WO2012113752A1 - Abtastmikroskop und verfahren zur lichtmikroskopischen abbildung eines objektes - Google Patents

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light beam
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excitation
lens
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Werner Knebel
Arnold Giske
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Leica Microsystems CMS GmbH
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    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to a scanning microscope with a lighting unit for emitting an illumination light beam, a lens for producing an oblong illumination focus in an object to be imaged and a scanning device for moving the illumination focus over a target area of the object to be illuminated by changing the direction of incidence in which the illumination light beam enters an entrance pupil of the lens falls. Furthermore, the invention relates to a method for light microscopic
  • Scanning or scanning microscopes are known from the prior art, which are used for example in fluorescence microscopy to excite dyes with laser light to emit fluorescence radiation, which is then detected by a detector for imaging of the object to be examined.
  • Confocal scanning microscopes are used in this field of microscopy, in contrast to
  • Such a confocal microscope usually has a so-called point scanner as a scanning device which transmits the illumination light beam emitted by the illumination unit into the entrance pupil of the
  • Microscope lens directs.
  • the microscope lens shapes that into hers
  • the entrance pupil incident illuminating light beam in a focused light distribution which is hereinafter referred to as the illumination focus.
  • Shape and size of the illumination focus depend on the optical
  • the lens produces an elongated illumination focus, the extension of which is smaller transverse to the optical axis than along the optical axis.
  • the illumination focus is then moved to scan the object transversely to the optical axis, for example, the point scanner changes the angle of incidence, for example via a movable mirror assembly, under which the illumination light beam in the
  • Entry pupil of the lens falls.
  • SPIM Selective Plane Illumination Microscopy
  • Detection lens at an angle of 90 degrees to each other are arranged.
  • the illumination lens generates, in cooperation with a cylindrical lens preceded by it, an approximation level
  • Illumination light distribution that passes through the object along the optical axis of the illumination objective.
  • a light distribution is often referred to as a light sheet or lens.
  • the target area of the object illuminated by this light sheet is illuminated by the detection field j, whose optical axis is perpendicular to the light sheet
  • Detection area e.g. a CCD, pictured. If now the illuminating light sheet is moved within the object to be imaged, then with this arrangement, tomograms of the object can be taken.
  • Illumination lens have a correspondingly high numerical aperture, wherein the free working distance of theansobj ective must be correspondingly large in order to avoid a collision with the Detektobj ekti v.
  • the numerical aperture of the illumination objective thus defines the thickness of the light sheet and thus the optical resolution along the optical axis of the detection objective.
  • the entrance pupil of the lens is decentralized
  • the illumination light beam passes through a part of the entrance pupil, which is offset transversely to the optical axis.
  • a cylinder lens arranged in front of the lens generates in the object an illuminating light sheet, which is inclined to the optical axis of the lens.
  • the illuminated by this light sheet target area of the object is then again imaged by the lens.
  • the above-described devices each operate with a cylindrical lens to achieve the desired oblique illumination of the object.
  • the use of such a cylindrical lens has disadvantages.
  • these devices are designed exclusively for oblique illumination by means of a light sheet and do not allow any deviating application, eg a pointwise confocal scanning.
  • Oblique lighting generated light sheet can vary. This is not possible with a cylindrical lens.
  • the object of the invention is to provide a scanning microscope, in particular a confocal scanning microscope, which allows flexible illumination of the object to be imaged in a simple manner.
  • the invention solves this problem in a scanning microscope of the type mentioned in that the scanning the
  • Directed illumination beam for tilting the illumination focus relative to the optical axis of the lens to a pupil center offset portion of the entrance pupil and for moving the
  • Illumination focus on the target area to be illuminated changes the direction of incidence of the illumination light beam within this subarea.
  • the invention envisages a decentralized illumination of the entrance pupil of the objective with the illuminating light beam, in that the
  • Illuminating light beam is passed to a part of the entrance pupil offset from the pupil center.
  • the illumination of the entrance pupil i. the measure that the illuminating light beam does not pass through the entire area of the entrance pupil and thus does not use the full aperture, causes a widening of the (from the outset elongated)
  • the illumination focus is inclined relative to the optical axis of the objective.
  • the flared and tilted illumination focus can now be used to sequentially build a light sheet illuminating the target area.
  • the scanning device which for a corresponding scanning movement of the illumination light beam in the
  • Entrance pupil of the lens provides.
  • This scanning movement corresponds to a tilting of the illumination light beam about a tilting point, which lies in the region of the entrance pupil.
  • the illumination light beam which of course does not constitute a beam in the mathematical sense, but rather a bundle of light beams, remains stationary (at least approximately) in the area of the entrance pupil, while being at a distance from the entrance pupil
  • Entrance pupil in the direction of the scanning device as it were a
  • Illuminating light beam translates the objective into a corresponding movement of the oblique illumination focus transversely to the optical axis.
  • the actual magnitude of the movement of the illumination focus in the object depends on the specific structure of the objective. It is essential, however, that the tilting of the illumination light beam effected by the scanning device is used according to the invention to move the illumination focus within the target area of the object and thus build up a light sheet which illuminates the target area.
  • the scanning microscope according to the invention for generating the light sheet makes use of the fact that the scanning periods with which today
  • Scanning devices can be operated so short that they are significantly lower than the detection cycles commonly used light detectors. Since in the case of the light sheet generation only one line (in X or Y-direction) is generated, the total duration of illumination for the complete light sheet is dependent on the scanning rate of the illumination scanner, ie the scanning device. Depending on the scanner type, this can be in the range of 1 Hz to several 10 KHz.
  • the light detector primarily an area detector, CCD, CMOS, APD array, etc.
  • Example values for the sampling period are in the range of a few hundredths of a millisecond to 1 second, while the detection time for the whole of the light sheet plane (depending on the detector resolution, e.g., 512x512 pixels) is e.g. between a few milliseconds and seconds, as long as it is ensured that the sampling period is less than the detection time.
  • the invention enables a particularly efficient generation of the
  • Illuminating light beam is introduced. If the scanning microscope is then to work again with point-by-point illumination, then the optical element only has to come out of the light path of the optical system
  • Lighting beam can be removed.
  • the scanning microscope according to the invention makes it possible to record high-resolution sectional images of the object.
  • the object is scanned stepwise with the light sheet. This scanning is done by moving the lens and the object along the optical axis relative to each other.
  • the scanning device changes the direction of incidence of
  • Illumination focus formed light sheet within a plane of incidence, which is offset parallel to the optical axis of the lens.
  • the entrance pupil is made circular
  • the above-mentioned plane of incidence in the plan view of the entrance pupil forms a straight line which intersects the circle defined by the pupil edge in the manner of a secant in two mutually different points, without crossing the center of this circle .
  • the illuminating light beam then performs a tilting movement along this secant.
  • the objective converts this tilting movement into a corresponding movement of the illumination focus along a straight line which runs parallel to the aforementioned secant. In this way, the desired light sheet for illuminating the target area can be generated in a simple manner.
  • the Abtastvorri rect a in the light path of the illumination light beam between the
  • Offset element through which the plane of incidence of the illumination light beam is offset parallel to the optical axis of the lens.
  • This offset element can, for example, a glass wedge, a plane-parallel plate, an optical or photonic crystal, a spatial light modulator, short SLM, a Micro mirror actuator, short DMD, etc.
  • the scanning device it is also possible to arrange the scanning device relative to the entrance pupil of the objective so that the illuminating light beam falls in the desired manner in a decentralized manner into the entrance pupil.
  • it is possible to crop the illumination light beam in its light path in front of the scanning device for example by a shutter from one side so that the desired decentralized
  • Beam offset can be used. For example, one in one
  • Scanning microscope usually present decoupling beamtei 1er, which transmits the illuminating light beam in the direction of the lens while it reflects the light originating from the object detection light in the direction of the light detector, be formed from a (eg correspondingly coated) glass substrate whose thickness is such that the desired Beam offset, which is usually in a range of a few millimeters, is effected.
  • the scanning device has an actuating element for introducing and removing the optical displacement element into or out of the light path of the illumination light beam.
  • the offset element can be introduced into the illumination light beam path as desired and removed therefrom, so as to be able to interpose, for example, between a conventional confocal illumination and the invention
  • the example wedge-shaped offset element incrementally in the light path of the illumination light beam to move so as to cause any decentering of the illumination light beam relative to the lens.
  • the scanning device has an in the light path of the illumination light beam between the
  • Beam setting for changing the beam diameter of the emitted from the illumination unit illumination light beam is a Beam setting for changing the beam diameter of the emitted from the illumination unit illumination light beam.
  • Beam adjustment allows the beam diameter of the
  • a confocal scanning microscope often has a beam-expanding optical system in order to widen the illumination light beam emitted by the illumination unit so that the entrance pupil of the objective is fully illuminated and thus the full aperture is utilized. If such an optical system is present in the scanning microscope anyway, then it can also be used to correspondingly reduce the beam diameter in order to bring about the inventive illumination of the entrance pupil.
  • the illumination light beam is composed of an excitation light beam and a deenergizing light, which are superimposed on each other before entering the scanning device.
  • the objective generates an excitation focus from the excitation light beam and a de-excitation focus from the deexcitation light beam, which are superposed on each other to the illumination focus.
  • the so-called STED method can be used, the spatial Increase resolution beyond the diffraction limit.
  • the Abregungslichtstrahl fluorescent dyes that are used to mark individual areas of the object, in a conventional manner deliberately de-energized and thus turned off to increase the resolution.
  • Scanning microscope can by applying the STED method
  • Effectiveness of the illumination focus by the excitation light beam is superimposed on the Abregungslichtstrahl increased to increase the resolution and thus the resulting light sheet are thinned.
  • the excitation light beam is superimposed before reaching the scanning device, the two superimposed light beams are tilted by the scanning device together in the entrance pupil of the lens.
  • the de-focus has a spatial
  • Lighting focus is moved to produce a light sheet, a
  • the above-mentioned embodiment provides a de-focus focus which is in cross section (above and below the plane in which the illumination focus for
  • Intensity cross-section profile preferably formed symmetrically with two equal sized maxima and an intermediate zero point as a minimum.
  • the surface of the light sheet is defined by the length of the moving illumination focus, while the sheet thickness is defined by the extent of the
  • Illumination focus is set transversely to the plane in which the illumination focus is moved.
  • the de-excitation focus described above is now just shaped so that it reduces the excitation efficiency of the excitation focus only in the direction of the lateral extension, but not in the direction of the longitudinal focal length.
  • phase plate for example, which arranges the spatial intensity distribution of the light source, is arranged in the light path of the depletion light beam
  • phase plate is preferably arranged in front of the scanning device in the light path of the depletion light beam.
  • it can also be formed directly in front of the entrance pupil of the objective, for example on a decoupling beam divider arranged in front of the objective.
  • the scanning microscope according to the invention comprises an element for varying the intensity of the illumination light beam within a scanning period during which the illumination focus is moved over the target area. This embodiment uses the fact that the
  • Lighting focus is spanned. This makes it possible to realize a modulated or structured illumination of the target area.
  • the intensity of the illumination light beam is varied.
  • the intensity of the illumination light beam at any time within the sampling period and thus at any point of the
  • Target area can be set as desired.
  • an acousto-optically tunable filter AOTF
  • AOM acousto-optic modulator
  • EOM electro-optic modulator
  • the scanning microscope comprises detection optics having a first partial optics for intermediate imaging of an image of the target area illuminated obliquely to the illumination focus, and a second partial optics for imaging that of the first Partial optics generated intermediate image on a detection surface, which is arranged parallel to the intermediate image.
  • the two partial optics ensure an alignment of the target area imaged by the oblique illumination through the objective.
  • a picture erection is also possible in other ways, for example by a so-called Scheimpflug arrangement.
  • a detection surface on which finally the erect image of the target area for example, a CCD, an sCMOS or other area detectors such as an APD array can be used.
  • the intensity of the illumination light beam is varied within a scanning period during which the illumination focus is moved over the target area.
  • Suitable fluorescent dyes are switchable fluorescent proteins, fluorescent dyes such as ATTO, Alexa, rhodamine derivatives, fluorescein derivatives, nanocrystals, etc.
  • About the oblique illumination can either the fluorescent
  • Components are activated or driven into saturation. Dosed illumination ensures that single-molecule detection is possible. The locations of the fluorescent dyes can then be determined by determining the center of gravity of the detected photons.
  • the method according to the invention can be used particularly profitably in small animal imaging, for example fluorescence imaging on fish, since the objects used here are readily accessible.
  • FIG. 1 shows a confocal scanning microscope as a first embodiment
  • FIG. 2 shows a comparison with the scanning microscope according to FIG. 1
  • FIG. 3 is a modified third embodiment of the scanning microscope according to FIG. 2;
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing the complete one used in conventional confocal scanning microscopy
  • Figure 5 is a schematic diagram illustrating the illumination light beam scanning used in conventional confocal scanning microscopy
  • Figure 6 is a schematic representation of the inventive
  • Figure 7 is a schematic diagram illustrating the scanning according to the invention by tilting the illumination of the entrance pupil illuminating light beam.
  • Figure 8 is a schematic representation of the inventive
  • FIG. 1 shows a confocal scanning microscope 10 first
  • the scanning microscope 10 forms a confocal fluorescence microscope, which is designed, using the known STED method, a beyond the diffraction limit spatial
  • the scanning microscope 10 comprises a first laser light source 12, hereinafter referred to as excitation light source, and a second laser light source 15, hereinafter referred to as
  • the excitation light source 12 emits an excitation light beam 14 whose wavelength is selected so that the fluorescent dyes used in the microscopy method used excited to emit fluorescence radiation.
  • the de-excitation light source 15 emits a depletion light beam 16, the
  • Excitation light beam 14 is superimposed in the manner described below, and whose wavelength is selected so that by the
  • the excitation light beam 14 is incident on a mirror 20 and is reflected thereon in the direction of a beam splitter 22.
  • the beam splitter 22 is so
  • the illumination light beam 24 is configured to transmit the excitation light beam 14 while reflecting the depletion light beam 16 incident thereon. In this way, the excitation light beam 14 and the Abregungslichtstrahl 16 influenced in its intensity profile by the phase plate 18 are superimposed on each other.
  • the beam formed by the two superimposed light beams 14 and 16 is referred to below as the illumination light beam 24.
  • the illumination light beam 24 strikes a galvanomirror arrangement 26, which is shown purely schematically in FIG.
  • Illumination light beam 24 through a scanning lens 28, a tube lens 30 and a beam splitter 32 and finally strikes a lens 34th
  • the illuminating light beam 24 entering the objective 34 does not completely illuminate an entrance pupil of the objective 34 designated by 36 in FIG. This means that the illumination light beam 24 passes through only a portion of the entrance pupil 36 and thus does not use the full aperture of the objective 34.
  • the entering into the lens 34 does not completely illuminate an entrance pupil of the objective 34 designated by 36 in FIG.
  • the illumination light beam 24 is thus on directed the lens 34 that it illuminates the entrance pupil 36 decentralized.
  • Illumination light beam 24 is achieved in the present exemplary embodiment in that the light reflected from the galvanomirror arrangement 26
  • Illuminating light beam 24 with a parallel offset relative to the optical axis O falls on an edge region of the scanning lens 28.
  • This parallel offset causes the illuminating light beam 24 emerging from the scanning lens 28 to first cross the optical axis O and subsequently to fall on an edge region of the tube lens 30, this edge region on the other side of the optical axis O being the light-penetrated edge region of the scanning lens 28 located. From the tube lens 30 then enters the
  • Illumination light beam 24 with respect to the optical axis O parallel offset in the entrance pupil 36 of the lens 34 a.
  • the tube lens 30 deflects the illumination light beam 24 so that it falls with a parallel offset relative to the optical axis O in the entrance pupil 36 of the objective 34.
  • the mirror 20 and the beam splitter 22 already ensure that the illumination light beam 24 composed of the excitation light beam 14 and the depletion light beam 16 has a parallel offset relative to the optical axis O on the
  • Galvano-mirror assembly 26 drops. This parallel offset can be adjusted by means of an actuating element 38.
  • the actuator 38 shifts the mirror 20 and the beam splitter 22 as a unit transverse to the optical axis O.
  • the above-described components 20, 22, 26, 28, 30, and 38 form a scanning device which serves to tilt the illuminating light beam 24 in the entrance pupil 36 of the objective 34, as described in more detail below is described.
  • the objective 34 converts the illuminating light beam 24 entering its entrance pupil 36 into an illumination focus, not shown in FIG. 1, which is caused by the tilting movement of the illuminating beam 24
  • Scanning device is moved over a target area of an object to be imaged 40.
  • a light sheet is generated which is inclined by the decentralized entry of the illumination light beam 24 into the entrance pupil 36 of the objective 34 with respect to the optical axis O.
  • This light sheet is designated in the schematic representation of Figure 1 with 42.
  • the fluorescence radiation originating from the target area of the object 40 illuminated by the light sheet 42 is in turn detected by the objective 34.
  • the fluorescence radiation is reflected at the beam splitter 32 in the direction of a detection optics generally designated 44 in FIG.
  • Detection optics 44 comprises a first detection objective 46, which is arranged downstream of a tube lens system 47, which consists of two tube lenses 49, 51.
  • the tube lens 49 is associated with the objective 34, while the tube lens 51 is associated with the first detection objective 46.
  • the tube lens 49 in cooperation with the objective 34, generates a first intermediate image 53.
  • the optical axis of the first labeled O 'in FIG.
  • Detection lens 46 is perpendicular to the optical O of the lens 34. Since the illuminated with the light sheet 42 target area is arranged obliquely to the optical axis O of the lens 34, and the first intermediate image 53 is oblique to the optical axis O 'of the first detection lens 46th Dasachi Detektions Acceptiv 46 forms, in cooperation with the tube lens 51, the first intermediate image 53 into a second intermediate image 48, which is also arranged obliquely to the optical axis O '.
  • the detection optics 44 further comprises a second detection objective 50, which the second intermediate image 48 via a tube lens 52 on a
  • Detection surface 54 of a light detector 55 images.
  • the designated O "optical axis of the second detection lens 50 is perpendicular to the second intermediate image 48 and perpendicular to the detection surface 54.
  • a slide 56 In order to record a series of high-resolution sectional images of the object 40, a slide 56, on which the object 40 is arranged, is moved successively along or across the optical axis O in the present embodiment. In this way, a high-resolution, three-dimensional image of the object 40 can be made.
  • Figure 2 shows a modified embodiment as a second
  • the parallel displacement of the illumination light beam 24 with respect to the optical axis O of the objective 34 before entering the entrance pupil 36 is effected in a manner different from that in the first embodiment. So spreads the
  • the beam splitter 58 is formed from a comparatively thick, plane-parallel substrate which, during the passage of the
  • Illuminating light beam 24 ensures the desired parallel offset relative to the optical axis O.
  • the beam splitter 59 can be adjusted transversely to the optical axis O in order to vary the parallel offset.
  • FIG. 3 shows a third exemplary embodiment. The third exemplary embodiment differs from the embodiment shown in FIG. 2 in that the beam splitter 58 formed from a plane-parallel substrate is replaced by a wedge-shaped beam splitter 59. Also in this embodiment, the beam splitter 59 is displaceable by means of the adjusting element 60 in order to effect the desired parallel offset of the illumination light beam 24.
  • FIGS. 4 to 8
  • Illumination light beam 24 is formed solely of the excitation light beam 14, i. no overlay with the Abregungslichtstrahl 16 takes place.
  • FIG. 4 firstly illustrates the case typical of a conventional confocal, point-by-point scan in which the signal transmitted through the
  • the illumination light beam 24 is aligned parallel to the optical axis O.
  • the lens 36 produces a focused light distribution whose extension along the optical axis O is greater than transverse to the optical axis O.
  • This light distribution referred to as illumination focus in the present application, is 62 in FIG.
  • FIG. 4 also shows a top view of the illumination focus 62 in the direction of the z-axis.
  • the illumination focus 62 is circular in plan view.
  • FIG. 5 now shows how the position of the illumination focus 62 changes when the illumination light beam 24 in the entrance pupil 36 is tilted by the scanning device described above. It is assumed for the case shown in Figure 5 that the main beam of the through
  • Illuminating light beam 24 formed beam is tilted in an incident plane which is parallel to the x-z plane. Furthermore, the
  • Illumination beam 24 still pass through the entire area of the entrance pupil 36, i. fully illuminate the entrance pupil 36.
  • the illumination light beam 24 is tilted in the plane of incidence such that it changes its direction of incidence relative to the optical axis O.
  • This change in the direction of incidence is converted by the objective 34 into a displacement of the illumination focus 62 transversely to the optical axis O.
  • this movement takes place along the x-axis. Since the illumination light beam 24 still passes through the entire surface of the entrance pupil 36, the illumination focus 62 remains aligned with its longitudinal extension parallel to the optical axis O. This is also evident in the plan views shown in FIG. 5 under B, in which the illumination focus 62 is still circular.
  • FIG. 6 shows the illumination of the entrance pupil 36 according to the invention. As can be seen in FIG.
  • the illumination light beam 24 passes through only a partial area of the entrance pupil 36, this partial area being arranged in a decentralized manner, ie offset transversely to the optical axis O from the pupil center.
  • This decentering of the illumination light beam 24 in the entrance pupil 36 causes the illumination focus 62 to be skewed relative to the optical axis O.
  • Illumination focus 62 is greater overall than when the entrance pupil 36 is fully illuminated.
  • FIG. 7 shows the case in which the illuminating light beam 24 illuminating the entrance pupil 36 in the entrance pupil 36 is tilted. It should be assumed for the case shown in Figure 7 that the main beam of the illuminating light beam 24 forming beam is tilted in a plane parallel to the optical axis O incidence plane which is parallel to the y-z plane. This means that the illumination light beam 24 in FIG. 7 is tilted out of the drawing plane and into it.
  • This tilting of the illumination light beam 24 is converted by the objective 34 into a corresponding displacement of the obliquely set illumination focus 62 along the y-axis. Accordingly, the illumination focus 62 in FIG. 7 is shifted out of the drawing plane and into it. This is illustrated again in FIG. 7 under D.
  • the motion sequence of the illumination focus 62 shown at D in Figure 7 illustrates how the light sheet 42 is built by moving the illumination focus 62 within a sample period. The prerequisite for this is that the sampling period in which the illumination focus 62 is moved over the entire target area is shorter than the detection time with which
  • Light detector 54 operates to image. As a result, the light detector 54 detects the moving illumination focus 62 temporally and thus not spatially resolved. Rather, it detects a coherent or continuous light distribution in the form of the light sheet 42.
  • FIG. 8 shows the case in which the illumination light beam 24 consists of a superposition of the excitation light beam 14 and of the illumination light beam 24
  • the objective 34 generates an excitation focus 64 and a de-excitation focus 66 which, when superimposed, produce the illumination focus 62.
  • the excitation focus 64 corresponds in shape to that shown in FIGS. 5 and 6
  • the Abregungsfokus 66 is shown in Figure 8 under E again in a section parallel to the x-z plane. As can be seen in particular from this illustration, the relaxation focus 66 has a spatial
  • composite illumination focus 62 is zero, while having a maximum on either side of that plane.
  • the above-mentioned plane of movement is designated 68 in FIG. It lies parallel to a plane which contains the y-axis and whose
  • Line of intersection with the xz-plane forms an angle with the x-axis. This angle depends on the maximum opening angle of the used Lens 34 and the expansion and decentration of the illumination light beam 24th
  • Movement plane 68 is superimposed by the Ausregungsfokus 66, the excitation efficiency of the excitation focus 62 is reduced from above and below the plane of motion 68 ago.
  • the excitation-effective part of the excitation focus is indicated by hatching in FIG. 8 under E.
  • Light sheet 42 is becoming thinner, whereby the spatial resolution is increased.

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Abstract

Beschrieben ist ein Abtastmikroskop (10) mit einer Beleuchtungseinheit (12, 15) zum Aussenden eines Beleuchtungslichtstrahls (24), einem Objektiv (34) zum Erzeugen eines länglichen Beleuchtungsfokus (62) in einem abzubildenden Objekt (40) und einer Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) zum Bewegen des Beleuchtungsfokus (62) über einen zu beleuchtenden Zielbereich des Objektes (40) durch Ändern der Einfallsrichtung, in der der Beleuchtungslichtstrahl (24) in eine Eintrittspupille (36) des Objektivs (34) fällt. Die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) richtet den Beleuchtungslichtstrahl (24) zum Schrägstellen des Beleuchtungsfokus (62) relativ zur optischen Achse (O) des Objektivs (34) auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille (36) und ändert die Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) innerhalb dieses Teilbereichs, um den Beleuchtungsfokus (62) über den zu beleuchtenden Zielbereich zu bewegen.

Description

Abtastmikroskop und Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines
Objektes
Die Erfindung betrifft ein Abtastmikroskop mit einer Beleuchtungseinheit zum Aussenden eines Beleuchtungslichtstrahls, einem Objektiv zum Erzeugen eines länglichen Beleuchtungsfokus in einem abzubildenden Objekt und eine Abtastvorrichtung zum Bewegen des Beleuchtungsfokus über einen zu beleuchtenden Zielbereich des Objektes durch Ändern der Einfallsrichtung, in der der Beleuchtungslichtstrahl in eine Eintrittspupille des Objektivs fallt. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur lichtmikroskopischen
Abbildung eines Objektes.
Aus dem Stand der Technik sind Abtast- oder Scanmikroskope bekannt, die beispielsweise in der Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt werden, um mit Laserlicht Farbstoffe zur Emission von Fluoreszenzstrahlung anzuregen, die dann zur Abbildung des zu untersuchenden Objektes von einem Detektor erfasst wird. Auf diesem Gebiet der Mikroskopie kommen insbesondere konfokale Abtastmikroskope zum Einsatz, die im Unterschied zu
konventionellen Lichtmikroskopen zu einem bestimmten Zeitpunkt nicht das gesamte Objekt beleuchten, sondern einen in der Regel beugungsbegrenzten Lichtfleck erzeugen, mit dem das Objekt Punkt für Punkt abgetastet wird. Die von dem Detektor in den einzelnen Objektpunkten erfassten Lichtsignale werden dann zu einem Gesamtbild des Objektes zusammengesetzt.
Ein solches Konfokalmikroskop weist üblicherweise einen so genannten Punktscanner als Abtastvorrichtung auf, der den von der Beleuchtungseinheit abgegebenen Beleuchtungslichtstrahl in die Eintrittspupille des
Mikroskopobjektivs lenkt. Das Mikroskopobjektiv formt den in ihre
Eintrittspupille einfallenden Beleuchtungslichtstrahl in eine fokussierte Lichtverteilung um, die im Folgenden als Beleuchtungsfokus bezeichnet wird. Form und Größe des B eleuchtungs fokus hängen von den optischen
Eigenschaften, insbesondere der numerischen Apertur des Objektivs ab. Fällt der Beleuchtungslichtstrahl mittig und senkrecht, d.h. längs der optischen Achse in die Eintrittspupille des Objektivs, so erzeugt das Objektiv einen länglichen Beleuchtungsfokus, dessen Ausdehnung quer zur optischen Achse kleiner als längs der optischen Achse ist. Der Beleuchtungsfokus wird dann zum Abtasten des Objektes quer zur optischen Achse bewegt, indem der Punktscanner beispielsweise über eine bewegliche Spiegelanordnung den Einfallswinkel ändert, unter dem der Beleuchtungslichtstrahl in die
Eintrittspupille des Objektivs fällt.
Um mittels eines Konfokalmikroskops eine dreidimensionale Abbildung vorzunehmen, muss also das Objekt in oben beschriebener Weise punktweise abgetastet werden. Da dies vergleichsweise aufwändig ist, wurde in jüngerer Vergangenheit ein in der Literatur als SPIM (Selective Plane Illumination Microscopy) bezeichnetes Mikroskopierverfahren vorgeschlagen. Dieses Verfahren arbeitet mit einem Beleuchtungsobjektiv und einem
Detektionsobjektiv, die unter einem Winkel von 90 Grad zueinander angeordnet sind. Das Beleuchtungsobjektiv erzeugt im Zusammenwirken mit einer ihm vorgeordneten Zylinderlinse eine näherungs weise ebene
Beleuchtungslichtverteilung, die das Objekt längs der optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs durchsetzt. Eine solche Lichtverteilung wird häufig auch als Lichtblatt oder Lichtscheibe bezeichnet. Der durch dieses Lichtblatt beleuchtete Zielbereich des Objektes wird durch das Detektionsob j ekti v, dessen optische Achse senkrecht zu dem Lichtblatt verläuft, auf eine
Detektionsfläche, z.B. ein CCD, abgebildet. Wird nun das beleuchtende Lichtblatt innerhalb des abzubildenden Objektes bewegt, so können mit dieser Anordnung Schichtbilder des Objektes aufgenommen werden.
Um ein möglichst dünnes Lichtblatt zu erzeugen, muss das
Beleuchtungsobjektiv eine entsprechend hohe numerische Apertur aufweisen, wobei der freie Arbeitsabstand des Beleuchtungsobj ektivs entsprechend groß sein muss, um eine Kollision mit dem Detektionsobj ekti v zu vermeiden. Die numerische Apertur des Beleuchtungsobjektivs definiert demnach die Dicke des Lichtblattes und damit die optische Auflösung längs der optischen Achse des Detektionsobj ektivs.
Bei einem in der WO 2010/012980 AI beschriebenen abgewandelten SPIM- Verfahren erfolgen Beleuchtung und Detektion mit ein und demselben
Objektiv. Hierzu wird die Eintrittspupille des Objektivs dezentral
unterleuchtet, d.h. der Beleuchtungslichtstrahl tritt durch einen Teil der Eintrittspupille, der quer zur optischen Achse versetzt ist. Eine vor dem Objektiv angeordnete Zylinderlinse erzeugt in dem Objekt ein beleuchtendes Lichtblatt, das zur optischen Achse des Objektivs schräggestellt ist. Der durch dieses Lichtblatt beleuchtete Zielbereich des Objektes wird dann wiederum durch das Objektiv abgebildet. Die vorstehend beschriebenen Einrichtungen arbeiten jeweils mit einer Zylinderlinse, um die gewünschte Schrägbeleuchtung des Objektes zu erzielen. Die Verwendung einer solchen Zylinderlinse hat jedoch Nachteile. So sind diese Einrichtungen ausschließlich auf eine Schrägbeleuchtung mittels eines Lichtblattes ausgelegt und ermöglichen keine davon abweichende Anwendung, z.B. eine punktweise konfokale Abtastung. Auch wäre es wünschenswert, die räumliche Verteilung der Lichtintensität des zur
Schrägbeleuchtung erzeugten Lichtblattes variieren zu können. Dies ist mit einer Zylinderlinse nicht möglich.
Aus der DE 10 2005 007 756 AI ist ein Abtastmikroskop bekannt, bei dem der Beleuchtungslichtstrahl zum Schrägstellen des Beleuchtungsfokus auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille des Objektivs gerichtet wird.
In der DE 10 2007 045 897 AI ist ein Mikroskop offenbart, bei dem das Lichtblatt mittels eines Scanners erzeugt wird.
Zur weiterführenden Literatur wird ferner verwiesen auf A.H. Voie et al.:„Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens", Journal of Microscopy 170, 229-236 (1993); J. Huisken, J. Swoger, F. Del Bene, J. Wittbold, E. II. K. Stelzer:„Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane Illumination microscopy", Science 305, 1007 (2004); F. Fahrbach, A. Rohrbach: "Microscopy with non diffracting beams", FOM 2009, Krakau; C. Dunsby: "Optically sec- tioned imaging by oblique plane mirror microscopy", Optics Express Vol. 16, 25 (2008); DE 10 2005 027 077 AI ; DE 44 16 558 C2; US 5 952 668; WO 2006/127692 A2; DE 10 2006 021 317 B3; WO 2007/128434 AI ; US
2009/01354342 AI ; DE 10 2008 024 568 AI ; US 2008/0032414 AI . Aufgabe der Erfindung ist es, ein Abtastmikroskop, insbesondere ein konfokales Abtastmikroskop, anzugeben, das in einfacher Weise eine flexible Beleuchtung des abzubildenden Objektes ermöglicht.
Die Erfindung löst diese Aufgabe bei einem Abtastmikroskop eingangs genannter Art dadurch, dass die Abtastvorrichtung den
Beleuchtungslichtstrahl zum Schrägstellen des Beleuchtungsfokus relativ zur optischen Achse des Objektivs auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille richtet und zum Bewegen des
Beleuchtungsfokus über den zu beleuchtenden Zielbereich die Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb dieses Teilbereichs ändert.
Die Erfindung sieht zum einen vor, die Eintrittspupille des Objektivs mit dem Beleuchtungslichtstrahl dezentral zu unterleuchten, indem der
Beleuchtungslichtstrahl auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille geleitet wird. Die Unterleuchtung der Eintrittspupille, d.h. die Maßnahme, den Beleuchtungslichtstrahl nicht die gesamte Fläche der Eintrittspupille durchsetzen zu lassen und damit nicht die volle Apertur zu nutzen, bewirkt eine Aufweitung des (von vorneherein länglichen)
Beleuchtungsfokus sowohl in Längs- als auch in Querrichtung. Da der Beleuchtungslichtstrahl zudem außermittig auf die Eintrittspupille fällt, wird der Beleuchtungsfokus relativ zur optischen Achse des Objektivs schräg gestellt.
Der in dieser Weise aufgeweitete und schräg gestellte Beleuchtungsfokus kann nun dazu genutzt werden, sequenziell ein den Zielbereich beleuchtendes Lichtblatt aufzubauen. Hierzu dient die Abtastvorrichtung, die für eine entsprechende Abtastbewegung des Beleuchtungslichtstrahls in der
Eintrittspupille des Objektivs sorgt. Diese Abtastbewegung entspricht einem Verkippen des Beleuchtungslichtstrahls um einen Kipppunkt, der im Bereich der Eintrittspupille liegt. Dies bedeutet, dass der Beleuchtungslichtstrahl, der selbstredend kein Strahl im mathematischen Sinne, sondern vielmehr ein Bündel von Lichtstrahlen darstellt, im Bereich der Eintrittspupille (zumindest näherungsweise) ortsfest bleibt, während er in einem Abstand von der
Eintrittspupille (in Richtung der Abtastvorrichtung) gleichsam eine
Schwenkbewegung relativ zu einer parallel zur optischen Achse liegenden Referenzrichtung ausführt. Diese Kipp- oder Schwenkbewegung des
Beleuchtungslichtstrahls setzt das Objektiv in eine entsprechende Bewegung des schräg gestellten B eleuchtungs fokus quer zur optischen Achse um.. Die tatsächliche Größe der Bewegung des B eleuchtungs fokus in dem Objekt hängt vom konkreten Aufbau des Objektivs ab. Wesentlich ist jedoch, dass die durch die Abtastvorrichtung bewirkte Verkippung des Beleuchtungslichtstrahls erfindungsgemäß dazu genutzt wird, den B eleuchtungs fokus innerhalb des Zielbereichs des Objektes zu bewegen und damit gleichsam ein Lichtblatt aufzubauen, das den Zielbereich beleuchtet.
Im Unterschied zu den aus dem Stand der Technik bekannten Lösungen, die zur Erzeugung eines Lichtblattes mit einer Zylinderlinse arbeiten, wird bei dem erfindungsgemäßen Abtastmikroskop das Lichtblatt mittels der
Abtastvorrichtung sequenziell aufgebaut, indem der Beleuchtungsfokus innerhalb einer Abtastperiode über den Zielbereich bewegt wird. Damit macht sich das erfindungsgemäße Abtastmikroskop zur Erzeugung des Lichtblattes den Umstand zunutze, dass die Abtastperioden, mit denen heutzutage
Abtastvorrichtungen betrieben werden können, so kurz sind, dass sie die Detektionszyklen üblicherweise eingesetzter Lichtdetektoren deutlich unterschreiten. Da im Falle der Lichtblatterzeugung nur eine Linie (in X- oder Y-Richtung) erzeugt wird, ist die Gesamtdauer der Beleuchtung für das komplette Lichtblatt abhängig von der Scanrate des Beleuchtungsscanners, d.h. der Abtastvorrichtung. Je nach Scannertyp kann diese im Bereich von 1 Hz bis mehreren 10 KHz liegen. Der Lichtdetektor (vornehmlich ein Flächendetektor; CCD; CMOS, APD Array...)„sieht" demnach den bewegten
Beleuchtungsfokus zeitlich und damit räumlich nicht aufgelöst. Vielmehr sieht er eine zusammenhängende Lichtverteilung in Form des Lichtblattes.
Beispielhafte Werte für die Abtastperiode liegen in einem Bereich von einigen Hundertstel Millisekunden bis 1 Sekunde, während die Detektionszeit für die ganze Lichtblattebene (abhängig von der Detektorauflösung, z.B. 512x512 Pixel) z.B. zwischen einigen Millisekunden und Sekunden beträgt, sofern sichergestellt ist, dass die Abtastperiode kleiner als die Detektionszeit ist.
Da in einem herkömmlichen konfokalen Abtastmikroskop ohnehin eine den Beleuchtungslichtstrahl bewegende Abtastvorrichtung vorgesehen ist, ermöglicht die Erfindung eine besonders effiziente Erzeugung des
beleuchtenden Lichtblattes. Insbesondere ist es möglich, im Wesentlichen ein und denselben Mikroskopaufbau für unterschiedliche Applikationen
vorzusehen. So ist es zur Realisierung der erfindungsgemäßen Applikation, bei der eine Schrägbeleuchtung des Objektes mittels eines Lichtblattes vorgenommen wird, lediglich erforderlich, in einem an sich standardmäßig aufgebauten konfokalen Abtastmikroskop für eine dezentrale Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs zu sorgen. Dies kann beispielsweise mittels eines optischen Elementes erfolgen, das in den Lichtweg des
Beleuchtungslichtstrahls eingebracht wird. Soll das Abtastmikroskop anschließend wieder mit einer punktweisen Beleuchtung arbeiten, so muss das optische Element lediglich wieder aus dem Lichtweg des
Beleuchtungslichtstrahls entfernt werden. Das erfindungsgemäße Abtastmikroskop ermöglicht es, hochaufgelöste Schnittbilder des Objektes aufzunehmen. Hierzu wird das Objekt schrittweise mit dem Lichtblatt abgetastet. Diese Abtastung erfolgt dadurch, dass das Objektiv und das Objekt längs der optischen Achse relativ zueinander bewegt werden.
Vorzugsweise ändert die Abtastvorrichtung die Einfallsrichtung des
Beleuchtungslichtstrahls zur Erzeugung eines durch den bewegten
Beleuchtungsfokus gebildeten Lichtblattes innerhalb einer Einfallsebene, die zur optischen Achse des Objektivs parallel versetzt ist. Unter der Annahme, dass die Eintrittspupille kreisrund ausgeführt ist, bildet die vorstehend genannte Einfallsebene in der Draufsicht auf die Eintrittspupille eine Gerade, die den durch den Pupillenrand definierten Kreis nach Art einer Sekante in zwei voneinander verschiedenen Punkten schneidet, ohne den Mittelpunkt dieses Kreises zu kreuzen. In der vorstehend definierten Draufsicht führt dann der Beleuchtungslichtstrahl eine Kippbewegung längs dieser Sekante aus. Das Objektiv setzt diese Kippbewegung in eine entsprechende Bewegung des Beleuchtungsfokus längs einer Geraden um, die parallel zu der vorstehend genannten Sekante verläuft [geprüft]. Auf diese Weise kann in einfacher Weise das gewünschte Lichtblatt zur Beleuchtung des Zielbereichs erzeugt werden.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung weist die Abtastvorri chtung ein in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls zwischen der
Beleuchtungseinheit und dem Objektiv angeordnetes optisches
Versatzelement auf, durch das die Einfallsebene des Beleuchtungslichtstrahls parallel zur optischen Achse des Objektivs versetzt ist. Dieses Versatzelement kann beispielsweise ein Glaskeil, eine planparallele Platte, ein optischer oder photonischer Kristall, ein räumlicher Lichtmodulator, kurz SLM, ein Mikrospiegelaktor, kurz DMD, etc. sein. Alternativ ist es auch möglich, die Abtastvorrichtung relativ zur Eintrittspupille des Objektivs so anzuordnen, dass der Beleuchtungslichtstrahl in der gewünschten Weise dezentral in die Eintrittspupille fällt. Ebenso ist es möglich, den Beleuchtungslichtstrahl in seinem Lichtweg vor der Abtastvorrichtung beispielsweise durch eine Blende von einer Seite so zu beschneiden, dass die gewünschte dezentrale
Beleuchtung der Eintrittspupille erzielt wird. In einer weiteren alternativen Ausführungsform können optische Elemente, die in dem Abtastmikroskop ohnehin schon vorhanden sind, zur Erzeugung des gewünschten
Strahlversatzes genutzt werden. Beispielsweise kann ein in einem
Abtastmikroskop üblicherweise vorhandener Auskoppel strahltei 1er, der den Beleuchtungslichtstrahl in Richtung des Objektivs durchlässt, während er das von dem Objekt stammende Detektionslicht in Richtung des Lichtdetektors reflektiert, aus einem (z.B. entsprechend beschichteten) Glassubstrat gebildet sein, dessen Dicke so bemessen ist, dass der gewünschte Strahlversatz, der üblicherweise in einem Bereich von einigen Millimetern liegt, bewirkt wird.
Vorzugsweise weist die Abtastvorrichtung ein Stellelement zum Einbringen und Entfernen des optischen Versatzelementes in den bzw. aus dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls auf. Mittels eines solchen Stellelementes kann das Versatzelement nach Wunsch in den Beleuchtungslichtstrahlengang eingebracht und aus diesem entfernt werden, um so beispielsweise zwischen einer üblichen konfokalen Beleuchtung und der erfindungsgemäßen
Schrägbeleuchtung mittels eines Lichtblattes umzuschalten. Darüber hinaus ist es mit einem solchen Stellelement möglich, das beispielsweise keilförmig ausgebildete Versatzelement inkrementell in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls zu verschieben, um so eine beliebige Dezentrierung des Beleuchtungslichtstrahls gegenüber dem Objektiv zu bewirken. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform weist die Abtastvorrichtung ein in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls zwischen der
B eleuchtungseinheit und dem Objektiv angeordnetes optisches
Strahleinstellelement zum Verändern des Strahldurchmessers des von der Beleuchtungseinheit ausgesendeten Beleuchtungslichtstrahls auf. Das
Strahleinstellelement ermöglicht es, den Strahldurchmesser des
Beleuchtungslichtstrahls und damit die Unterleuchtung der Eintrittspupille des Objektivs nach Bedarf einzustellen, um die gewünschte Ausdehnung des Beleuchtungsfokus zu erzielen. Es sind jedoch auch alternative
Ausführungsformen denkbar. So weist ein konfokales Abtastmikroskop häufig eine Strahlaufweitoptik auf, um den von der B eleuchtungseinheit abgegebenen Beleuchtungslichtstrahl so aufzuweiten, dass die Eintrittspupille des Objektivs voll ausgeleuchtet und damit die volle Apertur genutzt wird. Ist eine solche Optik in dem Abtastmikroskop ohnehin vorhanden, so kann sie auch dazu genutzt werden, den Strahldurchmesser entsprechend zu verringern, um die erfindungsgemäße Unterleuchtung der Eintrittspupille zu bewirken.
Selbstverständlich sind die vorstehend genannten Ausführungsformen rein beispielhaft zu verstehen. So können auch Blenden oder andere optische Elemente zur Einstellung des gewünschten Strahldurchmessers verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung ist der Beleuchtungslichtstrahl aus einem Anregungslichtstrahl und einem Abregungslicht zusammengesetzt, die vor Eintritt in die Abtastvorrichtung einander überlagert sind.
Entsprechend erzeugt das Objektiv aus dem Anregungslichtstrahl einen Anregungsfokus und aus dem Abregungslichtstrahl einen Abregungsfokus , die einander zu dem Beleuchtungsfokus überlagert sind. Auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie kann ein solcher Abregungslichtstrahl beispielsweise nach dem so genannten STED- Verfahren dazu genutzt werden, die räumliche Auflösung über die Beugungsgrenze hinaus zu steigern. Bei dem STED- Verfahren werden durch den Abregungslichtstrahl Fluoreszenzfarbstoffe, die zum Markieren einzelner Bereiche des Objektes eingesetzt werden, in an sich bekannter Weise gezielt abgeregt und damit gleichsam ausgeschaltet, um das Auflösungsvermögen zu steigern. In dem erfindungsgemäßen
Abtastmikroskop kann durch Anwendung des STED- Verfahrens die
Wirksamkeit des Beleuchtungsfokus dadurch, dass dem Anregungslichtstrahl der Abregungslichtstrahl überlagert wird, zur Auflösungssteigerung eingeengt und damit das resultierende Lichtblatt dünner geformt werden. Indem der Abregungslichtstrahl dem Anregungslichtstrahl schon vor Erreichen der Abtastvorrichtung überlagert wird, werden die beiden einander überlagerten Lichtstrahlen durch die Abtastvorrichtung gemeinsam in der Eintrittspupille des Objektivs verkippt.
Vorzugsweise hat der Abregungsfokus eine räumliche
Lichtintensitätsvertei lung , die in einer Ebene, in welcher der aus dem
Anregungsfokus und dem Abregungsfokus zusammengesetzte
Beleuchtungsfokus zur Erzeugung eines Lichtblattes bewegt wird, ein
Minimum und beiderseits dieser Ebene jeweils ein Maximum aufweist.
Während bei der herkömmlichen Anwendung des STED- Verfahrens der Abregungsfokus im Querschnitt eine Ringform aufweist, sieht die vorstehend genannte Ausführungsform einen Abregungsfokus vor, der im Querschnitt (oberhalb und unterhalb der Ebene, in der der Beleuchtungsfokus zur
Erzeugung des Lichtblattes bewegt wird) zwei Intensitätsmaxima und zwischen diesen Maxima ein Minimum hat. Dabei ist dieses
Intensitätsquerschnittsprofil vorzugsweise symmetrisch mit zwei gleich großen Maxima und einer dazwischen liegenden Nullstelle als Minimum ausgebildet. Diese vorteilhafte Ausgestaltung macht sich den Umstand zunutze, dass eine STED-Abregung in der Ebene, in der der Beleuchtungsfokus zur Erzeugung des Lichtblattes bewegt wird, nicht erforderlich, ja sogar unerwünscht ist. So soll bei der erfindungsgemäßen Lösung ein möglichst großflächiges und zugleich möglichst dünnes Lichtblatt erzeugt werden, um räumlich
hochaufgelöste optische Schnittbilder aufnehmen zu können. Dabei ist die Fläche des Lichtblattes durch die Länge des bewegten Beleuchtungsfokus definiert, während die Blattdicke durch die Ausdehnung des
Beleuchtungsfokus quer zu der Ebene, in der der Beleuchtungsfokus bewegt wird, festgelegt ist. Der vorstehend beschriebene Abregungsfokus ist nun gerade so geformt, dass er die Anregungswirksamkeit des Anregungsfokus lediglich in Richtung der F okusquerausdehnung, nicht jedoch in Richtung der Fokuslängsausdehnung herabsetzt.
Zur Erzeugung des dem Anregungsfokus überlagerten Abregungsfokus ist in dem Lichtweg des Abregungslichtstrahls beispielsweise eine Phascnplatte angeordnet, welche die räumliche Intensitätsverteilung des
Abregungslichtstrahls entsprechend der gewünschten Form des
Abregungsfokus einstellt. Diese gewünschte Form des Abregungsfokus ist mit einem geringeren technischen Aufwand in Form einer einfachen Phasenplatte erzeugbar, als dies in der üblichen Anwendung des STED-Verfahrens der Fall ist, in der der Abregungsfokus ringförmig ausgebildet werden muss. Die Phasenplatte ist in dem Lichtweg des Abregungslichtstrahls vorzugsweise vor der Abtastvorrichtung angeordnet. Sie kann jedoch auch unmittelbar vor der Eintrittspupille des Objektivs, z.B. an einem vor dem Objektiv angeordneten Auskoppelstrahlteiler ausgebildet sein. Ebenso ist möglich, die Phasenplatte direkt in dem Objektiv anzuordnen. Vorzugsweise umfasst das erfindungsgemäße Abtastmikroskop ein Element zum Variieren der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb einer Abtastperiode, während der der Beleuchtungsfokus über den Zielbereich bewegt wird. Diese Ausgestaltung nutzt den Umstand, dass das den
Zielbereich beleuchtende Lichtblatt sequenziell durch den bewegten
Beleuchtungsfokus aufgespannt wird. Dadurch ist es möglich, eine modulierte bzw. strukturierte Beleuchtung des Zielbereichs zu realisieren. Hierzu wird innerhalb der Abtastperiode, in der der Beleuchtungsfokus den Zielbereich abtastet, die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls variiert. So kann die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls zu jedem beliebigen Zeitpunkt innerhalb der Abtastperiode und damit an jeder beliebigen Stelle des
Zielbereichs nach Wunsch eingestellt werden. Als Element, das die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb der Abtastperiode variiert, kann beispielsweise ein akusto-optisch abstimmbarer Filter (AOTF), ein akusto- optischer Modulator (AOM) oder ein elektro-optischer Modulator (EOM) verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung umfasst das Abtastmikroskop eine Detektionsoptik mit einer ersten Teiloptik zur Zwischenabbildung eines schräg zur optischen Achse der ersten Teiloptik angeordneten, von dem Objektiv erzeugten Bildes des mit dem schräg gestellten Beleuchtungsfokus beleuchteten Zielbereichs, und einer zweiten Teiloptik zur Abbildung des von der ersten Teiloptik erzeugten Zwischenbildes auf eine Detektionsfläche, die parallel zu dem Zwischenbild angeordnet ist. Die beiden Teiloptiken sorgen für eine Aufrichtung des unter der Schrägbeleuchtung durch das Objektiv abgebildeten Zielbereichs. Eine solche Bildaufrichtung ist jedoch auch in anderer Weise möglich, beispielsweise durch eine so genannte Scheimpflug- Anordnung. Als Detektionsfläche, auf der schließlich das aufgerichtete Bild des Zielbereichs erzeugt wird, kann beispielsweise ein CCD, ein sCMOS oder andere flächige Detektoren wie ein APD-Array verwendet werden.
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur
lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes mit den Merkmalen des Anspruchs 14 vorgesehen.
In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls innerhalb einer Abtastperiode variiert, während der der Beleuchtungsfokus über den Zielbereich bewegt wird. Insbesondere ist es möglich, durch alternierende Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls und/oder des Abregungslichtstrahls unterschiedliche Beobachtungsvolumina aufzunehmen. Erfolgt die Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls und/oder des Abregungslichtstrahls im Mikrosekundenbe- trieb, so können durch geeignete Synchronisation mit dem Lichtdetektor z.B. spaltenweise unterschiedliche Volumenelemente delektiert werden (sofern angenommen wird, dass die Detektionsfläche des Lichtdetektor aus Zeilen und Spalten zusammengesetzt ist).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft in der
Lokalisationsmikroskopie eingesetzt werden. Als Fluoreszenzfarbstoffe eignen sich schaltbare fluoreszierende Proteine, Fluoreszenzfarbstoffe wie ATTO, Alexa, Rhodamin-Derivate, Fluoreszein-Derivate, Nanokristalle etc. Über die Schrägbeleuchtung können entweder die fluoreszierenden
Komponenten aktiviert oder in die Saturierung getrieben werden. Über eine dosierte Beleuchtung wird sichergestellt, dass eine Einzelmolekül-Detektion möglich ist. Über eine Schwerpunktbestimmung der delektierten Photonen können dann die Orte der Fluoreszenzfarbstoffe bestimmt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann besonders gewinnbringend in der Kleintierbildgebung, z.B. der Fluoreszenzbildgebung an Fischen, eingesetzt werden, da die hier verwendeten Objekte gut zugänglich sind.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
Figur 1 ein konfokales Abtastmikroskop als erstes Ausführungsbeispiel;
Figur 2 eine gegenüber dem Abtastmikroskop nach Figur 1
abgewandelte Ausführungsform als zweites
Ausführungsbeispiel;
Figur 3 eine gegenüber dem Abtastmikroskop nach Figur 2 abgewandelte Ausführungsform als drittes Ausführungsbeispiel;
Figur 4 eine schematische Darstellung, die die in der herkömmlichen konfokalen Abtastmikroskopie angewandte vollständige
Ausleuchtung der Eintrittspupille eines Objektivs mit dem Beleuchtungslichtstrahl veranschaulicht;
Figur 5 eine schematische Darstellung, die die in der herkömmlichen konfokalen Abtastmikroskopie angewandte Abtastung mit dem Beleuchtungslichtstrahl veranschaulicht;
Figur 6 eine schematische Darstellung, die die erfindungsgemäße
Unterleuchtung der Eintrittspupille mit dem
Beleuchtungslichtstrahl veranschaulicht; Figur 7 eine schematische Darstellung, die die erfindungsgemäße Abtastung durch Verkippen des die Eintrittspupille unterleuchtenden Beleuchtungslichtstrahls veranschaulicht; und
Figur 8 eine schematische Darstellung, die die erfindungsgemäße
Überlagerung des Beleuchtungsfokus mit dem Anregungsfokus veranschaulicht.
Figur 1 zeigt ein konfokales Abtastmikroskop 10 als erstes
Ausführungsbeispiel in einer schematischen Darstellung. Es ist darauf hinzuweisen, dass in der Darstellung nach Figur 1 Komponenten des
Abtastmikroskops 10 weggelassen sind, die zur Verständnis des
Erfindungsgegenstandes nicht wesentlich sind.
Das Abtastmikroskop 10 bildet ein konfokales Fluoreszenzmikroskop, das darauf ausgelegt ist, unter Anwendung des an sich bekannten STED- Verfahrens eine über die Beugungsgrenze hinausgehende räumliche
Auflösung zu erzielen. Dementsprechend umfasst das Abtastmikroskop 10 eine erste Laserlichtquelle 12, im Folgenden als Anregungslichtquelle bezeichnet, sowie eine zweite Laserlichtquelle 15, im Folgenden als
Abregungslichtquelle bezeichnet. Die Anregungslichtquelle 12 sendet einen Anregungslichtstrahl 14 aus, dessen Wellenlänge so gewählt ist, dass die in dem angewandten Mikroskopierverfahren verwendete Fluoreszenzfarbstoffe zur Abgabe von Fluoreszenzabstrahlung angeregt. Dagegen sendet die Abregungslichtquelle 15 einen Abregungslichtstrahl 16 aus, der dem
Anregungslichtstrahl 14 in weiter unten beschriebener Weise überlagert wird und dessen Wellenlänge so gewählt ist, dass die durch den
Anregungslichtstrahl beleuchteten Fluoreszenzfarbstoffe durch stimulierte Emission abgeregt und damit gleichsam ausgeschaltet werden. Der von der Abregungslichtquelle 15 emittierte Abregungslichtstrahl 16 tritt durch eine Phasenplatte 18, die dazu dient, ein gewünschtes Intensitätsprofil des
Abregungslichtstrahls 16 einzustellen.
Der Anregungslichtstrahl 14 fällt auf einen Spiegel 20 und wird an diesem in Richtung eines Strahlteilers 22 reflektiert. Der Strahlteiler 22 ist so
ausgebildet, dass er den Anregungslichtstrahl 14 durchlässt, während er den auf ihn fallenden Abregungslichtstrahl 16 reflektiert. Auf diese Weise werden der Anregungslichtstrahl 14 und der in seinem Intensitätsprofil durch die Phasenplatte 18 beeinflusste Abregungslichtstrahl 16 einander überlagert. Der aus den beiden einander überlagerten Lichtstrahlen 14 und 16 gebildete Strahl wird im Folgenden als Beleuchtungslichtstrahl 24 bezeichnet.
Der Beleuchtungslichtstrahl 24 trifft auf eine in Figur 1 rein schematisch dargestellte Galvanospiegelanordnung 26, die dazu dient, den
Beleuchtungslichtstrahl so umzulenken, dass dieser eine weiter unten näher beschriebene Abtastbewegung ausführt. Anschließend tritt der
Beleuchtungslichtstrahl 24 durch eine Abtastlinse 28, eine Tubus linse 30 sowie einen Strahlteiler 32 und trifft schließlich auf ein Objektiv 34.
Wie der in Figur 1 schematisch dargestellte Beleuchtungslichtstrahlengang zeigt, leuchtet der in das Objektiv 34 eintretende Beleuchtungslichtstrahl 24 eine in Figur 1 mit 36 bezeichnete Eintrittspupille des Objektivs 34 nicht vollständig aus. Dies bedeutet, dass der Beleuchtungslichtstrahl 24 nur einen Teilbereich der Eintrittspupille 36 durchsetzt und somit nicht die volle Apertur des Objektivs 34 nutzt. Zudem ist der in das Objektiv 34 eintretende
Beleuchtungslichtstrahl 24 gegenüber der in Figur 1 mit O bezeichneten optischen Achse versetzt. Der Beleuchtungslichtstrahl 24 ist demnach so auf das Objektiv 34 gerichtet, dass er dessen Eintrittspupille 36 dezentral unterleuchtet.
Diese dezentrale Unterleuchtung der Eintrittspupille 36 mit dem
Beleuchtungslichtstrahl 24 wird im vorliegenden Ausfuhrungsbeispiel dadurch erreicht, dass der von der Galvanospiegelanordnung 26 reflektierte
Beleuchtungslichtstrahl 24 mit einem Parallelversatz relativ zur optischen Achse O auf einen Randbereich der Abtastlinse 28 fällt. Dieser Parallelversatz fuhrt dazu, dass der aus der Abtastlinse 28 austretende Beleuchtungslichtstrahl 24 zunächst die optische Achse O kreuzt und anschließend wiederum auf einen Randbereich der Tubuslinse 30 fällt, wobei sich dieser Randbereich auf der anderen Seite der optischen Achse O als der lichtdurchsetzte Randbereich der Abtastlinse 28 befindet. Aus der Tubuslinse 30 tritt dann der
Beleuchtungslichtstrahl 24 gegenüber der optischen Achse O parallel versetzt in die Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 ein. Die Tubuslinse 30 lenkt den Beleuchtungslichtstrahl 24 so um, dass dieser mit einem Parallelversatz relativ zur optischen Achse O in die Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 fällt.
In dem in Figur 1 gezeigten Ausführungsbeispiel sorgen schon der Spiegel 20 und der Strahlteiler 22 dafür, dass der aus dem Anregungslichtstrahl 14 und dem Abregungslichtstrahl 16 zusammengesetzte Beleuchtungslichtstrahl 24 mit einem Parallelversatz relativ zur optischen Achse O auf die
Galvanospiegelanordnung 26 fällt. Dieser Parallelversatz kann mittels eines Stellelementes 38 eingestellt werden. Hierzu verschiebt das Stellelement 38 den Spiegel 20 und den Strahlteiler 22 als Einheit quer zur optischen Achse O.
Die vorstehend erläuterten Komponenten 20, 22, 26, 28, 30 und 38 bilden eine Abtastvorrichtung, die dazu dient, den B eleuchtungsl ichtstrahl 24 in der Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 zu verkippen, wie weiter unten in Detail beschrieben wird. Das Objektiv 34 formt den in ihrer Eintrittspupille 36 eintretenden Beleuchtungslichtstrahl 24 zu einem in Figur 1 nicht gezeigten Beleuchtungsfokus um, der durch die Kippbewegung des
Beleuchtungslichtstrahles 24 innerhalb einer Abtastperiode der
Abtastvorrichtung über einen Zielbereich eines abzubildenden Objektes 40 bewegt wird. Durch die Bewegung des Beleuchtungsfokus wird ein Lichtblatt erzeugt, das durch den dezentralen Eintritt des Beleuchtungslichtstrahls 24 in die Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 gegenüber der optischen Achse O schräg gestellt ist. Dieses Lichtblatt ist in der schematischen Darstellung nach Figur 1 mit 42 bezeichnet.
Die aus dem mit dem Lichtblatt 42 beleuchteten Zielbereich des Objektes 40 stammende Fluoreszenzstrahlung wird wiederum von dem Objektiv 34 erfasst. Die Fluoreszenzstrahlung wird an dem Strahlteiler 32 in Richtung einer in Figur 1 allgemein mit 44 bezeichneten Detektionsoptik reflektiert. Die
Detektionsoptik 44 umfasst ein erstes Detektionsobjektiv 46, das einem Tubuslinsensystem 47 nachgeordnet ist, das aus zwei Tubuslinsen 49, 51 besteht. Die Tubuslinse 49 ist dem Objektiv 34 zugeordnet, während die Tubuslinse 51 dem ersten Detektionsobjektiv 46 zugeordnet ist. Die Tubuslinse 49 erzeugt im Zusammenwirken mit dem Objektiv 34 ein erstes Zwischenbild 53. Die in Figur 1 mit O' bezeichnete optische Achse des ersten
Detektionsobjektivs 46 steht senkrecht zur optischen O des Objektivs 34. Da der mit dem Lichtblatt 42 beleuchtete Zielbereich schräg zur optischen Achse O des Objektivs 34 angeordnet ist, liegt auch das erste Zwischenbild 53 schräg zur optischen Achse O' des ersten Detektionsobjektivs 46. Das erste Detektionsobjektiv 46 bildet im Zusammenwirken mit der Tubuslinse 51 das erste Zwischenbild 53 in ein zweites Zwischenbild 48 ab, das ebenfalls schräg zur optischen Achse O' angeordnet ist. Die Detektionsoptik 44 umfasst ferner ein zweites Detektionsobjektiv 50, welches das zweite Zwischenbild 48 über eine Tubuslinse 52 auf eine
Detektionsfläche 54 eines Lichtdetektors 55 abbildet. Die mit O" bezeichnete optische Achse des zweiten Detektionsobjektivs 50 steht senkrecht auf dem zweiten Zwischenbild 48 und senkrecht auf der Detektionsfläche 54. Durch das Zusammenwirken der beiden Detektionsobj ektive 46 und 50 kann so auf der Detektionsfläche 54 weitgehend abbildungsfehlerfrei ein geradegestelltes Bild des mit dem Lichtblatt 42 beleuchteten, schräg gestellten Zielbereichs des Objektes 40 erzeugt werden.
Um eine Reihe hochaufgelöster Schnittbilder des Objektes 40 aufzunehmen, wird in dem vorliegenden Ausführungsbei spiel ein Objektträger 56, auf dem das Objekt 40 angeordnet ist, sukzessive längs oder quer der optischen Achse O bewegt. Auf diese Weise kann eine hochaufgelöste, dreidimensionale Abbildung des Objektes 40 vorgenommen werden.
Figur 2 zeigt eine abgewandelte Ausführungsform als zweites
Aus führungsbeispiel . In diesem zweiten Ausführungsbeispiel wird der Parallelversatz des Beleuchtungslichtstrahls 24 gegenüber der optischen Achse O des Objektivs 34 vor Eintritt in die Eintrittspupille 36 in anderer Weise als in dem ersten Ausführungsbeispiel bewirkt. So breitet sich der
Beleuchtungslichtstrahl 24 in der Ausführungsform nach Figur 2 bis zu einem Strahlteiler 58 auf der optischen Achse O aus. Der Strahlteiler 58 ist im Unterschied zu dem Strahlteiler 32 nach Figur 1 aus einem vergleichsweise dicken, planparallelen Substrat gebildet, das beim Durchgang des
Beleuchtungslichtstrahls 24 für den gewünschten Parallelversatz gegenüber der optischen Achse O sorgt. Über ein Stellelement 60 kann der Strahlteiler 59 quer zur optischen Achse O verstellt werden, um den Parallelversatz zu variieren. In Figur 3 ist ein drittes Ausführungsbeispiel gezeigt. Das dritte Ausfuhrungsbeispiel unterscheidet sich von der in Figur 2 gezeigten Ausführungsform dadurch, dass der aus einem planparallelen Substrat gebildete Strahlteiler 58 durch einen keilförmigen Strahlteiler 59 ersetzt ist. Auch in diesem Ausführungsbeispiel ist der Strahlteiler 59 mittels des Stellelementes 60 verschiebbar, um den gewünschten Parallelversatz des Beleuchtungslichtstrahls 24 zu bewirken.
Im Folgenden wird unter Bezugnahme auf die Figuren 4 bis 8 die
erfindungsgemäße Erzeugung des Lichtblattes 42 im Einzelnen erläutert.
Dabei ist darauf hinzuweisen, dass die Figuren 4 bis 8 rein schematische Darstellungen sind, die das Verständnis der Erfindung erleichtern sollen.
Ferner soll für die in den Figuren 4 bis 7 gezeigten Fälle zur Erleichterung des Verständnisses zunächst angenommen werden, dass der
Beleuchtungslichtstrahl 24 allein aus dem Anregungslichtstrahl 14 gebildet ist, d.h. noch keine Überlagerung mit dem Abregungslichtstrahl 16 erfolgt.
In Figur 4 ist zunächst der für eine herkömmliche konfokale, punktweise Abtastung typische Fall veranschaulicht, bei der das durch den
Beleuchtungslichtstrahl 24 gebildete Strahlenbündel die volle Objektivapertur nutzt, d.h. die gesamte Fläche der Eintrittspupille 36 des Objektivs 34 durchsetzt. In Figur 4 ist der Beleuchtungslichtstrahl 24 parallel zur optischen Achse O ausgerichtet. In diesem Fall erzeugt das Objektiv 36 eine fokussierte Lichterverteilung, deren Ausdehnung längs der optischen Achse O größer als quer zur optischen Achse O ist. Diese in der vorliegenden Anmeldung als Beleuchtungsfokus bezeichnete Lichtverteilung ist in Figur 4 mit 62
bezeichnet. Für die nachstehenden Erläuterungen wird jeweils auf ein Koordinatensystem Bezug genommen, dessen x-Achse in der Zeichenebene horizontal und dessen z-Achse in der Zeichenebene vertikal ausgerichtet ist, während die y-Achse aus der Zeichenebene heraus weist. Bei dieser Festlegung ist die
Eintrittspupille 36 parallel zur x-y-Ebene angeordnet, während die optische Achse O parallel zur z-Achse verläuft. In Figur 4 ist ferner unter A eine Draufsicht auf den Beleuchtungsfokus 62 in Richtung der z-Achse dargestellt. In dieser konventionellen Anordnung ist der B eleuchtungs fokus 62 in der Draufsicht kreisförmig.
Figur 5 zeigt nun, wie sich die Lage des Beleuchtungsfokus 62 ändert, wenn der B eleuchtungslichtstrahl 24 in der Eintrittspupille 36 durch die weiter oben beschriebene Abtastvorrichtung verkippt wird. Dabei wird für den in Figur 5 gezeigten Fall angenommen, dass der Hauptstrahl des durch den
Beleuchtungslichtstrahl 24 gebildeten Strahlenbündels in einer Einfallsebene verkippt wird, die parallel zur x-z-Ebene liegt. Ferner soll der
Beleuchtungslichtstrahl 24 immer noch die gesamte Fläche der Eintrittspupille 36 durchsetzen, d.h. die Eintrittspupille 36 vollständig ausleuchten.
Der Beleuchtungslichtstrahl 24 wird in der Einfallsebene so verkippt, dass er seine Einfallsrichtung relativ zur optischen Achse O ändert . Diese Änderung der Einfallsrichtung wird durch das Objektiv 34 in eine Verschiebung des Beleuchtungsfokus 62 quer zur optischen Achse O umgesetzt. In dem in Figur 5 gezeigten Fall findet sich diese Bewegung längs der x-Achse statt. Da der Beleuchtungslichtstrahl 24 immer noch die gesamte Fläche der Eintrittspupille 36 durchsetzt, bleibt der Beleuchtungsfokus 62 mit seiner Längserstreckung parallel zur optischen Achse O ausgerichtet. Dies zeigt sich auch in den in Figur 5 unter B dargestellten Draufsichten, in denen der Beleuchtungsfokus 62 immer noch kreisrund ist. In Figur 6 ist die erfindungsgemäße Unterleuchtung der Eintrittspupille 36 dargestellt. Wie in Figur 6 zu erkennen, durchsetzt der Beleuchtungslichtstrahl 24 lediglich einen Teilbereich der Eintrittspupille 36, wobei dieser Teilbereich dezentral angeordnet, d.h. quer zur optischen Achse O aus der Pupillenmitte versetzt ist. Diese Dezentrierung des Beleuchtungslichtstrahls 24 in der Eintrittspupille 36 führt dazu, dass der Beleuchtungsfokus 62 relativ zur optischen Achse O schräg gestellt wird. Dies ist auch in der unter C gezeigten Draufsicht zu erkennen, in der der Beleuchtungsfokus 62 nicht mehr kreisrund, sondern in Richtung der x-Achse länger als in Richtung der y- Achse ist. Durch die Unterleuchtung des Beleuchtungslichtstrahls 24 wird zudem eine Aufweitung des Beleuchtungsfokus 62 bewirkt, d.h. der
Beleuchtungsfokus 62 ist insgesamt größer als bei vollständiger Ausleuchtung der Eintrittspupille 36.
In Figur 7 ist nun der Fall gezeigt, in dem der die Eintrittspupille 36 dezentral unterleuchtende Beleuchtungslichtstrahl 24 in der Eintrittspupille 36 verkippt wird. Dabei soll für den in Figur 7 gezeigten Fall angenommen werden, dass der Hauptstrahl des den Beleuchtungslichtstrahl 24 bildenden Strahlenbündels in einer zur optischen Achse O parallelen Einfallsebene verkippt wird, die parallel zur y-z-Ebene liegt. Dies bedeutet, dass der Beleuchtungslichtstrahl 24 in Figur 7 aus der Zeichenebene heraus und diese hinein verkippt wird.
Diese Verkippung des Beleuchtungslichtstrahls 24 wird durch das Objektiv 34 in eine entsprechende Verschiebung des schräg gestellten Beleuchtungsfokus 62 längs der y-Achse umgesetzt. Demnach wird der Beleuchtungsfokus 62 in Figur 7 aus der Zeichenebene heraus und in diese hinein verschoben. Dies ist in Figur 7 unter D nochmals veranschaulicht. Die in Figur 7 unter D gezeigte Bewegungssequenz des Beleuchtungsfokus 62 macht deutlich, wie durch Bewegen des Beleuchtungsfokus 62 innerhalb einer Abtastperiode das Lichtblatt 42 aufgebaut wird. Voraussetzung ist hierfür, dass die Abtastperiode, in der der Beleuchtungsfokus 62 über den gesamten Zielbereich bewegt wird, kürzer ist als die Detektionszeit, mit dem
Lichtdetektor 54 zur Bilderzeugung arbeitet. Dadurch erfasst der Lichtdetektor 54 den bewegten Beleuchtungsfokus 62 zeitlich und damit räumlich nicht aufgelöst. Vielmehr erfasst er eine zusammenhängende oder kontinuierliche Lichtverteilung in Form des Lichtblattes 42.
In Figur 8 ist nun der Fall gezeigt, in dem der Beleuchtungslichtstrahl 24 aus einer Überlagerung des Anregungslichtstrahls 14 und des
Abregungslichtstrahls 16 gebildet ist. Dementsprechend erzeugt das Objektiv 34 einen Anregungsfokus 64 sowie einen Abregungsfokus 66, die in ihrer Überlagerung den Beleuchtungsfokus 62 ergeben. Der Anregungsfokus 64 entspricht in seiner Form dem in den Figuren 5 und 6 gezeigten
Beleuchtungsfokus 62.
Der Abregungsfokus 66 ist in Figur 8 unter E nochmals in einem Schnitt parallel zur x-z-Ebene dargestellt. Wie insbesondere aus dieser Darstellung deutlich wird, hat der Abregungsfokus 66 eine räumliche
Lichtintensitätsverteilung, bei der die Lichtintensität in der Ebene, in welcher der aus dem Anregungsfokus 64 und dem Abregungsfokus 66
zusammengesetzte Beleuchtungsfokus 62 bewegt wird, gleich Null ist, während sie beiderseits dieser Ebene jeweils ein Maximum aufweist. Die vorstehend genannte Bewegungsebene ist in Figur 7 mit 68 bezeichnet. Sie liegt parallel zu einer Ebene, welche die y-Achse enthält und deren
Schnittgerade mit der x-z-Ebene mit der x-Achse einen Winkel bildet. Dieser Winkel ist abhängig von dem maximalen Öffnungswinkel des verwendeten Objektivs 34 und der Aufweitung sowie der Dezentrierung des Beleuchtungslichtstrahls 24.
Indem der Anregungsfokus 64 oberhalb und unterhalb dieser
Bewegungsebene 68 von dem Abregungsfokus 66 überlagert ist, wird die Anregungswirksamkeit des Anregungsfokus 62 von oberhalb und unterhalb der Bewegungsebene 68 her herabgesetzt. Der anregungswirksame Teil des Anregungsfokus ist in Figur 8 unter E schraffiert angedeutet.
In Figur 8 ist die Richtung, in der der Anregungsfokus 62 gleichsam eingeengt wird, durch eine Linie 70 angedeutet. Diese Einengungsrichtung 70 steht senkrecht auf der Bewegungsebene 68. Die Überlagerung des Anregungsfokus 64 und des Abregungsfokus 66 bewirkt, dass das anregungswirksame
Lichtblatt 42 gleichsam dünner wird, wodurch die räumliche Auflösung erhöht wird.
Die vorstehende beschriebene Erzeugung des Lichtblattes 42 bietet die
Möglichkeit, eine modulierte bzw. strukturierte Beleuchtung des Zielbereichs des Objektes 40 vorzunehmen. So ist es möglich, die Lichtintensität des Anregungslichtstrahls 14 und/oder des Abregungslichtstrahls 16 innerhalb einer Abtastperiode beispielsweise mittels eines in den Figuren nicht gezeigten AOTFs nach Wunsch zu variieren. Durch alternierende Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls 14 und/oder Abregungslichtstrahls 16 können unterschiedliche Beobachtungsvolumina aufgenommen werden. Erfolgt die Zu- und Abschaltung des Anregungslichtstrahls 14 und/oder Abregungslichtstrahls 16 im Mikrosekundenbereich können durch geeignete Synchronisation mit dem Lichtdetektor 55 z.B. spaltenweise unterschiedliche Volumenelemente delektiert werden (sofern angenommen wird, dass sich die Detektionsfläche 55 des Lichtdetektors 54 aus Zeilen und Spalten zusammensetzt). B ezugszeichenl iste
10 Abtastmikroskop
12 Anregungslichtquelle
14 Anregungslichtstrahl
15 Abregungslichtquelle
16 Abregungslichtstrahl
18 Phasenplatte
20 Spiegel
22 Strahlteiler
24 B eleuchtungslichtstrahl
26 Galvanospiegelanordnung
28 Abtastlinse
30 Tubuslinse
32 Strahlteiler
34 Objektiv
36 Eintrittspupille
38 Stellelement
40 Objekt
42 Lichtblatt
44 Detektionsoptik
46 erstes Detektionsobjektiv
47 Tubuslinsensystem
48 Zwischenbild
49 Tubuslinse
50 zweites Detektionsobj ektiv
51 Tubuslinse
52 Tubuslinse
53 Zwischenbild 54 Detektionsfläche
55 Lichtdetektor
56 Objektträger
58 Strahlteiler
60 Stellelement
62 Beleuchtungsfokus
64 Anregungsfokus
66 Abregungsfokus
68 Bewegungsebene
70 Einengungsrichtung
O, Ο', 02' optische Achsen

Claims

Ansprüche
1. Abtastmikroskop ( 10) mit
einer Beleuchtungseinheit (12, 15) zum Aussenden eines
Beleuchtungslichtstrahls (24),
einem Objektiv (34) zum Erzeugen eines länglichen Beleuchtungsfokus (62) in einem abzubildenden Objekt (40), und
einer Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) zum Bewegen des Beleuchtungsfokus (62) über einen zu beleuchtenden Zielbereich des Objektes (40) durch Ändern der Einfallsrichtung, in der der
Beleuchtungslichtstrahl (24) in eine Eintrittspupille (36) des Objektivs (34) fällt,
dadurch gekennzeichnet, dass die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) den Beleuchtungslichtstrahl (24) zum Schrägstellen des
Beleuchtungsfokus (62) relativ zur optischen Achse (O) des Objektivs (34) auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der
Eintrittspupille (36) richtet und zum Bewegen des Beleuchtungsfokus (62) über den zu beleuchtenden Zielbereich die Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) innerhalb dieses Teilbereichs ändert.
2. Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) die Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) zur Erzeugung eines durch den bewegten Beleuchtungsfokus (62) gebildeten Lichtblattes (42) innerhalb einer Einfallsebene ändert, die zur optischen Achse (O) des Objektivs (34) parallel versetzt ist.
3. Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der der von dem Beleuchtungslichtstrahl (24) durchsetzte Teilbereich der Eintrittspupille (36) etwa 0,1% bis 50 % der Gesamtfläche der Eintrittspupille (36) einnimmt, und
der Parallelversatz der Einfallsebene gegenüber der optischen Achse (O) des Objektivs (34) etwa 4 bis 96% des Radius der Eintrittspupille (36) beträgt.
4. Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 2 oder 3, dadurch
gekennzeichnet, dass die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) ein in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls (24) zwischen der Beleuchtungseinheit (12, 15) und dem Objektiv (34) angeordnetes optisches Versatzelement (20, 22, 58, 59) aufweist, durch das die Einfallsebene des Beleuchtungslichtstrahls (24) parallel zur optischen Achse (O) des Objektivs (34) versetzt ist.
5. Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das optische Versatzelement (59) keilförmig ausgebildet ist.
6. Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, dass die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) ein Stellelement (38, 60) zum Einbringen und Entfernen des optischen Versatzelementes (20, 22, 58, 59) in den bzw. aus dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls (24) aufweist.
7. Abtastmikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass
die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) mindestens einen beweglichen Spiegel (26), der den von der Beleuchtungseinheit (12, 1 5) ausgesendeten Beleuchtungslichtstrahl (24) in den aus der
Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille (36) reflektiert, und einen Antrieb aufweist, durch den der Spiegel (26) zum Verändern der Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahl (24) bewegbar ist.
8. Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Spiegel der Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) gegenüber der optischen Achse (O) des Objektivs (34) versetzt angeordnet ist.
9. Abtastmikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) ein in dem Lichtweg des Beleuchtungslichtstrahls (24) zwischen der Beleuchtungseinheit (12, 15) und dem Objektiv (34) angeordnetes optisches Strahleinstellelement zum Verändern des Strahldurchmessers des von der Beleuchtungseinheit (12, 15) ausgesendeten Beleuchtungslichtstrahls (24) aufweist.
10. Abtastmikroskop (10) nach der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl (24) aus einem
Anregungslichtstrahl (14) und einem Abregungslichtstrahl ( 16) zusammengesetzt ist, die vor Eintritt in die Abtastvorrichtung (20, 22, 26, 28, 30, 38, 58) einander überlagert sind, und dass das Objektiv (34) aus dem Anregungslichtstrahl (14) einen Anregungsfokus (64) und aus dem Abregungslichtstrahl (16) einen Abregungsfokus (66) erzeugt, die einander zu dem Beleuchtungsfokus (62) überlagert sind.
1 1.Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Abregungsfokus (66) eine räumliche Lichtintensitätsverteilung hat, die in einer Ebene (68), in welcher der aus dem Anregungsfokus (64) und dem Abregungsfokus (66) zusammengesetzte Belcuchtungsfokus (62) zur Erzeugung eines Lichtblattes (42) bewegt wird, ein Minimum und beiderseits dieser Ebene (68) jeweils ein Maximum aufweist.
12. Abtastmikroskop (10) nach Anspruch 11, gekennzeichnet durch eine in dem Lichtweg des Abregungslichtstrahls (16) angeordnete Phasenplatte (18) zum Einstellen der räumlichen Intensitäts Verteilung des dem Anregungsfokus (64) überlagerten Abregungsfokus (66).
13. Abtastmikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch ein Element zum Variieren der Intensität des Beleuchtungslichtstrahls (24) innerhalb einer Abtastperiode, während der der Beleuchtungsfokus (62) über den Zielbereich bewegt wird.
14. Abtastmikroskop (10) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine Detektionsoptik (44) mit einer ersten Teiloptik (46) zur Zwischenabbildung eines schräg zur optischen Achse (Ο') der ersten Teiloptik (46) angeordneten, von dem Objektiv (34) erzeugten Bildes des mit dem schräggestellten Beleuchtungsfokus (62) beleuchteten Zielbereichs, und einer zweiten Teiloptik (50) zur
Abbildung des von der ersten Teiloptik (46) erzeugten Zwischenbildes (48) auf eine Detektionsfläche (54), die parallel zu dem Zwischenbild (48) angeordnet ist
15. Verfahren zur lichtmikroskopischen Abbildung eines Objektes (40), mit folgenden Schritten:
Aussenden eines Beleuchtungslichtstrahls (24),
Erzeugen eines länglichen Beleuchtungsfokus (62) in dem
abzubildenden Objekt (40) mittels eines Objektivs (34), Bewegen des Beleuchtungsfokus (62) über einen zu beleuchtenden Zielbereich des Objektes (40) durch Ändern der Einfallsrichtung, in der der Beleuchtungslichtstrahl (24) in eine Eintrittspupille (36) des Objektivs (34) fällt,
dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl (24) zum Schrägstellen des Beleuchtungsfokus (62) relativ zur optischen Achse (O) des Objektivs (34) auf einen aus der Pupillenmitte versetzten Teilbereich der Eintrittspupille (36) gerichtet wird und zum Bewegen des Beleuchtungsfokus (62) über den zu beleuchtenden Zielbereich die Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) innerhalb dieses Teilbereichs geändert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die
Einfallsrichtung des Beleuchtungslichtstrahls (24) zur Erzeugung eines durch den bewegten Beleuchtungsfokus (62) gebildeten Lichtblattes (42) innerhalb einer Einfallsebene geändert wird, die zur optischen Achse (O) des Objektivs (34) parallel versetzt ist.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Beleuchtungslichtstrahl (24) aus einem Anregungslichtstrahl (14) und einem Abregungslicht (16) zusammengesetzt wird und dass aus dem Anregungslichtstrahl (14) ein Anregungsfokus (64) und aus dem
Abregungsl ichtstrahl (16) einen Abregungsfokus (66) erzeugt wird, die einander zu dem Beleuchtungsfokus (62) überlagert werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die
räumliche Intensitätsverteilung des Abregungsfokus (66) derart eingestellt wird, dass sie in einer Ebene (68), in welcher der aus dem Anregungsfokus (64) und dem Abregungsfokus (66) zusammengesetzte Beleuchtungsfokus (62) zur Erzeugung eines Lichtblattes (42) bewegt wird, ein Minimum und beiderseits dieser Ebene (68) jeweils ein Maximum aufweist.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Intensität des Beleuchtungslichtstrahls (24) innerhalb einer Abtastperiode variiert wird, während der der Beleuchtungsfokus (62) über den Zielbereich bewegt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Anregungslichtstrahl (14) und/oder der Abregungslichtstrahl (16) alternierend zu- und abgeschaltet werden.
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