WO2012115068A1 - 乳癌におけるｆｇｆｒ４変異体の検出法 - Google Patents

乳癌におけるｆｇｆｒ４変異体の検出法 Download PDF

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WO2012115068A1
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fgfr4
seq
breast cancer
alanine
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崇史 二見
竜也 川瀬
鈴木　智之
信昭 新堂
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Astellas Pharma Inc
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Astellas Pharma Inc
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting the presence of breast cancer in a subject by detecting the presence of a mutation in FGFR4.
  • Fibroblast Growth Factor Receptor is a kind of receptor tyrosine kinase, and fibroblast growth factor (FGF) is known as a ligand for FGFR.
  • FGF fibroblast growth factor
  • the existence of four receptor types FGFR1, FGFR2, FGFR3, and FGFR4 is known in the FGFR family. These receptors are composed of transmembrane proteins having an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracytoplasmic domain. The extracellular domain contains two or three immunoglobulin (Ig) domains.
  • FGFR is a monomeric tyrosine kinase receptor that is activated by dimerization that occurs at the cell surface in a complex of FGFR dimer, FGF, and heparing lycan or proteoglycan.
  • FGF FGFR dimer
  • FGF heparing lycan or proteoglycan.
  • FGF there are 22 known FGFs, each having the ability to bind to one or more FGFRs.
  • Receptor tyrosine kinase is activated by binding of FGF to FGFR, and signal transduction is performed downstream.
  • Complex biological functions such as cell migration and cell proliferation are controlled by differences in the expression site and timing of FGFR.
  • FGFR4 gene variant 1 (GenBank accession number: NM_002011.3), variant 2 (GenBank accession number: NM_022963.2)), variant 3 (GenBank accession) are currently available for the human FGFR4 gene. Number: NM — 21367.1))
  • variant 1 and variant 3 encode FGFR4 isoform 1
  • variant 2 encodes FGFR4 isoform 2.
  • FGFR4 isoform 1 has a total length of 802 amino acids
  • isoform 2 has a total length of 762 amino acids
  • isoform 1 and isoform 2 have different amino acid sequences in the transmembrane domain, but the same amino acid sequence in the extracellular domain and the intracellular membrane domain
  • the FGFR tyrosine kinase domain is present in the intracellular membrane domain, and it has been confirmed that point mutations in the FGFR tyrosine kinase domain are involved in cancer activation in various cancers. Among these, as for FGFR4, point mutations in the tyrosine kinase domain have been found in rhabdomyosarcoma, and introduction of these point mutations causes constitutive activation of FGFR4, and intracellular signals are abnormally active. Has been reported to cause canceration and cell proliferation (Non-patent Document 1).
  • Breast cancer is the most common cancer among women, and the incidence is still increasing.
  • surgery radiation therapy, chemotherapy (anticancer agent), hormone therapy and the like are often used in combination, but early diagnosis and detection of breast cancer is desirable for improving the cure rate.
  • hormone receptors such as estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR).
  • estrogen receptor estrogen receptor
  • PR progesterone receptor
  • hormone receptor positive breast cancer female hormones (estrogens) bind to the receptor and promote cell proliferation.
  • hormonal therapy with antiestrogens such as tamoxifen and aromatase inhibitors is considered effective.
  • epidermal growth factor receptor type 2 HER2 exists, and it has been confirmed that HER2 overexpression promotes breast cancer cell proliferation.
  • molecular targeted drugs such as trastuzumab (anti-HER2 antibody) are used as one of the treatment methods.
  • triple negative breast cancer is a breast cancer that is difficult to treat because the use of hormonal therapy or HER2-targeted drugs is not effective. Therefore, it is desirable to select a better combination of treatments for triple negative breast cancer by early diagnosis and discovery.
  • FGFR4 having a mutation in the tyrosine kinase domain is present in a specimen obtained from a breast cancer patient (Examples 1 to 4), and used a lentiviral vector for expressing these mutant FGFR4 genes.
  • the infected cells of the mutant FGFR4 gene have an anchorage-independent growth promoting action (Example 7), and the infected cells have an in vivo tumor-forming ability (Examples) 8) was confirmed, and the gene was found to be a causative gene for cancer.
  • the present inventor constructed a method for detecting breast cancer by detecting the presence of these mutant FGFR4 genes, and provided a primer set, a probe, and a detection kit for the detection of these mutant FGFR4 genes. By detecting, it was possible to select cancer patients to be treated with FGFR4 inhibitory drug treatment.
  • the present invention relates to the following [1] to [14].
  • [1] A method for detecting the presence of breast cancer in a subject, wherein the asparagine or lysine from the 82nd asparagine of the fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) tyrosine kinase domain in a sample obtained from the subject Detecting the presence of the mutation.
  • [2] The method according to [1], wherein the mutation is a mutation in FGFR4 described in (1) to (2) below. (1) Mutation from 535th asparagine of FGFR4 isoform 1 to aspartic acid or lysine; or (2) Mutation from 495th asparagine of FGFR4 isoform 2 to aspartic acid or lysine.
  • [3] The method according to [1] or [2], wherein the mutation is a mutation in FGFR4 according to (1) or (2) below.
  • the method according to [1] or [2] comprising a step of detecting the presence of a mutation in the FGFR4 gene according to (1) to (2) below.
  • a step of detecting the presence of a mutation from the 1603rd alanine to guanine or from the 1605th cytosine to alanine in the FGFR4 gene comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 [6] to [6]
  • the method according to any one of 8].
  • the method includes a step of amplifying a nucleic acid in a sample obtained from the subject using a primer set designed to amplify a region in the FGFR4 gene described in (1) to (2) below: [1 ] To [9].
  • a probe designed to be able to hybridize under stringent conditions to a region containing a mutation in the FGFR4 gene described in (1) to (2) below is applied to a nucleic acid in a sample obtained from the subject.
  • the present invention also relates to the following [15] to [20].
  • [15] A method for diagnosing breast cancer in a subject, comprising the detection step according to any one of [1] to [11].
  • [16] The method according to [15], comprising the step of obtaining a sample from the subject.
  • the method according to [15] or [16] wherein the breast cancer is triple negative breast cancer.
  • the method according to [18] further comprising the step of determining that the subject is highly likely to suffer from triple negative breast cancer when the mutation is detected from a sample obtained from the subject. .
  • [20] The method according to [18] or [19], wherein the subject is a breast cancer patient.
  • the present invention also relates to the following [21] to [23].
  • [21] A primer set for detecting the presence of breast cancer in a subject, the primer set designed to amplify a region in the FGFR gene described in (1) to (2) below. (1) a region containing the 1603rd, 1605th, or both bases of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1; or (2) the 1483rd of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, A region containing the 1485th base or both of them.
  • the primer set according to [21] which is selected from the group consisting of the following (1) to (6).
  • a sense primer comprising an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1602 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1604 to 2409 of SEQ ID NO: 1
  • a primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides complementary to (2) a sense primer composed of an arbitrary consecutive at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1604 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1606 to 2409 of SEQ ID NO: 1
  • a primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides complementary to (3) a sense primer composed of an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1602 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1606 to 2409 of SEQ ID NO: 1
  • the present invention also relates to the following [24] to [25].
  • [24] A probe for detecting the presence of breast cancer in a subject so that it can hybridize under stringent conditions to a region containing a mutation in the FGFR4 gene described in (1) to (2) below Designed probe.
  • (1) Mutation from the 1603rd alanine to guanine or mutation from the 1605th cytosine to alanine of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1; or (2) consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 Mutation from the 1483th alanine to guanine or the 1485th cytosine to alanine in the FGFR4 gene.
  • the probe according to [24] wherein the breast cancer is triple negative breast cancer.
  • the present invention also relates to the following [26] to [27].
  • [26] A detection kit for detecting the presence of breast cancer in a subject, comprising at least one of the primer set described in [21] or [22] or the probe described in [24] For kit.
  • [27] The detection kit according to [26], wherein the breast cancer is triple negative breast cancer.
  • the present invention also relates to the following [28] to [36].
  • [28] A method for detecting the presence of breast cancer in a subject, comprising the step of amplifying a nucleic acid in a sample obtained from the subject using the primer set according to [21] or [22]. .
  • the method according to [28], comprising a step of amplifying a region in the FGFR4 gene according to (1) to (2) below using the primer set. (1) a region containing the 1603rd, 1605th or both bases of the FGFR4 isoform 1 gene; or (2) a region containing the 1483th, 1485th or both bases of the FGFR4 isoform 2 gene.
  • [30] The method according to [28] or [29], comprising a step of amplifying a region in the FGFR4 gene according to (1) to (2) below using the primer set.
  • (1) a region containing the 1603rd, 1605th, or both bases of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1; or (2) the 1483rd of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, A region containing the 1485th base or both of them.
  • a method for detecting the presence of breast cancer in a subject comprising the step of hybridizing the probe according to [24] to a nucleic acid in a sample obtained from the subject.
  • the present invention also relates to the following [37] to [42].
  • [37] A method for diagnosing breast cancer in a subject, comprising the step according to any of [28] to [33].
  • [38] The method according to [37], comprising obtaining a sample from the subject.
  • the method of [40] The method of [37] or [38], wherein the breast cancer is triple negative breast cancer.
  • the method according to [40] further comprising the step of determining that the subject is likely to have triple negative breast cancer when the mutation is detected from a sample obtained from the subject. .
  • [42] The method of [40] or [41], wherein the subject is a breast cancer patient.
  • the detection method of the present invention can be used as a method for detecting breast cancer (particularly triple negative breast cancer) in a subject. Moreover, according to the detection method of the present invention, it is possible to discriminate whether or not a breast cancer patient is an application target of an FGFR4 inhibitor.
  • the primer set, probe and detection kit of the present invention can be used for the detection method of the present invention.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting the presence of breast cancer in a subject, comprising the step of detecting the presence of a mutation in the tyrosine kinase domain of fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4) in a sample obtained from the subject. Including.
  • Samples obtained from the subjects include collected from the subjects (samples separated from the living body), specifically, any collected cellular tissue, body fluid (blood, oral mucus, circulating tumor cells), Exosomes, etc.), biopsy samples, etc. are used, but biopsy samples are preferably used.
  • Genomic DNA or RNA can be extracted from the collected sample and used, and its transcription product (product resulting from transcription and translation of the genome; for example, mRNA, cDNA, protein) can be used. In particular, it is preferable to prepare and use mRNA or cDNA.
  • FGFR4 is known to have two isoforms, isoforms 1 and 2.
  • FGFR4 isoform 1 is FGFR4 consisting of 802 amino acids in total length.
  • wild-type FGFR4 isoform 1 consists of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and is encoded by a polynucleotide consisting of a base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • FGFR4 isoform 2 is FGFR4 consisting of 762 amino acids in total length.
  • wild-type FGFR4 isoform 2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and is encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
  • FGFR4 isoforms 1 and 2 have a common tyrosine kinase domain in their intracellular region.
  • the tyrosine kinase domain of FGFR4 is a region consisting of 311 amino acids corresponding to amino acid positions 454 to 764 of FGFR4 isoform 1 and amino acid positions 414 to 724 of isoform 2, respectively. Means.
  • the tyrosine kinase domain of wild type FGFR4 isoforms 1 and 2 consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, and is encoded by a polynucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • the mutation to be detected in the method of the present invention is a mutation in the tyrosine kinase domain of FGFR4. Specifically, the aspartate from the 82nd asparagine of the tyrosine kinase domain of FGFR4. Or a mutation to lysine.
  • a typical example of the mutation to be detected is a mutation from the asparagine at position 82 of the FGFR4 tyrosine kinase domain consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 to aspartic acid or lysine.
  • the mutation to be detected is caused by a mutation in the tyrosine kinase domain coding region of the FGFR4 gene. Therefore, the presence of the genetic mutation may be detected in the method of the present invention.
  • a mutation from the 244th alanine to guanine or a 246th cytosine to alanine in the tyrosine kinase domain coding region of the FGFR4 gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13 Mutations.
  • the aforementioned detection target mutation corresponds to a mutation from 535th asparagine to aspartic acid or lysine in FGFR4 isoform 1, and corresponds to a mutation from 495th asparagine to aspartic acid or lysine in FGFR4 isoform 2.
  • the mutation in the FGFR4 gene corresponding to each of these mutations includes a mutation from the 1603rd alanine to guanine in the FGFR4 isoform 1 gene, a mutation from the 1605th cytosine to alanine, and the 1483rd position of the FGFR4 isoform 2 gene Alanine to guanine or 1485th cytosine to alanine.
  • a mutation from 535th asparagine of FGFR4 consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 to aspartic acid or lysine, amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 And the mutation from asparagine at position 495 to aspartic acid or lysine in FGFR4.
  • mutations in the FGFR4 gene corresponding to these include mutations from the 1603rd alanine to guanine or the 1605th cytosine to alanine in the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: Mutation of the 1483th alanine to guanine or mutation of the 1485th cytosine to alanine of the FGFR4 gene comprising the base sequence shown in FIG.
  • the mutation of asparagine (N) to aspartic acid (D) in FGFR4 is also referred to as ND-FGFR4, and the mutation of asparagine (N) to lysine (K) is also referred to as NK-FGFR4.
  • a protein having a detection target mutation also referred to as “mutant protein”
  • a polynucleotide encoding a protein having a detection target mutation also referred to as “mutant polynucleotide”
  • a detection target also referred to as “mutant protein”
  • mutant polynucleotide encoding a protein having a detection target mutation
  • mutant proteins include a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 10 for ND-FGFR4, and an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 12 for NK-FGFR4.
  • mutant polynucleotides include ND-FGFR4, a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 9, and NK-FGFR4, shown in SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 11.
  • a polynucleotide comprising a base sequence is exemplified.
  • this detection step detects the presence of the mutant polynucleotide in the genomic DNA of the sample obtained from the subject, or the sample obtained from the subject.
  • a transcript for example, mRNA or cDNA
  • Extraction of genomic DNA and preparation of mRNA and cDNA can be performed by methods known in the art, and can be easily performed using a commercially available kit.
  • this detection step a gene mutation analysis method known in the art can be used.
  • this detection step is performed by using a known nucleic acid amplification method (PCR method, RT-PCR method, LCR method (Ligase chain Reaction), SDA method) for nucleic acid derived from a sample obtained from a subject (eg, mRNA, cDNA, etc.).
  • PCR method RT-PCR method
  • LCR method Liigase chain Reaction
  • SDA method SDA method for nucleic acid derived from a sample obtained from a subject
  • NASBA method Nucleic acid sequence-based amplification method
  • ICAN method Isothermal and chimerized amplification-Lampification method.
  • TMAs a region including a portion corresponding to the mutation to be detected in the mutant polynucleotide (also referred to as “mutation region to be detected”), and sequencing the amplified product after amplification.
  • the presence or absence of mutation can be confirmed by performing the above.
  • a method known in the art such as a direct sequence method can be used.
  • the primer used in the above-described nucleic acid amplification method is not particularly limited as long as it can amplify the mutation region to be detected in the mutant polynucleotide, and is designed based on the base sequence of the mutant polynucleotide.
  • Primer design can be performed using primer design software (for example, Primer Express; PE Biosystems).
  • primer design software for example, Primer Express; PE Biosystems.
  • the sense primer and the antisense primer should be set so that the size of the amplification product when mRNA or cDNA is amplified is 1 kb or less. Is appropriate.
  • PCR restriction enzyme fragment length polymorphism analysis method
  • TaqMan method allele-specific primer PCR (ASP-PCR) method
  • SSCP method SSCP method
  • a method can also be used.
  • RFLP method after a mutation region to be detected is amplified by PCR, when a change occurs in a restriction enzyme recognition site based on the mutation, the difference between the nucleic acid fragments after the restriction enzyme treatment is analyzed by electrophoresis.
  • the TaqMan method is a method of adding a probe (TaqMan probe) modified with a fluorescent substance (FAM, VIC, etc.) at the 5 ′ end and a quencher (quenching) substance at the 3 ′ end to the PCR reaction system.
  • a TaqMan probe is hybridized to the mutation region to be detected and a PCR reaction is performed from the primer, the TaqMan probe is degraded by the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of the DNA polymerase in the extension reaction, thereby The fluorescent substance is released from the probe, the suppression by the quencher is released, and the fluorescent substance emits fluorescence, thereby detecting the target mutation.
  • the ASP-PCR method is a method of detecting the presence or absence of nucleic acid amplification by PCR by designing a primer so as to have a detection target mutation site at the 3 'end.
  • a mutation region to be detected is amplified by PCR and then separated into single-stranded DNA, which is separated by electrophoresis on a non-denaturing gel. Mutation changes the higher order structure of the DNA, which reflects the difference in mobility on the gel.
  • a method based on probe hybridization can also be used, and examples thereof include a DNA chip method, an Invader method, and a melting curve analysis method.
  • DNA chip method DNA containing a mutation region to be detected is placed on a substrate, nucleic acid derived from a subject is hybridized to the DNA chip, and the presence or absence of hybridization is confirmed.
  • Invader method two types of nucleic acids (Invader oligo and signal probe) that hybridize before and after the mutation site to be detected are reacted with a nucleic acid derived from a subject, and then a Cleavease enzyme that recognizes the triplex structure of the DNA to be formed is used. Act to release the flap in the signal probe.
  • the flap hybridizes with the detection FRET Probe, and the enzyme acts again on this to detect the fluorescence of the fluorescent substance released from the FRET Probe.
  • the temperature is gradually raised, and a change in fluorescence accompanying the temperature rise is measured to create a melting curve. This confirms the change in melting temperature with or without mutation.
  • a method based on primer extension can also be used, and examples thereof include SNaPshot method and Pyrosequencing method.
  • SNaPshot method a primer adjacent to the mutation site to be detected and a fluorescently labeled ddNTP are used, and the incorporated base is detected by extending only one base from the primer.
  • pyrosequencing method pyrophosphoric acid is generated when dNTPs are added one by one in the primer extension reaction and dNTPs are incorporated by the polymerase reaction. The resulting pyrophosphate is detected by a fluorescence reaction with luciferase, and the base sequence is determined from the emission peak pattern.
  • a person skilled in the art can appropriately design primers and probes to be used based on the gene mutation analysis method to be used, and is not particularly limited. For example, it can be produced by a chemical synthesis method. .
  • the presence of a mutant protein in a sample obtained from a subject may be detected, and for example, it can be carried out using an antibody that specifically recognizes the mutant protein. Production of such an antibody and detection of a protein using the antibody can be performed using a method known in the art.
  • ER estrogen receptor
  • PR progesterone receptor
  • HER2 epidermal growth factor receptor type 2
  • the presence of triple negative breast cancer may be detected in a breast cancer patient as the subject.
  • a subject (patient) having the mutation-positive breast cancer can be an application target of treatment with an FGFR4 inhibitor.
  • the detection method of the present invention can be used for a diagnosis method of breast cancer (more specifically, triple negative breast cancer) in a subject.
  • the diagnostic method of the present invention in addition to the detection step of the present invention, when the mutation is detected from a sample obtained from a subject, it is determined that the subject is likely to have breast cancer or triple negative breast cancer. A process may be included.
  • the primer set of the present invention is a primer set for detecting the presence of breast cancer in a subject, and is a sense primer and an anti-antigen designed to amplify a mutant region to be detected in a mutant polynucleotide in the detection step of the present invention.
  • the antisense primer consists of a nucleic acid molecule (preferably a nucleic acid molecule of at least 16 bases) that hybridizes under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) to the mutated polynucleotide. It consists of a nucleic acid molecule (preferably a nucleic acid molecule of at least 16 bases) that hybridizes with the complementary strand of the mutant polynucleotide under stringent conditions (preferably under more stringent conditions).
  • the primer set of the present invention is a region containing the 1603rd, 1605th, or both bases of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • primer set of the present invention include a primer set selected from the group consisting of (1) to (6) below: (1) A sense primer comprising an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1602 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1604 to 2409 of SEQ ID NO: 1 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides complementary to (2) a sense primer composed of an arbitrary consecutive at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1604 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1606 to 2409 of SEQ ID NO: 1 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides complementary to (3) a sense primer composed of an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 1602 of SEQ ID NO: 1 and an arbitrary continuous at least 16
  • the primer set of the present invention is designed to amplify a region containing the 244th, 246th or both bases of the tyrosine kinase domain coding region of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 13.
  • a specific embodiment including a sense primer and an antisense primer includes a primer set selected from the group consisting of the following (1) to (3): (1) A sense primer comprising an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 243 of SEQ ID NO: 13 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 245 to 933 of SEQ ID NO: 13 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides complementary to (2) a sense primer composed of an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 1 to 245 of SEQ ID NO: 13 and an arbitrary continuous at least 16 base oligonucleotide between base numbers 247 to 933 of SEQ ID NO: 13 A primer set of antisense primers consisting of oligonucleotides complementary to each other; and (3) a sense primer consisting of any consecutive oligonucleotides of at least 16 bases between base numbers 1 to 243 of SEQ ID NO: 13
  • the primer set of the present invention can be used in the method of the present invention.
  • the primer set of the present invention may be used to amplify a nucleic acid in a sample obtained from a subject. Good.
  • the probe of the present invention is a probe for detecting the presence of breast cancer in a subject, and is a probe designed so that it can hybridize to the mutation region to be detected in the mutant polynucleotide in the detection step of the present invention. is there.
  • the probe of the present invention is a nucleic acid molecule (preferably at least 16 bases) that hybridizes under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) to a mutant region to be detected in a mutant polynucleotide or its complementary strand. Nucleic acid molecules).
  • the probe of the present invention is a mutation from the 1603 alanine to guanine or the 1605 mutation from cytosine to alanine of the FGFR4 gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or the base shown in SEQ ID NO: 3. It is designed to hybridize to a region containing a mutation from the 1483th alanine to guanine or a 1485th cytosine to alanine mutation in the FGFR4 gene comprising the sequence.
  • the probe of the present invention can be used in the method of the present invention.
  • the method of the present invention may include a step of hybridizing the probe of the present invention to a nucleic acid in a sample obtained from a subject.
  • the “stringent conditions” are as follows: “5 ⁇ SSPE, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 ⁇ g / mL sperm DNA, over 42 ° C. “Night” is a condition for cleaning, “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”. “More stringent conditions” means “5 ⁇ SSPE, 5 ⁇ Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 ⁇ g / mL sperm DNA, over 42 ° C.” “Night”, the conditions for cleaning are “0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
  • the interval between the selected positions of the sense primer and the antisense sense primer is 1 kb or less, or the size of the amplification product amplified by the sense primer and the antisense sense primer is 1 kb or less.
  • the primer and probe of the present invention usually have a chain length of 15 to 40 bases, preferably 16 to 24 bases, more preferably 18 to 24 bases, and particularly preferably 20 to 24 bases.
  • the primer set and probe of the present invention can be easily produced by those skilled in the art by, for example, chemical synthesis, and may be labeled with a fluorescent label or the like depending on the detection method.
  • the detection kit of the present invention is a kit for detecting the presence of breast cancer or triple negative breast cancer in a subject, and preferably contains at least one of the primer set of the present invention or the probe of the present invention.
  • the primer set, probe and detection kit of the present invention can also be used in the aforementioned detection method of the present invention.
  • the detection method of the present invention may include a step of amplifying the detection target mutation region using the primer set of the present invention, and may include a step of hybridizing the probe of the present invention to the detection target mutation region.
  • ND mutant FGFR4 (ND-FGFR4) polynucleotide in breast cancer clinical specimens
  • ND-FGFR4 ND mutant FGFR4
  • Br031 specimen RNA Br031 specimen RNA
  • reverse transcriptase SuperScriptIII, Life Technologies
  • oligo (dT) primer oligo (dT) 20 primer, Life Technologies
  • FGFR4 isoform 2 (GenBank accession number: NM_022963.2) in the coding region (SEQ ID NO: 1) of FGFR4 isoform 1 (GenBank accession number: NM_002011.3, GenBank accession number: NM_2133647.1).
  • a substitution of alanine (A) to guanine (G) was found at the position corresponding to position 1483 in the coding region (SEQ ID NO: 3).
  • This mutation is caused by aspartic acid (N) to aspartic acid (N) at the amino acid position corresponding to the 535th position in the amino acid sequence of isoform 1 (SEQ ID NO: 2) and the 495th position in the amino acid sequence of isoform 2 (SEQ ID NO: 4). Corresponds to the mutation to D).
  • This mutation in FGFR4 is also referred to as ND-FGFR4.
  • Example 2 Discovery of NK mutant FGFR4 (NK-FGFR4) polynucleotide in breast cancer clinical specimens
  • Breast cancer patient tissue-derived RNA (Asterland, USA) Br036 specimen RNA was analyzed using the same method as in Example 1. Was synthesized.
  • PCR was performed using the obtained cDNA as a template with the same primers and reaction conditions as in Example 1. Thereafter, in the same manner as in Example 1, the PCR product was purified using a column, and then the sequencing reaction was performed on the PCR product using the same primers.
  • cytosine (C) to alanine (A) at positions corresponding to the 1605th position in the coding region of FGFR4 isoform 1 (SEQ ID NO: 1) and the 1485th position in the coding region of FGFR4 isoform 2 (SEQ ID NO: 3), respectively. ) was found.
  • This mutation occurs from asparagine (N) to lysine (K) at amino acid positions corresponding to the 535th position in the amino acid sequence of isoform 1 (SEQ ID NO: 2) and the 495th position in the amino acid sequence of isoform 2 (SEQ ID NO: 4). Corresponds to the mutation to).
  • This mutation in FGFR4 is also referred to as NK-FGFR4.
  • Example 3 Detection of ND-FGFR4 in a breast cancer sample Using the same method as in Example 1 on the breast cancer clinical specimen-derived RNA (Asterland, USA) 149 sample, the presence or absence of ND-FGFR4 mutation was confirmed.
  • ND-FGFR4 mutation was found in samples Br031 and Br032.
  • these ND mutation-positive breast cancer specimens are triple negative breast cancer specimens that do not show strong expression of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and epidermal growth factor receptor type 2 (HER2). there were.
  • ER estrogen receptor
  • PR progesterone receptor
  • HER2 epidermal growth factor receptor type 2
  • ND-FGFR4 in a sample derived from a clinical specimen of breast cancer can be detected by the above method, and a positive patient of ND-FGFR4 can be selected.
  • Example 4 Detection of NK-FGFR4 in breast cancer sample Using the same method as in Example 1 on the breast cancer clinical specimen-derived RNA (Asterland, USA) 149 sample, the presence or absence of NK-FGFR4 mutation was confirmed.
  • NK-FGFR4 in a sample derived from a clinical specimen of breast cancer can be detected by the above method, and a positive patient of NK-FGFR4 can be selected.
  • This PCR product was cloned into a cloning vector (TOPO XL PCR Cloning Kit; Life Technologies) (FGFR4 / TOPO XL).
  • N535D ND mutation
  • Mutagenesis method PrimeSTAR (registered trademark) Mutagenesis Basal Kit; Takara Bio Inc.
  • SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22 primers of SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 22.
  • N535D-FGFR4 / TOPO XL The nucleotide sequence and amino acid sequence of the prepared N535D-FGFR4 are shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • N535K an NK mutation
  • FGFR4 / TOPO XL FGFR4 / TOPO XL
  • primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 N535K-FGFR4 / TOPO XL
  • SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 The nucleotide sequence and amino acid sequence of the prepared N535K-FGFR4 are shown in SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively.
  • lentiviral expression vector of wild type and mutant FGFR4 Lentiviral expression vector obtained by digesting FGFR4 / TOPO XL with SpeI and XhoI and digesting the nucleic acid fragment with SpeI and SalI Cloning to SpeI-SalI site (named FGFR4 / pLenti6.3);
  • each of the lentiviral expression vectors N535D-FGFR4 / pLenti6.3 and N535K-FGFR4 / pLenti6.3 was constructed from N535D-FGFR4 / TOPO XL and N535K-FGFR4 / TOPO XL, respectively.
  • FGFR4 / pLenti6.3, N535D-FGFR4 / pLenti6.3, and N535K-FGFR4 / pLenti6.3 are each 3 ⁇ g, packaging plasmid 9 ⁇ g (ViraPower TM Packaging Mix; Life Technologies), Transfect reagent (Lipof 2000) Life Technologies, Inc.) was used to introduce 293FT cell packaging cells (Life Technologies). The culture supernatant 3 days after the introduction was recovered as a lentivirus, polybrene (Sigma) was added at a concentration of 6 ⁇ g / ml, and then added to mouse NIH3T3 cells.
  • NIH3T3 cells Two days later, the culture supernatant of NIH3T3 cells was replaced with DMEM medium (Invitrogen) supplemented with 10% bovine serum (Invitrogen) and Blastcidin (InvivoGen) 5 ⁇ g / ml.
  • DMEM medium Invitrogen
  • Blastcidin InvivoGen 5 ⁇ g / ml.
  • NIH3T3 cells (named FGFR4 / NIH3T3, N535D-FGFR4 / NIH3T3, and N535K-FGFR4 / NIH3T3, respectively) stably expressing type FGFR4, N535D-FGFR4, and N535K-FGFR4 were obtained.
  • Example 7 Examination of anchorage-independent growth-promoting action of mutant FGFR4 FGFR4 / NIH3T3, N535D-FGFR4 / NIH3T3, and N535K-FGFR4 / NIH3T3 on 96-well spheroid plates (Sumilon Celtite Spheroid 96U; Sumitomo Bakelite) Were seeded in a medium containing 10% fetal bovine serum so that 3 ⁇ 10 3 per well were obtained. After culturing at 37 ° C.
  • Example 8 Examination of tumor-forming ability of mutant FGFR4
  • this cell line was transplanted into nude mice and the tumor-forming ability was examined.
  • N535D-FGFR4 / NIH3T3 and N535K-FGFR4 / NIH3T3 cells were inoculated subcutaneously into nude mice at 3 ⁇ 10 6 cells and observed for 8 days, tumor formation was confirmed. From the above, it was shown that ND-FGFR4 and NK-FGFR4 are causative genes for cancer.
  • the detection method of the present invention is useful for detecting breast cancer (particularly triple negative breast cancer) in a subject.
  • the primer set, probe and detection kit of the present invention can be used for the detection method of the present invention.

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Abstract

【課題】　乳癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異に基づくタンパク質検出することによる、被験者における乳癌の存在を検出する方法、被験者における乳癌を診断する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。 【解決手段】　被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。

Description

乳癌におけるＦＧＦＲ４変異体の検出法
　本発明は、ＦＧＦＲ４における変異の存在を検出することによる、被験者における乳癌の存在を検出する方法に関する。
　線維芽細胞増殖因子受容体（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＦＧＦＲ）は受容体チロシンキナーゼの１種であり、ＦＧＦＲのリガンドとしては、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）が知られている。ＦＧＦＲファミリーには、４つの受容体型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３及びＦＧＦＲ４の存在が知られている。これらの受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質内ドメインを有する膜貫通タンパク質から構成される。細胞外ドメインは２つ又は３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ二量体、ＦＧＦ、及びヘパリングリカン又はプロテオグリカンの複合体において細胞表面で起こる二量体化によって活性化される、単量体チロシンキナーゼ受容体である。ＦＧＦについては、２２種の既知のＦＧＦが存在し、それぞれが１つ又は複数のＦＧＦＲと結合する能力を有する。ＦＧＦがＦＧＦＲに結合することで受容体チロシンキナーゼが活性化され、下流にシグナル伝達が行われる。ＦＧＦＲの発現部位や時期の差異によって、細胞遊走や細胞増殖などの複雑な生体機能を制御している。
　ＦＧＦＲファミリーのうち、ヒトのＦＧＦＲ４遺伝子については現在までに３つのスプライシングバリアント（ＦＧＦＲ４遺伝子バリアント１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００２０１１．３）、バリアント２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２２９６３．２）、バリアント３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿２１３６４７．１））の存在が知られている。このうち、バリアント１及びバリアント３はＦＧＦＲ４のアイソフォーム１をコードし、バリアント２はＦＧＦＲ４のアイソフォーム２をコードする。ＦＧＦＲ４アイソフォーム１は全長８０２アミノ酸、アイソフォーム２は全長７６２アミノ酸からなり、アイソフォーム１とアイソフォーム２はその膜貫通ドメイン内の領域において異なるものの、細胞外ドメイン及び細胞膜内ドメインにおいて同一のアミノ酸配列を有する。
　ＦＧＦＲのチロシンキナーゼドメインは細胞膜内ドメインに存在し、種々の癌においてＦＧＦＲのチロシンキナーゼドメインにおける点変異が癌の活性化に関与していることが確認されている。このうち、ＦＧＦＲ４については、横紋筋腫において、チロシンキナーゼドメイン内の点変異が見いだされており、これら点突然変異の導入が、ＦＧＦＲ４の恒常的な活性化を引き起こし、細胞内シグナルが異常に活性化され、癌化及び細胞増殖を引き起こしていることが報告されている（非特許文献１）。
　しかし、これまでに乳癌において、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメイン内の点変異が存在しているとの報告は無い。
　乳癌は、女性における罹患数が最も多い癌であり、罹患率は依然として増加傾向にある。乳癌の治療には、手術、放射線治療、化学療法（抗癌剤）、ホルモン療法などが組み合わせで用いられることが多いが、治癒率の改善のためには乳癌の早期診断及び発見が望ましい。
　乳癌の原因として考えられている因子の１つに、エストロゲン受容体（ＥＲ）やプロゲステロン受容体（ＰＲ）などのホルモン受容体がある。ホルモン受容体陽性の乳癌においては、女性ホルモン（エストロゲン）が受容体に結合し、細胞増殖が促進される。このようなタイプの乳癌に対しては、タモキシフェンなどの抗エストロゲン剤やアロマターゼ阻害剤によるホルモン療法が有効と考えられている。また乳癌の別の要因として、上皮細胞増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）が存在し、ＨＥＲ２の過剰発現によって乳癌の細胞増殖が促進されることが確認されている。このようなＨＥＲ２陽性の乳癌患者に対しては、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）のような分子標的薬が治療法の１つとして用いられている。
　しかし、近年の研究によって、ＥＲやＰＲのホルモン受容体やＨＥＲ２のいずれにも関連せずに発症するタイプの乳癌が存在することが確認されており、このようなタイプの乳癌はトリプルネガティブ乳癌と呼ばれている。トリプルネガティブ乳癌は、その治療においてホルモン療法やＨＥＲ２標的薬の使用が効果を奏さず、治療が難しい乳癌である。それ故、トリプルネガティブ乳癌については、より早期に診断し発見することによって、より良い治療法の組み合わせを選択することが望ましい。
「（ザ ジャーナル オブ クリニカル インベスティゲーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）, （英国）、２００９年、１１巻、p.３３９５－３４０７」
　乳癌の原因である新たな遺伝子変異を解明し、これにより、当該遺伝子変異又は当該変異を有するタンパク質を検出することによる、被験者における乳癌の存在を検出する方法、被験者における乳癌を診断する方法、並びにそのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供することを課題とする。
　本発明者らは、チロシンキナーゼドメイン内に変異を有するＦＧＦＲ４が乳癌患者から得た検体に存在することを見出し（実施例１～４）、これらの変異ＦＧＦＲ４遺伝子を発現させるためのレンチウイルスベクターを作製し（実施例５～６）、変異ＦＧＦＲ４遺伝子の感染細胞が足場非依存的増殖亢進作用を有すること（実施例７）、及び該感染細胞がｉｎ　ｖｉｖｏで腫瘍形成能を有すること（実施例８）を確認し、該遺伝子が癌の原因遺伝子であることを見出した。本発明者は、これらの知見から、これらの変異ＦＧＦＲ４遺伝子の存在を検出することによる乳癌の検出法を構築し、そのためのプライマーセット、プローブ及び検出用キットを提供し、これらの変異ＦＧＦＲ４遺伝子を検出することにより、ＦＧＦＲ４阻害薬物治療の対象となる癌患者を選別することを可能とした。
　すなわち、本発明は、以下の［１］～［１４］に関する。
［１］被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
［２］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、［１］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
［３］前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
（２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
［４］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］又は［２］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［５］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［６］前記変異がＦＧＦＲ４アイソフォーム１の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異である、［２］に記載の方法。
［７］前記変異が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異である、［６］に記載の方法。
［８］ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］に記載の方法。
［９］配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異の存在を検出する工程を包含する、［６］～［８］のいずれかに記載の方法。
［１０］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。 
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［１１］下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。 
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［１２］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］前記被験者が乳癌患者である、［１３］に記載の方法。
　また、本発明は、以下の［１５］～［２０］に関する。
［１５］被験者における乳癌を診断する方法であって、前記［１］～［１１］のいずれかに記載の検出工程を包含する、方法。
［１６］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［１５］に記載の方法。
［１７］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１８］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［１５］又は［１６］に記載の方法。
［１９］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［１８］に記載の方法。
［２０］前記被験者が乳癌患者である、［１８］又は［１９］に記載の方法。
　また、本発明は、以下の［２１］～［２３］に関する。
［２１］被験者における乳癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ遺伝子における領域を増幅できるように設計した、プライマーセット。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［２２］以下の（１）～（６）からなる群より選択される、［２１］に記載のプライマーセット。
（１）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０４から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（２）配列番号１の塩基番号１から１６０４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（３）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（４）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８４から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（５）配列番号３の塩基番号１から１４８４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（６）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
［２３］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２１］又は［２２］に記載のプライマーセット。
　また、本発明は、以下の［２４］～［２５］に関する。
［２４］被験者における乳癌の存在を検出するためのプローブであって、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計した、プローブ。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［２５］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２４］に記載のプローブ。
　また、本発明は、以下の［２６］～［２７］に関する。
［２６］被験者における乳癌の存在を検出するための検出用キットであって、前記［２１］又は［２２］に記載のプライマーセット或いは前記［２４］に記載のプローブの少なくとも１つを含む、検出用キット。
［２７］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２６］に記載の検出用キット。
　また、本発明は、以下の［２８］～［３６］に関する。
［２８］被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、前記［２１］又は［２２］に記載のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、方法。
［２９］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［２８］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［３０］前記プライマーセットを用いて、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅させる工程を包含する、［２８］又は［２９］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
［３１］被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、前記［２４］に記載のプローブを、被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、方法。
［３２］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［３１］に記載の方法。
（１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［３３］前記プローブを、下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にハイブリダイズさせる工程を包含する、［３１］又は［３２］に記載の方法。
（１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
（２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
［３４］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［２８］～［３３］のいずれかに記載の方法。
［３５］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［２８］～［３４］のいずれかに記載の方法。
［３６］前記被験者が乳癌患者である、［３５］に記載の方法。
　また、本発明は、以下の［３７］～［４２］に関する。
［３７］被験者における乳癌を診断する方法であって、前記［２８］～［３３］のいずれかに記載の工程を包含する、方法。
［３８］前記被験者から試料を得る工程を包含する、［３７］に記載の方法。
［３９］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者が乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［３７］又は［３８］に記載の方法。
［４０］前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、［３７］又は［３８］に記載の方法。
［４１］前記変異が前記被験者から得た試料から検出された場合に、該被験者がトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程をさらに包含する、［４０］に記載の方法。
［４２］前記被験者が乳癌患者である、［４０］又は［４１］に記載の方法。
　本発明の検出方法は、被験者における乳癌（特にはトリプルネガティブ乳癌）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、乳癌患者に対してＦＧＦＲ４阻害剤の適用対象者であるか否かを鑑別することができる。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の検出方法に用いることができる。
《本発明の検出方法》
　本発明の検出方法は、被験者における乳癌の存在を検出する方法であり、被験者から得た試料中の線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）のチロシンキナーゼドメインにおける変異の存在を検出する工程を含む。
　被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された細胞組織、体液（血液、口腔粘液、循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ）、エキソソーム等）、生検された試料等を用いるが、好適には生検された試料を用いる。採取した試料からゲノムＤＮＡもしくはＲＮＡを抽出して用いることができ、またその転写産物（ゲノムが転写及び翻訳される結果生じる産物；例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、蛋白質）を用いることができる。特には、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを調製して用いることが好ましい。
　現在まで、ＦＧＦＲ４には２つのアイソフォーム、アイソフォーム１及び２が存在することが知られている。ＦＧＦＲ４アイソフォーム１は全長８０２アミノ酸からなるＦＧＦＲ４であり、例えば、野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ４アイソフォーム２は全長７６２アミノ酸からなるＦＧＦＲ４であり、例えば、野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム２は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。ＦＧＦＲ４のアイソフォーム１及び２は、その細胞膜内領域において共通のチロシンキナーゼドメインを有する。本明細書中で使用される場合、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメインとは、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１のアミノ酸第４５４～７６４位、アイソフォーム２のアミノ酸第４１４～７２４位にそれぞれ対応する、３１１アミノ酸からなる領域を意味する。野生型のＦＧＦＲ４アイソフォーム１及び２のチロシンキナーゼドメインは、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなり、配列番号１３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにコードされる。
　本発明の方法における検出対象となる変異（「検出対象変異」とも称する）は、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメイン内の変異であり、具体的には、ＦＧＦＲ４のチロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異である。本検出対象変異の代表的な例としては、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異が挙げられる。本検出対象変異は、ＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域における変異に起因し、従って、本発明の方法において遺伝子変異の存在を検出してもよい。このような遺伝子変異の代表的な例としては、配列番号１３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の２４４番目のアラニンからグアニンへの変異又は２４６番目のシトシンからアラニンへの変異が挙げられる。
　前述の検出対象変異は、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１においては５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異に対応し、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２においては４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異に対応する。また、これらの変異にそれぞれ対応するＦＧＦＲ４遺伝子における変異としては、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異が挙げられる。
　本発明の方法における検出対象変異のより具体的な例としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異が挙げられる。また、これらに対応するＦＧＦＲ４遺伝子における変異の例としては、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異、配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異が挙げられる。
　本明細書中、前記ＦＧＦＲ４におけるアスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）への変異をＮＤ－ＦＧＦＲ４、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）の変異をＮＫ－ＦＧＦＲ４とも称する。本発明の方法においては、検出対象変異を有するタンパク質（「変異型タンパク質」とも称する）又は検出対象変異を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド（「変異型ポリヌクレオチド」とも称する）のいずれを検出対象としてもよい。変異型タンパク質の例としては、ＮＤ－ＦＧＦＲ４については、配列番号６又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、ＮＫ－ＦＧＦＲ４については、配列番号８又は配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。また、変異型ポリヌクレオチドの例としては、ＮＤ－ＦＧＦＲ４については、配列番号５又は配列番号９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ＮＫ－ＦＧＦＲ４については、配列番号７又は配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明の検出方法において変異型ポリヌクレオチドの存在を検出する場合、本検出工程は、被験者から得た試料のゲノムＤＮＡ中の変異型ポリヌクレオチドの存在を検出すること、あるいは、被験者から得た試料から抽出したゲノムＤＮＡの転写産物（例えば、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ）を調製し、変異型ポリヌクレオチドに対応するｍＲＮＡ又はｃＤＮＡの存在を検出することにより実施できる。ゲノムＤＮＡの抽出、ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの調製は当該分野で公知の方法で行うことができ、市販のキットを用いて簡便に行うことができる。
　本検出工程は、当該分野で公知の遺伝子変異解析方法を使用することができる。例えば、本検出工程は、被験者から得た試料由来の核酸（例えば、ｍＲＮＡやｃＤＮＡ等）に対して公知の核酸増幅方法（ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＬＣＲ法（Ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ＳＤＡ法（Ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＮＡＳＢＡ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｂａｓｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）、ＬＡＭＰ法（Ｌｏｏｐ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、ＴＭＡ法（Ｇｅｎ－Ｐｒｏｂｅ’ｓ　ＴＭＡ　ｓｙｓｔｅｍ）等）を用いて、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異に対応する部分を含む領域（「検出対象変異領域」とも称する）を増幅させる工程を含み、増幅後、この増幅産物について配列決定を行うことによって変異の有無を確認することができる。このような配列決定法としては、ダイレクトシーケンス法等の当該分野で公知の方法を使用することができる。
　前述の核酸増幅方法に用いられるプライマーは、変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるものであれば、特には限定されず、変異型ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計する。プライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Ｐｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓ；ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）等を利用してできる。また、増幅産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。
　核酸増幅方法を用いる別の公知の遺伝子変異解析方法として、ＲＦＬＰ法（制限酵素断片長多型解析法）、ＴａｑＭａｎ法、アレル特異的プライマーＰＣＲ（ＡＳＰ－ＰＣＲ）法、ＳＳＣＰ法等のＰＣＲに基づく方法も使用可能である。ＲＦＬＰ法は、ＰＣＲにより検出対象変異領域を増幅した後、変異に基づき制限酵素認識部位に変化が生じる場合に、その制限酵素処理後の核酸断片の差異を電気泳動により解析する。ＴａｑＭａｎ法は、５’末端に蛍光物質（ＦＡＭ、ＶＩＣ等）、３’末端にクエンチャー（消光）物質で修飾したプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に添加する方法である。本方法では、検出対象変異領域に対してＴａｑＭａｎプローブをハイブリダイズさせ、プライマーからのＰＣＲ反応を行うと、伸長反応におけるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性によりＴａｑＭａｎプローブが分解され、それにより蛍光物質がプローブより遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光物質から蛍光が発し、これにより目的の変異が検出される。ＡＳＰ－ＰＣＲ法は、３’末端に検出対象変異部位を有するようにプライマーを設計し、ＰＣＲによる核酸増幅の有無を検出する方法である。ＳＳＣＰ法では、検出対象変異領域をＰＣＲ増幅した後、一本鎖ＤＮＡに分離し、これを非変性ゲルでの電気泳動により分離する。変異によりＤＮＡの高次構造が変化し、これがゲル上の移動度の差異を反映する。
　また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プローブハイブリダイゼーションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＤＮＡチップ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、融解曲線解析法等が挙げられる。ＤＮＡチップ法では、検出対象変異領域を含むＤＮＡを基板上に配置し、被験者由来の核酸をＤＮＡチップにハイブリダイズさせ、ハイブリダイズの有無を確認する。Ｉｎｖａｄｅｒ法では、検出対象変異部位の前後にハイブリダイズする２種の核酸（Ｉｎｖａｄｅｒオリゴ及びシグナルプローブ）を被験者由来の核酸に反応させた後、形成されるＤＮＡの三重鎖構造を認識するＣｌｅｖａｓｅ酵素を作用させ、シグナルプローブ中のＦｌａｐを遊離させる。次いで、Ｆｌａｐが検出用ＦＲＥＴ　Ｐｒｏｂｅとハイブリダイズし、これに同酵素が再度作用し、ＦＲＥＴ　Ｐｒｏｂｅから遊離された蛍光物質の蛍光を検出する。融解曲線解析法は、検出対象変異領域に蛍光標識プローブをハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、温度上昇に伴う蛍光の変化を測定して融解曲線を作成する。これにより、変異の有無に伴う融解温度の変化を確認する。
　また別の公知の遺伝子変異解析方法として、プライマーエクステンションに基づく方法も使用可能であり、例えば、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法が挙げられる。ＳＮａＰｓｈｏｔ法では、検出対象変異部位に隣接するプライマーと蛍光標識したｄｄＮＴＰを用い、プライマーから一塩基のみを伸長させて取り込まれた塩基を検出する。Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ法では、プライマー伸長反応において、１種類ずつｄＮＴＰを添加し、ポリメラーゼの反応によりｄＮＴＰが取り込まれるとピロリン酸が生じる。生じたピロリン酸をルシフェラーゼによる蛍光反応で検出し、発光ピークパターンから塩基配列を決定する。
　当業者であれば、使用する遺伝子変異解析方法に基づいて、使用されるプライマー及びプローブを適宜設計することができ、特に限定されることはないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。
　本発明の検出方法においては、被験者から得た試料中の変異型タンパク質の存在を検出してもよく、例えば、変異型タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて実施できる。このような抗体の作製及び抗体を用いたタンパク質の検出は、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。
　本発明の方法において、検出対象変異が被験者から得た試料から検出された場合、当該被験者が乳癌に罹患している可能性が高いと判定できる。また、後記実施例に示されるように、当該変異はトリプルネガティブ乳癌患者において高い割合で確認されるため、本発明の方法において、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合、当該被験者がトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いとも判定できる。トリプルネガティブ乳癌とは、乳癌原因遺伝子であるエストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＲ）、プロゲステロン受容体（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＰＲ）、上皮細胞増殖因子受容体２型（Ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２；ＨＥＲ２）の過剰発現がいずれも認められないタイプの乳癌である。それゆえ、確立した治療方針がなく予後不良であり、アンメットメディカルニーズが非常に高い癌種である。従って、本発明の方法においては、乳癌患者を被験者として、当該被験者におけるトリプルネガティブ乳癌の存在を検出してもよい。また、当該変異陽性の乳癌を有する被験者（患者）は、ＦＧＦＲ４阻害剤による治療の適用対象となり得る。
　本発明の検出方法は、被験者における乳癌（より詳細には、トリプルネガティブ乳癌）の診断方法に使用することができる。本発明の診断方法は、本発明の検出工程に加えて、当該変異が被験者から得た試料から検出された場合に、被験者が乳癌又はトリプルネガティブ乳癌に罹患している可能性が高いと判定する工程を含んでもよい。
《本発明のプライマーセット、プローブ、検出用キット》
　本発明のプライマーセットは、被験者における乳癌の存在を検出するためのプライマーセットであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。アンチセンスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは、変異型ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
　好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域、あるいは配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む。
　本発明のプライマーセットの具体的な態様としては、以下（１）～（６）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０４から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（２）配列番号１の塩基番号１から１６０４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（３）配列番号１の塩基番号１から１６０２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号１６０６から２４０９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（４）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８４から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（５）配列番号３の塩基番号１から１４８４間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（６）配列番号３の塩基番号１から１４８２間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号３の塩基番号１４８６から２２８９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
　より好ましくは、本発明のプライマーセットは、配列番号１３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子のチロシンキナーゼドメインコード領域の２４４番目、２４６番目又はそれら両方の塩基を含む領域を増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含み、具体的な態様としては、以下（１）～（３）からなる群より選択されるプライマーセットが挙げられる：
（１）配列番号１３の塩基番号１から２４３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２４５から９３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；
（２）配列番号１３の塩基番号１から２４５間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２４７から９３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット；並びに
（３）配列番号１３の塩基番号１から２４３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１３の塩基番号２４７から９３３間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーのプライマーセット。
　本発明のプライマーセットは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、本発明のプライマーセットを用いて、被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を含んでもよい。
　本発明のプローブは、被験者における乳癌の存在を検出するためのプローブであって、本発明の検出工程における変異型ポリヌクレオチド中の検出対象変異領域にハイブリダイズすることができるように設計したプローブである。本発明のプローブは、変異型ポリヌクレオチド又はその相補鎖中の検出対象変異領域にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でハイブリダイズする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなる。
　好ましくは、本発明のプローブは、配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異、あるいは配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異を含む領域にハイブリダイズするように設計される。
　本発明のプローブは、本発明の方法において使用することができ、例えば、本発明の方法において、被験者から得た試料中の核酸に本発明のプローブをハイブリダイズさせる工程を含んでもよい。
　前記「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。
　前記プライマーセットにおいては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。また、本発明のプライマー及びプローブは、通常、１５～４０塩基、好ましくは１６～２４塩基、更に好ましくは１８～２４塩基、特に好ましくは２０～２４塩基の鎖長を有する。
　本発明のプライマーセット及びプローブは、例えば、化学合成法によって当業者に容易に製造することができ、また、検出方法に応じて、蛍光標識等で標識化してもよい。
　本発明の検出用キットは、被験者における乳癌又はトリプルネガティブ乳癌の存在を検出するためのキットであり、好ましくは、本発明のプライマーセット又は本発明のプローブの少なくとも１つを含む。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、前述の本発明の検出方法において使用することもできる。例えば、本発明の検出方法は、本発明のプライマーセットを用いて検出対象変異領域を増幅する工程を含んでもよく、本発明のプローブを検出対象変異領域にハイブリダイズさせる工程を含んでよい。
　以下、実施例によって本発明を詳述するが、本発明は該実施例によって限定されるものではない。なお、特に断りがない場合は、公知の方法に従って実施可能である。また、市販の試薬やキット等を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。
［実施例１］　乳癌臨床検体におけるＮＤ変異ＦＧＦＲ４（ＮＤ－ＦＧＦＲ４）ポリヌクレオチドの発見
　乳癌患者組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｂｒ０３１検体ＲＮＡに対して、逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ、ライフテクノロジーズ社）及びオリゴ（ｄＴ）プライマー（オリゴ（ｄＴ）２０プライマー、ライフテクノロジーズ社）を用いて、キットのプロトコールにしたがって逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。
　次に、配列番号１５及び配列番号１６のプライマーを用いて、上記で得たｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｖｅｒ．２；東洋紡社）を用いてＰＣＲ（９８℃３０秒、５２℃３０秒、６８℃３０秒を３５サイクル）を行った。その後、前述ＰＣＲ産物をカラム（ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ；キアゲン社）を用いて精製した。その後、配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを用いて、上記で得た精製ＰＣＲ産物を鋳型として、シークエンス反応を実施した（Ｂｉｇ　Ｄｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）。
　この結果、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ_００２０１１．３、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿２１３６４７．１）のコーディング領域（配列番号１）における１６０３番目、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０２２９６３．２）のコーディング領域（配列番号３）における１４８３番目にそれぞれ対応する位置での、アラニン（Ａ）からグアニン（Ｇ）への置換が見いだされた。この変異は、アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号２）における５３５番目、アイソフォーム２のアミノ酸配列（配列番号４）における４９５番目にそれぞれ対応するアミノ酸位置での、アスパラギン（Ｎ）からアスパラギン酸（Ｄ）への変異に相当する。このＦＧＦＲ４における変異をＮＤ－ＦＧＦＲ４とも称する。
［実施例２］　乳癌臨床検体におけるＮＫ変異ＦＧＦＲ４（ＮＫ－ＦＧＦＲ４）ポリヌクレオチドの発見
　乳癌患者組織由来ＲＮＡ（米国アステランド社）Ｂｒ０３６検体ＲＮＡに対して、実施例１と同様の方法を用いてｃＤＮＡを合成した。
　次に、得られたｃＤＮＡを鋳型として、実施例１と同じプライマー及び反応条件でＰＣＲを行った。その後、実施例１と同様に、ＰＣＲ産物をカラムを用いて精製した後、同じプライマーを用いてＰＣＲ産物についてシークエンス反応を実施した。
　この結果、ＦＧＦＲ４アイソフォーム１のコーディング領域（配列番号１）における１６０５番目、ＦＧＦＲ４アイソフォーム２のコーディング領域（配列番号３）における１４８５番目にそれぞれ対応する位置での、シトシン（Ｃ）からアラニン（Ａ）への置換が見いだされた。この変異は、アイソフォーム１のアミノ酸配列（配列番号２）における５３５番目、アイソフォーム２のアミノ酸配列（配列番号４）における４９５番目にそれぞれ対応するアミノ酸位置での、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）への変異に相当する。このＦＧＦＲ４における変異をＮＫ－ＦＧＦＲ４とも称する。
［実施例３］　乳癌サンプルにおけるＮＤ－ＦＧＦＲ４の検出
　乳癌臨床検体由来ＲＮＡ（米国アステランド社）１４９サンプルに対して、実施例１と同じ方法を用いて、ＮＤ－ＦＧＦＲ４変異の有無を確認した。
　その結果、サンプルＢｒ０３１及びＢｒ０３２において、前述のＮＤ－ＦＧＦＲ４変異が見出された。非常に興味深いことに、これらＮＤ変異陽性乳癌検体は、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、上皮細胞増殖因子受容体２型（ＨＥＲ２）の強発現を認めないトリプルネガティブ乳癌検体であった。
　以上から、上記方法により、乳癌臨床検体由来の試料中のＮＤ－ＦＧＦＲ４の存在を検出することができ、ＮＤ－ＦＧＦＲ４の陽性患者を選択できることが示された。
［実施例４］　乳癌サンプルにおけるＮＫ－ＦＧＦＲ４の検出
　乳癌臨床検体由来ＲＮＡ（米国アステランド社）１４９サンプルに対して、実施例１と同じ方法を用いて、ＮＫ－ＦＧＦＲ４変異の有無を確認した。
　その結果、サンプルＢｒ０３６、Ｂｒ０８２及びＢｒ１４５において、前述のＮＫ－ＦＧＦＲ４変異が見出された。非常に興味深いことに、これらＮＫ変異陽性乳癌検体も、前述と同様に、トリプルネガティブ乳癌検体であった。
　以上から、上記方法により、乳癌臨床検体由来の試料中のＮＫ－ＦＧＦＲ４の存在を検出することができ、ＮＫ－ＦＧＦＲ４の陽性患者を選択できることが示された。
［実施例５］　野生型及び変異体ＦＧＦＲ４のクローニング
　ＮＤ－ＦＧＦＲ４及びＮＫ－ＦＧＦＲ４変異をそれぞれ含むＦＧＦＲ変異体のＯＲＦ全長をタンパク質として発現するため、ＦＧＦＲ４（アイソフォーム１）をクローニングした。配列番号１９（制限酵素サイトとして、ＳｐｅＩを含む）及び配列番号２０（制限酵素サイトとして、ＸｈｏＩを含む）のプライマーにて、全長ＦＧＦＲ４（ＵｌｔｉｍａｔｅTM　ＯＲＦＣａｒｄ　ｆｏｒ　Ｃｌｏｎｅ　ＩＤ　ＩＯＨ１３３７１：ライフテクノロジーズ社）を鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；タカラバイオ社）を用いてＰＣＲ（９８℃１０秒、５５℃１５秒、６８℃２分を３０サイクル）を行った。本ＰＣＲ産物をクローニングベクター（ＴＯＰＯ　ＸＬ　ＰＣＲ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ；ライフテクノロジーズ社）にクローニングした（ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬ）。
　次に、ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬを鋳型に、配列番号２１及び配列番号２２のプライマーを用いてＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ；タカラバイオ株式会社）にて、ＮＤ変異（Ｎ５３５Ｄ）を導入した（Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬ）。作製したＮ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号５及び配列番号６にそれぞれ示す。同様に、ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬを鋳型に、配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いてＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ法にて、ＮＫ変異（Ｎ５３５Ｋ）を導入した（Ｎ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬ）。作製したＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４の塩基配列及びアミノ酸配列を、配列番号７及び配列番号８にそれぞれ示す。
［実施例６］　野生型及び変異体ＦＧＦＲ４のレンチウイルス発現ベクターの作製
　ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬをＳｐｅＩ、ＸｈｏＩで消化し、核酸断片をＳｐｅＩ、ＳａｌＩ消化したレンチウイルス発現ベクター（ｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５－ＴＯＰＯ；ライフテクノロジーズ社）のマルチクローニングサイトに存在するＳｐｅＩ－ＳａｌＩサイトにクローニングした（ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３と命名）。同様の手法にて、Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬ及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ＴＯＰＯ　ＸＬから、各レンチウイルス発現ベクターＮ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３をそれぞれ構築した。
　上記、ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３、Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３、及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ｐＬｅｎｔｉ６．３をそれぞれ３μｇ、パッケージング用プラスミド９μｇ（ＶｉｒａＰｏｗｅｒTM　Ｐａｃｋａｇｉｎｇ　Ｍｉｘ；ライフテクノロジーズ社）と共に、トランスフェクション試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００；ライフテクノロジーズ社）を用いて、２９３ＦＴ細胞パッケージング細胞（ライフテクノロジーズ社）に導入した。導入３日後の培養上清を、レンチウイルスとして回収し、ポリブレン（ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ；Ｓｉｇｍａ社）を６μｇ／ｍｌの濃度で添加した後、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に添加した。２日後にＮＩＨ３Ｔ３細胞の培養上清をＤＭＥＭ培地（インビトロジェン社）に１０％牛血清（インビトロジェン社）及びＢｌａｓｔｃｉｄｉｎ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）５μｇ／ｍｌを添加したものに交換し、さらに２週間培養を続け、野生型ＦＧＦＲ４、Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４、及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４をそれぞれ安定発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞（それぞれ、ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３と命名）を取得した。
［実施例７］　変異体ＦＧＦＲ４の足場非依存的増殖亢進作用の検討
　９６ウェルスフェロイドプレート（スミロンセルタイトスフェロイド９６Ｕ；住友ベークライト）に、ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３、及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３を、それぞれ１ウェル当り３×１０3個となるように１０％牛胎児血清を含む培地で播種した。５％ＣＯ2存在下、３７℃にて培養後、翌日（Ｄａｙ１）および６日後（Ｄａｙ６）の細胞数を細胞数測定試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏTM　Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　Ａｓｓａｙ；Ｐｒｏｍｅｇａ社）をマニュアルの方法に従って測定した。検出には発光測定装置（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー社）を用いた。ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｄａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントが増加しなかったのに対して、Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、Ｄａｙ１からＤａｙ６までで細胞数のカウントの増加が確認された。以上から、ＮＤ－ＦＧＦＲ４及びＮＫ－ＦＧＦＲ４を有する変異体ＦＧＦＲ４は足場非依存的細胞増殖を亢進させる作用を有することが明らかとなった。
［実施例８］　変異体ＦＧＦＲ４の腫瘍形成能の検討
　ｉｎ　ｖｉｖｏにおける造腫瘍能を検討するため本細胞株をヌードマウスに移植し腫瘍形成能を検討した。Ｎ５３５Ｄ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３及びＮ５３５Ｋ－ＦＧＦＲ４／ＮＩＨ３Ｔ３細胞をヌードマウスの皮下に３ｘ１０6個ずつ接種し８日観察したところ腫瘍形成が確認された。以上から、ＮＤ－ＦＧＦＲ４及びＮＫ－ＦＧＦＲ４は癌の原因遺伝子であることが示された。
　本発明の検出方法は、被験者における乳癌（特にはトリプルネガティブ乳癌）の検出に有用である。本発明のプライマーセット、プローブ及び検出用キットは、本発明の検出方法に用いることができる。

Claims (10)

  1. 　被験者における乳癌の存在を検出する方法であって、被験者から得た試料中の、線維芽細胞増殖因子受容体４（ＦＧＦＲ４）チロシンキナーゼドメインの８２番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異の存在を検出する工程を包含する、方法。
  2. 　前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、請求項１に記載の方法。
    （１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
    （２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
  3. 　前記変異が下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４における変異である、請求項１に記載の方法。
    （１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の５３５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異；あるいは
    （２）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＦＧＦＲ４の４９５番目のアスパラギンからアスパラギン酸又はリジンへの変異。
  4. 　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
    （１）ＦＧＦＲ４アイソフォーム１遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
    （２）ＦＧＦＲ４アイソフォーム２遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
  5. 　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異の存在を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
    （１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
    （２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
  6. 　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における領域を増幅できるように設計したプライマーセットを用いて、前記被験者から得た試料中の核酸を増幅させる工程を包含する、請求項１に記載の方法。 
    （１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目、１６０５番目又はそれら両方の塩基を含む領域；あるいは
    （２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目、１４８５番目又はそれら両方の塩基を含む領域。
  7. 　下記（１）乃至（２）に記載のＦＧＦＲ４遺伝子における変異を含む領域にストリンジェント条件下でハイブリダイズすることができるように設計したプローブを、前記被験者から得た試料中の核酸にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項１に記載の方法。
    （１）配列番号１に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１６０３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１６０５番目のシトシンからアラニンへの変異；あるいは
    （２）配列番号３に示される塩基配列からなるＦＧＦＲ４遺伝子の１４８３番目のアラニンからグアニンへの変異又は１４８５番目のシトシンからアラニンへの変異。
  8. 　前記被験者から試料を得る工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  9. 　前記乳癌がトリプルネガティブ乳癌である、請求項１に記載の方法。
  10. 　前記被験者が乳癌患者である、請求項９に記載の方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090258369A1 (en) * 2008-04-14 2009-10-15 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Service Over-expression and mutation of a tyrosine kinase receptor fgfr4 in tumors

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE GENBANK [online] 30 January 2011 (2011-01-30), YE, Y. ET AL.: "Definition: Homo sapiens fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4), transcript variant 1, mRNA", retrieved from http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/47524172?sat=14&satkey=5325213 Database accession no. NM_002011 *
DATABASE GENBANK [online] 30 January 2011 (2011-01-30), YE, Y. ET AL.: "Definition: Homo sapiens fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4), transcript variant 2, mRNA", retrieved from http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/47524176?sat=14&satkey=5317706 Database accession no. NM_022963 *
DATABASE GENBANK [online] 30 January 2011 (2011-01-30), YE, Y. ET AL.: "Definition: Homo sapiens fibroblast growth factor receptor 4 (FGFR4), transcript variant 3, mRNA", retrieved from http://www.ncbi.nlm. nih.gov/nuccore/47524174?sat=14&satkey=5419006 Database accession no. NM_213647 *
TAYLOR VI, J.G. ET AL.: "Identification of FGFR4-activating mutations in human rhabdomyosarcomas that promote metastasis in xenotransplanted models", J.CLIN.INVEST., vol. 119, no. 11, 5 October 2009 (2009-10-05), pages 3395 - 3407 *
TAYLOR VI, J.G. ET AL.: "Supplemental material: Identification of FGFR4-activating mutations in human rhabdomyosarcomas that promote metastasis in xenotransplanted models", J.CLIN.INVEST., vol. 119, no. 11, 5 October 2009 (2009-10-05), Retrieved from the Internet <URL:http://www. ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2769177/bin/ JCI39703sd.pdf> [retrieved on 20120427] *

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