WO2012113494A1 - Verfahren zur gewinnung sekundärer pflanzeninhaltsstoffe unter verwendung einer membran mit kationenaustauschenden gruppen - Google Patents

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Wolfgang Demmer
René FABER
Louis VILLAIN
Hans-Heinrich HÖRL
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Sartorius Stedim Biotech GmbH
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    • B01D2325/00—Details relating to properties of membranes
    • B01D2325/14—Membrane materials having negatively charged functional groups

Definitions

  • the present invention relates to a process for isolating phenolic secondary plant ingredients from plant material and to a food supplement obtainable by this process.
  • Herbal ingredients especially the so-called secondary plant ingredients, which have no greater caloric value, are increasingly attracting the attention of science and food technology, where they are under the keyword "Functional Food” as dietary supplements or food additives of interest.
  • reactive oxygen species reactive oxygen-containing molecules, such as hydroxyl radicals OH-, superoxide O2, hydrogen peroxide H 2 O 2 , Singlet oxygen, which can react with nitric oxide NO to peroxynitrite ONO2, as well as inactivate hypobromite and hypochlorite.
  • reactive oxygen species reactive oxygen-containing molecules, such as hydroxyl radicals OH-, superoxide O2, hydrogen peroxide H 2 O 2 , Singlet oxygen, which can react with nitric oxide NO to peroxynitrite ONO2, as well as inactivate hypobromite and hypochlorite.
  • the cardioprotective effect associated with regular red wine consumption is caused, inter alia, by OH-substituted diphenols such as resveratrol.
  • Resveratrol is a substance that, as an antioxidant, presumably reduces the sensitivity to oxidation of low density lipoprotein (LDL) in the blood, inhibits aggregation of platelets, and inhibits endogenous cholesterol biosynthesis by inhibiting squalene monooxygenase.
  • LDL low density lipoprotein
  • DE 10 2009 024 410 A1 discloses a method for the isolation of phenolic secondary plant ingredients from plant material, such. Plums, in which the plant ingredients are adsorbed on a microporous membrane with affinity ligands from the group of boronates or metal chelates and subsequently eluted from the membrane.
  • WO 2008/136741 A1 discloses a process for the removal of polyphenols from beverages, in which the beverages are treated with a polymer matrix on which are fixed ether ligands, preferably polyether ligands with CC multiple bonds.
  • the polymer matrix can be present as a particulate or membrane-shaped adsorbent.
  • the polyphenols are not isolated as end products and target substances of this method.
  • WO 2008/097154 A1 discloses a process for removal of suspended matter from beverages.
  • the polymer matrices based on crosslinked polysaccharides used have a polyether coating, which can be prepared by grafting, for example, polyethylene glycol or diethylene glycol vinyl ether.
  • the polyether functionalization of the matrices allows efficient removal of undesirable polyphenols from beverages.
  • the polyphenols are not isolated as end products and target substances of this method.
  • No. 5,141,611 discloses a process for removing polyphenols from beverages using polyamide membranes or particles with a glutaraldehyde / resorcinol-based or glutaraldehyde-based surface modification in combination with melamine, 1,6-hexamethylenediamine or various amino acids , Likewise, the polyphenols are not isolated as end products and target substances of this process.
  • EP 0806474 A1 discloses a method in which chromatography gels based on Sepharose ®, which cation exchanging ligands have (sulfopropyl or carboxymethyl groups), used for beverage clarification or stabilization.
  • the polyphenols are simultaneously removed with accompanying proteins as undesirable contaminants from beer.
  • the cation exchangers can be regenerated by reuse of water, caustic soda or saline for reuse.
  • the process known from EP 0 806 474 A1 does not contain any steps which permit isolation of the polyphenols as target substances, ie no steps which permit separation of the polyphenols from the accompanying proteins or other contaminants from beer production.
  • the object of the present invention is therefore to provide a process for the isolation of secondary plant constituents from plant material, which can be carried out in a simple manner, with little expenditure of time and at low pH values.
  • This method should also avoid the use of toxicologically objectionable solvents as well as the use of large volumes of solvents to isolate the phytochemicals.
  • an object of the present invention relates to a method for isolating positively charged phenolic plant secondary plant constituents, comprising the steps of:
  • (c) eluting the positively charged phenolic phytochemicals from the membrane to yield a solution containing the positively charged phenolic phytochemicals.
  • isolated also includes obtaining a solution containing the positively charged phenolic phytochemicals of the present invention.
  • the positively charged phenolic phytochemicals may be further purified from this solution and / or the positively charged phenolic phytochemicals may be obtained as such by removal of the solvent.
  • the term "vegetable material” in the present invention includes any vegetable material containing positively charged phenolic phytochemicals.
  • the plant material is selected from the group consisting of fruits, especially berries, vegetables, legumes, tubers, onions, beets, tea, cocoa, coffee, wood, flowers, seeds, leaves and cones of coniferous trees.
  • the vegetable material is fruit skin, fruit juice, fruit pulp, pulp, or whole fruit, which is brought by suitable process steps into a state which permits subsequent efficient extraction of its positively charged secondary ingredients.
  • an extract of plums is provided in step a) of the method according to the invention.
  • second plant ingredients comprises chemical compounds that are produced by plants neither in the energy metabolism nor anabolic or catabolic metabolism, and preferably the defense against pathogens and herbivores, the protection against environmental influences, such as UV radiation, or attracting of pollinators and seed wideners.
  • the secondary plant ingredients are positively charged phenolic compounds.
  • the term "positively charged phenolic compounds” is understood to mean phenols and derivatives of phenols. Such compounds may comprise one or more aromatic rings, wherein the aromatic rings may be fused or may be bridged together by substituted alkyl groups and wherein the derivatives may have further OH groups in addition to the phenolic OH groups.
  • the phenolic OH groups can be derivatized.
  • the secondary plant ingredients may be modified by methylation, acetylation or conversion to their aldehyde or acid function.
  • the molecules of all these compounds have as a common feature a temporary, ie at least during the inventive process producible, or permanent cationic charge, which is compensated by a corresponding counter anion.
  • the present invention relates to the isolation of any suitable phenolic phytochemicals.
  • the secondary plant ingredients are selected from the group consisting of flavonoids, especially flavones, flavonols, flavanols, flavanones, flavanonols, anthocyanins, proanthocyanins, isoflavonoids and biflavonoids.
  • Preferred flavonoids are, for example, flavones, flavonols, flavanols, flavanones, flavanonols, proanthocyanins and anthocyanins.
  • Preferred flavones are, for example, apigenin, luteolin, diosmetin, chrysoeriol, nobiletine, apirgenin, acetacetin, galangin, chrysin, tectochrysin, scutellarein, eupatorin, genkwanin, senensetin and their glycosides such as hyperoside, quercitrin and hesperidin.
  • Examples of preferred flavonols are fighter oil, quercetin, myricetin and their arabinosides, galactosides, glucosides, glycosides, rhamnosides and xylosides.
  • Examples of preferred flavanones are isokuranetin, naringenin, hesperitin, eriodictyol and their glycosides, rutinosyl derivatives and neohesperidosyl derivatives.
  • a preferred flavanonol is, for example, taxifolin.
  • Preferred proanthocyanins are, for example, the glycosides of procyanidins and prodelphinidines, in particular their gallates.
  • Preferred anthocyanins are, for example, the glycosides of pelargonidin, cyanidin, harionidin, delphinidin, petunidin and malvidin.
  • Preferred isoflavonoids are, for example, the isoflavones, especially the soy isoflavones.
  • Preferred isoflavones are, for example, genistein, daidzein, glycetein and their glycosides.
  • Preferred lignans are, for example, the flax lignans, in particular matairesinol and Secoisolariciresinol-diglucosides.
  • Suitable positively charged phenolic phytochemicals are for example, in K. Shetty, G. Paliyath, AL Pometto, RE Levin, "Functional Foods and Biotechnology", CRC Press LLC 2005, Taylor & Francis Group, pp. 152-159.
  • the anthocyanins ie the dyes of various parts of plants, such as fruit skins, berries, or vacuole components, in particular the glycosides of pelargonidin, cyanidin, ubenonidin, delphinidin, petunidin and malvidin, are preferred according to the invention.
  • proanthocyanins are particularly preferred on the structural basis of cathechin or epicathechin, also in the form of their gallates.
  • the skilled person is aware of the diverse plant sources of anthocyanins and other phytochemicals. A list can be found for example in H.-D. Belitz and W. Grosch, "textbook of food chemistry", 4th edition, H. Springer Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1992, pp. 738-754, ISBN 3-540-55449-1.
  • Suitable processes for the preparation of plant extracts from vegetable material are known to the person skilled in the art, and include, for example, the homogenization of plant parts in a disperser or homogenizer.
  • the plant extract can be pretreated before contacting with the membrane, for example by prefiltration. Such prefiltration is used to remove particles and trub substances from the plant extract.
  • the plant extract is not further pretreated after its preparation.
  • the plant extract can be contacted with the membrane without prefiltration.
  • the plant extract contains particles and Trubstoffe and may have a turbidity due to these ingredients.
  • the size of the particles is not limited.
  • the particles contained in the plant extract have a size of not more than 0.5 mm.
  • the method according to the invention may further comprise the step after step (a) and before step (b):
  • microporous membrane in the context of the present invention refers to membranes having a pore size of 0.1 to 20 ⁇ m, preferably 0.5 to 15 ⁇ m and more preferably 1 to 10 ⁇ m.
  • the determination of the pore size can be carried out with a so-called "Capillary Flow Porometry Test” (Capillary Flow Porometer 6.0, CAPWIN Software System, Porous Materials Inc.).
  • the microporous membrane may be in any form suitable for contacting the surfaces of the membrane with the plant extract.
  • the microporous membrane may be integrated into a membrane adsorber module.
  • Suitable membrane adsorber modules are known, for example, from DE 102 36 664 A1.
  • such a membrane adsorber module is particle-like, i. insensitive to clogging by particulate and slurry media.
  • the integration of the microporous membrane into a particle-permeable membrane adsorber module is particularly advantageous when a particle-containing plant extract is used.
  • the particles contained in the plant extract generally do not affect the adsorption of the phenolic secondary plant constituents to be isolated on the membrane. Pre-filtration is not necessary in this case, which simplifies the process according to the invention.
  • microporous membrane all membranes capable of adsorbing the positively charged phenolic secondary plant ingredients can be used.
  • the microporous membranes have suitable cation-exchanging groups.
  • the cation-exchanging groups are selected from the group of weak or strong cation-exchange ligands.
  • the weak cation exchange ligands are particularly preferably methacrylate, carboxymethyl or orthophosphate groups.
  • the strong cation exchange ligands preferred are sulfoalkyl (more preferably sulfopropyl or sulfoethyl), sulfonate and sulfate groups, as well as heparin and derivatives.
  • Particularly preferred cation exchange ligands are carboxymethyl and sulfopropyl groups.
  • Suitable methods for derivatizing microporous membranes with cation-exchanging groups are known to the person skilled in the art and are described, for example, in EP 0 527 992 B1.
  • a microporous membrane suitable for use in the method of the present invention is, for example, a membrane of a cellulose hydrate matrix and pores extending from one major surface to the other major surface of the membrane, the membrane having cation exchange groups for adsorptive separation on its inner and outer surfaces.
  • the starting material for such a microporous membrane is a cellulose ester membrane which is brought into contact with at least one solution under conditions which, on the one hand, lead to swelling of the cellulose ester matrix and, on the other hand, simultaneously, i. in situ, hydrolysis (saponification) of the ester groups to hydroxyl groups, whereby a cellulose hydrate membrane is formed.
  • Cellulose ester membranes may be composed of cellulose monoacetate, cellulose diacetate, cellulose triacetate, cellulose propionate, cellulose butyrate and cellulose acetobutyrate or other suitable cellulose esters or cellulose nitrate, methylcellulose or ethylcellulose, as well as mixtures thereof.
  • the resulting cellulose hydrate matrix is preferably crosslinked by reacting the hydroxyl groups with one or more at least bifunctional reagents. Thereafter, functional groups (cation exchange ligands) are introduced into the crosslinked matrix to enable adsorptive material separation.
  • functional groups for example to the hydroxyl groups, of the crosslinked membrane can be bound. Suitable methods for binding functional groups are known to the person skilled in the art.
  • functional groups are bonded to the cellulose membrane via epoxide groups or aldehyde groups. The introduction of the epoxide groups can take place already in the crosslinking step or subsequently.
  • the step (b) of contacting the plant extract with the microporous membrane comprises all forms of contacting the plant extract with the microporous membrane.
  • the contacting is done in such a way that the positively charged, phenolic secondary plant ingredients contact the cation-exchanging groups of the membrane to be adsorbed to them.
  • Step (b) may be accomplished by, for example, passing the plant extract tangentially along at least one membrane surface.
  • the plant extract is passed through the membrane, which is preferably convective permeable.
  • the term "adsorption” means all possibilities of reversibly binding positively charged, phenolic secondary plant constituents to the cation exchanger ligands. This reversible bond can be chemical and / or physical in nature.
  • step (c) the elution of the positively charged phenolic secondary ingredients from the membrane occurs. In this way, a solution containing the phenolic secondary plant ingredients is obtained.
  • the eluent used in step c) is water or from the group of aqueous solutions of alkali metal or alkaline earth metal salts of inorganic or organic acids, preferably alkali metal and alkaline earth metal salts of mineral acids (preferably hydrochloric, sulfuric, Phosphoric or nitric acid).
  • alkali metal or alkaline earth metal salts of the halogens particularly preferably NaCl.
  • the salts of di- and tricarboxylic acids are preferred, particularly preferred are citric and lactic acids.
  • C1-C4 alcohols such as ethanol or butanol
  • aqueous media for this washing step are those which do not elute the phenolic phytochemicals.
  • water is preferred as the aqueous medium.
  • the cation-exchanging groups are sulfonate groups and the microporous membrane consists of cellulose hydrate, wherein as eluent in step c) a solution of sodium chloride and potassium phosphate in a mixture of water, ethanol and 1- or iso-butanol is used ,
  • the method according to the invention further comprises the step after step (b) and before step (c):
  • the present invention further relates to a food additive which is obtainable by the process according to the invention.
  • Figure 1 the course of the adsorption and elution of anthocyanins at
  • Figure 2 the adsorption of anthocyanins on a strongly acidic membrane adsorber by bilateral overflow with circular promotion.
  • Example 1 Production of a plant extract
  • the plant extract was prepared from commercially available prunes (Prunus domestica) (Unipack Fruits, South Africa).
  • the fruits had a diameter of 7 to 8 cm, a fresh weight of about 150 to 200 g and were characterized by a very dark, purple-colored fruit skin (shell).
  • the extract was diluted 1:50 with the abovementioned buffer, and an adsorption spectrum in the wavelength range of 240-650 nm was recorded with a spectrophotometer of the type Spekord registered by Jenoptik, Jena, Germany. A maximum at 280 nm and 513 nm (broad) was found. The further determination of the concentration of the plant dye was carried out at 513 nm.
  • Example 2 Production of a planar module, which can be overflowed on both sides, with adsorptive membrane for the extraction of anthocyanins from plant material
  • a device for receiving an adsorption membrane was created.
  • Two rectangular plates (upper and lower part) with the dimensions 12 x 6 cm were on the front sides, d. H. provided on the sides facing each other in a parallel arrangement of the plates, each with a, parallel to the narrower side of the plates at a distance of 1 cm extending inlet and outlet channel with a depth of 3 mm.
  • the inlet or outlet channel was connected in each case via a feed bore with a hose nozzle.
  • the elution solution consisted of a mixture of 10% by volume of EtOH, 10% by volume of isobutanol, filled with 80% by volume of buffer to a final volume of 1 l, in which 1 mol / l of NaCl had been dissolved.
  • the unit ml / min indicates the flow rate through the adsorber.
  • AL means the number of extinction units "EE" in the template at the beginning of the experiment indicated by the respective experiment number.
  • DL means the number of extinction units "EE” in the template, or in linear mode ("lin”), in the receiver at the end of the experiment.
  • Geb means the absolute difference between the two values "AL” and “DL”, “Geb%” the corresponding indication of this difference referred to "AL" in percent.
  • EL means the total amount elutable by the adsorber, which can be determined from the extinction at 513 nm, "Rec%” is the proportion of "EL” in relation to "Geb" in
  • An oblique arrow pointing from the upper right to the lower left in the table from a higher line to a lower line means that the depleted solution was recharged onto the adsorber after elution of the adsorber.
  • FIG. 1 shows the decrease in the extinction units (EE) for AL or EL of the starting solution with repeated application of the anthocyanin-depleted solution to the same adsorber with subsequent elution according to the results for the experiments Nos. 8 to 11 according to Table 2.
  • the diamond-shaped symbols of row 1 correspond to the quantity of anthocyanins offered in each case, the symbols in square form of row 2 indicate the respectively eluted material. For each run, about 15 extinction units (RE) are depleted. This amount is found only in the first elution (Experiment 8), in the following three elutions less anthocyanin than the theoretical 15 EE is found. This indicates a non-elutable amount of anthocyanin remaining on the adsorber under these conditions.
  • RE extinction units
  • Figure 2 shows the adsorption of anthocyanins on a strongly acidic membrane adsorber by bilateral overflow with circular promotion.
  • the data are taken from experiment No. 6 of Table 2.
  • E 513 denotes the extinction of the solution studied at 513 nm as a measure of the anthocyanin content, and the x-axis indicates the circulation time in minutes.
  • the symbols in diamond form represent the concentration of anthocyanin in the template measured over the circulation time.
  • the recirculation curve is exponentially decaying and approaching a limit corresponding to the capacity of the adsorbent for anthocyanins under the chosen experimental conditions.
  • a particle-permeable membrane adsorber module was produced.
  • Example 4 Adsorption of anthocyanins on a strongly acidic membrane adsorber
  • M1 by controlled linear overflow of M1
  • the receiver was filled with 500 ml of buffer and circulated through the adsorber module for 5 minutes at a flow rate of 300 ml / min.
  • the buffer was discarded, 300 ml of fresh buffer filled and the process repeated.
  • E Fra k represents the measured value in the respective fraction and EE the total extinction fraction in the fraction as product of E513 and the volume of the respective fraction, ie 50 ml.
  • the bound amount of anthocyanins results from the subtraction of the respective value for "EE (total)" of 42.5 (corresponding to 100%).
  • “E513 cumulated” represents the total amount of anthocyanins bound during the experiment.
  • V / ml denotes the cumulative sample volume at the end of the experiment with the number given in Table 3.
  • the adsorber was washed with buffer until the absorbance value of the liquid in the effluent had dropped to virtually zero.
  • the bound anthocyanins were eluted from the adsorbent with 200 ml of eluant as indicated above by cycling and subsequent drainage.
  • Table 4 shows the mass balance of Example 4 with linear overflow:
  • Example 5 Adsorption of anthocyanins on a strongly acidic membrane adsorber by controlled cyclic overflow of the membrane adsorber M1 50 ml of the crude extract were added to 450 ml of buffer and mixed by means of a magnetic stirrer, which was in operation (speed 500 revolutions / min) throughout the experiment.
  • the original Erlenmeyer flask had a nominal volume of 500 ml, the magnetic stir bar was 3 cm long.
  • the adsorbent was drained by draining the depleted crude extract, washed with buffer and then eluted with the eluent.
  • E2 dead fraction by weight) / E tot (initial solution) * 100% for entries 1) to 4) or
  • Example 6 Serial connection of the membrane adsorber modules M1, M2 and M3

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material unter Verwendung einer Membran mit kationenaustauschenden Gruppen sowie einen durch dieses Verfahren erhältlichen Nahrungsmittelzusatz.

Description

Verfahren zur Gewinnung sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe unter Verwendung einer Membran mit kationenaustauschenden Gruppen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material sowie einen durch dieses Verfahren erhältlichen Nahrungsmittelzusatz.
Pflanzliche Inhaltsstoffe, insbesondere die sogenannten sekundären Pflanzeninhaltsstoffe, die keinen größeren kalorischen Wert besitzen, geraten immer mehr in die Aufmerksamkeit der Wissenschaft und der Lebensmitteltechnologie, wo sie unter dem Stichwort "Functional Food" als Nahrungsergänzungsmittel bzw. Nahrungsmittelzusätze von Interesse sind.
Von besonderer Bedeutung sind hierbei niedermolekulare Verbindungen, die antioxidative Eigenschaften aufweisen und damit die ubiquitär entstehenden, sogenannten "reactive oxygen species", reaktive Sauerstoff-enthaltende Moleküle, wie zum Beispiel Hydroxyl-Radikale OH-, das Superoxidanion O2 , Wasserstoffperoxid H2O2, Singulett-Sauerstoff, der mit Stickstoffmonoxid NO zu Peroxynitrit ONO2 reagieren kann, sowie Hypobromit und Hypochlorit inaktivieren können. Im Zusammenhang mit ihrer antioxidativen Wirkung werden weitere positive Effekte dieser niedermolekularen Verbindungen, wie der Schutz endothelialer Zellen, die Unterdrückung von Tumorwachstum und der Schutz des Herz-Kreislaufsystems, intensiv diskutiert. Die kardioprotektive Wirkung zum Beispiel, die mit regelmäßigem Rotweinkonsum einhergeht, wird hierbei unter anderem durch mit OH-Gruppen substituierte Diphenole wie beispielsweise Resveratrol verursacht. Bei Resveratrol handelt es sich um einen Stoff, der seinerseits mutmaßlich als Antioxidans die Oxidationsempfindlichkeit des Lipoproteins geringer Dichte („low density lipoprotein", LDL) im Blut senkt, die Aggregation der Blutplättchen hemmt und durch Inhibition der Squalenmonooxygenase die endogene Cholesterolbiosynthese hemmt.
Die technische Gewinnung bzw. Isolierung sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe stellt besondere Herausforderungen an deren Aufarbeitung, da die Stabilität vieler isolierter Substanzen oberhalb eines bestimmten pH-Werts rasch abnimmt. Da darüber hinaus viele Pflanzenextrakte einen hohen Gehalt an Fruchtsäuren und Ionen aufweisen, wird eine Auftrennung über konventionelle lonenaustauschchromatographie erschwert oder sogar unmöglich gemacht. Im Stand der Technik bekannte Verfahren erfordern zudem oft hohe Volumina an einzusetzendem Pflanzenextrakt, benötigen toxikologisch bedenkliche oder ätzende Substanzen wie Methanol oder Essigsäure zur Elution der sekundären Pflanzeninhaltsstoffe, und sind oft sehr langwierig. Die eingeschränkte Lagerstabilität vieler sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe verlangt dagegen nach raschen Prozeßabläufen, um die empfindlichen Substanzen möglichst schnell in ein stabilisierendes Milieu überführen zu können.
Im Stand der Technik bekannt ist beispielsweise ein Verfahren zur Anthocyan- Anreicherung aus Heidelbeersaftkonzentrat mittels einer zwei Meter langen, stark hydrophoben Amberlite® XAD-Säule mit einem Durchmesser von 11 cm. Nachteilig bei diesem Verfahren sind allerdings die erforderlichen hohen Volumina an einzusetzendem Saftkonzentrat, die Elution mit toxikologisch bedenklichen bzw. ätzenden Substanzen, wie Methanol und Essigsäure, und der hohe Zeitbedarf für die Abtrennung der Anthocyane aus dem Saftkonzentrat.
DE 10 2009 024 410 A1 offenbart ein Verfahren zur Isolierung von phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material, wie z. B. Pflaumen, bei welchem die Pflanzeninhaltsstoffe an einer mikroporösen Membran mit Affinitätsliganden aus der Gruppe der Boronate oder Metallchelate adsorbiert und nachfolgend von der Membran eluiert werden.
WO 2008/136741 A1 offenbart ein Verfahren zur Entfernung von Polyphenolen aus Getränken, bei welchem die Getränke mit einer Polymermatrix behandelt werden, auf welcher Etherliganden, bevorzugt Polyetherliganden mit CC-Mehrfachbindungen, fixiert sind. Die Polymermatrix kann als partikuläres oder membranförmiges Adsorbens vorliegen. Die Polyphenole werden dabei nicht als Endprodukte und Zielsubstanzen dieses Verfahrens isoliert.
WO 2008/097154 A1 offenbart ein Verfahren zur Trubstoffentfernung aus Getränken. Die verwendeten Polymermatrizen auf Basis von vernetzten Polysacchariden weisen eine Polyetherbeschichtung auf, welche durch Pfropfung von beispielsweise Polyethylenglycol oder Diethylen-glycol-vinylether herstellbar ist. Die Polyether- Funktionalisierung der Matrizen ermöglicht eine effiziente Entfernung von unerwünschten Polyphenolen aus Getränken. Die Polyphenole werden dabei nicht als Endprodukte und Zielsubstanzen dieses Verfahrens isoliert.
US 5,141 ,611 offenbart ein Verfahren zur Entfernung von Polyphenolen aus Getränken, wobei Polyamidmembranen oder -partikel mit einer Oberflächenmodi- fizierung auf Basis von Glutaraldehyd/Resorcinol oder auf Basis von Glutaraldehyd in Kombination mit Melamin, 1 ,6-Hexamethylendiamin oder verschiedenen Aminosäuren verwendet werden. Die Polyphenole werden gleichfalls nicht als Endprodukte und Zielsubstanzen dieses Verfahrens isoliert.
EP 0 806 474 A1 offenbart ein Verfahren, bei welchem Chromatographiegele auf Basis von Sepharose®, welche kationenaustauschende Liganden (Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen) aufweisen, zur Getränkeklärung oder -Stabilisierung verwendet werden. Bei diesem Verfahren werden die Polyphenole gleichzeitig mit begleitenden Proteinen als unerwünschte Kontaminanten aus Bier entfernt. Es wird desweiteren offenbart, wie die Kationenaustauscher durch Einwirkung von Wasser, Natronlauge oder Kochsalzlösung für die erneute Verwendung regeneriert werden können. Das aus EP 0 806 474 A1 bekannte Verfahren enthält keine Schritte, die eine Isolierung der Polyphenole als Zielsubstanzen erlauben, d. h. keine Schritte, die eine Abtrennung der Polyphenole von den begleitenden Proteinen oder anderen Kontaminanten aus der Bierherstellung erlauben.
Z. Borneman et al. offenbaren in Journal of Membrane Science 134 (1997), 191-197, ein Verfahren zur Entfernung von Polyphenolen und von einer mit der Anwesenheit dieser Polyphenole einhergehenden Braunfärbung aus Apfelsaft. Bezüglich der Entfernung dieser Polyphenole sind Polyethersulfonmembranen (PES), welche mit Polyvinylpyrrolidon modifiziert sind, Membranen aus regenerierter Cellulose, auf welcher keine Liganden fixiert sind, überlegen. Während des Verfahrens an der PES- Membran auftretende „Fouling"-Phänomene können durch Regeneration der Membran mit Natronlauge rückgängig gemacht werden. Wie die vorstehend zitierten Dokumente offenbart auch dieses Dokument kein Verfahren, Polyphenole als Zielsubstanzen aus Fluiden zu isolieren.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Isolierung von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material bereitzustellen, welches auf einfache Weise, bei geringem Zeitaufwand und bei niedrigen pH-Werten durchgeführt werden kann. Dieses Verfahren soll außerdem die Verwendung von toxikologisch bedenklichen Lösungsmitteln sowie die Verwendung großer Volumina von Lösungsmitteln zur Isolierung der sekundären Pflanzeninhaltsstoffe vermeiden.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst. Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Isolierung von sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material bereitgestellt, das die obigen Anforderungen erfüllt. Dabei wurde überraschend gefunden, daß durch den Einsatz von mikroporösen Membranen, die kationenaustauschende Gruppen tragen, eine Extraktion von positiv geladenen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material möglich ist.
Dementsprechend betrifft ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Isolieren von positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material, umfassend die Schritte:
(a) das Bereitstellen eines Extraktes aus pflanzlichem Material, welches positiv geladene, phenolische sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe enthält,
(b) das Kontaktieren des Extraktes mit einer mikroporösen Membran, welche kationenaustauschende Gruppen zur Wechselwirkung mit den positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe aufweist, wodurch die positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe an der Membran adsorbiert werden, und
(c) das Eluieren der positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe von der Membran, wodurch eine die positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe enthaltende Lösung erhalten wird. Der Begriff "Isolieren" umfaßt erfindungsgemäß auch das Erhalten einer die positiv geladenen phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe enthaltenden Lösung. Aus dieser Lösung können die positiv geladenen phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe gegebenenfalls weiter aufgereinigt werden und/oder die positiv geladenen phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe als solche durch Entfernen des Lösungsmittels erhalten werden.
Der Begriff "pflanzliches Material" umfaßt erfindungsgemäß jegliches pflanzliches Material, das positiv geladene, phenolische sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das pflanzliche Material aus der Gruppe, bestehend aus Früchten, insbesondere Beeren, Gemüse, Hülsenfrüchten, Knollen, Zwiebeln, Rüben, Tee, Kakao, Kaffee, Holz, Blüten, Samen, Blättern und Zapfen von Nadelbäumen ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das pflanzliche Material Fruchthaut, Fruchtsaft, Fruchtmark, Fruchtpulpe, bzw. die gesamte Frucht, die durch geeignete Prozess-Sch ritte in einen Zustand gebracht wird, welcher eine nachfolgende effiziente Extraktion ihrer positiv geladenen sekundären Inhaltsstoffe zuläßt. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Extrakt aus Pflaumen bereitgestellt. Der Begriff "sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe" umfaßt erfindungsgemäß chemische Verbindungen, die von Pflanzen weder im Energiestoffwechsel noch im anabolen oder katabolen Stoffwechsel produziert werden, und die bevorzugt der Abwehr von Pathogenen und Herbivoren, dem Schutz vor Umwelteinflüssen, wie beispielsweise UV-Strahlung, oder dem Anlocken von Bestäubern und Samenverbreitern dienen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den sekundären Pflanzeninhaltsstoffen um positiv geladene phenolische Verbindungen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter positiv geladenen phenolischen Verbindungen Phenole sowie Derivate von Phenolen verstanden. Solche Verbindungen können einen oder mehrere aromatische Ringe umfassen, wobei die aromatischen Ringe annelliert sein können oder durch substituierte Alkylgruppen miteinander verbrückt sein können und wobei die Derivate neben den phenolischen OH-Gruppen weitere OH-Gruppen aufweisen können. Außerdem können die phenolischen OH-Gruppen derivatisiert sein. Beispielsweise können die phenolischen OH-Gruppen und/oder die weiteren OH-Gruppen glykosyliert sein. Des Weiteren können die sekundären Pflanzeninhaltsstoffe durch Methylierung, Acetylierung oder Umwandlung in ihre Aldehyd- oder Säurefunktion modifiziert sein. Die Moleküle alle dieser Verbindungen haben als gemeinsames Merkmal eine temporäre, d. h. wenigstens während des erfindungsgemäßen Verfahrens erzeugbare, oder permanente kationische Ladung, die durch ein korrespondierendes Gegenanion ausgeglichen wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Isolierung von jeglichen geeigneten phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen. Vorzugsweise sind die sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus der Gruppe, bestehend aus Flavonoiden, insbesondere Flavonen, Flavonolen, Flavanolen, Flavanonen, Flavanonolen, Anthocyanen, Proanthocyanen, Isoflavonoiden und Biflavonoiden ausgewählt. Bevorzugte Flavonoide sind beispielsweise Flavone, Flavonole, Flavanole, Flavanone, Flavanonole, Proanthocyane und Anthocyane. Dabei sind bevorzugte Flavone beispielsweise Apigenin, Luteolin, Diosmetin, Chrysoeriol, Nobiletin, Apirgenin, Acacetin, Galangin, Chrysin, Tectochrysin, Scutellarein, Eupatorin, Genkwanin, Senensetin und deren Glykoside wie Hyperosid, Quercitrin und Hesperidin. Bevorzugte Flavonole sind beispielsweise Kämpferoi, Quercetin, Myricetin und deren Arabinoside, Galactoside, Glucoside, Glycoside, Rhamnoside und Xyloside. Bevorzugte Flavanone sind beispielsweise Isokuranetin, Naringenin, Hesperitin, Eriodictyol und deren Glycoside, Rutinosylderivate und Neohesperidosylderivate. Ein bevorzugtes Flavanonol ist beispielsweise Taxifolin. Bevorzugte Proanthocyane sind beispielsweise die Glycoside der Procyanidine und Prodelphinidine, insbesondere deren Gallate. Bevorzugte Anthocyane sind beispielsweise die Glycoside von Pelargonidin, Cyanidin, Päonidin, Delphinidin, Petunidin und Malvidin. Bevorzugte Isoflavonoide sind beispielsweise die Isoflavone, insbesondere die Soja-Isoflavone. Dabei sind bevorzugte Isoflavone beispielsweise Genistein, Daidzein, Glycetein und deren Glycoside. Bevorzugte Lignane sind beispielsweise die Flachs-Lignane, insbesondere Matairesinol und Secoisolariciresinol-Diglucoside.
Geeignete positiv geladene, phenolische sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe sind beispielsweise in K. Shetty, G. Paliyath, A. L. Pometto, R. E. Levin, "Functional Foods and Biotechnology", CRC Press LLC 2005, Taylor & Francis Group, S. 152- 159, beschrieben. Unter den genannten Verbindungen sind erfindungsgemäß insbesondere die Anthocyane, d.h. die Farbstoffe verschiedener Pflanzenteile, wie Fruchthäute, Beeren, oder Vakuolenbestandteile, insbesondere die Glycoside von Pelargonidin, Cyanidin, Päonidin, Delphinidin, Petunidin und Malvidin, bevorzugt. Ebenso sind die Proanthocyane auf der strukturellen Basis von Cathechin oder Epicathechin, auch in Form ihrer Gallate, besonders bevorzugt. Dem Fachmann sind die vielfältigen pflanzlichen Quellen für Anthocyane und andere sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe bekannt. Ein Aufstellung findet sich beispielsweise in H.-D. Belitz und W. Grosch, "Lehrbuch der Lebensmittelchemie", 4. Auflage, H. -Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, New York, 1992, S. 738-754, ISBN 3-540-55449-1.
Geeignete Verfahren zur Herstellung von Pflanzenextrakten aus pflanzlichem Material sind dem Fachmann bekannt, und umfassen beispielsweise die Homogenisierung von Pflanzenteilen in einem Dispergierer oder Homogenisator. Der Pflanzenextrakt kann vor dem Kontaktieren mit der Membran beispielsweise durch eine Vorfiltration vorbehandelt werden. Eine solche Vorfiltration dient der Entfernung von Partikeln und Trubstoffen aus dem Pflanzenextrakt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Pflanzenextrakt nach seiner Herstellung jedoch nicht weiter vorbehandelt. Insbesondere kann der Pflanzenextrakt ohne Vorfiltration mit der Membran kontaktiert werden. In diesem Fall enthält der Pflanzenextrakt Partikel und Trubstoffe und kann aufgrund dieser Bestandteile eine Trübung aufweisen. Die Größe der Partikel ist nicht beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weisen die in dem Pflanzenextrakt enthaltenen Partikel eine Größe von nicht mehr als 0,5 mm auf. Um dies zu erreichen, kann das erfindungsgemäße Verfahren in einer bevorzugten Ausführungsform nach Schritt (a) und vor Schritt (b) weiter den Schritt umfassen:
(a2) das Homogenisieren des Pflanzenextraktes derart, daß die im Pflanzenextrakt enthaltenen Partikel eine Größe von nicht mehr als 0,5 mm aufweisen.
Geeignete Verfahren zum Homogenisieren sind dem Fachmann bekannt. Ebenso sind dem Fachmann Verfahren zur Überprüfung der Teilchengröße bekannt, beispielsweise durch mikroskopische Kontrolle und computergestützte Bildauswertung. Der Begriff "mikroporöse Membran" bezeichnet im Rahmen der vorliegenden Erfindung Membranen mit einer Porengröße von 0,1 bis 20 pm, vorzugsweise 0,5 bis 15 pm und mehr bevorzugt 1 bis 10 pm. Die Bestimmung der Porengröße kann mit einem sogenannten "Capillary Flow Porometry Test" (Capillary Flow Porometer 6.0, CAPWIN Software System, Fa. Porous Materials Inc.) durchgeführt werden.
Die mikroporöse Membran kann in jeder Form vorliegen, die geeignet ist, daß die Oberflächen der Membran mit dem Pflanzenextrakt in Kontakt kommen. Beispielsweise kann die mikroporöse Membran in ein Membranadsorbermodul integriert sein. Geeignete Membranadsorbermodule sind beispielsweise aus DE 102 36 664 A1 bekannt. Vorzugsweise ist ein solches Membranadsorbermodul partikelgängig, d.h. unempfindlich gegenüber Verstopfung durch partikel- und trubstoffh altige Medien.
Die Integration der mikroporösen Membran in ein partikelgängiges Membranadsorbermodul ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn ein partikelhaltiger Pflanzenextrakt verwendet wird. Die in dem Pflanzenextrakt enthaltenen Partikel beeinträchtigen die Adsorption der zu isolierenden phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe an der Membran im Allgemeinen nicht. Eine Vorfiltration ist in diesem Fall nicht notwendig, was das erfindungsgemäße Verfahren vereinfacht.
Als mikroporöse Membran können alle Membranen verwendet werden, die zur Adsorption der positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe befähigt sind. Dazu weisen die mikroporösen Membranen geeignete kationenaustauschende Gruppen auf.
Als kationenaustauschende Liganden für positiv geladene, phenolische sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe können in dem erfindungsgemäßen Verfahren jegliche geeignete Liganden, die zur Wechselwirkung mit positiv geladenen Molekülen befähigt sind, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die kationenaustauschenden Gruppen aus der Gruppe der schwachen oder starken Kationenaustauscherliganden ausgewählt. Unter den schwachen Kationenaustauscherliganden sind besonders bevorzugt Methacrylat-, Carboxymethyl- oder Orthophosphatgruppen. Unter den starken Kationenaustauscherliganden sind Sulfoalkyl- (besonders bevorzugt Sulfopropyl- oder Sulfoethyl-), Sulfonat- und Sulfatgruppen sowie Heparin und Derivate bevorzugt. Besonders bevorzugte Kationenaustauscherliganden sind Carboxymethyl- und Sulfopropylgruppen. Geeignete Verfahren zur Derivatisierung von mikroporösen Membranen mit kationenaustauschenden Gruppen sind dem Fachmann bekannt und sind beispielsweise in EP 0 527 992 B1 beschrieben. Eine zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignete mikroporöse Membran ist beispielsweise eine Membran aus einer Cellulosehydrat-Matrix und Poren, die sich von einer Hauptoberfläche zur anderen Hauptoberfläche der Membran erstrecken, wobei die Membran auf ihren inneren und äußeren Oberflächen kationenaustauschende Gruppen zur adsorptiven Stofftrennung aufweist.
Als Ausgangsmaterial für eine solche mikroporöse Membran dient eine Celluloseester-Membran, die mit mindestens einer Lösung unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die zum einen zu einer Quellung der Celluloseester-Matrix führen und zum anderen gleichzeitig, d.h. in situ, eine Hydrolyse (Verseifung) der Estergruppen zu Hydroxylgruppen bewirkt, wobei eine Cellulosehydrat-Membran entsteht.
Celluloseester-Membranen können aus Cellulosemonoacetat, Cellulosediacetat, Cellulosetriacetat, Cellulosepropionat, Cellulosebutyrat und Celluloseacetobutyrat oder anderen geeigneten Celluloseestern oder Cellulosenitrat, Methylcellulose oder Ethylcellulose, sowie Gemischen davon, aufgebaut sein.
Anschließend an die Verseifung wird die erhaltene Cellulosehydrat-Matrix bevorzugt durch Umsetzung der Hydroxylgruppen mit einem oder mehreren, mindestens bifunktionellen Reagenz vernetzt. Danach werden in die vernetzte Matrix funktionelle Gruppen (Kationenaustauscherliganden) zur Befähigung der adsorptiven Stofftrennung eingeführt. In einem weiteren Schritt können funktionelle Gruppen, z.B. an die Hydroxylgruppen, der vernetzten Membran gebunden werden. Geeignete Methoden zur Bindung von funktionellen Gruppen sind dem Fachmann bekannt. Bevorzugt werden funktionelle Gruppen über Epoxid-Gruppen oder Aldehyd- Gruppen an die Cellulosemembran gebunden. Die Einführung der Epoxid-Gruppen kann bereits in dem Vernetzungsschritt oder nachträglich stattfinden.
Besonders bevorzugt werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren "Sartobind®"- Membranen der Fa. Sartorius Stedim Biotech GmbH verwendet.
Der Schritt (b) des Kontaktierens des Pflanzenextraktes mit der mikroporösen Membran umfaßt alle Formen des Inkontaktbringens des Pflanzenextraktes mit der mikroporösen Membran. Dabei erfolgt das Inkontaktbringen in einer Weise, daß die positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe mit den kationenaustauschenden Gruppen der Membran in Kontakt treten, um an diese adsorbiert zu werden. Der Schritt (b) kann erfolgen, indem der Pflanzenextrakt beispielsweise tangential an mindestens einer Membranoberfläche entlanggeleitet wird. Es ist aber auch möglich, dass bei Verwendung einer Membran mit Poren, die sich von einer Hauptoberfläche zur anderen Hauptoberfläche der Membran erstrecken, der Pflanzenextrakt durch die Membran, welche bevorzugt konvektiv permeabel ist, geleitet wird.
Unter dem Begriff "Adsorption" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung sämtliche Möglichkeiten der reversiblen Bindung von positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe an die Kationenaustauscherliganden verstanden. Diese reversible Bindung kann chemischer und/oder physikalischer Natur sein. Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt in Schritt (c) das Eluieren der positiv geladenen, phenolischen sekundären Inhaltsstoffe von der Membran. Auf diese Weise wird eine Lösung erhalten, welche die phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe enthält. Unter dem Begriff "Elution" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Desorption und die damit einhergehenden Spülschritte zusammengefaßt. Die zur Elution verwendete Flüssigkeit ist das "Eluens".
Als Eluens kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren jedes Lösungsmittel, das eine höhere Affinität zu den verwendeten kationenaustauschenden Gruppen als der zu isolierende, positiv geladene, phenolische sekundäre Pflanzeninhaltsstoff aufweist, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das in Schritt c) verwendete Eluens Wasser oder aus der Gruppe der wäßrigen Lösungen von Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalzen von anorganischen oder organischen Säuren, bevorzugt von Alkali- und Erdalkalisalzen der Mineralsäuren (bevorzugt Salz-, Schwefel-, Phosphor- oder Salpetersäure) ausgewählt. Weitere bevorzugte Salze sind die Alkali- oder Erdalkalisalze der Halogene, besonders bevorzugt NaCI.
Unter den organischen Säuren sind die Salze der Di- und Tricarbonsäuren bevorzugt, besonders bevorzugt sind Zitronen- und Milchsäure.
Weiterhin hat sich die zusätzliche Beimischung von C1-C4-Alkoholen, wie Ethanol oder Butanol, zum Eluens als vorteilhaft erwiesen.
Auf diese Weise kann der nachfolgende Schritt des Eluierens vereinfacht werden. Als wäßriges Medium für diesen Waschschritt sind solche bevorzugt, die zu keiner Elution der phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe führen. Insbesondere wird Wasser als wäßriges Medium bevorzugt.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die kationenaustauschenden Gruppen Sulfonatgruppen und die mikroporöse Membran besteht aus Cellulosehydrat, wobei als Eluens in Schritt c) eine Lösung von Natriumchlorid und Kaliumphosphat in einem Gemisch aus Wasser, Ethanol und 1- oder iso-Butanol verwendet wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren weiter nach Schritt (b) und vor Schritt (c) den Schritt:
(b2) das Entfernen von auf der Membran verbliebenen Pflanzenresten aus dem Extrakt durch Waschen mit einem wäßrigen Medium.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen Nahrungsmittelzusatz, welcher nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlich ist.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden nicht-einschränkenden Beispiele und Figuren näher erläutert.
Dabei zeigen
Figur 1 : den Verlauf der Adsorption und Elution von Anthocyanen bei
Verwendung eines beidseitig überströmbaren Membranadsorbers und
Figur 2: die Adsorption von Anthocyanen an einem stark sauren Membran- adsorber durch beidseitige Überströmung bei zirkulärer Förderung.
Beispiel 1 : Herstellung eines Pflanzenextrakts
Im Folgenden ist die Herstellung eines Anthocyane enthaltenden Pflanzenextrakts beschrieben.
Der Pflanzenextrakt wurde aus kommerziell erhältlichen Pflaumen (Prunus domestica) (Unipack Fruits, Südafrika) hergestellt. Die Früchte hatten einen Durchmesser von 7 bis 8 cm, ein Frischgewicht von ca. 150 bis 200 g und zeichneten sich durch eine sehr dunkle, lila gefärbte Fruchthaut (Schale) aus. Die Schale einer Frucht wurde vollständig entfernt und in 300 ml einer Lösung von 0,02 Mol/I Kaliumorthophosphat, welche mit Phosphorsäure auf pH 2,0 eingestellt wurde (hier und im folgenden„Puffer" genannt), mit einem "Ultra-Turrax® T25" Dispergierer (Janke und Kunkel, Staufen im Breisgau) bei einer Leerlaufdrehzahl von 8000 Upm für 5 min homogenisiert. Es entstand eine trübe Suspension, wobei Partikel in einem Größenbereich von maximal 0,5 mm entstanden. Die Partikelgröße wurde mit einem Durchlichtmikroskop "Axiovert 40" (Zeiss) mit angeschlossener Kamera und der Bildauswertungssoftware "Axiovision" (Zeiss) bestimmt. Dabei wurde keine Größenverteilung bestimmt, sondern nur sichergestellt, daß die Partikel die Größe von 0,5 mm nicht überschreiten. Der Extrakt wurde durch ein Faltenfilter gegeben und auf 500 ml mit Puffer aufgefüllt und gründlich vermischt. Es resultierte eine trübe, schwarzrote Flüssigkeit, im folgenden "Rohextrakt" genannt, welcher in den folgenden Beispielen verwendet wurde.
Der Extrakt wurde 1 : 50 mit dem vorgenannten Puffer verdünnt, und ein Adsorptionsspektrum im Wellenlängenbereich von 240 - 650 nm mit einem registrierenden Spektralphotometer des Typs Spekord der Fa. Jenoptik, Jena, Deutschland, aufgenommen. Es wurde je ein Maximum bei 280 nm und 513 nm (breit) gefunden. Die weitere Bestimmung der Konzentration des Pflanzenfarbstoffes wurde bei 513 nm durchgeführt.
Zur Gehaltsbestimmung des Anthocyans in den einzelnen untersuchten Fraktionen können die Extinktionen der jeweiligen Fraktion in mg/l umgerechnet werden. Dabei erzeugt eine Lösung von 16 mg/l Anthocyangemisch bei pH 2,5 eine Extinktion von 0,45 bei der Wellenlänge 520 nm (L. Jurd, Food Sei. 29, 1964, S. 16-19).
Beispiel 2: Herstellung eines flächigen, beidseitig überströmbaren Moduls mit adsorptiver Membran zur Extraktion von Anthocvanen aus Pflanzenmaterial
Es wurde eine Vorrichtung zur Aufnahme einer Adsorptionsmembran erstellt. Zwei rechteckige Platten (Ober- und Unterteil) mit den Maßen 12 x 6 cm wurden an den Stirnseiten, d. h. an den einander zugewandten Seiten bei paralleler Anordnung der Platten, mit je einem, zur schmaleren Seite der Platten parallel in einem Abstand von 1 cm verlaufenden Zulauf- und Ablaufkanal mit einer Tiefe von 3 mm versehen. Der Zulauf- bzw. Ablaufkanal war jeweils über eine Zuführungsbohrung mit einer Schlauchtülle verbunden.
Aus einer 1 mm dicken Platte aus weichem Silikon wurden zwei Rahmen mit 10 x 5 cm inneren und 12 x 6 cm äußeren Maßen geschnitten. Es wurden Aussparungen passend für die Aufnahme von Gewindestangen ausgeführt, mit denen beide Platten so zusammengefügt werden konnten, dass ein 2 mm hoher Kanal zwischen ihnen entstand. Es wurden aus den zu untersuchenden Membranen jeweils ein rechteckiges Stück mit den Maßen 10 x 5 cm ausgeschnitten und zwischen zwei Geweben des Typs XNP 4410 der Fa. Convet Plastics bv, Genk, Belgien, mit gleicher Abmessung in den Kanal eingesetzt.
Es resultierte eine Vorrichtung mit zwei parallelen Kanälen auf gegenüberliegenden Seiten einer mikroporösen Membran, welche durch eine geeignete Pumpe auf beiden Seiten gleichzeitig mit dem zu behandelnden Fluid überströmt wurden.
Die Elutionslösung bestand aus einem Gemisch aus 10 Vol% EtOH, 10 Vol% iso- Butanol, aufgefüllt mit 80 Vol% Puffer auf ein Endvolumen von 1 I, in welchem 1 Mol/I NaCI gelöst waren.
Es wurde eine stark saure Kationenaustauschermembran des Typs Sartobind® S der Fa. Sartorius Stedim Biotech, Bezeichnung 18842, Charge 1000353 R: 22M (Membran aus verstärkter, stabilisierter Cellulose mit Sulfonsäuregruppen) mit den Maßen 12 x 6 cm mit Puffer benetzt und eingebaut. Es wurden Versuche mit dem 1 : 50 verdünnten Extrakt in verschiedenen Betriebsweisen und Überströmgeschwindigkeiten durchgeführt. Es wurden in jedem Versuch 50 ml Ausgangslösung vorgelegt.
Die Ergebnisse sind in Tabellen 1 und 2 zusammengefasst.
Es bedeuten:
Etoil die gesamte, in den jeweiligen Fraktionen bei 513 nm bestimmte Extinktion, angegeben in Extionseinheiten„EE". Spalte 1. Nr.: Laufende Versuchsnummer mit der gleichen Membran in der Vorrichtung,
Spalte 2, Art: Die Abkürzung „lin" bedeutet, dass die Lösung einmalig durch den Adsorber gefördert wurde, die Abkürzung„zirk" bedeutet, dass das Volumen 10 min lang im Kreis durch den Adsorber gefördert wurde.
Die Einheit ml/min kennzeichnet die Flußrate durch den Adsorber.
AL: bedeutet die Zahl der Extinktionseinheiten„EE" in der Vorlage bei Beginn des durch die jeweilige Versuchsnummer gekennzeichneten Versuchs.
DL: bedeutet die Zahl der Extinktionseinheiten„EE" in der Vorlage, bzw. bei linearer Betriebsweise („lin"), im Auffanggefäß am Ende des Versuchs.
Geb: bedeutet die absolute Differenz der beiden Werte„AL" und„DL",„Geb%" die entsprechende Angabe dieser Differenz bezogen auf„AL" in Prozent.
EL: bedeutet die vom Adsorber eluierbare Gesamtmenge, welche bestimmbar ist aus der Extinktion bei 513 nm, "Rec%" ist der Anteil an „EL" bezogen auf „Geb" in
Prozent.
Ein schräger, in der Tabelle von rechts oben nach links unten weisender Pfeil aus einer höheren in eine niedrigere Zeile bedeutet, dass die abgereicherte Lösung nach Elution des Adsorbers erneut auf den Adsorber geladen wurde.
Tabelle 1 : Bilanz der Versuche mit der Sartobind® S-Typ-Membran des Beispiels 2 unter unterschiedlichen Betriebsbedingungen
Figure imgf000017_0001
Nr. Art ml/min AL DL Geb Geb% EL Ree %
1 lin 5 28,3 11 17,3 61 12 69
2 zirk 50 21 14,5 6,5 31 5,6 86
3 lin 5 34,5 17,5 17 49 15 88
4 lin 5 17,5 13,7 3,8 22 3,6 95
5 zirk 50 37 21 16 43 12,2 76
Nach Durchführung der fünf Versuche aus Tabelle 1 wurde in die Vorrichtung eine frische Membran des gleichen Typs eingebaut.
Tabelle 2: Weitere Versuche mit dem Extrakt und einer frischen Membran
Nr. Art ml/min AL DL Geb Geb% EL Ree %
6 zirk 50 43,5 29 14,5 33 1 1 ,6 80
7 lin 5 20 10,6 9,4 47 6,4 68
8 lin 5 74 52 22 30 15 68
'
9 lin 5 52 35,5 16,5 32 10 61
10 lin 5 35,5 . 21 ,1 14,4 41 12 83
1 1 lin 5 21 ,1 14,3 6,8 32 6 88
12 zirk 6-75 21 ,5 1 1 ,5 10 47 7,2 72
13 zirk 12-72 23,5 14,5 9 38 9 100
Die schrittweise Erhöhung der Pumpenleistung in den Versuchen 12 und 13 ergab keine Beschleunigung der Abnahme der Konzentration. Dabei wurde die Geschwindigkeit von 6 auf 75 ml/min bzw. 12 auf 72 ml/min in zehn Inkrementen alle drei Minuten erhöht.
Figur 1 zeigt die Abnahme der Extinktionseinheiten (EE) für AL bzw. EL der Ausganglösung bei wiederholter Aufgabe der an Anthocyanen abgereicherten Lösung auf den gleichen Adsorber mit anschließender Elution gemäß der Ergebnisse für die Versuche Nr. 8 bis 1 1 nach Tabelle 2.
Die Symbole in Diamantform der Reihe 1 entsprechen der jeweils angebotenen Menge an Anthocyanen, die Symbole in Quadratform der Reihe 2 kennzeichnen das jeweils eluierte Material. Es werden bei jedem Lauf ca. 15 Extinktionseinheiten (EE) abgereichert. Diese Menge findet sich nur in der ersten Elution (Versuch 8), in den folgenden drei Elutionen wird weniger Anthocyan als die theoretischen 15 EE gefunden. Dies deutet auf eine unter diesen Bedingungen nicht eluierbare Menge Anthocyan, die auf dem Adsorber verbleibt, hin.
Figur 2 zeigt die Adsorption von Anthocyanen an einem stark sauren Membran- adsorber durch beidseitige Überströmung bei zirkulärer Förderung. Die Daten sind dem Versuch Nr. 6 der Tabelle 2 entnommen. E 513 bezeichnet die bei 513 nm gemessene Extinktion der untersuchten Lösung als Maß für den Anthocyangehalt, auf der x-Achse ist die Zirkulationszeit in Minuten angegeben.
Die Symbole in Diamantform repräsentieren die über die Zirkulationszeit gemessene Konzentration des Anthocyans in der Vorlage. Der Kurvenverlauf bei Rezirkulation ist exponentiell abfallend und nähert sich einem Grenzwert, welcher der Kapazität des Adsorbers für Anthocyane unter den gewählten Versuchsbedingungen entspricht.
Beispiel 3: Herstellung eines partikelgänqigen Membranadsorber-Moduls mit ka- tionenaustauschenden Gruppen
Analog zu DE 102 36 664 A1 wurde ein partikelgängiges Membranadsorber-Modul hergestellt. Dazu wurde ein rechteckiges Stück der in Beispiel 2 beschriebenen stark sauren Kationenaustauscher-Membran Sartobind® S der Sartorius Stedim Biotech GmbH mit einer Breite von 12 cm und einer Länge von 100 cm zusammen mit einem Gewebe der gleichen Größe des Typs XNP 4410 (Convet Plastics bv, Genk, Belgien) auf einen Plastikstab mit 1 cm Durchmesser aufgewickelt und diese Packung in ein Plastikrohr mit 14 cm Länge und 47 mm Durchmesser zentriert so eingepaßt, daß die äußerste Membran-Wicklung der inneren Rohrwandung direkt und flüssigkeitsdicht anlag. Es resultierte daraus ein durch das Gewebe gebildeter, partikelgängiger Kanal, der auf beiden Seiten von der aufgewickelten Membran begrenzt wurde. Aus dem gleichen Gewebe wurden Ronden mit einem Durchmesser von 47 mm gestanzt. Je acht dieser Ronden wurden auf die Packung auf der Anström- und Abströmseite des Wickels aufgelegt. Die Rohrenden wurden mit zentral durchbohrten und mit Schlaucholiven versehenen Gummistopfen geeigneter Größe verschlossen. Das Rohr wurde senkrecht in einen Halter eingesetzt und eine Schlauchpumpe mit einem Silikonschlauch an die Eingangsolive angeschlossen. An die Ablaufschlaucholive wurde ebenfalls ein geeigneter Silikonschlauch angeschlossen. Beide Schläuche wurden in ein Vorlagengefäß gesteckt. Das Totvolumen des gesamten Systems aus dem Adsorbermodul und den Schläuchen betrug 200 ml. Es wurden insgesamt drei baugleiche Module erstellt, die nachfolgend als M1 , M2 und M3 bezeichnet werden.
Beispiel 4: Adsorption von Anthocvanen an einem stark sauren Membranadsorber
M1 durch kontrollierte lineare Überströmung von M1 Das Vorlagengefäß wurde mit 500 ml Puffer befüllt und dieser für 5 min mit einer Flußrate von 300 ml/min durch das Adsorber-Modul zirkuliert. Der Puffer wurde verworfen, 300 ml frischer Puffer eingefüllt und der Vorgang wiederholt.
50 ml des Rohextrakts wurden zu 450 ml Puffer gegeben und mittels eines Magnetrührers durchmischt. Diese leicht trübe Suspension wurde mittels der Schlauchquetschpumpe mit einer Flußrate von 50 ml/min von unten nach oben durch den senkrecht stehenden Adsorber geleitet, dabei wurde jede Minute pro 50 ml Volumen am Ablauf eine Probe entnommen und die Extinktion E5i3 der Suspension in einem Spektralphotometer bei 513 mn gegen den Puffer als Blindwert bestimmt (vgl. Proben 1 bis 9). Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt:
EFrak stellt den Meßwert in der jeweiligen Fraktion und EE die Gesamtextinktion in der Fraktion als Produkt aus E513 und dem Volumen der jeweiligen Fraktion, d. h. 50 ml, dar. E513 (%) ergibt sich aus dem Extinktionswert der jeweiligen Probe EFrak dividiert durch den Ausgangswert EFrak (AL) = 0,85 und aus der Umrechnung in den Prozentwert. Die gebundene Menge an Anthocyanen ergibt sich aus der Subtraktion des jeweiligen Werts für „EE (gesamt)" von 42,5 (entsprechend 100 %). „E513 kumuliert" stellt die gesamte, während des Versuches gebundene Menge an Anthocyanen dar.
Tabelle 3:
Probe EFrak EE (gesamt) E513 (%) der Gebundene Gesamtin der Ausgangs- menge an Anthocy- Fraktion Lösung anen zum Zeitpunkt der Messung
AL 0,85 - 100 0
V/ml in der Fraktion E513 kumulier
1 50 0,19 9,5 22,4 33 33
2 100 0,37 18,5 43,5 24 57
3 150 0,42 21 49,4 21 ,5 78,5
4 200 0,44 22 51 ,8 20,5 99
5 250 0,45 22,5 52,9 20 119
6 300 0,47 23,5 55,3 19 138
7 350 0,48 24 56,5 18,5 156,5
8 400 0,48 24 56,5 18,5 175
9 450 0,50 25 58,8 17,5 192,5
V/ml bezeichnet das kumulierte Probenvolumen nach Ablauf des Versuchs mit der in Tabelle 3 angegebenen Nummer.
EE: Extinktionseinheiten
Es werden 45,3 % (= (192,5 EE / 425 EE) . 100 %) der bei dem Versuch eingesetzten Anthocyanmenge (425 EE), bestimmt über die Extinktionseinheiten (EE), gebunden.
Die Werte zeigen, daß die Bindung der Anthocyane an den Membranadsorber M1 im Verlauf des Versuches immer langsamer verläuft und daß die adsorbierte Menge einem Grenzwert zustrebt.
Der Adsorber wurde mit Puffer solange gewaschen, bis der Extinktionswert der Flüssigkeit im Ablauf praktisch auf Null gesunken war. Die gebundenen Anthocyane wurden vom Adsorber mit 200 ml Elutionsmittel, wie oben angegeben, durch Kreislaufförderung und anschließende Drainage eluiert.
Es wurde eine Massenbilanz erstellt. Da der/(die) spezifische(n) Extink- tionkoeffizient(en) des/der vorhandenen Anthocyans/Anthocyane nicht bekannt war(en), wurde mit den Gesamtextinktionen gerechnet, d. h. mit Etot (Ausgangslösung) = 0,85 · 500 ml = 425 und mit E2 = Etot Gewei'i9e Fraktion) / Etot (Ausgangslösung) * 100 %.
Tabelle 4 zeigt die Massenbilanz des Beispiels 4 bei linearer Überströmung:
Tabelle 4:
Fraktion ml E513 Etot E2 (%)
Ausgangslösung 500 0,85 425 100
Durchlauf 475 0,4 190 45
Gebunden — ~ 235 55
Waschen 300 0,23 69 16
Rest nach Waschen — — 166 39
Eluat 200 0,61 122 29
Die vom Adsorber eluierte Menge Anthocyan beträgt also 122/166 = 73 %.
Beispiel 5: Adsorption von Anthocyanen an einem stark sauren Membranadsorber durch kontrollierte zyklische Überströmung des Membranadsorbers M1 50 ml des Rohextrakts wurden zu 450 ml Puffer gegeben und mittels eines Magnetrührers durchmischt, welcher während des gesamten Versuches in Betrieb war (Drehzahl 500 Umdrehungen/min). Der als Vorlage dienende Erlenmeyerkolben hatte ein Nennvolumen von 500 ml, der Magnetrührstab war 3 cm lang.
Diese leicht trübe Suspension wurde mittels einer Schlauchquetschpumpe mit einer Flußrate von 50 ml/min von unten nach oben durch den senkrecht stehenden Adsorber geleitet, dabei wurde die am Ablauf austretende Flüssigkeit in die Vorlage zurückgeleitet und mit deren Inhalt kontinuierlich vermischt. Zu den in der Tabelle 5A angegebenen Zeiten t wurden aus der Vorlage Proben entnommen und die Extinktion der Suspension in einem Spektralphotometer bei 513 nm gegen den Puffer als Blindwert bestimmt. Die Tabellen 5A und 5B zeigen die erhaltenen Werte, wobei Ei und die gebundene Menge an Anthocyanen analog wie für Tabelle 3 definiert sind: Tabelle 5A:
t E513 Ei in % der AusgangsGebundene
(min) lösung Menge an
Anthocyanen im
Ablauf zum
Zeitpunkt der
Messung
AL(0) 0,82 100 0
5 0,66 80 20
10 0,54 66 34
16 0,45 55 45
23 0,39 48 52
29 0,35 43 57
36 0,32 39 61
41 0,31 38 62
47 0,30 37 63
53 0,29 35 65
Der Adsorber wurde durch Ablaufenlassens des abgereicherten Rohextraktes drainiert, mit Puffer gewaschen und anschließend mit dem Elutionsmittel eluiert.
Tabelle 5B:
Vorlageninhalt Volumen/ml E513
am Ende des
- Versuches 500 0,29
- Waschens 250 0,09
- der Elution 210 0,9
Es wurde analog zu Beispiel 4 eine Massenbilanz erstellt (Tabelle 6). Tabelle 6: Massenbilanz des Beispiels 5:
Fraktion V/ml E513 Etot E2 (%)
1) Ausgangslösung 500 0,82 410 100
2) Pool 500 0,29 145 35
3) Waschen 250 0,09 22,5 5,5
4) Gebunden ~ — 265 ~
5) Rest nach Waschen — — 242,5 100
6) Eluat 210 0,9 189 78
E2 = tot Geweilige Fraktion) / Etot (Ausgangslösung) * 100 % für Einträge 1) bis 4) bzw.
E2 = Etot (Eluat) / Etot (Rest nach Waschen) *100 %
Die vom Adsorber eluierte Menge beträgt also 189/242,5 = 78 %
Beispiel 6: Serielle Verschaltung der Membranadsorbermodule M1 , M2 und M3
Weitere Versuche wurden in ähnlicher Weise wie bei den Beispielen 4 und 5 durchgeführt, wobei unterschiedliche Mengen an Extrakt sowie eine unterschiedliche Anzahl von in Serie geschalteten Modulen verwendet wurden, so daß die aus dem ersten Modul M1 austretende Flüssigkeit durch das zweite nachgeschaltete Modul M2 geleitet wurde und die aus dem zweiten Modul austretende Flüssigkeit durch das dritte nachgeschaltete Modul M3 geleitet wurde. Dabei wurden ein Modul M1 bzw. drei Module M1 , M2 und M3 wie folgt betrieben: „Linear" bedeutet, daß das angegebene Volumen nur einmal durch einen Adsorber bzw. die drei in Reihe geschalteten Adsorber geleitet wurde,„Zirkulär" bedeutet, dass die Flüssigkeit im Kreis über die Adsorber geführt wurde. „Anz Mod" bedeutet die Anzahl der verwendeten Module (M1 , M2 und M3 oder nur M1 ) Eine Zusammenfassung der durchgeführten Versuche ist in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7: Ergebnisse der Versuche Nr. 1 bis 5 aus Beispiel 6
Nr. Art Anz. V/ml Εω(513) Elution**
Mod gebunden*
1 Linear 1 500 166 73
2 Zirkulär 1 500 242 78
3 Linear 3 1500 495 65
4 Linear 3 1000 331 94
5 Zirkulär 3 1000 400 76
* angegeben in Extinktionseinheiten EE
** Extinktionswert des Eluats angegeben in EE
Mit den beiden Verfahren der linearen und zirkulären Förderung des Extraktes durch die Adsorber werden Anthocyane extrahiert und können eluiert werden. Unabhängig von der Betriebsweise wurden mit steigendem Angebot an anthocyanhaltigem Rohextrakt auch steigende Mengen an Anthocyane gebunden. Die größte Kapazität wurde bei einer Beladung mit 1 ,5 I verdünntem Rohextrakt bei linearer Betriebsweise erreicht (Versuchsnr. 3).

Claims

Patentansprüche
Verfahren zum Isolieren von positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffen aus pflanzlichem Material, umfassend die Schritte:
(a) das Bereitstellen eines Extraktes aus pflanzlichem Material, welches positiv geladene, phenolische sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe enthält,
(b) das Kontaktieren des Extraktes mit einer mikroporösen Membran, welche kationenaustauschende Gruppen zur Wechselwirkung mit den positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe aufweist, wodurch die positiv geladenen phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe an der Membran adsorbiert werden, und
(c) das Eluieren der positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe von der Membran, wodurch eine die positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe enthaltende Lösung erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das pflanzliche Material aus der Gruppe, bestehend aus Früchten, insbesondere Beeren, Gemüse, Hülsenfrüchten, Knollen, Zwiebeln, Rüben, Tee, Kakao, Kaffee, Holz, Blüten, Samen, Blättern und Zapfen von Nadelbäumen, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe aus der Gruppe, bestehend aus Flavonoiden, insbesondere Flavonen, Flavonolen, Flavanonen, Flavanonolen, Anthocyanen, Proanthocyanen, Isoflavonoiden und Biflavonoiden, ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die positiv geladenen, phenolischen sekundären Pflanzeninhaltsstoffe aus der Gruppe, bestehend aus Flavonolen, ausgewählt aus Kämpferoi, Quercetin, Myricetin, sowie deren Arabinosiden, Galactosiden, Glucosiden, Glycosiden, Rhamnosiden und Xylosiden; Flavanonen, ausgewählt aus Isosakuranetin, Naringenin, Hesperitin, Eriodictyol, sowie deren Glycosiden, Rutinosylderivaten und Neohesperidosylderivaten; Anthocyanen, ausgewählt aus den Glycosiden von Pelargonidin, Cyanidin, Päonidin, Delphinidin, Petunidin und Malvidin; Proanthocyanen, ausgewählt aus den Glycosiden der Procyanidine und Prodelphinidine; Isoflavonen, ausgewählt aus Genistein, Daidzein, Glycetein, sowie deren Glycosiden; ausgewählt sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die kationenaustauschenden Gruppen aus der Gruppe der schwachen oder starken Kationenionenaustauscherliganden ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der schwache Kationenaustauscherligand aus der Gruppe der Methacrylat-, Carboxymethyl- oder Orthophosphatgruppen ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der starke Kationenaustauscherligand aus der Gruppe der Sulfoalkyl-, Sulfonat-, und der Sulfatgruppen sowie aus der Gruppe von Heparin und seinen Derivaten ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das zum Eluieren in Schritt (c) verwendete Eluens aus Wasser ist oder aus der Gruppe der wäßrigen Lösungen von Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalzen von organischen oder anorganischen Säuren ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die kationenaustauschenden Gruppen Sulfonatgruppen sind und die mikroporöse Membran aus Cellulosehydrat besteht und als Eluens in Schritt c) eine Lösung von Natriumchlorid und Kaliumphosphat in einem Gemisch aus Wasser, Ethanol und 1- oder iso-Butanol verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, nach Schritt (a) und vor Schritt (b) weiter den Schritt umfassend:
(a2) das Homogenisieren des Pflanzenextraktes derart, daß die im Pflanzenextrakt enthaltenen Partikel eine Größe von nicht mehr als 0,5 mm aufweisen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, nach Schritt (b) und vor Schritt (c) weiter den Schritt umfassend:
(b2) das Entfernen von auf der Membran verbliebenen Pflanzenresten aus dem Pflanzenextrakt durch Waschen mit einem wäßrigen Medium.
12. Nahrungsmittelzusatz, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
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