WO2012088577A2 - Proteína recombinante de mycobacterium sp., teste imunodiagnóstico e vacina para tuberculose - Google Patents

Proteína recombinante de mycobacterium sp., teste imunodiagnóstico e vacina para tuberculose Download PDF

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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis

Definitions

  • the present invention relates to the description of a diagnostic test and a vaccine for tuberculosis comprising the use of a novel secreted protein (sMTL-13) with lectin characteristics isolated from Mycobacterium tuberculosis.
  • sMTL-13 novel secreted protein
  • EP 2226635 "IMMUNODETECTION ASSAY FOR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX", which describes a method for detecting M. tuberculosis secreted protein MPT64 by immunoassay using specific antibody capable of recognizing epitopes of such protein;
  • the present invention demonstrates the identification of a new secreted 13 kDa lectin not yet described in the prior art (secreted M. tuberculosis Lectin, sMTL-13; Rv1419), belonging to the beta-trefoil type-ricin family, present only M. tuberculosis complex species, being absent in non-tuberculous mycobacterial species (MNT) such as M. avium, M. kansasii and M. leprae.
  • MNT non-tuberculous mycobacterial species
  • the sMTL-13 lectin was able to agglutinate rabbit erythrocytes in a dose-dependent manner, suggesting that this protein has functional lectin domains.
  • sMTL-13 can be used as a biomarker in the treatment of tuberculosis in immunodiagnostic testing and as a vaccine.
  • FIG. 1 In silico analysis and molecular cloning of the Mycobacterium tuberculosis gene Rv1419.
  • A Rv1419p is composed of a 33 amino acid signal peptide (gray bar), with the cleavage site between Ala33 and Asp34 ( * ). The ricin-like lectin domain is found from Asp45 to Asp 154 (table). Putative sugar binding sites are present in the mature sequence as indicated by circles. The presence of a predicted QW pattern is underlined.
  • B Isolation of the Rv1419 gene. Lines: 1, standard molecular weight; 2, expected PCR product.
  • FIG. 1 Predicted Rv1419 protein is detected in the Mycobacterium tuberculosis H37Rv CFP fraction.
  • A Western Blot analysis in which the M. tuberculosis CFP fraction was resolved on SDS-PAGE, transferred to nitrocellulose membrane and probed with monoclonal supernatant produced against Rv1419p.
  • Mtb Mycobacterium tuberculosis; Atypical mycobacteria (clinical isolates of M. avium, M. fortuitum and M. kansasii).
  • B subcellular preparations of Mtb H37Rv. As a control the membrane was again analyzed with the 19-kD lipoprotein monoclonal antibody (IT-19, 1: 1000 dilution). The data shown are representative of two independent experiments. In situ marking of sMTL-13 in patients with active tuberculosis.
  • Figure 3 Adaptive immune response in patients with active tuberculosis.
  • PBMC Peripheral blood mononuclear cells
  • B Serum from tuberculosis patients was evaluated for sMTL-13 specific IgG by ELISA.
  • C based on anti-ESAT-6 and anti-sMTL-13 antibody levels (active disease versus endemic area controls), a ROC curve was used to compare the accuracy of the indicated variables (variable 1: ESAT-6; variable 2 : sMTL-13) during the active phase of tuberculosis. For each indicator, sensitivity is plotted against specificity and accuracy is measured by the area over the curve (AUC).
  • the recombinant protein Rv1419p from Mycobacterium sp. was produced and from it the lectin sMTL-13 was obtained.
  • the ability of sMTL-13 to agglutinate erythrocytes in a dose-dependent manner was then demonstrated, suggesting that this protein has functional lectin domains.
  • serum from patients with active tuberculosis showed high levels of IgG antibodies against sMTL-13, and this response decreases after successful anti-tuberculosis treatment.
  • the immunodiagnostic test may be selected from the group comprising ELISA, Western blot, dot blot, immunodiffusion and immunochromatography. In the following examples the ELISA test was used.
  • Example 1 Obtaining Mycobacterial Fractions.
  • Subcellular fractions of the standard M. tuberculosis H37Rv laboratory strain used in this invention as total cell lysate (WCL), culture protein filtrate (CFP), membrane (MEM), and cell wall (CW) fractions were obtained by culturing the strain. late log phase (day 14) in GAS (glycerol-alanine-salts) media as described elsewhere (Sonnenberg MG and Belisle, JT. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry Infect Immun 1997; 65: 4515-24; Lee BY Hefta SA and Brennan P.
  • a database of non-redundant lectins was generated to search lectinic domains in the Araidopsis thaliana genome using this organism as a model (Moreno FB, Facó F, Ceccatto VM, Sampaio AH, Costa ABS, Freitas JLT, Nogueira LL, Lima ME, Lima JL, Cavada BS Matching carbohydrate-binding domains in Arabidopsis thaliana genome: development of a lectin database Online J Bioinform 2003; 4: 96-105.). To assess the presence of such domains in an important human pathogen, Mycobacterium tuberculosis, this database was adapted and a unique hypothetical lectin encoded by the Rv1419 gene was identified.
  • Figure 1 shows the bioinformatic characterization of the Rv1419 gene (SEQ IDN # 3).
  • Its open reading module (ORF) contains 474 nucleotides and the amino acid sequence (aa) encodes a hypothetical 157 residue protein containing signal peptide and an estimated molecular mass of 16.8 kDa.
  • the primary amino acid sequence of the protein encoded by Rv1419 contains a 33 residue signal peptide, with a type I cleavage signal between Ala33 and Asp34.
  • Analysis of mature protein (without signal peptide) showed molecular mass of 13.6 kDa.
  • Precursor protein positions 31-32 contain the Ala-x-Ala sequence, a standard sequence commonly found preceding the cleavage site (Tuteja R.
  • Rv1419p contains a carbohydrate-binding B-chain ricin domain and belongs to the beta-trefoil-like ricin family of proteins, consisting of three homologous subdomains as well as the presence of a QW (Hazes B.
  • the (QxW) 3 domain a) flexible lectin scaffold (Protein Sci 1996; 5: 1490-501).
  • B-chain ricin domains have been shown to bind cell surface glycolipids and glycoproteins that contain beta-1,4-linked galactose and mannose molecular moieties [Hartley MR, Lord JM.
  • Rv1419p a recombinant protein (SEQ ID NO: 1) was produced.
  • the sequence encoding the complete Rv1419, including the signal peptide was amplified by PCR using M. tuberculosis H37v DNA as a template.
  • a 496 bp DNA fragment was obtained ( Figure 1 B), purified and then cloned into the pMOSBIue vector.
  • the sequencing procedure was employed to confirm cloning and amplification experiments generated an unchanged Rv1419 sequence.
  • the product was named pMOSBIue-Mtb and digested by restriction enzymes XhoI and Ndel to subclon the pET-15b expression vector. The fragment was then inserted in-frame with the start codon present at the Ndel cleavage site to allow total production of Rv1419p. Heterologous expression was then performed using E. coli strain BL21 (DE3).
  • Figure 1C shows a typical SDS-PAGE experiment of the recombinant Rv1419 (rRv1419) obtained, showing a single band of ⁇ 17 kDa molecular weight.
  • This recombinant protein (SEQ ID NO: 1) was produced as inclusion bodies and purified under denaturing conditions by affinity chromatography. Refolding of the denatured protein was performed using pH 7.4 renaturation PBS buffer, resulting in the complete soluble protein used thereafter.
  • Example 4 Rv1419p is expressed in the fraction of the M. tuberculosis culture protein filtrate, but not in the non-tuberculous mycobacteria (NTM).
  • FIG. 2A shows a single band of -13 kDa mm in M. tuberculosis H37Rv CFP, but not in CFP fractions obtained from the M. avium, M. kansasii and M. fortuitum MNT species.
  • M. tuberculosis H37Rv cell wall or membrane preparations showed discrete bands when incubated with the same monoclonal antibody ( Figure 2B).
  • tuberculosis CFP preparations revealed that sMTL-13 is at least as abundant as 19 kDa lipoprotein, a well-known component of CFP (Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C, Ivanyi, I., Appel, RD and Bairoch, A., ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis (Nucleic Acids Res. 2003. 31: 3784-3788). As previously shown by Rosenkrands et al., High levels of the M.
  • tuberculosis H37Rv 19 kDa lipoprotein band were observed in fractions incubated with the 19 kDa anti-lipoprotein monoclonal antibody (Figure 2B) (Rosenkrands I, King A, Weldingh K, Moniatte M, Moertz E and Andersen P. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis (Electrophoresis 2000; 21: 3740-56). Together, these data indicate that Rv1419p is a secreted lectin present at reasonable levels in M. tuberculosis CFP. We therefore name this protein 'Secreted M. tuberculosis Lectin' (sMTL) -13.
  • Open reading modules recorded as hypothetical proteins of unknown or putative function were filtered from the entire M. tuberculosis genome using a Peari script (Moreno FB, Phaco F, Ceccatto VM, Sampaio AH, Costa ABS, Freitas JLT, Nogueira LL, Lima ME, Lima JL, Cavada BS Matching carbohydrate-binding domains in Arabidopsis thaliana genome: development of a lectin database Online J Bioinform 2003; 4: 96-105.).
  • the deduced amino acid sequence of the entire Rv1419 ORF was subjected to primary structure analysis using Proteomis Server Expert Protein Analysis System (ExPASy), Gattiger E, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD and Bairoch A.
  • ExPASy The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis (Nucleic Acids Res 2003; 31: 3784-8).
  • the SignalP 3.0 server was used to identify potential Sec-type signal peptides and cleavage sites based on various Neural Network methods and Hidden Markov models (Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S and von Heijne G.
  • the sMTL-13 protein containing the signal peptide was expressed as a histidine-tagged protein (His) in an E. coli strain (DE3).
  • the Rv1419 gene was subcloned into the pET15b expression vector (Novagen, Madison, USA) encoding six histidine residues located in the N-terminal region, allowing expression of a fusion protein.
  • an Rv1419 PCR fragment representing the entire open reading module was generated with specific primers designed to produce Ndel and Xhol enzyme restriction sites in the resulting PCR product using M.
  • tuberculosis H37Rv DNA as a template: Ndel for sense (5'-GGAATTCCATATGGGTGAATTACGGTTGG-3 ') and Xhol for antisense (5'-CCGCTCGAGTCATTACGGCACGCTATCCC-3').
  • the parameters for the PCR reaction were as follows: initial denaturation for 4 min at 94 ° C, denaturation for 1 min at 94 ° C, annealing for 1 min at 56 ° C and extension for 1 min at 72 ° C (36 cycles). Then the sequence was confirmed by DNA sequencing.
  • E E.
  • coli BL21 (DE3) was grown at 37 ° C for an A 60 (nm) of 0.6 and expression was performed in the presence of 1 mM isopropylthiogalactoside (IPTG). After further induction for 4 h, cells were harvested by centrifugation and resuspended in 50 ml 10 mM Na 2 HP0 4, 10 mM NaH 2 P0 4 , 0.5 mM NaCl and 10 mM imidazole. Cells were sonicated lyses 3 times at 30% amplitude and centrifuged at 5,400xG, 4 ° C for 20 min.
  • IPTG isopropylthiogalactoside
  • Recombinant sMTL-13p was recovered as inclusion bodies and resuspended in 50 ml of 10 mM Na 2 HP0 4, 10 mM NaH 2 P0 4 , 0.5 mM NaCl, 10 mM imidazole and 8 M urea.
  • the recombinant protein was purified by nickel column affinity chromatography (GE Healthcare, Sao Paulo) under denaturing conditions following the methodology described in the manufacturer's protocol. Then the denaturation buffer was removed by dialysis and exchanged for renaturation PBS buffer before in vivo use in experiments.
  • Example 7- Generation of monoclonal antibody against sMTL-13p (clone 276.B7).
  • mice Three Balb / c mice were immunized with subcutaneous injection of 100 ⁇ g of recombinant sMTL-13p diluted in incomplete Freund's adjuvant and then three intraperitoneal injections of 100 ⁇ g of lectin were administered at weekly intervals. Splenocytes from mice showing the highest ELISA detector serum titers were fused to NS1 myeloma cells (ATCC number TIB-108) at a 7: 1 ratio using 50% polyethylene glycol as fusogen.
  • NS1 myeloma cells ATCC number TIB-108
  • Hybridoma supernatants were screened by ELISA, where purified recombinant sMTL-13 was used as a capture antigen Out of 900 initially screened clones, 12 positive clones were selected based on the production of high lectin antibody titers. The most stable hybridoma was selected and subcloned by dilution. The murine immunoglobulin class and subclass produced was determined by ELISA to be IgGlkappa using SBA Clonotyping. System / HRP (Southern Biotech, Birmingham, USA) following manufacturer's instructions.
  • Example 8 sMTL-13p-induced haemagglutination assay.
  • sMTL-13p a classic hemagglutination experiment was performed [38-40]. Briefly, different doses of recombinant sMTL-13p (2.5-10 pg / ml, 100 ⁇ l) were incubated with 100 ⁇ l to 2% of a rabbit erythrocyte suspension. Samples were then incubated for 30 min at 37 ° C and left at room temperature for a further 16 h. Lectinic activity was assessed by optical microscopy (Olympus, 10X objective) and images were acquired with digital camera (Nikkon, Japan).
  • rRv1419p induces agglutination of erythrocytes at doses of 2.5 ⁇ g / ml or 10 ⁇ g / ml ( Figure 1 D).
  • pretreatment with trypsin or papain two enzymes known to expose hidden carbohydrate binding sites on the cell surface (Denis M, Palatty PD, Bai NR, Suriya SJ. Purification and characterization of a sialic acid specific lectin from the hemolymph of the freshwater crab Paratelphusa jacquemontii Eur J Biochem 2003; 270 (21): 4348-55.), increase hemagglutination by Rv1419p (data not shown).
  • rRv1419p has at least two carbohydrate-binding functional domains, a prerequisite for promoting hemagglutination.
  • Maxsorb plates (Nunc, Roskilde, Denmark) were sensitized overnight with recombinant sMTL-13p in carbonate buffer at 4 ° C. Plates were washed with PBS / 0.05% Tween-20 and blocked with PBS / 0.1% Tween-20 and 0.05% BSA. Serum from patients and controls was diluted 1: 20 in PBS / 0.05% Tween-20 and incubated overnight at 4 ° C. Then the plates were washed and incubated with HRP-conjugated anti-human IgG (Sigma, St. Louis, MO, USA) at a dilution of 1: 1,000. Color development was performed with the addition of ABTS ® Peroxidase substrate. The reaction was stopped with 10% SDS and A * 05 was measured in an ELISA reader.
  • Anti-sMTL-13 IgG antibodies are increased during active tuberculosis.
  • a feature of mycobacterial infection is the generation of an intense immune response against secreted antigens.
  • Several antigens secreted by M. tuberculosis are believed to be virulence factors and influence the development of tuberculosis.
  • FIG. 3B newly diagnosed tuberculosis patients who are either treatment-naive or up to 15 days of chemotherapy (0-15 days) had high levels of total anti-sMTL-13 IgG antibodies.

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Abstract

A presente invenção refere-se à descrição de um teste diagnóstico e uma vacina para tuberculose caracterizados por compreender o uso de uma nova proteína secretada (sMTL-13), com características de lectina, isolada de Mycobacterium tuberculosis.

Description

"PROTEÍNA RECOMBINANTE DE MYCOBACTERIUM SP., TESTE IMUNODIAGNÓSTICO E VACINA PARA TUBERCULOSE"
A presente invenção refere-se à descrição de um teste diagnóstico e uma vacina para tuberculose caracterizados por compreender o uso de uma nova proteína secretada (sMTL-13), com características de lectina, isolada de Mycobacterium tuberculosis.
Proteínas ativamente secretadas durante a fase inicial de crescimento in vivo de M. tuberculosis têm sido alvo de intensa investigação pela sua capacidade de elicitar respostas imunes tanto in vivo como in vitro (Andersen P.; Effective vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis infection with a soluble mixture of secreted mycobacterial proteins. Infect Immun 1994; 62:2536-44; Young DB, Kaufmann SH, Hermans PW and Thole JE. Mycobacterial protein antigens: a compilation. Mol Microbiol 1992;6:133-45). A identificação de proteínas secretadas de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose, é considerada uma etapa importante para o desenvolvimento de novas estratégias para o controle dessa doença. Isto é evidenciado pelo fato de que 2 milhões de pessoas morrem a cada ano com tuberculose devido à inexistência de uma vacina eficaz (Dye C, Scheele S, Dolin P, Pathania V and Raviglione MC, 1999. Consensus statement. Global burden of tuberculosis: estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project. JAMA;282:677-86).
Apesar de tanto a resposta imune humoral quanto a celular estarem envolvidas na resistência do hospedeiro contra M. tuberculosis, acredita-se que a imunidade mediada por células seja o componente principal na proteção. Portanto, moléculas secretadas estão entre as possíveis candidatas a influenciar interações patógeno-hospedeiro in vivo (Teitelbaum R, Glatman- Freedman A, Chen B, et al, 1998. A mAb recognizing a surface antigen of Mycobacterium tuberculosis enhances host survival. Proc Natl Acad Sei U S A;95: 15688-93; Flynn JL, Chan J, Triebold KJ, Dalton DK, Stewart TA and Bloom BR, 1993. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med; 178:2249-54; Andersen P, Andersen AB, Sorensen AL and Nagai S, 1995. Recall of long-lived immunity to Mycobacterium tuberculosis infection in mice. J Immunol; 154:3359-72).
No estado da técnica, vários documentos sugerem o uso de proteínas secretadas de M. tuberculosis para diagnóstico e vacina. Dentre eles, pode-se citar:
_ EP 2226635, "IMMUNODETECTION ASSAY FOR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS COMPLEX", que descreve um método para detectar a proteína secretada MPT64 de M. tuberculosis através de imunoensaio utilizando anticorpo específico capaz de reconhecer epitopos de tal proteína;
_ WO 03012395, "EARLY DETECTION OF MYCOBACTERIAL DISEASE
USING PEPTIDES", que descreve o uso de glicoproteínas secretadas por M. tuberculosis para diagnóstico de tuberculose através da urina do paciente e para vacina contra tuberculose;
WO 0066143, "SECRETED PROTEINS OF MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS AND THEIR USE AS VACCINES AND DIAGNOSTIC REAGENTS", que descreve o uso de polipeptídeos secretados por M. tuberculosis (MTSP1 , MTSP2, MTSP3, MTSP4.MTSP5, MTSP6, MTSP7, MTSP8, MTSP9, MTSP10, MTSP1 1 , MTSP12.MTSP13, MTSP14, MTSP15, MTSP16, MTSP17, MTSP18, MTSP19.MTSP20, MTSP21 , MTSP22, MTSP23, MTSP24, MTSP25, MTSP26.MTSP27, MTSP28, MTSP29, MTSP30, MTSP31 , MTSP32, MTSP33.MTSP34, MTSP35, MTSP36, MTSP37, MTSP38, MTSP39, MTSP40.MTSP41 , MTSP42, MTSP43, MTSP44, MTSP45, MTSP46, or MTSP47), seus segmentos funcionais, moléculas de DNA que os codificam, vetores contendo tais moléculas, células transformadas por tais vetores, composições contendo um ou mais dos peptídeos ou das moléculas de DNA citadas para uso em diagnóstico e vacina.
A presente invenção demonstra a identificação de uma nova lectina, ainda não descrita no estado da técnica, de 13 kDa, secretada (secreted M. tuberculosis Lectin, sMTL-13; Rv1419), pertencente à família beta-trefoil tipo- ricina, presente apenas nas espécies do complexo M. tuberculosis, estando ausentes nas espécies de micobactérias não tuberculosas (MNT) tais como M. avium, M. kansasii e M. leprae. A lectina sMTL-13 foi capaz de aglutinar eritrócitos de coelho de maneira dose-dependente, sugerindo que esta proteína apresenta domínios lectínicos funcionais. Além disto, o soro de pacientes com tuberculose ativa apresentou altos níveis de anticorpos IgG contra sMTL-13, sendo observado que esta resposta decresce após tratamento bem sucedido anti-tuberculose. Estes resultados revelam que sMTL-13 pode ser utilizada como um biomarcador no tratamento da tuberculose em teste imunodiagnóstico e ainda como vacina.
BREVE DECRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 : Análise in silico e clonagem molecular do gene Rv1419 de Mycobacterium tuberculosis. A, Rv1419p é composto de um peptídeo sinal de 33 aminoácidos (barra cinza), com o sítio de clivagem entre Ala33 e Asp34 (*). O domínio lectínico tipo-ricina é encontrado do Asp45 ao Asp 154 (quadro). Sítios putativos de ligação a açúcares estão presentes na sequência madura como indicado por círculos. A presença de um padrão Q-W predito está sublinhada. B, Isolamento do gene Rv1419. Linhas: 1 , massa molecular padrão; 2, produto de PCR esperado. C, Purificação da 17-kD Mtb recombinante (Rv1419p) por HPLC (seta) e análise em gel SDS-PAGE (12%). D, A proteína Rv1419p induz hemaglutinação. Hemáceas de coelho (2%) foram incubadas salina ou Rv1419p (10 ug/ml) por 16 h. Imagens foram geradas com câmera digital (objetiva 10X). Dados mostrados são representativos de dois experimentos independentes.
Figura 2: A proteína Rv1419 predita é detectada na fração CFP de Mycobacterium tuberculosis H37Rv.
A, análise por Western Blot na qual a fração CFP de M. tuberculosis foi resolvida em SDS-PAGE, transferida para membrana de nitrocelulose e sondada com sobrenadante monoclonal produzido contra a Rv1419p. Mtb, Mycobacterium tuberculosis; Micobactéria atípica (isolados clínicos de M. avium, M. fortuitum e M. kansasii). B, preparações subcelulares de Mtb H37Rv. Como controle a membrana foi analisada novamente com o anticorpo monoclonal contra a lipoproteína 19-kD (IT-19, diluição 1 :1000). Os dados mostrados são representativos de dois experimentos independentes. Marcação in situ da sMTL-13 em pacientes com tuberculose ativa. Imunohistoquímica de uma biópsia pleural representativa de três pacientes com típico infiltrado inflamatório mononuclear (aumento X400) é mostrado. C, marcação positiva usando o anticorpo anti-sMTL-13 (inserte, aumento X 1000). D, controle negativo utilizando um anticorpo isotipo lgG1 (inserte, aumento X1000). E, marcação negativa em biópsia de pele de um paciente leproso usando o anticorpo anti-sMTL-13 (aumento x400). F, percentagem da área total marcada por granuloma para a sMTL-13 no grupo experimental ou controles. Resultados representam a média+/-erro padrão das medidas a partir de três amostras por grupo (cinco granulomas por slide). ** Diferença estatisticamente significante entre os pacientes com tuberculose pleural versus grupo controle (sarcoidosis, leprose, infecção fúngica; p=0.0079), Teste Mann-Whitney).
Figura 3: Resposta imune adaptativa em pacientes com tuberculose ativa.
A, Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos sadios e vacinados com BCG, controles (PPD-negativo, n=6) ou pacientes com tuberculose ativa (n=11) foram expostas à sMTL-13 (10ug/mL) por 48h. A produção de IFN-γ foi detectada no sobrenadante de cultura por CBA (BD). * Estatisticamente significante quando comparado ao grupo PPD-negativo. (p=0.0238, Teste Mann-Whitney). B, Soro de pacientes com tuberculose foi avaliado para IgG específica contra sMTL-13 por ELISA. Resultados são expressos como mediana das medidas individuais de densidade óptica de pacientes com tuberculose (n=34) e controles (n=38, indivíduos de área endémica; n=5, indivíduos de área não endémica). Estatisticamente significativo comparado tanto com controles de áreas endémicas como não endémicas (p<0.001 , teste Kruskal-Wallis). C, baseado nos níveis de anticorpos anti-ESAT-6 e anti-sMTL-13 (doença ativa versus controles de área endémica), uma curva ROC foi utilizada para comparar a acurácia das variáveis indicadas (variável 1 : ESAT-6; variável 2: sMTL-13) durante a fase ativa da tuberculose. Para cada indicador, sensibilidade é plotada contra a especificidade e a acurácia é medida pela área sobre a curva (AUC). DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA
Na presente invenção a proteína recombinante Rv1419p de Mycobacterium sp. foi produzida e a partir da mesma a lectina sMTL-13 foi obtida. Em seguida foi demonstrada a capacidade de sMTL-13 em aglutinar eritrócitos de maneira dose-dependente, sugerindo que esta proteína apresenta domínios lectínicos funcionais. Além disto, o soro de pacientes com tuberculose ativa apresentou altos níveis de anticorpos IgG contra sMTL-13, sendo observado que esta resposta decresce após tratamento bem sucedido anti- tuberculose. Estes resultados revelam que sMTL-13 pode ser utilizada como vacina contra tuberculose e em testes imunodiagnóstico.
Ainda, o teste imunodiagnóstico pode ser selecionado do grupo compreendendo ELISA, Western blot, dot blot, imunodifusão e imunocromatografia. Nos exemplo que se segue foi utilizado o teste de ELISA.
A invenção poderá ser melhor compreendida, de forma não limitante, através dos seguintes exemplos:
Exemplo 1 : Obtenção de frações micobacterianas.
Frações subcelulares da cepa laboratorial padrão M. tuberculosis H37Rv utilizadas nessa invenção, como frações de lisado celular total (WCL), filtrado de proteínas de cultura (CFP), membrana (MEM) e parede celular (CW), foram obtidas pelo cultivo da cepa à fase log tardia (dia 14) em meio GAS (glycerol- alanine-salts) como descrito em outros trabalhos (Sonnenberg MG and Belisle, JT. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two- dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun 1997;65:4515- 24; Lee BY, Hefta SA and Brennan PJ. Characterization of the major membrane protein of virulent Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 1992;60:2066-74; Hirschfield GR, McNeil M, and Brennan PJ. Peptidoglycan-associated polypeptides of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 1990;172:1005-13.). Exemplo 2- Caracterização bioinformática do gene Rv1419.
Um banco de dados de lectinas não redundantes foi gerado para pesquisar domínios lectínicos no genoma da Araidopsis thaliana, utilizando este organismo como modelo (Moreno FB, Facó F, Ceccatto VM, Sampaio AH, Costa ABS, Freitas JLT, Nogueira LL, Lima ME, Lima JL, Cavada BS. Matching carbohydrate-binding domains in Arabidopsis thaliana genome: development of a lectin database. Online J Bioinform 2003;4: 96-105.). Para avaliar a presença de tais domínios em um importante patógeno humano, o Mycobacterium tuberculosis, este banco de dados foi adaptado e uma lectina hipotética única codificada pelo gene Rv1419 foi identificada. A figura 1 apresenta a caracterização bioinformática do gene Rv1419(SEQ IDN°3). O seu módulo aberto de leitura (ORF) contém 474 nucleotídeos e a sequência de aminoácidos (aa) codifica uma proteína hipotética de 157 resíduos contendo peptídeo sinal e uma massa molecular estimada de 16,8 kDa. A sequência primária de aminoácidos da proteína codificada pelo Rv1419 contém um peptídeo sinal de 33 resíduos, com um sinal de clivagem tipo I entre Ala33 e Asp34. A análise da proteína madura (sem o peptídeo sinal) apresentou massa molecular de 13,6 kDa. As posições 31-32 da proteína precursora contêm a sequência Ala-x-Ala, uma sequência padrão comumente encontrada precedendo o sítio de clivagem (Tuteja R. Type I signal peptidase: an overview. Arch Biochem Biophys 2005;441 :107-11). O Rv1419p contém um domínio ricina cadeia-B ligador de carboidrato e pertence à família de proteínas do tipo ricina beta-trefoil, composta por três subdomínios homólogos assim como pela presença de um padrão Q-W (Hazes B. The (QxW)3 domain: a flexible lectin scaffold. Protein Sei 1996;5:1490-501). Foi demonstrado que domínios ricina cadeia-B ligam glicolipídios e glicoproteínas de superfície celular que contêm porções moleculares galactose e manose ligadas a beta-1 ,4 [Hartley MR, Lord JM. Cytotoxic ribosome-inactivating lectins from plants. Biochim Biophys Acta 2004;1701 :1-14]. Além disso, a pesquisa no banco de dados demonstrou que a sequência de aminoácidos Rv1419p apresentou correlação de 100% com a cepa clínica CDC1551 de M. tuberculosis (Genbank código gi: 118619073). Estes dados sugerem a existência de uma proteína de M. tuberculosis, secretada, ligadora de açúcar, sem descrição prévia e com sequências relacionadas em outras micobactérias.
Exemplo 3- Expressão da proteína recombinante codificada pelo Rv1419 de M. tuberculosis.
Para estudar melhor possíveis funções do Rv1419p, produziu-se uma proteína recombinante (SEQ ID N°1). Primeiro gerou-se o vetor de clonagem seguido pela produção do vetor de expressão. Para tanto, a sequência codificando o Rv1419 completo, incluindo o peptídeo sinal, foi amplificada por PCR utilizando DNA de M. tuberculosis H37v como molde. Um fragmento de DNA com 496 pb foi obtido (Figura 1 B), purificado e então clonado no vetor pMOSBIue. O procedimento de seqiienciamento foi empregado para confirmar a clonagem e os experimentos de amplificação geraram uma sequência Rv1419 inalterada. O produto foi denominado pMOSBIue-Mtb e digerido por enzimas de restrição Xhol e Ndel para realizar a subclonagem no vetor de expressão pET-15b. O fragmento foi então inserido in-frame com o start códon presente no sítio de clivagem Ndel para permitir produção total de Rv1419p. Em seguida realizou-se expressão heteróloga utilizando a cepa BL21 (DE3) de E. coli.
A Figura 1C mostra um experimento SDS-PAGE típico do Rv1419 recombinante (rRv1419) obtido, evidenciando uma única banda de peso molecular ~17 kDa. Esta proteína recombinante (SEQ ID N°1) foi produzida como corpos de inclusão e purificada em condições desnaturantes por cromatografia de afinidade. O redobramento da proteína desnaturada foi realizado utilizando tampão PBS de renaturação pH 7,4, resultando na proteína solúvel completa utilizada daí em diante.
Exemplo 4- Rv1419p é expresso na fração do filtrado protéico de cultura de M. tuberculosis, mas não na de micobactérias não-tuberculosas (MNT).
Após análise de gel bidimensional e espectometria de massa do filtrado protéico de cultura (CFP) de M. tuberculosis H37Rv, Malen et al. detectaram uma proteína de ~13 kDa m.m. correspondente ao gene Rv1419, sugerindo que Rv1419p é secretada (Malen, H., Berven, F. S., Fladmark, K. E. andWiker, H. G., Comprehensive analysis of exported proteins from Mycobacterium tuberculosis H37Rv.Proteomics 2007. 7: 1702-1718). Contudo, não se sabe o nível de expressão de Rv1419p em frações micobacterianas. Para investigar melhor a expressão de Rv1419p em diversas frações de M. tuberculosis, geramos um anticorpo monoclonal contra esta lectina (clone 276.B7/lgGKappa). A Figura 2A revela uma banda única de -13 kDa m.m. em CFP de M. tuberculosis H37Rv, mas não em frações CFP obtidas das espécies de MNT M. avium, M. kansasii e M. fortuitum. Além disso, as preparações de parede celular ou de membrana de M. tuberculosis H37Rv apresentaram bandas discretas quando incubadas com o mesmo anticorpo monoclonal (Figura 2B). Em contraste, a análise por Western Blot de preparações do CFP de M. tuberculosis revelou que sMTL-13 é pelo menos tão abundante quanto a lipoproteína de 19 kDa, um componente bem conhecido do CFP (Gasteiger, E., Gattiker, A., Hoogland, C, Ivanyi, I., Appel, R. D. and Bairoch, A., ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res. 2003. 31 : 3784-3788). Como demonstrado anteriormente por Rosenkrands et al., altos níveis da banda correspondente à lipoproteína de 19 kDa de M. tuberculosis H37Rv foram observados nas frações incubadas com o anticorpo monoclonal anti-lipoproteína 19 kDa (Figura 2B) (Rosenkrands I, King A, Weldingh K, Moniatte M, Moertz E and Andersen P. Towards the proteome of Mycobacterium tuberculosis. Electrophoresis 2000;21 :3740-56). Juntos, estes dados indicam que Rv1419p é uma lectina secretada presente em níveis razoáveis no CFP de M. tuberculosis. Nomeamos, portanto, esta proteína "Secreted M. tuberculosis Lectin' (sMTL)-13.
Exemplo 5- Análise da sequência de aminoácidos da sMTL-13 in silico.
Os módulos de leitura abertos (ORF) registrados como proteínas hipotéticas, de função desconhecida ou putativa, foram filtrados de todo o genoma do M. tuberculosis utilizando um script Peari (Moreno FB, Facó F, Ceccatto VM, Sampaio AH, Costa ABS, Freitas JLT, Nogueira LL, Lima ME, Lima JL, Cavada BS. Matching carbohydrate-binding domains in Arabidopsis thaliana genome: development of a lectin database. Online J Bioinform 2003;4: 96-105.). A sequência de aminoácidos deduzida da ORF Rv1419 inteira (sMTL-13 precursor, sMTL-13p) foi submetida à análise primária de estrutura usando ExPASy (Expert Protein Analysis System) Proteomis Server (Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD and Bairoch A. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Res 2003;31 :3784-8). O servidor SignalP 3.0 foi utilizado para identificar potenciais peptídeos sinal tipo-Sec e sítios de clivagem com base em diversos métodos Neural Network e modelos Hidden Markov (Nielsen H, Engelbrecht J, Brunak S and von Heijne G. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng 1997;10:1-;, Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G and Nielsen H. Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Nat Protoc 2007;2:953-71). Para comparar sequências múltiplas utilizamos os programas CLUSTALW e T- COFFE [Notredame C, Higgins DG and Heringa J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. J Mol Biol 2000;302:205-17. Por fim, o servidor Blast Network do National Center dor Biotechnology Information (NCBI) foi utilizado para identificar sequências semelhantes ao sMTL-13p e domínios conservados.
Exemplo 6- Expressão e purificação do sMTL-13p recombinante.
A proteína sMTL-13 contendo o peptídeo sinal foi expressa como uma proteína marcada com histidina (His) em uma cepa de E. coli (DE3). O gene Rv1419 foi subclonado no vetor de expressão pET15b (Novagen, Madison, EUA) codificando seis resíduos de histidina localizados na região N-terminal, permitindo a expressão de uma proteína de fusão. Para tanto, um fragmento de PCR do Rv1419 representando todo o módulo aberto de leitura foi gerado com primers específicos desenhados para produzir sítios de restrição enzimática Ndel e Xhol no produto de PCR resultante, utilizando DNA do M. tuberculosis H37Rv como molde: Ndel para o senso sense (5'- GGAATTCCATATGGGTGAATTACGGTTGG-3') e Xhol para o anti-senso (5'- CCGCTCGAGTCATTACGGCACGCTATCCC-3'). Os parâmetros para a reação de PCR foram os seguintes: desnaturação inicial por 4 min a 94°C, desnaturação por 1 min a 94°C, anelamento por 1 min a 56°C e extensão por 1 min a 72°C (36 ciclos). Depois, a sequência foi confirmada por seqiienciamento de DNA. Um litro de E. coli BL21 (DE3) foi cultivado a 37°C para um A6oo (nm) de 0.6 e a expressão foi realizada em presença de 1 mM isopropiltiogalactosídeo (IPTG). Após indução por mais 4 h, células foram colhidas por centrifugação e ressuspendidas em 50 ml de Na2HP04 10 mM, NaH2P04 10mM, NaCI 0,5 mM e imidazol 10mM. Células foram lisadas por sonicação 3 vezes a 30% da amplitude e centrifugadas a 5.400xG, 4°C por 20 min. O sMTL-13p recombinante foi recuperado como corpos de inclusão e ressuspendido em 50 ml de Na2HP04 10 mM, NaH2P04 10mM, NaCI 0,5 mM, imidazol 10mM e uréia 8M. A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel (GE Healthcare, São Paulo) em condições desnaturantes seguindo a metodologia descrita no protocolo do fabricante. Depois, o tampão de desnaturação foi removido por diálise e trocado por tampão PBS de renaturação antes de uso in vivo em experimentos. Exemplo 7- Geração de anticorpo monoclonal contra sMTL-13p ( clone 276.B7).
Três camundongos Balb/c foram imunizados com injeção subcutânea de 100 ug de sMTL-13p recombinante diluídos em adjuvante Freund incompleto e em seguida três injeções intraperitoneais de 100 ug de lectina foram aplicadas com intervalos semanais. Esplenócitos dos camundongos que apresentaram os títulos séricos de Ac mais altos detectador por ELISA foram fundidos com células NS1 de mieloma (ATCC número TIB-108) na razão de 7:1 utilizando polietileno glicol 50% como fusógeno. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Brasil) suplementado com SBF 20% (Hyclone, EUA) e hibridomas foram selecionados usando hipoxantina 0,1 mM, aminopterina 4x10" 4 M e timidina 0,016 mM. Sobrenadantes dos hibridomas foram triados por ELISA, onde a sMTL-13 recombinante purificada foi usada como antígeno de captura. Dos 900 clones triados inicialmente, 12 clones positivos foram selecionados com base na produção de altos títulos de anticorpos contra a lectina. O hibridoma mais estável foi selecionado e subclonado por diluição limitante. A classe e subclasse de imunoglobulina murínica produzida foi determinada por ELISA como sendo IgGlkappa utilizando SBA Clonotyping System/HRP (Southern Biotech, Birmingham, EUA), seguindo instruções do fabricante.
Detecção de anticorpos contra SMTL-13p por ELISA. Microplacas de 96 poços de poliestireno foram sensibilizadas overnight com sMTL-13p (5 pg/mL; 100 uL/poço) diluído em solução tampão de carbonato 0,06 M (pH 9,6). Cada poço foi bloqueado com leite desnatado a 2% em PBS contendo Tween 20 a 0,05% (PBS-T), lavado com PBS contendo 0,01% Tween 20 e incubado com with 100 uL de sobrenadantes de culturas de hibridoma por 40 min a 37°C. Após lavagem, os poços foram incubados com anticorpo de cabra conjugado com peroxidase contra IgG murínico (Santa Cruz Biotechnology, EUA) diluído em 1 :1.200 em PBS-T por 40 min a 37°C. A revelação foi realizada adicionando ABTS ® Peroxidase substrate 1-component (KPL, EUA). Após 3 minutos a reação foi interrompida com SDS a 10% e a A*o5 foi mensurada em leitor de ELISA (Molecular Devices, EUA).
Detecção de sMTL-13 por Western Blotting. A proteína total da fração subcelular de M. tuberculosis (10 pg or 50 pg por linha) foi submetida ao SDS- PAGE (Invitrogen, EUA) e transferida para membrana de nitrocelulose. Depois, a membrana foi bloqueada com leite desnatado a 5% em salina tamponada com tris contendo Tween 20 a 0,1% (TBS-T). sMTL-13 reagiu então com a sonda (sobrenadante do monoclonal - Clone 276.B7/lgG1 kappa) e foi incubado em seguida com anticorpo secundário conjugado a HRP, diluído em tampão de bloqueio (1 :2.000). A detecção foi realizada por análise de quimioluminescência seguindo instruções do fabricante (Pierce, EUA).
Exemplo 8- Ensaio de hemaglutinação induzida por sMTL-13p.
Para investigar a atividade lectínica do sMTL-13p, um experimento clássico de hemaglutinação foi realizado [38-40]. Brevemente, diferentes doses do sMTL-13p recombinante (2,5-10 pg/mL, 100 uL) foram incubadas com 100 uL a 2% de uma suspensão de eritrócitos de coelho. Em seguida, amostras foram incubadas por 30 min a 37°C e deixadas à temperatura ambiente por mais 16 h. A atividade lectínica foi avaliada por- microscopia óptica (Olympus, objetiva 10X) e as imagens foram adquiridas com câmera digital (Nikkon, Japão). Consistente com dados in silico, rRv1419p induz aglutinação de eritrócitos com doses de 2,5 ug/ml ou 10 ug/ml (Figura 1 D). Ademais, pré- tratamento com tripsina ou papaína, duas enzimas que sabidamente expõem sítios de ligação de carboidrato escondidos na superfície celular (Denis M, Palatty PD, Bai NR, Suriya SJ. Purification and characterization of a sialic acid specific lectin from the hemolymph of the freshwater crab Paratelphusa jacquemontii. Eur J Biochem 2003;270(21):4348-55.), aumentam hemaglutinação pela Rv1419p (dados não apresentados). Estes dados sugerem que a rRv1419p possui pelo menos dois domínios funcionais ligadores de carboidratos, um pré-requisito para promover hemaglutinação.
Exemplo 9- Quantificação dos anticorpos IgG anti-sMTL-13p e subtipos IgG. População do estudo:
Trinta e quatro pacientes, antes ou durante tratamento para tuberculose pulmonar ativa na Divisão de Doenças Respiratórias da Clínica Central de Saúde Pública de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil, foram selecionados. Apenas aqueles pacientes com bacilos álcool-ácido resistentes presentes na baciloscopia do escarro ou cultura positiva e que foram submetidos a exame clínico e radiológico por Rx de Tórax, de acordo com as normas do Ministério da Saúde, foram incluídos neste estudo. AIDS, diabetes, hepatite, hipertensão, gravidez e alcoolismo foram critérios de exclusão. Todos os pacientes incluídos no estudo têm confirmação de apresentar baciloscopia negativa durante e após tratamento. Trinta e oito controles vacinados com BCG foram incluídos no grupo controle de estudantes de medicina sem história prévia de infecção micobacteriana. Todos os pacientes e indivíduos do grupo controle foram informados do estudo e consentiram com o fornecimento das amostras sanguíneas. O Comité de Ética Médica da Universidade Federal de Juiz de Fora aprovou o protocolo de estudo (UFJF-1495.186.2008).
Placas Maxsorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram sensibilizadas overnight com sMTL-13p recombinante em tampão carbonato a 4°C. Placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween-20 e bloqueadas com PBS/0,1 % Tween-20 e 0,05%BSA. O soro dos pacientes e controles foi diluído a 1 :20 em PBS/0,05% Tween-20 e incubado overnight a 4°C. Em seguida as placas foram lavadas e incubadas com IgG anti-humano conjugado a HRP (Sigma, St. Louis, MO, EUA) a uma diluição de 1 :1.000. A revelação da cor foi realizada com a adição de substrato Peroxidase ABTS ®. A reação foi interrompida com SDS 10% e a A*05 foi mensurada em leitor de ELISA.
Anticorpos IgG anti-sMTL-13 estão aumentados durante tuberculose ativa.
Uma característica da infecção micobacteriana é a geração de uma resposta imune intensa contra antígenos secretados. Acredita-se que diversos antígenos secretados por M. tuberculosis sejam fatores de virulência e influenciem o desenvolvimento da tuberculose. Investigamos, portanto, se sMTL-13 é reconhecida por pacientes tuberculosos durante doença ativa. Para tanto, realizamos teste de ELISA em amostras de soro de 34 pacientes assim como de 38 indivíduos controle. Como demonstrado na Figura 3B, pacientes de tuberculose com diagnóstico recente sejam virgens de tratamento ou com até 15 dias de tratamento quimioterápico (0-15 dias) apresentaram altos níveis de anticorpos IgG totais anti-sMTL-13. Foi importante notar que níveis séricos de IgG anti-sMTL-13 decresceram rapidamente nos primeiros meses (1-2) de tratamento e atingiram níveis basais comparáveis àqueles de indivíduos controle residentes de áreas endémicas e não-endêmicas. Além disso, títulos de anticorpos IgG anti-sMTL-13 permaneceram em níveis basais após quimioterapia anti-tuberculosa com sucesso (6 meses). Adicionalmente, foi constatado que o subtipo lgG1 , porém não lgG3, estava diminuído durante quimioterapia anti-tuberculosa (dados não apresentados). Estes dados sugerem que respostas imunes contra sMTL-13 diminuem após o controle terapêutico de M. tuberculosis in vivo e isso pode servir como uma estratégia a ser explorada como biomarcador da eficácia do tratamento da tuberculose.
Exemplo 10- Uso de sMTL-13 para o diagnóstico de tuberculose
Em comparação a níveis de IgG anti-ESAT-6 (especificidade=89%, sensibilidade=89%), curvas ROC revelaram que IgG anti-sMTL-13 apresentou alta especificidade (90%) assim como alta sensibilidade (93%) para o diagnóstico de tuberculose (Figura 3C). Curiosamente, títulos de IgG anti- sMTL-13 diminuíram rapidamente durante os dois primeiros meses de tratamento (Figura 3B), sugerindo que a resposta imune contra esta proteína decresce após o controle da proliferação do M. tuberculosis. Portanto, níveis de IgG anti-sMTL-13 podem ser utilizados como biomarcador sérico da eficácia do tratamento.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína recombinante de Mycobacteríum sp. caracterizada por consistir da sequência SEQ ID N°1 ou porções antigênicas da mesma.
2. Método para teste imunodiagnóstico de Tuberculose caracterizado por compreender:
a) ligação de anticorpos de uma amostra à proteína consistindo da sequência SEQ ID N°1 ou à porções antigênicas da mesma, ligadas a um suporte sólido ou um carreador;
b) contactar os anticorpos do passo (a) com um anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se ligam aos anticorpos do passo (a)
c) detectar os anticorpos na amostra supracitada pela detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados ao dito anticorpo anti- SEQ ID N°1 ou anti porções antigênicas da mesma.
3. Método para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas amostras serem selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e outro fluído corporal.
4. Método para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela porção antigênica do item a consistir preferencialmente da sequência SEQ ID N°2.
5. Método para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado de um grupo de materiais consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e poliestireno.
6. Método para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo carreador ser uma partícula de ouro.
7. Método para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo anticorpo secundário ser selecionado de um grupo consistindo de IgG, IgM, IgA, IgE e subclasses deles.
8. Método para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela proteína ser selecionada de um grupo consistindo de Proteína A e Proteína G.
9. Método para teste Imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo consistindo de fosfatase alcalina, peroxidase, β-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.
10. Método para teste Imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
11. Método para teste Imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo passo de detecção do anticorpo anti SEQ ID N°1 ou porções antigênicas da mesma ser selecionado do grupo consistindo de detecção de fluorescência, de imunoluminescência, de absorbância ou de radioisótopos.
12. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, caracterizado por compreender:
- a proteína recombinante consistindo da sequência SEQ ID N° 1 ou porções antigênicas da mesma.
- Um anticorpo secundário ou uma proteína, onde o anticorpo secundário ou a proteína está conjugado a um enzima ou marcador, e um reagente para detectar a dita enzima ou marcador.
13. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela porção antigênica consistir preferencialmente da sequência SEQ ID N° 2.
14. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela proteína recombinante ou porções antigênicas da mesma estarem ligadas a um suporte sólido ou carreador.
15. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de material consistindo de nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e polistireno.
16. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo carreador consistir de partículas de ouro.
17. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo anticorpo secundário ser selecionado do grupo consistindo de IgG, IgM, IgA, IgE e subclasses deles.
18. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela proteína ser selecionada do grupo consistindo de proteína A e proteína G.
19. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo dito marcador ser selecionado do grupo consistindo de enzimas, redioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
20. Kit para teste imunodiagnóstico de Tuberculose, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pela enzima ser selecionada do grupo compreendendo fosfatase alcalina, peroxidase, β- galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.
21. VACINA CONTRA TUBERCULOSE, caracterizada por utilizar a proteína consistindo da sequência SEQ ID N°1 ou polipeptídeos contendo porções antigênicas da mesma ou o gene que codifica para tal proteína ou polinucleotídeos que codificam para porções antigênicas da mesma em excipiente farmacologicamente aceitável.
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