WO2012025582A2 - Verfahren zur herstellung hochkonzentrierter lösungen von selbstassemblierenden proteinen - Google Patents

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    • D06M15/00—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment
    • D06M15/01—Treating fibres, threads, yarns, fabrics, or fibrous goods made from such materials, with macromolecular compounds; Such treatment combined with mechanical treatment with natural macromolecular compounds or derivatives thereof
    • D06M15/15—Proteins or derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to stable aqueous protein dispersions, comprising in an aqueous phase at least one self-assembling protein in dispersed form and at least one special dispersing agent for the self-assembling protein; Process for the preparation of such stable aqueous dispersions; Process for the electrospinning of self-assembled proteins using such stable aqueous dispersions; Process for the production of fiber surface formations or fibers from such aqueous dispersions; the use of such aqueous dispersions for coating surfaces; the use of the materials produced by electro-spinning for the production of medical devices, hygiene articles and textiles; and fibrous or fibrous webs made by an electrospinning process of the present invention.
  • the electrospinning process (also referred to as “electrospinning” or “electrospinning”) is a preferred method of making nano and meso fibers.
  • electrospinning is a preferred method of making nano and meso fibers.
  • a polymer melt or a polymer solution is exposed to a high electric field at an edge serving as an electrode. This can be achieved, for example, by extruding the polymer melt or polymer solution in an electric field under low pressure through a cannula connected to one pole of a voltage source.
  • Natural starting materials such as biopolymers or synthetic polymers derived therefrom, can also be processed by electrospinning.
  • the processing of spider silk proteins of the spider Nephila clavipes from a hexafluoro-2-propanol solution into nanofibers has been described by electrospinning by Zarkoob and Reneker (Polymer 45: 3973-3977, 2004).
  • Spin tests of Bombyx mori silk from a formic acid solution are described by Sukigara and Ko (Polymer 44: 5721-572, 2003), whereby the fiber morphology is influenced by varying the electrospinning parameters.
  • Jin and Kaplan reported water-based electrospinning of silk or silk / polyethylene oxide (Biomacromolecules 3: 1233-1239, 2002).
  • WO-A-03/060099 describes various methods (including electrospinning) and apparatuses for spinning Bombyx mori silk proteins and spider silk proteins.
  • the spider silk proteins used were recombinantly produced by transgenic goats and purified from their milk and then spun.
  • Synthetic biopolymers composed of repititive units of the insect protein Resilin or of the spider silk protein designated R16 or S16 are described in WO2008 / 155304 of the present Applicant.
  • the present in the form of microbeads polymers may, for. B. converted into gel-like products or processed into protein films.
  • polymers e.g. synthetic biopolymers or other spinnable organic polymers, or matched polymer blends thereof, optionally in admixture with pharmaceutical or agrochemical active ingredients is described in WO 2010/015709 and WO 2010/015419 of the present applicant.
  • solutions of the polymers in organic solvents or concentrated formic acid are used.
  • the object of the invention is to develop systems which can be sprayed, which make it possible to stabilize the protein at a higher concentration in the liquid phase to be spun.
  • a first solution according to the invention of avoiding precipitation of the protein from the aqueous solution involves the stabilization of the hydrophobic protein with a hydrophilic protein which also contains hydrophobic moieties in the structure.
  • BSA bovine serum albumin
  • BSA is a soluble protein that acts as a transporter for fatty acids and lipids in the blood.
  • BSA consists of 607 amino acids and has a molecular mass of about 69.4 kDa.
  • Non-fat BSA ff. BSA
  • BSA is a particular embodiment of BSA in which additional hydrophobic sites are present by removal of fatty acids.
  • a second solution according to the invention of the above problem comprises the stabilization of the hydrophobic protein with the aid of suitable protein fragments (peptides).
  • the protein fragments according to the invention have both hydrophobic and hydrophilic sequence regions.
  • two peptide-based systems are provided: a) Stabilization of the native R16 protein by means of protein fragments of the R16 protein.
  • the respective hydrolytic cleavage of the protein for the preparation of the stabilizing protein fragments is carried out in a conventional manner, for. B. by means of a NaOH solution at 80 ° C.
  • a third solution according to the invention of the above problem comprises the stabilization of the hydrophobic protein with the aid of suitable synthetic organic oligomers, which represent known verbi ndu ngen gene and z. B. in WO2010 / 057654, the disclosure of which is incorporated herein by reference. These oligomers also have both hydrophobic and hydrophobic le areas and stabilize the hydrophobic proteins in aqueous solution even at elevated concentrations.
  • FIG. 1 shows the mass spectrum (Maldi-ToF) of an R16 protein hydrolyzate according to the invention.
  • FIG. 2 shows the mass spectrum (Maldi-ToF) of a BSA protein hydrolyzate according to the invention.
  • FIG. 3 shows electron micrographs of fibers obtained by electrospinning of R16 protein solutions stabilized with BSA and additionally added to increase the viscosity with polyethylene oxide polymer (PEO);
  • FIG. 3a shows the result of spinning a dispersion of R16 protein, BSA and PEO with a solids content of the components of 42.5%, 42.5% and 15%, respectively;
  • FIG. 3a shows the result of spinning a dispersion of R16 protein, BSA and PEO with a solids content of the components of 42.5%, 42.5% and 15%, respectively;
  • FIG. 3b shows the result of a mixture of these three components, but with a solids content of 37%, 37% and 16%, respectively; and
  • Figures 3c and d show the result of spinning a mixture of these three components with solids contents of 34.5%, 34.5% and 31% respectively, spun at a rate of 0.4 ml / h ( Figure 3c) and 0.5 ml / h ( Figure 3d).
  • FIG. 4 shows electron micrographs of fibers obtained by electrospinning an aqueous dispersion of R16 protein stabilized with the aid of peptide fragments of the R16 protein;
  • FIG. 4 a shows the spinning of a mixture of an R 16 protein, R 16 fragment and PEO with a solids content of these components of 61%, 0.003% and 39%, respectively;
  • FIG. 4b shows the result of a spinning of these three components with a solids content of the components of 74%, 0.004% and 26%, respectively.
  • FIG. 5 shows electron micrographs of fibers obtained by electrospinning an R16 protein solution stabilized with BSA peptide fragments.
  • Figures 5a and b show the same fibers at different magnifications.
  • FIG. 6 shows an electron micrograph of fibers obtained by electrospinning an R16 protein solution stabilized with an amphiphilic oligomer of the formula 1 according to the invention.
  • FIG. 7 shows the in vitro activity according to the invention of the R16 protein on the cell proliferation of fibroblasts. The time-dependent change in the relative cell number at different concentrations of R16 protein fragments compared to the control (Ktrl, without such fragments) is shown. Detailed description of the invention
  • Amphiphile describes the chemical property of a substance to be both hydrophilic and lipophilic, which is why it is based on nonpolar Lkipedia.org / wiki / solutions that the substance has both hydrophilic and hydrophobic regions.
  • Chaotropic refers to chemical substances, such as barium salts, guanidine hydrochloride, thiocyanates, such as guanidinium thiocyanate, perchlorates, which dissolve ordered hydrogen bonds in water, breaking the hydrogen bonds and disrupting the chaotropic substances the water structure and provide an increase in entropy.
  • amino acids they thus reduce hydrophobic effects and have a denaturing effect on proteins, since the driving force of protein folding is the assembly of the hydrophobic amino acids in the water.
  • a “dispersion” is a heterogeneous mixture of at least two substances that do not or hardly dissolve into each other or that chemically combine with each other, so that an aqueous protein dispersion is a mixture of aqueous medium (the dispersion medium) and solid protein (the disperse phase). and thus may also be referred to as "aqueous protein suspension”.
  • a “carrier polymer” is understood to mean biopolymers or their mixtures, or mixtures of at least one synthetic polymer and one biopolymer, the carrier polymer having the ability to enter into noncovalent interactions with the active substance (s) to be formulated or particulate To enclose (carry) active ingredients (dispersed or crystalline) or adsorb.
  • an "active ingredient” or “effect substance” is understood as meaning synthetic or natural, low molecular weight substances having hydrophilic, lipophilic or amphiphilic properties which can be used in the agrochemical, pharmaceutical, cosmetic or food and feed industries; as well as biologically active macromolecules which can be embedded in or adsorbed to a fibrous sheet of the invention, such as e.g. Peptides (such as oligopeptides having 2 to 10 amino acid residues and polypeptides having more than 10, such as 1 to 100 amino acid residues) and enzymes and single or double-stranded nucleic acid molecules (such as oligonucleotides having 2 to 50 nucleic acid tests and polynucleotides having more than 50 nucleic acid residues) ,
  • fiber webs encompasses both individual polymer fibers and also the ordered or disordered one or more layered assemblage of a multiplicity of such fibers, for example fiber nonwovens or nonwoven webs.
  • molecular weight data for polymers are Mn or Mw values 2.
  • a stable aqueous protein dispersion comprising, in an aqueous phase, at least one self-assembled natural, synthetic or recombinantly produced protein in dispersed form, and at least one dispersant for the self-assembling protein, wherein the dispersant is a polymeric dispersant selected from amphiphilic proteins, or an oligomeric dispersant , selected from amphiphilic peptide fragments and / or amphiphilic organic oligomers.
  • the self-assembling protein is a microbead-forming or intrinsically unfolded protein, in particular a silk protein, such as a spider silk protein, or an insect protein (such as Resilin) or a self-assembling analog derived from at least one of these proteins having a sequence identity of at least about 60% (based on the starting protein (s)).
  • R16 protein comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 4; b) S16 protein comprising an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 6; c) spinnable analog proteins derived from these proteins having a sequence identity of at least about 60%, e.g. at least about 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 or 99%, to SEQ ID NO: 4 or 6, (eg also by insertion or attachment of oligo-amino acid blocks, such as oligo-arginine blocks (1 4.
  • a stable aqueous dispersion according to any one of the preceding embodiments, wherein the amphiphilic peptide fragment comprises a fragment of a precursor protein.
  • the amphiphilic organic oligomer is a block co-oligomer comprising ether blocks, comprising at least one hydrophobic ether oligomer block (in particular having at least one hydrophobic side groups), and at least one hydrophilic ether oligomer block (in particular having at least one hydrophilic side groups).
  • each of the blocks is homogeneous, i. composed of essentially identical monomer building blocks.
  • Stable aqueous dispersion containing at least one self-assembling protein in a proportion in the range of 1 to 40 wt .-%, in particular 2 to 30, 3 to 25 or 5 to 20 wt .-%, based on the total weight of stable dispersion, optionally together with 0.01 to 50 wt .-%, in particular 0.05 to 30, 0.08 to 20 or 0, 1 to 10 wt .-%, of at least one further formulation or processing aid.
  • a process for electrospinning self-assembling protein comprising electrospinning a stable aqueous dispersion according to any of embodiments 1 to 10 or prepared according to any of embodiments 11 to 18.
  • 20. A process for producing a fiber fabric or fibers comprising at least one self-assembling protein, wherein an aqueous dispersion according to one of embodiments 1 to 10, or prepared according to one of embodiments 1 1 to 18, electrospun into a fiber fabric.
  • viscosity-adjusting agents such as dispersible or dispersible organic / synthetic or bio-polymers in the dispersion
  • a stable, aqueous dispersion according to one of embodiments 1 to 10 for the coating, in particular spray or dip coating or coatings in film form, of surfaces, in particular nonwovens, fibers and foams.
  • Particularly useful self-assembling proteins are, in particular, silk proteins. According to the invention, this refers below to those proteins which contain highly repetitive amino acid sequences and are stored in the animal in a liquid form and whose secretion by shearing or spinning results in fibers (Craig, CL (1997) Evolution of arthropod Silks. Annu. Rev. Entomol 42: 231-67).
  • spider silk proteins which in their original form could be isolated from spiders, such as from the "major ampullate” gland, such as ADF3 and ADF4 from the Araneus "Major Ampullate” gland diadematus (Guerette et al., Science 272, 5258: 1 12-5 (1996)).
  • Equally suitable proteins are natural or synthetic proteins that are derived from natural silk proteins and that have been produced heterologously in prokaryotic or eukaryotic expression systems using genetic engineering techniques.
  • prokaryotic expression organisms are Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Corynebacterium glutamicum, etc.
  • Nonlimiting examples of eukaryotic expression organisms are yeasts such as Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris and others, filamentous fungi such as Aspergillus niger, Aspergillus oryzae and Aspergillus nidulans, Trichoderma reesei, Acremonium chrysogenum and others, mammalian cells, such as Heia cells, COS cells, CHO cells, among others, insect cells, such as Sf9 cells, MEL cells and others.
  • synthetic proteins which are based on repeating units of natural silk proteins.
  • synthetic repetitive silk protein sequences these may additionally contain one or more natural non-repetitive silk protein sequences (Winkler and Kaplan, J Biotechnol 74: 85-93 (2000)).
  • spider silk proteins are also useful which are based on repeating units of natural spider silk proteins.
  • synthetic repetitive In addition to spider silk protein sequences, these may additionally contain one or more natural non-repetitive spider silk protein sequences.
  • functional equivalents are in particular also understood as meaning mutants which, in at least one sequence position of the abovementioned amino acid sequences, have a different amino acid than the one specifically mentioned, but nevertheless possess the property of packaging effect substances.
  • “Functional equivalents” include, but are not limited thereto one or more of the additional amino acid additions, substitutions, deletions, and / or inversions of available mutants, wherein said changes may occur in any sequence position as long as they result in a mutant having the property profile of the invention. Functional equivalence is especially given when the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide are qualitatively consistent.
  • Precursors are natural or synthetic precursors of the polypeptides with or without the desired biological activity. Examples of suitable amino acid substitutions are shown in the following table:
  • Salts are understood as meaning both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules of the invention.
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts such as, for example, sodium, calcium, ammonium, egg salts and salts with organic bases, such as, for example, amines, such as triethanolamine, arginine, lysine, piperidine, etc.
  • Acid addition salts for example salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and Oxalic acid are also the subject of the invention.
  • “Functional derivatives” of polypeptides of the invention may also be produced at functional amino acid side groups or at their N- or C-terminal end by known techniques
  • Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtained by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxy groups prepared by reaction with acyl groups.
  • Homologs to the specific proteins / polypeptides disclosed herein include at least 60%, such as 70, 80, or 85%, such as 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98 or 99% identity to one of the specifically disclosed amino acid sequences.
  • identity between two sequences is meant, in particular, the identity of the residues over the respective entire sequence length, in particular the identity which is determined by comparison with the aid of the Vector NTI Suite 7.1 (Vector NTI Advance 10.3.0, Vitrogen Corp.) (or Software of the company Informax (USA) using the Clustal method (Higgins DG, Sharp PM, Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer, Appl. Appl. Biosci, 1989 Apr; 5 (2): 151-1) with the following setting Parameter is calculated: Multiple alignment parameter:
  • Stable aqueous dispersion are especially made using polymeric or oligomeric dispersants.
  • Polymeric dispersants are in particular selected from globulins, in particular albumins, in particular bovine serum albumin (BSA) and fat-free preparations thereof (ff BSA) and are commercially available as such.
  • Albumins have a molecular mass of about 66,000 Da and consist of 584 to 590 amino acids. Due to a high content of cysteine, the albumins have a relatively high sulfur content.
  • Albumins are water-soluble, their binding capacity for water is about 18 ml / g. The isoelectric point is at pH 4.6. Albumins are ampholytes, that is, they can reversibly bind both anions and cations.
  • Oligomeric dispersants are, in particular, amphiphilic peptide fragments of the natural and synthetic silk proteins described above, and in particular of R16 and S16 proteins; as well as amphiphilic peptide fragments of the mentioned Globu- line, in particular albumins, especially BAS or ff BSA.
  • Such fragments can be prepared by controlled staging of the starting proteins. For example, a suitable amount of the protein can be weighed into a test tube and admixed with 0.2 M NaOH solution. The test tube is tightly closed and the mixture is heated in a water bath to about 80 ° C internal temperature. The resulting mixture is stirred vigorously. After some time, the protein begins to dissolve in the NaOH solution. Once the protein is dissolved, the sample is removed from the water bath and cooled and analyzed analytically. The protein hydrolyzate preparable in this manner provides a mixture of peptide fragments having a molecular weight in the range of about 500 to 5,000, such as e.g. 1,000 to 3,000 or 600 to 4,000, as readily detectable by mass spectrometry (e.g., by Maldi-ToF).
  • mass spectrometry e.g., by Maldi-ToF
  • Oligomeric dispersants are, in particular, also block co-oligomers comprising ether units, which comprise the lowest-possible hydrofluorophores.
  • Oligomer block in particular having at least one hydrophobic side groups
  • at least one hydrophilic ether oligomer block in particular having at least one hydrophilic side groups
  • each of the blocks is homogeneous, ie composed of substantially identical monomer building blocks.
  • a specific group of block co-oligomer can be represented by the following general formula (A)
  • blocks 1 and 2 are different and one of blocks 1 and 2 has hydrophilic side groups and the other has hydrophobic side groups,
  • R 1 is H or straight-chain or branched C 1 -C 6 -alkyl, aryl or straight-chain or branched C 1 -C 6 -alkylaryl, where aryl may optionally be substituted, and in particular represents straight-chain or branched C 1 -C 4 -alkyl or straight-chain or branched C -C 4 -alkylphenyl ;
  • the side group radicals R 2 and R 3 are different and are selected from hydrophobic radicals, in particular straight-chain or branched C 1 -C 6 -alkyl, aryl or straight-chain or branched C 1 -C 6 -alkylaryl; or are selected from H and hydrophilic radicals, such as - (CH 2 ) P -COOH, - (CH 2 ) P -COO " X + , wherein X + is H + or a metal cation, such as an alkali metal cation, in particular Na + or K + , and p stands for an integer value such as 1, 2 or 3;
  • the side group radicals R 2 and R 3 are the same or within the blocks 1 and / or 2, the side group radicals R 2 and / or R 3 may each be different and thereby within a hydrophilic or hydrophobic block least two forming various hydrophilic or hydrophobic sub-blocks, each sub-block having at least 2 to 5 identical side-group residues; and
  • R 4 is H or CC 6 alkyl, in particular H is C 1 -C 6 -alkyl is, for example, methyl, ethyl, propyl, 1-methylethyl, butyl, 1-methylpropyl, 2-methylpropyl, 1, 1-dimethylethyl, pentyl, 1-methylbutyl, 2-methylbutyl, 3-methylbutyl, 2,2-dimethylpropyl, 1-ethylpropyl, hexyl, 1, 1-dimethylpropyl, 1, 2-dimethylpropyl, 1-methylpentyl, 2-methylpentyl, 3-methylpentyl, 4-methylpentyl, 1, 1-dimethylbutyl, 1, 2-dimethylbutyl, 1,3-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 2,3-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl, 1-ethylbutyl, 2-ethylbutyl, 1, 1, 2-trimethylpropyl
  • Aryl is particularly suitable for naphthyl or phenyl.
  • C 1 -C 6 -alkylaryl represents the aryl, especially phenyl-substituted, analogs of the above C 1 -C 6 -alkyl radicals, in particular unbranched C 1 -C 6 -alkyl radicals.
  • Aryl substituents are, in particular, C 1 -C 4 -alkyl radicals as defined above
  • Preferred examples of such oligomers are compounds of the following formulas (1) to (5)
  • a viscosity-increasing additive for better processing of stabilized aqueous protein dispersions according to the invention in electro-spinning, it may be expedient to add a viscosity-increasing additive to this dispersion.
  • suitable polymers include: polyvinyl alcohol, polyvinylformamide, polyvinylamine, polycarboxylic acid (polyacrylic acid, polymethacrylic acid), polyacrylamide, polyitaconic acid, poly (2-hydroxyethyl acrylate), poly (N-isopropylacrylamide), polymethacrylamide, polyalkylene oxides, eg.
  • polyethylene oxides Poly-N-vinylpyrrolidone; hydroxymethylcellulose; Hydroxyethylcellulose; hydroxypropyl cellulose; carboxymethyl cellulose; alginate; collages; Gelatin, poly (ethyleneimine), polystyrenesulfonic acid; Combinations of two or more of the aforementioned polymers; Copolymers containing one or more of the monomer units forming the aforementioned polymers, graft copolymers comprising one or more of the monomer units forming the aforementioned polymers.
  • the water-soluble polymer is selected from polyethylene oxide, polyvinyl alcohol, polyvinylformamide, polyvinylamine and poly-N-vinylpyrrolidone.
  • the molecular weight of the polymers used can vary over a wide range and is for example in the range of 500 to 2,000,000, or 1, 000 to 1, 000,000 or 10,000 to 500,000.
  • water-soluble polymers are commercially available or can be prepared according to processes known to those skilled in the art.
  • the protein solution or dispersion to be used in the method according to the invention contains, based on the total solids of the solution or dispersion, 0.01 to 40% by weight, such as 0.5 to 20% by weight. or 2 to 15% by weight, at least one water-soluble polymer as defined above.
  • the weight ratio of protein to the water-soluble polymer present in the solution or dispersion depends on the polymers used.
  • the protein and the water-soluble polymer employed may be in a weight ratio of from about 300: 1 to about 1: 5, e.g. from about 100: 1 to about 1: 2, or from about 20: 1 to about 1: 1.
  • Suitable synthetic polymers are, for. B. selected from the group consisting of homo- and copolymers of aromatic vinyl compounds, homopolymers and copolymers of alkyl acrylates, homo- and copolymers of alkyl methacrylates, homopolymers and copolymers of ⁇ -olefins, homopolymers and copolymers of aliphatic see serving , Homo- and copolymers of vinyl halides, homo- and copolymers of vinyl acetates, homo- and copolymers of acrylonitriles, homopolymers and copolymers of urethanes, homopolymers and copolymers of vinyl amides and copolymers composed of two or more of the monomer units forming the abovementioned polymers.
  • Suitable carrier polymers are, in particular, polymers based on the following monomers: Acrylamide, adipic acid, allyl methacrylate, alpha-methylstyrene, butadiene, butanediol, butanediol dimethacrylate, butanediol divinyl ether, butanediol dimethacrylate, butanediol monoacrylate, butanediol monomethyl ether, butyl acrylate, butyl methacrylate, cyclohexyl vinyl ether, diethylene glycol divinyl ether, diethylene glycol monovinyl ether, ethyl acrylate, ethyl diglycol acrylate, ethylene, ethylene glycol butyl vinyl ether, Ethylene glycol dimethacrylate, ethylene glycol divinyl ether, ethylhexyl acrylate, ethylhexyl methacrylate,
  • polymers encompasses both homopolymers and copolymers Suitable copolymers include both random and alternating systems, block copolymers or graft copolymers
  • copolymers encompasses polymers which are composed of two or more different monomers or in which the incorporation of at least one monomer in the polymer chain can be realized in various ways, as is the case, for example, in the stereo block copolymers.
  • the homo- and copolymers can be miscible and immiscible.
  • the following polymers are preferably mentioned:
  • Polyvinyl ethers such as polybenzyloxyethylene, polyvinyl acetals, polyvinyl esters such as polyvinyl acetate, polyoxytetramethylene, polyamides, polycarbonates, polyesters, polysiloxanes, polyurethanes, polyacrylamides such as poly (N-isopropylacrylamide), polymethacrylamide, polyhydroxybutyrates, polyvinyl alcohols, acetylated polyvinyl alcohols, polyvinyl nylformamide, polyvinylamines, polycarboxylic acids (polyacrylic acid, polymethacrylic acid), polyacrylamide, polyitaconic acid, poly (2-hydroxyethyl acrylate), poly (N-isopropylacrylamide), polysulfonic acid (poly (2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid) or PAMPS), polymethacrylamide, polyalkylene oxides, e.g.
  • polyethylene oxides For example, polyethylene oxides; Poly-N-vinylpyrrolidone; Maleic acids, poly (ethyleneimine), polystyrenesulfonic acid, polyacrylates, such as, for example, polyphenoxyethyl acrylate, polymethyl acrylate, polyethyl acrylate, polydodecyl acrylate, poly (ibornyl acrylate), poly (n-butyl acrylate), poly (t-butyl acrylate), polycyclohexyl acrylate, poly (2 ethylhexyl acrylate), polyhydroxypropyl acrylate, polymethacrylates, such as.
  • polyacrylates such as, for example, polyphenoxyethyl acrylate, polymethyl acrylate, polyethyl acrylate, polydodecyl acrylate, poly (ibornyl acrylate), poly (n-butyl acrylate), poly (t-butyl acrylate), polycyclohex
  • Polymethylmethacrylate poly (n-amylmethacrylate), poly (n-butylmethacrylate), polyethylmethacrylate, poly (hydroxypropylmethacrylate), polycyclohexylmethacrylate, poly (2-ethylhexylmethacrylate), polylaurylmethacrylate, poly (t-butylmethacrylate), polybenzylmethacrylate, poly (ibornylmethacrylat), polyglycidyl methacrylate and polystearyl methacrylate, polystyrene, and copolymers based on styrene, for example with maleic anhydride, styrene-butadiene copolymers, methyl methacrylate-styrene copolymers, N-vinylpyrrolidone copolymers, polycaprolactones, polycaprolactams, poly (N-vinylcaprolactam ).
  • poly-N-vinylpyrrolidone polymethyl methacrylate
  • acrylate-styrene copolymers polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, polyamide, polyester may be mentioned.
  • biodegradable polymers are still applicable.
  • biodegradable polymers is intended to include all polymers which meet the definition of biodegradability given in DIN V 54900, in particular compostable polyesters.
  • biodegradability means that the polymers, such as polyesters, decompose in a reasonable and detectable time. Degradation may be hydrolytic and / or oxidative, and for the most part effected by the action of microorganisms such as bacteria, yeasts, fungi and algae.
  • the biodegradability can be determined, for example, by mixing polyesters with compost and storing them for a certain period of time. For example, in accordance with ASTM D 5338, ASTM D 6400 and DI NV 54900, C0 2 -free air is allowed to flow through ripened compost during composting and subjected to a defined temperature program.
  • biodegradability is determined by the ratio of the net C0 2 release of the sample (after deduction of C02 release by the compost without sample) to the maximum C0 2 release of the sample (calculated from the carbon content of the sample) as biological Degradability defined.
  • Biodegradable polyesters generally show clear signs of degradation after only a few days of composting, such as fungal growth, cracking and puncture. education.
  • biodegradable polymers are biodegradable polyesters such as, for example, polylactide, polycaprolactone, polyalkylene adipate repthalates, polyhydroxyalkonates (polyhydroxybutyrate) and polylactide glycoside.
  • biodegradable polyalkylene adipate terephthalates preferably polybutylene nadipate terephthalates.
  • Suitable polyalkylene adipate terephthalates are, for. As described in DE 4 440 858 (and are commercially available, eg Ecoflex® from BASF).
  • Active Ingredients The stabilized protein dispersions prepared according to the invention can also be used to produce active substance-containing or effect-containing fibers or fabrics containing such fibers, such as films or nonwovens.
  • hydrophilic and hydrophobic substances can be formulated.
  • formulatable classes of substances are: proteins, peptides, nucleic acids, mono-, di-, oligo- and polysaccharides, proteoglycans, lipids, organic polymers, low molecular weight synthetic or natural organic or inorganic substances or chemical elements, such as e.g. Silver.
  • Such formulations are particularly applicable in cosmetics, human and veterinary medicine but also in the field of crop protection.
  • Colorants fatty acids, carotenoids, retinoids, vitamins and their precursors, antioxidants, lipoic acids, UV light protection filters, peroxide decomposers, such as those used in the field of cosmetics or medicine; as well as derivatives and precursors thereof.
  • Pharmaceutical agents for therapeutic or diagnostic purposes such as anti-irritants, anti-inflammatories, vasoactive agents, anti-infective agents, anesthetizing agents, growth-promoting agents; and derivatives and precursors thereof;
  • Wound healing-promoting agents and active ingredients which have a positive effect on wound healing
  • Antimicrobial, antibacterial or antiviral agents are provided.
  • Antibodies enzymes, peptides, nucleic acids, growth factors.
  • Crop protection agents such as e.g. those with herbicidal, insecticidal and / or fungicidal action.
  • Electrospinning The protein solution was spun with the aid of the nozzle-based electrospinning plant (Gimpel Ingenieur-Gesellschaft mbH www.gimpel.de). As high voltage source a generator of the company Eltex, type KNH34 / N2A from 0-30 kV, DC neg was used. The protein solution was extruded in an electric field at low pressure through a cannula connected to the pole of a voltage source. Due to the electrostatic charge of the protein solution due to the electric field, a material flow directed towards the counterelectrode formed, which solidified on the way to the counterelectrode and deposited in the form of thin fibers.
  • Cannula diameter 0.8 or 0.9 mm.
  • Electro-spinning systems are transferred.
  • Both matrices were used as saturated solutions (20 mg / ml) dissolved in TA. Composition of the TA solution
  • Preparation methods were both the “cover method” and the “mix method”.
  • the sample was mixed with matrix after dissolving in buffer 1:10 and a defined volume was applied to the target the “mix method” was 10, whereas the “cover method” was diluted 1: 1.
  • the high salt content of the samples was reduced by solid phase extraction.
  • Zip-Tip pipette tips from Applied Biosystems with a cis-occupancy were used.
  • the zip-tip was washed with 0.1% trifluoroacetic acid in pure acetonitrile and with 0.1% TFA in 1: 1 acetonitrile: water. It was then equilibrated twice with 0.1% TFA in water.
  • the sample was dissolved in 10 ⁇ l of 0.1% TFA solution and repeatedly pipetted in and out of the zip-tip tip to attach the peptides to bind the resin. Thereafter, the tip was washed three times with a solution of 0.1% TFA and 5% methanol in water.
  • the sample components were eluted from the zip-tip with 1, 8 ⁇ matrix solution (matrix dissolved in 0.1% TFA 50% acetonitrile) and pipetted directly onto the MALDI-ToF-MS target.
  • R16 and S16 protein microbeads were used for the preparation of spinnable R16 and S16 solutions. These can be prepared as described in WO 2008/155304.
  • amphiphilic oligomer named P (phenylglycidyl ether) -block-P (carboxymethylglycidyl ether) - (3,3) of formula 1:
  • the brownish oil was dissolved in DMF and stirred with 16.2 g (0.45 mol) of NaH (washed with pentane) overnight. The solution turns dark brown. Subsequently, 78.8 g (0.45 mol) of sodium chloroacetate (NaTa) were added and the batch was stirred overnight at 60.degree. The DMF was removed in vacuo and the residue in dist. Water dissolved. The product, a light brown precipitate, was precipitated with half-concentrated HCl, separated and then redissolved in NaOH.
  • the product remains stable for several months as Na salt in the solution.
  • the solution can also be dried at 37 degrees before use and stored as a solid.
  • Example 1 Stabilization of R16 spider silk protein solutions with BSA and spinning of the stabilized preparation
  • the solution is stirred overnight (at least 12 h) at room temperature (about 20-25 ° C).
  • the ff.-BSA / R16 solution thus obtained is dialyzed against 10 mM NaHCO 3 buffer (pH about 10.5).
  • Dialysis takes place in a dialysis tube (Sigma-Aldrich, order no .: D9777-100FT, cellulosic membrane) with the exclusion limit of approx. 12,400.
  • the volume of the NaHC0 3 buffer is at least 100 times greater than the sample.
  • the buffer is changed at least once to remove the GdmSCN as quantitatively as possible.
  • Electron micrographs are shown in Figures 3a to d.
  • R16 protein is weighed, transferred to a snap-cap jar, and solubilized with guanidine thiocyanate solution (6M).
  • R16 Peptide Fragments In a test tube, weigh 45 mg of R16 protein and add 2 ml of 0.2 M NaOH solution. The test tube is tightly closed and the mixture is heated in a water bath to about 80 ° C internal temperature (the temperature of the water bath should be at least 85 ° C). The mixture thus obtained is stirred vigorously (about 1000 rpm). After some time (about 10 minutes), the protein begins to dissolve in the NaOH solution. Once the protein is dissolved, the sample is taken out of the water bath and cooled. Thereafter, the sample must not be subjected to an increased temperature treatment, since the fragments can be further split thereby and it may come to a complete cleavage. Uncleaved R16 protein is visually very well recognized in the solution. During cleavage, it begins to dissolve, as the fragments are readily soluble in water. Once the protein is visually unrecognizable, cleavage is stopped to avoid complete hydrolysis.
  • the R16 protein hydrolyzate prepared in this manner represents a mixture of peptide fragments having a molecular weight in the range of about 1,000 to 3,000, as illustrated by attached Figure 1. There, the mass spectrum (Maldi- ToF) of a typical R16 protein hydrolyzate is shown.
  • the hydrolyzate is transferred by syringe to a dialysis bath (NaHCO 3 buffer) (10 mM, 1.5 L).
  • the pH of the dialysis bath is about 10-11 adjust (NaOH, solid).
  • the particular R16 peptide quantity used for different approaches is listed in Table 3 below.
  • R16 samples (prepared according to 2.1) with different R16 protein content (compare Table 3) are dialyzed against the NaHCO 3 dialysis buffer (pH about 10.5) containing the R 16 hydrolyzate.
  • the sample is transferred into a dialysis tube (Sigma-Aldrich, order No. D9777-100FT, cellulosic membrane, exclusion limit of about 12,400).
  • the volume (eg, 1.5 liters) of the NaHCO 3 buffer should be at least 100 times larger than the sample.
  • the temporal stability of the respective solution during dialysis is determined and is given in Table 3 below. Stability means that no gelation is observed in the solution studied during dialysis.
  • R16 protein is weighed, transferred to a snap-cap jar and dissolved with guanidine thiocyanate solution (6 M).
  • BSA protein 45 mg are weighed into a test tube and 2 ml of 0.2 M NaOH solution are added.
  • the test tube is tightly closed.
  • the mixture in the test tube is dissolved at room temperature and then heated to about 80 ° C internal temperature.
  • the temperature of the water bath should be at least 85 ° C.
  • the mixture must be stirred vigorously (about 1000 rpm).
  • the protein begins to cleave in NaOH solution and a yellowish solution is formed.
  • the sample is taken out of the water bath and cooled. Thereafter, the sample must not be subjected to an increased temperature treatment, as the fragments can be further split thereby and it may come to a complete cleavage.
  • the BSA protein hydrolyzate prepared in this way represents a mixture of peptide fragments having a molecular weight in the range of about 600 to 4,000, such as illustrated by enclosed Figure 2. There, the mass spectrum of a typically resulting BSA protein hydrolyzate is shown.
  • the sample is transferred by syringe to the dialysis bath (NaHCO 3 buffer) (10 mM, 1.5 L).
  • the pH of the dialysis bath should be adjusted to approx. 10-1 1 (with NaOH).
  • the BSA peptide concentration is about 0.003-0.004%.
  • R16 samples prepared according to 2.1
  • R16 protein content containing the BSA hydrolyzate in different amounts (see Table 5)
  • dialyzed takes place in a dialysis tube (Sigma-Aldrich, see above) with an exclusion limit of about 12,400.
  • the volume of the NaHC0 3 - buffer should be at least 100 times greater (eg 2 ml protein solution in 1, 5 L dialysis bath) as the sample.
  • the temporal stability of each solution during dialysis is determined and is shown in Table 5. Stability means that no gelation is observed in the solution studied during dialysis.
  • P phenylglycidyl ether
  • block-P carboxymethyl glycidyl ether
  • 3,3 prepared according to Reference Example 2 (1).
  • the previously dissolved in NaOH solution oligomer, which remains stable for several months as Na salt in solution can be used as a solution or as a solid (dried at 37 ° C).
  • the substance is used in particular as a solid.
  • the R16 protein is dissolved in a 6M guanidine thiocyanate solution.
  • the oligomer solid is weighed in and dissolved directly in the R16 solution. The solution is stirred slowly overnight. During this time, the addition of the oligomer to the protein takes place.
  • Corresponding quantities for various approaches are summarized in Table 7 below.
  • dialysis is performed to remove guanidine thiocyanate.
  • the volume of the solution to be dialyzed is 3 ml (contains a magnetic stir bar and is stirred during dialysis).
  • the temporal stability of the respective solution during dialysis is determined and is given in Table 7 below. Stability means that no gelation is observed in the solution studied during dialysis.
  • the wound healing promoting effect of the fibers produced according to the invention (prepared according to Example 2, R16 stabilized with R16 peptides) is determined by the cellular proliferation test described above:
  • test results are summarized in FIG. 7.
  • an increase in the number of cells can be achieved (optimal concentration 0.06 mg / ml).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft stabile wässrige Proteindispersionen, umfassend in einer wässrigen Phase wenigstens ein selbstassemblierendes Protein in dispergierter Form sowie wenigstens ein spezielles Dispergiermittel für das selbstassemblierende Protein; Verfahren zur Herstellung solcher stabilen wässrigen Dispersionen; Verfahren zur Elektroverspinnung von selbstassemblierenden Proteinen unter Verwendung solcher stabiler wässriger Dispersionen; Verfahren zur Herstellung von Faserflächengebilden oder Fasern aus solchen wässrigen Dispersionen; die Verwendung solcher wässriger Dispersionen zur Beschichtung von Oberflächen; die Verwendung der durch Elektroverspinnung hergestellten Materialien zur Herstellung von Medizinprodukten, Hygieneartikeln und Textilien; sowie Faser- oder Faserflächengebilde, hergestellt nach einem erfindungsgemäßen Elektroverspinnungsverfahren.

Description

Verfahren zur Herstellung hochkonzentrierter Lösungen von selbstassemblie- renden Proteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft stabile wässrige Proteindispersionen, umfassend in einer wässrigen Phase wenigstens ein selbstassemblierendes Protein in dispergierter Form sowie wenigstens ein spezielles Dispergiermittel für das selbstassemblierende Protein; Verfahren zur Herstellung solcher stabilen wässrigen Dispersionen; Verfahren zur Elektroverspinnung von selbstassemblierenden Proteinen unter Verwendung solcher stabiler wässriger Dispersionen; Verfahren zur Herstellung von Faserflächenge- bilden oder Fasern aus solchen wässrigen Dispersionen; die Verwendung solcher wässriger Dispersionen zur Beschichtung von Oberflächen; die Verwendung der durch Elektroverspinnung hergestellten Materialien zur Herstellung von Medizinprodukten, Hygieneartikeln und Textilien; sowie Faser- oder Faserflächengebilde, hergestellt nach einem erfindungsgemäßen Elektroverspinnungsverfahren.
Stand der Technik
Das Elektrospinnverfahren (auch bezeichnet als„Electrospinning" oder„Elektroverspinnung") ist ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung von Nano- und Mesofasern. Bei diesem Verfahren, welches beispielsweise von D.H. Reneker, H.D. Chun in Nano- techn. 7 (1996), Seite 216 f. beschrieben ist, wird üblicherweise eine Polymerschmelze oder eine Polymerlösung an einer als Elektrode dienenden Kante einem hohen elektrischen Feld ausgesetzt. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass die Polymerschmelze oder Polymerlösung in einem elektrischen Feld unter geringem Druck durch eine mit einem Pol einer Spannungsquelle verbundene Kanüle extrudiert wird. Aufgrund der dadurch erfolgenden elektrostatischen Aufladung der Polymerschmelze oder Polymerlösung entsteht ein auf die Gegenelektrode gerichteter Materialstrom, der sich auf dem Wege zur Gegenelektrode verfestigt. In Abhängigkeit von den Elektrodengeometrien werden mit diesem Verfahren Vliese bzw. sogenannte Nonwovens oder Ensembles geordneter Fasern erhalten.
Auch natürliche Ausgangsstoffe, wie Biopolymere oder davon abgeleitete synthetische Polymere sind durch Elektroverspinnung verarbeitbar. Beispielsweise ist die Verarbeitung von Spinnenseidenproteinen der Spinne Nephila clavipes aus einer Hexafluoro-2-propanol-Lösung zu Nanofasern mittels des Elektro- verspinnens von Zarkoob und Reneker beschrieben worden (Polymer 45: 3973-3977, 2004). Spinnversuche von Bombyx mori Seide aus einer Ameisensäurelösung werden von Sukigara und Ko (Polymer 44: 5721-572, 2003) beschrieben, wobei durch Variation der Elektrospinnparameter die Fasermorphologie beeinflusst wird. Jin und Kaplan berichteten von Wasser-basiertem Elektrospinning von Seide bzw. Sei- de/Polyethylenoxid (Biomacromolecules 3: 1233-1239, 2002).
Die WO-A-03/060099 beschreibt verschiedene Methoden (u.a. Elektroverspinnen) und Apparaturen zum Verspinnen von Bombyx mori Seidenproteinen und Spinnenseidenproteinen. Die verwendeten Spinnenseidenproteine wurden dabei rekombinant von transgenen Ziegen produziert und aus deren Milch aufgereinigt sowie anschließend versponnen.
Synthetische Biopolymere, aufgebaut aus repititiven Einheiten des Insektenproteins Resilin, bzw. des Spinnenseidenproteins mit der Bezeichnung R16 bzw, S16 sind in der WO2008/155304 der vorliegenden Anmelderin beschreiben. Die in Form von Mikrobeads vorliegenden Polymere können z. B. in gelförmige Produkte überführt oder zu Proteinfilmen verarbeitet werden.
Die Elektroverspinnung von Polymeren, wie z.B. synthetischen Biopolymeren oder an- deren verspinnbaren organischen Polymeren, oder aufeinander abgestimmter Polymermischungen davon, gegebenenfalls im Gemisch mit pharmazeutischen oder agrochemischen Wirkstoffen ist in der WO 2010/015709 und der WO 2010/015419 der vorliegenden Anmelderin beschrieben. Zur Verspinnung werden Lösungen der Polymere in organischen Lösungsmitteln oder konzentrierter Ameisensäure verwendet.
Die grundsätzliche Verspinnbarkeit wässriger Lösungen von R16 bzw. S16 findet in der WO 2010/015419 allgemeine Erwähnung. Es besteht aber grundsätzlich das Problem der mangelnden Stabilität solcher wässriger Lösungen, insbesondere bei höherer Proteinkonzentration, welche zu unerwünschter Gelbildung oder Präzipitation in der Lö- sung führt.
Die Löslichkeit solcher verspinnbarer hydrophober Proteine kann mit Hilfe von bekannten chaotropen Reagenzien zwar stark erhöht werden. Der maximale experimentell gefundene Wert der Löslichkeit in 10 M Guanidiniumthiocyanat (GdmSCN)-Lösung liegt bei etwa 38%. Wird GdmSCN aber mittels Dialyse wieder entfernt, führt dies zum Ausfallen des Proteins. Zusammenfassung der Erfindung
Aufgrund der schlechten Löslichkeit stark hydrophober Proteine, wie z.B. dem R16- Protein, in Wasser (max. ca. 1 %), liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, verspinn- bare Systeme zu entwickeln, welche die Stabilisierung des Proteins bei höherer Konzentration in der zu verspinnenden Flüssigphase ermöglichen.
Eine erste erfindungsgemäße Lösung des Problems der Vermeidung einer Ausfällung des Proteins aus der wässrigen Lösung (während der Dialyse) umfasst die Stabilisie- rung des hydrophoben Proteins mit einem hydrophilen Protein, das ebenfalls hydrophobe Anteile in der Struktur enthält. Experimentell wurde insbesondere gezeigt, dass Rinder Serum Albumin (BSA, Fraktion V) diesen Anforderungen entspricht. BSA ist ein lösliches Protein, das eine Transporterfunktion für Fettsäuren und Lipide im Blut übernimmt. BSA besteht aus 607 Aminosäuren und besitzt eine molekulare Masse von et- wa 69,4 kDa. Fettfreies BSA (ff. BSA) ist eine besondere Ausführungsform von BSA, bei dem zusätzliche hydrophobe Stellen durch Entfernen von Fettsäuren vorliegen.
Eine zweite erfindungsgemäße Lösung des obigen Problems umfasst die Stabilisierung des hydrophoben Proteins mit Hilfe von geeigneten Proteinfragmenten (Peptiden). Die erfindungsgemäßen Proteinfragmente weisen sowohl hydrophobe als auch hydrophile Sequenzbereiche auf. Insbesondere werden zwei Peptid-basierte Systeme bereitgestellt: a) Stabilisierung des nativen R16-Proteins mit Hilfe von Proteinfragmenten des R16-Proteins.
b) Stabilisierung des nativen R16-Proteins mit Hilfe von Proteinfragmenten von BSA.
Die jeweilige hydrolytische Spaltung des Proteins zur Herstellung der stabilisierenden Proteinfragmente erfolgt dazu in herkömmlicher Weise, z. B. mittels einer NaOH- Lösung bei 80°C.
Eine dritte erfindungsgemäße Lösung des obigen Problems umfasst die Stabilisierung des hydrophoben Proteins mit Hilfe von geeigneten synthetischen organischen Oligo- meren , welche an si ch bekan nte Verbi ndu ngen darstel len und z. B . i n der WO2010/057654 beschrieben sind, auf deren Offenbarung hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Auch diese Oligomere weisen sowohl hydrophobe als auch hydrophi- le Bereiche auf und stabilisieren die hydrophoben Proteine in wässriger Lösung auch bei erhöhten Konzentrationen.
Überraschend wurde erfindungsgemäß insbesondere festgestellt, dass man mit Hilfe aller oben beschriebener, verschiedener Lösungsansätze stabilisierte wässrige Protein-Dispersionen erhält, die das hydrophobe Protein in erhöhter Konzentration und über einer ausreichend langen Zeitraum stabil enthalten, welcher ausreicht um derartige Dispersionen durch Elektroverspinnung weiterzuverarbeiten. Damit erübrigt sich erstmals die Verwendung von organischen Lösungsmitteln oder organischen Säuren in hoher Konzentration bei der Elektroverspinnung von hydrophoben Polymeren, wodurch das Gesamtverfahren der Herstellung von Nanofasern und Faserflächengebilden deutlich vereinfacht und dessen Kosten weiter verringert werden können. Damit sind erfindungsgemäß durchgeführte Verfahren umweltfreundlicher (da aus wässriger Lösung versponnen wird) , materialschonender bei der Herstellung der Fasern und verbessern die Stabilität der Proteine. Zudem besitzendie Verfahren den vorteil der Verwendung kleiner Volumina und somit auch ein besseres handling. Durch die konzentrierten Proteinlösungen können die Fasern mit hohem Durchsatz, d.h. hoher Produktivität, aus wässriger Lösung versponnen werden
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt das Massenspektrum (Maldi-ToF) eines erfindungsgemäßen R16- Proteinhydrolysats.
Figur 2 zeigt das Massenspektrum (Maldi-ToF) eines erfindungsgemäßen BSA- Proteinhydrolysats.
Figur 3 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von Fasern erhalten durch Elektro- verspinnung von R16-Proteinlösungen, stabilisiert mit BSA und zur Viskositätserhöhung zusätzlich versetzt mit Polyethylenoxidpolymer (PEO); Figur 3a zeigt dabei das Ergebnis der Verspinnung einer Dispersion von R16-Protein, BSA und PEO mit einem Feststoffgehalt der Komponenten von 42,5 %, 42,5 % bzw. 15 %; Figur 3b zeigt dabei das Ergebnis einer Mischung dieser drei Komponenten, jedoch mit einem Feststoffge- halt von 37 %, 37 % bzw. 16 %; und die Figuren 3c und d zeigen dabei das Ergebnis einer Verspinnung einer Mischung dieser drei Komponenten mit Feststoffgehalten von 34,5 %, 34,5 % bzw. 31 %, versponnen mit einer Geschwindigkeit von 0,4 ml/h (Figur 3c) bzw. 0,5 ml/h (Figur 3d).
Figur 4 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von Fasern erhalten durch Elektro- verspinnung einer wässrigen Dispersion von R16-Protein, stabilisiert mit Hilfe von Pep- tidfragmenten des R16-Proteins; Figur 4a zeigt dabei die Verspinnung einer Mischung aus einem R16-Protein, R16-Fragment und PEO mit einem Feststoffgehalt dieser Komponenten von 61 %, 0,003 % bzw. 39 %; und Figur 4b zeigt dabei das Ergebnis einer Verspinnung dieser drei Komponenten mit einem Feststoffgehalt der Komponen- ten von 74 %, 0,004 % bzw. 26 %.
Figur 5 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von Fasern erhalten durch Elektro- verspinnung einer R16-Proteinlösung stabilisiert mit BSA-Peptidfragmenten. Figur 5a und b zeigen die gleichen Fasern bei unterschiedlicher Vergrößerung.
Figur 6 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Fasern erhalten durch Elektroverspinnung einer R16-Proteinlösung stabilisiert mit einem erfindungsgemäßen amphiphilen Oligomer der Formel 1. Figur 7 zeigt die in vitro-Aktivität gemäß erfindungsgemäßen R16-Proteins auf die Zellproliferation von Fibroblasten. Es wird die zeitabhängige Veränderung der relativen Zellzahl bei unterschiedlichen Konzentrationen von R16 Proteinfragmenten im Vergleich zur Kontrolle (Ktrl, ohne solche Fragmente) gezeigt. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
1. Definition allgemeiner Begriffe
„Amphiphil" umschreibt die chemische Eigenschaft einer Substanz, sowohl hydrophil als auch lipophil zu sein. Das hei//de.wikipedia.org/wikpolaren L "LERLINK "ht als auch in unpolaren Lkipedia.org/wiki/L%C3%B6sungses beruht darauf, dass die Substanz sowohl hydrophile als auch hydrophobe Bereiche aufweist.
Als „Chaotrop" werden chemische Substanzen, wie z. B. Bariumsalze, Guanidinhydrochlorid, Thiocyanate wie Guanidiniumthiocyanat, Perchlorate, bezeichnet, die geordnete Wasserstoffbrückenbindungen in Wasser auflösen. Indem die Wasserstoffbrückenbindungen aufgebrochen werden, stören die chaotropen Substanzen die Wasserstruktur und sorgen für eine Zunahme der Entropie. Bei Aminosäuren vermindern sie damit hydrophobe Effekte und wirken denaturierend auf Proteine, da die treibende Kraft der Proteinfaltung die Zusammenlagerung der hydrophoben Aminosäuren im Wasser ist.
Eine„Dispersion" ist ein heterogenes Gemisch aus mindestens zwei Stoffen, die sich nicht oder kaum ineinander lösen oder chemisch miteinander verbinden. Eine wässrige Protein-Dispersion ist demgemäß eine Mischung aus wässrigem Medium (dem Dispersionsmedium) und dem Feststoff Protein (der disperse Phase) und kann somit auch als „wässrige Protein-Suspension" bezeichnet werden.
Unter einem„Trägerpolymer" versteht man Biopolymere bzw. ihre Abmischungen, oder auch Abmischungen aus mindestens einem synthetischen Polymer und einem Biopolymer, wobei das Trägerpolymer die Fähigkeit besitzt, mit dem oder den zu formulierenden Wirkstoffen/Effektstoffen nicht-kovalente Wechselwirkungen einzugehen, bzw. partikuläre Wirkstoffe (dispergiert oder kristallin) zu umschließen oder zu adsorbieren (tragen).
Unter einem„Wirkstoff" oder„Effektstoff" versteht man synthetische oder natürliche, niedermolekulare Substanzen mit hydrophilen, lipophilen oder amphiphilen Eigenschaf- ten, welche in der Agrochemie, Pharmazie, Kosmetik oder Nahrungs- und Futtermittelindustrie Anwendung finden können; ebenso wie biologische aktive Makromoleküle welche in ein erfindungsgemäßes Faserflächengebilde eingebettet oder daran adsorbiert werden können, wie z.B. Peptide (wie Oligopeptide mit 2 bis 10 Aminosäureresten und Polypeptide mit mehr als 10, wie z.B. 1 1 bis 100 Aminosäureresten) sowie Enzy- me und einzel- oder doppelsträngige Nukleinsäuremoleküle (wie Oligonukleotide mit 2 bis 50 Nukleinsäuretesten und Polynukleotide mit mehr als 50 Nukleinsäureresten).
Der Begriff „Faserflächengebilde" umfasst erfindungsgemäß sowohl einzelne Polymerfasern als auch die geordnete oder ungeordnete ein- oder mehrlagige Zusammenlage- rung einer Vielzahl solcher Fasern, beispielsweise zu Faservliesen bzw. Nonwoven- Vliesen.
Werden keine anderen Angaben gemacht, so betreffen Molekulargewichtsangaben für Polymere Mn oder Mw- Werte 2. Spezielle Ausführungsformen
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere folgende Ausführungsformen:
Stabile wässrige Protein-Dispersion, umfassend in einer wässrigen Phase wenigstens ein selbstassemblierendes natürliches, synthetisches oder rekombinant hergestelltes Protein in dispergierter Form, und wenigstens ein Dispergiermittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Dispergiermittel ein polymeres Dispergiermittel, ausgewählt unter amphiphilen Proteinen, oder ein oligomeres Dispergiermittel, ausgewählt unter amphiphilen Peptidfragmenten und / oder amphiphilen organischen Oligomeren, ist.
Stabile wässrige Dispersion nach Ausführungsform 1 , wobei das selbstassemblierende Protein ein Microbead-bildendes oder intrinsisch entfaltetes Protein, insbesondere ein Seidenprotein, wie ein Spinnenseidenprotein, oder ein Insektenprotein (wie Resilin) oder ein, von wenigstens einem dieser Proteine abgeleitetes, selbstassemblierendes Analoges mit einer Sequenzidentität von wenigstens etwa 60% (bezogen auf das (die) Ausgangsprotein(e)) ist.
Stabile wässrige Dispersion nach Ausführungsform 1 oder 2, wobei das selbstassemblierende Protein ausgewählt ist unter
a) R16-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 ; b) S16-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6; c) von diesen Proteinen abgeleiteten verspinnbaren analogen Proteinen mit einer Sequenzidentität von wenigstens etwa 60%, wie z.B. wenigstens etwa 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 oder 99%, zu SEQ I D NO: 4 oder 6, (z.B. auch durch Insertion oder Anhängung von Oligo-Aminosäure-Blöcken, wie Oligo-Arginin- Blöcken (1-20 Arg) 4. Stabile wässrige Dispersion nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei das amphiphile Peptidfragment ein Fragment eines Vorläufer-Proteins um- fasst.
5. Stabile wässrige Dispersion nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei das polymere Dispergiermittel, ein Albumin, insbesondere Rinderserumalbumin (BSA) oder fettfreies Rinderserumalbumin (ff BSA) ist. 6. Stabile wässrige Dispersion nach Ausführungsform 4, wobei das Vorläufer-Protein ein Albumin, insbesondere Rinderserumalbumin (BSA) oder fettfreies Rinderserumalbumin (ff BSA) ist
Stabile wässrige Dispersion nach Ausführungsform 4, wobei das amphiphile Pep tidfragment ein Peptidfragment eines selbstassemblierenden Proteins nach An spruch 2 oder 3 ist.
Stabile wässrige Dispersion nach Ausführungsform 1 , wobei das amphiphile organische Oligomer ein Etherbausteine umfassendes Block-Co-Oligomer ist, umfassend wenigstens einen hydrophoben Ether-Oligomerblock (insbesondere mit wenigstens einer hydrophoben Seitengruppen), und wenigstens einen hydrophilen Ether-Oligomerblock (insbesondere mit wenigstens einer hydrophilen Seitengruppen). Insbesondere ist jeder der Blöcke homogen, d.h. aus im Wesentlichen identischen Monomer-Bausteinen aufgebaut.
Stabile wässrige Dispersion nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, enthaltend wenigstens ein selbstassemblierendes Protein in einem Anteil im Bereich von 1 bis 40 Gew.-%, insbesondere 2 bis 30, 3 bis 25 oder 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Dispersion, gegebenenfalls zusammen mit 0,01 bis 50 Gew.-%, insbesondere 0,05 bis 30, 0,08 bis 20 oder 0, 1 bis 10 Gew.-%, wenigstens eines weiteren Formulierungs- oder Verarbeitungs-Hilfsmittels.
Stabile wässrige Dispersion nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, enthaltend selbstassemblierendes Protein und Dispergiermittel in einem relativen Gewichtsverhältnis im Bereich von 0, 1 : 1 bis 1 : 0,001 , oder 0,2 : 1 bis 1 : 0,05 oder 0,5 : 1 bis 1 : 0,2 oder 0,7 : 1 bis 1 : 0,5. 1 1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen wässrigen Dispersion wenigstens eines selbstassemblierenden Proteins nach einer der vorhergehenden Ausführungsformen, wobei man selbstassemblierendes Protein in einem wässrigen Medium, enthaltend einen Lösungsvermittler (Chaotrop) löst und die so erhaltene Lösung in Gegenwart von Dispergiermittel dialysiert oder ultrafiltriert, um den Lösungs- vermittler (Chaotrop) vom selbstassemblierendes Protein abzutrennen. Verfahren nach Ausführungsform 1 1 , wobei man eine Mischung aus selbstas- semblierendem Protein und polymerem Dispergiermittel in dem wässrigen Medium, enthaltend das Chaotrop löst und unter Ausbildung der stabilen Dispersion das Chaotrop vom selbstassemblierendes Protein abtrennt, insbesondere durch Dialyse gegen Chaotrop-freies Dialysemedium. Verfahren nach Ausführungsform 1 1 , wobei man selbstassemblierendes Protein in dem wässrigen Medium, enthaltend das Chaotrop löst und das Chaotrop unter Ausbildung der stabilen Dispersion vom selbstassemblierendes Protein abtrennt, indem man amphiphiles Peptidfragment oder synthetisches amphiphiles Oligomer vor oder während der Abtrennung des Chaotrops zusetzt. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1 1 bis 13, wobei die Abtrennung des Chaotrops durch Dialyse, Ultrafiltration und/oder Fällung erfolgt. Verfahren nach Ausführungsform 13, wobei man zur Abtrennung des Chaotrops gegen ein, wenigstens ein amphiphiles Peptidfragment oder wenigstens ein synthetisches amphiphiles Oligomer enthaltendes, Dialysemedium (Dialysepuffer) dialysiert. Verfahren nach einer der Ausführungsformen 1 1 bis 15, wobei man das Cha- otrop-haltige wässrige Medium gegen ein gepuffertes wässriges Medium austauscht.
Verfahren nach Ausführungsform 16, wobei das gepufferte Medium einen Wert im Bereich von etwa 4 bis 12 oder 10 bis 12 oder etwa 11 ,5 aufweist.
Verfahren nach einer der Ausführungsformen 14 bis 17, wobei man das Dialysevolumen das Volumen des zu dialysierenden wässrigen Mediums, welches Chaotrop und selbstassemblierendes Protein enthält, wenigstens 100-fach wie z. B. 200-fach, 300-fach, 500-fach oder 1000-fach, höher ist.
Verfahren zur Elektroverspinnung von selbstassemblierendem Protein, wobei man eine stabile wässrige Dispersion nach einer der Ausführungsformen 1 bis 10, oder hergestellt nach einer der Ausführungsformen 11 bis 18, elektroverspinnt. 20. Verfahren zur Herstellung eines Faserflächengebildes oder von Fasern umfassend wenigstens ein selbstassemblierendes Protein, wobei man eine wässrige Dispersion nach einer der Ausführungsformen 1 bis 10, oder hergestellt nach einer der Ausführungsformen 1 1 bis 18, zu einem Faserflächengebilde elektro- verspinnt.
Verfahren nach einer der Ausführungsformen 19 und 20, wobei die zu verspinnende Dispersion selbstassemblierendes Protein in einem Anteil von 1 bis 40 Gew.-%, insbesondere 2 bis 30, 3 bis 25 oder 5 bis 20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Dispersion enthält.
Verfahren nach einer der Ausführungsformen 19 bis 21 , wobei man die Dispersion vor dem Verspinnen mit wenigstens einem weiteren Zusatz vermischt, ausgewählt unter
a) Mitteln zur Einstellung der Viskosität, wie in der Dispersion lösliche oder dispergierbare organische/synthetische oder Bio-Polymere;
b) Träger-bildende Polymere
c) pharmakologischen, agrochemischen, haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen.
d) Medikamenten, wundheilungsfördernden Mitteln
e) antimikrobiellen, antibakteriellen oder antiviralen Präparaten
Verwendung einer stabilen, wässrigen Dispersion gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 10 für die Beschichtung, insbesondere Sprüh- oder Tauchbeschich- tung oder Beschichtungen in Folienform, von Oberflächen, insbesondere Vliesstoffen, Fasern und Schäumen.
Verwendung der Materialien, hergestellt gemäß einer der Ausführungsformen 19 bis 22, für Produkte aus dem medizinischen Bereich, insbesondere Wundauflagen, Nahtmaterialien, Medizinprodukte, Implantate, Tissue Engineering.
25. Verwendung der Materialien, hergestellt gemäß einer der Ausführungsformen 19 bis 22, zur Herstellung von Hygieneartikeln und Textilien. 26. Faser oder Faserflächengebilde, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 20 bis 22. 3. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung i) Selbstassemblierende Proteine
Besonders brauchbare selbstassemblierende Proteine sind insbesondere Seidenproteine. Darunter verstehen man erfindungsgemäß im Folgenden solche Proteine, die hoch repetitive Aminosäuresequenzen enthalten und im Tier in einer flüssigen Form gespeichert werden und bei deren Sekretion durch Scherung oder Verspinnen Fasern entstehen (Craig, C. L. (1997) Evolution of arthropod Silks. Annu. Rev. Entomol. 42: 231-67).
Besonders geeignete derartige Proteine sind Spinnenseidenproteine, die in ihrer ursprünglichen Form aus Spinnen, wie aus der„Major Ampullate"-Drüse von Spinnen isoliert werden konnten. , wie z. B. ADF3 und ADF4 aus der der„Major Ampullate"- Drüse von Araneus diadematus (Guerette et al., Science 272, 5258: 1 12-5 (1996)).
Ebenso geeignete Proteine sind natürliche oder synthetische Proteine, die sich von natürlichen Seidenproteinen ableiten und welche unter Verwendung gentechnologischer Arbeitsmethoden heterolog in prokaryontischen oder eukaryontischen Expressi- onssystemen hergestellt wurden. Nichtlimitierende Beispiele für prokaryontische Expressionsorganismen sind Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Co- rynebacterium glutamicum u.a.. Nichtlimitierende Beispiele für eukaryontische Expressionsorganismen sind Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris u.a., fila- mentöse Pilze, wie Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Tricho- derma reesei, Acremonium chrysogenum u.a., Säugetierzellen, wie Heia-Zellen, COS- Zellen, CHO-Zellen u.a., Insektenzellen, wie Sf9-Zellen, MEL-Zellen u.a..
Weiterhin geeignet sind synthetische Proteine, welche auf Wederholungseinheiten von natürlichen Seidenproteinen basieren. Neben den synthetischen repetitiven Seidenpro- tein-Sequenzen können diese zusätzlich eine oder mehrere natürliche nicht-repetitve Seidenprotein-Sequenzen enthalten (Winkler und Kaplan, J Biotechnol 74:85-93 (2000)).
Für die Formulierung von Wirkstoffen mittels Spinnverfahren sind insbesondere solche synthetische Spinnenseidenproteine auch brauchbar, welche auf Wiederholungseinheiten von natürlichen Spinnenseidenproteinen basieren. Neben den synthetischen repeti- tiven Spinnenseidenprotein-Sequenzen können diese zusätzlich eine oder mehrere natürliche nicht-repetitve Spinnenseidenprotein-Sequenzen enthalten.
Unter den synthetischen Spinnenseidenproteinen ist das sog. C16-Protein zu nennen (Huemmerich et al. Biochemistry, 43(42): 13604-13612 (2004)) gemmmeSEQ ID NO: 2 und funktionale Äquivalente, funktionale Derivate und Salze dieser Sequenz, (vgl auch WO2007/082936)
Weiterhin sind synthetische Proteine bevorzugt, welche auf Wiederholungseinheiten von natürlichen Seidenproteinen kombiniert mit Sequenzen von Insektenstrukturprotei- nen wie dem Resilin (Elvin et al., 2005, Nature 437: 999-1002) basieren. Von diesen Kombinationsproteinen aus Seidenproteinen und Resilinen sind insbesondere die R16- und S16-Proteine zu nennen. Diese Proteine haben die in SEQ ID NO: 4 bzw. SEQ ID NO: 6 dargestellten Polypeptidsequenzen. (vgl WO2008/155304)
Neben der in SEQ I D NO: 2, 4 und 6 dargestellten Polypeptidsequenzen sind auch besonders funktionale Äquivalente, funktionale Derivate und Salze dieser Sequenzen bevorzugt. Unter„funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere auch Mutanten, welche in wenigstens einer Sequenzposition der oben genannten Aminosäuresequenzen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem die Eigenschaft zur Verpackung von Effektstoffen besitzt.„Funktionale Äquivalente" u m fasse n som it d i e d u rch e i ne ode r m eh rere Aminosäure-Additionen, - Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch„Präkursoren" der beschriebenen Polypeptide sowie„funktionale Derivate" und„Salze" der Polypeptide.
„Präkursoren" sind dabei natürliche oder synthetische Vorstufen der Polypeptide mit oder ohne die gewünschte biologische Aktivität. Beispiele für geeignete Aminosäuresubstitutionen sind folgender Tabelle zu entnehmen:
Ursprünglicher Rest Beispiele der Substitution
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin; His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn ; Gin
lle Leu; Val
Leu lle; Val
Lys Arg ; Gin ; Glu
Met Leu ; lle
Phe Met ; Leu ; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp ; Phe
Val lle; Leu
Unter dem Ausdruck„Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Ei- sen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhält- lieh durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen. Erfindungsgemäß mit umfasste„funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den hierin konkret offenbarten Proteinen/Polypeptiden. Diese besitzen wenigstens 60%, wie z.B. 70, 80 oder 85%, wie z.B. 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 oder 99%, Identität zu einer der konkret offenbarten Aminosäuresequenzen.
Unter„Identität" zwischen zwei Sequenzen wird insbesondere die Identität der Reste über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, insbesondere die Identität, die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 (Vector NTI Advance 10.3.0, In- vitrogen Corp.) (bzw. Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr;5(2):151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird: Multiple alignment parameter:
Gap opening penalty 10
Gap extension penalty 0,05
Gap Separation penalty ränge 8
Gap Separation penalty off
% identity for alignment delay 40
Residue specific gaps off
Hydrophilic residue gap off
Transition weighing 0 Pairwise alignment parameter:
FAST algorithm off
K-tuple size 1
Gap penalty 3
Window size 5
Number of best diagonals 5
ii) Dispergiermittel
Stabile wässrige Dispersion werden insbesondere unter Verwendung polymerer oder oligomerer Dispergiermittel hergestellt. (1) Polymere Dispergiermittel sind insbesondere ausgewählt unter Globulinen, vor allem Albuminen, wie insbesondere Rinderserumalbumin (BSA) und fettfreien Präparaten davon (ff BSA) und als solche käuflich erhältlich. Albumine haben eine Molekülmasse von etwa 66.000 Da und bestehen aus 584 bis 590 Aminosäuren. Durch einen hohen Anteil an Cystein haben die Albumine einen relativ hohen Schwefelgehalt. Albumine sind wasserlöslich, ihre Bindungskapazität für Wasser beträgt ca. 18 ml/g. Der isoelektrische Punkt liegt bei pH 4,6. Albumine sind Ampholyte, d. h. sie können sowohl Anionen als auch Kationen reversibel binden.
(2) Oligomere Dispergiermittel sind insbesondere amphiphile Peptidfragmente der oben beschriebenen natürlichen und synthetischen Seidenproteine und insbesondere von R16 und S16 Proteinen; sowie amphiphile Peptidfragmente der genannten Globu- line, insbesondere Albumine, vor allem BAS oder ff BSA.
Derartige Fragmente sind durch kontrollierte Staltung der Ausgangsproteine herstellbar. Beispielsweise kann dazu in einem Reagenzglas eine geeignete Menge des Protein eingewogen und mit 0,2 M NaOH-Lösung versetzt werden. Das Reagenzglas wird fest verschlossen und die Mischung in einem Wasserbad auf ca. 80°C Innentemperatur erhitzt.. Die so erhaltene Mischung wird stark gerührt. Nach einiger Zeit beginnt das Protein sich in der NaOH-Lösung zu lösen. Sobald das Protein gelöst ist, wird die Probe aus dem Wasserbad herausgenommen und abgekühlt und analytisch untersucht. Das auf diese Weise herstellbare Proteinhydrolysat stellt eine Mischung von Peptid- fragmenten mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 500 bis 5.000, wie z.B. 1.000 bis 3.000 oder 600 bis 4.000, dar, wie massenspektrometrisch (z.B. mittels Mal- di-ToF) leicht nachweisbar ist.
(3) Oligomere Dispergiermittel sind insbesondere auch Etherbausteine umfassendes Block-Co-Oligomer i st, u mfassen d we n i gsten s ei ne n hyd ro ph o be n Eth e r-
Oligomerblock (insbesondere mit wenigstens einer hydrophoben Seitengruppen), und wenigstens einen hydrophilen Ether-Oligomerblock (insbesondere mit wenigstens einer hydrophilen Seitengruppen) wie gemäß WO2010/057654 herstellbar. Insbesondere ist jeder der Blöcke homogen, d.h. aus im Wesentlichen identischen Monomer-Bausteinen aufgebaut. Eine spezielle Gruppe von Block-Co-Oligomer kann durch folgende allgemeine Formel (A) dargestellt werden
Figure imgf000017_0001
Block 1
(A) worin:
n und m gleich oder verschieden sind und für ganzzahlige Werte von 1=3 bis 20, insbesondere 3 bis 10, wie 4, 5, 6, 7, 8 oder 9 steht,
die Blöcke 1 und 2 verschieden sind und einer der Blöcke 1 und 2 hydrophile Seitengruppen aufweist und der andere hydrophobe Seitengruppen aufweist ,
R1 für H oder geradkettiges oder verzweigtes CrC6-Alkyl, Aryl oder geradkettiges oder verzweigtes CrC6-Alkylaryl steht, wobei Aryl gegebenenfalls substituiert sein kann, und insbesondere für geradkettiges oder verzweigtes CrC4-Alkyl oder geradkettiges oder verzweigtes C C4-Alkylphenyl steht;
die Seitengruppenreste R2 und R3 verschieden sind und ausgewählt sind unter hydrophoben Resten, wie insbesondere geradkettiges oder verzweigtes CrC6-Alkyl, Aryl oder geradkettiges oder verzweigtes CrC6-Alkylaryl; oder ausgewählt sind unter H und hydrophilen Resten, wie -(CH2)P-COOH, -(CH2)P-COO" X+, worin X+ für H+ oder ein Metall kation, wie ein Alkalimetallkation, insbesondere Na+ oder K+, steht und p für einen ganzzahligen Wert wie 1 , 2 oder 3 steht;
wobei innerhalb der Blöcke 1 und 2 die Seitengruppenreste R2 bzw. R3 jeweils gleich sind oder innerhalb der Blöcke 1 und/oder 2 die Seitengruppenreste R2 und/oder R3 jeweils verschieden sein können und dabei innerhalb eines hydrophilen oder hydrophoben Blocks wenigsten zwei verschiedene hydrophile bzw. hydrophobe Teilblöcke bilden, wobei jeder Teilblock wenigstens 2 bis 5 identische Seitengruppenreste aufweist; und
R4 für H oder C C6 Alkyl, insbesondere H steht CrC6-Alkyl steht beispielsweise für wie Methyl, Ethyl, Propyl, 1-Methylethyl, Butyl, 1- Methyl-propyl, 2-Methylpropyl, 1 , 1-Dimethylethyl, Pentyl, 1-Methylbutyl, 2-Methylbutyl, 3-Methylbutyl, 2,2-Di-methylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 1 , 1-Dimethylpropyl, 1 ,2- Dimethylpropyl, 1-Methylpentyl, 2-Methylpentyl, 3-Methylpentyl, 4-Methylpentyl, 1 , 1- Dimethylbutyl, 1 ,2-Di methyl butyl , 1 , 3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3- Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 1-Ethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2-Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Trimethylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl und 1-Ethyl-2-methylpropyl.
Aryl steht inspesonder für Naphtyl oder Phenyl.
CrC6-Alkylaryl steht insbesondere für die Aryl- vor allem Phenyl-substituierten Analoga obiger CrC6-Alkylreste, insbesondere unverzweigter CrC6-Alkylreste.
Aryl-Substituenten sind insbesondere CrC4-Alkylreste gemäß obiger Definition
Als bevorzugte Beispiele solcher Oligomere sind zu nennen Verbindungen der folgenden Formeln (1) bis (5)
Figure imgf000018_0001
(1)
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000019_0003
(4)
Figure imgf000020_0001
iii) Viskositätssteigernde Mittel
Zur besseren Verarbeitung erfindungsgemäßer stabilisierter wässriger Proteindispersionen bei der Elektroverspinnung kann es zweckmäßig sein, dieser Dispersion einen Viskositätserhöhenden Zusatz beizumischen.
Grundsätzlich können der stabilisierten Proteinlösung bzw. Proteindispersion in einem wässrigen Medium alle dem Fachmann bekannten wasserlöslichen Polymere zugesetzt werden, die obigem Zweck dienlich sind. Dabei sind insbesondere als geeignete Polymer zu nennen: Polyvinylalkohol, Polyvinylformamid, Polyvinylamin, Polycarbon- säure (Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure), Polyacrylamid, Polyitaconsäure, Poly(2- hydroxyethylacrylat), Poly(N-isopropylacrylamid), Polymethacrylamid, Polyalkylenoxi- de, z. B. Polyethylenoxide; Poly-N-vinylpyrrolidon; Hydroxymethylcellulose; Hydroxye- thylcellulose; Hydroxypropylcellulose; Carboxymethylcellulose; Alginat; Collagen; Gelatine, Poly(ethylenimin), Polystyrolsulfonsäure; Kombinationen aus zwei oder mehreren der vorstehend genannten Polymere; Copolymere enthaltend eine oder mehr der die vorstehend genannten Polymere bildenden Monomereinheiten, Pfropfcopolymeren enthaltend eine oder mehr der die vorstehend genannten Polymere bildenden Monomereinheiten. In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das wasserlösliche Polymer ausgewählt aus Polyethylenoxid, Polyvinylalkohol, Polyvinylformamid, Polyvi- nylamin und Poly-N-vinylpyrrolidon. Die Molmasse der eingesetzten Polymere kann dabei über einen weitern Bereich variieren und liegt z.B. im Bereich von 500 bis 2,000,000, oder 1 ,000 bis 1 ,000,000 oder 10,000 bis 500,000.
Die vorstehend genannten wasserlöslichen Polymere sind kommerziell erhältlich bzw. können gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden.
In der weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die in dem erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Proteinlösung oder -dispersion, bezogen auf den Gesamtfeststoff der Lösung bzw. der Dispersion, 0,01 bis 40 Gew.-%, wie 0,5 bis 20 Gew.-% oder 2 bis 15 Gew.-%, wenigstens ein wasserlösliches Polymer gemäß obiger Definition.
Das Gewichtsverhältnis von Protein zum in der Lösung oder Dispersion vorliegenden wasserlöslichen Polymer ist abhängig von den eingesetzten Polymeren. Beispielsweise können das Protein und das eingesetzte wasserlösliche Polymer in einem Gew.- Verhältnis von etwa 300 : 1 bis etwa 1 : 5, wie z.B. etwa 100 : 1 bis etwa 1 : 2, oder von etwa 20 : 1 bis etwa 1 : 1 eingesetzt werden. iv) Trägerbildende Polymere
Geeignete synthetische Polymere sind z. B. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Homo- und Copolymerisaten von aromatischen Vinylverbindungen, Homo- und Copolymerisaten von Alkylacrylaten, Homo- und Copolymerisaten von Alkylmethacryla- ten, Homo- und Copolymerisaten von α-Olefinen, Homo- und Copolymere von aliphati- sehen Dienen, Homo- und Copolymerisaten von Vinylhalogeniden, Homo- und Copolymerisaten von Vinylacetaten, Homo- und Copolymerisaten von Acrylnitrilen, Homo- und Copolymerisaten von Urethanen, Homo- und Copolymerisaten von Vinylamiden und Copolymeren aufgebaut aus zwei oder mehr der die vorstehend genannten Polymere bildenden Monomereinheiten.
Als Trägerpolymere kommen insbesondere Polymere auf Basis der folgenden Monomere in Betracht: Acrylamid, Adipinsäure, Allylmethacrylat, alpha-Methylstyrol, Butadien, Butandiol, Bu- tandioldimethacrylat, Butandioldivinylether, Butandioldimethacrylat, Butandiolmonoac- rylat, Butandiolmonomethacrylat, Butandiolmonovinylether, Butylacrylat, Butylmethac- rylat, Cyclohexylvinylether, Diethylenglycoldivinylether, Diethylenglycolmonovinylether, Ethylacrylat, Ethyldiglycolacrylat, Ethylen, Ethylenglycolbutylvinylether, Ethylenglycol- dimethacrylat, Ethylenglycoldivinylether, Ethylhexylacrylat, Ethylhexylmethacrylat, Ethylmethacrylat, Ethylvinylether, Glycidylmethacrylat, Hexandioldivinylether, Hexandi- olmonovinylether, Isobuten, Isobutylacrylat, Isobutylmethacrylat, Isopren, Isopropylac- rylamid, Methylacrylat, Methylenbisacrylamid, Methylmethacrylat, Methylvinylether, n- Butylvinylether, NMethyl-N-vinylacetamid, N-Vinylcaprolactam, N-Vinylimidazol, N- Vinylpiperidon, NVinylpyrrolidon, Octadecylvinylether, Phenoxyethylacrylat, Polytetra- hydrofuran-2-divinylether, Propylen, Styrol, Terephthalsäure, tert-Butylacrylamid, tert- Butylacrylat, tert-Butylmethacrylat, Tetraethylenglycoldivinylether, Triethylenglycoldi- methylacrylat, Triethylenglycoldivinylether, Triethylenglycoldivinylmethylether, Tri- methylolpropantrimethacrylate, Trimethylolpropantrivinylether, Vinyl-(2- ethylhexyl)ether, Vinyl-4-tertbutyl-benzoat, Vinylacetat, Vinylchlorid, Vinyldodecylether, Vinylidenchlorid, Vinylisobutylether, Vinylisopropylether, Vinylpropylether und Vinyl-tert- butylether. Der Begriff„synthetische Polymere" umfasst sowohl Homo- als auch Copolymere. Als Copolymere kommen sowohl statistische als auch alternierende Systeme, Blockcopo- lymere oder Pfropfcopolymere in Frage. Der Begriff Copolymere umfasst Polymere, die aus zwei oder mehr verschiedenen Monomeren aufgebaut sind, oder bei denen sich der Einbau mindestens eines Monomers in die Polymerkette auf verschiedene Art und Weise realisieren lässt, wie es z.B. bei den Stereoblockcopolymeren der Fall ist.
Es können auch Abmischungen von Homo- und Copolymeren sein. Die Homo- und Copolymere können mischbar und nicht mischbar sein. Folgende Polymere sind vorzugsweise zu nennen:
Polyvinylether wie z.B. Polybenzyloxyethylen, Polyvinylacetale, Polyvinylester wie z.B. Polyvinylacetat, Polyoxytetramethylen, Polyamide, Polycarbonate, Polyester, Polysilo- xane, Polyurethane, Polyacrylamide, wie z.B. Poly(N-isopropylacrylamid), Polymethac- rylamide, Polyhydroxybutyrate, Polyvinylalkohole, acetylierte Polyvinylalkohole, Polyvi- nylformamid, Polyvinylamine, Polycarbonsäuren (Polyacrylsäure, Polymethacrylsäure), Polyacrylamid, Polyitaconsäure, Poly(2-hydroxyethylacrylat), Poly(N-isopropylacryl- amid) , Polysulfonsäure (Poly(2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonsäure) oder PAMPS), Polymethacrylamid, Polyalkylenoxiden, z. B. Polyethylenoxiden; Poly-N- vinylpyrrolidon; Maleinsäuren, Poly(ethylenimin), Polystyrolsulfonsäure, Polyacrylate, wie z.B. Polypheno xyethylacrylat, Polymethylacrylat, Polyethylacrylat, Polydodecylac- rylat, Poly(ibornylacrylat),Poly(n-butylacrylat), Poly(t-butylacrylat), Polycyclohexylacry- lat, Poly(2-ethylhexylacrylat), Polyhydroxypropylacrylat, Polymethacrylate, wie z. B. Polymethylmethacrylat, Poly(n-amylmethacrylat), Poly(n-butylmethacrylat), Polyethyl- methacrylat, Poly(hydroxypropylmethacrylat), Polycyclohexylmethacrylat, Poly(2- ethylhexylmethacrylat), Polylaurylmethacrylat, Poly(t-butylmethacrylat), Polybenzyl- methacrylat, Poly(ibornylmethacrylat), Polyglycidylmethacrylat und Polystearylmethac- rylat, Polystyrol, sowie Copolymere auf Basis von Styrol, z.B. mit Maleinsäureanhydrid, Styrol-Butadien-Copolymere, Methylmethacrylat-Styrol-Copolymere, N-Vinylpyrrolidon- Copolymere, Polycaprolactone, Polycaprolactame, Poly(N-vinylcaprolactam).
Insbesondere sind Poly-N-vinylpyrrolidon, Polymethylmethacrylat, Acrylat-Styrol- Copolymere, Polyvinylalkohol, Polyvinylacetat, Polyamid, Polyester zu nennen.
Anwendbar sind weiterhin synthetische, biologisch abbaubare Polymere. Die Angabe "biologisch abbaubare Polymere" soll alle Polymere umfassen, die die in DIN V 54900 gegebene Definition der Bioabbaubarkeit erfüllen, insbesondere kompostierbare Polyester.
Im Allgemeinen bedeutet die biologische Abbaubarkeit, dass die Polymere, wie z.B. Polyester, in einer angemessenen und nachweisbaren Zeitspanne zerfallen. Der Abbau kann hydrolytisch und/oder oxidativ erfolgen und zum überwiegenden Teil durch die Einwirkung von Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefen, Pilzen und Algen, bewirkt werden. Die biologische Abbaubarkeit lässt sich z.B. dadurch bestimmen, dass Polyester mit Kompost gemischt und für eine bestimmte Zeit gelagert werden. Gemäß ASTM D 5338, ASTM D 6400 und DI N V 54900 wird C02-freie Luft beispielsweise durch gereiften Kompost während des Kompostierens strömen gelassen und dieser einem definierten Temperaturprogramm unterworfen. Hierbei wird die biologische Abbaubarkeit über das Verhältnis der Netto-C02-Freisetzung der Probe (nach Abzug der C02- Freisetzung durch den Kompost ohne Probe) zur maximalen C02-Freisetzung der Pro- be (berechnet aus dem Kohlenstoffgehalt der Probe) als biologische Abbaubarkeit definiert. Biologisch abbaubare Polyester zeigen in der Regel schon nach wenigen Tagen der Kompostierung deutliche Abbauerscheinungen wie Pilzbewuchs, Riss- und Loch- bildung. Beispiele für biologisch abbaubare Polymere sind biologisch abbaubare Polyester wie zum Beispiel Polylactid, Polycaprolacton, Polyalkylenadipatterepthalate, Po- lyhydroxyalkonoate (Polyhydroxybutyrat) und Polylactidglycosid. Besonders bevorzugt sind biologisch abbaubare Polyalkylenadipatterephthalate, vorzugsweise Polybutyle- nadipatterephtalate. Geeignete Polyalkylenadipatterephthalate sind z. B. in der DE 4 440 858 beschrieben (und sind kommerziell erhältlich, z.B. Ecoflex® von BASF). v) Wirkstoffe Die erfindungsgemäß hergestellten stabilisierten Protein-Dispersionen können auch dazu verwendet werden, um Wirkstoff-haltige oder Effektstoff-haltige Fasern oder solche Fasern enthaltende Flächengebilde, wie Filme oder Vliese, herzustellen.
Die Herstellung derartiger Wirkstoff-haltiger oder Effektstoff-haltiger Formulierungen ist insbesondere in der WO2010/015419 der Anmelderin beschrieben, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Eine detaillierte Auflistung potentiell geeigneter Stoffklassen von Wirk- bzw. Effektstoffen und eine nicht-limitierende Auflistung repräsentativer Beispiele dafür ist ebenfalls in der WO2010/015419 beschrieben.
Grundsätzliche formulierbar sind sowohl hydrophile als auch hydrophobe Stoffe. Als Beispiele für formulierbare Stoffklassen sind zu nennen: Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, Mono-, Di-, Oligo- und Polysaccharide, Proteoglycane, Lipide, organische Polyme- re, niedermolekulare synthetische oder natürliche organische oder anorganische Stoffe oder chemische Elemente, wie z.B. Silber.
Derartige Formulierungen sind insbesondere in der Kosmetik, der Human- und Tiermedizin aber auch im Bereich des Pflanzenschutzes anwendbar.
Als konkrete, nichtlimitierende Beispiele für formulierbare Stoffklassen sind zu nennen:
Farbstoffe, Fettsäuren, Carotinoide, Retinoide, Vitamine und deren Vorläufer, Antioxidantien, Liponsäuren, UV-Lichtschutzfilter, Peroxidzersetzer, wie sie auf dem Gebiet der Kosmetik oder Medizin Anwendung finden; sowie Derivate und Vorläufer davon. Pharmazeutische Wirkstoffe zu therapeutischen oder diagnostischen Zwecken, wie z.B. Antiirritantien, Entzündungshemmer, vasoaktive Mittel, infektionshemmende Mittel, anästhetisierende Mittel, wachstumsfördernde Mittel; sowie Derivate und Vorläufer davon;
Wundheilungsfördernde Mittel;sowie Wirkstoffe, die die Wundheilung positiv beeinflussen;
Antimikrobielle, antibakterielle oder antivirale Wrkstoffe
Antikörper, Enzyme, Peptide, Nukleinsäuren, Wachstumsfaktoren.
Pflanzenschutzwirkstoffe, wie z.B. solche mit herbizider, insektizider und/oder fungizider Wrkung.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht-limitierenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
Experimenteller Teil:
Allgemeine Methoden: 1. Elektrospinning: Die Proteinlösung wurde mit Hilfe der düsenbasierten Elektrospinnanlage (Firma Gimpel Ingenieur-Gesellschaft mbH www.gimpel.de) versponnen. Als Hochspannungsquelle wurde ein Generator der Firma Eltex, Typ KNH34/N2A von 0-30 kV, DC neg. verwendet. Die Proteinlösung wurde dazu in einem elektrischen Feld unter geringem Druck durch eine mit dem Pol einer Spannungsquelle verbundene Kanüle extrudiert. Aufgrund der durch das elektrische Feld bedingten elektrostatischen Aufladung der Proteinlösung bildete sich ein auf die Gegenelektrode gerichteter Materialstrom aus, der sich auf dem Weg zur Gegenelektrode verfestigte und in Form von dünnen Fasern ablagerte.
Folgende Parameter wurden eingestellt:
Relative Luftfeuchtigkeit: 27 %,
Spinntemperatur: 23 °C, elektrische Spannung: 20 kV,
Elektrodenabstand: 15-20 cm,
Kanülendurchmesser: 0,8 oder 0,9 mm.
Pump-Geschwindigkeit: 0,2 bis 0,5 ml/h
Die beschriebenen Ausführungsbeispiele können zudem auf walzenbasierte
Elektrospinn-Anlagen übertragen werden.
2. Chromatographie-Massenspektrometrie
MALDI-ToF Messung der Peptide
Matrices: a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CCA)
Sinapinsäure (SA)
Beide Matrices wurden als gesättigte Lösungen (20mg/ml) verwendet, gelöst in TA. Zusammensetzung der TA-Lösung
Figure imgf000026_0001
Präparationsmethoden waren sowohl die„Cover-Methode" als auch die„Mix-Methode" Bei der„Mix-Methode" wurde die Probe nach dem Lösen in Puffer 1 : 10 mit Matrix gemischt und ein definiertes Volumen auf das Target gebracht. Der Verdünnungsfaktor bei der„Mix-Methode" betrug 10, wohingegen bei der„Cover-Methode" im Verhältnis 1 :1 verdünnt wurde.
Der hohe Salzgehalt der Proben wurde mit Hilfe einer Festphasenextraktion verringert. Dafür wurden sogenannte Zip-Tip-Pipettenspitzen von Applied Biosystems mit einer Cis-Belegung verwendet. Das Zip-Tip wurde mit 0.1 % Trifluoressigsäure in reinem Acetonitril und mit 0, 1 % TFA in 1 : 1 Acetonitril:Wasser gewaschen. Dann wurde zweimal mit 0, 1 % TFA in Wasser äquilibriert. Die Probe wurde in 10 μΙ 0, 1 % TFA-Lösung gelöst und wiederholt durch die Zip-Tip-Spitze ein- und auspipettiert, um die Peptide an das Harz zu binden. Danach wurde die Spitze dreimal mit einer Lösung von 0,1 % TFA und 5% Methanol in Wasser gewaschen. Die Probenbestandteile wurden von dem Zip- Tip mit 1 ,8 μΙ Matrix-Lösung (Matrix gelöst in 0,1 % TFA 50% Acetonitril) eluiert und direkt auf das MALDI-ToF-MS-Target pipettiert.
3. Zellulärer Proliferationstest
Der in-vitro Test wurde mit Fibroblasten (HDFn, Invitrogen, Nr. C0045C) durchgeführt. Die Durchführung erfolgt in folgenden Schritten:
Aussaat von 15.000 Zellen pro well in einer 6-well-Platte in Medium
(DMEM low glucose mit 10% FCS und 1 % Penicillin/Streptomycin)
nach 4 Stunden (in dieser Zeit sind alle Zellen angewachsen) Wechsel des Medi- ums zu dem Medium mit Zusatz variierender Konzentrationen an Proteinfragmenten (Herstellung siehe unten); 1 ml/well
nach 24h Inkubation im Brutschrank bei 37°C und 5% C02 Zugabe von Ala- marblue (Firma Invitrogen Best.-Nr. DAL1100; 100μΙ pro ml Medium; entspricht einer Verdünnung von 1 : 10) und weitere Inkubation von 2 Stunden im Brutschrank
- Überführung von je 2x100 μΙ Überstand pro Well (=Doppelbestimmung) in eine 96-well-Platte mit F-Bottom und Messung am Optima Fluoreszenz-Reader bei 544 nm
Wiederholung der Messung an den verschiedenen Messzeitpunkten und Auswertung mittels Excel-Programm
Herstellung der Proteinfragmente für den Proliferationstest:
In einem Reagenzglas werden 300 mg R16-Protein (bzw. andere Proteine) eingewogen und 9 ml 0,2 M NaOH-Lösung zugesetzt. Das Reagenzglas wird fest verschlossen. Die Mischung im Reagenzglas wird auf ca. 80°C Innentemperatur erhitzt. Die Temperatur des Wasserbades sollte dabei mindestens 85°C betragen. Die Mischung wird stark gerührt. Nach einiger Zeit löst sich das Protein und es entsteht eine transparente Lösung (Farbumschlag). Sobald das Protein gelöst ist, wird die Probe aus dem Wasserbad herausgenommen und abgekühlt. Danach darf die Probe keiner Temperaturbe- handlung mehr ausgesetzt werden, da die Fragmente dadurch weiter gespaltet werden könnten und es unter Umständen zu einer vollständigen Spaltung kommt. Nach dem Abkühlen wird die Probe gegen destilliertes Wasser (5 L) dialysiert. Für die Dialyse wird eine Dialysemembran aus regenerierter Cellulose mit einer Ausschlussgrenze von 1000 Da verwendet (Carl-Roth, Bestellnummer: 1967.1). Während der Dialyse wird das Wasser dreimal gewechselt.
Anschließend wird die Probe in eine Plastikpetrischale (vorher das Gewicht bestimmen) überführt und bei 37°C vollständig getrocknet. Nach der Gewichtsbestimmung kann die Probe für den Zelltest verwendet werden. Referenzbeispiel 1 : Herstellung von R16 und S16 Spinnenseidenprotein
Für die Herstellung von verspinnbaren R16- und S16-Lösungen wurden R16- bzw. S16-Protein-Microbeads genutzt. Diese können wie in WO 2008/155304 beschrieben hergestellt werden.
Referenzbeispiel 2: Herstellung von synthetischen amphiphilen oligomeren Dispergiermitteln
(1) Herstellung des Oligomers P(Phenylglycidylether)-block-P(Carboxymethyl- glycidylether)-(3,3)
Das amphiphile Oligomer mit Namen P(Phenylglycidylether)-block- P(Carboxymethylglycidylether)-(3,3) der Formel 1 :
Figure imgf000028_0001
besitzt in seiner Struktur drei unpolare Phenylethergruppen und drei polare Carbo- xylgruppen, welche durch pH-Wert Änderungen der Lösung geladen werden können. In allen Synthesen wurde mit gängigen Schlenktechniken und unter Ausschluss von Luft bzw. Sauerstoff gearbeitet. a) Synthese des Monomers Etylethoxyglycidylether (EEGE)
Figure imgf000029_0001
Glycidol Ethylvinylether Ethylethoxyglycidylether
Zunächst wurden 80 g (1.08 mol) Glycidol und 400 mL Ethylvinylether so im Eisbad mit 2 g para-Toluolsulfonsäure (p-TsOH) versetzt, dass die Temperatur nicht höher als Raumtemperatur stieg. Anschließend wurde der Ansatz 3 h gerührt. Nach abgelaufener Reaktionszeit wurde die Lösung drei Mal mit Natriumhydrogencarbonat gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Trockenmittel wurde abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand (ca. 250 mL EEGE) wurde im Vakuum destilliert (nicht höher als 70°C Ölbadtemperatur) und über Calciumhydrid gelagert. Anschließend wurde er überkondensiert. b) Synthese der ersten Oligomerzwischenstufe
KOtBu /THF
Figure imgf000030_0001
Diglyme
Phenylglycidylether 3-Phenylpropan-1-ol (Initiator)
Figure imgf000030_0002
Es wurden 20.13 mL (0, 148 mol) des Initiators 3-Phenylpropan-1-ol mit 14.8 mL (0,148 mol) 10M Kalium-tert-butanolat in 50 mL Diglyme gelöst. Die Lösung wurde im Vakuum bei 40°C eine halbe Stunde erhitzt, um tert-Butanol zu entfernen. Anschließend wurden 100 mL (0,739 mol) vorher aufgereinigtes PGE (überkondensiert und über CaH2 getrocknet) zur Starterlösung hinzu gegeben und bei 120°C über Nacht gerührt. Am nächsten Tag wurde 98 mL (0,739 mol) EEGE zur Lösung hinzu gegeben und 3 h bei 120°C unter rühren erhitzt. Das Diglyme wurde im Vakuum entfernt. Es verblieb eine gold-braune honigartige Flüssigkeit. c) Entschützen der Oligomerzwischenstufe
Oligomerzwischenstufe
entschützte Oligomerzwischenstufe
Die gold-braune honigartige Flüssigkeit wurde in THF gelöst und mit 93 mL konz. HCl (37%) versetzt und 1 h gerührt. Anschließend wurde die Lösung mit NaHC03 neutralisiert. Es fällt ein leicht bräunlicher Niederschlag aus, welcher abfiltriert wurde. Über Nacht fällt weitere Niederschlag aus. Dieser wurde so lange abzentrifugiert, bis sämtlicher Feststoff aus der Lösung entfernt war. Anschließend wurde das THF im Vakuum entfernt. Es verblieben 116,28 g (0,1 1 mol) bräunliches, klares Öl. d) Acetylierung der Oligomerzwischenstufe
Figure imgf000032_0001
Das bräunliche Öl wurde in DM F gelöst und mit 16,2 g (0,45 mol) NaH (mit Pentan gewaschen) über Nacht gerührt. Dabei färbt sich die Lösung dunkelbraun. Anschließend wurde 78,8 g (0,45 mol) Natriumchloracetat (NaTa) hinzugegeben und der An- satz über Nacht bei 60°C gerührt. Das DMF wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand in dest. Wasser gelöst. Das Produkt, ein hell brauner Niederschlag, wurde mit halbkonzentrierter HCl gefällt, abgetrennt und danach wieder in NaOH gelöst. Es wurden 127 g (0, 127 mol) P(Phenylglycidylether)-block-P(Carboxymethylglycidylether)- (3,3) der Formel 1 erhalten, was 52% Ausbeute der Theorie entspricht.
Durch Lösen in eine NaOH-Lösung, erhält man ein Na-Salz anstatt der Säurefunktion.
Das Produkt bleibt über mehrere Monate als Na-Salz in der Lösung stabil. Die Lösung kann auch vor der Verwendung bei 37 Grad getrocknet werden und als Feststoff gela- gert werden.
(2) Herstellung weiterer Oligomere
Unter Berücksichtigung der obigen Synthesevorschrift, jedoch durch Variation des Initi- ators, der molaren Anteile der Monomerkomponenten und / oder des Grads der Depro- tektion und Acetylierung lassen sich beispielsweise folgende weitere amphiphile Oli gomere der Formeln 2 bis 5 herstellen:
Figure imgf000033_0001
(4)
Figure imgf000034_0001
Beispiel 1 : Stabilisierung von R16-Spinnenseidenprotein-Lösungen mit BSA und Verspinnen des stabilisierten Präparats
1.1. Herstellung stabilisierter Lösungen Fettfreies BSA (ff. BSA) (Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe) und R16-Protein werden eingewogen, in ein Schnappdeckelglas überführt und mit Hilfe von Guanidinthio- cyanat-Lösung (6 M) gelöst. So kann eine Mischung aus 140 mg R16-Protein und 140 mg ff.BSA in 2 ml 6 M Guanidinthiocyanat gelöst werden. Die Einsatzmengen von R16 und ff.BSA für verschiedene Ansätze sind Tabelle 1 zu entnehmen.
Die Lösung wird über Nacht (mindestens 12 h) bei Raumtemperatur (ca. 20-25 °C) gerührt. Anschließend wird die so erhaltene ff.-BSA/R16 Lösung gegen 10 mM NaH- C03 - Puffer (pH etwa 10,5) dialysiert. Die Dialyse findet in einem Dialyseschlauch (Sigma-Aldrich, Bestellnr.: D9777-100FT, Zellulosemembran) mit der Ausschlussgren- ze ca. 12.400 statt. Das Volumen des NaHC03 - Puffers ist mindestens 100-fach größer als der Probe. Während der Dialyse wird der Puffer mindestens einmal gewechselt, um das GdmSCN möglichst quantitativ zu entfernen.
Die zeitliche Stabilität der jeweiligen Lösung während der Dialyse wird bestimmt und ist in folgender Tabelle 2 ebenfalls angegeben. Stabilität bedeutet, dass während der Dialyse keine Gelbildung in der untersuchten Lösung zu beobachten ist. 1.2. Verspinnen der stabilisierten Lösung
Zur Überprüfung der Verspinnbarkeit der stabilisierten Lösungen werden 0,5 ml der Probe mit PEO Polymer (Polyethylenoxid, Mw=900.000; Sigma-Aldrich, Bestell-Nr. 189456-250g) in unterschiedlicher Menge versponnen. Verschiedene Mengen PEO (gelöst in Wasser) gibt man hinzu, mischt und verspinnt unter den oben angegebenen Bedingungen in einer Elektrospinning-Laboranlage. Beispielsweise werden folgende Lösungen versponnen:
Tabelle 1
Figure imgf000035_0001
Je 7% R16 und ff.BSA (Ansatz Nr 2, Tabelle 2)
Verspinnen mit 0,4 ml/h
c) Verspinnen mit 0,5 ml/h
Elektronenmikroskopische Aufnahmen sind in den Figuren 3a bis d gezeigt.
1.3. Ergebnisse Tabelle 2
Figure imgf000035_0002
Masse /Volumen (m/v) Es wurde festgestellt, dass das beste Ergebnis mit einer 1 : 1-Mischung von ff. BSA/R16 erzielt werden kann. Beispiel 2: Stabilisierung des R16-Spinnenseidenproteins mit Hilfe von Peptid- fragmenten des R16-Proteins und Verspinnen des stabilisierten Präparats
2.1. Vorbereitung des R16-Proteins: R16-Protein wird eingewogen, in ein Schnappdeckelglas überführt und mit Hilfe von Guanidinthiocyanat-Lösung (6 M) gelöst.
2.2. Herstellung der R16-Peptidfragmente: In einem Reagenzglas werden 45 mg R16-Protein eingewogen und 2 ml 0,2 M NaOH- Lösung zugegeben. Das Reagenzglas wird fest verschlossen und die Mischung in einem Wasserbad auf ca. 80°C Innentemperatur erhitzt (die Temperatur des Wasserbades sollte mindestens 85°C betragen). Die so erhaltene Mischung wird stark (etwa 1000 Upm) gerührt. Nach einiger Zeit (ca. 10 min) beginnt das Protein sich in der Na- OH-Lösung zu lösen. Sobald das Protein gelöst ist, wird die Probe aus dem Wasserbad herausgenommen und abgekühlt. Danach darf die Probe nicht mehr einer erhöhten Temperaturbehandlung ausgesetzt werden, da die Fragmente dadurch weiter gespaltet werden können und es unter Umständen zu einer vollständigen Spaltung kommt. Nichtgespaltenes R16-Protein ist visuell sehr gut in der Lösung zu erkennen. Während der Spaltung beginnt es sich aufzulösen, da die Fragmente gut wasserlöslich sind. Sobald das Protein visuell nicht mehr erkennbar ist, wird die Spaltung beendet, um eine vollständige Hydrolyse zu vermeiden.
Das auf diese Weise hergestellte R16-Proteinhydrolysat stellt eine Mischung von Pep- tidfragmenten mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 1.000 bis 3.000 dar, wie durch beiliegende Figur 1 veranschaulicht. Dort wird das Massenspektrum (Maldi- ToF) eines typischerweise anfallenden R16-Proteinhydrolysats gezeigt.
2.3. Vorbereitung des Dialysebads
Nach dem Abkühlen wird das Hydrolysat mit einer Spritze in ein Dialysebad (NaHC03 - Puffer) (10 mM, 1 ,5 L) überführt. Der pH-Wert des Dialysebades ist auf ca. 10-11 einzustellen (NaOH , Feststoff). Die jeweils verwendete R16-Peptid-Menge für verschiedene Ansätze ist in folgender Tabelle 3 aufgelistet.
2.4. Durchführung der Dialyse
Anschließend werden R16-Proben (hergestellt gemäß 2.1) mit unterschiedlichem R16- Proteingehalt (vgl. Tabelle 3) gegen den NaHC03 - Dialysepuffer (pH-Wert ca. 10,5) enthaltend das R16-Hydrolysat dialysiert. Dazu wird die Probe in einen Dialyseschlauch (Sigma-Aldrich, Bestellnr. D9777-100FT, Zellulosemembran; Ausschlussgrenze von ca. 12.400) überführt. Das Volumen (z.B. 1 ,5 Liter) des NaHC03 - Puffers sollte mindestens 100-mal größer als die Probe sein.
Die zeitliche Stabilität der jeweiligen Lösung während der Dialyse wird bestimmt und ist in folgender Tabelle 3 angegeben. Stabilität bedeutet, dass während der Dialyse keine Gelbildung in der untersuchten Lösung zu beobachten ist.
Tabelle 3
Figure imgf000037_0001
Probenvolumen jeweils 2 ml
Endkonzentration in der Probe nach Dialyse
2.5. Verspinnen der stabilisierten Lösung
Zur Überprüfung der Verspinnbarkeit der R16-Fragment-stabilisierten Lösungen werden 0,5 ml der Probe mit PEO Polymer (Polyethylenoxid Mw = 900.000; Sigma- Aldrich, Bestell-Nr. 189456-250g) in unterschiedlicher Menge versponnen. Verschiedene Mengen PEO (gelöst in Wasser) gibt man hinzu, mischt und verspinnt unter den oben angegebenen Bedingungen in einer Elektrospinning-Laboranlage. Beispielsweise werden folgende Lösungen versponnen:
Tabelle 4
Figure imgf000038_0001
a) % R16 in Klammern
' Verspinnen mit 0,4 ml/h
c) Verspinnen mit 20 cm, 15 kV, 0,3ml/h
Beispiel 3: Stabilisierung des R16-Spinnenseidenproteins mit Hilfe von Peptid- fragmenten von BSA und Verspinnen des stabilisierten Präparats
3.1 Vorbereitung des R16-Proteins:
R16-Protein wird eingewogen, in ein Schnappdeckelglas überführt und mit Hilfe von Guanidinthiocyanat-Lösung (6 M) gelöst.
3.2 Herstellung der BSA-Peptidfragmente:
In einem Reagenzglas werden 45 mg BSA-Protein eingewogen und 2 ml 0,2 M NaOH- Lösung zugegeben. Das Reagenzglas wird fest verschlossen. Die Mischung im Reagenzglas wird bei Raumtemperatur gelöst und anschließend auf ca. 80°C Innentempe- ratur erhitzt. Die Temperatur des Wasserbades sollte mindestens 85°C betragen. Die Mischung muss stark (etwa 1000 Upm) gerührt werden. Nach einer Minute beginnt das Protein sich in NaOH-Lösung zu spalten und es entsteht eine gelbliche Lösung. Sobald das Protein gespalten ist, wird die Probe aus dem Wasserbad herausgenommen und abgekühlt. Danach darf die Probe nicht mehr einer erhöhten Temperaturbehandlung ausgesetzt werden, da die Fragmente dadurch weiter gespalten werden können und es unter Umständen zu einer vollständigen Spaltung kommt.
Das auf diese Weise hergestellte BSA-Proteinhydrolysat stellt eine Mischung von Pep- tidfragmenten mit einem Molekulargewicht im Bereich von etwa 600 bis 4.000 dar, wie durch beiliegende Figur 2 veranschaulicht. Dort wird das Massenspektrum eines typischerweise anfallenden BSA-Proteinhydrolysats gezeigt.
3.3. Vorbereitung des Dialysebads:
Nach dem Abkühlen wird die Probe mit einer Spritze ins Dialysebad (NaHC03 - Puffer) (10 mM, 1 ,5 L) überführt. Der pH-Wert des Dialysebades ist (mit NaOH) auf ca.10-1 1 einzustellen. Die BSA-Peptidkonzentration beträgt etwa 0,003-0,004 %.
3.4 Durchführung der Dialyse:
Anschließend werden R16-Proben (hergestellt gemäß 2.1) mit unterschiedlichem R16- Proteingehalt, enthaltend das BSA-Hydrolysat in unterschiedlicher Menge (vgl. Tabelle 5), dialysiert. Die Dialyse erfolgt in einem Dialyseschlauch (Sigma-Aldrich, siehe oben) mit einer Ausschlussgrenze von ca. 12.400. Das Volumen des NaHC03 - Puffers sollte mindestens 100-mal größer (z.B. 2 ml Protein-Lösung im 1 ,5 L Dialysebad) als die Probe sein.
Die zeitliche Stabilität der jeweiligen Lösung während der Dialyse wird bestimmt und ist in Tabelle 5 angegeben. Stabilität bedeutet, dass während der Dialyse keine Gelbildung in der untersuchten Lösung zu beobachten ist.
Tabelle 5
Figure imgf000039_0001
Probenvolumen jeweils 2 ml
'Endkonzentration in der Probe nach Dialyse 3.5. Verspinnen der stabilisierten Lösung
Zur Überprüfung der Verspinnbarkeit der BSA-Fragment-stabilisierten Lösungen werden 2 ml der Probe mit PEO Polymer (Polyethylenoxid Mw = 900.000; Sigma-Aldrich, Bestell-Nr. 189456-250g) in unterschiedlicher Menge versponnen. Verschiedene Men- gen PEO (PEO zugesetzt als Feststoff, s. Tabelle 6) gibt man hinzu, mischt und verspinnt unter den oben angegebenen Bedingungen in einer Elektrospinning- Laboranlage.
Beispielsweise wird folgende Lösung versponnen:
Tabelle 6
Figure imgf000040_0001
Verspinnen bei 20 kV, 15 cm, 0,2 ml/h
Beispiel 4: Stabilisierung des R16-Spinnenseidenproteins mit Hilfe von syntheti- sehen amphiphilen Oligomeren und Verspinnen des stabilisierten Präparats
Zur Stabilisierung verwendet man P(Phenylglycidylether)-block-P(Carboxymethyl- glycidylether)-(3,3), hergestellt nach Referenzbeispiel 2(1). Das zuvor in NaOH-Lösung gelöste Oligomer, welches über mehrere Monate als Na- Salz in Lösung stabil bleibt, kann als Lösung oder als Feststoff (getrocknet bei 37 °C) verwendet werden.
4.1 Vorbereitung des R16-Proteins:
Für die Stabilisierung von R16 wird die Substanz insbesondere als Feststoff eingesetzt. Dabei wird das R16-Protein in einer 6M Guanidinthiocyanat-Lösung gelöst. Der Oligo- mer-Feststoff wird eingewogen und direkt in der R16-Lösung gelöst. Die Lösung wird über Nacht langsam gerührt. In dieser Zeit erfolgt die Anlagerung des Oligomers an das Protein. Entsprechende Mengenangaben für verschiedene Ansätze sind in folgen- der Tabelle 7 zusammengefasst.
4.2 Durchführung der Dialyse:
Am nächsten Tag wird die Dialyse durchgeführt, um Guanidinthiocyanat zu entfernen. Das Volumen der zu dialysierenden Lösung beträgt 3 ml (enthält einen Magnetrührstab und wird während der Dialyse gerührt). Das Volumen der Dialyselösung (10mM NaH- C03 -Puffer, pH=12 mit NaOH eingestellt) beträgt 1 ,5 L. Die Dialyse dauert über Nacht (12 h).
Die zeitliche Stabilität der jeweiligen Lösung während der Dialyse wird bestimmt und ist in folgender Tabelle 7 angegeben. Stabilität bedeutet, dass während der Dialyse keine Gelbildung in der untersuchten Lösung zu beobachten ist.
Tabelle 7
Figure imgf000041_0001
Probenvolumen jeweils in Klammern
'Endkonzentration in der Probe nach Dialyse 4.3 Verspinnen der stabilisierten Lösung
Zur Überprüfung der Verspinnbarkeit der Oligomer-stabilisierten Lösungen werden 0,5 ml der Probe mit PEO Polymer (Polyethylenoxid Mw = 900.000; Sigma-Aldrich,
Bestell-Nr. 189456-250g) versponnen. PEO (Zusatz als Feststoff) gibt man hinzu, mischt und verspinnt unter den oben angegebenen Bedingungen in einer Elektrospin- ning-Laboranlage. Beispielsweise wird folgende Lösung versponnen: Tabelle 8
Figure imgf000042_0001
Verspinnen bei 20 kV, 15 cm, 0,2 ml/h
Beispiel 5: Bestimmung der wundheilungsfördernden Eigenschaften eines erfindungsgemäßen Faserflächengebildes
Die wundheilungsfördernde Wirkung der erfindungsgemäß hergestellter Fasern (hergestellt gemäß Beispiel 2 ; R16 stabilisiert mit R16 Peptiden) wird durch den oben beschriebenen zellulären Proliferationstest bestimmt:
Die Versuchsergebnisse sind in beiliegender Figur 7 zusammengestellt. Man erkennt über den Zeitverlauf von 8 Tagen eine Zunahme der Zellzahl. Durch Zusatz der R16- Proteinfragmente kann eine zusätzliche Steigerung der Zellzahl erreicht werden (opti- male Konzentration 0,06 mg/ml).
Auf die Offenbarung der hierin erwähnten Druckschriften, insbesondere die
WO2010/057654, wird ausdrücklich Bezug genommen.

Claims

Patentansprüche
Stabile wässrige Protein-Dispersion, umfassend in einer wässrigen Phase wenigstens ein selbstassemblierendes Protein in dispergierter Form, und wenigstens ein Dispergiermittel für das selbstassemblierende Protein, wobei das Dispergiermittel ein polymeres Dispergiermittel, ausgewählt unter amphiphilen Proteinen, oder ein oligomeres Dispergiermittel, ausgewählt unter amphiphilen Peptidfrag- menten und amphiphilen organischen Oligomeren, ist.
Stabile wässrige Dispersion nach Anspruch 1 , wobei das selbstassemblierende Protein ein Microbead-bildendes oder intrinsisch entfaltetes Protein, insbesondere ein Seidenprotein, wie ein Spinnenseidenprotein, oder ein Insektenprotein oder ein, von wenigstens einem dieser Proteine abgeleitetes, selbstassemblierendes Analoges mit einer Sequenzidentität von wenigstens etwa 60% ist.
Stabile wässrige Dispersion nach Anspruch 1 oder 2, wobei das selbstassemblierende Protein ausgewählt ist unter
a) R16-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 ; b) S16-Protein, umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 6; c) von diesen Proteinen abgeleiteten verspinnbaren analogen Proteinen mit einer Sequenzidentität von wenigstens etwa 60% zu SEQ ID NO: 4 oder 6.
Stabile wässrige Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das amphiphile Peptidfragment ein Fragment eines Vorläufer-Proteins umfasst.
Stabile wässrige Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche,, wobei das polymere Dispergiermittel, ein Albumin, insbesondere Rinderserumalbumin (BSA) oder fettfreies Rinderserumalbumin (ff BSA) ist.
Stabile wässrige Dispersion nach Anspruch 4, wobei das Vorläufer-Protein ein Albumin, insbesondere Rinderserumalbumin (BSA) oder fettfreies Rinderserumalbumin (ff BSA) ist.
Stabile wässrige Dispersion nach Anspruch 4, wobei das amphiphile Peptidfragment ein Peptidfragment eines selbstassemblierenden Proteins nach Anspruch 2 oder 3 ist. Stabile wässrige Dispersion nach Anspruch 1 , wobei das amphiphile organische Oligomer ein Etherbausteine umfassendes Block-Co-Oligomer ist, umfassend wenigstens einen hydrophoben Ether-Oligomerblock (mit hydrophoben Seitengruppen), und wenigstens einen hydrophilen Ether-Oligomerblock (mit hydrophilen Seitengruppen).
Stabile wässrige Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthaltend wenigstens ein selbstassemblierendes Protein in einem Anteil im Bereich von 1 bis 40 Gew.-%, bevorzugt 5-20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Dispersion, gegebenenfalls zusammen mit 0,01 bis 50 Gew.-%, bevorzugt 0, 1 bis 10 Gew.-%, wenigstens eines weiteren Formulierungs- oder Verarbeitungs-Hilfsmittels.
Stabile wässrige Dispersion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, enthal tend selbstassemblierendes Protein und Dispergiermittel in einem relativen Ge wichtsverhältnis im Bereich von 0,1 : 1 bis 1 : 0,001.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen wässrigen Dispersion wenigstens eines selbstassemblierenden Proteins nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man selbstassemblierendes Protein in einem wässrigen Medium, enthaltend einen Lösungsvermittler(Chaotrop) löst und die so erhaltene Lösung in Gegenwart von Dispergierm ittel dialysiert oder ultrafiltriert, um den Lösungsvermitt- ler(Chaotrop) vom selbstassemblierendes Protein abzutrennen.
Verfahren nach Anspruch 1 1 , wobei man eine Mischung aus selbstassemblieren- dem Protein und polymerem Dispergiermittel in dem wässrigen Medium, enthaltend das Chaotrop löst und unter Ausbildung der stabilen Dispersion das Cha- otrop vom selbstassemblierendes Protein abtrennt, insbesondere durch Dialyse gegen Chaotrop-freies Dialysemedium.
Verfahren nach Anspruch 1 1 , wobei man selbstassemblierendes Protein in dem wässrigen Medium, enthaltend das Chaotrop löst und das Chaotrop unter Ausbildung der stabilen Dispersion vom selbstassemblierendes Protein abtrennt, indem man amphiphiles Peptidfragment oder synthetisches amphiphiles Oligomer vor oder während der Abtrennung des Chaotrops zusetzt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, wobei die Abtrennung des Chaotrops durch Dialyse oder Ultrafiltration oder Fällung erfolgt.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei man zur Abtrennung des Chaotrops gegen ein, wenigstens ein amphiphiles Peptidfragment oder wenigstens ein synthetisches amphiphiles Oligomer enthaltendes, Dialysemedium (Dialysepuffer) dialy- siert.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 15, wobei man das Chaotrop-haltige wässrige Medium gegen ein gepuffertes wässriges Medium austauscht.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das gepufferte Medium einen pH-Wert im Bereich von etwa 10 bis 12 aufweist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 17, wobei man das Dialysevolumen das Volumen des zu dialysierenden wässrigen Mediums, welches Chaotrop und selbstassemblierendes Protein enthält, wenigstens 100-fach höher ist.
19. Verfahren zur Elektroverspinnung von selbstassemblierendem Protein, wobei man eine stabile wässrige Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 10, oder hergestellt nach einem der Ansprüche 1 1 bis 18, elektroverspinnt.
20. Verfahren zur Herstellung eines Faserflächengebildes oder von Fasern umfassend wenigstens ein selbstassemblierendes Protein, wobei man eine wässrige Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 10, oder hergestellt nach einem der
Ansprüche 1 1 bis 18, zu einem Faserflächengebilde elektroverspinnt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 und 20, wobei die zu verspinnende Dispersion selbstassemblierendes Protein in einem Anteil von 1 bis 40 Gew.-%, be- vorzugt 5-20 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der stabilen Dispersion enthält.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21 , wobei man die Dispersion vor dem Verspinnen mit wenigstens einem weiteren Zusatz vermischt, ausgewählt unter
a) Mitteln zur Einstellung der Viskosität, wie in der Dispersion lösliche oder dispergierbare organische/synthetische oder Bio-Polymere; b) Träger-bildende Polymere
c) pharmakologischen, agrochemischen, haut- oder haarkosmetischen Wirkstoffen.
23. Verwendung einer stabilen, wässrigen Dispersion nach einem der Ansprüche 1 bis 10 für die Beschichtung, insbesondere Sprüh- oder Tauchbeschichtung, von Oberflächen, insbesondere Vliesstoffen, Fasern und Schäumen.
24. Verwendung der Materialien, hergestellt nach einem der Ansprüche 19 bis 22, für Produkte aus dem medizinischen Bereich, insbesondere Wundauflagen, Nahtmaterialien, Medizinprodukte, Implantate, Tissue Engineering.
25. Verwendung der Materialien, hergestellt nach einem der Ansprüche 19 bis 22, zur Herstellung von Hygieneartikeln und Textilien.
26. Faser oder Faserflächengebilde, hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22.
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