WO2012089868A2 - Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas - Google Patents

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    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/065—Bowel diseases, e.g. Crohn, ulcerative colitis, IBS

Definitions

  • the present invention shows a method for monitoring gluten intake by measuring gluten proteins / peptides in feces with antibodies against immunogenic peptides resistant to gastrointestinal digestion.
  • the presence or absence of said immunogenic peptides is controlled by immunological assays based on antibodies reactive against immunogenic gluten peptides that are resistant to proteolysis.
  • Such tests may be quantitative ELISAs, or qualitative techniques such as rapid immunochromatographic tests, immunoblots, etc.
  • Gluten is a set of cereal storage proteins. Gluten proteins from wheat, barley, rye and probably oats are not tolerated by genetically predisposed individuals suffering from celiac disease (CD).
  • CD celiac disease
  • gluten is made up of a fraction soluble in ethanol (prolamines: ⁇ , ⁇ , ⁇ and ⁇ -gliadins); and another insoluble, glutenins (high and low molecular weight) (Wieser, 2007, Food Microbol., 24: 115-119; Fasano, 2009, Sci Am., 301: 54-61).
  • Gliadins, as well as glutenins are unusually rich in proline residues ( ⁇ 15%) and glutamine ( ⁇ 35%).
  • gluten proteins are not completely digested (Erickson and Kim, 1990, Annu Rev Med., 41: 133- 139; Gray, 1991, New York xford University, pp. 411-420; Ganapathy et al., 2006, Academic Press, pp. 1667-1692). Therefore, some of the gluten peptides generated during gastrointestinal digestion are highly resistant to digestion by gastric and pancreatic enzymes, so they persist in the intestine. These peptides are able to internalize in intestinal cells and, as a consequence, the glutamine residues they possess can be deaminated by tissue transglutaminase (tTG).
  • tTG tissue transglutaminase
  • the intestinal villi are destroyed due to the immunological reaction, producing a decrease in intestinal absorption that can lead to symptoms such as diarrhea, anemia, stunted growth, weight loss, bone disorders, neurological complications, cancer, etc. (Alaedini and Green, 2005, Ann Int Med., 142: 289-299; Catassi and Fasano, 2008, Curr Opin Gastroenterol., 24: 687-691; Tack et al., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7: 204- 213).
  • One of the main gluten peptides described to date is the 33-mer peptide of a2-gliadin (Shan et al., 2002, Science, 297: 2275-2279; Bethune et al., 2009, Chem Biol., 16 : 868-881) which has been shown to be resistant to gastrointestinal digestion, a substrate for deamination mediated by tTG and highly reactive against T cells isolated from celiac patients.
  • DSG gluten-free diet
  • a more direct measure of gluten intake could provide critical information about the patient: the detection of non-compliance with the DSG before anatomical damage, the detection of inadvertent consumption, the evaluation of the accuracy of treatment adherence in the initial period after the diagnosis when patients are less familiar with diet, etc., providing easy and reliable confirmation of the results obtained. Therefore, a sensitive and reliable marker for monitoring and detecting gluten intake could be a useful tool for the correct compliance of the DSG and, probably, for an accurate diagnosis of refractory CD.
  • the monoclonal antibodies (moAbs) G12 and A1 obtained against the main immunogenic epitope of ⁇ -gliadin have proven to be very useful in the detection of toxic peptides in food samples, as well as in clinical research of enzymatic detoxification of gluten (Morón et al. ., 2008, Am J Clin Nutr., 87: 405-414; Morón et al., 2008, PloS ONE, 3: e2294; Ehren et al., 2009, PloS ONE, 4: e6313; Alvine Pharmaceuticals, Inc., Biomedal SL).
  • the sensitivity and specificity of monoclonal antibodies and their ability to recognize peptides resistant to gastrointestinal digestion could make them ideal for the monitoring of gluten immunotoxic peptides obtained after intestinal digestion in human samples.
  • the recognition epitopes of moAb G12, QP (Q / E) LP (Y / F), are present in the main peptides recently described in a high-yield screening performed with 2,700 peptides from prolamines of different cereals (Tye-Din and col., 2010, Sci Trans ⁇ Med., 2:41 ra51).
  • the undigested peptide fragments from the intake of gluten and not absorbed could be recovered from the feces, which would demonstrate the individual's gluten intake.
  • the gluten-free diet is the only effective treatment for celiac disease today. Therefore, compliance with the DSG in patients should be monitored to avoid direct and indirect cumulative damage, as well as to confirm that the persistence of any typical celiac symptoms is not due to a violation (voluntary or not) of the diet.
  • a violation voluntary or not
  • the present invention has as its object the application of immunological methods to monitor the fulfillment of the gluten-free diet by means of the detection in faeces of immunotoxic peptides resistant to gastrointestinal digestion.
  • the object of the invention is the application of antibody-based immunological techniques that recognize immunogenic gluten peptides that resist gastrointestinal digestion.
  • the invention employs immunological techniques that use antibodies that recognize gliadin 33-mer peptide.
  • the preferred method used in the invention should allow to detect ingested gluten equivalent to 50 mgs of wheat gluten per day, which is the maximum amount described for a gluten-free diet, or in its case a minimum of 20 ppms of equivalent gluten in feces.
  • Said procedure and analytical kits also have their object of the patent in their use to reveal the lack of adherence to the DSG, either due to the contamination of the food consumed or to an occasional voluntary / involuntary intake of gluten-containing foods.
  • the application of the detection of said immunotoxic peptides in feces for the control of clinical research on celiac disease, including therapies is an object of the present invention. enzymatic related to detoxification of gluten prolamines, immunotoxic peptide sequestrants, and other alternative therapies.
  • the object of the present invention is a method for detecting or monitoring ingested gluten by detecting immunotoxic peptides in feces, characterized by the use of immunological methods with antibodies that recognize, preferably epitopes related to the 33-mer peptide of the gliadin and other peptide sequences resistant to gastrointestinal digestion.
  • the object of the present invention is the use of immunological techniques for said gluten monitoring, immunological methods such as indirect ELISA, competitive ELISA, sandwich ELISA, immunochromatographic strips, fluorescent immunomicroparticles, Western blot, biosensors based on electrochemical reactions catalyzed by enzymes coupled to the antibodies, by magnetic particles upholstered by antibodies, by resonance of surface plasmons, and other techniques in which the binding of an analyte to an antibody is detected.
  • immunological methods such as indirect ELISA, competitive ELISA, sandwich ELISA, immunochromatographic strips, fluorescent immunomicroparticles, Western blot, biosensors based on electrochemical reactions catalyzed by enzymes coupled to the antibodies, by magnetic particles upholstered by antibodies, by resonance of surface plasmons, and other techniques in which the binding of an analyte to an antibody is detected.
  • these methods are characterized in that they preferably employ one or more monoclonal antibodies capable of detecting epitopes contained or similar to the 33-mer peptide (SEQ ID No. 1), such as the following sequences: SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8.
  • SEQ ID No. 1 the antibodies used by immunological techniques they would be G12 and A1 for their demonstrated relationship of their reactivity with the potential immunotoxicity of a sample.
  • the invention also contemplates the use of the R5 antibody that reacts with the epitope SQ ID No. 9, which can also be found in gluten peptides resistant to gastrointestinal digestion, but with less specificity before protease resistant immunogenic peptides.
  • a preferred form of the invention would be the use of immunological methods based on the G12 monoclonal antibody conjugated to an enzyme that allows a quantitative assay using chromogenic, fluorogenic or luminescent substrates.
  • This procedure could use a pattern of gliadin, hydrolyzed gliadin, complete 33-mer peptide or a part of its sequence of at least 6 amino acids (SEQ ID N ° 2).
  • Another object of the invention is the particular use of immunochromatographic strips based on the anti-33-mer antibodies of gliadin, G12 and A1 that allow a semi-quantitative and rapid detection of gluten peptides / proteins contained in feces.
  • the invention proposes a measure of the gluten ingested by the individual through the diet. It is a useful procedure for the control of ingested gluten through the use of analytical methods in which a correlation between the amount of gluten ingested and the protein / peptide estimates of gluten in feces obtained through these procedures has been demonstrated.
  • the invention proposes an analytical instrument for monitoring compliance with the DSG, as well as to rule out the uncontrolled intake of gluten in patients suspected of suffering from the so-called refractory celiac disease.
  • the new therapeutic alternatives for the enzymatic detoxification of gluten and other alternative therapies can also be controlled in the feces of celiac patients undergoing clinical trials or a therapeutic prescription in the future, since the effectiveness of the therapy It could be determined by measuring the presence or absence of peptides in feces after 12-48 hours of the intake of some controlled amount of gluten along with therapies that eliminate immunotoxic peptides
  • the extraction of the peptides in the feces can be carried out directly with a hydroalcoholic solution of 40 to 60%.
  • the extraction of gluten in feces could be improved by adding a solution with dispersing agents such as guanidinium chloride, arginine chloride, etc; or detergents such as polyvinylpyrrolidone, and reducing agents such as b-mercaptoethanol, DTT or TCEP.
  • dispersing agents such as guanidinium chloride, arginine chloride, etc; or detergents such as polyvinylpyrrolidone, and reducing agents such as b-mercaptoethanol, DTT or TCEP.
  • the extracted gluten polypeptides are diluted in a buffered saline solution and then used to make the measurement with an ELISA, very competitive, or sandwich if you want to have an idea of the concentration of the reactive peptides.
  • the straight pattern could be made with standard pepsino-trypsin gliadin, to simulate gastric digestion.
  • Synthesized polypeptide that reacts with antibodies, preferably, 33-mer of gliadin or fragments thereof, could also be used directly with the option of putting some specific modifications that maintain reactivity against antibodies.
  • the following peptides could be used for the G12 antibodies: SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, and SEQ ID No. 4.
  • the peptides SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 or SEQ ID No. 8 to make the straight pattern with a competitive ELISA.
  • an immunochromatographic strips using the G12 or A1 antibody or both could be used.
  • the procedure could be carried out with a kit containing the stool polypeptide extraction solution; a reference standard with pepsin and trypsin hydrolyzed gluten polypeptides or synthesized; and the components of an ELISA with a multiwell plate and using the A1 and / or G12 antibodies to immobilize the wells and / or for the development of the assay, or immunochromatographic strips.
  • Figure 1 Relative affinity of moAb G12 against immunotoxic peptides derived from gliadin PWG after simulation of gastrointestinal digestion.
  • a and B SDS-PAGE and Western blot of gliadin PWG, PWG gliadin + pepsin and gliadin PWG + pepsin + trypsin / chymotrypsin. The samples were stained with silver or transferred to a PVDF membrane with the G12 moAb. PM: molecular weight marker.
  • C Analysis by competitive ELISA G12-HRP of peptides from gliadin PWG.
  • Figure 2 Resistance of the 33-mer peptide to rupture by gastrointestinal enzymes.
  • A Amino acid sequence of the 33-mer peptide. The recognition sequence of the G12 moAb in the 33-mer peptide appears in bold.
  • B Competitive ELISA for the detection of 33-mer after treatment with pepsin, trypsin and chymotrypsin through the use of moAb G12-HRP.
  • C Western blot of the 33-mer peptide after treatment with gastrointestinal enzymes.
  • PM molecular weight marker. Two separate trials were performed with 3 repetitions each.
  • Figure 3 Detection of gluten in the feces of healthy individuals undergoing a controlled gluten diet.
  • HL901-HL911 subjects who participated in the study. * Traces of gluten were detected.
  • C and D SDS-PAGE and Western blot of gluten peptides and proteins extracted from feces.
  • PM molecular weight marker.
  • FIG. 4 Concentration of 33-mer peptide (ng / mg) in feces after a controlled gluten diet.
  • Competitive ELISA G12-HRP to know the relationship between ingested / excreted gluten proteins through its 33-mer peptide content.
  • the 33-mer peptide concentration was determined by with a standard 33-mer curve. Two trials were performed separately, each with three repetitions.
  • Example 1 Quantification of the toxic peptides of gliadin PWG obtained after simulation of gastrointestinal digestion.
  • the G12 moAb is specific for the 6 amino acid epitope SEQ ID No. 10, with 3 repetitions in the 33-mer peptide.
  • this antibody that is capable of recognizing other immunoreactive peptides contained in gliadins and other toxic prolamines.
  • the objective of this example is to show how it is to know the ability of the G12 antibody to detect the toxic peptides formed after the gastrointestinal simulation of gliadin.
  • gliadin PWG considered as an international reference reagent in gluten analyzes due to its high content of gliadins, its good solubility, its homogeneity, its stability and for being constituted by 28 European wheat cultivars (Eckert et al., 2006, J Cereal Sci., 43: 331-341).
  • Gliadin was subjected to sequential digestion with pepsin (the main protease present in the stomach), with trypsin and chymotrypsin (proteases contained in the intestinal membrane).
  • the samples were incubated at 37 ° C in HCI solution (pH 2) containing 0.06 mg / ml pepsin.
  • the samples were incubated for 60 min and deactivated by heat at 95 ° C for 5 min.
  • the digestions were adjusted to pH 6.0 with sodium phosphate buffer, and incubated with pancreatic proteases: trypsin (0.375 mg / ml) and chymotrypsin (0.375 mg / ml). After duodenal simulation at 37 0 C for 30 min and the samples they were immediately inactivated at 95 ° C for 5 min.
  • the protein profile of the prolamin fractions constituting the PWG gliadin was analyzed by SDS-PAGE in order to observe the pattern of bands obtained after the enzymatic treatment and confirm that the samples had been digested.
  • the samples were diluted in electrophoresis buffer (62.5 mM Tris-HCI at pH 6.8; 10% glycerol; 2% SDS; 0.001% bromophenol blue and 5% 2-mercapto-ethanol) and denatured by boiling at 100 ° C for 5 min. This step was repeated a total of three times.
  • the samples were run on 15-18% polyacrylamide gels (SDS-PAGE) at a constant voltage of 100 V using the MiniProtein system (BioRad Laboratories). The proteins separated in the electrophoresis gel were stained using silver staining.
  • the membranes were incubated with the secondary anti-mouse IgG antibody conjugated to phosphatase (Sigma, Mr. Louis, MO) (1: 2000 dilution in blocking solution). The membrane was revealed using the Sigma-Fast system.
  • the G12 antibody was able to recognize the different fractions that make up the PWG gliadin. After gastric digestion, the peptide fragments formed continued to be recognized by the G12 antibody ( Figure 1B). Sequential treatment with pancreatic enzymes (trypsin, chymotrypsin) resulted in the presence of smaller peptides also recognized by moAb G12.
  • the concentration of 33-mer and analogous peptides obtained after gastrointestinal simulation of gliadin PWG was determined by competitive ELISA, also using the G12 antibody.
  • Competitive ELISA is a very appropriate technique for monitoring gluten digestion, since it is able to detect both intact proteins and small protein fragments: the latter could be underestimated with sandwich ELISA, because for the detection of antigens it requires at least two different epitopes per peptide molecule.
  • the relative amount of immunotoxic epitopes contained in the samples was quantified by competitive ELISA with the use of the G12-HRP moAb (Biomedal SL, Seville, Spain).
  • G12-HRP moAb Biomedal SL, Seville, Spain.
  • Maxisorp microtiter plates (Nunc, Roskilde, Denmark) were used which were coated with 100 ⁇ / ⁇ gliadin Sigma solution (5 ⁇ g mL) in 0.1 M PBS (Na 2 C0 3- NaHC0 3 , pH 9.6), and incubated at 4 ° C overnight.
  • the plates were washed with PBS 0.05% Tween® 20 and blocked with a solution of blocking (PBS, 5% skim milk) for 1 h at room temperature.
  • the ability of the G12 moAb to detect hydrolysates was evaluated by a rapid gluten detection system, immunochromatographic strips based on the G12 moAb (GlutenTox stick, Biomedal S.L.).
  • the detection limit of gliadin and hydrolyzed gliadin was 30 ng / ml (6 ppm gluten) and 50 ng / ml (10 ppm hydrolyzed gluten), respectively, while for 33-mer peptide and 33 peptide -mer subjected to digestion was 0.5 ng / mL in both cases.
  • Example 2 Detection and semiquantification of gluten peptides / proteins in feces of healthy individuals under a controlled gluten diet.
  • the subjects were instructed to follow a diet in which they controlled the type and amount of gluten consumed during the 15 days of this study.
  • the subjects consumed a strict gluten-free diet for a week.
  • the next 4 days, 9 g of unprocessed gluten were ingested, distributed in the three meals of the day.
  • the gluten dose was increased to 30 g, similarly distributed.
  • Prolamines were extracted by mixing 1 g of feces with 10 ml of 60% (v / v) ethanol on a rotary shaker for 1 h at room temperature. The suspension was centrifuged at 13,000 x g for 10 min and the supernatant was removed. The positive control, gliadin PWG, was also prepared in 60% ethanol (v / v) at a concentration of 1 mg / ml.
  • the stool sample was taken from the analyzed individuals, who maintained a normal diet in which gluten was present (bread, pasta, cookies, etc.).
  • the presence of gluten polypeptides in fecal extracts was determined semiquantitatively using immunochromatographic strips based on the G12 antibody, in serial dilutions of the sample with the aim of representing a wide range from less than 6 ppm to more than 500 ppm.
  • the samples were diluted (1: 10 to 1: 20,000) in the dilution solution proposed by the manufacturer (6, 25, 50, 100, 250 and 500 ppm of gluten were tested).
  • the immunochromatographic strips were immersed in the different samples (300 ⁇ ) for 10 min and allowed to air dry. In this case, all individuals presented an excretion of gluten proteins / peptides in feces with values above 500 ppm ( Figure 3A and 3B).
  • the proposed calendar took into account that in healthy people the transit time is 45 ⁇ 16 hours (mean ⁇ standard deviation) with a diet rich in fiber and more than 70 hours in diets low in fiber (Stasse-Wolthuis et al., 1979, Am J Clin Nutr., 32: 1881-1888).
  • the partial digestion of the reactive peptides with the antibody used in the invention can be determined by an ELISA method, by the most suitable method and widely used in clinical analysis, by combining simplicity, sensitivity and economy.
  • sandwich ELISA systems are designed to quantify intact proteins, but may underestimate hydrolyzed gluten.
  • the passage of gluten through the gastrointestinal tract results in the hydrolysis of most of it: a competitive ELISA is able to quantify toxic peptides, even at the level of a few amino acids, therefore it would be a convenient method for quantification.
  • the objective of this study was to determine the concentration of toxic peptides present in feces of healthy individuals by competitive ELISA G12, using the 33-mer peptide as the standard curve. Each experiment was carried out in triplicate on separate days. All statistical analyzes were performed with the SPSS program for Windows. The data were expressed as mean, maximum, minimum and 25th and 75th percentile values. The differences between the groups were examined using the Friedman test and the Wilcoxon test to compare two related samples. The statistical probability of p ⁇ 0.05 was considered significant.
  • the stool samples analyzed were those corresponding to the intake periods: uncontrolled diet, GSD, GSD + 9 g and GSD + 30 g.
  • Stool samples collected during the period in which the individuals maintained a gluten-free diet had toxic peptide levels below the quantification limit of the method (5.4 pg 33-mer / mg sample).
  • immunoreactive peptides were detected in feces, being in the range between 3.49 and 9.62 ng of 33-mer / mg of feces, 600 times higher than the detection limit of the method.

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Abstract

La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrían aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celíaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.

Description

Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas
OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención, encuadrada en el sector médico-clínico, muestra un procedimiento para la monitorización de la ingestión de gluten mediante la medida de las proteínas/péptidos del gluten en heces con anticuerpos frente a péptidos inmunogénicos resistentes a digestión gastrointestinal. La presencia o ausencia de dichos péptidos inmunogénicos es controlada por ensayos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente a péptidos inmunogénicos del gluten que son resistente a proteólisis. Dichos ensayos pueden ser técnicas cuantitativas ELISAs, o cualitativos como ensayos inmunocromatográficos rápidos, inmunoblots, etc. Estas medidas también se podrían aplicar para verificar el cumplimiento de la dieta sin gluten, para mejorar el diagnóstico en casos de síntomas refractarios o agudos de la enfermedad celíaca en casos donde supuestamente se está respetando una dieta sin gluten, o a la investigación clínica de la efectividad de las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El gluten es un conjunto de proteínas de almacenamiento de los cereales. Las proteínas del gluten procedentes del trigo, la cebada, el centeno y, probablemente la avena, no son toleradas por individuos predispuestos genéticamente que padecen la enfermedad celíaca (EC). En el trigo, el gluten está compuesto por una fracción soluble en etanol (prolaminas: α, β, γ y ω-gliadinas); y otra insoluble, gluteninas (de alto y bajo peso molecular) (Wieser, 2007, Food Microb¡ol., 24:115-119; Fasano, 2009, Sci Am., 301 :54-61). Las gliadinas, así como también las gluteninas, son inusualmente ricas en residuos de prolina (~15%) y glutamina (~35%). Como resultado, mientras que la mayoría de las proteínas de la dieta son digeridas mediante proteasas gastrointestinales a aminoácidos simples, dipéptidos o tripéptidos, las proteínas del gluten no son completamente digeridas (Erickson y Kim, 1990, Annu Rev Med., 41 :133-139; Gray, 1991 , New York xford University, pp.411-420; Ganapathy y col., 2006, Academic Press, pp.1667-1692). Por lo tanto, algunos de los péptidos del gluten generados durante la digestión gastrointestinal son altamente resistentes a la digestión por parte de las enzimas gástricas y pancreáticas, por lo que persisten en el intestino. Estos péptidos son capaces de internalizarse en las células intestinales y, como consecuencia, los residuos de glutamina que poseen pueden ser desaminados por la transglutaminasa tisular (tTG). La predisposición genética de los individuos con EC hace que sean intolerantes a dichos péptidos debido a que su sistema inmunológico reacciona de manera patológica contra autoantígenos resultantes de la interacción - péptidos del gluten/tTG- (Korponay-Szabó y col., 2007, BMJ, 335:1244-1247; Bethune y Khosla, 2008, PloS Pathogens, 4:e34; Jabri y Sollid, 2009, Nat Rev Immunol., 9:858- 870). Los péptidos desaminados inducen una reacción inmunológica mediada por células T que ocasiona inflamación crónica del intestino delgado. Las vellosidades intestinales son destruidas debido a la reacción inmunológica, produciéndose disminución de la absorción intestinal que puede dar lugar a síntomas como diarrea, anemia, retraso en el crecimiento, pérdida de peso, desórdenes óseos, complicaciones neurológicas, cáncer, etc. (Alaedini y Green, 2005, Ann Int Med., 142:289-299; Catassi y Fasano, 2008, Curr Opin Gastroenterol., 24:687-691 ; Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213).
Uno de los principales péptidos del gluten descritos hasta la fecha es el péptido 33-mer de la a2-gliadina (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Bethune y col., 2009, Chem Biol., 16:868-881) que ha demostrado ser resistente a la digestión gastrointestinal, sustrato de la desaminación mediada por la tTG y altamente reactivo frente a las células T aisladas de pacientes celíacos. La identificación del péptido 33- mer, así como otros péptidos, contribuye a demostrar que los epítopos del gluten con elevada antigenicidad están localizados en regiones de las gliadinas ricas en residuos de prolina y glutamina (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Tye-Din y col., 2010, Sci Transí Med., 2:41 ra51).
La única terapia existente a día de hoy para los pacientes celíacos es una rigurosa dieta sin gluten (DSG). El incumplimiento de la DSG se ha asociado con osteoporosis, anemia por deficiencia de hierro, depresión e infertilidad, todo lo cual se mejora, en cierta medida, mediante la adhesión a la dieta libre de gluten. Estas observaciones nos dan una idea de la importancia de la adherencia a una DSG para reducir los síntomas, evitar deficiencias nutricionales y mejorar la calidad de vida del paciente. Sin embargo, varios estudios basados en biopsias intestinales han sugerido que las transgresiones de la dieta son relativamente frecuentes, estando entre el 32,6% y el 55,4% en las poblaciones estudiadas (Ciacci y col., 2002, Digestión, 66:178-185; Silvester y Rashid, 2007, Can J Gastroenterol., 21 :557-564). La falta de adherencia a una dieta libre de gluten de manera estricta es la principal razón de enfermedad celíaca mal controlada en adultos.
Así mismo existe una parte de la población celíaca que no parece responder de manera positiva a la DSG y sufren síntomas de malabsorción persistente o recurrente y atrofia de las vellosidades intestinales. Esta población podría ser sospechosa de padecer EC refractaria, una enfermedad rara (aproximadamente el 5%-10% de los pacientes con EC) que aparece en los pacientes sin aparente respuesta positiva a la dieta libre de gluten (Al-Toma y col., 2007, Dig Dis, 25:230-236; Freeman, 2009, Gut Liver, 3:237-246; Rubio-Tapia y Murray, 2010, Gut, 59:547-557). Aunque esta enfermedad refractaria fue descrita en pacientes con supuesta ausencia total de ingesta de gluten, la ingestión involuntaria y la hipersensibilidad a una pequeña cantidad de gluten también pueden desencadenar los síntomas propios de la patología. La falta de un marcador preciso para el control del cumplimiento de la DSG es pues todavía una cuestión sin resolver y es especialmente difícil en el caso de leves transgresiones dietéticas (Fernández-Calle y col., 1993, Gut, 34:774-777). No hay manera de demostrar la ingesta de gluten y así evitar posibles secuelas nocivas, de hecho sólo se puede medir las consecuencias de las transgresiones dietéticas observando la inflamación de las mucosas y/o la atrofia vellositaria para lo cual se tendría que realizar biopsias intestinales y como consecuencia anestesiar al paciente con las posibles consecuencias que ello pueda tener.
El control de la anti-tTG, que ha sido propuesto como un marcador para evaluar el estricto cumplimiento de la DSG, sin embargo la eficacia de dicho marcador para controlar la ingesta de gluten aún no está clara (Tack y col., 2010, Gastroenterol Hepatol., 7:204-213). Otros marcadores han sido propuestos para el seguimiento de la dieta, como por ejemplo la prueba de permeabilidad (Duerksen et al., 2005) o la calprotectina fecal (Ertekin y col., 2010, J Clin Gastroenterol., 44:544-546.) Estos métodos pueden mostrar que existen procesos inflamatorios, de tal manera que si los valores de estos marcadores se encuentran modificados puede ser como consecuencia de enfermedades infecciosas, enfermedades inflamatorias intestinales o de procesos de alergia, lo que significa que no tienen por qué ser una medida del consumo directo de gluten. Por lo tanto, no existe un método eficaz para comprobar que el enfermo celíaco esté realizando una DSG o descartar la posibilidad de que los síntomas de la EC refractaria sean debidos a una intolerancia hipersensible a trazas de gluten asociada a una exposición involuntaria a los cereales tóxicos.
El cumplimiento de la dieta evaluado mediante entrevista ha sido sugerido como marcador de control de la EC por su bajo coste, su no invasividad, y su demostrada correlación con el daño intestinal. Sin embargo, la DSG supone numerosas restricciones para los pacientes debido a sus implicaciones sociales y económicas. Además, una dieta libre de gluten es difícil de mantener debido a la ubicuidad del gluten en los alimentos, a la desinformación educativa, a las variaciones en el etiquetado de los alimentos y a la posible contaminación cruzada de éstos (Bethune y col., 2009, Chem Biol., 16:868-881 ; Selimoglu y Karabiter, 2010, J Clin Gastroenterol., 44:4-8). Por otra parte, ciertos estilos de vida y algunos sectores de la población dificultan, en cierta medida, el cumplimiento de la DSG. Además no existe una alternativa a las entrevistas a los pacientes para conocer cuánto de fiables son los resultados obtenidos de estos estudios clínicos.
Una medida más directa sobre la ingestión de gluten podría proporcionar información crítica sobre el paciente: la detección del incumplimiento de la DSG antes del daño anatómico, la detección del consumo inadvertido, la evaluación de la exactitud de la adherencia al tratamiento en el periodo inicial tras el diagnóstico cuando los pacientes están menos familiarizados con la dieta, etc., proporcionando una confirmación fácil y fiable de los resultados obtenidos. Por tanto, un marcador sensible y fiable para monitorizar y detectar la ingesta de gluten podría ser una herramienta útil para el correcto cumplimiento de la DSG y, probablemente, para un diagnóstico preciso de la EC refractaria.
Los anticuerpos monoclonales (moAbs) G12 y A1 obtenidos frente al principal epítopo inmunogénico de la α-gliadina han demostrado ser muy útiles en la detección de péptidos tóxicos en muestras de alimentos, así como en investigación clínica de desintoxicación enzimática del gluten (Morón y col., 2008, Am J Clin Nutr., 87:405-414; Morón y col., 2008, PloS ONE, 3:e2294; Ehren y col., 2009, PloS ONE, 4:e6313; Alvine Pharmaceuticals, Inc., Biomedal S.L.). La sensibilidad y especificidad de los anticuerpos monoclonales y su capacidad para reconocer péptidos resistentes a la digestión gastrointestinal los podrían hacer ideales para la monitorización de péptidos inmunotóxicos del gluten obtenidos tras digestión intestinal en muestras humanas. Los epítopos de reconocimiento del moAb G12, QP(Q/E)LP(Y/F), están presentes en los principales péptidos descritos recientemente en un rastreo de alto rendimiento realizado con 2.700 péptidos procedentes de prolaminas de diferentes cereales (Tye- Din y col., 2010, Sci Transí Med., 2:41 ra51). Los fragmentos peptídicos no digeridos procedentes de la ingesta de gluten y no absorbidos, podrían ser recuperados de las heces, lo que demostraría la ingesta de gluten del individuo.
En esta patente, hemos evaluado la viabilidad de la monitorización de gluten intacto y digerido en las heces mediante la detección de epítopos relacionados con el péptido 33-mer, que podría ser aplicada en estudios clínicos y de seguimiento de la dieta, así como también, en el diagnóstico de la EC refractaria. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La dieta sin gluten es el único tratamiento efectivo a día de hoy para la enfermedad celíaca. Por ello, el cumplimiento de la DSG en los pacientes debe ser monitorizado para evitar daños acumulativos directos e indirectos, así como también, para confirmar que la persistencia de cualquier síntoma típico de la celíaca no se debe a una infracción(voluntaria o no) de la dieta. Sin embargo, actualmente no se dispone de métodos para controlar el cumplimiento de la dieta en pacientes con enfermedad celíaca.
La presente invención tiene como objeto la aplicación de métodos inmunológicos para monitorizar el cumplimiento de la dieta libre de gluten mediante la detección en heces de péptidos inmunotóxicos resistentes a digestión gastrointestinal. Es objeto de la invención la aplicación de técnicas inmunológicas basadas en anticuerpos que reconocen péptidos inmunogénicos del gluten que resisten la digestión gastrointestinal. Preferentemente, la invención emplea técnicas inmunológicas que usan anticuerpos que reconocen el péptido 33-mer de la gliadina. Se tendría una forma preferente de realizarse la detección de los péptidos mediante métodos cualitativos rápidos basado en tiras inmunocromatográficas o bien por métodos cuantitativos y automatizables como las técnicas de ELISA. El método preferente usado en la invención debe permitir detectar gluten ingerido equivalente a 50 mgs de gluten de trigo por día, que es la cantidad máxima descrita para una dieta sin gluten, o en su caso un mínimo de 20 ppms de gluten equivalente en heces.
Es objeto también de la presente patente kits o dispositivos analíticos inmunológicos basados en anticuerpos reactivos frente al 33-mer de gliadina que estén indicados para la detección de los péptidos del gluten en heces.
Dicho procedimiento y kits analíticos tienen también su objeto de la patente en su uso para revelar la falta de adherencia a la DSG, ya sea debido a la contaminación de los alimentos consumidos o a una ingesta voluntaria/involuntaria ocasional de alimentos que contienen gluten. Además, es objeto de la presente invención la aplicación de la detección de dichos péptidos inmunotóxicos en heces para el control de la investigación clínica sobre la enfermedad celíaca, incluidas las terapias enzimáticas relacionadas con desintoxicación de las prolaminas del gluten, secuestrantes de péptidos inmunotóxicos, y otras terapias alternativas.
El objeto de la presente invención lo constituye un procedimiento para detección o monitorización del gluten ingerido mediante detección de péptidos inmunotóxicos en las heces, caracterizado por el uso de métodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen, preferentemente a epítopos relacionados con el péptido 33-mer de la gliadina y otras secuencias peptídicas resistentes a las digestión gastrointestinal.
Es objeto de la presente invención el uso de técnicas inmunológicas para dicha monitorización de gluten, métodos inmunológicos tales como ELISA indirecto, ELISA competitivo, ELISA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, Western blot, biosensores basados en reacciones electroquímicas catalizadas por enzimas acoplados a los anticuerpos, por partículas magnéticas tapizadas por anticuerpos, por resonancia de plasmones superficiales, y demás técnicas en las que se detecta la unión de un analito a un anticuerpo.
En una forma preferente de la invención, estos métodos se caracterizan porque emplean preferentemente uno o varios anticuerpos monoclonales con capacidad para detectar epítopos contenidos o similares al péptido 33-mer (SEQ ID N° 1), como pueden ser las secuencias siguientes: SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8. En una forma preferente de la invención los anticuerpos usados por las técnicas inmunológicas serían el G12 y el A1 por su demostrada relación de su reactividad con la potencial inmunotoxicidad de una muestra. También contempla la invención el uso del anticuerpo R5 que reacciona con el epítopo SQ ID N° 9, que también puede hallarse en péptidos del gluten resistente a digestión gastrointestinal, pero con menor especificidad antes péptidos inmunogénicos resistentes a las proteasas.
Una forma preferente de la invención sería el empleo de métodos inmunológicos basados en el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permita un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes. Este procedimiento podría usar un patrón de gliadina, gliadina hidrolizada, péptido 33-mer completo o una parte de su secuencia de al menos 6 aminoácidos (SEQ ID N° 2).
Otro objeto de la invención lo constituyen el uso particular de tiras inmunocromatográficas basadas en los anticuerpos anti-33-mer de gliadina, G12 y A1 que permiten una detección semicuantitativa y rápida de los péptidos/proteínas del gluten contenidos en las heces.
La invención propone una medida del gluten ingerido por el individuo a través de la dieta. Se trata de un procedimiento útil para el control del gluten ingerido mediante el empleo de métodos analíticos en los que se ha demostrado una correlación entre la cantidad de gluten ingerida y las estimaciones de proteínas/péptidos del gluten en heces obtenidas a través de estos procedimientos.
La invención propone un instrumento analítico para la monitorización del cumplimiento de la DSG, así como también para descartar la ingesta no controlada de gluten en los pacientes sospechosos de sufrir la llamada enfermedad celíaca refractaria. Además, con este procedimiento, las nuevas alternativas terapéuticas para la desintoxicación enzimática del gluten y otra terapias alternativas también podrán ser controladas en las heces de los pacientes celíacos sometidos a ensayos clínicos o a una prescripción terapéutica en el futuro, ya que la efectividad de la terapia se podría determinar midiendo la presencia o ausencia de péptidos en heces tras 12-48 horas de la ingesta de alguna cantidad controlada de gluten junto con las terapias que eliminen los péptidos inmunotóxicos
Cuestiones aún sin resolver en la práctica clínica, como son el control de una DSG o el control de la exposición involuntaria al gluten por contaminación de los alimentos, podrían ser resueltas con simples ensayos inmunológicos de las heces. Médicos, clínicos y analistas podrían considerar útiles estos métodos para el diseño de ensayos clínicos y seguimientos de sus pacientes celíacos a para establecer conclusiones coherentes sobre el estado de la enfermedad del paciente.
La extracción de los péptidos en las heces se puede llevar a cabo directamente con una solución hidroalcohólica del 40 al 60%. En algunas ocasiones por la naturaleza del alimento ingerido, podría mejorarse la extracción del gluten en heces añadiendo una solución con agentes dispersantes como el cloruro de guanidinio, el cloruro de arginina, etc; o bien detergentes como la polivinilpirrolidona, y agentes reductores como el b-mercaptoetanol, el DTT o el TCEP. Posteriormente los polipéptidos del gluten extraídos se diluyen en una solución salina tamponada y se usan entonces para hacer la medida con un ELISA, bien competitivo, bien sandwich si se quiere tener una idea de la concentración de los péptidos reactivos. La recta patrón se podría hacer con gliadina estándar pepsino- tripsinada, para simular su digestión gástrica, También se podría usar directamente polipéptido sintetizado que reaccione con los anticuerpos, preferentemente, el 33-mer de gliadina o fragmentos del mismo con la opción de poner algunas modificaciones puntuales que mantengan la reactividad frente a los anticuerpos. Así por ejemplo se podrían usar los péptidos siguientes para los anticuerpos G12: SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, y SEQ ID N° 4. Para el A1 además del 33-mer serían válidos los péptidos SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7 o SEQ ID N° 8 para hacer la recta patrón con un ELISA competitivo.
Para un ensayo cualitativo en las que se viera si el valor de polipéptidos del gluten en heces es mayor o menor de una cierta cantidad, se podría usar una tiras inmunocromatográficas que usen el anticuerpo G12 o A1 o bien ambos. El procedimiento se podría llevar a cabo con un kit que contuviese la solución de extracción de los polipéptidos en heces; un patrón de referencia con polipéptidos del gluten hídrolizados por pepsina y tripsina o bien sintetizados; y los componentes de un ELISA con una placa multipocillo y usando los anticuerpos A1 y/o G12 para inmovilizar los pocilios y/o para el revelado del ensayo, o bien tiras inmunocromatográficas.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, de acuerdo con un ejemplo preferente de realización práctica del mismo, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, con carácter ilustrativo y no limitativo, las figuras siguientes: Figura 1. Afinidad relativa del moAb G12 frente a péptidos inmunotóxicos derivados de la gliadina PWG tras simulación de la digestión gastrointestinal. A y B. SDS-PAGE y Western blot de gliadina PWG, PWG gliadina + pepsina y gliadina PWG + pepsina + tripsína/quimotripsina. Las muestras fueron teñidas con plata o transferidas a una membrana de PVDF con el moAb G12. PM: marcador de peso molecular. C. Análisis mediante ELISA competitivo G12- HRP de los péptidos procedentes de la gliadina PWG.
Figura 2. Resistencia del péptido 33-mer a la ruptura mediante enzimas gastrointestinales. A. Secuencia de aminoácidos del péptido 33-mer. La secuencia de reconocimiento del moAb G12 en el péptido 33-mer aparece en negrita. B. ELISA competitivo para la detección de 33-mer tras tratamiento con pepsina, tripsina y quimotripsina mediante el uso del moAb G12-HRP. C. Western blot del péptido 33-mer tras tratamiento con enzimas gastrointestinales. PM: marcador de peso molecular. Se realizaron dos ensayos por separado con 3 repeticiones cada uno.
Figura 3. Detección de gluten en las heces de individuos sanos sumetidos a una dieta controlada de gluten. A y B. Semicuantificación de péptidos/proteínas del gluten en las heces de individuos sanos (n=11) mediante inmunocromatográfica G12. La franja azul es un control interno positivo que indica que el dispositivo ha funcionado correctamente, y la franja rosa indica la presencia de gluten. HL901-HL911 : sujetos que intervinieron en el estudio. *Se detectaron trazas de gluten. C y D. SDS-PAGE y Western blot de los péptidos de gluten y proteínas extraídas de las heces. PM: marcador de peso molecular.
Figura 4. Concentración de péptido 33-mer (ng/mg) en las heces tras una dieta controlada de gluten. ELISA competitivo G12-HRP para conocer la relación entre las proteínas del gluten ingeridas/excretas mediante su contenido en péptido 33-mer. La concentración de péptido 33-mer se determinó mediante con una curva estándar de 33-mer. Dos ensayos se realizaron por separado, cada uno con tres repeticiones.
REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1. Cuantificación de los péptidos tóxicos de la gliadina PWG obtenidos tras simulación de la digestión gastrointestinal.
En el presente ejemplo se muestra como una parte sustancial de los péptidos inmunogénicos del gluten, permanecen susceptibles de detección en heces a pesar de la digestión gastrointestinal. Entre las principales proteínas de la dieta, las que forman parte del gluten son las únicas que contienen aproximadamente un 15% de residuos de prolina y un 35% de residuos de glutamina. El alto contenido en estos dos aminoácidos impide la completa proteolisis de estas proteínas por parte de las enzimas gástricas y pancreáticas, de manera que se forman fragmentos peptídicos en el intestino delgado que son inmunotóxicos para los pacientes celíacos. En particular, el peptido 33-mer fue encontrado como uno de los principales contribuyentes de la inmunotoxicidad del gluten (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279). Este péptido de la a-2 gliadina contiene 6 epítopos de reconocimiento de las células T y es altamente resistente a la proteolisis.
El moAb G12 es específico para el epítopo de 6 aminoácidos SEQ ID N° 10, con 3 repeticiones en el péptido 33-mer. Además, es este anticuerpo es capaz de reconocer otros péptidos inmunoreactivos contenidos en las gliadinas y otras prolaminas tóxicas. El objetivo de este ejemplo es mostrar como es conocer la capacidad del anticuerpo G12 para detectar los péptidos tóxicos formados tras la simulación gastrointestinal de la gliadina. Para la estandarización de este ensayo se utilizó la gliadina PWG, considerada como un reactivo de referencia internacional en los análisis de gluten debido a su alto contenido en gliadinas, su buena solubilidad, su homogeneidad, su estabilidad y por estar constituida por 28 cultivares de trigo europeo (Eckert y col., 2006, J Cereal Sci., 43:331-341).
La gliadina fue sometida a digestión secuencial con pepsina (la principal proteasa presente en el estómago), con tripsina y quimotripsina (proteasas contenidas en la membrana intestinal). Las muestras fueron incubadas a 37 °C en solución de HCI (pH 2) que contenía 0,06 mg/ml de pepsina. Las muestras fueron incubadas durante 60 min y se desactivaron mediante calor a 95 °C durante 5 min. Después de la simulación gástrica con pepsina, las digestiones se ajustaron a pH 6.0 con tampón fosfato sódico, e incubados con proteasas pancreáticas: tripsina (0,375 mg/ml) y quimotripsina (0,375 mg/ml). Tras la simulación duodenal a 37 0 C durante 30 min y las muestras fueron inmediatamente inactivadas a 95 °C durante 5 min.
El perfil proteico de las fracciones de prolaminas que constituyen la gliadina PWG fue analizado mediante SDS-PAGE con el fin de observar el patrón de bandas obtenido tras el tratamiento enzimático y confirmar que las muestras habían sido digeridas. Para el análisis mediante SDS-PAGE, las muestras fueron diluidas en tampón de electroforesis (62.5 mM Tris-HCI a pH 6,8; 10% glicerol; 2% SDS; 0,001% azul de bromofenol y 5% 2-mercapto-etanol) y desnaturalizadas mediante ebullición a 100°C durante 5 min. Este paso se repitió un total de tres veces. Las muestras se corrieron en geles de poliacrilamida al 15-18% (SDS-PAGE) a un voltaje constante de 100 V utilizando el sistema MiniProtein (BioRad Laboratories). Las proteínas separadas en el gel de electroforesis, fueron teñidas usando tinción de plata.
El estudio de la gliadina PWG intacta mediante gel 1 D reveló bandas intensas de alfa, beta y gamma gliadinas (Pm= 33-45 kDa) y bandas débiles de omega gliadina (Pm= 50-67 kDa) (Eckert y col., 2006, J Cereal Sci., 43:331-341). La digestión de estas proteínas mediada por pepsina (digestión gástrica) dio lugar a la formación de fragmentos peptídicos de menor tamaño, inferiores a 25 kDa. Secuencialmente, la digestión con tripsina y quimotripsina generó péptidos más pequeños (inferiores a 15 kDa), como consecuencia del proceso de hidrólisis mediado por estas enzimas (Figura 1A). Con el objetivo de comprobar si los péptidos de la gliadina PWG obtenidos mediante el proceso de digestión gastrointestinal eran reconocidos por el anticuerpo anti-33-mer se realizó un Western blot con dicho anticuerpo de las muestras descritas anteriormente: gliadina PWG sin digerir, gliadina PWG sometida a digestión gástrica y gliadina PWG sometida a digestión intestinal (previa digestión gástrica). Los extractos proteicos obtenidos inicialmente fueron separados mediante gel SDS-PAGE y seguidamente incubados con el anticuerpo G12 en membranas de PVDF. Posteriormente, se incubaron en tampón de bloqueo (TBS con leche desnatada al 5%) durante toda la noche, tras lo cual se añadió el anticuerpo G12 (dilución 1 :5000 en solución de bloqueo). Después de 3 lavados, las membranas fueron incubadas con el anticuerpo secundario anti-mouse IgG conjugado a fosfatasa (Sigma, Sr. Louis, MO) (dilución 1 :2000 en solución de bloqueo). La membrana se reveló utilizando el sistema Sigma-Fast.
El anticuerpo G12 fue capaz de reconocer las distintas fracciones que componen la gliadina PWG. Tras digestión gástrica, los fragmentos peptídicos formados continuaron siendo reconocidos por el anticuerpo G12 (Figura 1B). El tratamiento secuencial con enzimas pancreáticas (tripsina, quimotripsina) dio lugar a la presencia de péptidos más pequeños también reconocidos mediante moAb G12.
Con el fin de conocer la capacidad del anticuerpo G12 para cuantificar los péptidos tóxicos generados, se determinó la concentración de 33-mer y péptidos análogos obtenidos tras simulación gastrointestinal de la gliadina PWG mediante ELISA competitivo, usando igualmente el anticuerpo G12. El ELISA competitivo es una técnica muy apropiada para el seguimiento de la digestión del gluten, ya que es capaz de detectar tanto proteínas intactas como pequeños fragmentos de proteínas: estos últimos podrían ser subestimados con ELISA sándwich, debido a que para la detección de antígenos requiere como mínimo dos epítopos diferentes por molécula de péptido.
La cantidad relativa de epítopos inmunotóxicos contenida en las muestras se cuantificó mediante ELISA competitivo con el uso del moAb G12-HRP (Biomedal S.L., Sevilla, España). Para este ensayo se usó placas Maxisorp microtiter (Nunc, Roskilde, Dinamarca) que fueron recubiertas con 100 μί/ροαΙΙο de solución de gliadina Sigma (5 μg mL) en 0,1 M de PBS (Na2C03-NaHC03, pH 9,6), e incubadas a 4°C toda la noche. Las placas fueron lavadas con PBS 0,05% Tween® 20 y bloqueadas con solución de bloqueo (PBS, 5% leche desnatada) durante 1 h a temperatura ambiente. Se realizaron diluciones seriadas del patrón (gliadina o péptido 33-mer) y de las muestras de estudio en PBS con BSA 3% (100 μΙ_) y a cada una de ellas se añadió 100 μΙ_ de solución de moAb G12 conjugado con HRP (1 :10.000 en PBS con BSA 3%). Se preincubaron las muestras 1 h a temperatura ambiente con agitación suave, y posteriormente se añadieron en los pocilios. Tras 30 minutos de incubación, se lavaron las muestras, y se les añadió 100 μ-Jpocillo de solución de sustrato (TMB, Sigma, St. Louis, Missouri, EE.UU.). Trascurridos 30 minutos de incubación a temperatura ambiente en oscuridad, se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 1 M (100 μί/ροαΙΙο), y la absorbancia se midió a 450 nm (Lector de microplacas UVM340, Asys Hitech GMBH, Eugendorf, Austria). La concentración de gliadina/33-mer se determinó usando el modelo de los 4 parámetros.
Con este método, se determinó la concentración de 33-mer tanto en la gliadina PWG intacta como sometida a digestión gástrica y a digestión intestinal. La digestión gástrica de la gliadina PWG dio lugar a un ligero aumento en los niveles de péptido tóxico. Posiblemente este aumento es debido a la apertura de las moléculas que constituyen las fracciones de gliadina, de esta manera los epítopos del anti-33-mer presentes quedan más accesibles, y por tanto, se identifican con mayor especificidad (gliadina PWG intacta=21 ,6 ng 33-mer/ g vs. Gliadina PWG digestión gástrica=24,5 ng 33-mer/Mg). Tras el proceso sucesivo de digestión intestinal el moAb G12 continúa reconociendo los péptidos de la gliadina PWG formados, aunque con menor especificidad (7,5 ng 33-mer/ g) (Figura 1C).
En contraste con estos resultados, estudios in vitro e in vivo realizados con el péptido 33-mer demuestran la gran estabilidad de este péptido a la ruptura mediante endoproteasas gástricas, pancreáticas e intestinales. Sus características hacen que sea sugerido como el principal promotor de la respuesta inflamatoria al gluten en pacientes celíacos (Figura 2A) (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; 2005, J Proteome Res., 4:1732-1741).
Con el objetivo de verificar que el péptido 33-mer permanece intacto tras proteólisis gástrica (mediada por pepsina) y secuencial proteólisis intestinal (mediada principalmente por tripsina y quimotripsina) se realizó una simulación in vitro de la digestión gastrointestinal de dicho péptido. Las concentraciones de péptido 33-mer obtenidas tras cada uno de los procesos de digestión se determinaron mediante ELISA competitivo usando el anticuerpo monoclonal anti-33-mer. La concentración de 33-mer obtenida tras digestión gástrica no varió significativamente con respecto al péptido no sometido a digestión (194 pg/mL vs. 186 Mg/mL, respectivamente, p=0,4469). Igualmente, la exposición del 33-mer a las enzimas tripsina y quimotripsina (digestión intestinal), no supuso una variación de los niveles de este péptido en comparación con el péptido no tratado (169 pg/mL vs. 186 g/mL, respectivamente, p=0,1024) (Figura 2B). Estos resultados confirman la gran estabilidad del 33-mer a la hidrólisis por parte de las enzimas implicadas en el proceso digestivo.
Los resultados obtenidos mediante ELISA fueron confirmados mediante análisis Western blot. Tricina-SDS-PAGE y Western blot se realizaron en condiciones estándar (Sousa y col., 2001 , Mol Cellular Biol., 7:204-213). El inmunobotting mostró bandas de aproximadamente 3,5 kDa tanto en la muestra que conteína 33-mer no procesado como en aquella que contenía 33-mer sujeto a digestión gastrointestinal (Peso molecular teórico 33-mer 3,9 kDa, PIR, Protein Information Resource, Georgetown University Medical Center, E.E.U.U.) (Figura 2C).
Del mismo modo, la capacidad del moAb G12 para detectar hidrolizados se evaluó mediante un sistema de detección rápida de gluten, las tiras inmunocromatográficas basadas en el moAb G12 (GlutenTox stick, Biomedal S.L.). El límite de detección de la gliadina y la gliadina hidrolizada fue de 30 ng/ml (6 ppm de gluten) y 50 ng/ml (10 ppm de gluten hidrolizado), respectivamente, mientras que para el péptido 33-mer y el péptido 33-mer sometido a digestión fue de 0,5 ng/mL en ambos casos. Estos resultados sugieren que el método de análisis presenta una alta sensibilidad tanto frente a las proteínas/péptidos intactos como frente a sus respectivos hidrolizados.
Los resultados obtenidos mediante Western blot, ELISA competitivo y tiras inmunocromatográficas sugieren que el anti-33-mer G12 podría ser usado para controlar la presencia de los péptidos tóxicos de la gliadina y otras prolaminas de gluten durante el proceso digestivo. Al menos un tercio de los péptidos reactivos para G12 se mantuvieron resistentes a la digestión gastrointestinal. Por lo tanto, una parte sustancial de los epítopos de las prolaminas de los alimentos ingeridos que fueron detectados con moAb G12 podrían ser resistentes a la digestión gastrointestinal y su detección podría ser adecuada en el tubo gastrointestinal.
Ejemplo 2. Detección y semicuantificación de péptidos/proteínas del gluten en heces de individuos sanos sometidos a una dieta controlada de gluten.
En el presente ejemplo se muestra como ocurre la digestión que sufren las proteínas del gluten in vivo en individuos sanos y como determinar la capacidad del moAb G12 para detectar dichas proteínas/péptidos excretados a través de las heces. Se llevó a cabo un ensayo en el que se controló el tipo y la cantidad de gluten consumido en individuos sanos (n=11 , 7 mujeres y 4 hombres, edad media 24-42 años). Los criterios de inclusión comprenden la ausencia de enfermedades, síntomas digestivos, medicamentos, antibióticos en los últimos dos meses y ausencia de historia familiar de EC. Todos los participantes fueron evaluados para la EC, mostraron niveles de tTG sérica normales y su fenotipo HLA-DQ no fue DQ-2/-8. Los niveles de hemoglobina y el análisis de bioquímico de sangre, incluyendo las pruebas renales y hepáticas, estaban dentro de los valores normales. El comité de Ético local del "Hospital Universitario de León", fue aprobado para este estudio y se obtuvo el consentimiento informado de los sujetos.
Para este estudio se llevó a cabo el siguiente protocolo:
- Dieta:
Los sujetos fueron instruidos para cumplir una dieta en la que controló el tipo y la cantidad de gluten consumido durante los 15 días que duró este estudio. En primer lugar, los sujetos consumieron una dieta libre de gluten estricta durante una semana. Los siguientes 4 días, 9 g de gluten no procesado fueron ingeridos, distribuidos en las tres comidas del día. En los últimos 4 días, la dosis de gluten se incrementó a 30 g, distribuidos de manera similar.
Toma de muestra fecal:
Se recogieron las heces frescas de los 1 sujetos que intervinieron en el estudio bajo distintas condiciones de dieta: dieta normal, DSG, DSG+9 g de gluten y DSG+30 g de gluten. La toma de muestras se llevó a cabo antes de la DSG y después de cada una de las dietas ensayadas. Todas las muestras fueron homogeneizadas y alicuotadas en menos de 3 horas después de la defecación.
La extracción de las prolaminas de las heces y solución de gliadina:
Prolaminas se extrajeron mediante la mezcla de 1 g de heces con 10 mi de etanol 60% (v/v) en un agitador rotatorio durante 1 h a temperatura ambiente. La suspensión se centrifugó a 13.000 x g durante 10 min y se separó el sobrenadante. El control positivo, gliadina PWG, se preparó, igualmente, en etanol 60% (v/v) a una concentración de 1 mg/ml.
En primer lugar, se realizó la toma de muestra de heces de los individuos analizados, los cuales mantenían una dieta normal en la que estaba presente el gluten (pan, pasta, galletas, etc.). La presencia de polipéptidos del gluten en los extractos fecales se determinó de manera semicuantitativa usando tiras inmunocromatográficas basadas en el anticuerpo G12, en diluciones seriadas de la muestra con el objetivo de representar un amplio rango desde menos de 6 ppm hasta más de 500 ppm. Las muestras fueron diluidas (1 :10 a 1 :20.000) en la solución de dilución propuesta por el fabricante (se probaron 6, 25, 50, 100, 250 y 500 ppm de gluten). Las tiras inmunocromatográficas se sumergieron en las distintas muestras (300 μί) durante 10 min y se dejaron secar al aire. En este caso, todos los individuos presentaron una excreción de proteínas/péptidos del gluten en heces con valores por encima de 500 ppm (Figura 3A y 3B).
Una vez confirmada la viabilidad del método para la detección del gluten en heces, estudiamos si existía una correlación entre la cantidad de gluten consumido y la cantidad de gluten excretado. Para ello, los 11 individuos fueron sometidos a una dieta controlada de gluten. En primer lugar, estos individuos consumieron una dieta estricta libre de gluten durante una semana; a continuación, se les admininistró 9 g de gluten al día repartidos en las comidas principales durante un periodo de 4 días (teniendo en cuenta el tiempo de llenado del intestino grueso) y por último, consumieron 30 g de gluten al día, igualmente repartidos en las comidas principales durante un periodo de 4 días. Con el fin de evitar diferencias en la determinación de gluten como consecuencia de la ingesta de diferentes productos con gluten de distinto origen, en todos los casos se les administró el mismo tipo (sin previo tratamiento térmico). El calendario propuesto tuvo en cuenta que en personas sanas el tiempo de tránsito es de 45 ± 16 horas (media ± desviación estándar) con una dieta rica en fibra y más de 70 horas en dietas pobres en fibra (Stasse-Wolthuis y col., 1979, Am J Clin Nutr., 32:1881-1888).
Las muestras de heces recogidas durante el periodo en el que los individuos mantuvieron una dieta exenta de gluten presentaron, en todos los casos, niveles de gluten por debajo del límite de detección del método (6 ppm gluten intacto, 10 ppm gluten hidrolizado). En cambio, cuando se realizó una ingesta de 9 g de gluten al día se encontró que la cantidad de gluten detectada estaba por encima de 250 ppm en todas las muestras, exepto en una de ellas que presentaba valores entre 6 y 25 ppm. Cuando los individuos consumieron 30 g de gluten al día los niveles excretados por encima de 500 ppm (Figura 3A y 3B), más de .000 veces superiores al límite de detección del método. Por tanto, existe una correlación entre la cantidad de gluten consumida y la cantidad de péptidos con epítopos G12 excretada a través de las heces.
Con el fin de demostrar la idoneidad del moAb G12 en la detección de péptidos/proteínas del gluten excretadas en las heces, los extractos proteicos obtenidos mediante tratamiento con etanol 60%, así como los controles, gliadina PWG y el gluten ingerido por los sujetos, fueron separados mediante SDS-PAGE. Posteriormente las proteínas/péptidos fueron teñidas con tinción de plata o transferidas a una membrana y posterior análisis Western blot con el moAb G12 (Figura 3C y 3D). Los resultados indicaron que el moAb G12 reacciona con las muestras derivadas de una dieta convencional no controlada, DSG+9 g gluten y DSG+30 g gluten, así como también con el controles positivos, gliadina PWG y el gluten ingerido. Sin embargo, en la muestra derivada de una DSG no se encontraron péptidos/proteínas en heces (Figura 3D). Ejemplo 3. Monitorización in vivo de péptidos inmunotóxicos derivados del gluten en heces de individuos sometidos a una dieta controlada de gluten.
En el presente ejemplo se muestra cómo se puede determinar por un método ELISA la digestión parcial de los péptidos reactivos con el anticuerpo usado en la invención, por el método más adecuado y ampliamente utilizado en el análisis clínico, al unir sencillez, sensibilidad y economía. En el caso de la detección de proteínas/péptidos del gluten, los sistemas ELISA tipo sándwich están diseñados para cuantificar proteínas intactas, pero pueden subestimar gluten hidrolizado. El paso del gluten por el tracto gastrointestinal da lugar a la hidrólisis de la mayor parte de este: un ELISA competitivo es capaz de cuantificar péptidos tóxicos, incluso a nivel de unos pocos aminoácidos, por tanto sería un método conveniente para su cuantificación.
Por tanto, el objetivo de este estudio fue determinar la concentración de péptidos tóxicos presentes en heces de individuos sanos mediante ELISA competitivo G12, usando como curva patrón el péptido 33-mer. Cada experimento se llevó a cabo por triplicado en días separados. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS para Windows. Los datos se expresaron como media, máxima, mínima y valores de percentiles 25 y 75. Las diferencias entre los grupos fueron examinados mediante el test de Friedman y el test de Wilcoxon para comparar dos muestras relacionadas. La probabilidad estadística de p<0,05 fue considerada significativa.
Al igual que en el ensayo anterior, las muestras de heces analizadas fueron las correspondientes a los periodos de ingesta: dieta no controlada, GSD, GSD+9 g y GSD+30 g. Las muestras de heces recogidas durante el periodo en el que los individuos mantuvieron una dieta exenta de gluten presentaron niveles de péptido tóxico inferiores al límite de cuantificación del método (5,4 pg 33-mer/mg muestra). Sin embargo, cuando se realizó una ingesta de 9 g de gluten al día en todos los casos se detectaron péptidos inmunoreactivos en heces, encontrándose en el rango de entre 3,49 y 9,62 ng de 33-mer/mg de heces, 600 veces superior al límite de detección del método. Por último, cuando los individuos consumieron 30 g de gluten al día los niveles de 33-mer obtenidos ascendieron en todos los casos, con respecto al periodo de ingesta de 9 g/día (6,69-28,00 ng de 33-mer/mg faeces, p=0,018, con respecto a DSG+9 g) (Figura 4), más de 1.000 veces superior al límite de detección del método. Estos resultados concuerdan con los obtenidos anteriormente en la detección de gluten en heces mediante inmunocromatografía. El método basado en el anticuerpo anti-33-mer podría estimar la cantidad de proteínas del gluten consumidas mediante la medida de los péptidos reactivos excretados en las heces, además la ingestión de algunos gramos de gluten al día podrían detectarse en cantidades 600 veces superiores al límite de detección. Por lo tanto, una cantidad de ingesta superior a 10 mg de gluten al día podría ser asumida como detectable mediante ensayos inmunológicos basados en el moAb G12.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S
1. - Procedimiento para la monitorización del gluten ingerido mediante detección de péptidos inmunotóxicos en las heces caracterizado por el uso de métodos inmunologicos con anticuerpos que reconocen péptidos de proteínas del gluten con resistencia a la digestión gastrointestinal.
2. - Procedimiento para la monitorización del gluten según la reivindicación 1 en el que los métodos inmunologicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con reactividad por algunas de las secuencias del péptido 33-mer SEQ ID N° 1.
3. - Procedimiento para la monitorización de gluten en heces de las reivindicaciones 1 a
2 en el que los métodos inmunologicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con capacidad para detectar los epítopos contenidos en el péptido 33-mer SEQ ID N° 1 , SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8.
4. - Procedimiento para la monitorización de gluten en heces de las reivindicaciones 1 a
3 en el que los métodos inmunologicos usan al menos uno de los anticuerpos monoclonales G12, A1 y R5.
5. - Procedimiento para la monitorización de gluten en heces de la reivindicaciones 1 a
4 en el que los métodos inmunologicos son un ELISA indirecto, ELISA competitivo, ELISA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, inmunopartículas magnéticas, Western blot, biosensores electrónicos, biosensores de resonancia.
6. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos del gluten ingeridos según las reivindicaciones 1 a 5 en el que los métodos inmunologicos usan el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permite un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes.
7. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunologico según algunas de las reivindicaciones del 1 a 6, caracterizado porque se usa como patrón de referencia algunos de los péptidos de la reivindicación 3.
8. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunologico según alguna de las reivindicaciones del 1 a 6, caracterizado porque se usa como patrón de referencia gliadina hidrolizada con pepsina y tripsina.
9. - Procedimiento de monitorización de la presencia de péptidos inmunogénicos del gluten ingerido mediante un ensayo inmunologico en el que los métodos inmunológicos usan al menos uno de los anticuerpo anti gliadina G12 y A1 para la realización de un ensayo semicuantitativo basado en tiras inmunocromatográficas de detección rápida.
10. - Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para la monitorización del cumplimiento de la dieta sin gluten.
11. - Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para detectar la ingesta no controlada de gluten en pacientes celíacos sometidos a dieta sin gluten pero con síntomas refractarios y agudos de la enfermedad celíaca.
12. - Uso de procedimientos analíticos según alguna de las reivindicaciones 1 a 9 para monitorizar la efectividad de las terapias relacionadas con la eliminación de péptidos inmunogénicos del gluten.
13. - Kit analítico para detectar péptidos inmunogénicos del gluten en heces que comprendan:
- Una solución dedicada a la extracción del gluten en heces.
Un patrón de referencia peptídico que comprenda al menos una parte o la totalidad del péptido inmunogénico del 33-mer de gliadina. - Un ensayo inmunológico que usen algún anticuerpo reactivo con el péptido 33- mer de gliadina.
14.- Kit analítico para detectar péptidos inmunogénicos del gluten en heces de la reivindicación 13 que comprenda:
- Una solución acuosa que tenga en su composición alguno de los componentes siguientes: un agente dispersante, un detergente suave, un agente reductor, un tampón, y etanol.
Un patrón de referencia peptídico obtenido por hidrólisis pepsino-tripsinada de gliadina o un péptido sintético que comprenda parte o la totalidad de la secuencia del 33-mer de la gliadina.
- Un ensayo inmunológico que usen algún anticuerpo reactivo con el péptido 33- mer de gliadina del tipo ELISA, tiras inmunocromatográficas, inmunoblots, biosensores electrónicos.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160320385A1 (en) * 2010-12-28 2016-11-03 Universidad De Sevilla Determination of levels of immunogenic gluten peptides in human samples field of the invention
ES2982932A1 (es) * 2023-03-16 2024-10-18 Biomedal SL Procedimiento para la determinacion del estado de permeabilidad intestinal

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013098441A1 (es) * 2011-12-29 2013-07-04 Universidad De Sevilla Determinación de niveles de péptidos inmunogénicos del gluten en muestras humanas
ES2556177B1 (es) * 2014-07-09 2016-10-20 Universidad De Sevilla Detección de péptidos del gluten en fluidos humanos
US9738920B2 (en) * 2015-01-16 2017-08-22 General Mills, Inc. In vitro method for estimating in vivo protein digestibility
BR102021012841A2 (pt) * 2021-06-28 2023-01-03 Sociedade Beneficente Israelita Brasileira Hospital Albert Einstein Sistema para acompanhamento de consumo de glúten e predição de associação de indisposição a consumo de glúten

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4208479A (en) * 1977-07-14 1980-06-17 Syva Company Label modified immunoassays
US7462688B2 (en) * 2002-05-14 2008-12-09 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Peptides for diagnostic and therapeutic methods for celiac sprue
ES2214108B1 (es) * 2002-08-16 2005-11-16 Consejo Sup. Investig. Cientificas Sistema y procedimiento inmunocromatografico para la identificacion simultanea de anticuerpos frente a aga y t-tg, y su uso en el diagnostico de enfermedad celiaca.
ATE554392T1 (de) * 2002-11-20 2012-05-15 Univ Leland Stanford Junior Diagnoseverfahren für sprue/zöliakie
US7563864B2 (en) * 2004-04-26 2009-07-21 Celiac Sprue Research Foundation Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten
US7892763B2 (en) * 2009-01-26 2011-02-22 Dodds W Jean Multi-stage nutrigenomic diagnostic food sensitivity testing in animals

Non-Patent Citations (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AI-SHOT ET AL., DIG DIS, vol. 25, 2007, pages 230 - 236
ALAEDINI; GREEN, ANN INT MED, vol. 142, 2005, pages 289 - 299
BETHUNE ET AL., CHEM BIOL, vol. 16, 2009, pages 868 - 881
BETHUNE; KHOSLA, PLOS PATHOGENS, vol. 4, 2008, pages E34
CATASSI; FASANO, CURR OPIN GASTROENTEROL., vol. 24, 2008, pages 687 - 691
CIACCI ET AL., DIGESTION, vol. 66, 2002, pages 178 - 185
ECKERT ET AL., J CEREAL SCI, vol. 43, 2006, pages 331 - 341
EHREN ET AL.: "PLoS ONE", vol. 4, 2009, ALVINE PHARMACEUTICALS, INC., pages: E6313
ERICKSON; KIM, ANNU REV MED, vol. 41, 1990, pages 133 - 139
ERTEKIN ET AL., J CLIN GASTROENTEROL., vol. 44, 2010, pages 544 - 546
FASANO, SCI AM, vol. 301, 2009, pages 54 - 61
FERNANDEZ-CALLE ET AL., GUT, vol. 34, 1993, pages 774 - 777
FREEMAN, GUT LIVER, vol. 3, 2009, pages 237 - 246
GANAPATHY ET AL.: "ANNU REV MED", 2006, ACADEMIC PRESS, pages: 1667 - 1692
GRAY, ANNU REV MED, 1991, pages 411 - 420
J PROTEOME RES, vol. 4, 2005, pages 1732 - 1741
JABRI; SOLLID, NAT REV IMMUNOL., vol. 9, 2009, pages 858 - 870
KORPONAY-SZABO ET AL., BMJ, vol. 335, 2007, pages 1244 - 1247
MORON ET AL., AM J CLIN NUTR., vol. 87, 2008, pages 405 - 414
MORON ET AL., PLOS ONE, vol. 3, 2008, pages E2294
RUBIO-TAPIA; MURRAY, GUT, vol. 59, 2010, pages 547 - 557
See also references of EP2660593A4
SELIMOGLU; KARABITER, J CLIN GASTROENTEROL., vol. 44, 2010, pages 4 - 8
SHAN ET AL., SCIENCE, vol. 297, 2002, pages 2275 - 2279
SOUSA ET AL., MOL CELLULAR BIOL, vol. 7, 2001, pages 204 - 213
STASSE-WOLTHUIS ET AL., AM J CLIN NUTR., vol. 32, 1979, pages 1881 - 1888
SYLVESTER; RASHID, CAN J GASTROENTEROL., vol. 21, 2007, pages 557 - 564
TACK ET AL., GASTROENTEROL HEPATOL., vol. 7, 2010, pages 204 - 213
TYE-DIN ET AL., SCI TRANSL MED, vol. 2, 2010, pages 41 RA51
WIESER, FOOD MICROBIOL., vol. 24, 2007, pages 115 - 119

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160320385A1 (en) * 2010-12-28 2016-11-03 Universidad De Sevilla Determination of levels of immunogenic gluten peptides in human samples field of the invention
US10466238B2 (en) * 2010-12-28 2019-11-05 Universidad De Sevilla Determination of levels of immunogenic gluten peptides in human samples
ES2982932A1 (es) * 2023-03-16 2024-10-18 Biomedal SL Procedimiento para la determinacion del estado de permeabilidad intestinal

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