Sambrook, J, Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York. (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (2011), John Wiley & Sons, Inc.

El término "derivados" de polipéptidos se refiere a formas modificadas de polipéptidos. Dichas modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, deleciones y/o adiciones simples o múltiples de cualquier molécula asociada con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. El término "derivado" también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos.

Una variante de un ácido nucleico o una secuencia de aminoácidos puede tener una propiedad funcional del ácido nucleico o la secuencia de aminoácidos de la que procede. Dichas propiedades funcionales pueden comprender, por ejemplo, la interacción con receptores o ligandos, la interacción con anticuerpos, la interacción con otros péptidos o proteínas, la unión selectiva de ácidos nucleicos y una actividad enzimática.

Un péptido de origen no natural puede ser un péptido sintético o un péptido aislado. Un péptido de origen no natural puede producirse mediante tecnología de ADN recombinante.

Se conocen métodos para aislar y/o producir polipéptidos y proteínas, y se describen en general en Sambrook, J, Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York. (1989), y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (2011), John Wiley & Sons, Inc.

La confirmación de que un anticuerpo se une a un epítopo deseado puede determinarse mediante un método conocido.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo (y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se produce mediante la generación del anticuerpo contra un antígeno del receptor de quimiocina CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo (y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se produce mediante la generación del anticuerpo contra un receptor de quimiocina CCX-CKR y/o un fragmento antigénico del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo (y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo) es un anticuerpo generado contra un receptor de quimiocina CCX-CKR animal o humano. En determinadas realizaciones, el anticuerpo (y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo) se genera contra un receptor de longitud completa, una variante de un receptor, un fragmento de un receptor, una forma soluble del receptor o el receptor expresado en la superficie de una célula.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra un receptor de quimiocinas CCX-CKR y/o un fragmento antigénico del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra una región amino terminal de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra todo o parte de una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra una región amino terminal extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra un polipéptido que comprende la totalidad o parte de una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR y/o una variante del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra un polipéptido que comprende la totalidad o parte de una región amino terminal de un receptor de quimiocinas CCX-CKR y/o una variante del mismo.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una o más de las siguientes regiones del receptor de quimiocinas CCX-CKR humano: aminoácidos 1 a 42, aminoácidos 109 a 113, aminoácidos 176 a 201 y aminoácidos 262 a 289; o una región equivalente del receptor en otra especie. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra un polipéptido que comprende uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una o más de las siguientes regiones del receptor de quimiocinas CCX-CKR humano: aminoácidos 1 a 42, aminoácidos 109 a 113, aminoácidos 176 a 201 y aminoácidos 262 a 289; o una región equivalente del receptor en otra especie.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 1 a 42 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en la siguiente secuencia polipeptídica: CCX-CKR: MALEQNQSTDYYYEENEMNGTYDYSQYELICIKEDVREFAKV (SEQ ID NO. 5) o una variante de la misma.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en las siguientes secuencias polipeptídicas: MALEQNQSTDYYYEENEMNG (SEQ ID NO. 6); TYDYSQYELICIKEDVREFAK (SEQ ID NO. 7); MALELNQSAEYY (SEQ ID NO. 13); NYTHDYSQYEVI (SEQ ID NO. 14). MALEQNQSTDYY (SEQ ID NO.19), NGTYDYSQYE LI (SEQ ID NO.20) o una variante de una de las secuencias mencionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 100 a 111 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en las siguientes secuencias polipeptídicas: NAVHGWILGKMM (SEQ ID NO. 15), NAVHGWVLGKIM (SEQ ID NO. 21) o una variante de las mismas.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 109 a 113 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en la siguiente secuencia polipeptídica: KIMCK (SEQ ID NO. 8) o una variante de la misma.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 176 a 201 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 180 a 191 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 186 a 197 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en la siguiente secuencia polipeptídica: YTVNDNARCIPIFPRYLGTSMKALIQ (SEQ ID NO. 9) o una variante de la misma. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) en las siguientes secuencias polipeptídicas: QNARCTPIFPHH (SEQ ID NO. 16), DNARCIPIFPRY (SEQ ID NO.22) o una variante de las mismas. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) en las siguientes secuencias polipeptídicas: PIFPHHLGTSLK (SEQ ID NO. 17), PIFPRYLGTSMK (SEQ ID NO. 23) o una variante de las mismas.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 262 a 289 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una región que comprende los aminoácidos 276 a 287 de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) en la siguiente secuencia polipeptídica: CRAIDIIYSLITSc Nm SKRMDIAIQVTE (SEQ ID NO. 10) o una variante de la misma. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) en las siguientes secuencias polipeptídicas: DMSKRMDVAIQV (SEQ ID NO. 18), NMSKRMDIAIQV (SEQ ID NO.24) o una variante de las mismas.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra uno o más aminoácidos (epítopos) ubicados en una o más de las SEQ ID NO. 5 a 24, y/o una variante o fragmento de la misma. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de una o más de las SEQ ID NO 5 a 24, o una variante o fragmento de una cualquiera o más de estas secuencias. En determinadas realizaciones, el anticuerpo genera un polipéptido aislado o sintético que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de una o más de las SEQ ID NO. 5 a 24, o una variante o fragmento del mismo.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una Kd para la unión de más de 10'6 M. En realizaciones adicionales, una Kd para la unión es igual o mayor que 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M. En realizaciones adicionales, una Kd para la unión es al menos 10'7 M, 10'8 M, 10'9 M o 10'10 M. En determinadas realizaciones, la Kd está en el intervalo de 10'8 M a 10'12 M.

Determinadas realizaciones de la presente divulgación proporcionan un anticuerpo neutralizante para un receptor de quimiocina CCX-CKR y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento para su uso en la prevención y/o tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto. Los cánceres son como se describen en el presente documento.

El anticuerpo neutralizante y/o fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la invención puede unirse a una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR; puede generarse para un epítopo en una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR; puede unirse a un epítopo ubicado en una o más de las siguientes regiones de un receptor de quimiocinas CCX-CKR humano: aminoácidos 1 a 42, aminoácidos 109 a 113, aminoácidos 176 a 201 y aminoácidos 262 a 289; o una región equivalente del receptor en otra especie.

El anticuerpo neutralizante para su uso de acuerdo con la presente invención puede generarse contra un polipéptido que comprende la totalidad o parte de una o más de las siguientes secuencias polipeptídicas: SEQ ID NO. 5 a 24, y/o una variante de la misma.

El anticuerpo neutralizante y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso de acuerdo con la invención puede inhibir la metástasis de una célula cancerosa.

Ejemplos de cánceres metastásicos son como se describen en el presente documento. Ejemplos de metástasis de cánceres son como se describen en el presente documento. En determinadas realizaciones, el cáncer metastásico es un melanoma metastásico, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de ovario o un cáncer colorrectal.

En determinadas realizaciones, la metástasis de un cáncer es la metástasis de un melanoma, un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de ovario o un cáncer colorrectal.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento se une a la región de un CCX-CKR, como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a una región extracelular de un CCX-CKR, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión del anticuerpo del mismo se une a una región amino terminal de un CCX-CKR, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo se une a una región amino terminal extracelular de un CCX-CKR, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se une a una región que comprende uno o más aminoácidos ubicados en una región de los aminoácidos 1 a 12, 1 a 41 o 42, 1 a 20, 19 a 30, 21 a 41, 100 a 111, 109 a 113, 176 a 201, 180 a 191, 186 a 197, 262 a 289, o 276 a 287 de un receptor CCX-CKR, como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se une a uno o más aminoácidos o un epítopo en una o más de las secuencias polipeptídicas SEQ ID NO 5 a 24.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra un receptor de quimiocinas CCX-CKR y/o un fragmento antigénico del mismo, como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra la totalidad o parte de una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR y/o una variante del mismo, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se genera contra una región amino terminal de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra una región amino terminal extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR o una variante del mismo, como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra una región que comprende uno o más aminoácidos ubicados en una región de los aminoácidos 1 a 12, 1 a 41 o 42, 1 a 20, 19 a 30, 21 a 41, 100 a 111, 109 a 113, 176 a 201, 180 a 191, 186 a 197, 262 a 289, o 276 a 287 de un receptor quimiocinas CCX-CKR o variante del mismo, como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra una región que comprende uno o más aminoácidos ubicados en una región de los aminoácidos 1 a 12, 1 a 41 o 42, 1 a 20, 19 a 30, 21 a 41, 100 a 111, 109 a 113, 176 a 201, 180 a 191, 186 a 197, 262 a 289, o 276 a 287 de un receptor quimiocinas CCX-CKR, o una región equivalente del receptor en otra especie, o una variante de cualquiera de las mencionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo se genera contra un polipéptido que comprende la totalidad o parte de una o más de las secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO 5 a 24, y/o una variante de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado.

El anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo se neutraliza para un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo es un antagonista de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo reduce la unión de un ligando a un receptor de quimiocinas CCX-CKr , como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo y/o el fragmento de unión a antígeno del mismo promueve la internalización de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo tiene un isotipo como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM e IgA, como se describe en el presente documento.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal y/o fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, como se describe en el presente documento. Se conocen métodos para producir anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno.

El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se puede expresar de forma recombinante en las células. Las células pueden ser células aisladas. Los ejemplos de células incluyen células procariotas y células eucariotas tales como células de insecto y células de mamífero. Un ejemplo de dicha célula aislada es una célula de hibridoma. Se conocen métodos para producir células de hibridoma. Por ejemplo, un protocolo típico es el siguiente: los animales (por ejemplo, ratones) se exponen primero al antígeno seleccionado. Por lo general, esto se realiza mediante una serie de inyecciones del antígeno, en el transcurso de varias semanas. Una vez que los esplenocitos se aíslan del bazo del mamífero, los linfocitos B pueden fusionarse con células de mieloma inmortalizadas. Las células de mieloma generalmente se seleccionan para asegurar que no secretan anticuerpos por sí mismas y que carecen del gen hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (HGPRT, de sus siglas en inglés), lo que las hace sensibles al medio HAT. La fusión se puede lograr, por ejemplo, usando polietilenglicol o virus Sendai.

Las células fusionadas se incuban en medio HAT durante aproximadamente 10 a 14 días. La aminopterina bloquea la ruta que permite la síntesis de nucleótidos y las células de mieloma no fusionadas mueren, ya que no pueden producir nucleótidos por las rutas de novo o de rescate porque carecen de HGPRT. La eliminación de las células de mieloma no fusionadas es necesaria porque tienen el potencial de superar otras células, especialmente los hibridomas débilmente establecidos. Los linfocitos B no fusionados mueren ya que tienen una vida útil corta. De esta manera, solo los híbridos de mieloma-linfocitos B sobreviven, ya que el gen HGPRT que proviene de los linfocitos B es funcional. Estas células producen anticuerpos y son inmortales. El medio incubado se diluye luego en placas de múltiples pocillos hasta el punto de que cada pocillo contenga solo una célula. Dado que los anticuerpos en un pocillo son producidos por el mismo linfocito B, se dirigirán hacia el mismo epítopo y, por lo tanto, son anticuerpos monoclonales.

La siguiente etapa es un proceso rápido de selección primaria, que identifica y selecciona solo aquellos hibridomas que producen anticuerpos de especificidad apropiada. El sobrenadante de cultivo de hibridoma, el conjugado marcado con enzimas secundarias y el sustrato cromogénico o fluorescente, se incuban y la formación de un producto coloreado indica un hibridoma positivo. Alternativamente, también se puede utilizar la selección inmunocitoquímica o la citometría de flujo.

El linfocito B que produce los anticuerpos deseados puede clonarse para producir muchos clones hijos idénticos. Los medios suplementarios que contienen interleucina-6 son esenciales para esta etapa. Una vez que se establece una colonia de hibridoma, crecerá continuamente en un medio de cultivo como RPMI-1640 (con antibióticos y suero fetal bovino) y producirá anticuerpos.

Las placas de pocillos múltiples se usan inicialmente para cultivar los hibridomas, y después de la selección, se cambian a matraces de cultivo de tejidos más grandes. Esto mantiene el bienestar de los hibridomas y proporciona suficientes células para la crioconservación y el sobrenadante para investigaciones posteriores. El sobrenadante de cultivo puede producir de 1 a 60 pg/ml de anticuerpo monoclonal, que se mantiene a -20 °C o menos hasta que se requiera.

Mediante el uso de sobrenadante de cultivo o una preparación de inmunoglobulina purificada, se puede realizar un análisis adicional de un posible hibridoma productor de anticuerpos monoclonales en términos de reactividad, especificidad y reactividad cruzada.

La metástasis de una célula cancerosa puede inhibirse mediante un método que comprende exponer la célula a una cantidad eficaz de un inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

El término "exponer", y los términos relacionados como "expone" y "exposición", se refieren al contacto y/o tratamiento directo y/o indirecto de una especie (por ejemplo, una célula cancerosa) con un agente que inhibe directa y/o indirectamente un CCX-CKR.

Para las células in vivo, se puede administrar un inhibidor a un sujeto para exponer las células a un inhibidor, o se puede administrar un agente a un sujeto que da como resultado la producción de un inhibidor en el sujeto, exponiendo así las células in vivo a un inhibidor. En otro ejemplo, una o más células pueden eliminarse de un sujeto y ponerse en contacto directa o indirectamente con un inhibidor, y luego las células se vuelven a introducir en el mismo sujeto u otro para efectuar la exposición a un inhibidor. Ejemplos de rutas de administración son como se describen en el presente documento. Una célula cancerosa puede exponerse a un inhibidor ex vivo y posteriormente introducirse en un sujeto.

La metástasis de una célula cancerosa puede inhibirse in vivo o ex vivo mediante un método que comprende exponer la célula a un inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En el presente documento se describen inhibidores de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. El inhibidor puede comprender un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento.

La expresión "cantidad eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un agente que, cuando se expone a una célula u otra especie, es suficiente para generar la respuesta o el resultado deseado. La cantidad eficaz variará dependiendo de una serie de factores, incluyendo, por ejemplo, la actividad específica del agente utilizado y el tipo de célula cancerosa.

En determinadas realizaciones, una célula cancerosa o un cáncer metastásico se expone a una concentración de un inhibidor de 0,1 nM o mayor, 0,5 nM o mayor, 1 nM o mayor, 5 nM o mayor, 10 nM o mayor, 50 nM o mayor, 100 nM o mayor, 500 nM o mayor, 1 pM o mayor, 5 pM o mayor, 10 pM o mayor, 100 pM o mayor, 500 pM o mayor, 1 mM o mayor o 10 mM o mayor. Se contemplan otras concentraciones.

En determinadas realizaciones, una célula cancerosa o un cáncer metastásico se expone a un anticuerpo, y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a una de las concentraciones mencionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, una célula cancerosa o un cáncer metastásico se expone a un inhibidor en una cantidad que varía de uno de los siguientes intervalos seleccionados: 1 pg/kg a 100 mg/kg; 1 pg/kg a 10 mg/kg; 1 |jg/kg a 1 mg/kg; 1 pg/kg a 100 pg/kg; 1 pg/kg a 10 pg/kg; 10 pg/kg a 100 mg/kg; 10 pg/kg a 10 mg/kg; 10 pg/kg a 1 mg/kg; 10 pg/kg a 100 pg/kg; 100 pg/kg a 100 mg/kg; 100 pg/kg a 10 mg/kg; 100 pg/kg a 1 mg/kg; 1 mg/kg a 10 mg/kg; y 10 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. Se contemplan otras cantidades. En determinadas realizaciones, una célula cancerosa o un cáncer metastásico se expone a un anticuerpo, y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, a una de las cantidades mencionadas anteriormente.

Ejemplos de células cancerosas incluyen células cancerosas de cánceres como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de cáncer sólido. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de carcinoma. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de sarcoma. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de linfoma. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula cancerosa de células germinales. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de blastoma. En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula cancerosa hematológica.

En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de melanoma, una célula de mama cancerosa, una célula de próstata cancerosa, una célula de ovario cancerosa, una célula de pulmón cancerosa, una célula colorrectal cancerosa, una célula gástrica cancerosa, una célula pancreática cancerosa, una célula de vejiga cancerosa, una célula esofágica cancerosa, una célula urotelial cancerosa, una célula de pulmón no microcítico cancerosa, una célula de cabeza y cuello cancerosa, una célula testicular cancerosa, una célula uterina cancerosa, una célula hepática cancerosa, una célula renal cancerosa, una célula del estómago cancerosa, una célula del cerebro cancerosa, una cáncer de mieloma maligno, una célula de LMC cancerosa, una célula de LMA cancerosa o una célula de un tumor linfoproliferativo. Se contemplan otros tipos de cánceres.

En determinadas realizaciones, la célula cancerosa es una célula de melanoma, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de ovario o una célula de cáncer colorrectal.

En el presente documento se describen inhibidores de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. El inhibidor para su uso de acuerdo con la invención comprende uno o más de un ARN de interferencia pequeño, un microARN, un ARN antisentido, un ligando para un receptor de quimiocinas CCX-CKR y un anticuerpo neutralizante y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

En determinadas realizaciones, el inhibidor reduce la unión de un ligando a un receptor de quimiocinas CCX-CKR, como se describe en el presente documento. En determinadas realizaciones, el inhibidor promueve la internalización de un receptor de quimiocinas CCX-CKR. En determinadas realizaciones, el inhibidor comprende un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en el presente documento se refiere a la cantidad de un agente que es suficiente para efectuar la prevención y/o el tratamiento, cuando se administra a un sujeto. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo de una serie de factores, incluyendo, por ejemplo, la actividad específica del agente utilizado, la gravedad de la enfermedad, afección o estado en el sujeto, la edad, condición física, existencia de otros estados de enfermedad, y estado nutricional del sujeto.

En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra al sujeto para producir una concentración de un inhibidor de 0,1 nM o mayor, 0,5 nM o mayor, 1 nM o mayor, 5 nM o mayor, 10 nM o mayor, 50 nM o mayor, 100 nM o mayor, 500 nM o mayor, 1 pM o mayor, 5 pM o mayor, 10 pM o mayor, 100 pM o mayor, 500 pM o mayor, 1 mM o mayor o 10 mM o mayor. En determinadas realizaciones, un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo se administra al sujeto para producir una concentración en uno de los intervalos mencionados anteriormente.

En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra al sujeto en una cantidad que varía de uno de los siguientes intervalos seleccionados: 1 pg/kg a 100 mg/kg; 1 pg/kg a 10 mg/kg; 1 pg/kg a 1 mg/kg; 1 pg/kg a 100 pg/kg; 1 pg/kg a 10 pg/kg; 10 pg/kg a 100 mg/kg; 10 pg/kg a 10 mg/kg; 10 pg/kg a 1 mg/kg; 10 pg/kg a 100 pg/kg; 100 pg/kg a 100 mg/kg; 100 pg/kg a 10 mg/kg; 100 pg/kg a 1 mg/kg; 1 mg/kg a 10 mg/kg; y 10 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. En determinadas realizaciones, un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo se administra al sujeto para producir en uno de los intervalos mencionados anteriormente. Por ejemplo, un anticuerpo terapéutico puede administrarse a una concentración de 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 o 20 mg/kg de peso corporal. Se contemplan otras cantidades. La dosis y la frecuencia de administración se pueden determinar por un experto en la materia.

El inhibidor puede administrarse al sujeto en una forma adecuada. En este sentido, los términos "administrar" o "proporcionar" incluyen administrar el inhibidor, o administrar un profármaco del inhibidor, o un derivado del inhibidor que formará una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor dentro del cuerpo del sujeto. Los términos incluyen vías de administración que son sistémicas (por ejemplo, mediante inyección tal como inyección intravenosa, por vía oral en un comprimido, píldora, cápsula u otra forma de dosificación útil para la administración sistémica de productos farmacéuticos) y tópicas (por ejemplo, cremas, soluciones y similares, incluyendo soluciones tales como enjuagues bucales, para administración oral tópica).

En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra por vía oral. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra por vía intravenosa. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra mediante inyección, tal como inyección intravenosa. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra mediante administración nebulizada, mediante administración en aerosol o mediante instilación en el pulmón.

Los inhibidores pueden administrarse solos o pueden administrarse en una mezcla con otros agentes terapéuticos y/o agentes que potencian, estabilizan o mantienen la actividad del inhibidor. En determinadas realizaciones, un vehículo de administración (por ejemplo, píldora, comprimido, implante, solución inyectable, etc.) contendría tanto el (los) inhibidor(es) como el (los) agente(s) adicional(es).

El inhibidor para su uso de acuerdo con la presente invención también se puede usar en terapia de combinación. En este sentido, el sujeto se trata o se le da otro fármaco o modalidad de tratamiento junto con el inhibidor como se describe en el presente documento. Esta terapia combinada puede ser una terapia secuencial donde el sujeto se trata primero con uno y luego con el otro, o las dos o más modalidades de tratamiento se pueden administrar simultáneamente.

"Administración conjunta" o "coadministración" se refiere a la administración de dos o más agentes terapéuticos juntos a la vez. Los dos o más agentes terapéuticos pueden formularse conjuntamente en una sola forma de dosificación o "unidad de dosificación combinada", o formularse por separado y posteriormente combinarse en una unidad de dosificación combinada, normalmente para administración intravenosa o administración oral.

Cuando se administra a un sujeto, la dosificación terapéuticamente eficaz puede variar dependiendo del inhibidor particular utilizado, el modo de administración, la afección y la gravedad de la misma, así como los diversos factores físicos relacionados con el sujeto que se está tratando. Como se analiza en el presente documento, las dosis diarias adecuadas varían de 1 pg/kg a 100 mg/kg. Se espera que las dosis diarias varíen con la vía de administración y la naturaleza del inhibidor administrado. En determinadas realizaciones, al sujeto se le administran dosis crecientes de inhibidor y/o dosis repetidas. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra por vía oral. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra mediante inyección, tal como inyección intravenosa. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra por vía parenteral. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra mediante introducción directa a los pulmones, tal como mediante administración en aerosol, mediante administración nebulizada, y mediante instilación en el pulmón. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra mediante implante. En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra mediante inyección subcutánea, intraarticular, rectal, intranasal, intraocular, vaginal o transdérmica.

La "administración intravenosa" es la administración de sustancias directamente en una vena.

La "administración oral" es una vía de administración en la que una sustancia se toma por la boca e incluye la administración bucal, sublabial y sublingual, así como la administración enteral y a través del tracto respiratorio, a menos que se realice, por ejemplo, con un tubo para que el medicamento no esté en contacto directo con ninguna de las mucosas orales. La forma típica para la administración oral de agentes terapéuticos incluye el uso de comprimidos o cápsulas.

En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra como una formulación de liberación inmediata. La expresión "formulación de liberación inmediata" es una formulación que está diseñada para liberar rápidamente un agente terapéutico en el cuerpo durante un período de tiempo más corto.

En determinadas realizaciones, el inhibidor se administra como una formulación de liberación sostenida. La expresión "formulación de liberación sostenida" es una formulación que está diseñada para liberar lentamente un agente terapéutico en el cuerpo durante un período prolongado de tiempo.

En determinadas realizaciones, el inhibidor se utiliza en una composición farmacéutica.

Una composición farmacéutica puede comprender además uno o más de un transportador, excipiente, vehículo y aditivo farmacéuticamente aceptable.

En determinadas realizaciones, el inhibidor está presente en un medicamento para producir una concentración de un inhibidor en el sujeto de 0,1 nM o mayor, 0,5 nM o mayor, 1 nM o mayor, 5 nM o mayor, 10 nM o mayor, 50 nM o mayor, 100 nM o mayor, 500 nM o mayor, 1 pM o mayor, 5 pM o mayor, 10 pM o mayor, 100 pM o mayor, 500 pM o mayor, 1 mM o mayor o 10 mM o mayor. Se contemplan otras concentraciones. En determinadas realizaciones, un anticuerpo terapéutico y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo está presente en un medicamento en una de las cantidades mencionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, el inhibidor está presente en un medicamento para proporcionar una cantidad de inhibidor para administración al sujeto en una cantidad que varía de uno de los siguientes intervalos seleccionados: 1 pg/kg a 100 mg/kg; 1 pg/kg a 10 mg/kg; 1 pg/kg a 1 mg/kg; 1 pg/kg a 100 pg/kg; 1 pg/kg a 10 pg/kg; 10 pg/kg a 100 mg/kg; 10 pg/kg a 10 mg/kg; 10 pg/kg a 1 mg/kg; 10 pg/kg a 100 pg/kg; 100 pg/kg a 100 mg/kg; 100 pg/kg a 10 mg/kg; 100 |jg/kg a 1 mg/kg; 1 mg/kg a 10 mg/kg; y 10 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. Se contemplan otras cantidades. En determinadas realizaciones, un anticuerpo terapéutico y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo está presente en un medicamento en una de las cantidades mencionadas anteriormente.

En determinadas realizaciones, el medicamento es adecuado para la administración al sujeto mediante una o más de administración intravenosa, administración intratraqueal, mediante administración nebulizada, mediante administración en aerosol, mediante instilación en el pulmón, mediante administración oral, mediante administración parenteral, mediante implante, mediante inyección subcutánea, intraarticular, rectal, intranasal, intraocular, vaginal o transdérmica.

En determinadas realizaciones, el inhibidor se proporciona en un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para administrar la composición farmacéutica a un sujeto. Los vehículos pueden elegirse en función de la ruta de administración como se describe en el presente documento, la ubicación del problema diana, el inhibidor que se administra, el curso temporal de la administración del medicamento, etc. La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a una carga, diluyente, material de encapsulación o auxiliar de formulación sustancialmente inerte, sólido, semisólido o líquido de cualquier tipo. Un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable es la solución salina fisiológica. Otros vehículos fisiológicamente aceptables y sus formulaciones son conocidos en la materia. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y derivados de la misma, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón; aceite de cártamo; aceite de sésamo; aceite de oliva; aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; detergentes tal como TWEEN 80; agentes tamponantes, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua apirógena; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; y soluciones de tampón de fosfato, así como otros lubricantes compatibles no tóxicos, tales como lauril sulfato de sodio y estearato de magnesio, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, edulcorantes, agentes aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes también pueden estar presentes.

En determinadas realizaciones, el inhibidor puede administrarse o presentarse en una composición farmacéutica como una sal farmacéuticamente aceptable. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales de adición de ácidos o complejos metálicos que se usan comúnmente en la industria farmacéutica. Los ejemplos de sales de adición de ácidos incluyen ácidos orgánicos tales como ácidos acético, láctico, pamoico, maleico, cítrico, málico, ascórbico, succínico, benzoico, palmítico, subérico, salicílico, tartárico, metanosulfónico, toluensulfónicos o trifluoroacéticos o similares; ácidos poliméricos tales como ácido tánico, carboximetilcelulosa o similares; y ácidos inorgánicos tal como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, o similares. Los complejos metálicos incluyen zinc, hierro y similares.

Las composiciones farmacéuticas o medicamento comprenden otros agentes terapéuticos y/o agentes que potencian, estabilizan o mantienen la actividad del activo.

Las formulaciones orales, que contienen los inhibidores como se describe en el presente documento, pueden comprender cualquier forma oral usada convencionalmente, incluyendo comprimidos, cápsulas, formas bucales, trociscos, pastillas para chupar y líquidos, suspensiones o soluciones orales. Las cápsulas pueden contener mezclas de los compuestos activos con rellenos inertes y/o diluyentes tales como los almidones farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, almidón de maíz, patata o tapioca), azúcares, agentes edulcorantes artificiales, celulosas en polvo, tales como celulosas cristalinas y microcristalinas, harinas, gelatinas, gomas, etc. Las formulaciones de comprimidos útiles pueden prepararse mediante métodos de compresión convencional, granulación húmeda o granulación seca y utilizar diluyentes farmacéuticamente aceptables, agentes aglutinantes, lubricantes, disgregantes, agentes modificadores de la superficie (incluidos los tensioactivos), agentes de suspensión o estabilizantes, incluyendo estearato de magnesio, ácido esteárico, talco, laurilsulfato de sodio, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa de calcio, polivinilpirrolidona, gelatina, ácido algínico, goma arábiga, goma de xantano, citrato de sodio, silicatos complejos, carbonato de calcio, glicina, dextrina, sacarosa, sorbitol, fosfato de dicalcio, sulfato de calcio, lactosa, caolín, manitol, cloruro de sodio, talco, almidones secos y azúcar en polvo. Los agentes modificadores de superficie incluyen agentes modificadores de superficie no iónicos y aniónicos. Ejemplos representativos de agentes modificadores de superficie incluyen, pero sin limitación, poloxámero 188, cloruro de benzalconio, estearato de calcio, alcohol cetoestearílico, cera emulsionante de cetomacrogol, ésteres de sorbitano, dióxido de silicio coloidal, fosfatos, dodecilsulfato sódico, silicato de aluminio y magnesio y trietanolamina. Las formulaciones orales pueden utilizar formulaciones estándar de retardo o de liberación prolongada para alterar la absorción de los péptidos. La formulación oral también puede consistir en administrar el principio activo en agua o un zumo de fruta, que contenga solubilizantes o emulsionantes apropiados según sea necesario.

En determinadas realizaciones, puede ser deseable administrar el inhibidor directamente a las vías respiratorias en forma de aerosol. Se conocen formulaciones para la administración en formas de aerosol.

En determinadas realizaciones, el inhibidor también se puede administrar parenteralmente (tal como directamente en el espacio articular) o intraperitonealmente. Por ejemplo, las soluciones o suspensiones de estos compuestos en una forma no ionizada o como una sal farmacológicamente aceptable pueden prepararse en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo tal como hidroxipropilcelulosa. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones normalmente contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.

En determinadas realizaciones, el inhibidor también puede administrarse mediante inyección. Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El vehículo puede ser un disolvente o un medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales.

En determinadas realizaciones, el inhibidor también puede administrarse por vía intravenosa. Las composiciones que contienen el inhibidor descrito en el presente documento adecuado para administración intravenosa pueden formularse por una persona experta.

En determinadas realizaciones, el inhibidor también puede administrarse por vía transdérmica. Se entiende que las administraciones transdérmicas incluyen todas las administraciones a través de la superficie del cuerpo y los revestimientos internos de los conductos corporales, incluidos los tejidos epiteliales y mucosos. Dichas administraciones pueden llevarse a cabo utilizando el inhibidor como se describe en el presente documento, o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, en lociones, cremas, espumas, parches, suspensiones, soluciones y supositorios (rectales y vaginales).

La administración transdérmica también se puede lograr mediante el uso de un parche transdérmico que contiene el compuesto activo y un vehículo que es inerte al compuesto activo, no es tóxico para la piel y permite la administración del agente para la absorción sistémica en el torrente sanguíneo a través de la piel. El vehículo puede adoptar cualquier cantidad de formas, tales como cremas y ungüentos, pastas, geles y dispositivos oclusivos. Las cremas y pomadas pueden ser emulsiones líquidas viscosas o semisólidas del tipo aceite en agua o agua en aceite. Las pastas compuestas de polvos absorbentes dispersos en petróleo o petróleo hidrófilo que contienen el principio activo también pueden ser adecuadas. Se puede usar una variedad de dispositivos oclusivos para liberar el principio activo en el torrente sanguíneo, tal como una membrana semipermeable que cubre un depósito que contiene el principio activo con o sin un vehículo, o una matriz que contiene el principio activo.

En determinadas realizaciones, el inhibidor también puede administrarse por medio de un supositorio. Las formulaciones de supositorios pueden estar hechas de materiales tradicionales, incluida la manteca de cacao, con o sin la adición de ceras para alterar el punto de fusión del supositorio y glicerina. También se pueden usar bases de supositorios solubles en agua, tales como polietilenglicoles de diversos pesos moleculares.

Las formulaciones son conocidas y se describen en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985.

Para la administración de un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo, estos pueden incorporarse en una composición farmacéutica, generalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, adecuado para la administración a un sujeto in vivo.

Se conocen métodos para preparar, formular y administrar composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo, e incluyen, por ejemplo, "Handbook of Therapeutic Antibodies" ed. S. Dubel (2007) Wiley-VCH. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable, como se describe en el presente documento.

Se puede usar un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento para detectar un receptor de quimiocinas CCX-CKR. Se conocen varios métodos para usar anticuerpos para detectar receptores, y se describen generalmente en Sambrook, J, Fritsch, E.F. y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York. (1989).

El anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento también se puede usar como agente de diagnóstico para detectar un receptor de quimiocinas CCX-CKR in vitro, ex vivo y/o in vivo. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden usar en un inmunoensayo convencional, que incluye un ELISA, un RIA, FACS, inmunohistoquímica tisular, transferencia de Western o inmunoprecipitación.

Se puede usar un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento para detectar una célula cancerosa, un cáncer o un cáncer metastásico. La célula cancerosa puede ser una célula cancerosa metastásica. En particular, se puede usar un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento para detectar una célula cancerosa, una célula cancerosa metastásica, un cáncer o un cáncer metastásico que expresa o sobreexpresa el receptor de quimiocinas CCX-CKR. Para dichos fines, el anticuerpo y/o porción de unión a antígeno puede marcarse con una fracción detectable y, por lo tanto, el receptor o la célula pueden detectarse directamente.

Alternativamente, un anticuerpo primario contra un receptor de quimiocinas CCX-CKR puede no estar marcado y puede utilizarse un anticuerpo secundario u otra molécula que se una al anticuerpo del receptor de quimiocinas CCX-CKR. Por ejemplo, el anticuerpo puede usarse en el análisis inmunohistoquímico de tejidos o células. La unión del anticuerpo puede detectarse con un anticuerpo secundario, por ejemplo, como una IgG biotinilada que reconoce el anticuerpo primario, y la incubación con estreptavidina CY3/FITC se usa para detectar la unión del anticuerpo al receptor.

Los ejemplos de fracciones detectables incluyen radioisótopos, tales como 3H, 14C, 32P, 35S, o 1311; compuestos fluorescentes o quimioluminiscentes, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Se conocen métodos para conjugar un anticuerpo con una fracción detectable.

Por ejemplo, se puede obtener una muestra que comprende una o más células de un sujeto, y se puede detectar el presente de una o más células cancerosas. Métodos para detectar un CCX-CKR, o una célula que expresa un CCX-CKR, se describen en el presente documento.

Alternativamente, una célula cancerosa, un cáncer o un cáncer metastásico pueden detectarse in situ. Se puede usar un anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo como se describe en el presente documento para detectar una célula cancerosa in vivo, tal como la formación de imágenes in vivo. El anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo puede marcarse con una fracción detectable, tal como un agente radiopaco o radioisótopo, administrarse a un sujeto, y determinar la presencia y ubicación del anticuerpo marcado, etc., en el hospedador ensayado. Dichas técnicas de imagen son útiles en la estadificación y el tratamiento de tumores malignos. El anticuerpo y/o un fragmento de unión a antígeno del mismo puede marcarse con cualquier fracción que sea detectable en un hospedador, ya sea mediante resonancia magnética nuclear, radiología u otros medios de detección conocidos para la obtención de imágenes in vivo. Ejemplos de células cancerosas son como se describen en el presente documento.

Los ejemplos de sujetos en los que se puede detectar una célula cancerosa son como se describen en el presente documento. Los sujetos son como se describen en el presente documento. En particular, el sujeto puede ser humano.

El cáncer puede ser cáncer metastásico. Ejemplos de cánceres y cánceres metastásicos son como se describen en el presente documento.

Un agente capaz de inhibir la metástasis de un cáncer puede identificarse mediante un método que comprende:

identificar un agente de prueba que modula la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR;

determinar la capacidad del agente de prueba para inhibir la metástasis de un cáncer; e

identificar el agente de prueba como un agente capaz de inhibir la metástasis de un cáncer.

Se describen en el presente documento ejemplos de cánceres.

Los ejemplos de agentes de prueba incluyen un fármaco, una molécula pequeña, una proteína, un polipéptido, un lípido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un oligonucleótido, una ribozima, un producto biológico, un aptámero, un cofactor, un ligando, un mimético de ligando, un receptor, una enzima, una cinasa, una fosfatasa, una citocina, un factor de crecimiento, un ión metálico, un quelato, un ácido nucleico antisentido, un ARN antisentido, un microARN, un ARNip, un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo, un antagonista, un inhibidor o un supresor.

Se conocen métodos para determinar la capacidad de un agente de prueba para modular la actividad del receptor. Por ejemplo, la capacidad de un agente de prueba para modular la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR puede incluir la capacidad del agente de prueba para modular la unión del ligando al receptor y/o la capacidad del agente de prueba para modular la señalización del receptor. En este sentido, se puede determinar la capacidad del agente de prueba para modular la señalización mediante una o más proteínas G.

Se conocen métodos para determinar la capacidad del agente de prueba para inhibir la metástasis. Por ejemplo, la capacidad del agente de prueba para inhibir la metástasis se puede determinar en un modelo animal adecuado como se describe en el presente documento. Entonces se puede lograr la identificación del agente de prueba como un agente capaz de inhibir la metástasis.

Un agente capaz de inhibir la metástasis de células cancerosas puede identificarse mediante un método que comprende:

identificar un agente de prueba que inhibe un receptor de quimiocinas CCX-CKR;

determinar la capacidad del agente de prueba para inhibir la metástasis de células cancerosas; e

identificar el agente de prueba como un agente capaz de inhibir la metástasis de células cancerosas.

Un anticuerpo y/o fragmento de unión a antígeno del mismo capaz de inhibir la metástasis de células cancerosas puede identificarse mediante un método que comprende:

producir un anticuerpo generado contra un polipéptido del receptor de quimiocinas CCX-CKR;

determinar la capacidad del anticuerpo para inhibir la metástasis de células cancerosas; e

identificar el anticuerpo como un agente capaz de inhibir la metástasis cancerosa.

Ejemplos de células cancerosas son como se describen en el presente documento, e incluyen una célula de melanoma, una célula de cáncer de mama, una célula de cáncer de próstata, una célula de cáncer de ovario y una célula de cáncer colorrectal.

El polipéptido del receptor de quimiocinas CCX-CKR puede ser un polipéptido como se describe en el presente documento. En particular, el polipéptido del receptor de quimiocinas CCX-CKR es un polipéptido aislado que consiste en una o más secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO. 5 a SEQ ID NO. 24, o una variante o un fragmento del mismo.

Se pueden usar técnicas estándar para la tecnología de ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, producción de anticuerpos, síntesis de péptidos, cultivo tisular y transfección. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se pueden realizar de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se logra comúnmente en la materia o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la materia y como se describe en varias referencias generales y más específicas que se citan y discuten a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

La enumeración de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique otra cosa en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se citara individualmente en el presente documento. Cuando se proporciona un intervalo de valores específico, se entiende que cada valor intermedio, a la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está incluido en el mismo. Todos los subintervalos más pequeños también están incluidos. También se incluyen en el mismo los límites superior e inferior de estos intervalos menores, sujetos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo indicado.

Determinadas realizaciones ejemplares se ilustran mediante algunos de los siguientes ejemplos:

EJEMPLO 1 - El ARNi de CCX-CKR en células de melanoma B16 da como resultado el rechazo completo del melanoma.

Se insertaron casetes de ARNhc dirigidos a CCX-CKR en el vector de expresión lentivírico pLKO.1 adquirido de Open Biosystems (Thermo Scientific) y ARNip producido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes lentivíricos se produjeron mediante la transfección de células de empaquetamiento HEK293T con uno de los ARNhc de CCX-CKR o los vectores lentivíricos que codifican ARNhc de control junto con los plásmidos de empaquetamiento psPAX2, pREV y pMD2-G. El medio que contiene lentivirus se cosechó 48 horas después de la transfección y se colocó en células B16. Después de una incubación de 6 horas, se retiró el sobrenadante vírico y se reemplazó con medio completo. Los transductores se seleccionaron con puromicina durante al menos 2 semanas antes de ser sometidos a un análisis adicional.

Se inocularon ratones por vía subcutánea con células B16 de control (B16CTLkd) o células B16 en las que el ARNi había atenuado el CCX-CKR (designado B16CCXkd6 o kd7). CCX-CKR kd n.° 6: 5'-CCGGCAGTACGAAGTGATCTGCATACTCGAGTATGCAGATCACTTCGTACTGTTT TT-3' (SEQ ID NO. 2); CCXCKR kd n.° 7:5'-CCGGCTGCGATATGAGCAAACGCATCTCGAGATGCGTTTGCTCATATCGCAGTTT TT-3' (SEQ ID NO. 4).

El crecimiento tumoral se midió diariamente durante un máximo de 22 días. Los tumores se eliminaron y se examinaron mediante microscopía de disección. Los gráficos representan la media ± eem (n = mínimo de 10 ratones por grupo). Los tumores disecados son de un experimento.

En la figura 1 se muestran los resultados. Los datos muestran que una reducción en la actividad de CCX-CKR da como resultado un rechazo completo del crecimiento del melanoma, en comparación con los ratones inoculados con células B16 de control.

EJEMPLO 2- La atenuación del ARNi de CCX-CKR inhibe la metástasis del melanoma B16.

Se inocularon ratones con 4x105 células a través de la almohadilla plantar con células B16 de control (B16GFPkd) o células B16 en las que el ARNi había atenuado el CCX-CKR (B16CCXkd6 o kd7). Se recogieron ganglios linfáticos pélvicos (PLN, de sus siglas en inglés) y se cultivaron cultivos homogenizados en presencia de puromicina.

En la figura 2 se muestran los resultados. La atenuación de CCX-CKR inhibió drásticamente el número de células de puromicina presentes en el PLN, lo que demuestra que la atenuación del ARNi inhibe la metástasis linfática de las células de melanoma B16.

EJEMPLO 3 - La pérdida de CCX-CKR da como resultado la generación de una respuesta inmunitaria anti-melanoma.

Se inyectaron a los ratones células B16 de control o células en las que el ARNi había atenuado el CCX-CKR (B16CCXkd) y los tumores se recogieron en los días indicados y se analizaron para detectar la presencia de diversas células inmunitarias y citocinas. Cuando fue adecuado, los datos se expresaron como media ± eem (n = mínimo de 5 ratones).

En la figura 3 se muestran los resultados. Figura 3A - Niveles de leucocitos infiltrantes de tumores en tumores B16 con atenuación de CCX-CKR. Los tumores subcutáneos recogidos en el día 10 o 17 después de la inyección tumoral se picaron y se digirieron usando colagenasa IA. Se eliminaron los eritrocitos de la suspensión de células individuales antes de bloquear los receptores Fcy y se marcaron las células para combinaciones de CD4 y CD8, CD49b y NK1.1, IA/IE y CD11c, o IA/IE y F4/80. Cada punto representa los datos de ratones individuales y las barras representan la media ± EEM de 6 ratones por grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t desapareada. Figura 3B -Tinción inmunofluorescente de secciones tumorales con atenuación de CCX-CKr para leucocitos infiltrantes de tumores. Los tumores subcutáneos recogidos el día 17 después de la inyección tumoral se incluyeron en OCT y se congelaron en nitrógeno líquido. Las secciones tumorales se fijaron y bloquearon con suero de ratón normal al 2 % y suero de cabra normal al 2 %. Las secciones se tiñeron para CD4, CD8, F4/80, CD11b o CD11c. Se adquirieron imágenes utilizando el microscopio confocal de barrido espectral Leica SP5 y el programa informático LAS AF. Se muestran imágenes representativas de 2 experimentos independientes, cada uno realizado con 3 ratones por grupo. Figura 3C - Niveles de citocinas inflamatorias en el microambiente tumoral B16 con atenuación de CCX-CKR. Los tumores subcutáneos extraídos de ratones fueron picados y digeridos usando colagenasa IA. El sobrenadante homogenizado se probó para medir los niveles de IFN-y, IL-12 e IL-17 mediante ELISA secuencial. Las concentraciones de quimiocinas se normalizaron para cada peso tumoral. Cada punto representa los datos de ratones individuales y las barras representan la media ± e Em de 6 ratones por grupo. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t desapareada.

EJEMPLO 4 - Los ratones con CCX-CKR inactivado son resistentes al crecimiento de melanoma y metástasis.

Los ratones CCX-CKR'7', generados en el Instituto Beatson para la Investigación del Cáncer (Glasgow, Reino Unido), y se retrocruzaron con el antecedente C57Bl/6 durante más de 10 generaciones y se confirmó que eran singénicos con la cepa C57Bl/6 usando un análisis de polimorfismo de nucleótido único (SNP, de sus siglas en inglés) de todo el genoma, eliminando la posibilidad de antígenos menores que difieren entre ratones ts e inactivados.

Los ratones CCX-CKR KO o TS se inocularon por vía subcutánea con células de melanoma B16 TS. El crecimiento del tumor se evaluó diariamente y el peso tumoral se evaluó al final del experimento. Los resultados se muestran en las Figuras 4A y 4B. Los datos se trazan como media ± eem (n = mínimo 2o ratones). El tamaño del tumor y el peso del tumor disminuyeron notablemente en los ratones inactivados para CCX-CKR.

Los ratones CCX-CKR KO o TS se inocularon por vía intravenosa con células de melanoma B16 TS. Se recogieron los pulmones 14 días después y se cuantificó el número de nódulos tumorales de superficie. Se muestran los resultados en la Figura 4C. Los datos se trazan como media ± eem (n = mínimo 20 ratones). La cantidad de nódulos de superficie disminuye notablemente en ratones con CCX-CKR inactivado.

EJEMPLO 5 - Efecto de los anticuerpos anti-CCX-CKR (anti-CCR11) sobre la colonización pulmonar por las células de melanoma B16.

Se inmunizaron conejos con uno de los siguientes péptidos; MALELNQSAEYYYEENEMNY (SEQ ID NO.11; correspondiente a los aminoácidos 1-20 del receptor CCX-CKR de ratón; n.° de referencia de GenBank AY072796) o THDYSQYEVICIKEEVRQFAK (SEQ ID NO.12; correspondiente a los aminoácidos 21-41 del receptor CCX-CKR de ratón; n.° de referencia de GenBank AY072796) y los anticuerpos se purificaron del suero usando una columna de afinidad. Los anticuerpos contra dos péptidos se agruparon antes de ser inyectados en ratones.

Los ratones C57B16 se inyectaron con 2x105 células de melanoma B16 de tipo silvestre por vía intravenosa. Los ratones se trataron con 375 ug de IgG normal de conejo o con anticuerpos policlonales anti-CCX-CKR purificados por afinidad en los días 0, 4 y 8. Los pulmones se extirparon 13 días después y se contó el número de nódulos metastásicos, como se muestra en la Figura 5A. En la Figura 5B se muestran fotografías representativas.

El tratamiento con anticuerpos anti-CCX-CKR redujo el número de nódulos metastásicos en aproximadamente un 40

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor que actúa directamente para alterar la actividad del receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso en la prevención y/o tratamiento de un cáncer metastásico en un sujeto, en el que el inhibidor comprende uno o más de un ARN de interferencia pequeño, un microARN, un ARN antisentido, un ligando para un receptor de quimiocinas CCX-CKR, y un anticuerpo neutralizante y/o una parte de unión a antígeno del mismo.

2. El inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el cáncer metastásico es un melanoma metastásico, un cáncer de mama metastásico, un cáncer de próstata metastásico, un cáncer de ovario metastásico o un cáncer colorrectal metastásico.

3. El inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor es un anticuerpo y/o la parte de unión a antígeno del mismo que:

(i) se une a un receptor de quimiocinas CCX CKR; o

(ii) se une a una región extracelular de un receptor de quimiocinas CCX-CKR; o

(iii) se une a una región amino-terminal de un receptor de quimiocinas CCX-CKR; o

(iv) se une a uno o más aminoácidos y/o un epítopo ubicado en una o más de las siguientes regiones del receptor de quimiocinas CCX-CKR humano: aminoácidos 1 a 42, aminoácidos 109 a 113, aminoácidos 176 a 201 y aminoácidos 262 a 289; o

(v) se une a uno o más aminoácidos y/o un epítopo en una o más secuencias polipeptídicas de SEQ ID NO. 5 a 24; o

(vi) es un anticuerpo monoclonal.

4. El inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor:

(i) induce una respuesta inmunitaria al cáncer en el sujeto; o

(ii) promueve la internalización de un receptor de quimiocinas CCX-CKR.

5. El inhibidor de un receptor de quimiocinas CCX-CKR para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el inhibidor induce células antitumorales CD4+ y/o CD8+ en el sujeto.

6. Un inhibidor como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria a un cáncer metastásico en un sujeto.