WO2012120026A1 - Verfahren zum identifizieren einer teilmenge von polynucleotiden aus einer dem humangenom entsprechenden ausgangsmenge von polynucleotiden zur in vitro bestimmung eines schweregrads der wirtsantwort eines patienten - Google Patents

Verfahren zum identifizieren einer teilmenge von polynucleotiden aus einer dem humangenom entsprechenden ausgangsmenge von polynucleotiden zur in vitro bestimmung eines schweregrads der wirtsantwort eines patienten Download PDF

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Andriy Ruryk
Britta Wlotzka
Cristina GUILLEN
Karen FELSMANN
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SIRS Lab GmbH
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    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying a
  • the invention further relates to the use of k-tuples on polynucleotides selected from the group consisting of m polynucleotides of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO 7704 where k is at least 7 and less than or equal to the number of polynucleotides m in The group is for detecting a score as a measure of the severity of the host response of a subject who is in an acutely infectious and / or acutely inflammatory state according to claim 18.
  • Claim 19 relates to the use of polynucleotides for carrying out the method according to the invention.
  • the invention also relates to the uses of protein gene products from the polynucleotides according to claim 24.
  • Sepsis blood poisoning
  • blood poisoning is a life-threatening infection that affects the entire organism, is associated with high mortality, is becoming more prevalent and affects people of all ages.
  • the mortality rate of severe sepsis has not improved significantly in recent decades, with the last two breakthroughs in innovation since the introduction of blood culture (around 1880) being the introduction of antibiotics over 60 years ago and the onset of intensive care about 50 years ago.
  • novel diagnostic agents must be made available.
  • interventions on the gastrointestinal tract can lead to a fulminant spread of bacteria into the sterile abdominal cavity due to suture insufficiencies.
  • Infectious courses also play a role in the follow-up treatment after transplantations, thoracotomies, extremity and joint corrections and neurosurgical interventions.
  • immune effector cells e.g., lymphocytes and dendritic cells
  • HLA-DR monocytes
  • Immunostimulants can reverse the long-lasting monocyte deactivation again.
  • a numerical increase could be demonstrated for many immune cell populations: both the monocytes and the neutrophils and lymphocyte populations benefited from the treatment.
  • the patients also showed improvements in the clinical condition in the treatment group: shorter ventilation time and longer hospital stay. For the first time, the positive influence of a biomarker-guided immunostimulatory therapy on immunological and clinical level could be proven.
  • the immunosuppressive phase of sepsis was further characterized [Muenzer et al. 2010].
  • the initial hyperinflammatory phase which may be associated with a so-called cytokine storm, resulting in early organ damage and patient death, is followed by a more persistent phase
  • proinflammatory cytokines could be stimulated.
  • time of a so-called "second hit”, ie a second infection is of crucial importance for the survival of the organism.
  • the status of the immune paralysis lasted for 4 days in the mouse model, on day 7 after the septic stimulus This was reflected in the survival rate of the animals after a septic stimulus, which was higher after 7 days than after 4 days In the hypoinflammatory time window (4 days), the survival rate through the immune modulator AS101 or through
  • Blocking of IL-10 can also be increased. Until the normalization of the immune status, the return of the innate immune cells and the balancing of the pro- and antiinflammatory signal cascades thus creates a critical gap with high risk for further infections and patient survival.
  • Lymphocyte populations in patients with septic shock [Venet et al. 2010].
  • the exact beginning of the septic episode can not be precisely defined
  • the immune status of patients with sepsis diagnosis is therefore severely impaired.
  • the impairment affects both the innate and the adaptive immune system. Characteristics of this impairment are the loss of immune effector cells from the peripheral bloodstream by apoptosis, the decrease in the expression of MHCII molecules and the decrease in the
  • Immune state can be reversible.
  • the consequence of the impairment is on the one hand the inability to eliminate infections and to control an infection focus so that it remains active.
  • Such infections are often caused by less pathogenic bacteria, which in case of intact
  • Endotoxemia a significantly elevated level of endotoxin in the blood of patients, is widespread in critically ill patients. In more than half of all patients studied, an endotoxin level higher than 2 standard deviations of the value found in healthy volunteers was measured. At the same time, a large discrepancy between a high endotoxin level and the number of confirmed Gram-negative pathogen infections was observed. It is concluded that the origin of the endotoxin must be endogenous and must be in the intestinal flora, whereby due to translocation processes both endotoxin and viable bacteria can enter the bloodstream.
  • Endotoxemia may also be a cause of excessive stimulation
  • PAMPS pathogen-associated molecular structures
  • the spectrum of disease that is thus covered by the invention is the progression of an infectious-inflammatory reaction of the body, also called host response or host response, of the ability to effectively fight pathogens to the suppression of the immune system, in which the pathogens and the Persist infection site and secondary and / or
  • Pathogen identification is clinically irrelevant results such as non-disease-associated bacteremia, the presence of free-circulating bacterial and fungal nucleic acids from colonization as well as the detection of non-vital pathogen cells problematic for the evaluation of the result.
  • the presence of circulating microbial DNA from translocation processes or the transient presence of non-disease associated bacteria in blood has been demonstrated in vivo. [Dagan et al., 1998; Isaacman et al., 1 998].
  • the origin and clinical significance of such false-positive results are mostly unclear and could result from previously unknown host-pathogen interactions [Schrenzel, 2007].
  • cases are known in which bacteria were isolated from the blood of symptom-free blood donors and even from transient fungemia without visible clinical significance has already been reported [Davenport et al., 2007, Rodero et al., 2002].
  • the measurement of the immune state as defined can be used to assess the significance and clinical relevance of the finding from DNA-based pathogen detection
  • the resulting response of the body also referred to as host response or host response, or the resulting "immune burden" is dependent on the extent, amount, duration and / or frequency of the infectious and / or inflammatory stimulation directly, but as the body's response to the stimulation, are measured as the severity of the host response (host response) .
  • This reaction indicates a continuous change in the form of a rise of the
  • the invention provides a diagnostic test useful for detection and follow-up of the described
  • the excessive stimulation can have the following causes:
  • One group contains score systems such as APACHE, SAPS and SIRS, which can stratify patients based on a variety of physiological indices. While some studies have shown diagnostic potential for the APACHE II Score, other studies have demonstrated that APACHE II and SAPS II can not differentiate between sepsis and SIRS [Carrigan et al., 2004].
  • Procalcitonin is a 16 amino acid protein that plays a role in inflammatory reactions. Despite widespread acceptance of the biomarker PCT, it could be shown in international studies that achieved
  • CRP C-reactive protein
  • PCT is a more appropriate diagnostic marker than CRP [Sponholz et al., 2006; Kofoed et al., 2007].
  • PCT is considered more suitable as a CRP to differentiate non-infectious versus infectious SIRS as well as bacterial versus viral infection [Simon et al., 2004].
  • Another group contains biomarkers or profiles identified at the transcriptome level.
  • Gene expression profiles or classifiers are for the determination of the severity of sepsis [WO 2004/087949], the distinction between a local or systemic infection [unpublished DE 10 2007 036 678.9], the identification of the source of infection [WO 2007/124820] or gene expression signatures for the distinction between multiple etiologies and pathogen-associated signatures [Ramilo et al., 2007].
  • the consensus criteria of [Bone et al., 1992] the currently available protein marker, and the
  • the amounts of the corresponding mRNA present in a sample are always determined quantitatively.
  • the information determined by these gene expression levels is the respective over or under-expression of these mRNAs, which is determined experimentally with respect to a control state or with respect to control genes.
  • the detection of over or underexpression can be seen analogously to the determination of the concentration of a protein biomarker.
  • Test data showed they differed with this signature Survivor and Non-Survivor with high sensitivity and specificity Hessen. For the plausibility of the result, they argue that the late stage of septic shock is characterized by the formation of an immunosuppressed state and that restoration of immune function is necessary for patient survival. They lead to the fact that a number of the overexpressed in survivors genes are attributable to the innate immune system and justify the findings
  • US 2008/0020379 A1 relates to the diagnosis and prognosis of
  • US 2008/0020379 A1 discloses that specific sets of peripheral blood gene expression markers (leukocytes) may provide an indication of a host response to exposure, response, and recovery from infections with infectious pathogens.
  • US 2008/0020379 A1 it is only referred to in a general nature that it is possible with the unique technique of US 2008/0020379 A1 to diagnose a large number of different diseases. Furthermore, in [0293] on page 22, right column of US 2008/0020379 A1, reference is made only to the usual statistical methods.
  • Adenovirus infections and non-adenovirus infections are Adenovirus infections and non-adenovirus infections.
  • FIG. 15V of US 2009/0307181 A1 includes Crohn's disease as
  • phenotypes are the age and onset of Crohn's disease and the localization and / or severity of colitis.
  • Such phenotypes may include two or more phenotypes. However, this only refers to general panels, such as the World Infectious Disease Panel, HIV Panel, Malaria Panel, Viral Hepatitis Panel, Infection Panel, etc.
  • Document US 2010/0293130 A1 relates to genetic analysis systems and methods therefor. According to the abstract, this document is essentially concerned with determining methods for determining a genetic composite index score for estimating the association between the genotype of an individual and at least one disease or condition.
  • US 2010/0293130 A1 compares the gene profile of a
  • document US 2010/0293130 A1 discloses that a particular phenotype may be related to corresponding genotypes correlated therewith. This may include, according to US 2010/0293130 A1 Crohn's disease, lupus, psoriasis as well as rheumatoid arthritis as inflammatory diseases.
  • Claim 1 of US 2010/0293130 A1 relates to a general method for generating at least one genetic composition index score based on a phenotype gene correlation without an explicit indication of which genes are to be used.
  • a specific gene expression profile between an SNP and a phenotype is given and a list of specific SNPs associated with a particular phenotype is given.
  • Tang et al. (2007b) thus concerns the "classical” approach to search for specific "lead genes” for sepsis and to correlate their gene expression with a prediction of the course of sepsis.
  • Phenotype groups are to be formed according to claim 1 of the present application.
  • Oligonucleotide arrays with 6.9 million oligonucleotides Oligonucleotide arrays with 6.9 million oligonucleotides.
  • the present invention may be delineated from the prior art discussed above.
  • the invention has the statement and
  • inflammatory stimulation also known as host response or host response, or the resulting "immune burden"
  • host response or host response or the resulting "immune burden”
  • Patient group limited. It serves to determine a particular condition and not to distinguish it from survival. non-survival after septic shock. Also, the present invention is independent of the presence of infection according to the current definition of sepsis. It is shown in the on-going writings that a critical condition, a maximum immune load, "even without infection, eg excessive stimulation of the innate system by other causes, can be present.” The use of the invention lies in the derivation of suitable therapeutic measures and the course observation but not in predicting which of the patients will survive. In a review [Monneret et al., 2008], the importance of an effective immune system is illustrated by a number of scientific studies
  • Patient selection was very heterogeneous. Patients were included in the study who had very different comorbidities, such as B to 1 1% to 16% had tumors or very different
  • therapeutic measures e.g., 27% to 64% vasopressor therapy, which greatly affected gene expression profiles.
  • inflammatory stimulation also referred to as host response or host response, or the resulting "immune burden” are delimited
  • RNA samples isolated from peripheral blood mononuclear cells of ten patients each with E. coli and S. aureus infection, respectively.
  • the identification of the pathogens was done by blood culture. Based on the training dataset, 30 genes were identified, through which
  • Pathogens are to be detected, the invention, however, to establish and follow-up of the response of the body to infectious and / or
  • pathophysiological condition in the present case are the
  • the object is characterized by the features of
  • the present invention relates to a method for identifying a subset of polynucleotides from a human polynucleotide starting amount of in vitro determining a host response severity of a patient who is in an acute infectious and / or acute inflammatory condition. in a sample, using a measuring device having a plurality of different gene probes representing the substantially entire human genome;
  • Inflammation status can be divided into at least two of the following clinically determined phenotype groups:
  • Threshold provide a false positive result
  • a master score is determined as a measure of the severity of the host response of a subject who is in an acutely infectious and / or acutely inflammatory state, by quantifying the increase and decrease in the gene expression intensity of the selected gene probes; and a considerably reduced number of times compared to the initial amount
  • Polynucleotides is identified by determining a score that has at most a predetermined deviation from the master score and also serves as a measure of the severity of the host response of a subject who is in an acute infectious and / or acute inflammatory state.
  • the present invention relates to the use of k-tuples on polynucleotides which are selected from the group consisting of m
  • k-tuples on polynucleotides selected from the group consisting of m polynucleotides having SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO 7704, wherein k is at least 7 and less than or equal to the number of
  • Amplification method preferably polymerase chain reaction (PCR), preferably real-time PCR, in particular probe-based methods such as Taq-Man, Scorpions, Molecular Beacons; and / or by means of hybridization methods, in particular those on microarrays; and / or direct mRNA detection, in particular sequencing or mass spectrometry; and / or isothermal amplification
  • PCR polymerase chain reaction
  • probe-based methods such as Taq-Man, Scorpions, Molecular Beacons
  • hybridization methods in particular those on microarrays
  • / or direct mRNA detection in particular sequencing or mass spectrometry
  • RNA can be detected with high sensitivity and RNA can also be detected by reverse transcription (RT) [Wong et al., 2005; Bustin, 2002].
  • Real-time PCR also called quantitative PCR (qPCR)
  • qPCR quantitative PCR
  • the quantitative determination of a template can be done by absolute or relative quantification.
  • absolute quantification finds the
  • the sample is selected from: tissue,
  • Body fluids in particular blood, serum, plasma, urine, saliva or cells or cell components; or a mixture of them.
  • samples especially cell samples, have a lytic
  • a further preferred embodiment of the present invention is a use, which is characterized in that from the individual specific gene activities an index is formed, which is a measure of the severity and / or the course of the pathophysiological state after appropriate calibration, preferably the index displayed on an easily interpretable scale.
  • RNA especially scRNA, snoRNA, microRNA, siRNA, dsRNA, ncRNA or transposable Elements, genes and / or Gene fragments with a length of at least 5 nucleotides are used, which have a sequence homology of at least about 10%, in particular about 20%, preferably about 50%, particularly preferably about 80% to the polynucleotide sequences according to SEQ ID NO. 1 to 7704.
  • the sample nucleic acid is RNA, in particular total RNA or mRNA, or DNA, in particular cDNA.
  • amplicons can be used, for example, as probes for
  • the multigene biomarker is a combination of several elements
  • Polynucleotide in particular gene sequences, based on their gene activities by means of an interpretation function performed a classification and / or an index or score is formed.
  • amplification method preferably polymerase chain reaction (PCR), preferably real-time PCR; and / or by means of hybridization methods, in particular those on microarrays.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Polynucleotide sequences can advantageously and uniquely pathophysiological status, a course and / or therapy monitoring.
  • This score can provide the treating physician with a quick diagnostic tool.
  • Sequence pools used to determine states and / or to distinguish or answer defined investigation questions. Examples are in the following
  • the invention relates to polynucleotide sequences, to a method and furthermore to kits for the production of multigene biomarkers which have features of an "in vitro diagnostic multivariate index assay” (IVDMIA) in one and / or several modules [FDA: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays, 2007].
  • IVDMIA in vitro diagnostic multivariate index assay
  • RefSeq is a public database that includes nucleotide and protein sequences with their characteristics and bibliographic information.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the RefSeq collection is unique when it comes to providing error-corrected, nonredundant, explicitly linked nucleotide and nucleotide sequences
  • Protein databases goes. The entries are not redundant with the aim of representing the various biological molecules that are characteristic of the organism, strain or haplotype.
  • transcript variants it encodes alternative spliced transcripts for the same protein product (so-called transcript variants).
  • RefSeq database provides the critical foundation for sequence integration, genetic and functional information and is internationally recognized as the standard for genome annotation.
  • BLAST Sequence Search provides RefSeq information in multiple NCBI resources, including Entrez Nucleotide, Entrez Protein, Entrez Gene, Map Viewer, for FTP Download; or by networking with PubMed [Pruitt et al., 2007; The NCBI handbook 2002].
  • RefSeq statements can be identified by the unique Accession format, which includes the underscore (_).
  • the RefSeq specification includes either the essentially unchanged, initially valid copy of the original GenBank entries or corrected as well as additional
  • the present invention was made due to the properties of the RefSeq database described above.
  • the properties of this database concerning the generation, quality, maintenance and updates of the biological sequences, as well as the presence of functional information at the nucleic acid level, equally for alternative splice variants, were the decisive factors.
  • SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome, according to Bone [Bone et al., 1992] and Levy [Levy et al., 2003] a generalized, inflammatory
  • Inflammation / inflammation It is a reaction of the body caused by injury or tissue destruction, which serves to eliminate, dilute or delineate the injurious agent or tissue.
  • the inflammatory process can be by physical, chemical or
  • a systemic infection is an infection in which the pathogens have spread through the bloodstream throughout the organism.
  • Biological fluids within the meaning of the invention are understood to be all body fluids of mammals, including humans.
  • a gene is a section of the deoxyribonucleic acid (DNA) that contains the basic information needed to produce a biologically active ribonucleic acid (RNA) as well as regulatory elements that activate or inactivate this production.
  • genes are also understood as meaning all derived DNA sequences, partial sequences and synthetic analogs (for example peptido-nucleic acids (PNA)).
  • PNA peptido-nucleic acids
  • Genlocus is the position of a gene in the genome. If the genome consists of several chromosomes, the position is within the
  • Chromosome meant on which the gene is located. Different manifestations or variants of this gene are referred to as alleles, all located at the same site on the chromosome, namely the gene locus.
  • gene locus includes, on the one hand, the pure genetic information for a specific gene product and, on the other hand, all regulatory DNA segments and any additional DNA sequences that are in any functional connection with the gene at the gene locus
  • Sequence regions that are in the immediate vicinity (1 Kb) but outside the 5 'and / or 3' end of a gene locus is made by the accession number and / or RefSeq ID of the main RNA product derived from this locus.
  • Gene activity Genetic activity is the measure of the ability of a gene to be transcribed and / or to form translation products.
  • Gene Expression The process of forming a gene product and / or expression of a genotype into a phenotype.
  • Multigenbiomarker Combination of several gene sequences whose gene activities form a combined overall result (for example a classification and / or an index) by means of an interpretation function. This result is specific to a condition and / or an investigation question.
  • Hybridization Conditions Physical and chemical parameters well known to those skilled in the art, which include the establishment of a thermodynamic
  • Amplification conditions Constant or cyclic reaction conditions that allow the amplification of the starting material in the form of nucleic acids.
  • the reaction mixture are the individual components (deoxyribonucleotides) for the resulting nucleic acids, as well as short oligonucleotides, which can attach to complementary regions in the starting material, as well as a nucleic acid synthesis enzyme, called polymerase.
  • the cation concentrations, pH, volume and the duration and temperature of the individual reaction steps which are well known to the person skilled in the art are of importance for the course of the amplification.
  • Primer is an oligonucleotide which can be used as a starting point for nucleic acid-replicating enzymes, such as, for example, B. the DNA polymerase is used. Primers may consist of both DNA and RNA (primer 3, see, e.g., http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi of MIT).
  • a probe is a
  • Nucleic acid fragment (DNA or RNA) labeled with a molecular tag (eg Fluorescent labels, particularly Scorpion ®, molecular beacons, Minor Groove
  • a molecular tag eg Fluorescent labels, particularly Scorpion ®, molecular beacons, Minor Groove
  • Binding- probes can be provided and for sequence-specific detection of target DNA and / or RNA target molecules is used.
  • PCR is the abbreviation for the term "polymerase chain reaction.”
  • the polymerase chain reaction is a method to amplify DNA in vitro outside a living organism using a DNA-dependent DNA polymerase used according to the present invention to short parts - up to about 3,000
  • Base pairs - to amplify a DNA strand of interest It may be a gene or even a part of a gene or non-coding DNA sequences. It is well known to those skilled in the art that a number of PCR methods are known in the art, which are all encompassed by the term "PCR.” This applies in particular to the "real-time PCR” (cf. Explanations below).
  • RNA transcript For the purposes of the present application, a transcript is understood to mean any RNA product which is produced on the basis of a DNA template.
  • Small RNA Small RNAs in general. Representatives of this group are in particular, but not exclusively:
  • scRNA small cytoplasmic RNA
  • snRNA small nuclear RNA
  • RNAs small non-protein codinq RNAs, which include the so-called small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), short interfering RNAs (siRNAs) and small double-stranded RNAs (dsRNAs), which increase gene expression on many levels, including chromatin architecture, RNA editing, RNA stability, translation, and possibly also transcription and splicing.
  • small nucleolar RNAs small nucleolar RNAs
  • miRNAs microRNAs
  • siRNAs short interfering RNAs
  • dsRNAs small double-stranded RNAs
  • these RNAs are processed in multiple ways from the introns and exons longer primary transcripts, including protein-coding transcripts.
  • protein-coding transcripts Although only 1, 2% of the human genome encodes proteins, a large part is nevertheless transcribed. In fact, about 98% of them are in mammals and humans
  • ncRNA non-protein-coding RNAs
  • snoRNAs Small nucleolar RNAs
  • snoRNAs Pseudouridylation regulated by two large snoRNA families called box C / D snoRNAs on the one hand and box H / ACA snoRNAs on the other.
  • Such snoRNAs have a length of about 60 to 300 nucleotides.
  • miRNAs miRNAs
  • siRNAs short interfering RNAs
  • miRNAs are derived from endogenous short hairpin precursor structures and usually use other loci with similar - but not identical - sequences as the target of translational repression.
  • siRNAs arise from longer double-stranded RNAs or long hairpins, often of exogenous origin. They usually target homologous sequences at the same locus or elsewhere in the genome, where they participate in so-called gene silencing, a phenomenon also called RNAi. However, the boundaries between miRNAs and siRNAs are fluid.
  • small RNA may also include so-called transposable elements (TEs) and in particular retroelements, which are also understood for the purposes of the present invention by the term “small RNA”.
  • TEs transposable elements
  • retroelements which are also understood for the purposes of the present invention by the term “small RNA”.
  • RefSeq ID This name refers to entries in the NCBI
  • genomic information includes, among others, chromosomes, mRNAs, RNAs, and proteins.
  • Each RefSeq ID represents a single, naturally occurring molecule of an organism.
  • the biological sequences representing a RefSeq are derived from GenBank entries (also NCBI), but are a compilation of Information elements. These information elements come from primary research at the DNA, RNA and protein levels.
  • accession number represents the entry number of a polynucleotide in the NCBI gene bank known to the person skilled in the art. In this database, both RefSeq IDs and less well-characterized and redundant sequences are managed as entries and made accessible to the public (www .ncbi.nlm.nih.gov / gene bank / index.html).
  • the infection is limited to the entry portal of the pathogen (e.g., wound infection)
  • the pathogen e.g., wound infection
  • Colonization The presence of microorganisms does not cause any disease symptoms in the organism.
  • Bacteremia A condition in which there are transient and short-term presence of bacteria in the blood, without this being associated with the appearance of bacterial-related clinical symptoms.
  • BLAST Basic Local Alignment Search Tool [according to Altschul et al., J Mol Biol 215: 403-410; 1990]. Sequence comparison algorithm, optimized for speed, is used for searching in sequence databases for optimal local adaptation to the query sequence.
  • cDNA Complementary DNA. DNA sequence, product of reverse transcription of mRNA. Coding Sequence: Protein-encoding portion of a gene or mRNA as distinct from introns (non-coding sequences) and 5- or 3 'untranslated portions. Coding sequences of the cDNA or mature mRNA include the region between start (AUG or ATG) and stop codon.
  • EST Expressed Sequence Tag. Short ssDNA sections of the cDNA (usually -300-500 bp), usually produced in large quantities. Represent the genes that are expressed in certain tissues and / or during certain stages of development. Partial coding or non-coding labels of expression for cDNA libraries. Useful for sizing complete genes and in mapping.
  • Exon Coding, the mRNA corresponding sequence region of typical eukaryotic genes. Exons may include the coding sequences, the 5 'untranslated region, or the 3' untranslated region. Exons encode specific portions of the complete protein and are usually separated by long sections (introns), sometimes referred to as "junk DNA", whose function is not well known but likely to encode short, untranslated RNAs (snRNA) or regulatory information.
  • introns sometimes referred to as "junk DNA”
  • GenBank nucleotide sequence database with sequences from more than 100,000 organisms. Entries annotated with properties of the coding regions also include the translation products. GenBank is part of the international cooperation of the sequence databases, which also includes EMBL and DDBJ.
  • Intron Non-coding sequence region of a typical eukaryotic gene is excised from the primary transcript during RNA splicing and is thus no longer present in the mature, functional mRNA, rRNA or tRNA.
  • mRNA messenger RNA or sometimes just "message". RNA containing the sequences necessary for protein coding. The term mRNA, in contrast to the (unspliced) primary transcript, is only used for the mature transcript with polyA tail (excluding the introns removed via the splicing). Has 5'-untranslated, amino acid-encoding, 3'-untranslated regions and (almost always) a poly (A) tail. Typically represents about 2% of total cellular RNA.
  • Poly (A) tail ss adenosine extension ( ⁇ 50-200 monomers) which is clipped to the 3 'end of the mRNA during splicing.
  • the polyA tail probably increases the stability of the mRNA (possibly protection against nucleases). Not all mRNAs have the construct, such as the histone mRNA.
  • SNPs Single Nucleotide Polymorphisms. Genetic differences between alleles of the same gene based on single nucleotide aberrations. Emerge at specific individual positions within a gene.
  • Transcript variants Alternative splicing products.
  • the exons of the primary gene transcript (pre-mRNA) were reconnected in different ways and are subsequently translated.
  • 3 'untranslated region Transcribed 3' -terminal mRNA region without protein-coding information (region between stop codon and polyA tail). May affect translation efficiency or stability of mRNA.
  • 5 'untranslated region Transcribed 5' -terminal mRNA region without protein-coding information (region between initial 7-methylguanosine and the base immediately before the ATG start codon). May affect translation efficiency or stability of mRNA.
  • Polynucleotide isoforms polynucleotides having the same function, however
  • transcriptomic signature represents an inflammatory-infective continuum of differential gene expression rather than abrupt changes depending on the various phenotypes.
  • Another surprising finding that followed from this finding was the lack of infection specific gene groups. Also, in the group with systemic inflammation one could, with patients with bloodstream infections
  • Sections of sepsis It characterizes the reaction of the body to infectious and / or inflammatory stimulation or the resulting "immune stress", also as a host response or
  • Called host response The information about this state, which is represented by all significantly differentially expressed gene transcripts, can be calculated to a non-dimensional numerical value, a score,
  • a progression of the condition into the critical area indicates a high mortality risk for the patient.
  • the patient is likely to experience a life-threatening complication in the form of an uncontrolled primary infection and / or secondary infection and / or die as a result of the uncontrolled inflammatory-infectious host response.
  • a progression towards a critical state can be considered
  • the reaction of the body to infectious and / or inflammatory stimulation or the resulting "immune burden" can be used as a single determination to determine a condition.
  • the immune status can be determined by chronological succession
  • Medical measures may include drug treatment and its escalation or de-escalation, invasive measures such as surgical procedures for refocusing and / or other diagnostic measures.
  • the determination of the immune status can be used for a differential diagnosis by determining whether the immune system makes a contribution to the acute disease process or is out of the question as the cause of a life-threatening condition of a patient.
  • the notifying party bases its studies on an experimental design in which the characteristics of infection and inflammation have been independently classified in terms of their spatial distribution. It was distinguished whether the inflammation was systemic, local or not pronounced. Systemic inflammation was determined by the definition of Systemic Inflammatory Response Syndrome (SIRS). In addition, it was tested whether pathogens were found in the blood (systemic), on an organ (local) or not at all. From the combination of the spread of infection and inflammation, the 9 possible phenotypes were defined. They are summarized in Table 1.
  • Table 1 Representation of phenotypes resulting from the spatial manifestation of inflammation and / or infection. Each phenotype is indicated by a 3-letter abbreviation. The first capital letter indicates the spread of the infection, the second the spread of the inflammation. Both were associated with an "a" (for and)
  • this division is unique, complete and independent of other factors. That Any subject can be assigned to one of the groups at the time of sampling.
  • inflammation is not necessarily caused by pathogens
  • infection without an inflammatory response is diagnostically not relevant.
  • a systemic infection that causes only a localized inflammation (so-called bacteremia, eg in endocarditis) is a rare phenomenon and is a special case. Therefore, the combinations LaN, SaN and SaL do not form clinically relevant phenotypes and have not been considered for the purposes of the present invention.
  • the inventors have divided diagnostically relevant patient samples after the spatial spread of an inflammation and / or infection. 6 study groups were created (written in bold in Tab. 1). These groups represent the most important and common infection-inflammatory phenotypes.
  • the 4 phenotypes with a local infection with local and systemic inflammation (LaL and LaS) as well as the corresponding control groups without an infection (NaL and NaS) allow, in a statistical comparison, the detection of infection-specific gene markers.
  • the comparison of the groups SaS and LaS provides information on whether, in systemic inflammation, the infection of the circulating cells (bloodstream infection) indicates a different gene expression pattern than the locally limited infection.
  • the present application is accompanied by a sequence listing with SEQ ID Nos. 1-7718, the contents of which fully belong to the disclosure content of the present application.
  • Fig. 1 shows a heat map in which the expression patterns are sorted by study groups
  • FIG. 2 shows a sorted heatmap in which the expression patterns are sorted according to the score (master score);
  • Fig. 3 shows distance triangles for the study samples
  • Fig. 4 shows distance triangles for two patient progressions
  • Fig. 5 shows the course of the score for all study samples.
  • Example 1 Determination of the severity of the host response to stress of the immune system by acute inflammation.
  • SaS 6 intensive care patients diagnosed with severe sepsis / septic shock. The sample was taken on the day that the same virus was confirmed in two separate tests (blood culture and DNA detection).
  • LaS Thirteen intensive care patients diagnosed with Severe Sepsis / Septic Shock who had at least one blood sample tested for pathogens during the disease with two independent tests (blood culture and DNA detection), but all findings remained negative. The examined sample was taken on the first day on which a pathogen was locally confirmed.
  • NaS 13 intensive care patients diagnosed with SIRS without signs of infection. The examined sample was taken within the first 3 days with the SIRS diagnosis.
  • LaL 7 patients of the ENT clinic with acute peritonsillar abscess (PTA). The examined sample was taken immediately before the surgical removal of the infectious abscess. The associated microbiological blood test (as with LaS) was negative.
  • NaL 8 patients of the ENT clinic with chronic tonsillitis without an acute infection.
  • the examined sample was taken within the first 3 days after the tonsillectomy (operative tonsil removal).
  • the patients did not show symptoms of SIRS, and at the surgical site there was a sterile wound infection.
  • 4 patients with chronic non-infectious pancreatitis without SIRS were included in the group.
  • NaN 7 healthy donors, 3 patients with chronic tonsillitis without an acute infection.
  • the examined sample was removed before tonsillectomy, the postoperative samples of these patients were not included in the NaL group.
  • Course samples In the study, samples from 2 patients were examined for 6 consecutive days each. In both cases, the first sample was taken before a planned surgery, the follow-up samples were taken in the intensive care unit.
  • Case 1 Patient does not recover after surgery. The inflammation-relevant parameters increase from the 2nd postoperative day on the 3rd day an infection was diagnosed, the patient dies after 10 days.
  • Case 2 After the operation, the patient recovers very slowly. On the third day, some inflammation-relevant parameters increase. After the medical measures, the condition improves, the patient is relocated after a total of 6 days.
  • Table 2 Summary of clinical parameters of the subjects included in the study. If a feature has not been queried or a parameter has not been determined, it is identified by the abbreviation n.a. Mistake.
  • Admission diagnosis (»: pathogen -ID female [years] group m discharged [ng / ml] [mg / l] A
  • Admission diagnosis (»: pathogen -ID female [years] group m discharged [ng / ml] [mg / l] A
  • Admission diagnosis (»: pathogen -ID female [years] group m discharged [ng / ml] [mg / l] A
  • BAL Candida albicans ,
  • Atherosclerotic tri-blood Enterococcus
  • Admission diagnosis (»: pathogen -ID female [years] group m discharged [ng / ml] [mg / l] A
  • RNA samples from the whole blood of 63 persons were measured.
  • commercial microarray beadchips HumanHT-12 v3 from lllumina were used.
  • the measuring platform used included 48,803 different gene probes, which represent the entire human genome independently of the tissue.
  • totaIRNA Isolation and stabilization of totaIRNA from whole blood samples: Starting material for analysis of the transcriptome of blood samples is 2.5 ml of whole blood. This was taken in a PAXgene tube (PAXgene Blood RNA Tube PreAnalytiX # 762165 (Becton Dickinson)) and stored at -80 ° C until processed.
  • PAXgene tube PAXgene Blood RNA Tube PreAnalytiX # 762165 (Becton Dickinson)
  • Globin mRNA Reduction of Globin mRNA: To enhance the sensitivity of gene expression measurements in whole blood, highly aberrant globin mRNA was recommended. "GLOBINclear TM -Human" kit was used by Ambion / Applied Biosystems # AM 1980. According to the manufacturer's estimates, the transcripts are superimposed Of globin, with their proportion of 70% of all mRNAs in blood, considerably fewer present transcripts. ⁇ g of totaIRNA was used for processing of each sample.
  • Amplification of totaIRNA to cRNA The preparation of the globin-reduced RNA for hybridization was carried out with the Ambion / Applied Biosystems "lllumina TotalPrep RNA amplification kit (AMIL 1791) according to the instructions of the manufacturer and with an input amount of 500 ng. Eluates were cooled on ice and the concentration of cRNA on the Nanodrop ND-2000 was measured spectrophotometrically.
  • Hybridization on lllumina beadchips The pangenomic lllumina beadchips, human HT-12v3 version were used. Of the cRNA samples, 750 ng were applied in a volume of 5 ⁇ per array and hybridized overnight at 58 ° C. The signal detection of successfully hybridized probes is carried out via CY3 streptavidin staining (GE-Amersham) according to the instructions of the manufacturer, lllumina protocol: whole-genome gene expression with IntelliHybTM Seal; Experienced User Card; Part # 1 1226030 Rev. B, Illumina Inc. Fluorescence readout was performed with the lllumina® BeadArray Reader 500 and the corresponding lllumina software "BeadScan" (Version 3.6.17).
  • 8537 gene probes were included in the further analysis. This selection was based on an estimate of the false positive rate of 0.3%. This is statistically interpreted to mean that about 26 probes in the selection list of 8537 probes (just 0.3%) are false positive. Any extension of the selection would result in a higher false positive rate.
  • the selected 8357 gene probes address a total of 7694 different RNA transcripts
  • each line represents a gene probe and each column represents an RNA sample. It represents the relative change in gene expression in gray scale. Thus, dark gray codes up black, a lower expression and light gray to white, a higher expression than the average per gene probe was determined.
  • the clusters were numbered from 1 to 9, the number in brackets below the cluster number indicates the number of gene probes in the cluster. Within a cluster, the gene probes were sorted by degrees so that probes with greatest differences within the study groups are located at the top of the cluster.
  • the sorted heatmap shows that the patient samples were mostly sorted according to their group affiliation in the order listed above, or are mixed into neighboring groups. However, individual samples are sorted in much higher or lower ranks than most group representatives.
  • the gene expression pattern of the heatmaps shows a simultaneous increase and decrease in the gene activity of NaN to SaS. The individual gene clusters differ only in the progression of the deviation.
  • gene expression particularly reflects the strength of the host response to the burden of the organism on inflammation.
  • a bloodstream infection means having one Systemic inflammation is the biggest burden on the immune system.
  • a similar burden will be caused by a local infection, if the immune system is unable to fight the pathogen at the source of infection. But even a traumatic event, such as a serious operation, can temporarily deplete the immune system of the capacity limit.
  • gene expression reflects the severity of host response to a weaker load caused by local inflammation.
  • the selected genes are divided into only 2 groups.
  • gene expression increases with the stress of the immune system (clusters 1 to 4), in the other group of 5496 gene probes (64%) (clusters 5 to 9).
  • X be the associated gene expression vector that summarizes the expression signals of the selected gene probes.
  • d (Xi, X 2 ) the Euclidean distance between two vectors X 1 and X 2 .
  • cor (Xi, X 2 ) denotes the correlation coefficient between X and X 2 according to Pearson, which corresponds to the cosine value of the angle between X 1 and X 2 [Mardia et al., 1 979].
  • the score is calculated according to the following formula
  • mH and mS are the two gene expression vectors that summarize the mean values of the groups NaN (mH) and SaS (mS) gene by gene.
  • the score can be illustrated as follows. From the distances d (mS, mH), d (mS, X) and d (X, mH), a triangle is formed, the corners of which are denoted by X, mH and mS for the sake of simplicity (see Fig. 3). The value
  • L x cor (X mH, MS mH) d (X, MS mH) defines the position of the foot's root from the corner to the straight line, which is determined by d (mS, mH).
  • the value of Lx equals the distance between mH and this lotus point. It also indicates how far the corner of the triangle is from the corner mH, the height of the triangle is not rated.
  • the sample 3 of mS is further than mH and gets the score value of -9.3%.
  • Sample 59 is more than mS from mH and scores 127.8%.
  • the sample 37 is between mH and mS and gets the score of 27.7%. The value of 50% would get a sample that has the same distance to the mH and mS.
  • the distance d (mS, mH) is composed of the distances of the individual gene probes additively. If this total distance is decomposed into two components, one component ⁇ (mS, mH) being calculated from the gene probes of clusters 1 to 4 and the other d (mS, mH) being calculated from the gene probes of clusters 5 to 9, one obtains one Information about the contribution of the expression increase and decrease to the total deviation. In the dataset we examined, the increase represented by 36% of the probes was 51% of the total distance. The decrease, represented by 64% of all probes, was 49% of the total distance. Thus, on average, the expression of a gene probe from clusters 1 to 4 decreased more than in clusters 5 to 9. The overall ratio of increase and decrease was about the same. If the ratio of the increase and decrease is calculated for each sample, information about the progression of the deviation in the excellent direction is obtained.
  • FIG. 4 shows how the distance triangle for the two patient cases moves in the course of the disease, wherein the index above the triangle tip indicates the day of the decrease and 0 denotes the pre-operative sample.
  • FIG. 5 shows the score for all study samples.
  • the study groups and the two courses were arranged as in FIG. 1.
  • the black dots mark the score, the bars the deviation of 7.5 percentage points up and down.
  • the proposed score is not the only one that can quantify the differences in gene expression of the study groups.
  • the advantage of this score is that it defines a relative measure, namely, a percentage of the difference found between gene expression to the group without acute inflammation and SIRS patients with a blood infection.
  • the score is independent of the measurement platform and the number of gene markers used.
  • the score quantifies only a simultaneous increase and decrease in gene activity, it is calculated from the expression of several thousand of genes.
  • the cause lies in the investigated phenomenon.
  • the genes used are generally responsible for different processes. Therefore, the expression deviation from the healthy for a single gene may have various causes. However, the swarm behavior of many genes in the excellent direction reflects the quantitative extent of the immune burden.
  • the postoperative condition was observed for 2 patients, show that the score records the current extent of the host response. Therefore, it can be used for monitoring / monitoring.
  • the score for a patient changes from about 20% to about 90% percentage points within 6 days.
  • it is suitable for general assessment of the immune burden.
  • the pre-operative samples from both patients show an elevated score of over 20%. This can be one of the causes of the complication-rich postoperative course.
  • Example 2 Determination of the severity of host response in patients with acute inflammation with a reduced number of markers
  • the procedure was as follows.
  • the expression matrix of 8357 gene markers and 61 expression vectors from the 6 study groups was subjected to a principal component analysis (Mardia et al., 1979).
  • the R function prcomp was used for this.
  • 512 gene probes were selected that correlated most strongly with the first major component. Of these, 183 (36%) were from gene clusters 1 to 4 and 329 (64%) from gene clusters 5 to 9 Selection quantity restricted to gene probes which most clearly represent the investigated trend in gene expression change, with the increase and decrease being in the same ratio as in the primary selection.
  • the number of randomly selected probes has been reduced to a maximum of 20 and the selection procedure 50000 repeated. Also retained were the gene probe tuples, in which for 70 samples (95%) the reduced score deviated from the master score by no more than 7.5 percentage points. In this simulation, 20 different combinations were found that met the selection condition.
  • simulations show that there are no preferred gene probes that determine the score.
  • different gene probe tuples increase similar estimate of the master score.
  • the total contains 423 different sequence numbers.
  • Table 4 Summary of the gene probe tuples that met the described selection criteria in simulations. The sets were numbered from 1 to 36, with the number n in parentheses indicating the number of sequences in the set. The subsequent sequence of numbers indicates the associated sequence numbers from the sequence listing.
  • Set 38 (n 7): SEQ ID NOS: 1983, 507, 5431, 3043, 1665, 5776, and 7695, taken alone, are preferred embodiments of the present invention that can be used to obtain a scores score that is limited to within the limits of the present invention, so that the individual sets 1 to 38 each give exact statements regarding the in vitro determination of a severity of the host response of a patient who is in an acutely infectious and / or or acute inflammatory condition is located in a sample of a subject or patient.
  • the replacement representative TFPI for CLU was selected, whose expression values on the microarray with the expression values associated with the marker CLU on the real-time PCR achieved a correlation of 0.8 (correlation coefficient according to Pearson).
  • Table 5 Score values for 7 and 10 selected gene probes compared to the master score (columns 2 to 4). Base 2 logarithmic expression values for 10 selected gene probes generated by the associated sequence number (2nd line), accession (3rd line) and symbol (4th line) are described. In the 5th line, the heatmap cluster is specified, in which the respective probe was classified.
  • Example 3 Determination of the severity of the host response to alternative measurement platforms
  • gene expression signals were measured by means of a real-time PCR for 7 relevant gene markers from Table 5 and for 67 RNA samples. The following measurement and analysis steps were carried out for this purpose.
  • the Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG kit from Invitrogen (Invitrogen Germany, Düsseldorf, Germany) was used.
  • the patient cDNA was diluted 1:25 with water, of which 1 ⁇ was used in the PCR.
  • the samples were each pipetted into 3 replicates.
  • the iQ 5 Multicolor Real-Time PCR Detection System from BIORAD was used with the associated evaluation software.
  • the so-called Ct values (estimated number of cycles in the threshold crossing) were calculated as a measurement result by the program automatically in the region of the linear increase of the curves.
  • the measured values were saved in string format.
  • the data matrices of the measured Ct values that were included in the analysis were processed as follows. Together with the marker genes, 3 so-called housekeeper genes were used, which were used as references. For normalization, the mean of the 3 selected housekeeper genes was calculated for each sample. From this value, the Ct value of each individual marker was subtracted. Each delta Ct value thus obtained reflects the relative abundance of the target transcript relative to the calibrator, where a positive delta Ct value means an abundance higher than the mean of the references and negative delta Ct value means an abundance less than the mean of the references. Data matrix of normalized Delta Ct values was summarized in Table 6.
  • Example was calculated from the expression signals, which were measured by real-time PCR, the associated score for quantifying the severity of the host response. The comparison of this score with the master score is demonstrated in FIG. 6, with the master score represented by the associated error bar of 10 percentage points up and down and the score determined from the PCR measurement as a rhombic sign. As already in the 1. As described in the example, the calculation rule of the score is independent of the number of gene markers used and of the measurement platform; its calculation requires only the mean expression signals of the phenotype groups NaN and SaS, which were defined in Table.
  • the score which was determined from the real-time PCR measurement of 7 markers, shows a trend similar to the master score and thus gives indications of the severity of the host response under an acute inflammatory load on the organism.
  • real-time PCR is a simpler, faster and cheaper measurement platform for determining gene expression than a microarray. Their limitation lies in the lower number of simultaneously measurable gene markers.
  • Table 6 Summary of 3 references normalized Delta Ct values for 7 selected gene sequences and 67 RNA samples. Sample ID refers to patient samples presented in Table 2.
  • Example 4 Differential expression of proteins for in vitro determination of severity of host response of patients
  • the differential expression of markers for the in-vitro determination of a severity of the host response of patients can be done not only on the basis of transcriptomic markers, but also on the level of Proteins.
  • proteins There are numerous examples of the use of proteins as biomarkers, which have already been briefly discussed (Pierrakos, 2010). It is also pointed out that the individual protein markers have so far failed to provide satisfactory or mediocre results, and that combinations of protein markers should be preferred.
  • PBMCs Peripheral blood mononuclear cells
  • PMNs polymorphonuclear cells
  • the proteins were detected by flow cytometry and Western blot using flow cytometry for surface proteins and Western blotting for intracellular proteins.
  • monoclonal antibodies were preferably used.
  • Flow cytometry FACSCalibur Flow Cytometer, Becton Dickinson GmbH Heidelberg was used to examine the expression of the following genes on T lymphocytes and monocytes: CD59, HLA-DPA1, IL7R, TLR5 and HLA- DR complex.
  • the distinction between T lymphocytes and monocytes was based on two surface markers: CD3 co-receptor for T lymphocytes [Tsoukas et al., 1985] and CD14 receptor for monocytes [Goyert et al., 1988].
  • the cells were identified by their cell size (FSC-H) and their granularity (SSC-H).
  • Western blot was used to examine the expression of the proteins from the following genes in the lysate of the total population of PBMCs in sepsis patients and healthy volunteers: FGL2, CLU and CPVL.
  • the experiments were carried out using standard Western Blot protocols, positive controls (lysates of transfected cells) were always carried and the normalization of the experiments was based on ⁇ -actin.
  • the anti-fibrinogen-like protein 2- (product of FGL2 gene), anti-clusterin (product of CLU gene) and anti-vitellogenic carboxypeptidase-like protein (product of CPVL gene) antibody were monoclonal mouse Antibody, the secondary antibody was an HRP-coupled rabbit anti-mouse antibody.
  • the antibody for ⁇ -actin was a monoclonal (13E5) rabbit antibody (Cell Signaling Technology Inc., Denver USA).
  • the measurement data was provided by the software of the respective measuring device. They were summarized in Table 7.
  • the expression of individual proteins was tested for statistically significant differences for the 2 to 3 phenotypic groups studied. As in the 1. Embodiment uses the one-way analysis of variance (Anova) and the pairwise t-test. The results of the comparisons are shown at the end of Table 7. They are summarized below.
  • T lymphocytes protein expression from the IL7R gene was significantly lower in sepsis patients than in healthy donors. This showed a change in the same direction as in gene expression.
  • the expression of MHC class II HLA-DPA1 antigen (product of HLA-DPA1 gene) was significantly higher in sepsis patients than in healthy donors. This showed a change in the opposite direction than in gene expression.
  • the T lymphocytes showed protein expression from CD59, TLR5 and HLA-DR No significant differences between the phenotype groups studied.
  • the monocytes showed no differences in protein expression from the genes HLA-DPA1 and TLR5 in the 3 groups; However, protein expression from CD59 and HLA-DR gene was significantly higher in healthy subjects than in SIRS and sepsis patients. An IL7R gene product was undetectable in monocytes.
  • Table 7 Protein expression levels for selected markers. Unmeasured values were taken with n.a. designated. Patient mean values that were significantly different from healthy were marked accordingly ("**" for p ⁇ 0.01, "*” for p ⁇ 0.05, and "+” for p ⁇ 0.1).
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe, wobei eine Messvorrichtung verwendet wird, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Gensonden aufweist, welche das im Wesentlichen gesamte Humangenom repräsentieren, wobei die Probanden je nach ihrem Infektions- und/oder Inflammationsstatus in wenigstens zwei der klinisch ermittelte Phänotypgruppen eingeteilt werden, die Änderungen der Genexpressionssignale zwischen den Phänotypgruppen statistisch verglichen werden und solche Gensonden ausgewählt werden, deren Genexpressionssignale zwischen mindestens zwei Phänotypgruppen statistisch signifikant verändert sind. Daraus wird ein Master-Score als Maß für den Schweregrad der Host Response ermittelt und es wird eine im Vergleich zur Ausgangsmenge erheblich reduzierte Anzahl von Polynucleotiden durch Ermittlung eines Scores identifiziert, der eine vorgegebene Abweichung vom Master-Score nicht überschreitet. Dieser Score kann zur Diagnose, Vorhersage der Entwicklung oder der Überwachung eines akut infektiösen und/oder inflammatorischen Zustandes eines Patienten und/oder der Therapieverlaufskontrolle und/oder zur Fokuskontrolle, verwendet werden.

Description

Beschreibung
Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro
Bestimmung eines Schweregrads der Wirtsantwort eines Patienten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Identifizieren einer
Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, gemäß Anspruch 1 . Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ- ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704 wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, gemäß Anspruch 18. Anspruch 19 betrifft die Verwendung von Polynucleotiden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendungen von Protein-Genprodukten aus den Polynucleotiden gemäß Anspruch 24.
Sepsis („Blutvergiftung" ) ist eine lebensbedrohliche Infektion, die den gesamten Organismus erfasst. Sie ist mit hoher Sterblichkeit verbunden, kommt immer häufiger vor und erfasst Menschen in jedem Lebensalter. Sepsis gefährdet den medizinischen Fortschritt in vielen Bereichen der Hochleistungsmedizin und verbraucht einen Großteil der Ressourcen im Gesundheitswesen. Die Sterblichkeit der schweren Sepsis hat sich in den letzten Jahrzehnten nicht entscheidend verbessert. Die letzten beiden Innovationssprünge nach Einführung der Blutkultur (ca. 1880) waren die Einführung der Antibiotika vor über 60 und der Beginn der Intensivmedizin vor etwa 50 Jahren. Um heute ähnlich entscheidende Behandlungsfortschritte zu erzielen, müssen neuartige Diagnostika zur Verfügung gestellt werden. Im internationalen Schrifttum haben sich zwischenzeitlich die Kriterien der Konsensuskonferenz des„American College of Chest Physicians/Society of Critical Care Medicine Consensus Conference (ACCP/SCCM)" aus dem Jahr 1992 am breitesten zur Definition des Sepsis-Begriffs durchgesetzt [Bone et al., 1992]. Die internationale Sepsis-Konferenz 2001 schlug außerdem ein neues Konzept (PIRO genannt) zur Beschreibung der Sepsis vor, welches sich aus den Kriterien
Prädisposition, Infektion, Immunantwort (Response) und Organdysfunktion
zusammensetzt [Levy et al., 2003]. Trotz einer neuen Definition der SIRS/Sepsis mit dem Akronym PIRO [Opal et al., 2005] wird in den meisten Studien immer noch die ACCP/SCCM Konsensuskonferenz aus dem Jahre 1992 benutzt [Bone et al., 1992], um ihre Patienten zu klassifizieren.
Lebensbedrohliche bakterielle Infektionen und deren Folgen Sepsis und konsekutives Organversagen sind häufige Komplikationen bei Krankenhauspatienten und nehmen weltweit um 2% bis 7% pro Jahr zu. In Deutschland sterben von den rund 154.000 Erkrankten jährlich 60.000 Menschen an schwerer Sepsis, die damit eine der häufigsten Todesursachen auf Intensivstationen ist. Gezielte antibiotische Therapie, beginnend in den ersten Stunden nach der Infektion, gilt als
ausschlaggebend für eine erfolgreiche Behandlung [Ibrahim et al., 2000; Fine et al., 2002; Garracho-Montero et al., 2003; Valles et al., 2003]. Die Sterblichkeit ist mit 40% bis 60% derzeit inakzeptabel hoch, wobei sich das Risiko im Falle einer verzögerten resistenzgerechten Behandlung erheblich vergrößert. Die spezifische Erregerdetektion bei Sepsis ist derzeit in der klinischen Anwendung unbefriedigend. Der„Goldstandard" Blutkultur leidet unter mangelnder Sensitivität und bleibt in 80% bis 90% aller Sepsisfälle negativ. Außerdem liegen die Blutkulturergebnisse erst nach 24 bis 72 Stunden vor und bilden dann nur die Basis einer weiteren mikrobiellen Diagnostik (Speziesdifferenzierung, Erstellung eines Antibiogramms). Häufig wird eine Therapie mit Breitbandantibiotika zum Zeitpunkt des ersten Sepsisverdachtes ohne gesicherten mikrobiologischen Befund eingeleitet werden. Dies fördert zum einen die Entwicklung multiresistenter Keime, zum anderen verringert die
antibiotische Vorbehandlung die Erfolgsquote einer später entnommenen Blutkultur. Epidemiologische Daten belegen, dass im Falle einer inadäquaten Therapie mit einer verdoppelten Mortalität [Valles et al., 2003] und bei verzögertem effektivem Therapiebeginn mit einer Zunahme der Sterblichkeit von mehr als 5% pro Stunde zu rechnen ist [Iregui et al., 2002; Ibrahim et al., 2000; Fine et al., 2002; Garnacho- Montero et al., 2003; Valles et al., 2003; Kumar et al., 2006].
Die exakte Diagnose von systemisch-inflammatorisch und infektiös bedingten Krankheitszuständen und deren Ursachen und assoziierten Risiken für nachfolgende Komplikationen spielt für die klinischen Entscheidungen zur Behandlung von
Patienten und anschließender Verlaufsbeobachtung neben der Sepsis auch in einer Reihe von weiteren Indikationen eine wichtige Rolle. In diesem Zusammenhang kann der Behandlung von akut und chronisch kranken Patienten sowie der peri-operative Kontrolle gesehen werden. Es ist bekannt, dass im Fall einer akuten Pankreatitis die Prognose eines letalen Ausgangs durch eine Infektion von 16% auf 40% signifikant verschlechtert. Bei der Ausbildung einer komplexen Superinfektion besteht ein hohes Risiko einer Sepsis mit einer Mortalität von bis zu 90%. Des Weiteren ist die
Verlaufsbeobachtung einer intra-abdominalen Inflammation und/oder Infektion bei chronisch kranken, postoperativen und Trauma-Patienten von Bedeutung. Es bestehen auch heute Schwierigkeiten einer eindeutigen klinischen Diagnose von intra-abdominalen Infektionen. Die Verlaufsbeobachtung chronisch Kranker, wie zum Beispiel Patienten mit Leberzirrhose oder Niereninsuffizienz ist von klinischer Relevanz, da diese Patientengruppe in Abhängigkeit der Organdekompensation prädestiniert sein kann inflammatorische und oder infektiöse Krankenverläufe zu nehmen. Insbesondere niereninsuffiziente Patienten mit Peritonealdialyse neigen zu chronischen Inflammationen und Infektionen [Blake, 2008]. Von besonderem
Interesse ist die Beobachtung von Patienten mit Leberzirrhose, da diese spontane bakterielle Peritonitiden entwickeln können, die eine hohe Mortalität aufweisen.
[Koulaouzidis et al., 2009]. Die Diagnose von sekundären Peritonitiden im Rahmen einer postoperativen Nachbehandlung ist von großem klinischem Wert und kann den Operationserfolg stark beeinflussen. Postoperative Infektionen sind auch heute noch ein großes Problem in der chirurgischen Behandlung. Ein Prozent der durchgeführten Laparotomien führen zu Komplikationen nach der Operation. Dabei kann die
Komplikationsrate zwischen den chirurgischen Prozeduren stark schwanken.
Insbesondere Eingriffe am Magen-Darm-Trakt können durch Nahtinsuffizienzen zu einer fulminanten Ausbreitung von Bakterien in den sterilen Bauchraum führen. Infektiöse Verläufe spielen unter anderem auch in der Operationsfolgebehandlung nach Transplantationen, Thorakotomien, Extremitäten- und Gelenkkorrekturen und neurochirurgischen Eingriffen eine Rolle.
Dem Fachmann ist bekannt, dass es sich bei diesen Ausführungen lediglich um eine beispielhafte Auswahl handelt und es zahlreiche weitere Anwendungsfelder gibt, für die die Erkennung und Verlaufsbeobachtung eines infektiös- inflammatorischen Prozesses und die Beurteilung seines Ausmaßes und das daraus resultierende Risiko des Auftretens von entsprechenden Komplikationen von großer Wichtigkeit ist. Mit der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung für dieses diagnostische Problem bereitgestellt.
Der Morbiditäts- und Letalitätsbeitrag von SIRS und Sepsis ist von
fachübergreifender klinisch-medizinischer Bedeutung, denn dadurch werden in zunehmendem Maße die Behandlungserfolge der fortgeschrittensten
Therapieverfahren zahlreicher medizinischer Fachgebiete (z.B. Traumatologie, Neurochirurgie, Herz-/Lungenchirurgie, Viszeralchirurgie, Transplantationsmedizin, Hämatologie/ Onkologie, etc.) gefährdet, denen ohne Ausnahme eine Erhöhung des Krankheitsrisikos aufgrund unbalancierter und unkontrollierter infektiös- inflammatorischer Prozesse immanent ist. Dies drückt sich auch im kontinuierlichen Anstieg der Häufigkeit der Sepsis aus: zwischen 1979 und 1987 wurde ein Anstieg um 139%, nämlich von 73,6 auf 176 Krankheitsfälle je 100.000
Krankenhauspatienten verzeichnet [MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1990]. Die Senkung der Morbidität und Letalität einer Vielzahl von schwer erkrankten Patienten ist daher an einen gleichzeitigen Fortschritt in der Vorbeugung, Behandlung und insbesondere der Erkennung und Verlaufsbeobachtung der Sepsis und schweren Sepsis gebunden.
Insbesondere bei Patienten, welche die initiale fulminante systemische Inflammationsantwort auf hochvirulente Erreger überstanden haben, kommt es zu einer lange andauernden Phase mit erhöhtem Risiko für Sepsis-induziertes
Multiorganversagen (bis zu mehreren Wochen). Derzeit wird als Ursache dieses Risikos eine induzierte Immunsuppression diskutiert. Neben der Unfähigkeit des Immunsystems, die primäre Infektion zu neutralisieren, entwickeln sich im
Intensivpatienten oft sekundäre Infektionen mit mehrfach anibiotikaresistenten und wenig virulenten Keimen bzw. kommt es zum Ausbruch latenter Virusinfektionen [Hotchkiss et al. 2009, 2010]. Daraus resultiert eine hohe klinische Relevanz, insbesondere vor dem Hintergrund der steigenden Resistenzentwicklung gegenüber Antibiotika und dem Mangel an neuen wirksamen antimikrobiellen Wirkstoffen. Ein wichtiges Ziel klinischer Forschung ist demnach die Prävention dieser Sepsisinduzierten Immunosuppression. Molekulare Targets für eine Intervention in Form einer molekularen Immunotherapie sind bekannt ( wie IL-15 und IL-7 als
antiapoptotische und immunstimulatorische Zytokine) , jedoch zeigen erste klinische Untersuchungen auf, dass die Therapieentscheidung auf Basis des individuellen Immunstatus erfolgen sollte. Das enge Monitoring innater und adaptiver
Immunfunktionen in weiteren Studien erfordert neue und komplexere
Messwerkzeuge für die immunsupprimierten Patienten, um die Balance aus pro-und antiinflammatorischen Signalen zugunsten der Patienten zu verschieben.
Als Mechanismen der Immunosuppression werden derzeit angesehen:
• Produktion antiinflammatorischer Zytokine, z.B. IL-10, dadurch kann die
Entwicklung der sog. T-Zell-Anergie induziert werden (non-responsives Verhalten)
• Absterben von Immunzellen
o Apoptotische Depletion von Immun-Effektorzellen (z.B. Lymphozyten und dendritische Zellen)
o Die Wiederherstellung der Normalpopulation spezifischer Zellen ist offenbar mit verbesserter Prognose verbunden
• Unterdrückung von MHC-Classll- Molekülen (Unterdrückung der Induktion der adaptiven Immunantwort)
• Expression negativer kostimulatorischer Moleküle (PD-1 , CTLA-4)
Eine Studie [Meisel et al 2009] liefert das erste Beispiel für eine therapeutische Intervention in immunsupprimierten Patienten. Es wurden molekulare
Oberflächenmarker von Monozyten genutzt (HLA-DR), um eine Aussage über den Immunstatus zu gewinnen. Eine stark verringerte Monozytenpopulation ist ein charakteristischer Anzeiger für sepsis-assoziierte Immunssuppression (auch gezeigt in Venet et al. 2010). Bei geringer HLA-DR-Expression im Blut von Patienten wurden diese mit dem Wachstumsfaktor GM-CSF bzw. einem Placebo behandelt. GM-CSF hat stark immunostimulatorische Eigenschaften, insbesondere werden Phagozytose, Proliferation und die Pathogenabwehr von Neutrophilen und Monozyten/
Makrophagen stimuliert. Es wurde in vorherigen Studien gezeigt, dass
Immunstimulanzien die langandauernde Monozyten-Deaktivierung wieder umkehren können. Im Ergebnis der Studie konnte für viele Immunzellpopulationen ein zahlenmäßiger Anstieg nachgewiesen werden: Sowohl die Monozyten, als auch die Neutrophilen und Lymphozytenpopulationen profitierten von der Behandlung. Die Patienten wiesen in der Behandlungsgruppe ebenfalls Verbesserungen des klinischen Zustandes auf: kürzere Beatmungszeit und Krankenhausverweildauer zeichneten sich ab. Es konnte erstmals der positive Einfluss einer Biomarer- geleiteten immunstimulatorischen Therapie auf immunologischer und klinischer Ebene nachgewiesen werden.
In einer weiteren Studie wurde die immunsuppressive Phase der Sepsis näher charakterisiert [Muenzer et al. 2010]. Auf die initiale hyperinflammatorische Phase, die mit einem sog. Zytokin-Sturm, daraus resultierender früher Organschädigung und Tod der Patienten verbunden sein kann, folgt eine Phase mit andauernder
Immunsuppression. Die Balance des Immunsystems ist demzufolge in beiden Phasen gestört, die Bedeutung einer Intervention in der zweiten Phase wird durch das Auftreten von sekundären Infektionen und extrem hoher Mortalität unterstrichen. Im Mausmodell konnte gezeigt werden, wie im Sepsisverlauf über 7 Tage hinweg mit einem Immunmodulator die IL-10-Synthese blockiert und die Produktion
proinflammatorischer Zytokine stimuliert werden konnte. Insbesondere wurde festgestellt, dass der Zeitpunkt eines sog.„second hit" , also einer zweiten Infektion, für das Überleben des Organismus von entscheidender Bedeutung ist. Der Status der Immunparalyse dauerte im Mausmodell 4 Tage an, am Tag 7 nach dem septischen Stimulus war die Immunantwort teilweise wiederhergestellt. Dies äußerte sich in der Überlebensrate der Tiere nach einem septischen Stimulus, diese war nach 7 Tagen höher als nach 4 Tagen. Im hypoinflammatorischen Zeitfenster (4Tage) konnte die Überlebensrate durch den Immunmodulator AS101 bzw. durch
Blockierung von IL-10 ebenfalls gesteigert werden. Bis zur Normalisierung des Immunstatus, der Rückkehr der innaten Immunzellen und der Balancierung der pro- und antiinflammatorischen Signalkaskaden entsteht also eine kritische Lücke mit hohem Risiko für weitere Infektionen und das Überleben des Patienten.
Eine andere Studie beschreibt drastische Veränderungen der
Lymphozytenpopulationen in Patienten mit septischem Schock [Venet et al. 2010]. Die Tatsache, dass diese extensiven Veränderungen zumeist zum Zeitpunkt der Diagnose festgestellt werden können, deutet darauf hin, dass sie ein sehr frühes Ereignis in der Kette der Prozesse sind, die zur Immunparalyse und Prädisposition für weitere Infektionen führen. In Studien mit Patienten lässt sich der genaue Beginn der septischen Episode nicht genau definieren, dadurch lassen sich die
Studienpopulationen bezüglich des Krankeitsverlaufs nicht zuverlässig
synchronisieren. Es konnte allerdings festgestellt werden, dass nach dem Einsetzen des septischen Schocks der immunsupprimierte Zustand für ca. 48 Stunden trotz intensivmedizinischer Maßnahmen anhielt. Hier entsteht enormer Bedarf nach einem Monitoring-Tool, um die Patienten für immunmodulatorische Interventionen zu qualifizieren.
Der Immunzustand von Patienten mit Sepsis-Diagnose ist demzufolge in starkem Umfang beeinträchtigt. Die Beeinträchtigung betrifft sowohl das innate als auch das adaptive Immunsystem. Merkmale dieser Beeinträchtigung sind der Verlust von Immun-Effektor-Zellen aus dem peripheren Blutstrom durch Apoptose, die Abnahme der Expression von MHCII Molekülen und die Abnahme der
Stimulierbarkeit von Monozyten durch Zytokine. Diese Beeinträchtigung des
Immunzustandes kann reversibel sein. Die Folge der Beeinträchtung ist einerseits die Unfähigkeit Infektionen zu eliminieren und einen Infektionsfokus zu kontrollieren, so dass dieser weiterhin aktiv bleibt. Zusätzlich besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit sekundäre, nosokomiale Infektionen auszubilden. Solche Infektionen werden häufig von minder-pathogenen Bakterien verursacht, die im Falle eines intakten
Immunzustandes keine Gefährdung darstellen.
Die makroskopische post-mortem Untersuchung von 235 kritisch kranken Patienten, deren Totesursache Sepsis oder septischer Schock war, ergab, dass in 80% dieser Fälle ein aktiver Infektionsfokus festgestellt wurde [Torgersen et al., 2009]. Die am häufigsten betroffenen Organe waren Lunge, Abdomen und der Urogenitaltrakt. Eine große Zahl dieser Patienten wurde wegen einer Sepsisdiagnose auf die Intensivstation verlegt und dort vor ihrem Tod länger als 7 Tage behandelt. Dieser Zeitraum kann als ausreichend lang angesehen werden, um einen
Infektionsfokus unter Kontrolle zu bringen. Obwohl die sofortige Fokussanierung in Kombination mit Antibiose die zentralen Maßnahmen der Sepsis-Therapie darstellen, waren die Maßnahmen zur Fokuskontrolle bei der Mehrzahl der Studienpatienten nicht erfolgreich gewesen und scheinen die Todesursache gewesen zu sein. Die Empfehlung der Autoren der Publikation ist es, bessere diagnostische und
therapeutische Methoden zu entwickeln, um dem medizinischen Bedarf in diesem Bereich gerecht zu werden.
In einer kürzlich veröffentlichten Studie wird geschlussfolgert dass etwa 20% der Patienten, die mit einem Sepsis-Verdacht in der Klinik aufgenommen werden nach sorgfältiger Prüfung tatsächlich nicht-infektiöse Ursachen der Erkrankung aufweisen, die in ihrem Erscheinungsbild jedoch dem der Sepsis gleichen. Die Autoren interpretieren ihre Ergebnisse dahingehend, dass die Sepsis vielmehr das Kontinuum eines Syndroms umfasst und keine abgegrenzte spezifische Erkrankung darstellt [Heffner et al., 2010].
In einer Kohorte von 857 Patienten wurde der Endotoxin-Level am Tag ihrer Aufnahme auf der Intensivstation untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass
Endotoxämie, ein signifikant erhöhter Endotoxin-Spiegel im Blut der Patienten, weit verbreitet bei kritisch krankern Patienten ist. In mehr als der Hälfte aller untersuchten Patienten wurde ein Endotoxin-Level höher als 2 Standard-Abweichungen des bei Gesunden Probanden ermittelten Wertes gemessen. Gleichzeitig wurde eine große Diskrepanz zwischen einem hohen Endotoxin-Wert und der Anzahl der bestätigten Infektionen mit gram-negativen Pathogenen beobachtet. Es wird geschlußfolgert, dass der Ursprung des Endotoxins endogener Natur sein und in der Darmflora liegen muss wobei aufgrund von Translokations-Prozessen sowohl Endotoxin als auch lebensfähige Bakterien in den Blutstrom gelangen können. Hohe Endotoxin-Werte waren mit höheren APACHE II Scores und einer höhere Prävalenz der schweren Sepsis korreliert sodass angenommen wird, das Endotoxämie eine Hoch-Risiko Subpopulation bei kritisch kranken Patienten anzeigt [Marshall et al., 2004]. Endotoxämie kann ebenfalls als eine Ursache exzessiver Stimulation des
Immunsystems angesehen werden.
Ein Review gibt Überblick über klinische und immunologische Parameter, die das Risiko bestimmen, nach schweren Operationen und Trauma eine septische Komplikation und lethale Folgen zu eintwickeln [Kimura et al., 2010]. Der aktuelle Stand der Technik legt nahe, daß operative Eingriffe und traumatische Verletzungen die sog. innate und adaptive Immunantwort so schwerwiegend beeinflussen, daß eine Suppression der zellulären Immunität des Körpers als Folge einer
überschießenden inflammatorischen Reaktion verantwortlich für die hohe Anfälligkeit einer nachfolgenden septischen Episode ist. Die Reaktionskaskaden der innaten und der adaptiven Immunantwort werden durch sog. Pathogen-assoziierte Molekulare Strukturen (PAMPS) und Gewebeschaden-assoziierte Molekulare Strukturen
(DAMPS) durch die entsprechenden Erkennungsrezeptoren initiert und moduliert.
Das Spektrum des Krankheitsgeschehens, dass somit von der Erfindung erfasst wird, ist die Progression einer infektiös-inflammatorischen Reaktion des Körpers, auch Host Response oder Wirtsantwort genannt, von der Befähigung effektiv Pathogene zu bekämpfen bis zur Suppression der Immunabwehr, bei der die Pathogene and der Infektionsstelle persistieren und sekundäre und/oder
nosokomiale Infektionen auftreten.
Bei dem Einsatz molekular-diagnostischer DNA-basierter
Pathogenidentifizierung sind klinisch irrelevante Ergebnisse wie nicht- Erkrankungsassozierter Bakteremie, die Präsenz frei zirkulierender bakterieller und fungaler Nukleinsäuren aus Kolonisierung sowie auch die Detektion nicht-vitaler Pathogen-Zellen problematisch für die Bewertung des Ergebnisses. Die Präsenz zirkulierender mikriobieller DNA aus Translokationsprozessen oder das transiente Vorhandendensein von nicht-Krankheitsassoziierten Bakterien in Blut wurden in vivo nachgewiesen. [Dagan et al.,1998; Isaacman et al.,1 998]. Die Herkunft und die klinische Signifikanz solcher Falsch-Positiv Ergebnisse sind meistens unklar und könnten aus bislang unbekannten Wirt-Pathogen Wechselwirkungen resultieren [Schrenzel, 2007]. Außerdem sind Fälle bekannt, bei denen Bakterien aus dem Blut symptomfreier Blutspender isoliert wurden und selbst von transienter Fungämie ohne sichtbare klinische Signifikanz wurde schon berichtet [Davenport et al., 2007, Rodero et al., 2002].
In den eben beschriebenen, " unklaren" Fällen kann die Messung des definitionsgemäßen Immunzustandes genutzt werden, um die Signifikanz und klinische Relevanz des Befundes aus DNA-basierter Pathogendetektion
zuverlässiger zu bewerten.
Der Gegenstand der Erfindung kann wie folgt zusammengefasst werden.
Exzessive Stimulation des Immunsystems durch PAMPS und DAMPS, z. B. durch einen unkontrollierten Infektionsherd oder durch übermäßiges
Entzündungsgeschehen nach einem schweren operativen Eingriff, beeinflusst das innate und adaptive Immunsystem. Die dadurch auftretende Reaktion des Körpers, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet bzw. die sich daraus ergebende„ Immunbelastung" ist abhängig von dem Ausmaß, der Menge, der Dauer und/oder Frequenz der infektiösen und/oder inflammatorischen Stimulation. Diese Stimulation kann nicht direkt, sondern als Reaktion des Körpers auf die Stimulation, als Schweregrad der Host Response (Wirtsantwort), gemessen werden. Diese Reaktion weist eine kontinuierliche Veränderung in Form eines Anstieges vom
Zustand des Gesunden bis zu einem Maximum, wie es z.B. im Extremfall der
Blutstrom-lnfektion vorliegt, auf. In einer Vielzahl von Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Körper in diesem Zustand nicht mehr über die Schutzmechanismen des Immunsystems verfügt. Vorhandene Infektionen können nicht mehr effektiv bekämpft werden. Es besteht ein hohes Risiko in dieser Phase eine sekundäre Infektion auszubilden. Dies gilt vor allem in Fällen, in denen sterile Prozesse Ursache für die Induzierung der Immunsuppression waren. Klinische Maßnahmen, wie z. B.
Identifizierung der Ursache der exzessiven Stimulation, Kontrollieren des
Infektionsherdes, operative Fokussanierung, gezielte Antibiose oder präventive medikamentöse Therapien, zu deren Beendigung/Blockierung, müssen in diesen Fällen zeitnah eingeleitet werden. Die Erfindung stellt einen diagnostischen Test zur Verfügung, der zur Feststellung und Verlaufsbeobachtung des beschriebenen
Krankheitsprozesses sowie zur Erfolgskontrolle der ergriffenen Therapiemaßnahmen verwendet werden kann. Die exzessive Stimulation kann die folgenden Ursachen haben:
- Unkontrollierter Infektionsherd
- Insult durch steriles inflammatorisches Geschehen
o Gewebeschaden durch Operation
o Gewebeschaden durch Trauma
o Nekrotische Vorgänge
- Endotoxämie
o Translokation aus dem Darm infolge eines schwerwiegenden pathologischen Geschehens
Die genannten Vorgänge führen zu transienter, induzierter Immunsuppression des innaten und adaptiven Immunsystems und sind korreliert mit:
- Hoher Moralität durch einen unkontrollierten Infektionsherd
- Hohem Risiko einer nosokomialen oder sekundären Infektion verbunden mit lebensbedrohlichen Komplikationen
Diesem pathophysiologischen Geschehen muss durch, für den jeweiligen Fall geeignete, klinische Maßnahmen begegnet werden:
- Identifizierung eines Infektionsfokus durch Eskalation der diagnostischen
Maßnahmen
- Fokussanierung, auch durch operative Eingriffe
- Gezielte Antibiose bei bekannten Pathogenen
- Kalkulierte Antibiose zur Prävention einer sekundären Infektion
- Immunstimulatorische Therapiemaßnahmen
- Antiinflammatorische Therapiemaßnahmen bei sterilem infektiösen
Geschehen
Mehrere Ansätze zur Diagnosestellung von SIRS und Sepsis wurden entwickelt.
Eine Gruppe enthält Score-Systeme wie beispielsweise APACHE, SAPS und SIRS, welche die Patienten auf der Basis einer Vielzahl physiologischer Indices stratifizieren können. Während in einigen Studien für den APACHE II Score ein diagnostisches Potential nachgewiesen werden konnte, haben andere Studien gezeigt, dass APACHE II und SAPS II nicht zwischen Sepsis und SIRS differenzieren können [Carrigan et al., 2004].
In einem Review fassen Pierrakos und Vincent [Pierrakos et al., 2010] den Stand der Biomarker-Suche in der Indikation Sepsis zusammen. Es wurden 3370 Publikationen zu 178 verschiedenen Biomarkern gesichtet. Die Schlussfolgerung ist, das die meisten Biomarker in vornehmlich in klinischen Studien und hauptsächlich als prognostische Marker untersucht wurden. Wenige wurden als diagnostische Marker getestet. Keiner dieser Kandidaten hat ausreichende Sensitivität oder Spezifität für eine routine-mäßige Anwendung in der Klinik gezeigt. Kein Marker wurde auf die eine Fragestellung zum Immunstatus eines Patienten getestet. Procalcitonin (PCT) und C- reactive Protein (CRP) werden zwar angewendet, aber zeigen ebenfalls nur begrenzte Eigenschaften zur Unterscheidung von Sepsis und anderen
inflammatorischen Zuständen oder die Nützlichkeit zur Vorhersage bestimmter Outcomes.
Procalcitonin ist ein 1 16 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Trotz der weitgehenden Akzeptanz des Biomarkers PCT konnte in internationalen Studien gezeigt werden, dass die erreichten
Sensitivitäten und Spezifitäten des Sepsismarkers PCT vor allem bei der Abgrenzung einer systemischen bakteriellen SIRS, also Sepsis, von einer nicht -bakteriellen SIRS noch immer unzureichend sind [Ruokonen et al., 1999; Suprin et al., 2000; Ruokonen et al., 2002; Tang et al., 2007a]. Die Meta-Analyse von Tang und Kollegen [Tang et al., 2007a], in der 18 Studien berücksichtigt wurden, zeigt, dass PCT nur schlecht geeignet ist, um SIRS von Sepsis zu diskriminieren. Darüberhinaus betonen die Autoren, dass PCT eine sehr schwache diagnostische Genauigkeit mit einem Odd Ratio (OR) von 7.79 hat.
C-reaktives Protein (CRP) ist ein 224 Aminosäuren langes Protein, das eine Rolle bei Entzündungsreaktionen spielt. Die Messung von CRP soll dazu dienen, um den Krankheitsverlauf sowie die Wirksamkeit der gewählten Therapie zu verfolgen.
In mehreren Berichten wurde beschrieben, dass im intensivmedizinischen Bereich PCT ein besser geeigneter diagnostischer Marker als CRP ist [Sponholz et al., 2006; Kofoed et al., 2007]. Darüber hinaus wird PCT als besser geeignet als CRP angesehen, um eine nicht infektiöse versus infektiöse SIRS sowie bakterielle versus virale Infektion zu unterscheiden [Simon et al., 2004].
Es ist für den Fachmann ersichtlich, dass die mit dieser Erfindung
bereitgestellte, Lösung mit den vorgenannten Biomarkern wie z. B. aber nicht ausschließlich PCT oder CRP kombiniert werden kann um die diagnostische
Aussage zu erweitern.
Eine weitere Gruppe enthält Biomarker oder Profile, die auf Transkriptom - Ebene identifiziert wurden. Genexpressionsprofile oder Klassifikatoren sind für die Bestimmung des Schwergrads von Sepsis [WO 2004/087949], die Unterscheidung zwischen einer lokalen oder systemischen Infektion [nicht veröffentlichte DE 10 2007 036 678.9], die Identifizierung der Infektionsquelle [WO 2007/124820] oder von Genexpressionssignaturen für die Unterscheidung zwischen mehreren Ätiologien und Pathogen-assoziierten Signaturen [Ramilo et al., 2007] geeignet. Allerdings besteht aufgrund der unzureichenden Spezifität und Sensitivität der Konsensuskriterien nach [Bone et al., 1992], der aktuell verfügbaren Proteinmarker sowie aufgrund des
Zeitbedarfs des Nachweises der Infektionsursache durch Blutkultur ein dringender Bedarf für neue Verfahren, die die Komplexität der Erkrankung berücksichtigen. Viele Geneexpressionsstudien, die entweder einzelne Gene und/oder Kombinationen von Genen, die als Klassifkatoren benannt sind, verwenden sowie zahlreiche
Beschreibungen von statistischen Verfahren zur Ableitung eines Score und/oder Index [WO 2003/084388; US 6960439] gehören zum Stand der Technik.
Bei der Verwendung von Genexpressionsmarkern für die Bestimmung eines pathophysiologischen Zustandes werden stets die in einer Probe vorhandenen Mengen der entsprechenden mRNA, die Genexpressions-Level, quantitativ bestimmt. Die durch diese Genexpressionslevel ermittelte Information ist die jeweilige Überoder Unterexpression dieser mRNAs, die bezogen auf einen Kontroll-Zustand oder bezogen auf Kontroll-Gene experimentell ermittelt wird. Die Feststellung von Überoder Unterexpression kann analog zur Bestimmung der Konzentration einer Protein- Biomarkers gesehen werden. Mehrere Anwendungen von Genexpressionsprofilen sind in dem Stand der Technik bekannt.
Pachot und Kollegen [Pachot et al., 2006] untersuchten, ob sich anhand von differentieller Genexpression aus Vollblut Vorhersagen zur Outcome-Variable
Überleben vs. nicht-Überleben bei Patienten mit septischem Schock treffen lassen. Zu dieser Fragestellung identifizierten sie durch Screening auf einem Affimetrix-Array eine Signatur aus 28 differentiell exprimierten Genen. In einem sehr kleinen
Testdatensatz zeigten sie, dass sich mit dieser Signatur Survivor und Non-Survivor mit hoher Sensitivität und Spezifität unterscheiden Hessen. Zur Plausibilität des Ergebnisses argumentieren sie, daß die Spätphase des septischen Schocks durch die Ausbildung eines immunsupprimierten Zustandes charakterisiert ist und dass eine Wiederherstellung der Immunfunktion notwendig für das Überleben der Patienten ist. Sie führen dazu aus, dass eine Reihe der bei Überlebenden überexprimierten Gene dem innaten Immunsystem zuzuordnen sind und begründen die festgestellte
Überexpression mit der Erholung des Immunsystems.
US 2008/0020379 A1 betrifft die Diagnose und Prognose von
Infektionserkrankungen, klinischen Phänotypen und anderen physiologischen
Zuständen unter Verwendung von Wirtsgenexpressionsbiomarkern im Blut.
Gemäß Zusammenfassung geht es in der US 2008/0020379 A1 darum, dass spezifische Sets an Genexpressionsmarkern aus peripherem Blut (Leukozyten) einen Hinweis auf eine Wirtsantwort auf Exposition, Antwort und Erholung von Infektionen mit infektiösen Pathogenen geben können.
In US 2008/0020379 A1 wird lediglich in allgemeiner Natur darauf verwiesen, dass es mit der einzigartigen Technik der US 2008/0020379 A1 möglich ist, eine große Zahl an unterschiedlichen Erkrankungen zu diagnostizieren. Ferner wird in [0293] auf Seite 22, rechte Spalte der US 2008/0020379 A1 lediglich auf die üblichen statistischen Methoden verwiesen.
Im Paragraph [0324] auf Seite 24 zählt die US 2008/0020379 A1 Möglichkeiten im Diagnostikbereich auf und nimmt hierbei auf entzündliche Erkrankungen Bezug, wobei 48 Entzündungsgene für rheumatoide Arthritis verwendet wurden, die aus einer kommerziellen Quelle stammen, nämlich„Source Precision Medicine" .
Paragraph [0608] auf Seite 45, rechte Spalte bis Seite 46, linke Spalte, erster Absatz, führt eine Liste von Genen auf, welche als„batch search" in der„Genetic
Association database" durchgeführt wurde.
Paragraph [0533] auf Seite 44, linke Spalte offenbart, dass die biomolekularen Wege, welche auf Zellniveau differentiell exprimiert werden, zwischen
Adenovirusinfektionen und Nicht-Adenovirusinfektionen unterscheiden können. Um diese Wege aufzufinden, wurde dann auf die in Paragraph [0533] folgende Analyse mittels KEGG-Weg und der„Genetic Association" Datenbanken unter Verwendung von EASE (70) verwiesen, um die Funktionen dieser Gene bezüglich molekularer Fragestellungen zu untersuchen.
Die oben erwähnte Genliste in Paragraph [0608] gehört ebenfalls hierzu und somit betrifft die US 2008/0020379 A1 eine Unterscheidung zwischen
Adenovirusinfektionen und Nicht-Adenovirusinfektionen.
Nirgendwo in der Beschreibung der US 2008/0020379 A1 wird eine Einteilung der Probanden je nach ihrem Infektions- und/oder Informationsstatus in lokal und systemisch getroffen.
Document US 2009/0307181 A1 betrifft genetische Analysen und die
Bestimmung genetischer Gesundheitsscores für spezifische Phänotypen, wie beispielsweise Erkrankungen, Störungen, Behandlungen und Zustände sowohl für Organsysteme als auch für bestimmte medizinische Spezialitäten und dem gesamten Gesundheitszustand.
Im Paragraph [0195] der US 2009/0307181 A1 wird unter Verweis auf die Figuren 15 bis 24, 26 bis 33 und 39 davon gesprochen, dass sogenannte Panels von Phänotypgruppen im Rahmen dieses Dokumentes untersucht werden können. Die genannten Panels sind allgemein gehalten und betreffen - ohne Einzelnachweise - mehr oder weniger die gesamte klinische Diagnostik und umfassen beispielsweise auch so unterschiedliche entzündliche Erkrankungen wie gastrointestinale Erkrankungen unklarer Ätiologie, virale Hepatitis, rheumatoide Arthritis, systemischen Lupus erythematosus, Malaria, chronisch obstruktive Lungenerkrankungen,
Autoimmunerkrankungen und sowie ein Infektionspanel (Seite 42, rechte Spalte). In Figur 15R der US 2009/0307181 A1 ist beispielsweise die rheumatoide Arthritis behandelt mit einer Liste von Genen in Spalte 2 und sogenannten„reflex testing phenotypes" . Hierbei wurde jedoch keine Unterteilung in systemisch oder nicht systemisch vorgenommen, sondern es wird das Risiko, an rheumatoider Arthritis zu erkranken, im Zusammenhang mit einer Zigarettenrauchexposition untersucht.
Figur 15V der US 2009/0307181 A1 beinhaltet Morbus Crohn als
inflammatorische Darmerkrankung und/oder die ulcerative Colitis. Ferner werden dort als Phänotypen Alter und Ausbruch der Crohn-Erkrankung und Lokalisation und/oder Schwere der Colitis angeführt. In Paragraph [0232] wird Bezug genommen auf einen Set von Phänotypen, die gemäß US 2009/0307181 A1 identifiziert werden können für den Zusammenhang zwischen Infektionserkrankungen und der Pulmonologie. Solche Phänotypen können zwei oder mehrere Phänotypen einschließen. Hierbei wird jedoch lediglich Bezug auf allgemeine Panels genommen, zum Beispiel den World Infectious Disease Panel, HIV Panel, Malaria Panel, Viral Hepatitis Panel, Infection Panel usw.
In Paragraph [0408] auf Seite 94, linke Spalte der US 2009/0307181 A1 , wird unter vielen anderen Möglichkeiten werden zum Beispiel neben Vorhofflimmern auch akute und chronische Infektionen, Sepsis und SIRS genannt.
Die Fülle von in der US 2009/0307181 A1 angegebenen Beispiele, die größtenteils ohne biostatistische Daten vorliegen, lassen für den Fachmann eine reproduzierbare Lehre vermissen. Diese Auffassung wird beispielsweise untermauert, durch das Merkmal b) in Anspruch 1 der US 2009/0307181 A1 , wo es heißt„using a Computer to determin the predisposition or carrier Status of said individual for at least two phenotypes..". [„unter Verwendung eines Computers, um die Prädisposition oder Trägerstatus des Individuums für zwei Phänotypen zu bestimmen..".] . Da auf keinerlei Algorithmen verwiesen wird, wie diese Bestimmung durchzuführen ist, die Lehre der US 2009/0307181 A1 - sofern überhaupt erkennbar - nicht
nachvollziehbar und nicht ausführbar. Dokument US 2010/0293130 A1 betrifft genetische Analysesysteme und Verfahren hierzu. Gemäß Abstract geht es in diesem Dokument im Wesentlichen darum, Verfahren zum Bestimmen eines genetischen Zusammensetzungsindex- Score zum Abschätzen der Verbindung zwischen dem Genotyp eines Individuums und wenigstens einer Erkrankung oder einem Zustand zu bestimmen.
Insbesondere vergleicht die US 2010/0293130 A1 das Genprofil eines
Individuums mit einer Datenbank aus medizinisch relevanten genetischen
Variationen, welche erstellt wurde, um mit einer bestimmten Erkrankung oder einem bestimmten pathophysiologischen Zustand in Verbindung gebracht zu werden.
In Paragraph [01 15] auf Seite 12, rechte Spalte, offenbart Druckschrift US 2010/0293130 A1 , dass ein bestimmter Phänotyp mit entsprechenden damit korrelierten Genotypen in Zusammenhang stehen kann. Dies kann gemäß US 2010/0293130 A1 Morbus Crohn, Lupus, Psoriasis wie auch rheumatoide Arthritis als inflammatorische Erkrankungen einschließen.
Anspruch 1 der US 2010/0293130 A1 betrifft ein allgemeines Verfahren zum Erzeugen mindestens eines genetischen Zusammensetzungsindexscores, basierend auf einer Phänotypgenkorrelation ohne explizite Angabe, welche Gene verwendet werden sollen. Für Lupus und rheumatoide Arthritis neben einer Menge anderer Erkrankungen ergibt sich aus Anspruch 133 auf Seite 33, wo mit einem speziellen Genexpressionsprofil zwischen einem SNP und einem Phänotyp angegeben werden und eine Liste spezifischer SNPs, die mit einem bestimmten Phänotyp assoziieren, angegeben sind.
Boldrick et al. (2002): Stereotyped and specific gene expression programs in human innate immune responses to bacteria, PNAS 99, 972-977 beschreibt insbesondere auf Seite 973, linke Spalte, letzter Absatz die Wirtsantwort auf immunologische Provokation mit gramnegativen Bakterien, untersucht anhand einer Gruppe von 206 Genen, jedoch findet sich nirgendwo in Boldrick et al. (2002) eine Phänotypklassifizierung in lokal und systemisch. Tang et al. (2007b): The Use of Gene Expression Profiling to Identify Candidate Genes in Human Sepsis, Am J Respir Crit Care Med 176, 676-684 betrifft die
Verwendung von Genexpressionprofilen zum Identifizieren von Gen-Kandidaten bei Humansepsis.
Gemäß Abstract und der Box auf Seite 676, rechte Spalte betrifft Tang et al. (2007b) die Diagnose von Sepsis mittels Genexpressionprofilen und spricht auch von einer mechanistischen biologischen Einsicht in die Wirtsantwort bei Sepsis.
Tang et al. (2007b) betrifft somit den„klassischen" Ansatz, bestimmte „Leitgene" für Sepsis zu suchen und deren Genexpression mit einer Vorhersage des Verlaufs der Sepsis zu korrelieren.
Dies folgt daraus, dass ein Set von 50 Signaturgenen gemäß Tang et al.
(2007b) Sepsis korrekt identifizierten, mit einer Vorhersagewahrscheinlichkeit von 91 % und 88% bei den Trainings- und Validierungssets. Tang et al. (2007b) behaupten ferner, dass bestimmte Gene, die bei der Immunmodulation und inflammatorischen Antwort eine Rolle spielen, eine verminderte Expression bei Sepsispatienten zeige.
Insbesondere zeigen Tang et al. (2007b), dass die Aktivierung des Kernfaktors Kappa B Stoffwechselwegs vermindert war, wogegen das entsprechende Inhibitorgen NFKBIA signifikant hoch reguliert war.
Tang et al. (2007b) haben demzufolge geschlossen, dass die aufgefundenen Signaturgene eine Suppression der Immun- und inflammatorischen Funktion der Neutrophilen bei Sepsis unterdrücken. Nach Auffassung der Autoren der Tang et al. (2007b) bieten somit Genexpressionsprofile einen neuen Ansatz, um die
Wirtsantwort bei Sepsis zu verstehen.
Gemäß Seite 678 der Tang et al. (2007b), unter dem Stichwort„Statistical Analysis" , wird dargelegt, dass die Autoren ein Vorhersagemodell für Sepsis entwickelten unter Verwendung der Daten des Trainingssets. Gemäß Seite 679, linke Spalte, Absatz unter der Tabelle sowie Figur 3A haben Tang et al. (2007b) drei Cluster von koordiniert exprimierten Genen identifiziert. Diese Cluster betreffen nach der Heat Map in Figur 3A einen mitochondrialen Funktionscluster, einen
Immunregulationscluster sowie einen inflammatorischen Responsecluster.
Nirgendwo innerhalb Tang et al. (2007b) ist jedoch erkennbar, dass
Phänotypgruppen gemäß Anspruch 1 der vorliegenden Anmeldung gebildet werden sollen.
Warren et al. (2009): A Genomic Score Prognostic of Outcome in Trauma Patients, Mol Med 15, 220-227 betrifft einen genomischen Score, der für den
Ausgang bei Traumapatienten prognostisch sein soll.
Schlußendlich beschreibt Xu et al. (2010): Human transcriptome array for high- throughput clinical studies, PNAS 108, 3707-3712 ein Transkriptomarray zum
Hochdurchsatz in klinischen Studien und beschreibt insbesondere
Oligonucleotidarrays mit 6,9 Millionen Oligonucleotiden.
Die vorliegende Erfindung kann von dem eingangs diskutierten Stand der Technik abgegrenzt werden. Die Erfindung hat die Feststellung und
Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder
inflammatorische Stimulation, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet, bzw. die sich daraus ergebende„ Immunbelastung" zum Gegenstand. Sie ist unabhängig vom Vorliegen eines septischen Schocks und nicht auf diese
Patientengruppe beschränkt. Sie dient zur Feststellung eines bestimmten Zustandes und nicht zur Unterscheidung von Überleben vs. nicht-Überleben nach septischem Schock. Auch ist die vorliegende Erfindung unabhängig vom Vorliegen einer Infektion entsprechend der gängigen Sepsis-Definition. Es wird in der voliegenden Schrift gezeigt, dass ein kritischer Zustand, eine maximale Immunbelastung" auch ohne Infektion, z. B. exzessive Stimulation des innaten Systems durch andere Ursachen, vorliegen kann. Die Verwendung der Erfindung liegt in der Ableitung geeigneter Therapiemaßnahmen und der Verlaufsbeobachtung jedoch nicht in der Vorhersage, welcher der Patienten überleben wird. In einem Review [Monneret et al., 2008] wird die Bedeutung des eines effektiv arbeitenden Immunssystems anhand einer Reihe von wissenschaftlichen
Ergebnissen dargestellt und zusammengefasst, durch welche Untersuchungen diese Annahme plausibilisiert wird. Gleichzeitig wird ausgeführt, dass geeignete Verfahren zur routinemäßigen Feststellung des Immunzustandes erst noch determiniert werden müssen.
Der Stand der Technik enthält zahlreiche Studien zur Identifikation von
Genexpressionsmarkern [Tang et al., 2007b] oder Genexpressionsprofilen für die Feststellung einer systemischen Infektion [Johnson et al., 2007].
Tang und Kollegen [Tang et al., 2007b] suchten in einer bestimmten
Blutzellpopulation, den Neutrophilen, nach einer Signatur, welche eine
Unterscheidung von Patienten mit SIRS und Sepsis ermöglicht. 50 Marker aus dieser Zellpopulation genügen um die Immunantwort auf eine systemische Infektion wiederzugeben und neue Erkenntnisse zur Pathophysiologie und den beteiligten Signalwegen zu ermöglichen.
Die Klassifikation von Patienten mit und ohne Sepsis gelingt mit hoher
Sicherheit (PPV 88% bzw. 91 % in Trainings- und Testdatensatz). Die Anwendbarkeit für die klinische Diagnose ist allerdings dadurch begrenzt, dass im Blut diese
Signatur von Signalen aus anderen Blutzelltypen überlagert werden kann. Bezüglich der Anwendbarkeit ist die Präparation dieser Blutzellpopulation mit erheblich erhöhtem Aufwand verbunden. Die Aussagekraft der in dieser Studie publizierten Ergebnisse ist für praktische Anwendungen jedoch limitiert, weil die
Patientenauswahl sehr stark heterogen war. Es wurden Patienten in die Studie eingeschlossen, die stark unterschiedliche Begleiterkrankungen wie z. B zu 1 1 % bis 16% Tumorerkrankungen aufwiesen oder sehr stark unterschiedlichen
therapeutischen Maßnahmen unterlagen (z.B. 27% bis 64% Vasopressor-Therapie), wodurch die Genexpressionsprofile stark beeinflusst wurden.
Johnson und Kollegen [Johnson et al., 2007] beschreiben an einem Kollektiv von Traumapatienten, dass sich die Ausprägung einer Sepsis bereits bis zu 48 Stunden vor der klinischen Diagnose anhand molekularer Veränderungen messen lässt. Die Traumapatienten wurden über mehrere Tage untersucht. Ein Teil der Patienten entwickelte eine Sepsis. Nichtinfektiöse SIRS-Patienten wurden mit präseptischen Patienten verglichen. Die identifizierte Signatur aus 459 Transkripten setzt sich aus Markern der Immunantwort und Entzündungsmarkern zusammen.
Probenmaterial war Vollblut, die Analysen wurden auf einem Mikroarray durchgeführt. Unklar ist, ob sich diese Signatur auch auf andere Kollektive septischer bzw. präseptischer Patienten ausdehnen lässt. Eine Klassifikation und der diagnostische Nutzen dieser Signatur wurde nicht gezeigt.
Diese Arbeiten zielen alle auf die Identifizierung eines infektiösen Geschehens durch differentielle Genexpression. Somit können diese Veröffentlichungen gut vom Gegenstand der vorliegenden Erfindung, der Identifizierung und
Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder
inflammatorische Stimulation, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet, bzw. die sich daraus ergebende„ Immunbelastung" , abgegrenzt werden
Das Ziel von Feezor und Kollegen [Feezor et al., 2003] war es, Unterschiede zwischen Infektionen mit gram-negativen und gram-positiven Erregern zu
identifizieren. Blutproben von drei verschiedenen Spendern wurden ex vivo mit E.coli- LPS und Hitze-inaktiviertem S.aureus stimuliert. Mittels Microarraytechnologie wurden Genexpressionsuntersuchungen durchgeführt. Die Arbeitsgruppe fand sowohl Gene, die nach S.aL/ret/s-Stimulation hochreguliert und nach LPS-Stimulation herunterreguliert waren, als auch Gene die nach LPS-Behandlung stärker exprimiert wurden als nach der Zugabe von Hitze-inaktivierten S.aL/ret/s-Keimen. Gleichzeitig wurden viele Gene durch gram-positive und gram-negative Stimulation in gleichem Maße hochreguliert. Dies betrifft zum Beispiel die Zytokine TNF-α, IL-1 ß und IL-6. Die differentiell exprimierten Gene wurden leider nicht namentlich veröffentlicht, so dass lediglich ein indirekter Vergleich anderen Ergebnissen möglich ist. Neben der
Genexpression wurden von Feezor und Kollegen auch die Plasmakonzentrationen einiger Zytokine untersucht. Dabei korrelierten die Genexpressionsdaten nicht zwangsweise mit den Plasmakonzentrationen. Bei der Genexpression wird die
Menge an mRNA vermessen. Diese ist jedoch vor der Proteinsynthese
posttranskriptionaler Regulation unterworfen, woraus die beobachteten Unterschiede resultieren können. Die interessanteste Publikation zu diesem Thema wurde von einer texanischen Forschungsgruppe um Ramilo [Ramilo et al., 2007], veröffentlicht. Hier wurden ebenfalls Genexpressionsuntersuchungen an humanen Blutzellen durchgeführt, die Unterschiede in der molekularen Wirtsreaktion auf verschiedene Pathogene aufdeckten. Dazu wurden pediatrische Patienten mit akuten Infektionen, wie z.B. akuten Atemwegserkrankungen, Harnwegsinfektionen, Bakteriämien, lokalen
Abszessen, Knochen- und Gelenkinfektionen sowie Meningitis untersucht.
Microarrayexperimente wurden mit RNA-Proben durchgeführt, die aus peripheren mononuklearen Blutzellen von jeweils zehn Patienten mit E.coli- bzw. S.aureus- Infektion isoliert wurden. Die Identifizierung der Erreger erfolgte mittels Blutkultur. Anhand des Trainingsdatensatzes wurden 30 Gene identifiziert, durch deren
Verwendung die verursachenden pathogenen Keime mit hoher Genauigkeit diagnostiziert werden konnten.
Diese Arbeiten lassen sich klar der vorliegenden Erfindung abgrenzen, da hier anhand von Genexpression-Signaturen der Wirtsantwort die verursachenden
Pathogene festgestellt werden sollen, die Erfindung jedoch zur Feststellung und Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder
inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende„ Immunbelastung" verwendet werden soll.
Keine dieser Publikationen bietet die Zuverlässigkeit, Genauigkeit und
Robustheit der hier offenbarten Erfindung. Diese Studien sind darauf konzentriert, den aus wissenschaftlicher Sicht " besten" Multigenbiomarker (Klassifikator) zu identifizieren, jedoch nicht, wie in der vorliegenden Erfindung, den für eine
spezifische klinische Fragestellung optimalen Multigenbiomarker [Simon et al., 2005].
Somit ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testsystem zur Verfügung zu stellen, mit dem eine schnelle und zuverlässige Aussage über einen
pathophysiologischen Zustand, im vorliegenden Fall handelt es sich um die
Feststellung und Verlaufsbeobachtung der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation, auch als Host Response oder Wirtsantwort bezeichnet, bzw. die daraus resultierende„Immunbelastung" getroffen werden kann, jedoch ohne auf zustandsspezifische Biomarker angewiesen zu sein.
Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt verfahrenstechnisch durch die Merkmale des Anspruchs 1 .
Bezüglich einer Verwendung wird die Aufgabe durch die Merkmale der
Ansprüche 18, 19 und 24 gelöst.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe, wobei eine Messvorrichtung verwendet wird, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Gensonden aufweist, welche das im Wesentlichen gesamte Humangenom repräsentieren;
wobei
- Nucleinsäure-Proben einer Mehrzahl von Probanden, die einen
bekannten phänotypischen physiologischen Zustand aufweisen, mit den Sonden der Messvorrichtung in Kontakt gebracht werden, um Expressionssignale einer jeweiligen Expression eines Gens zu erhalten;
- aus der Gesamtzahl der eingesetzten Gensonden solche ausgewählt werden, die ein Expressionssignal mit detektierbarer Intensität für mindestens eine Nucleinsäure-Probe eines Probanden liefern;
- die Probanden je nach ihrem Infektions- und/oder
Inflammationsstatus in wenigstens zwei der folgenden klinisch ermittelten Phänotypgruppen eingeteilt werden:
Figure imgf000025_0001
rrrfektte«— [S] [L] [N]
Systemisch [S] SaS
Lokal [L] LaS LaL
Keine [N] NaS NaL NaN
wobei„a" eine UND-Verknüpfung zwischen den Eigenschaften S, L und N darstellt;
- die Änderungen der Genexpressionssignale zwischen den Phänotypgruppen statistisch verglichen werden und bewertet wird, ob ein signifikanter Unterschied zwischen mindestens zwei der
Phänotypgruppen besteht;
- solche Gensonden ausgewählt werden, deren Genexpressionssignale zwischen mindestens zwei Phänotypgruppen statistisch signifikant verändert sind und eine geschätzte Anzahl von solchen Gensonden ausgeschlossen wird, die in Bezug auf einen vorgegebenen
Schwellwert ein falsch positives Ergebnis liefern;
- ein Master-Score als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, durch Quantifizierung der Zu- und Abnahme in der Genexpressionsintensität der ausgewählten Gensonden ermittelt wird; und eine im Vergleich zur Ausgangsmenge erheblich reduzierte Anzahl von
Polynucleotiden durch Ermittelung eines Scores identifiziert wird, der höchstens eine vorgegebene Abweichung vom Master-Score aufweist und der ebenfalls als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, dient.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m
Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet.
Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der
Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
In der Praxis der Anmelderin hat sich herausgestellt, dass eine solche
Verwendung besonders geeignet ist, welche dadurch gekennzeichnet, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren, insbesondere
Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR, insbesondere sondenbasierte Verfahren wie Taq-Man, Scorpions, Molecular Beacons; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays; und/oder direkter mRNA-Nachweis, insbesondere Sequenzierung oder Massenspektrometrie; und/oder isothermale Amplifikation, erfasst werden
[Valasek et al., 2005; Klein, 2002]. Mit diesem klassischen Verfahren lassen sich hochsensitiv DNA und über die reverse Transkription (RT) auch RNA nachweisen [Wong et al., 2005; Bustin, 2002].
Real-Time-PCR, auch quantitative PCR (qPCR) genannt, ist eine Methode zur Detektion und Quantifizierung von Nukleinsäuren in Echtzeit [Nolan et al., 2006]. In der Molekularbiologie gehört sie bereits seit einigen Jahren zu den etablierten Standardtechniken.
Die quantitative Bestimmung eines Templates kann mittels absoluter oder relativer Quantifizierung erfolgen. Bei der absoluten Quantifizierung findet die
Messung anhand externer Standards, z.B. Plasmid-DNA in unterschiedlichen Verdünnungen, statt. Die relative Quantifizierung nutzt dagegen so genannte
Housekeeping- oder Referenzgene als Referenz [Huggett et al., 2005].
Für die erfindungsgemäßen Verfahren (Arraytechnik und/oder
Amplifikationsverfahren) wird die Probe ausgewählt aus: Gewebe,
Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Serum, Plasma, Urin, Speichel oder Zellen oder Zellkomponenten; oder eine Mischung davon.
Es ist bevorzugt, dass Proben, insbesondere Zellproben, einer lytischen
Behandlung unterzogen werden, um deren Zellinhalte freizusetzen.
Es ist dem Fachmann klar, dass die in den Ansprüchen dargelegten einzelnen Merkmale der Erfindung ohne Einschränkung beliebig miteinander kombinierbar sind.
Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeipielen sowie anhand der Zeichnung.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt in einer Verwendung, die dadurch gekennzeichnet, dass aus den einzelnen bestimmten Genaktivitäten ein Index gebildet wird, der nach entsprechender Kalibrierung ein Maß für den Schweregrad und/oder den Verlauf des pathophysiologischen Zustands ist, wobei vorzugsweise der Index auf einer leicht interpretierbaren Skala angezeigt wird.
Es ist ferner bevorzugt, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur
Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines
pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme, insbesondere für die Verwendung zur Patientenstratifikation und als
Einschlusskriterium für klinische Studien, einsetzt.
Darüber hinaus ist eine Verwendung bevorzugt, bei welcher zur Erstellung der Genaktivitätsdaten solche spezifischen Genloci, sense und/oder antisense Stränge von prä-mRNA und/oder mRNA, small RNA, insbesondere scRNA, snoRNA, micro RNA, siRNA, dsRNA, ncRNA oder transposable Elemente, Gene und/oder Genfragmente mit einer Länge von mindestens 5 Nucleotiden verwendet werden, welche eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 10%, insbesondere ca. 20%, vorzugsweise ca. 50%, besonders bevorzugt ca. 80% zu den Polynukleotid- sequenzen gemäß SEQ-ID Nr. 1 bis 7704 aufweisen.
Vorzugsweise ist die Probennukleinsäure RNA, insbesondere Gesamt-RNA oder mRNA, oder DNA, insbesondere cDNA.
Es muß jedoch betont werden, dass die genannten Primer lediglich beispielhaft sind.
Die genannten Amplikons können beispielsweise als Sonden für
Hybridisierungsverfahren verwendet werden.
Im Rahmen eines optimierten EDV-gestützten Krankenhausmanagements wie auch zur weiteren Forschung auf dem Gebiet der Sepsis hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, dass man die erhaltenen Genaktivitätsdaten zur Herstellung von Software für die Beschreibung mindestens eines pathophysiologischen Zustands und/oder einer Untersuchungsfrage und/oder als Hilfsmittel für Diagnosezwecke und/oder für Patientendatenmangement-Systeme einsetzt.
Bevorzugt ist der Multigenbiomarker eine Kombination von mehreren
Polynukleotid-, insbesondere Gensequenzen, anhand deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion eine Klassifikation durchgeführt und/oder ein Index oder Score gebildet wird.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung hat es sich ferner als vorteilhaft herausgestellt, dass die Genaktivitäten mittels enzymatischer Verfahren,
insbesondere Amplifikationsverfahren, bevorzugt Polymereasekettenreaktion (PCR), vorzugsweise Real-Time-PCR; und/oder mittels Hybridisierungsverfahren, insbesondere solchen auf Microarrays, erfasst werden.
Bei der Erfassung der Genaktivitäten auftretende differentielle
Expressionssignale der in dem Multigenbiomarker enthaltenen
Polynukleotidsequenzen können vorteilhaft und eindeutig einem pathophysiologischen Zustand, einem Verlauf und/oder Therapiemonitoring zugeordnet werden.
Dieser Score kann dem behandelnden Arzt ein schnelles diagnostisches Hilfsmittel in die Hand geben.
Die Anmelderin hat mehrere Verfahren entwickelt, das unterschiedliche
Sequenzpools benutzt, um Zustände festzustellen und/oder zu unterscheiden oder definierte Untersuchungsfragen zu beantworten. Beispiele sind in folgenden
Patentschriften zu finden: Unterscheidung zwischen SIRS, Sepsis und
sepsisähnlichen Zuständen [WO 2004/087949; WO 2005/0831 15], Erstellung von Kriterien zur Vorhersage des Krankheitsverlaufs bei Sepsis [WO 05/106020], Unterscheidung zwischen nichtinfektiösen und infektiösen Ursachen eines
Multiorganversagens [WO 2006/042581 ], in vitro Klassifizierung von
Genexpressionsprofilen von Patienten mit infektiösem/nichtinfektiösem
Multiorganversagen [WO 2006/100203], Feststellung der lokalen Ursachen eines Fiebers unklarer Genese [WO 2007/144105], Polynukleotide zur Erfassung von Genaktivitäten für die Unterscheidung zwischen lokaler und systemischer Infektion [DE 10 2007 036 678.9].
Die Erfindung betrifft Polynukleotidsequenzen, ein Verfahren und ferner Kits zur Erstellung von Multigenbiomarkern, die in einem und/oder mehreren Modulen Merkmale eines„In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays" (IVDMIA) aufweisen [FDA: In Vitro Diagnostic Multivariate Index Assays, 2007].
Bezüglich der in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Nucleotidsequenzen ist Folgendes zu bemerken:
RefSeq ist eine öffentliche Datenbank, die von Nukleotid- und Proteinsequenzen mit ihren Eigenschaften sowie bibliographische Informationen beinhaltet.
Die RefSeq Datenbank wurde durch dasNational Center for Biotechnology Information (NCBI), ein Abteilung von National Library of Medicine, die zum US National Institute of Health gehört erstellt und wird fortlaufend gepflegt und aktualisiert [Pruitt et al., 2007]. NCBI erstellt RefSeq aus den Sequenzdaten der Archiv-Datenbank„GenBank" [Benson et al., 2009], einer umfangreichen öffentlichen Datenbank von Sequenzen, die bei GenBank in den USA, der EMBL Datenbibliothek in Großbritannien und der DNS Datenbank von Japan eingestellt und auch zwischen diesen Datenbanken ausgetauscht werden.
Die RefSeq Sammlung ist einzigartig, wenn es um die Bereitstellung von fehlerkorrigierten, nichtredundanten, explizitverlinkten Nukleotid- und
Proteindatenbanken geht. Die Einträge sind nichtredundant mit dem Ziel, die verschiedenen biologischen Moleküle zu repräsentieren, die für Organismus, Stamm oder Haplotyp charakteristisch sind.
Wenn bestimmte Einträge mehrfach in der Sammlung auftreten, kann es mehrere Gründe dafür geben:
-es kodieren alternative gespleißte Transkripte für das gleiche Proteinprodukt (sog. Transkriptvarianten),
-es existieren mehrere genomische Bereiche innerhalb einer Spezies oder zwischen Spezies, welche für das gleiche Proteinprodukt kodieren,
-wenn RefSeqs erstellt werden, die alternative Haplotypen darstellen und manche mRNA- und Proteinsequenzen sind dabei identisch in allen Haplotypen.
RefSeq Datenbank liefert das kritische Fundament für Sequenzintegration, genetische und funktionelle Information und gilt international als der Standard für Genomannotation. Bei der Sequenzsuche durch BLAST sind RefSeq Angaben in mehreren NCBI-Resourcen erhältlich einschließlich Entrez Nucleotide, Entrez Protein, Entrez Gene, Map Viewer, beim FTP-Download; oder durch die Vernetzung mit PubMed [Pruitt et al., 2007; The NCBI handbook 2002]. RefSeq Angaben können durch das eindeutige Accession-Format, welches den Unterstrich beinhaltet (_) identifiziert werden.
Arbeitsgruppen nutzen verschiedene Methoden und Protokolle und kompilieren die RefSeq Kollektion für verschiedene Organismen. RefSeq Unterlagen werden durch mehrere unterschiedliche Verfahren erstellt [The NCBI handbook 2002]:
1 . wissenschaftliche Kooperation
2. Computer-unterstützte Genomannotationsverfahren
3. Fehlerkorrektur durch die NCBI-Mitarbeiter
4. Auszüge aus GenBank Jede Angabe hat einen Kommentar, der den Stand der jeweiligen Fehlerkorrektur aufweist sowie die Zuordnung der kooperierenden Arbeitsgruppe. Dadurch
beeinhaltet die RefSeq Angabe entweder die essentiell unveränderte, initial valide Kopie der originellen GenBank Einträge oder korrigierte sowie zusätzliche
Informationen, die durch Kooperationspartner oder Experten hinzu gefügt wurden [The NCBI handbook 2002].
Falls ein Molekül in GenBank durch mehrere Sequenzen repräsentiert wird, wird durch die NCBI Mitarbeiter eine Entscheidung für die„ beste" Sequenz getroffen, die dann als RefSeq präsentiert wird.
Die Entscheidung, die in der vorliegenden Anmeldung benannte
Markerpopulation auf der Basis ihrer RefSeq- Identität für die Zwecke der
vorliegenden Erfindung zu verwenden, wurde aufgrund der oben beschriebenen Eigenschaften der RefSeq -Datenbank gefällt. Die Eigenschaften dieser Datenbank, die Erstellung, Qualität, Pflege und Aktualisierungen der biologischen Sequenzen betreffend, sowie das Vorliegen funktioneller Informationen auf Nukleinsäureebene, gleichermaßen für alternative Spleißvarianten, gaben dafür den Ausschlag.
Wie bereits erläutert, bietet der biologische Mechanismus des alternativen Spleißing Raum für den Fachmann wohl bekannte Erstreckungen des
Schutzumfangs. So ist denkbar, dass mit neuen Transkriptvarianten völlig neue Primärstrukturen identifiziert werden, oder dass sich Sequenzänderungen der bekannten Transkriptvarianten ergeben. Andererseits, werden die genomischen Regionen beansprucht, die für alle diese bekannten und unbekannten Varianten der kodierenden Transkripte, mitsamt ihren cis-regulatorischen Sequenzen als
vollkommende genomische funktionelle Einheiten umfasst und somit unter den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung fallen oder zumindest dem Fachmann leicht auffindbare Äquivalente zu den in den Ansprüchen, Beschreibung und im Sequenzprotokoll genannten Sequenzen zur Verfügung stellen.
Definitionen:
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung werden folgende Definitionen verwendet: SIRS: Systemic Inflammatory Response Syndrome, nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer,
nichtinfektiöser Zustand eines Patienten.
Sepsis: Nach Bone [Bone et al., 1992] und Levy [Levy et al., 2003] ein generalisierter, inflammatorischer infektiöser Zustand eines Patienten.
Entzündung/Inflammation: Es handelt sich um eine Reaktion des Körpers, hervorgerufen durch Verletzung oder Gewebezerstörung, die dazu dient das verletzende Agens oder das verletzte Gewebe zu beseitigen, verdünnen oder abzugrenzen.
Der Entzündungsvorgang kann durch physikalische, chemische oder
biologische Agentien, einschließlich mechanischen Traumas, Strahlenbelastung durch Sonne, Röntgen- und radioaktive Strahlung, korrosive Chemikalien, extreme Hitze oder Kälte und infektiöse Agentien wie Bakterien, Viren, Pilze und andere pathogene Organismen hervorgerufen werden. Inflammation und Infektion können jedoch nicht als Synonyme verwendet werden.
Die klassischen Zeichen der Entzündung sind Wärme, Rötung, Schwellung, Schmerz und Funktionsverlust des betroffenen Gewebes. Dabei handelt es sich um Manifestationen der physiologischen Veränderungen, die während des
Entzündungsvorganges auftreten. Die drei Hauptkomponenten dieses Vorganges sind
1 ) Änderungen des Durchmessers von Blutgefäßen und der Geschwindigkeit des Blutflusses durch diese Gefäße (hämodynamische Änderungen)
2) Gesteigerte Permeabilität der Kapillaren, und
3) Leukozytenwanderung
Infektion: Das Eindringen pathogener Mikroorganismen in den Körper und deren dortige Vermehrung, die eine Erkrankung durch die Verletzung von Zellen oder Zellverbänden, die Sekretion von Toxinen oder die Antigen-Antikörper Reaktion des Wirtes verursachen. Eine systemische Infektion ist eine Infektion, bei der sich die Erreger über die Blutbahn im gesamten Organismus ausgebreitet haben.
Biologische Flüssigkeit: Als biologische Flüssigkeiten im Sinne der Erfindung werden alle Körperflüssigkeiten der Säugetiere, einschließlich des Menschen, verstanden.
Gen: Ein Gen ist ein Abschnitt auf der Desoxyribonukleinsäure (DNA), der die Grundinformationen zur Herstellung einer biologisch aktiven Ribonukleinsäure (RNA) sowie regulatorische Elemente, welche diese Herstellung aktivieren oder inaktivieren, enthält. Als Gene im Sinne der Erfindung werden auch alle abgeleiteten DNA- Sequenzen, Partialsequenzen und synthetische Analoga (beispielsweise Peptido- Nukleinsäuren (PNA)) verstanden. Die auf Bestimmung der Genexpression auf RNA- Ebene bezogene Beschreibung der Erfindung stellt somit ausdrücklich keine
Einschränkung sondern nur eine beispielhafte Anwendung dar.
Genlocus: Genlocus {Genort) ist die Position eines Gens im Genom. Besteht das Genom aus mehreren Chromosomen, ist die Position innerhalb des
Chromosoms gemeint, auf dem sich das Gen befindet. Verschiedene Ausprägungen oder Varianten dieses Gens werden als Allele bezeichnet, die sich alle an derselben Stelle auf dem Chromosom, nämlich dem Genlocus befinden. Somit beinhaltet der Begriff„Genlocus" einerseits die reine genetische Information für ein spezifisches Genprodukt und andererseits sämtliche regulatorische DNA-Abschnitte sowie sämtliche zusätzliche DNA-Sequenzen, welche mit dem Gen am Genlocus in irgendeinem funktionellen Zusammenhang stehen. Die letzteren schließen an
Sequenzregionen an, die in der unmittelbar Nähe (1 Kb) aber außerhalb des 5-' und/oder 3' - Endes eines Genlocus liegen. Die Spezifizierung des Genlocus erfolgt durch die Accession-Nummer und/oder RefSeq ID des RNA-Hauptproduktes, welches von diesem Locus abstammt.
Genaktivität: Unter Genaktivität wird das Maß der Fähigkeit eines Gens verstanden, transkribiert zu werden und/oder Translationsprodukte zu bilden. Genexpression: Der Vorgang, ein Genprodukt zu bilden und/oder Ausprägung eines Genotyps zu einem Phänotyp.
Multigenbiomarker: Kombination von mehreren Gen-Sequenzen deren Genaktivitäten mittels einer Interpretationsfunktion ein kombiniertes Gesamtergebnis (z.B. eine Klassifikation und/oder ein Index) bilden. Dieses Ergebnis ist spezifisch für einen Zustand und/oder eine Untersuchungsfrage.
Hybridisierungsbedingungen: Dem Fachmann wohl bekannte physikalische und chemische Parameter, welche die Etablierung eines thermodynamischen
Gleichgewichtes aus freien und gebundenen Molekülen beeinflussen können. Im Interesse optimaler Hybridisierungsbedingungen müssen Zeitdauer des Kontaktes der Sonden- und Probenmoleküle, Kationenkonzentration im Hybridisierungspuffer, Temperatur, Volumen sowie Konzentrationen und -Verhältnisse der hybridisierenden Moleküle aufeinander abgestimmt werden.
Amplifikationsbedingungen: Konstante oder sich zyklisch verändernde Reaktionsbedingungen, welche die Vervielfältigung des Ausgangsmateriales in Form von Nukleinsäuren ermöglichen. Im Reaktionsgemisch liegen die Einzelbausteine (Desoxyribonukleotide) für die entstehenden Nukleinsäuren vor, ebenso wie kurze Oligonukleotide, welche sich an komplementäre Bereiche im Ausgangsmaterial anlagern können, sowie ein Nukleinsäure-Synthese-Enzym, Polymerase genannt. Dem Fachmann wohl bekannte Kationenkonzentrationen, pH-Wert, Volumen und die Dauer und Temperatur der einzelnen Reaktionsschritte sind von Bedeutung für den Ablauf der Amplifikation.
Primer: Als Primer wird in der vorliegenden Erfindung ein Oligonukleotid bezeichnet, das als Startpunkt für Nukleinsäure-replizierende Enzyme wie z. B. die DNA-Polymerase dient. Primer können sowohl aus DNA als auch aus RNA bestehen (Primer3, siehe z.B. http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi des MIT)
Sonde: In der vorliegenden Anmeldung ist eine Sonde ein
Nukleinsäurefragment (DNA oder RNA), das mit einer molekularen Markierung (z.B. Fluoreszenzlabel, insbesondere Scorpion®, molecular beacons, Minor Groove
Binding- Sonden,TaqMan®-Sonden, Isotopenmarkierung, usw.) versehen werden kann und zur sequenzspezifischen Detektion von Ziel-DNA- und/oder Ziel-RNA- Molekülen eingesetzt wird.
PCR: ist die Abkürzung für die englische Bezeichnung„ Polymerase Chain Reaction" (Polymerase-Kettenreaktion). Die Polymerase-Kettenreaktion ist eine Methode, um DNA in vitro außerhalb eines lebenden Organismus mit Hilfe einer DNA-abhängigen DNA Polymerase zu vervielfältigen. PCR wird insbesondere gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um kurze Teile - bis zu etwa 3.000
Basenpaare - eines interessierenden DNA-Strangs zu vervielfältigen. Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens oder auch um nicht kodierende DNA-Sequenzen handeln. Es ist dem Fachmann wohl bekannt, dass eine Reihe von PCR-Verfahren im Stand der Technik bekannt sind, welche alle durch den Begriff„ PCR" mit umfasst sind. Dies gilt insbesondere für die„ Real-Time-PCR" (vgl. auch die Erläuterungen weiter unten).
Transkript: Für die Zwecke der vorliegenden Anmeldung wird unter einem Transkript jegliches RNA-Produkt verstanden, welches anhand einer DNA-Vorlage hergestellt wird.
Small RNA: Kleine RNAs im Allgemeinen. Vertreter dieser Gruppe sind insbesondere, jedoch nicht ausschließlich:
a) scRNA (small cytoplasmatic RNA), welche eines von mehreren kleinen RNA-Molekülen im Cytoplasma eines Eukaryonten ist.
b) snRNA (small nuclear RNA), eine der vielen kleinen RNA-Formen, die nur im Zellkern vorkommen. Einige der snRNAs spielen beim Spleißen oder bei anderen RNA-verarbeitenden Reaktionen eine Rolle.
c) small non-protein-codinq RNAs, welche die sogenannten small nucleolar RNAs (snoRNAs), microRNAs (miRNAs), Short interfering RNAs (siRNAs) und small double-stranded RNAs (dsRNAs) einschließen, welche die Genexpression auf vielen Ebenen, einschließlich der Chromatin-Architektur, RNA-Editierung, RNA- Stabilität, Translation und möglicherweise auch Transkription und Spleißen. Im Allgemeinen werden diese RNAs auf mehrfachem Wege prozessiert aus den Introns und Exons längerer Primärtranskripte, einschließlich proteincodierender Transkripte. Obwohl etwa nur 1 ,2% des Humangenoms Proteine codiert, wird ein großer Teil dennoch transkribiert. Tatsächlich bestehen ca. 98% der in Säugern und Menschen
gefundenen Transkripte aus non-protein-coding RNAs (ncRNA) aus Introns von proteincodierenden Genen und den Exons und Introns von nicht proteincodierenden Genen, einschließlich vieler, welche anti-sense zu proteincodierenden Genen sind oder mit diesen überlappen. Small nucleolar RNAs (snoRNAs) regulieren die sequenzspezifische Modifikation von Nukleotiden in Target-RNAs. Hierbei treten zwei Typen von Modifikationen auf, nämlich 2'-O-Ribosemethylierung und
Pseudouridylierung, welche durch zwei große snoRNA-Familien reguliert werden, die einerseits box C/D-snoRNAs und andererseits box H/ACA snoRNAs genannt werden. Derartige snoRNAs weisen eine Länge von etwa 60 bis 300 Nukleotiden auf.
miRNAs (microRNAs) und siRNAs (short interfering RNAs ) sind noch kleinere RNAs mit im Allgemeinen 21 bis 25 Nukleotiden. miRNAs stammen aus endogenen kurzen Hairpin-Vorläuferstrukturen und benutzen gewöhnlich andere Loci mit ähnlichen - jedoch nicht identischen Sequenzen als Ziel translationaler Repression. siRNAs entstehen aus längeren doppelsträngigen RNAs oder langen Hairpins, oftmals exogenen Ursprungs. Sie haben gewöhnlich homologe Sequenzen an demselben Locus oder woanders im Genom zum Ziel, wo sie am sogenannten gene silencing, ein Phänomen, welches auch RNAi genannt wird, beteiligt sind. Die Grenzen zwischen miRNAs und siRNAs sind jedoch fließend.
d) Zusätzlich kann der Begriff " small RNA" auch sogenannte transposable Elemente (TEs) und insbesondere Retroelemente umfassen, welche ebenfalls für die Zwecke der vorliegenden Erfindung unter dem Begriff „small RNA" verstanden werden.
RefSeq ID: Diese Bezeichnung bezieht sich auf Einträge in der NCBI
Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Diese Datenbank liefert nicht-redundante
Referenz-Standards zu genomischer Information. Diese genomischen Informationen schließen unter anderem Chromosomen, mRNAs, RNAs und Proteine ein. Jede RefSeq ID stellt ein einzelnes, natürlich vorkommendes Molekül eines Organismus dar. Die biologischen Sequenzen, die eine RefSeq repräsentieren, sind von GenBank Einträgen (ebenfalls NCBI) abgeleitet, sind aber eine Zusammenstellung von Informationselementen. Diese Informationselemente stammen aus Primär-Forschung auf DNA-, RNA- und Proteinebene.
Accession-Nummer: Eine Accession-Nummer stellt die Eintragsnummer eines Polynukleotides in der dem Fachmann bekannten NCBI-GenBank dar. In dieser Datenbank werden sowohl RefSeq ID' s als auch weniger gut charakterisierte und redundante Sequenzen als Einträge verwaltet und der Öffentlichkeit zugänglich gemacht (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/index.html).
Lokale Infektion: Die Infektion beschränkt sich auf die Eintrittspforte des Erregers (z.B. Wundinfektion)
Generalisierte Infektion: Pathogene dringen ins Gefäßsystem vor und ziehen den gesamten Organismus in Mitleidenschaft. Generalisierte Infektionen können zu einer Sepsis führen.
Kolonisierung: Die Gegenwart von Mikroorganismen löst im Organismus keinerlei Krankheitssymptome aus.
Bakteriämie: Ein Zustand, in dem vorübergehend und kurzfristig Bakterien im Blut anwesend sind, ohne dass dies mit dem Auftreten von bakteriell bedingten klinischen Symptomen verbunden sein muss.
Alternatives Splicing: ein Prozess, bei dem die Exons des primären Gentranskripts (pre-mRNA) nach Ausschneiden der Introns in unterschiedlichen Kombinationen wiederverbunden werden.
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool [nach Altschul et al., J Mol Biol 215:403- 410; 1990]. Sequenzvergleichalgorithmus, geschwindigkeitsoptimiert, wird für die Suche in Sequenzdatenbanken für eine optimale lokale Anpassung an die Anfragesequenz genutzt. cDNA: Komplementäre DNA. DNA-Sequenz, Produkt der Reversen Transkription von mRNA. Codierende Sequenz: Protein-kodierender Abschnitt eines Gens bzw. einer mRNA in Abgrenzung zu Introns (nicht kodierende Sequenzen) und 5-' oder 3'- nichttranslatierten Abschnitten. Kodierende Sequenzen der cDNA oder reifen mRNA umfassen den Bereich zwischen Start- (AUG oder ATG) und Stopcodon.
EST: Expressed Sequence Tag. Kurze ssDNA-Abschnitte der cDNA (normalerweise -300-500 bp), üblicherweise in großen Mengen produziert. Repräsentieren die Gene, die in bestimmten Geweben und/oder während bestimmter Entwicklungsphasen exprimiert werden. Teilweise codierend bzw. nicht codierende Kennzeichnungen der Expression für cDNA-Bibliotheken. Wertvoll für die Größenbestimmung vollständiger Gene und im Rahmen von Kartierungen (Mapping).
Exon: Kodierender, der mRNA entsprechender Sequenzbereich typischer eukaryotischer Gene. Exons können die kodierenden Sequenzen, den 5' - nichttranslatierten Bereich oder den 3' -nichttranslatierten Bereich umfassen. Exons kodieren spezifische Abschnitte des vollständigen Proteins und sind normalerweise durch lange Abschnitte (Introns) getrennt, die bisweilen als "junk DNA" bezeichnet werden und deren Funktion nicht genau bekannt ist aber wohl kurze, nicht- translatierte RNAs (snRNA) oder regulatorische Informationen kodieren.
GenBank Nukleotidsequenz-Datenbank mit Sequenzen aus mehr als 100.000 Organismen. Einträge, die mit Eigenschaften der kodierende Bereiche annotiert sind, umfassen auch die Translationsprodukte. GenBank ist Teil der internationalen Kooperation der Sequenzdatenbanken, die auch EMBL und DDBJ umfasst.
Intron: Nicht-codierender Sequenzbereich eines typischen eukaryotischen Gens, wird während des RNA-Splicings aus dem primären Transkript herausgeschnitten und befindet sich somit nicht mehr in der reifen, funktionellen mRNA, rRNA oder tRNA. mRNA: Messenger RNA oder manchmal nur "message". RNA, die die für Proteinkodierung notwendigen Sequenzen enthält. Der Begriff mRNA wird in Abgrenzung zum (ungesplicten) Primärtranskript nur für das reife Transkript mit PolyA-Schwanz (exklusive der über das Splicing entfernten Introns) benutzt. Weist 5'- nichttranslatierte, Aminosäuren-kodierende, 3'- nichttranslatierte Bereiche und (fast immer) einen Poly(A)-Schwanz auf. Stellt typischerweise ca. 2% der gesamten zellulären RNA. Poly(A)-Schwanz: ssAdenosin-Verlängerung (~ 50-200 Monomere), die während des Splicings an das 3' -Ende der mRNA gehangen wird. Der PolyA-Tail erhöht vermutlich die Stabilität der mRNA (möglicherweise Protektion gegen Nukleasen). Nicht alle mRNA weisen das Konstrukt auf, so z.B. die Histon-mRNA.
RefSeq NCBI-Datenbank der Rereferenzsequenzen. Fehler-korrigierte, nichtredundante Sequenzsammlung genomischer DNA-Contigs, mRNA- und Protein- Sequenzen bzw. von bekannten Genen und vollständiger Chromosomen.
SNPs: Single Nucleotide Polymorphisms. Auf einzelnen Nukleotidabweichungen beruhende genetische Unterschiede zwischen Allelen des gleiches Gens. Entstehen an spezifischen individuellen Positionen innerhalb eines Gens.
Transkriptvarianten: Alternative Splicing-Produkte. Die Exons des primären Gentranskripts (prä-mRNA) wurden auf unterschiedliche Weise wiederverbunden und werden nachfolgend translatiert.
3'-nichttranslatierter Bereich: Transkribierter 3' -terminaler mRNA-Bereich ohne proteinkodierende Information (Bereich zwischen Stopkodon und PolyA-Schwanz). Kann die Translationseffizienz oder die Stabilität der mRNA beeinflussen.
5'- nichttranslatierter Bereich: Transkribierter 5' -terminaler mRNA-Bereich ohne proteinkodierende Information (Bereich zwischen initialem 7-Methylguanosin und der Base unmittelbar vor dem ATG-Startcodon). Kann die Translationseffizienz oder die Stabilität der mRNA beeinflussen.
Polynucleotid-Isoformen: Polynucleotide mit gleicher Funktion, jedoch
unterschiedlicher Sequenz.
Abkürzungen
CRP C-reaktives Protein
OR Odd Ratio
PCT Procalcitonin
Sensitivität Anteil der korrekten Tests in der
Gruppe mit vorgegebenener Erkrankung (infektiöse SIRS bzw.
Sepsis)
Spezifizität Anteil der korrekten Tests in der
Gruppe ohne vorgegebenene
Erkrankung (nicht-infektiöse SIRS)
Darüber hinaus offenbart die nicht vorveröffentlichte DE10 2009 044 085 ein System, das folgende Elemente umfaßt:
• Einen Set von Genaktivitätsmarkern
• Referenzgene als interne Kontrolle der Genaktivitätsmarkersignale in Vollblut
• Detektion hauptsächlich über Real-Time-PCR oder andere
Amplifikationsverfahren oder Hybridisierungsverfahren
• Verwendung eines Algorithmus, um die Einzelergebnisse der
Genaktivitätsmarker zu einem gemeinsamen numerischen Wert, Index oder auch Score, umzuwandeln
• Darstellung dieses numerischen Wertes auf einer entsprechend eingeteilten Skala
• Kalibrierung, d.h. Einteilung der Skala entsprechend der intendierten
Anwendung durch vorherige Validierungsexperimente.
Das System liefert eine Lösung für das Problem der Feststellung von
Krankheitszuständen wie z. B. die Unterscheidung von infektiösem und nichtinfektiösem Multiorganversagen aber auch für andere in diesem Kontext relevante Anwendungen und Fragestellungen.
Sämtlichen im Stand der Technik vorveröffentlichten und in dem oben angegebenen, zum Anmeldezeitpunkt noch nicht veröffentlichten Dokument DE 10 2009 044 085 enthaltenen Ansätzen zur diagnostischen/prognostischen Erfassung von inflammatorischen und/oder infektiösen Zuständen haben bislang jedoch nur - wie eingangs dargelegt - verhalten Eingang in die klinische Routine gefunden. Unter Verwendung eines breiten Spektrums inflammatorisch-infektiöser klinischer Phänotypen vom gesunden Probanden über Patienten mit lokaler
Inflammation und lokaler Infektion bis zu Intensivpflichtigen Patienten mit
systemischer Inflammation (SIRS) und systemischer Infektion (Sepsis) und einer Meßplattform die in Form von 25.000 unterschiedlichen Sonden das gesamte humane Genom repräsentiert, wurde eine Studie zur differentiellen Genexpression aus peripheren Vollblutproben durchgeführt. Im Ergebnis wurde
überraschenderweise eine transkriptomische Signatur identifiziert, die anstatt sprunghafter Änderungen in Abhängigkeit der verschiedenen Phänotypen ein inflammatorisch-infektiöses Kontinuum der differentiellen Genexpression darstellt. Ein weiteres überraschendes Ergebnis, dass aus dieser Feststellung folgte, war das Fehlen infektionsspezifischer Gen-Gruppen. Auch konnte in der Gruppe mit systemischer Inflammation eine, mit Patienten mit Blutstrom-Infektionen
vergleichbare, differentielle Genexpression festgestellt werden.
Diese Ergebnisse können eine Erklärung für die im Folgenden ausgeführte Feststellung liefern, dass in weniger als der Hälfte der Sepsis-Verdachtsfälle ein Pathogen-Nachweis aus Blutproben gelingt. Ein Zustand, der durch weitgehende, gleichzeitige Über- und Unterexpression von bestimmten Gentranskripten
repräsentiert wird, kann als kritisch angesehen werden und die in folgenden
Abschnitten aufgeführten Merkmale der Sepsis umfassen. Er kennzeichnet die Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende„ Immunbelastung" , auch als Host Response oder
Wirtsantwort bezeichnet. Die Information über diesen Zustand, die durch sämtliche signifikant differentiell expriemierten Gentranskripten repräsentiert ist, lasst sich rechnerisch zu einem nicht-dimensionalen Zahlenwert, einem Score,
zusammenfassen und als Abstand vom Zustand des Gesunden darstellen. Je größer der Zahlenwert des Scores, desto größer ist das Ausmaß der Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „Immunbelastung" . Eine vergleichbare Information über Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende „ Immunbelastung" läßt sich ebenfalls anhand von Scores, gebildet aus
Unterauswahlen aus allen differentiell exprimierten Genen erhalten. Die Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende„ Immunbelastung" kann sich nicht nur Vergrößern bzw verschlechtern, sondern sich auch in die Gegenrichtung, d.h. zum Zustand des Gesunden zurück bewegen bzw. verbessern. Diese Rückkehr kann als
Erholungsprozesses betrachtet werden. Folgt diese Erholung unmittelbar auf eine therapeutische Maßnahme, zeigt sie den Therapieerfolg an.
Eine Progression des Zustandes in den kritischen Bereich zeigt ein hohes Mortalitäts-Risiko für den Patienten an. In diesem Zustand ist die Wahrscheinlichkeit für den Patienten hoch, eine lebensbedrohliche Komplikation in Form einer unkontrollierten Primärinfektion und/oder eine sekundäre Infektion zu erleiden und/oder an den Folgen der unkontrollierten inflammatorisch-infektiösen Wirtsantwort zu versterben.
Eine Progression in Richtung eines kritischen Zustandes kann als
Früherkennung genutzt werden und auf deren Grundlage die erforderlichen therapeutischen Maßnahmen und Interventionen initiiert werden.
Die Reaktion des Körpers auf infektiöse und/oder inflammatorische Stimulation bzw. die sich daraus ergebende„Immunbelastung" kann als Einzelbestimmung zur Feststellung eines Zustandes verwendet werden.
Der Immunstatus kann anhand von zeitlich aufeinanderfolgenden
Mehrfachbestimmungen zur Verlaufsbeobachtung und Therapiekontrolle bei
Patienten genutzt werden.
Medizinische Maßnahmen können die medikamentöse Behandlung sowie deren Eskalation oder De-Eskalation, invasive Maßnahmen wie chirurgischeEingriffe zur Fokussanierung und/oder weitere diagnostische Maßnahmen sein. Die Bestimmung des Immunstatus kann zur differentiellen Diagnose herangezogen werden, indem festgestellt wird ob das Immunsystem einen Beitrag zum akuten Krankheitsgeschehen leistet oder als Ursache eines lebensbedrohlichen Zustandes eines Patienten nicht in Frage kommt.
Das Ziel der meisten Genexpression-Studien zur Sepsis-Diagnose lag bislang darin, Marker zu finden, die unterscheiden, ob ein systemisches inflammatorisches Response-Syndroms (SIRS, ACCP/SCCM, 1992) durch Erreger verursacht wurde oder nicht. In diesen Studien wurden insbesondere Proben von Intensiv-Patienten untersucht. Die Unterscheidung in Gruppen „sterile SIRS" vs. „Sepsis" (SIRS + positiver Erregernachweis) erfolgte insbesondere nach dem mikrobiologischen Nachweis. Diese Studien lieferten sehr heterogene Ergebnisse, wie in einer aktuellen vergleichenden Publikation festgestellt wurde [Tang et al. (2010)]. Die vorliegende Erfindung beleuchtet mit ihrem experimentellen Ansatz die Ursachen hierfür. Dem Versuchsplan der Erfinder lag die folgende Überlegung zugrunde:
Der bisherige Ansatz zur Sepsis-Diagnose wurde der Vorgehensweise bei einer lokalen Inflammation entnommen. Auch hier will man unterscheiden, ob die Entzündung an einem Organ durch Erreger verursacht wurde oder nicht (man spricht dann z.B. von einer bakteriellen oder aber einer sterilen Myokarditis oder Pankreatitis). Infektionsspezifische Genmarker müssen eine erhöhte oder aber eine reduzierte Expression auch bei einer Infektion zeigen, die sich nicht unbedingt durch eine systemische Inflammation manifestiert sondern lediglich eine Entzündung am betroffenen Organ/Ort hervorruft. Dies konnte jedoch für die bis jetzt gefundenen Genmarker im Stand der Technik nicht gezeigt werden.
Eine andere Erklärung für heterogene Ergebnisse wäre, dass die Genexpression- Studien RNA-Proben aus Blut verwenden. Somit mussten die besten Chancen für das Auffinden von infektionsspezifischen Genmarkern dann vorliegen, wenn nur Proben mit einer positiven Blutkultur, die ein „Gold Standard" für die Blutstrominfektion ist, vermessen werden. In den bisherigen Studien wurden Sepsis- Patienten unabhängig von der Ausbreitung der Infektion als eine Studiengruppe betrachtet
Die Anmelderin legt ihren Studien einen Versuchsplan zugrunde, in dem die Merkmale Infektion und Inflammation in ihrer räumlichen Ausbreitung unabhängig voneinander eingestuft wurden. Es wurde unterschieden, ob die Entzündung systemisch, lokal oder gar nicht ausgeprägt war. Dabei wurde eine systemische Inflammation durch die Definition des systemischen inflammatorischen Response- Syndroms (SIRS) bestimmt. Darüber hinaus wurde geprüft, ob Erreger im Blut (systemisch), an einem Organ (lokal) oder gar nicht gefunden wurden. Aus der Kombination der Ausbreitung von Infektion und Inflammation wurden die 9 möglichen Phänotypen definiert. Sie werden in der Tabelle 1 zusammengefasst.
Tabelle 1 : Darstellung der Phänotypen , die sich durch die räumliche Ausprägung von Inflammation und/oder Infektion ergeben. Jeder Phänotyp wird durch ein Kürzel aus 3 Buchstaben bezeichnet. Dabei bezeichnet der erste Großbuchstabe die Ausweitung der Infektion, der zweite die Ausbreitung der Inflammation. Beide wurden mit einem„a" (für und) verbunden
Figure imgf000045_0001
Aus Sicht der vorliegenden Erfindung ist diese Aufteilung eindeutig, vollständig und von anderen Faktoren unabhängig. D.h. jeder beliebige Proband kann zum Zeitpunkt der Probennahme einer der Gruppen zugeordnet werden.
Während eine Entzündung nicht unbedingt durch Erreger verursacht wird, ist eine Infektion ohne eine Entzündungsreaktion diagnostisch nicht relevant. Eine systemische Infektion, die nur eine örtlich begrenzte Entzündung hervorruft (so genannte Bakteriämie, z.B. bei einer Endokarditis), ist ein seltenes Phänomen und bildet einen Sonderfall. Daher bilden die Kombinationen LaN, SaN und SaL keine klinisch relevanten Phänotypen und wurden für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht betrachtet. Für die Studie haben die Erfinder diagnostisch relevante Patienten-Proben nach der räumlichen Ausbreitung einer Inflammation und/oder Infektion aufgeteilt. Es entstanden 6 Studien-Gruppen (in Tab. 1 fett geschrieben). Diese Gruppen repräsentieren die wichtigsten und häufigsten infektions-inflammatorischen Phänotypen. Insbesondere die 4 Phänotypen mit einer lokalen Infektion mit lokaler und systemischer Entzündung (LaL und LaS) sowie die entsprechenden Kontrollgruppen ohne eine Infektion (NaL und NaS) ermöglichen, im statistischen Vergleich, die Aufdeckung von infektionsspezifischen Genmarkern. Der Vergleich der Gruppen SaS und LaS gibt Hinweise darüber, ob bei systemischer Inflammation die Infektion der zirkulierenden Zellen (Blutistromnfektion), ein anderes Genexpressionsmuster als die lokal beschränkte Infektion anzeigt.
Der vorliegenden Anmeldung ist ein Sequenzprotokoll mit den SEQ-ID- Nummern 1 -7718 beigefügt, dessen Inhalt vollständig zum Offenbarungsgehalt der vorliegenden Anmeldung gehört.
Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbeispielen sowie anhand der Zeichnung.
Es zeigt:
Fig. 1 zeigt eine Heatmap, bei welcher die Expressionsmuster nach Studien-Gruppen sortiert sind;
Fig. 2 zeigt eine sortierte Heatmap, bei welcher die Expressionsmuster nach dem Score (Master-Score) sortiert sind;
Fig. 3 zeigt Abstands-Dreiecke für die Studien-Proben;
Fig. 4 zeigt Abstands-Dreiecke für zwei Patienten-Verläufe;
Fig. 5 zeigt den Verlauf des Scores für alle Studien-Proben; und
Fig. 6 zeigt den Verlauf des Scores, der aus Delta-Ct Werten der realtime PCR Genexpressionsmessung berechnet wurde im Vergleich zum Master-Score.
Beispiele Beispiel 1 : Bestimmung der Schwere der Wirtsantwort auf eine Belastung des Immunsystems durch eine akute Inflammation.
Patientenqruppen
In die Auswahl wurden Proben von folgenden Probanden eingeschlossen: Gesunde Spender, Patienten aus den Kliniken für Hals-Nasen-Ohrheilkunde (HNO) und für Anästhesie und Intensivmedizin (KAI) des Universitätsklinikums Jena. Die Belegung der Gruppen war wie folgt:
SaS: 6 Intensivpatienten mit der Diagnose Schwere Sepsis/Septischer Schock. Die untersuchte Probe wurde am Tag entnommen, an dem in zwei unabhängigen Tests (Blutkultur und DNA-Nachweis) der gleiche Erreger im Blut bestätigt wurde.
LaS: 13 Intensivpatienten mit der Diagnose Schwere Sepsis/Septischer Schock, bei denen während der Erkrankung mindestes eine Blutprobe mit zwei unabhängigen Test (Blutkultur und DNA-Nachweis) auf Erreger geprüft wurde, aber alle Befunde negativ blieben. Die untersuchte Probe wurde am ersten Tag entnommen, an dem ein Erreger lokal bestätigt wurde.
NaS: 13 Intensivpatienten mit der Diagnose SIRS ohne Zeichen einer Infektion. Die untersuchte Probe wurde innerhalb der ersten 3 Tage mit der SIRS-Diagnose abgenommen.
LaL: 7 Patienten der HNO-Klinik mit einem akuten Peritonsillarabszess (PTA). Die untersuchte Probe wurde unmittelbar vor der operativen Entfernung des infektiösen Abszess entnommen. Die zugehörige mikrobiologische Blutuntersuchung (wie bei LaS) war negativ.
NaL: 8 Patienten der HNO-Klinik mit chronischer Tonsillitis ohne einen akuten Infektionsherd. Die untersuchte Probe wurde innerhalb der ersten 3 Tage nach der Tonsillektomie (operativen Mandelentfernung) entnommen. Die Patienten zeigten keine SIRS-Symptome, an der Eingriffstelle befand sich eine sterile Wundentzündung. Weiter wurden in die Gruppe 4 Patienten mit einer chronischen nicht infektiösen Pankreatitis ohne SIRS eingeschlossen.
NaN: 7 gesunde Spender, 3 Patienten mit chronischer Tonsillitis ohne einen akuten Infektionsherd. Die untersuchte Probe wurde vor der Tonsillektomie abgenommen, die postoperativen Proben dieser Patienten wurden nicht in die NaL Gruppe eingeschlossen. Verlaufsproben: In der Studie wurden Proben von 2 Patienten über jeweils 6 nacheinander folgende Tage untersucht. In beiden Fällen wurde die erste Probe vor einem geplanten operativen Eingriff, die Folgeproben wurden auf der Intensivstation abgenommen. Fall 1 : Patient erholt sich nach der Operation nicht. Die entzündungsrelevanten Parameter steigen ab dem 2. postoperativen Tag am 3. Tag wurde eine Infektion diagnostiziert, der Patient verstirbt nach 10 Tagen. Fall 2: Nach der Operation erholt sich der Patient sehr langsam. Am dritten Tag steigen einige entzündungsrelevanten Parameter. Nach den medizinischen Maßnahmen verbessert sich der Zustand, der Patient wird nach insgesamt 6 Tagen verlegt.
Die wichtigsten klinischen Parameter zu den untersuchten Proben wurden in der Tabelle 2 zusammengefasst.
Tabelle 2: Zusammenfassung der klinischen Parameter der in die Studie eingeschlossenen Probanden. Wurde ein Merkmal nicht abgefragt oder ein Parameter nicht bestimmt, so wird es mit dem Kürzel n.a. versehen.
Geschlech Uberlebens
t -Status
Proben (w: Alter Studien Zentru PCT CRP SOF
Aufnahme-Diagnose (»: Erreger -ID weiblich [Jahre] -Gruppe m entlassen [ng/ml] [mg/l] A
m: ns:
männlich) verstorben)
chronische Tonsillitis,
1 w 32 NaN HNO s 0,061 12,67 n.a. Keine präoperativ
chronische Tonsillitis,
2 m 22 NaN HNO s 0,089 1 ,86 n.a. Keine präoperativ
chronische Tonsillitis,
3 w 57 NaN HNO s n.a. 5,12 n.a. keine präoperativ
4 m 43 NaN SL Spender s n.a. n.a. n.a. n.a.
5 m 24 NaN SL Spender s n.a. n.a. n.a. n.a.
6 w 25 NaN SL Spender s n.a. n.a. n.a. n.a.
7 w 46 NaN SL Spender s n.a. n.a. n.a. n.a.
8 m 58 NaN SL Spender s n.a. n.a. n.a. n.a.
9 m 38 NaN SL Spender s n.a. n.a. n.a. n.a.
10 w 48 NaN SL Spender s n.a. n.a. n.a. n.a.
chronische Tonsillitis,
11 w 23 NaL HNO s 0,078 19,74 n.a. keine postoperativ
chronische Tonsillitis,
12 w 19 NaL HNO s 0,058 15,98 n.a. keine postoperativ
chronische Tonsillitis,
13 w 38 NaL HNO s 0,054 14,72 n.a. keine postoperativ
chronische Tonsillitis,
14 w 58 NaL HNO s 0,035 94,02 n.a. keine postoperativ
chronische Tonsillitis,
15 m 22 NaL HNO s 0,08 14,53 n.a. keine postoperativ
chronische Tonsillitis,
16 m 22 NaL HNO s 0,066 60,5 n.a. keine postoperativ
chronische Tonsillitis,
17 w 20 NaL HNO s 0,089 20,05 n.a. keine postoperativ
chronische Tonsillitis,
18 w 46 NaL HNO s 0,059 46,27 n.a. keine postoperativ
19 n.a. n.a. NaL KAI Chronische Pankreatitis n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
20 n.a. n.a. NaL KAI Chronische Pankreatitis n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
21 w n.a. NaL KAI Chronische Pankreatitis n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. Geschlech Uberlebens
t -Status
Proben (w: Alter Studien Zentru PCT CRP SOF
Aufnahme-Diagnose (»: Erreger -ID weiblich [Jahre] -Gruppe m entlassen [ng/ml] [mg/l] A
m: ns:
männlich) verstorben)
22 m n.a. NaL KAI Chronische Pankreatitis s 0,45 3,5 0 n.a.
Streptokkoken im
23 m 35 LaL HNO Peritonsinallarbszess s 0,055 42,39 n.a.
Tonsillarabstrich
Streptokkoken im
24 m 40 LaL HNO Peritonsinallarbszess s n.a. n.a. n.a.
Tonsillarabstrich
115,5 Streptokkoken im
25 m 28 LaL HNO Peritonsinallarbszess s 0,1 n.a.
9 Tonsillarabstrich
179,2 Streptokkoken im
26 m 68 LaL HNO Peritonsinallarbszess s 0,096 n.a.
4 Tonsillarabstrich
Streptokkoken im
27 m 30 LaL HNO Peritonsinallarbszess s 0,076 77,71 n.a.
Tonsillarabstrich
Streptokkoken im
28 w 55 LaL HNO Peritonsinallarbszess s 0,034 42,14 n.a.
Tonsillarabstrich
143,4 Streptokkoken im
29 m 70 LaL HNO Peritonsinallarbszess s 0,181 n.a.
4 Tonsillarabstrich bösartige Neubildung am
30 w n.a. NaS KAI s 0,14 2 5 n.a.
Pankreaskopf, präoperativ
Duodenal-Karzinom,
31 m n.a. NaS KAI s 0,27 3,3 7 n.a.
präoperativ
Pankreaskopfkarzinom,
32 m n.a. NaS KAI s n.a. 2,1 2 n.a.
postoperativ
Tumor im distalen
33 m n.a. NaS KAI s n.a. 2 3 n.a.
Oesophagus, präoperativ
Pankreaskopfkarzinom,
34 m n.a. NaS KAI s n.a. 5,1 4 n.a.
präoperativ
Gallen-
35 w 56 NaS KAI s 2,01 108 1 n.a.
Karzinom.postoperativ
Leberteilresektion,
36 w 70 NaS KAI s 0,3 30,2 2 n.a.
postoperativ
Bypass-Operation nach
37 w 70 NaS KAI s 0,36 47,2 2 n.a.
Herzinfarkt
bypass-Operation,
38 m 64 NaS KAI s 0,39 73,7 4 n.a.
postoperativ
39 m 44 NaS KAI Kardiomyopathie ns n.a. 156 4 n.a.
Bypass-Operation nach
40 w 64 NaS KAI s 13,3 235 8 n.a.
Herzinfarkt
Bypass-Operation nach
41 m 61 NaS KAI s 1 ,05 209 10 n.a.
Herzinfarkt
Bypass-Operation nach
42 m 74 NaS KAI ns 4,43 154 12 n.a.
Herzinfarkt
Wunde:
43 m 73 LaS KAI Kolonkarzinom s 1 ,23 514 3 Enterobacter cloacae,
Escherichia coli
Plattenepithelkarzinom BAL: Enterobacter
44 m 67 LaS KAI s 0,13 149 3
rechter Oberkiefer aerogenes
Wunde:
Dickdarmteilresektion bei Pseudomonas
45 m LaS KAI ns 3,51 201
Morbus Chron aeruginosa,
Enterococcus faecium
Wunde: Escherichia
Perforation rechter coli, Enterococcus
46 m 56 LaS KAI s n.a. 114 8
Oberbauch faecalis, Klebsiella pneumoniae
Wunde: Escherichia coli, Klebsiella
47 w 75 LaS KAI Anastomoseninsuffizienz s 4,68 117 5 pneumoniae,
Morganella morganii, Clostridium perfringens dekompensierte Aszites:
48 m 52 LaS KAI s 64,3 342 9
Leberzirrhose Enterococcus faecalis Geschlech Uberlebens
t -Status
Proben (w: Alter Studien Zentru PCT CRP SOF
Aufnahme-Diagnose (»: Erreger -ID weiblich [Jahre] -Gruppe m entlassen [ng/ml] [mg/l] A
m: ns:
männlich) verstorben)
rezidivierende BAL: Enterobacter
49 m 69 LaS KAI Nachblutungen u. s 1 ,1 1 207 12 cloacae, Candida
Wundinfektion krusei
BAL: Candida albicans,,
Artherosklerotische
50 m 78 LaS KAI s 1 ,6 188 12 Candida glabrata,
Herzkrankheit
Trachealabstrich: Candida albicans
Adenokarzinom des Aszites:
51 m 83 LaS KAI Magenantrums vom s 2,25 256 7 Enterococcus faecalis, intestinalen Typ Candida glabrata
Wunde: Andere
Sigmaperforation bei
52 w 50 LaS KAI s 0,23 203 8 Gram positive
Sigmadivertikulitis
Bakterien
BAL:
Nachblutung nach Staphylococcus
53 m 74 LaS KAI pertrochanterer s 0,42 179 1 1 aureus, Klebsiella
Femurfraktur links pneumoniae, Candida albicans
Wunde: Escherichia
Wundabszess am
54 m 49 LaS KAI s 9,81 177 7 coli, Enterococcus
Sigmoideostoma
faecium
BAL:
Stenotrophomonas arteriosklerot. maltophilia,
55 m 83 LaS KAI s 0,53 132 1 1
Herzkrankheit Citrobacter, Klebsiella oxytocca, Candida albicans
56 m 66 SaS KAI Polytrauma ns 36,6 260 13 Blut: Escherichia coli
Traumatischer Blut: Staphylococcus
57 m 71 SaS KAI ns 2,5 393 9
Hämatothorax aureus.Pan Staph.
Atherosklerotische Drei- Blut: Enterococcus
58 m 77 SaS KAI ns 7,2 245 13
Gefäß-Herzkrankheit faecalis
59 m 84 SaS KAI nekrotisierende Fasziitis s 32,8 241 10 Blut: Escherichia coli
Plattenepithelkarzinom Blut: Staphylococcus
60 w 77 SaS KAI s 0,32 309 8
des Ösophagus aureus gepl. Trisektorektomie
61 w 64 SaS KAI bei kolorektalen s 1 ,68 21 1 13 Blut: Fungi
Lebermetastasen
Pankreaskopf-Karzinom,
1JQ m 65 Fall 1 KAI ns n.a. 32,9 n.a. n.a.
präoperativ
Pankreaskopf-Karzinom,
1_t1 m 65 Fall 1 KAI ns 1 ,61 101 9 n.a.
1. postoperativer Tag
Pankreaskopf-Karzinom,
1J2 m 65 Fall 1 KAI ns 1 ,79 191 7 n.a.
2.postoperativer Tag
Wunde:Morganella
Pankreaskopf-Karzinom,
1_t3 m 65 Fall 1 KAI ns 2,21 273 9 morganii, Enterococcus
3.postoperativer Tag
faecalis.Citrobacter
Pankreaskopf-Karzinom,
1_t4 m 65 Fall 1 KAI ns 2,37 282 1 1 n.a.
4.postoperativer Tag
Pankreaskopf-Karzinom,
1_t5 m 65 Fall 1 KAI ns 2,02 331 10 n.a.
5.postoperativer Tag
Ösophagus-Karzinom,
2_t0 m 47 Fall 2 KAI s n.a. 16,7 0 n.a.
präoperativ
Ösophagus-Karzinom,
2_t1 m 47 Fall 2 KAI s n.a. 122 5 n.a.
1. postoperativer Tag
Ösophagus-Karzinom,
2_t2 m 47 Fall 2 KAI s 1 ,14 250 5 n.a.
2.postoperativer Tag
Ösophagus-Karzinom,
2_t3 m 47 Fall 2 KAI s 0,69 234 1 n.a.
3.postoperativer Tag Geschlech Uberlebens
t -Status
Proben (w: Alter Studien Zentru PCT CRP SOF
Aufnahme-Diagnose (»: Erreger -ID weiblich [Jahre] -Gruppe m entlassen [ng/ml] [mg/l] A
m: ns:
männlich) verstorben)
Ösophagus-Karzinom,
2_t4 m 47 Fall 2 KAI s 0,41 152 3 n.a.
4.postoperativer Tag
Ösophagus-Karzinom,
2_t5 m 47 Fall 2 KAI s 0,25 106 3 n.a.
5.postoperativer Tag
Experimentelle Durchführung
Vermessen wurden 73 RNA Proben aus dem Vollblut von 63 Personen. Dafür wurden kommerzielle Mikroarray-BeadChips HumanHT-12 v3 der Firma lllumina verwendet. Auf der verwendeten Messplattform befanden sich 48803 verschiedene Gensonden, die das gesamte humane Genom unabhängig vom Gewebe repräsentieren.
Die Proben wurden in folgenden Schritten verarbeitet und vermessen:
1. Isolierung und Stabilisierung der totaIRNA aus Vollblutproben: Ausgangsmaterial für die Analyse des Transkriptoms von Blutproben sind 2,5 ml Vollblut. Dieses wurde in einem PAXgene-Röhrchen (PAXgene Blood RNA Tube PreAnalytiX #762165 (Becton Dickinson))abgenommen und bei -80 °C bis zur Aufarbeitung gelagert.
2. Standardmäßige automatische RNA-Isolation aus PAXgene Blutproben: Es wurde der QIAcube (Qiagen, Hilden) sowie der PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX # 762174) unter Verwendung des Programmes „PAXgene Blood RNA (CE)" zur Isolierung der totaIRNA eingesetzt. Nach Ablauf des Protokolls wurden die Elutionstubes mit den RNA-Isolaten verschlossen. Restliche DNase-Enzymaktivitäten wurden durch Erhitzen der Proben für 5 min bei 65 °C inaktiviert, die Proben danach sofort auf Eis gekühlt und bei -80 °C gelagert.
3. Qualitätskontrolle der totaIRNA: Die Überprüfung der isolierten RNA ist eine wichtige Maßnahme zur Qualitätssicherung der Hybridisierungsergebnisse. Nur eine intakte RNA kann ausgezeichnete Hybridisierungsergebnisse liefern. Die Prüfung der Integrität der isolierten total RNA erfolgte kapillarelektrophoretisch mit dem Bioanalyzer 2100 von Agilent Technologies unter Verwendung des RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent Technologies, Katalog-Nummer 5067-151 1 ) nach den Vorgaben des Herstellers. Als Richtwert gilt ein RIN-Wert um 7,5 auf der Skala von 1 - 10. Alle verwendeten Proben erreichten RIN > 5, der zur Zwecken der Genexpressionsanalyse ausreichend ist (vgl. Fleige und Paffl, 2006). 4. Reduktion der Globin mRNA: Zur Verbesserung der Sensitivität der Genexpressionsmessungen im Vollblut wurde die hochabundante Globin mRNA empfohlen Dazu wurde der Kit „GLOBINclear TM-Human" , von Ambion /Applied Biosystems # AM 1980) eingesetzt. Nach Schätzungen des Herstellers überlagern die Transkripte von Globin mit ihrem Anteil von 70% aller mRNAs in Blut ganz erheblich weniger präsente Transkripte. Von jeder Probe wurde ^g totaIRNA zur Bearbeitung eingesetzt.
5. Amplifikation von totaIRNA zu cRNA: Die Vorbereitung der Globin-reduzierten RNA zur Hybridisierung erfolgte mit dem Ambion/Applied Biosystems " lllumina TotalPrep RNA Amplifikation kit (AMIL 1791 ) nach den Angaben des Herstellers und mit einer eingesetzten Menge von 500ng. Die cRNA-Eluate wurden auf Eis gekühlt, die Konzentration der cRNA am Nanodrop ND-2000 spektrophotometrisch vermessen.
6. Hybridisierung auf lllumina BeadChips: Es wurden die pangenomischen lllumina- BeadChips, Version human HT-12v3 eingesetzt. Von den cRNA-Proben wurden mit 750 ng in einem Volumen von 5 μΙ pro Array aufgetragen und über Nacht bei 58 °C hybridisiert. Die Signaldetektion erfolgreich hybridisierter Sonden erfolgt über CY3- Streptavidin-Färbung (GE-Amersham) nach den Vorgaben des Herstellers, lllumina Protokoll: Whole-Genome Gene Expression with IntelliHybTM Seal; Experienced User Card; Part # 1 1226030 Rev. B, lllumina Inc. Die Auslesung der Fluoreszenzsignale erfolgte mit dem lllumina® BeadArray Reader 500 und der entsprechenden lllumina Software„ BeadScan" (Version3.6.17).
7. Imageanalyse der Mikroarrays: Die mit Fluoreszenzfarbstoff gefärbten BeadChips werden mit dem lllumina® BeadArray Reader gescannt. Die resultierenden Bilder werden mittels der Software von lllumina® „Genome-Studio" (Version Genome Studio 2009.2) analysiert. Zur ersten Beurteilung der Hybridisierung werden technische Kontrollsignale abgefragt. Ein erster qualitativer Überblick wird mittels der Anzahl detektierter Gene und der mittleren Signalstärke pro Array gewonnen. Die Rohdaten werden einer Qualitätskontrolle und der statistischen Analyse unterzogen.
Datenanalyse und statistische Auswertung
Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version R 2.8.0 (R.app GUI 1 .26 (5256), S.Urbanek & S.M.Iacus, © R Foundation for Statistical Computing, 2008) durchgeführt, die unter www.r-proiect.org zur Verfügung steht [R Development Core Team (2006)]. Diese Software wird bevorzugt bei der Analyse von Genexpressionsdaten verwendet, da sie zahlreiche Algorithmen für die Bearbeitung dieser Art von Daten zur Verfügen stellt. Insbesondere konnten folgenden Software- Pakete in unserer Studie verwendet werden: lumi zum Einlesen der lllumina- Messwerte und der zugehörigen Gen-Annotation, vsn für Daten-Normalisierung (beide in Du u. a., 2008), fdrtool zum Bestimmen der falsch positiven Rate (Strimmer, 2008) und stats für die Durchführung statistischer Signifikanz-Tests, für Clustering und zum Visualisieren der Ergebnisse.
Die Analyse erfolgte in den folgenden Schritten. Die Rohdaten sowie zusätzlich verfügbare Annotationsdaten wurden eingelesen. Aufgrund von technisch bedingten Variationen bei der Probenbearbeitung sowie Abweichungen von Reagenzchargen, können die Fluoreszenzintensitäten verschiedener Proben in der Regel nicht direkt miteinander verglichen werden. Damit dies möglich wird, werden solche Variationen durch eine geeignete Normierung ausgeglichen. Es wurde eine varianzstabilisierende Transformation angewendet [Huber et al., 2002]
In die Datenanalyse wurden normalisierte und zur Basis 2 logarithmierte Messdaten einbezogen In der statistischen Analyse wurden 61 Proben der 6 Studiengruppen untersucht. Die Genexpression zwischen diesen Gruppen wurde mittels der Einweg- Varianzanalyse verglichen [Mardia u. a., 1979]. Dabei wurde geprüft, ob ein signifikanter Unterschied zwischen mindestens 2 der untersuchten Gruppen besteht. Der zugehörige Signifikanz- Test wurde, Gen für Gen, für 18517 Gensonden berechnet, die ein Signal mit detektierbarer Intensität für mindestens eine RNA-Probe lieferten. Die die Zahl falsch-positiver Tests wurde mittels der false discovery rate (FDR) [Storey et al. (2003)] bestimmt. Dabei wurde für jede Gensonde der so genannte q-Wert berechnet, der als die minimale FDR definiert ist, unter welcher die Sonde als signifikant verändert erscheint. Das verwendete Verfahren zur FDR- Kontrolle schätzte 87,5% der Gensonden als signifikant verändert. Das entspricht 16204 Sonden aus dem Pool der 18517 untersuchten.
Die Genexpressionsmuster der 6 Patientengruppen wurden weiter mittels des t-Tests paarweise verglichen. Der Test wurde Gen für Gen für insgesamt 15 Gruppenkombinationen angewandt. Dabei wurde die gleiche Gensonden-Auswahl berücksichtigt und die FDR-Kontrolle durchgeführt, die bei der Einweg- Varianzanalyse beschrieben wurde. Die Ergebnisse wurden in der Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3: Zusammenfassung der falsch positiven Raten (FDR) beim paarweise Vergleich aller Studien-Gruppen. In der Tabelle wird angegeben, wie viele Gensonden bei einem Vergleich einen FDR-Wert kleiner als die angegebene Schwelle erreicht haben. Die Interpretation wird am Beispiel erklärt: Beim Vergleich von NaS vs. NaL wurde eine Gruppe von 265 Genen mit FDR von 1% und weniger bestimmt, d.h. von den 265 Gensonden sind 2-3 falsch positiv.
Figure imgf000054_0001
Aus der Tabelle (letzte Spalte) folgt, dass die deutlichsten Unterschiede zwischen den Patienten mit einer Sepsis (LaS und SaS) und den Gruppen NaN (keine Entzündung) und NaL (nicht infektöse lokale Entzündung). Dagegen wurden wenig deutliche Unterschiede zwischen den Gruppenpaaren NaS und LaL, SaS und LaS sowie LaS und NaS. Beim Vergleich der Mengen von Gensonden, die im Vergleich LaS vs. NaS und NaS vs. LaL eine FDR < 0.1 erreichten, konnte keine Gensonden gefunden werden, die bei einer Infektion die gleiche Veränderung der Genexpression hatten. Somit konnten keine Gensonden aufgedeckt werden, die einen infektionsspezifischen Expressionsmuster aufzeigen. Es soll erwähnt werden, dass auch weitere statistische Vergleiche, darunter die 2-Wege-Varianzanalyse [Mardia u.a., 1979 zwischen den Gruppen NaL, NaS, LaL und LaS, sowie der Vergleich der Gruppen LaL und LaS vs. NaS, zum gleichen negativen Ergebnis führten. Überraschender Weise ermöglichten die paarweise Vergleiche die folgende Anordnung der Studien Gruppen: (1 ) NaN, (2) NaL, (3) LaL, (4) NaS, (5) LaS, (6) SaS. Diese Anordnung zeichnet sich dadurch aus, dass die benachbarten Gruppen sich statistisch in ihrer Expression nur wenig unterscheiden. Genauer gesagt, im statistischen Vergleich wurden ausreichend viele veränderte Gensonden gefunden, Gensonden-Gruppen mit einer ausreichend kleinen falsch positiven Rate (ca. 5%) konnte zwischen den benachbarten Gruppen nicht gefunden werden. Dieses Phänomen tritt dann auf, wenn sich die Gruppenmittelwerte unterscheiden, die Streuung der Gruppen aber so hoch ist, dass sie zu einer Überlappung der beiden verglichenen Gruppen führt. Je weiter die Gruppen voneinander liegen desto größer die Unterschiede werden. Es soll erwähnt werden, dass ohne die Bestimmung der Genexpression eine gerichtete Anordung der Studien-Gruppen möglich war.
Um die aufgedeckte Änderung der Genexpression innerhalb der Studiengruppen darzustellen, wurden aus dem ersten statistischen Vergleich, in dem Gruppenunterschiede mittels einer Einweg-Varianzanalyse im allgemeinen untersucht wurden, 8537 Gensonden in die weitere Analyse eingeschlossen. Dieser Auswahl lag eine Schätzung der falsch positiven Rate von 0.3% zugrunde. Dies wird statistisch so interpretiert, dass ca. 26 Sonden in der Auswahlliste von 8537 Sonden (eben 0.3%) falsch positiv sind. Jede Erweiterung der Auswahl würde zur einer höheren falsch positiven Rate führen. Die ausgewählten 8357 Gensonden adressieren insgesamt 7694 verschiedene RNA-Transkripte
Die Genexpression dieser Gensonden innerhalb der Studie wurde nach ihrer Ähnlichkeit in 9 Gencluster mittels des k-means Algorithmus gruppiert (Hartigan u. Wong, 1979). Dafür wurde die R-Funktion kmeans verwendet, die Expressionssignale im Voraus wurde Gen für Gen bzgl des Mittelwertes und der Streuung standardisiert. Die Schätzung der Clusterzahl erfolgte nach der 2. Ableitung der Fehlerfunktion (Kostenfunktion), die sich aus der Wiederholung des Clustering- Verfahrens für 1 bis 20 Cluster ergibt [Goutte u. a., 1999].
Die Patientengrupen wurden in der Reihenfolge (1 ) NaN, (2) NaL, (3) LaL, (4) NaS, (5) LaS, (6) SaS angeordnet. Am Ende wurden die 12 Genexpressionmuster aus den 8537 Gensonden der Verlaufsproben beider Patienten angereiht. Die sortierte Expressionsmatrix wurde in einem sogenannten Heatmap visualisiert. In Fig. 1 repräsentiert jede Zeile eine Gensonde und jede Spalte eine RNA Probe. Es stellt die relative Veränderung der Genexpression in Graustufen dar. So kodiert dunkelgrau bis schwarz eine niedrigere Expression und hellgrau bis weiß eine höhere Expression als im Mittel pro Gensonde bestimmt wurde. Die Cluster wurden von 1 bis 9 durchnummeriert, die Zahl in Klammern unter der Clusternummer gibt die Anzahl der Gensonden im Cluster an. Innerhalb eines Clusters wurden die Gensonden abfallend sortiert, so dass Sonden mit größten Unterschieden innerhalb der Studien-Gruppen am oberen Ende des Clusters angeordnet sind.
Aus der Fig. 1 ist ersichtlich, dass es einen Trend in der Expression von links nach rechts gibt. Von der Gruppe NaN zur Gruppe SaS nimmt die Expression in den Genclustern 1 bis 4 zu und in den Genclustern 5 bis 9 ab. Jedoch zeigt sich auch eine hohe Variabilität innerhalb der einzelnen Gruppen, insbesondere der NaS- Gruppe. Die Übergänge zwischen einzelnen Gruppen sind fließend, die Gruppen überlappen sich.
Der mittlere Unterschied zwischen den Gruppen NaN (keine akute Entzündung) und SaS (SIRS-Patienten mit einer bestätigten Blutstrominfektion) ist am deutlichsten. Dieser Unterschied wurde im nächsten Schritt mittels eines Abstandsmaßes quantifiziert (vgl. nächsten Abschnitt). Alle anderen Proben wurden nach ihrem Abstand zu diesen beiden Gruppen angeordnet. In der sortierten Heatmap, die in der Fig. 2 dargestellt ist, wird diese Anordnung visualisiert. Proben, die dem Muster der Gesunden ähnlicher waren, wurden links und Proben, die dem Muster der Intensivpatienten mit einer Blutinfektion ähnlicher waren, wurden rechts sortiert.
Das sortierte Heatmap zeigt, dass die Patientenproben überwiegend nach ihrer Gruppenzugehörigkeit in der oben aufgestellten Reihenfolge sortiert wurden, bzw. in benachbarte Gruppen eingemischt werden. Jedoch werden einzelne Proben in deutlich höhere bzw. niedrigere Ränge als die meisten Gruppenverträter einsortiert. Das Genexpressionsmuster des Heatmaps zeigt eine gleichzeitige Zu- und Abnahme der Genaktivität von NaN zur SaS. Die einzelnen Gencluster unterscheiden sich lediglich im Fortschreiten der Abweichung.
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Genexpression in besonderem Maße die Stärke der Wirtsantwort auf die durch eine Inflammation verursachte Belastung des Organismus widerspiegelt. Tatsächlich bedeutet eine Blutstrominfektion mit einer systemischen Inflammation die größte Belastung des Immunsystems. Eine ähnliche Belastung wird durch eine lokale Infektion entstehen, wenn das Immunsystem nicht im Stande ist an der Infektionsquelle die Erreger zu bekämpfen. Aber auch ein traumatisches Ereignis, z.B. eine schwere Operation, kann das Immunsystem kurzfristig an die Belastbarkeitsgrenze auslasten. Darüber hinaus bildet die Genexpression die Schwere der Wirtsanwort bei einer schwächeren Belastung, die durch eine lokale Inflammation verursacht wird, ab.
Wie bereits erwähnt, werden die selektierten Gene in lediglich 2 Gruppen aufgeteilt. In der einen Gruppe von 3041 Gensonden (36%) nimmt die Genexpression mit der Belastung des Immunsystems zu (Cluster 1 bis 4), in der anderen Gruppe von 5496 Gensonden (64%) ab (Cluster 5 bis 9). Aufgrund bekannter Referenzen [(vgl. Calvano u.a. (2005) und Foteinou u.a., 2008] würde man bei der Expressionszunahme von einer (pro- und anti-) inflammatorischen und bei der Expressionsabnahme von einer energetischen Antwort sprechen. Die energetische Erschöpfung bei anhaltender Inflammation führt zu einer unbändigen Immunantwort.
Quantifizierung der Schwere der Wirtsantwort
Die Sortierung des Heatmaps (vgl. ) erfolgte nach dem folgenden Score.
Für eine RNA-Probe sei X der zugehörige Genexpressionsvektor, der die Expressionssignale der ausgewählten Gensonden zusammenfasst. Man bezeichne mit d(Xi,X2) den euklidischen Abstand zwischen zwei Vektoren X1 und X2. Weiter bezeichne cor(Xi,X2) den Korrelationskoeffizienten zwischen X und X2 nach Pearson, der dem Cosinus-Wert des Winkels zwischen X1 und X2 entspricht [Mardia u.a., 1 979].
Der Score wird nach der folgenden Formel
, λ 100% , w λ
score(X)[%] =— · cor[X - mH,mS - mH )d(X ,mS - mH) Formel 1
d(mS, mH)
berechnet, wobei mH und mS die zwei Genexpressionsvektoren sind, die die Mittelwerte der Gruppen NaN (mH) und SaS (mS) Gen für Gen zusammenfassen. Der Score kann wie folgt veranschaulich werden. Aus den Abständen d(mS,mH), d(mS,X) und d(X,mH) wird ein Dreieck gebildet, dessen Ecken der Einfachheit halber mit X, mH unä mS bezeichnet werden (vgl. Fig. 3). Der Wert
Lx = cor(X— mH,mS— mH)d(X,mS— mH) definiert die Lage des Fußpunkts des Lots von der Ecke auf die Gerade, die durch d(mS,mH) bestimmt wird. Der Wert von Lx entspricht dem Abstand zwischen mH und diesem Lotfußpunkt. Er gibt auch an, wie weit die Ecke des Dreiecks von der Ecke mH entfernt ist, die Höhe des Dreiecks wird nicht bewertet.
Schließlich gibt der Score, der durch Formel 1 definiert ist, den relativen Anteil des Abstands Lx bzgl. der Distanz d(mS,mH). Tatsächlich enthält man aus der Formel 1 für X=mH. score{mH) = 0% und für X=mS: score{mS) = 100%.
In der Fig. 3 liegt die Probe 3 von mS weiter als mH entfernt und bekommt den Score-Wert von -9,3%. Die Probe 59 liegt von mH weiter als mS und bekommt den Score-Wert von 127,8%. Schließlich liegt die Probe 37 zwischen mH und mS und bekommt den Score-Wert von 27,7%. Den Wert von 50% würde eine Probe bekommen, die den gleichen Abstand zum mH und mS hat.
Der Abstand d(mS,mH) setzt sich aus den Abständen der einzelnen Gensonden additiv zusammen. Zerlegt man diesen Gesamabstand in zwei Komponenten, wobei die eine Komponente < (mS,mH) aus den Gensonden der Clustern 1 bis 4 und die andere d(mS,mH) aus den Gensonden der Clustern 5 bis 9 berechnet werden, so gewinnt man eine Information über den Beitrag der Expressionszu- und -abnähme an der Gesamtabweichung. Im von uns untersuchten Datensatz betrug die Zunahme, die von 36% der Gensonden repräsentiert wird, 51 % des Gesamtabstands. Die Abnahme, repräsentiert durch 64% aller Sonden, betrug 49% des Gesamtabstands. Somit nahm im Mittel die Expression einer Gensonden aus den Clustern 1 bis 4 mehr ab als in den Clustern 5 bis 9. Das Gesamtverhältnis der Zu- und Abnahme war etwa gleich. Wird das Verhältnis der Zu- und Abnahme für jede Probe berechnet, so gewinnt man eine Information über das Fortschreiten der Abweichung in die ausgezeichnete Richtung.
Die Fig. 4 zeigt, wie sich das Abstandsdreieck für die beiden Patienten-Fälle im Verlauf der Erkrankung bewegt, wobei der Index oberhalb der Dreieckspitze den Tag der Abnahme angibt und mit 0 die pre-operative Probe bezeichnet wird.
In der Fig. 5 wird der Score für alle Studien-Proben dargestellt. Die Studien-Gruppen und die beiden Verläufe wurden wie in der Fig. 1 angeordnet. Die schwarzen Punkte markieren den Score-Wert, die Balken die Abweichung von 7,5 Prozentpunkten nach oben und unten. Es soll erwähnt werden, dass der vorgeschlagene Score nicht der einzige ist, mit dem die Unterschiede in der Genexpression der Studiengruppen quantifiziert werden können. Der Vorteil dieses Scores liegt darin, dass damit ein relatives Maß definiert wird, nämlich einen prozentualen Anteil des Unterschieds, der zwischen der Genexpression zur Gruppe ohne akute Inflammation und SIRS-Patienten mit einer Blutinfektion ermittelt wurde. Der Score ist unabhängig von der Messplattform und von der Anzahl der verwendeten Genmarkern.
Obwohl der Score lediglich eine gleichzeitige Zu- und Abnahme der Genaktivität quantifiziert, wird er aus der Expression von mehreren Tausend von Genen berechnet. Die Ursache dafür liegt im untersuchten Phänomen. Die verwendeten Gene sind im Allgemeinen für unterschiedliche Prozesse zuständig. Daher kann die Expressionsabweichung vom Gesunden für ein einzelnes Gen verschiedene Ursachen haben. Das Schwarm-Verhalten vieler Gene in die ausgezeichnete Richtung spiegelt aber das quantitative Ausmaß der Immunbelastung wider.
An den Beispielen, in denen für 2 Patienten der postoperative Zustand beobachtet wurde, zeigt sich, dass der Score das momentane Ausmaß der Wirtsantwort erfasst. Daher kann er zur Überwachung/Monitoring verwendet werden. Tatsächlich verändert sich der Score für einen Patienten innerhalb von 6 Tagen vom Wert von ca. 20% bis ca. 90% Prozentpunkten. Darüber hinaus ist er zu allgemeiner Beurteilung der Immunbelastung geeignet. Tatsächlich zeigen die prä-operativen Proben von beiden Patienten einen erhöhten Score-Wert von über 20%. Dies kann eine der Ursachen für den an Komplikationen reichen postoperativen Verlauf sein.
Beispiel 2: Bestimmung der Schwere der Wirtsantwort bei Patienten mit einer akuten Inflammation mit einer reduzierten Anzahl von Markern
Genmarker-Auswahl basierend auf Simulationen
Für die Bestimmung der Stärke der Wirtsantwort wurde eine hohe Genmarkerzahl verwendet. Die untersuchten Gene sind im Allgemeinen für unterschiedliche Prozesse zuständig und die Expressionsabweichung vom Gesunden für ein einzelnes Gen hat verschiedene Ursachen. Je mehr Gene beobachtet werden, desto besser kann eine andere Ursache als die Belastung des Immunsystems für die Expressionsabweichung ausgeschlossen werden. Die Beobachtung aller relevanten Gene schließt andere Ursachen gänzlich aus. Es besteht jedoch eine begründete Vermutung, dass auch eine reduzierte Gensondenzahl ausreichend genug den Belastungszustand des Immunsystems widerspiegeln würde. Die Genzahl-Reduktion ist aber nur dann glaubwürdig, wenn der resultierende Score ausreichend nah am ursprünglichen Score (Master-Score) liegt. In unserer Studie konnte der Master- Score mit großer Genauigkeit aus den 4372 Gensonden ermittelt werden, deren mittlere Expression zwischen 2 Studiengruppen mindestes 0.8 betrug. Tatsächlich betrug die Abweichung nicht mehr als 1 Prozentpunkt. Wurde der Score aus den restlichen 4165 Gensonden berechnet, so lag die Abweichung unter 8 Prozentpunkten.
Da es keinen Algorithmus zur Markerauswahl gibt, ist es nahe liegend, über Computer-Simulationen zu prüfen, ob es eine bevorzugte Genzahl und Genmenge gibt, die den Master-Score abbilden. Um die Zahl der benötigten Gensonden abzuschätzen, wurden in ersten Simulationsläufen aus den 8357 Gensonden des Master-Scores zufällig maximal 1500 ausgewählt. Davon waren 36% aus den Clustern 1 bis 4 und 64% aus den Clustern 5 bis 9. Für jede Auswahl wurde der Score nach der Formel 1 für alle 73 RNA-Proben berechnet. Behalten wurden die Gensonden-Sets, deren Score nicht mehr als ±7.5 Prozentpunkte vom Master-Score abweichte. In 500 Wiederholungen wurden 241 solche Genmarker-Sets gefunden. In diesen Sets waren alle 8375 Gensonden vertreten. Das kürzeste Set enthielt 138 Gensonden. In nächsten 5000 Wiederholungen wurden maximal 150 Gensonden pro Lauf zufällig ausgewählt, ihre Verteilung über die Cluster war wie im ersten Lauf. Als Ergebnis erhielten wir 24 Sets mit der Länge von 86 bis 148 Gensonden, wobei die zugehörigen Score-Werte nicht mehr als ±7.5 Prozentpunkte vom Master-Score abweichten. Die Ergebnisse der Voruntersuchung zeigen, dass die Anzahl der Genmarker erheblich reduziert werden kann, wenn man eine sinnvolle Abweichung vom Master-Score akzeptiert. In den nachfolgend beschriebenen Simulationen wurde die maximale Gensondenzahl weiter reduziert. Die Ergebnisse dieser Simulationen wurden in der zusammengefasst.
In der ersten Simulation wurde wie folgt vorgegangen. Die Expressionsmatrix von 8357 Genmarkern und 61 Expressionsvektoren aus den 6 Studiengruppen wurde einer Hauptkomponentenanalyse (Mardia u.a., 1979) unterzogen. Dafür wurde die R- Funktion prcomp verwendet. Es wurden 512 Gensonden ausgesucht, die mit der ersten Hauptkomponente am stärksten korrelierten. Dabei waren 183 (36%) aus den Genclustern 1 bis 4 und 329 (64%) aus den Gencluster 5 bis 9. Damit wurde die Auswahlmenge auf Gensonden eingeschränkt, die am deutlichsten den untersuchten Trend in der Genexpressions-veränderung repräsentieren, wobei die Zu- und Abnahme im gleichen Verhältnis wie in der primären Auswahl standen.
Aus dieser Vorauswahl (512 Gensonden) wurden in 5000 Simulationsschritten zufällig 40 bis 50 Gensonden ausgewählt und aus ihnen nach der Formel 1 für alle 73 Genmuster der Score berechnet. Die Auswahl wurde verworfen, wenn die absolute Differenz zwischen dem Master-Score und dem neuem Score für mindestens eine Probe größer war als 7.5 Prozentpunkte. In anderem Fall wurde die Auswahl gespeichert. Diese Simulation lieferte 2 Gensonden-Sets, die die Bedingung erfüllten. Diese Mengen wurden als Set 1 und Set 2 in der über die zugehörige Sequenznummer beschrieben. Sie enthielten 49 und 47 Gensequenzen.
In nächsten 5000 Simulationschritten wurden die Gensonden-Tupels behalten, bei denen für 70 Proben (95%) der reduzierte Score vom Master-Score nicht mehr als 7.5 Prozentpunkte abweichte. In diesem Simulationsschritt wurden 14 verschiedene Kombinationen gefunden. Diese Mengen, als Set 3 bis Set 16 in der über die zugehörige Sequenznummer beschrieben, enthielten 46 bis 49 Gensequenzen.
In einer dritten Simulation wurde die Anzahl der zufällig ausgewählten Sonden auf maximal 20 reduziert und die Auswahl-Prozedur 50000 wiederholt. Behalten wurden ebenfalls die Gensonden-Tupels, bei denen für 70 Proben (95%) der reduzierte Score vom Master-Score nicht mehr als 7.5 Prozentpunkte abweichte. In dieser Simulation wurden 20 verschiedene Kombinationen gefunden, die die Auswahlbedingung erfüllten.
Diese Mengen, als Set 17 bis Set 36 in der über die zugehörigen Sequenznummer beschrieben, enthielten 18 bis 20 Gensequenzen.
Die Ergebnisse dieser Simulationen zeigen, dass der Score mit einer ausreichenden Genauigkeit auch aus einer deutlich geringeren Sondenzahl bestimmt werden kann. Tatsächlich erscheint ein Fehlerbalken von 15 Prozentpunkten (die einem Fehler von ± 7.5 Prozentpunkten entspricht) akzeptabel, wenn er zu einer erheblichen Reduktion der Genmarker-Zahl führt. Dabei muss berücksichtigt werden, dass auch der ursprüngliche Score zufälligen Schwankungen unterliegt und von der unterliegenden Stichprobe abhängt.
Darüber hinaus zeigen die Simulationen, dass es keine bevorzugten Gensonden gibt, die den Score bestimmen. Tatsächlich führen unterschiedliche Gensonden-Tupels zu ähnlicher Schätzung des Master-Scores. Tatsächlich enthält die insgesamt 423 verschiedene Sequenznummern.
Tabelle 4: Zusammenfassung der Gensonden-Tupel, die in Simulationen die beschriebenen Auswahl-Kriterien erfüllten. Die Sets wurden von 1 bis 36 durchnummeriert, die Zahl n in Klammern gibt die Anzahl der Sequenzen im Set an. Die sich anschließende Folge von Zahlen gibt die zugehörigen Sequenznummern aus dem Sequenzprotokoll an.
Set 1 (n=49) 508, 553, 61 1 , 679, 734, 769, 851 , 860, 871 , 896, 1 1 17, 1263, 1646, 1647, 1648, 1675, 1688, 1975, 201 1 , 2077, 2415, 2516, 2560, 2581 , 3381 , 3491 , 3820, 3947, 4156, 4230, 4506, 4576,
5012, 5235, 5614, 5730, 5803, 5873, 61 14, 6262, 6265, 6301 , 6689, 6738, 6820, 6847, 6879, 7069, 7230
Set 2 (n=47) 160, 309, 374, 428, 462, 91 1 , 937, 1039, 1092, 1 105, 1458, 1533, 1604, 1895, 1917, 1997, 2002, 2055, 2242, 2332, 2369, 2386, 2427, 2516, 2541 , 2560, 2785, 3359, 3407, 3624, 4230, 4587, 4636, 5164, 5235, 5247, 5371 , 5776, 6278, 6328, 6497, 6636, 7156, 7201 , 7230, 7314, 7450
Set 3 (n=48) 10, 366, 41 1 , 462, 493, 495, 567, 1204, 1226, 1409, 1414, 1449, 1487, 1583, 1724, 1744, 2013, 2055, 2064, 2208, 2248, 2692, 2891 , 3051 , 3624, 4156, 4205, 4510, 4587, 4923, 5176, 5373, 5400, 5435, 5873, 5912, 5954, 6041 , 6073, 6247, 6301 , 6478, 6525, 6923, 7207, 7450, 7670, 7681
Set 4 (n=47) 160, 359, 441 , 493, 522, 541 , 652, 691 , 1 128, 1408, 1583, 1651 , 1652, 1664, 1688, 2002, 2077, 2248, 2273, 2415, 2676, 2690, 2755, 2876, 3053, 3623, 4216, 4327, 4525, 4587, 4765, 4870, 5013, 5164, 5431 , 5614, 5950, 6098, 6265, 6432, 6497, 6981 , 7062, 7202, 7314, 7450, 7607
Set 5 (n=49) 97, 428, 441 , 543, 61 1 , 851 , 1 136, 1384, 1533, 1868, 1997, 2077, 2183, 2208, 2226, 2260, 2329, 2386, 2475, 2686, 2690, 2876, 3054, 3821 , 4000, 4357, 4479, 4530, 4636, 4765, 4923,
5013, 5137, 5204, 5760, 5776, 5819, 5873, 5908, 6005, 6099, 6242, 6417, 6499, 6585, 6847, 7450, 7670, 7681
Set 6 (n=48) 10, 97, 359, 475, 495, 627, 928, 1039, 1 1 17, 1248, 1384, 1408, 1472, 1652, 1675, 1744, 1868, 1918, 2370, 2423, 2537, 2742, 2865, 3051 , 3086, 3408, 3916, 4030, 4078, 4274, 4294, 4362, 4751 , 5129, 5235, 5247, 5431 , 5734, 5803, 581 1 , 5908, 5950, 6005, 6417, 6497, 6525, 6923, 7456
Set 7 (n=49) 32, 160, 383, 414, 493, 61 1 , 652, 679, 734, 885, 896, 946, 1 177, 1640, 1650, 1704, 1882, 2077, 2248, 2250, 2260, 2415, 2561 , 3086, 3488, 3623, 3624, 4135, 4156, 4160, 4510, 4525, 4530, 4742, 5137, 5204, 5247, 5730, 5950, 61 14, 6210, 6225, 6430, 6478, 6497, 6545, 6668, 7314, 7607
Set 8 (n=48) 359, 383, 515, 538, 544, 691 , 769, 813, 1024, 1039, 1092, 1409, 1519, 1640, 1649, 1665, 1696, 1731 , 1744, 2167, 2183, 2226, 2260, 2273, 2425, 2516, 2618, 2634, 2672, 3051 , 3168, 3202, 4160, 4754, 4966, 5373, 5465, 5493, 5541 , 5574, 5912, 6005, 6216, 6432, 6636, 6748, 6847, 7423
Set 9 (n=46) 160, 352, 544, 691 , 802, 885, 1 126, 1 147, 1 163, 1336, 1416, 1639, 1969, 2002, 2058, 2077, 2183, 2331 , 2332, 2426, 2526, 2742, 2855, 2860, 2891 , 3054, 3138, 3488, 3947, 4560, 4576, 4707, 4776, 5235, 5371 , 5400, 5431 , 5760, 5873, 6247, 6301 , 6417, 6673, 6820, 7447, 7604
Set 10 (n=49)8, 164, 462, 494, 495, 510, 545, 567, 61 1 , 679, 941 , 1039, 1 105, 1 128, 1 147, 1318, 1533, 1649, 1918, 1973, 1975, 201 1 , 2077, 2080, 2370, 2537, 3051 , 3202, 3676, 4274, 4587, 4928, 5204, 5373, 5431 , 5465, 5541 , 5734, 5908, 5912, 5950, 6278, 6417, 6497, 6668, 6673, 7156, 7230, 7670
Set 1 1 (n=46)89, 97, 160, 355, 359, 366, 374, 41 1 , 462, 475, 515, 538, 543, 691 , 1384, 1647, 1649, 1651 , 1724, 201 1 , 2058, 2064, 2242, 2369, 2859, 3414, 4000, 4742, 4765, 4870, 4966, 5040, 5232, 5247, 5276, 5373, 5431 , 5760, 5873, 5954, 6417, 6419, 6497, 6545, 6636, 7484
Set 12 (n=49)8, 89, 515, 543, 585, 769, 969, 1 126, 1 163, 1526, 1583, 1639, 1744, 2019, 2393, 2415, 2453, 2618, 2690, 2692, 2810, 2855, 2863, 3153, 3158, 3190, 3408, 4000, 4083, 4104, 4248, 4479, 4491 , 4550, 4661 , 4877, 4995, 5176, 5276, 5599, 5695, 6073, 61 14, 6265, 6417, 6499, 6585, 6632, 6673
Set 13 (n=48)414, 538, 946, 1263, 1384, 1512, 1895, 2077, 2248, 2260, 2516, 2676, 2975, 3168, 3414, 4083, 4274, 4776, 4800, 4919, 4923, 5179, 5204, 5431 , 5493, 5541 , 5619, 5695, 5819, 6005, 6073, 6099, 6210, 6247, 6265, 6350, 6417, 6432, 6499, 6536, 6545, 6636, 6668, 6689, 7040, 7062, 7472, 7604
Set 14 (n=47)383, 428, 538, 553, 691 , 814, 871 , 896, 91 1 , 937, 1426, 1639, 1685, 1688, 1983, 2093, 2253, 2260, 2454, 2516, 2587, 2672, 2761 , 2865, 2975, 3086, 3781 , 4000, 4030, 4308, 4510, 4636, 4923, 5137, 5235, 5574, 5776, 5819, 5908, 6226, 6278, 6417, 6632, 7202, 7230, 7315, 7456
Set 15 (n=46)97, 366, 383, 802, 1426, 1514, 1558, 1685, 1744, 1975, 201 1 , 2013, 2369, 2415, 2454, 2510, 2516, 2577, 2587, 2759, 2968, 3168, 3364, 3641 , 3780, 4083, 4230, 4294, 4587, 4638, 4817, 5040, 5164, 5276, 5371 , 5465, 5541 , 6073, 6098, 61 14, 6184, 6216, 6497, 6515, 7062, 7202
Set 16 (n=49) 10, 504, 541 , 553, 567, 652, 802, 1024, 1092, 1 136, 1 197, 1519, 1646, 1647, 1648, 1652, 2055, 2058, 2260, 2273, 2330, 2331 , 2415, 2491 , 2581 , 2618, 2676, 2742, 3053, 3408, 3652, 3915, 4216, 4870, 5235, 5641 , 5695, 5954, 61 14, 6278, 6419, 6461 , 6791 , 6820, 6847, 6923, 7428, 7604, 7670
Set 17 (n=20) 10, 160, 428, 871 , 941 , 1 136, 1 197, 1416, 1558, 1786, 1951 , 2386, 2510, 2560, 3488, 3652, 3781 , 5176, 5400, 6515
Set 18 (n=20)871 , 1 163, 1414, 1416, 1426, 1487, 2001 , 2055, 2369, 2386, 2552, 2577, 2865, 3051 , 4550, 4577, 5614, 6098, 7369, 7423
Set 19 (n=20)567, 958, 2226, 2250, 2260, 2427, 251 6, 3364, 4030, 4135, 5235, 5574, 5950, 61 14, 6226, 6267, 6278, 6418, 7069, 7518
Set 20 (n=20)409, 1647, 1648, 1770, 1883, 1951 , 2013, 2386, 2423, 3152, 3491 , 4205, 4577, 4661 , 4765, 4919, 7428, 7604
Set 21 (n=20)355, 480, 494, 667, 1492, 2475, 2855, 2948, 3155, 3158, 3408, 3780, 4661 , 51 13, 5232, 5368, 5574, 61 14, 6419, 6499
Set 22 (n=19)769, 1 163, 1472, 2077, 2370, 2759, 3488, 3567, 3737, 3780, 4230, 4245, 4274, 4550, 5950, 6497, 7069, 7109, 7681
Set 23 (n=20) 160, 164, 355, 41 1 , 1 106, 1408, 1675, 1679, 2386, 2453, 2516, 2810, 3168, 3202, 3652, 4230, 5574, 5986, 7428, 7484
Set 24 (n=19) 10, 164, 885, 1263, 1318, 1416, 1492, 1508, 1647, 1951 , 2250, 2560, 2785, 2827, 3086, 4506, 5137, 5575, 5954
Set 25 (n=19)32, 522, 679, 1519, 2001 , 2491 , 2516, 2676, 3412, 3737, 4205, 4294, 4560, 5235, 5954, 6005, 61 14, 6499, 6525
Set 26 (n=19)958, 1449, 1472, 1582, 2332, 2516, 2552, 2891 , 2975, 3168, 3190, 3683, 3820, 3947, 4245, 4530, 7040, 7069, 7145
Set 27 (n=20)428, 515, 544, 562, 567, 1263, 2002, 2332, 2526, 3438, 4577, 4754, 5574, 5614, 5912, 6328, 6515, 7156, 7423, 7456
Set 28 (n=20)355, 508, 937, 1263, 1973, 2002, 2510, 4078, 4156, 4550, 4673, 4817, 5247, 5368, 5730, 6005, 6247, 6515, 7201 , 7207
Set 29 (n=20) 10, 544, 871 , 1408, 1487, 1649, 2002, 2415, 2690, 2859, 2975, 3126, 4577, 4636, 5541 , 6073, 6417, 6432, 6866, 6879 Set 30 (n=20)896, 1248, 1318, 1472, 1786, 1830, 1983, 2386, 2865, 2975, 3641 , 3916, 4030, 4530, 4995, 5472, 5619, 6099, 6247, 6265
Set 31 (n=20)355, 462, 1416, 1983, 201 1 , 2183, 2248, 2618, 3190, 3412, 4490, 4576, 4776, 4923, 5164, 6101 , 61 14, 6278, 7314, 7369
Set 32 (n=20)310, 1226, 1895, 2248, 2427, 2516, 2552, 2690, 3086, 3438, 3915, 4216, 4587, 5235, 5276, 5954, 6265, 6478, 6515, 7207
Set 33 (n=20)493, 584, 633, 937, 2330, 2377, 2491 , 2587, 3153, 3683, 4216, 4248, 4530, 61 14, 6419, 6478, 6525, 6689, 7202, 7456
Set 34 (n=20) 10, 359, 383, 478, 626, 1472, 1487, 1 647, 2475, 3683, 3780, 4490, 4636, 5179, 5247, 5371 , 5950, 6748, 6923, 7670
Set 35 (n=20)97, 626, 1039, 1 163, 1426, 1617, 1704, 2002, 2248, 2690, 3168, 4216, 4638, 5247, 5614, 5950, 6265, 6461 , 6632, 7428
Set 36
(n=20) 366, 414, 544, 734, 1263, 1416, 2167, 2208, 2250, 2370, 2491 , 2526, 2855, 3190, 3488,
4083, 4248, 6673, 6845, 6847
Es soll bemerkt werden, dass die einzelnen in Tabelle 4 genannten Sets 1 bis 36 sowie die beiden folgenden Sets: Set 37 (n=10): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431 , 3043, 1665, 5776, 2902, 6585, 3167 und 745; und
Set 38 (n=7): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431 , 3043, 1665, 5776 und 7695 jeweils für sich genommen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, mit denen sich ein Score-Wert erhalten läßt, der lediglich in den Grenzen der vorliegenden Erfindung angegebenen Abweichung von einem Master- Score liegt, so dass die einzelnen Sets 1 bis 38 jeweils exakte Aussagen bezüglich des zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe eines Probanden oder Patienten ermöglichen.
Bevorzugte Genmarker-Tupel
In einer früheren nicht vorveröffentlichten Patentanmeldung DE10 2009 044 085 der Anmelderin wurden Genexpressions-Marker gefunden, die eine Infektion bei Patienten mit einem systemischen inflammatorischen Response-Syndrom (SIRS) anzeigen können (DE10 2009 044 085). Von den dort untersuchten 13 Genmarkern finden sich 6-7 Marker in der hier untersuchten Liste der 8537 Gensonden wieder. Die Erklärung dafür liegt darin, dass SIRS-Patienten mit einer Infektion häufiger einer hohen Immunbelastung ausgesetzt sind als SIRS-Patienten ohne eine Infektion. In den folgenden Schritten wird gezeigt, dass der aus der Expression dieser Marker und nach der Formel 1 berechnete Score die Wirtsantwort ähnlich wie der im 1 . Anwendungsbeispiel eingeführte Master-Score abbildet. Darüber hinaus wird gezeigt, dass durch die Erweiterung des Markersets die Abweichung vom Master-Score sehr deutlich reduziert werden kann.
In der Gen-Auswahl des 1 . Anwendungsbeispiels finden sich 6 Gensequenzen aus einer nicht vorveröffentlichten Anmeldung (DE10 2009 044 085) der Anmelderin, die hier durch ihre Symbole angegeben werden: TLR5 und CD59 im Heatmap-Cluster 2, CPVL und FGL2 im Heatmap-Cluster 5, HLA-DPA1 und IL7R im Heatmap-Cluster 6. Für einen weiteren Gemmarker (CLU) lieferte die auf dem Mikroarray-BeadChips HumanHT-12 v3 verwendete Gensonde keine Signale. Für diese 7 Genmarker lagen Expressionswerte für 67 Patienten-Proben aus der Tabelle 2 vor, die auf einer alternativen Plattform, der so genannten realtime PCR vermessen wurden. Aus der Liste von 8537 Gensonden wurde der Ersatz-Vertreter TFPI für CLU ausgesucht, dessen Expressionswerte auf dem Mikroarray mit den zum Marker CLU zugehörigen Expressionswerten auf der realtime PCR eine Korrelation von 0,8 (Korrelationskoeffizient nach Pearson) erreichten.
Aus der Genexpression der 73 untersuchten RNA-Proben, die auf dem Mikroarray für den 7-Tupel von Gensonden bestimmt wurde, haben wir den Score nach der Formel 1 berechnet. Seine Abweichung vom Master-Score betrug für die Hälfte der Proben maximal ±6 Prozentpunkte, für drei Viertel der Proben maximal ±1 1 Prozentpunkte und für 90% der Proben ±18.3 Prozentpunkte.
Im nächsten Schritt wurden diesem Set von 7 Markern nacheinander jeweils 1 Gensonde von den verbliebenen 8530 Gensonden zugefügt und der zugehörige Score nach der Formel 1 berechnet. Der Set wurde um die Sonde erweitert, die den kleinsten Fehler lieferte. Der Fehler wurde als der 95%-Quantil aller absoluten Abweichungen vom Master-Score definiert. Die Prozedur wurde wiederholt bis dieser Fehler kleiner als ±10 Prozentpunkte betrug. Dieser Fall trat auf, nach dem der Genmarker-Tupel auf 10 Gensonden ausgeweitet wurde. Die Werte des Scores für 7 und 10 Gensonden sowie der Master-Score wurden in der Tabelle 5 zusammengefasst. In dieser Tabelle sind weiter die zur Basis 2 logarithmieren Expressionssignale der zugehörigen Gensequenzen angegeben.
Tabelle 5: Score-Werte für 7 und 10 ausgewählte Gensonden im Vergleich zum Master-Score (Spalte 2 bis 4). Zur Basis 2 logarithmierten Exprssionswerte für 10 ausgewählte Gensonden, die durch die zugehörige Sequenznummer (2. Zeile), Accession (3. Zeile) und Symbol (4. Zeile) beschrieben sind. In der 5. Zeile wird das Heatmap-Cluster angegeben, in das die jeweilige Sonde eingeordnet wurde.
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Beispiel 3: Bestimmung der Schwere der Wirtsantwort auf alternativen Messplattformen
Wie im 2. Beispiel bereits erwähnt, wurden für 7 relevante Genmarker aus der Tabelle 5 und für 67 RNA-Proben, Genexpressions-Signale mittels einer realtime PCR vermessen. Dafür wurden die folgenden Mess- und Analyseschritte durchgeführt.
Real-Time-PCR
Verwendet wurde der Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG - Kit der Firma Invitrogen (Invitrogen Deutschland, Karlsruhe, BRD). Die Patienten-cDNA wurde 1 :25 mit Wasser verdünnt, davon wurde jeweils 1 μΙ in die PCR eingesetzt. Die Proben wurden jeweils in 3 Replikaten pipettiert.
PCR-Ansatz pro well (10 μΙ) 2μΙ Templat-cDNA 1 :100
1 μΙ forward primer, 10 mM
1 μΙ reverse primer, 10 mM
1 μΙ Fluorescein Reference Dye
5 μΙ Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG Es wurde ein Mastermix ohne Templat hergestellt, dieser wurde in 9 μΙ-Aliquots in die PCR-Platte aliquotiert, dazu wurden jeweils die Patienten-cDNAs pipettiert.
Das sich daran anschließende PCR-Programm bestand aus den folgenden Schritten:
95 °C 2 min (Aktivierung der Polymerase)
95 °C 10 sec (Denaturierung)
58 °C 15 sec (Anlagerung) O x
72 °C 20 sec (Extension) J
55 °C- 95 °C 10 sec (Erstellung der Schmelzkurve, χ
Erhöhung der Anfangstemperatur
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nach jedem Schritt um 1 °C)
Verwendet wurde das iQ 5 Multicolor Real-Time-PCR Detection System der Firma BIORAD mit der dazugehörigen Auswertungssoftware. Die so genannten Ct-Werte (geschätzte Anzahl der Zyklen beim Schwellenüberschritt) wurden als Messergebnis vom Programm automatisch im Bereich des linearen Anstiegs der Kurven berechnet. Die Messwerte wurden im String-Format abgespeichert.
Datenanalyse:
Die Datenanalyse wurde unter der freien Software R Project Version R 2.8.0 (R.app GUI 1 .26 (5256), S.Urbanek & S.M.Iacus, © R Foundation for Statistical Computing, 2008) durchgeführt, die unter www.r-proiect.org zur Verfügung steht (vgl. R Development Core Team, 2006).
Die in die Analyse eingegangenen Datenmatrizen der gemessenen Ct-Werte wurden wie folgt bearbeitet. Zusammen mit den Markergenen wurden 3 so genannte Housekeeper Gene vermessen, die als Referenzen verwendet wurden. Zum Normalisieren wurde für jede Probe der Mittelwert der 3 ausgewählten Housekeeper- Gene berechnet. Von diesem Wert wurde der Ct-Wert jedes einzelnen Markers abgezogen. Jeder so gewonnene Delta Ct Wert spiegelt die relative Abundanz des Targettranskriptes bezogen auf den Kaiibrator wider, wobei ein positiver Delta Ct Wert eine Abundanz höher als der Mittelwert der Referenzen und negativer Delta Ct Wert eine Abundanz kleiner als der Mittelwert der Referenzen bedeuten. Datenmatrix der normalisierten Delta Ct-Werte wurde in der Tabelle 6 zusammengefasst.
Nach der Formel 1 und der Beschreibung im 1 . Beispiel wurde aus den Expressionssignalen, die mittels realtime PCR vermessen wurden, der zugehörige Score zur Quantifizierung der Schwere der Wirtsantwort berechnet. Der Vergleich dieses Scores mit dem Master-Score wird in der Fig. 6 demonstriert, wobei der Master-Score durch den zugehörigen Fehlerbalken von 10 Prozentpunkten nach unten und oben und der aus der PCR Messung bestimmte Score als Raute-Zeichen dargestellt sind. Wie bereits im 1 . Beispiel beschrieben, ist die Berechungsvorschrift des Scores von der Anzahl der verwendeten Genmarker und der Messplattform unabhängig, für seine Berechnung benötigt man lediglich die mittleren Expressionssignale der Phänotyp-Gruppen NaN und SaS, die in Tabellel definiert wurden.
Wie aus der Fig. 6 ersichtlich, zeigt der Score, der aus der realtime PCR Messung von 7 Markern bestimmt wurde, einen ähnlichen Trend wie der Master-Score und gibt damit Hinweise auf die Schwere der Wirtsantwort unter einer akuten inflammatorischen Belastung des Organismus. Es soll erwähnt werden, dass die realtime PCR eine einfachere schnellere und günstigere Messplattform zur Bestimmung der Genexpression als ein Mikroarray ist. Ihre Limitierung liegt in der niedrigeren Anzahl der gleichzeitig messbaren Genmarker.
Tabelle 6: Zusammenfassung der bzgl. 3 Referenzen normalisierten Delta Ct-Werte für 7 ausgewählte Gensequenzen und 67 RNA-Proben. Die Proben ID bezieht sich auf Patienten- Proben, die in der Tabelle 2 dargestellt wurden.
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Beispiel 4: Differentielle Expression von Proteinen zur in-vitro Bestimmung eines Schweregrades der Host-Response (Wirtsantwort) von Patienten
Die differentielle Expression von Markern zur in-vitro Bestimmung eines Schweregrades der Host-Response von Patienten kann nicht nur anhand von transkriptomischen Markern erfolgen, sondern ebenfalls auf der Ebene von Proteinen. Für die Verwendung von Proteinen als Biomarker gibt es zahlreiche Beispiele, auf die bereits kurz eingegangen wurde (Pierrakos, 2010). Es wird ebenfalls darauf verwiesen, das einzelne Protein-Marker bislang keine zufriedenstellenden oder nur mittelmäßige Resultate liefern und dass Kombinationen von Proteinmarker bevorzugt Verwendung haben sollten.
Im Folgenden werden beispielhaft Experimente beschrieben, mit deren Ergebnis gezeigt werden kann, dass Protein-Marker gleichermaßen geeignet sind, um die in- vitro Bestimmung eines Schweregrades der Host-Response von Patienten zu bestimmen. Bevorzugt wurden Proteine für die Untersuchung ausgewählt, für deren Gentranskripte in vorangegangenen Beispielen schon gezeigt werden konnte, dass sie sich für den genannten Zweck eignen.
Untersuchte Patienten-Gruppen
Es wurden Proben von 9 Sepsis-Patienten, 3 Patienten nach Herzchirurgischen Eingriffen und 7 gesunden Probanden untersucht (EDTA Blut Proben). Die Patienten nach Herzchirurgischem Eingriff (ICU-Patienten) wurden nach klinischen Kriterien zum Zeitpunkt der Probennahme mit der Diagnose SIRS (Systemic Inflammatory Response Syndrome) klassifiziert. Die drei Patientengruppen repräsentieren die Phänotypen LaS und SaS (zusammen), NaS und NaN aus der Tabelle 1.
Experimentelle Durchführung
Aus den Blutproben wurden mit Hilfe eines Dichte-Gradienten (Lymphocyte Separation Medium LSM 1077, PAA Laboratories GmbH, Cölbe) zwei Zellpopulationen weißer Blutzellen isoliert: periphere einkernige Zellen {peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) und vielkernige Zellen {polymorphonuclear cells, PMNs). Die für die Experimente verwendeten Zellen stellten zwei Subpopulationen der PBMCs dar: die T-Lymphozyten und Monozyten.
Die Detektion der Proteine erfolgte mittels Durchflußzytometrie und Western Blot, wobei die Durchflußzytometrie für Oberflächenproteine und der Western Blot für intrazelluläre Proteine eingesetzt wurden. Für beide Methoden wurden bevorzugt monoklonale Antikörper verwendet.
Mittels Durchflußzytometrie (FACSCalibur Flow Cytometer, Becton Dickinson GmbH Heidelberg) wurde die Expression der Proteine von folgenden Genen auf T- Lymphozyten und Monozyten untersucht: CD59, HLA-DPA1 , IL7R, TLR5 und HLA- DR-Komplex. Die analysierten Blutproben setzten sich folgendermaßen zusammen: Sepsis-Patienten (n=9), ICU-Patienten (n=3) und gesunde Kontrollen (n=7). Die Unterscheidung von T-Lymphozyten und Monozyten erfolgte anhand zweier Oberflächenmarker: CD3-Korezeptor für T-Lymphozyten [Tsoukas et al., 1985] und CD14-Rezeptor für Monozyten [Goyert et al., 1988]. Außerdem wurden die Zellen anhand ihrer Zellgröße (FSC-H) und ihrer Granularität (SSC-H) identifiziert.
Mittels Western Blot wurde die Expression der Proteine aus folgenden Genen im Lysat der Gesamtpopulation der PBMCs bei Sepsis-Patienten und gesunden Probanden untersucht: FGL2, CLU und CPVL. Die Experimente wurden anhand von Standard-Western-Blot-Protokollen durchgeführt, Positiv-Kontrollen (Lysate von transfizierten Zellen) wurden immer mitgeführt und die Normalisierung der Experimente erfolgte anhand von ß-Aktin. Die anti-fibrinogen-like protein 2- (Produkt von FGL2-Gen), anti-clusterin- (Produkt von CLU-Gen) und anti-vitellogenic carboxypeptidase-like protein- (Produkt von CPVL-Gen) -Antikörper waren monoklonale Maus-Antikörper, der sekundäre Antikörper war ein HRP-gekoppelter Kaninchen-anti-Maus-Antikörper. Der Antikörper für ß-Aktin war ein monoklonaler (13E5) Kaninchen-Antikörper (Cell Signalling Technology Inc., Denvers USA).
Datenanalyse
Die Messdaten wurden von der Software der jeweiligen Messvorrichtung zur Verfügung gestellt. Sie wurden in der Tabelle 7 zusammengefasst. Die Expression einzelner Proteine wurde für die 2 bis 3 untersuchten Phanotypgruppen auf statistisch signifikante Unterschiede getestet. Dabei wurden wie im 1 . Ausführungsbeispiel die Einweg-Varianzanalyse (Anova) und der paarweise t-Test verwendet. Die Ergebnisse der Vergleiche sind am Ende der Tabelle 7 angereiht. Sie werden nachfolgend zusammengefasst.
In T-Lymphozyten war die Protein-Expression aus dem IL7R-Gen bei Sepsis- Patienten signifikant kleiner als bei gesunden Spendern. Damit zeigte sich eine Änderung in der gleichen Richtung wie in der Genexpression. Die Expression von MHC class II HLA-DPA1 antigen (Produkt aus HLA-DPA1 -Gen) war bei Sepsis- Patienten signifikant höher als bei gesunden Spendern. Damit zeigte sich eine Änderung in der entgegen gesetzter Richtung als in der Genexpression. Die T- Lymphozyten zeigten bei der Proteinexpression aus CD59-, TLR5- und HLA-DR- Genen keine signifikanten Unterschiede zwischen den untersuchten Phänotypgruppen.
Die Monozyten zeigten bei der Proteinexpression aus den Genen HLA-DPA1 und TLR5 keine Unterschiede in den 3 Gruppen; die Protein-Expression aus CD59- und HLA-DR-Gen war jedoch bei den gesunden Probanden signifikant höher als bei SIRS- und Sepsis-Patienten. Ein IL7R-Genprodukt war in Monozyten nicht nachweisbar.
Die Western-Blot-Analyse von PBMC-Lysaten zeigte, daß die Proteinexpression aus FGL2-Gen in Sepsis-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen signifikant erhöht, die Proteinexpression aus CLU-Gen bei Sepsis-Patienten jedoch reduziert ist. Damit zeigte sich für beide Proteine eine Änderung der Expression in der entgegen gesetzen Richtung als in der Genexpression. Ein CPVL-Genprodukt war in den Lysaten nicht nachweisbar.
Tabelle 7: Protein-Expressionswerte für ausgewählte Marker. Nicht gemessenen Werte wurden mit n.a. bezeichnet. Patienten-Mittelwerte, die sich vom Gesunden signifikant unterschieden, wurden entsprechend markiert („**" für p < 0,01 ,„*" für p<0,05, und„+" für p< 0,1).
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Zusammenfassung
Aus dem beschriebenen Beispiel wird ersichtlich, dass sich der Schweregrad der Wirtsantwort bei einer akuten Inflammation auch in der Expression von Proteinen aus ausgewählten Genen widerspiegelt. Die Ergebnisse der Genexpressionsanalyse stellen eine umfangreiche Sammlung von Markerkandidaten zur Verfügung. Daher liegt es nahe, einen geeigneten Schweregrad-Score aus der Proteinexpression zu bestimmen, der den im Beispiel 1 eingeführten Master-Score aus der Genexpression ausreichend ähnlich ist.
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Claims

Ansprüche Verfahren zum Identifizieren einer Teilmenge von Polynucleotiden aus einer dem Humangenom entsprechenden Ausgangsmenge von
Polynucleotiden zur in vitro Bestimmung eines Schweregrads der Host Response (Wirtsantwort) eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, in einer Probe, wobei eine Messvorrichtung verwendet wird, die eine Vielzahl von unterschiedlichen Gensonden aufweist, welche das im Wesentlichen gesamte Humangenom repräsentieren;
wobei
- Nucleinsäure-Proben einer Mehrzahl von Probanden, die einen
bekannten phänotypischen physiologischen Zustand aufweisen, mit den Sonden der Messvorrichtung in Kontakt gebracht werden, um Signale einer jeweiligen Expression eines Gens zu erhalten;
- aus der Gesamtzahl der eingesetzten Gensonden solche ausgewählt werden, die ein Expressionssignal mit detektierbarer Intensität für mindestens eine Nucleinsäure-Probe eines Probanden liefern;
- die Probanden je nach ihrem Infektions- und/oder Inflammationsstatus in wenigstens zwei der folgenden klinisch ermittelten Phänotypgruppen eingeteilt werden:
Figure imgf000087_0001
wo e „a e ne - er n p ung zw sc en en gensc a ten S, L und N darstellt; die Änderungen der Genexpressionssignale zwischen den
Phänotypgruppen statistisch verglichen werden und bewertet wird, ob ein signifikanter Unterschied zwischen mindestens zwei der
Phänotypgruppen besteht; solche Gensonden ausgewählt werden, deren Genexpressionssignale zwischen mindestens zwei Phänotypgruppen statistisch signifikant verändert sind und eine geschätzte Anzahl von solchen Gensonden ausgeschlossen wird, die in Bezug auf einen vorgegebenen Schwellwert ein falsch positives Ergebnis liefern; ein Master-Score als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, durch Quantifizierung der Zu- und Abnahme in der Genexpressionsintensität der ausgewählten
Gensonden ermittelt wird; und eine im Vergleich zur Ausgangsmenge erheblich reduzierte Anzahl von Polynucleotiden durch Ermittlung eines Scores identifiziert wird, der höchstens eine vorgegebene Abweichung vom Master-Score aufweist und der ebenfalls als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet, dient.
Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine
Messvorrichtung verwendet wird, die 20.000 bis 50.000 Gensonden aufweist und/oder die Messvorrichtung ein Biochip mit darauf matrixförmig immobilisierten Gensonden ist, wobei jeder einzelnen Gensonde
eineindeutig Ortskoordinaten auf dem Biochip zugeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Expressionssignale erhalten werden durch Hybridisierung und/oder Amplifikation, insbesondere PCR, bevorzugt quantitative PCR,
vorzugsweise Real-time PCR und/oder Proteinnachweis.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die 6 Phanotypgruppen aus der Tabelle 1 paarweise miteinander verglichen werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der statistisch signifikante Unterschied zwischen Gruppen, von denen mindestens eine Gruppe mehr als eine
Phänotypgruppe umfasst, ermittelt wird
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass ein vorgegebener Schwellwert für eine geschätzte Anzahl von Gensonden, die ein falsch positives Ergebnis liefern, im Bereich von 0,1 bis 5%, insbesondere ca. 0,3% der eingesetzten Anzahl der Gensonden liegt und die geschätzte Anzahl der falsch positiven Gensonden ausgeschlossen werden.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass als Master-Score der relative Abstand der
Genexpressionssignale bezüglich des euklidischen Abstandes zwischen dem Mittelwert mS der Phänotypgruppe SaS und dem Mittelwert mH der Phänotypgruppe NaN dient.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der relative Abstand wie folgt erhalten wird:
100%
score (X)[%] =—f · cor(X - mH,mS - mH)d{X,mS - mH)
d{mS,mH)
wobei mit d(Xj,X2) der euklidische Abstand und mit cor(Xj,X2) der Pearson- Korrelationskoeffizient zwischen zwei Vektoren Xi und X2 bezeichnet werden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der Score höchstens 5 bis 15 Prozentpunkte, insbesondere 10 Prozentpunkte vom Master-Score nach oben oder unten abweichen darf.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der Master-Score gebildet wird aus der Gruppe der Polynucleotide mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704.
1 1 . Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass folgende Teilmengen-Sets von Polynucleotiden erhalten werden, wobei„n" die Anzahl der Polynucleotide des jeweiligen Sets angibt:
Set 1 (n=49) ) SEQ-ID Nummern: 508, 553, 61 1 , 679, 734, 769, 851 , 860, 871 , 896, 1 1 17, 1263, 1646, 1647, 1648, 1675, 1688, 1975, 201 1 , 2077, 2415, 2516, 2560, 2581 , 3381 , 3491 , 3820, 3947, 4156, 4230, 4506, 4576, 5012, 5235, 5614, 5730, 5803, 5873, 61 14, 6262, 6265, 6301 , 6689, 6738, 6820, 6847, 6879, 7069, 7230
Set 2 (n=47) SEQ-ID Nummern: 160, 309, 374, 428, 462, 91 1 , 937, 1039, 1092, 1 105, 1458, 1533, 1604, 1895, 1917, 1997, 2002, 2055, 2242, 2332, 2369, 2386, 2427, 2516, 2541 , 2560, 2785, 3359, 3407, 3624, 4230, 4587, 4636, 5164, 5235, 5247, 5371 , 5776, 6278, 6328, 6497, 6636, 7156, 7201 , 7230, 7314, 7450
Set 3 (n=48) SEQ-ID Nummern: 10, 366, 41 1 , 462, 493, 495, 567, 1204, 1226, 1409, 1414, 1449, 1487, 1583, 1724, 1744, 2013, 2055, 2064, 2208, 2248, 2692, 2891 , 3051 , 3624, 4156, 4205, 4510, 4587, 4923, 5176, 5373, 5400, 5435, 5873, 5912, 5954, 6041 , 6073, 6247, 6301 , 6478, 6525, 6923, 7207, 7450, 7670, 7681
Set 4 (n=47) SEQ-ID Nummern: 160, 359, 441 , 493, 522, 541 , 652, 691 , 1 128, 1408, 1583, 1651 , 1652, 1664, 1688, 2002, 2077, 2248, 2273, 2415, 2676, 2690, 2755, 2876, 3053, 3623, 4216, 4327, 4525, 4587, 4765, 4870, 5013, 5164, 5431 , 5614, 5950, 6098, 6265, 6432, 6497, 6981 , 7062, 7202, 7314, 7450, 7607
Set 5 (n=49) SEQ-ID Nummern: 97, 428, 441 , 543, 61 1 , 851 , 1 136, 1384, 1533, 1868, 1997, 2077, 2183, 2208, 2226, 2260, 2329, 2386, 2475, 2686, 2690, 2876, 3054, 3821 , 4000, 4357, 4479, 4530, 4636, 4765, 4923, 5013, 5137, 5204, 5760, 5776, 5819, 5873, 5908, 6005, 6099, 6242, 6417, 6499, 6585, 6847, 7450, 7670, 7681
Set 6 (n=48) SEQ-ID Nummern: 10, 97, 359, 475, 495, 627, 928, 1039, 1 1 17, 1248, 1384, 1408, 1472, 1652, 1675, 1744, 1868, 1918, 2370, 2423, 2537, 2742, 2865, 3051 , 3086, 3408, 3916, 4030, 4078, 4274, 4294, 4362, 4751 , 5129, 5235, 5247, 5431 , 5734, 5803, 581 1 , 5908, 5950, 6005, 6417, 6497, 6525, 6923, 7456
Set 7 (n=49) SEQ-ID Nummern: 32, 160, 383, 414, 493, 61 1 , 652, 679, 734, 885, 896, 946, 1 177, 1640, 1650, 1704, 1882, 2077, 2248, 2250, 2260, 2415, 2561 , 3086, 3488, 3623, 3624, 4135, 4156, 4160, 4510, 4525, 4530, 4742, 5137, 5204, 5247, 5730, 5950, 61 14, 6210, 6225, 6430, 6478, 6497, 6545, 6668, 7314, 7607
Set 8 (n=48) SEQ-ID Nummern: 359, 383, 515, 538, 544, 691 , 769, 813, 1024, 1039, 1092, 1409, 1519, 1640, 1649, 1665, 1696, 1731 , 1744, 2167, 2183, 2226, 2260, 2273, 2425, 2516, 2618, 2634, 2672, 3051 , 3168, 3202, 4160, 4754, 4966, 5373, 5465, 5493, 5541 , 5574, 5912, 6005, 6216, 6432, 6636, 6748, 6847, 7423
Set 9 (n=46) SEQ-ID Nummern: 160, 352, 544, 691 , 802, 885, 1 126, 1 147, 1 163, 1336, 1416, 1639, 1969, 2002, 2058, 2077, 2183, 2331 , 2332, 2426, 2526, 2742, 2855, 2860, 2891 , 3054, 3138, 3488, 3947, 4560, 4576, 4707, 4776, 5235, 5371 , 5400, 5431 , 5760, 5873, 6247, 6301 , 6417, 6673, 6820, 7447, 7604 Set 10 (n=49) SEQ-ID Nummern: 8, 164, 462, 494, 495, 510, 545, 567, 61 1 , 679, 941 , 1039, 1 105, 1 128, 1 147, 1318, 1533, 1649, 1918, 1973, 1975, 201 1 , 2077, 2080, 2370, 2537, 3051 , 3202, 3676, 4274, 4587, 4928, 5204, 5373, 5431 , 5465, 5541 , 5734, 5908, 5912, 5950, 6278, 6417, 6497, 6668, 6673, 7156, 7230, 7670
Set 1 1 (n=46) SEQ-ID Nummern: 89, 97, 160, 355, 359, 366, 374, 41 1 , 462, 475, 515, 538, 543, 691 , 1384, 1647, 1649, 1651 , 1724, 201 1 , 2058, 2064, 2242, 2369, 2859, 3414, 4000, 4742, 4765, 4870, 4966, 5040, 5232, 5247, 5276, 5373, 5431 , 5760, 5873, 5954, 6417, 6419, 6497, 6545, 6636, 7484
Set 12 (n=49) SEQ-ID Nummern: 8, 89, 515, 543, 585, 769, 969, 1 126, 1 163, 1526, 1583, 1639, 1744, 2019, 2393, 2415, 2453, 2618, 2690, 2692, 2810, 2855, 2863, 3153, 3158, 3190, 3408, 4000, 4083, 4104, 4248, 4479, 4491 , 4550, 4661 , 4877, 4995, 5176, 5276, 5599, 5695, 6073, 61 14, 6265, 6417, 6499, 6585, 6632, 6673
Set 13 (n=48) SEQ-ID Nummern: 414, 538, 946, 1263, 1384, 1512, 1895, 2077, 2248, 2260, 2516, 2676, 2975, 3168, 3414, 4083, 4274, 4776, 4800, 4919, 4923, 5179, 5204, 5431 , 5493, 5541 , 5619, 5695, 5819, 6005, 6073, 6099, 6210, 6247, 6265, 6350, 6417, 6432, 6499, 6536, 6545, 6636, 6668, 6689, 7040, 7062, 7472, 7604
Set 14 (n=47) SEQ-ID Nummern: 383, 428, 538, 553, 691 , 814, 871 , 896, 91 1 , 937, 1426, 1639, 1685, 1688, 1983, 2093, 2253, 2260, 2454, 2516, 2587, 2672, 2761 , 2865, 2975, 3086, 3781 , 4000, 4030, 4308, 4510, 4636, 4923, 5137, 5235, 5574, 5776, 5819, 5908, 6226, 6278, 6417, 6632, 7202, 7230, 7315, 7456
Set 15 (n=46) SEQ-ID Nummern: 97, 366, 383, 802, 1426, 1514, 1558, 1685, 1744, 1975, 201 1 , 2013, 2369, 2415, 2454, 2510, 2516, 2577, 2587, 2759, 2968, 3168, 3364, 3641 , 3780, 4083, 4230, 4294, 4587, 4638, 4817, 5040, 5164, 5276, 5371 , 5465, 5541 , 6073, 6098, 61 14, 6184, 6216, 6497, 6515, 7062, 7202
Set 16 (η=49) SEQ-ID Nummern: 10, 504, 541 , 553, 567, 652, 802, 1024, 1092, 1 136, 1 197, 1519, 1646, 1647, 1648, 1652, 2055, 2058, 2260, 2273, 2330, 2331 , 2415, 2491 , 2581 , 2618, 2676, 2742, 3053, 3408, 3652, 3915, 4216, 4870, 5235, 5641 , 5695, 5954, 61 14, 6278, 6419, 6461 , 6791 , 6820, 6847, 6923, 7428, 7604, 7670
Set 17 (η=20) SEQ-ID Nummern: 10, 160, 428, 871 , 941 , 1 136, 1 197, 1416, 1558, 1786, 1951 , 2386, 2510, 2560, 3488, 3652, 3781 , 5176, 5400, 6515
Set 18 (η=20) SEQ-ID Nummern: 871 , 1 163, 1414, 1416, 1426, 1487, 2001 , 2055, 2369, 2386, 2552, 2577, 2865, 3051 , 4550, 4577, 5614, 6098, 7369, 7423
Set 19 (η=20) SEQ-ID Nummern: 567, 958, 2226, 2250, 2260, 2427, 2516, 3364, 4030, 4135, 5235, 5574, 5950, 61 14, 6226, 6267, 6278, 6418, 7069, 7518
Set 20 (η=20) SEQ-ID Nummern: 409, 1647, 1648, 1770, 1883, 1951 , 2013, 2386, 2423, 3152, 3491 , 4205, 4577, 4661 , 4765, 4919, 7428, 7604
Set 21 (η=20) SEQ-ID Nummern: 355, 480, 494, 667, 1492, 2475, 2855, 2948, 3155, 3158, 3408, 3780, 4661 , 51 13, 5232, 5368, 5574, 61 14, 6419, 6499
Set 22 (n=19) SEQ-ID Nummern: 769, 1 163, 1472, 2077, 2370, 2759, 3488, 3567, 3737, 3780, 4230, 4245, 4274, 4550, 5950, 6497, 7069, 7109, 7681 Set 23 (n=20) SEQ-ID Nummern: 160, 164, 355, 41 1 , 1 106, 1408, 1675, 1679, 2386, 2453, 2516, 2810, 3168, 3202, 3652, 4230, 5574, 5986, 7428, 7484
Set 24 (n=19) SEQ-ID Nummern: 10, 164, 885, 1263, 1318, 1416, 1492, 1508, 1647, 1951 , 2250, 2560, 2785, 2827, 3086, 4506, 5137, 5575, 5954
Set 25 (n=19) SEQ-ID Nummern: 32, 522, 679, 1519, 2001 , 2491 , 2516, 2676, 3412, 3737, 4205, 4294, 4560, 5235, 5954, 6005, 61 14, 6499, 6525
Set 26 (n=19) SEQ-ID Nummern: 958, 1449, 1472, 1582, 2332, 2516, 2552, 2891 , 2975, 3168, 3190, 3683, 3820, 3947, 4245, 4530, 7040, 7069, 7145
Set 27 (n=20) SEQ-ID Nummern: 428, 515, 544, 562, 567, 1263, 2002, 2332, 2526, 3438, 4577, 4754, 5574, 5614, 5912, 6328, 6515, 7156, 7423, 7456
Set 28 (n=20) SEQ-ID Nummern: 355, 508, 937, 1263, 1973, 2002, 2510, 4078, 4156, 4550, 4673, 4817, 5247, 5368, 5730, 6005, 6247, 6515, 7201 , 7207
Set 29 (n=20) SEQ-ID Nummern: 10, 544, 871 , 1408, 1487, 1649, 2002, 2415, 2690, 2859, 2975, 3126, 4577, 4636, 5541 , 6073, 6417, 6432, 6866, 6879
Set 30 (n=20) SEQ-ID Nummern: 896, 1248, 1318, 1472, 1786, 1830, 1983, 2386, 2865, 2975, 3641 , 3916, 4030, 4530, 4995, 5472, 5619, 6099, 6247, 6265
Set 31 (n=20) SEQ-ID Nummern: 355, 462, 1416, 1983, 201 1 , 2183, 2248, 2618, 3190, 3412, 4490, 4576, 4776, 4923, 5164, 6101 , 61 14, 6278, 7314, 7369 Set 32 (n=20) SEQ-ID Nummern: 310, 1226, 1895, 2248, 2427, 2516, 2552, 2690, 3086, 3438, 3915, 4216, 4587, 5235, 5276, 5954, 6265, 6478, 6515, 7207
Set 33 (n=20) SEQ-ID Nummern: 493, 584, 633, 937, 2330, 2377, 2491 , 2587, 3153, 3683, 4216, 4248, 4530, 61 14, 6419, 6478, 6525, 6689, 7202, 7456
Set 34 (n=20) SEQ-ID Nummern: 10, 359, 383, 478, 626, 1472, 1487, 1647, 2475, 3683, 3780, 4490, 4636, 5179, 5247, 5371 , 5950, 6748, 6923, 7670
Set 35 (n=20) SEQ-ID Nummern: 97, 626, 1039, 1 163, 1426, 1617, 1704, 2002, 2248, 2690, 3168, 4216, 4638, 5247, 5614, 5950, 6265, 6461 , 6632, 7428
Set 36 (n=20) SEQ-ID Nummern: 366, 414, 544, 734, 1263, 1416, 2167, 2208, 2250, 2370, 2491 , 2526, 2855, 3190, 3488, 4083, 4248, 6673, 6845, 6847
Set 37 (n=10): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431 , 3043, 1665, 5776, 2902, 6585, 3167 und 745;
Set 38 (n=7): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431 , 3043, 1665, 5776 und 7695.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass
Fragmente der Polynucleotide eingesetzt werden, insbesondere solche mit Längen von 20 bis 1000, insbesondere 15 bis 500 Nucleotiden,
vorzugsweise 15 bis 200, bevorzugt 20 bis 200 Nucleotiden und/oder Fragmenten, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 20 %, vorzugsweise ca. 50% besonders bevorzugt ca. 80 % zu den
Polynucleotiden aufweisen.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass eine Reihe von Score-Werten gemessen werden, die jeweils zu unterschiedlichen Zeitpunkten gehören, um den zeitlichen Verlauf des Schweregrads der Host Response eines Patienten, der sich in einem akut infektiösen und/oder inflammatorischen Zustand befindet, zu erfassen.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der akut infektiöse Zustand wenigstens einen der folgenden pathophysiologischen Zustände umfasst: Abszesse;
Bakteriämien; postoperative Infektionen; Wundinfektionen; lokale
Infektionen; systemische Infektionen; Sepsis; schwere Sepsis; septischer Schock.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der akut inflammatorische Zustand wenigstens einen der folgenden pathophysiologischen Zustände umfasst: Traumata; Verbrennungen;
Strahlenschäden; toxische Schäden; Ischämie-Reperfusionsschäden; akute Abstoßungsreaktionen; inflammatorische Darmerkrankungen;
onkologische Erkrankungen; postoperative Zustände; lokale Inflammation; systemische Inflammation; SIRS; allergische Reaktionen; anaphylaktischer Schock.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der Score zur Diagnose, Vorhersage der
Entwicklung oder der Überwachung des akut infektiösen und/oder inflammatorischen Zustandes eines Patienten und/oder der
Therapieverlaufskontrolle und/oder zur Fokuskontrolle, verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der Score verwendet wird, um eine Chance für eine Recovery oder Non-Recovery eines Patienten mit akut infektiösem und/oder akut inflammatorischem Zustand anzugeben.
18. Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut inflammatorischen Zustand befindet.
19. Verwendung von k-Tupeln an Polynucleotiden, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der Polynucleotide m in der Gruppe ist; zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 18.
20. Verwendung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der folgenden Teilmengen-Sets von Polynucleotiden verwendet werden, wobei„n" die Anzahl der Polynucleotide des jeweiligen Sets angibt:
Set 1 (n=49) ) SEQ-ID Nummern: 508, 553, 61 1 , 679, 734, 769, 851 , 860, 871 , 896, 1 1 17, 1263, 1646, 1647, 1648, 1675, 1688, 1975, 201 1 , 2077, 2415, 2516, 2560, 2581 , 3381 , 3491 , 3820, 3947, 4156, 4230, 4506, 4576, 5012, 5235, 5614, 5730, 5803, 5873, 61 14, 6262, 6265, 6301 , 6689, 6738, 6820, 6847, 6879, 7069, 7230
Set 2 (n=47) SEQ-ID Nummern: 160, 309, 374, 428, 462, 91 1 , 937, 1039, 1092, 1 105, 1458, 1533, 1604, 1895, 1917, 1997, 2002, 2055, 2242, 2332, 2369, 2386, 2427, 2516, 2541 , 2560, 2785, 3359, 3407, 3624, 4230, 4587, 4636, 5164, 5235, 5247, 5371 , 5776, 6278, 6328, 6497, 6636, 7156, 7201 , 7230, 7314, 7450
Set 3 (n=48) SEQ-ID Nummern: 10, 366, 41 1 , 462, 493, 495, 567, 1204, 1226, 1409, 1414, 1449, 1487, 1583, 1724, 1744, 2013, 2055, 2064, 2208, 2248, 2692, 2891 , 3051 , 3624, 4156, 4205, 4510, 4587, 4923, 5176, 5373, 5400, 5435, 5873, 5912, 5954, 6041 , 6073, 6247, 6301 , 6478, 6525, 6923, 7207, 7450, 7670, 7681
Set 4 (n=47) SEQ-ID Nummern: 160, 359, 441 , 493, 522, 541 , 652, 691 , 1 128, 1408, 1583, 1651 , 1652, 1664, 1688, 2002, 2077, 2248, 2273, 2415, 2676, 2690, 2755, 2876, 3053, 3623, 4216, 4327, 4525, 4587, 4765, 4870, 5013, 5164, 5431 , 5614, 5950, 6098, 6265, 6432, 6497, 6981 , 7062, 7202, 7314, 7450, 7607
Set 5 (n=49) SEQ-ID Nummern:97, 428, 441 , 543, 61 1 , 851 , 1 136, 1384, 1533, 1868, 1997, 2077, 2183, 2208, 2226, 2260, 2329, 2386, 2475, 2686, 2690, 2876, 3054, 3821 , 4000, 4357, 4479, 4530, 4636, 4765, 4923, 5013, 5137, 5204, 5760, 5776, 5819, 5873, 5908, 6005, 6099, 6242, 6417, 6499, 6585, 6847, 7450, 7670, 7681
Set 6 (n=48) SEQ-ID Nummern:10, 97, 359, 475, 495, 627, 928, 1039, 1 1 17, 1248, 1384, 1408, 1472, 1652, 1675, 1744, 1868, 1918, 2370, 2423, 2537, 2742, 2865, 3051 , 3086, 3408, 3916, 4030, 4078, 4274, 4294, 4362, 4751 , 5129, 5235, 5247, 5431 , 5734, 5803, 581 1 , 5908, 5950, 6005, 6417, 6497, 6525, 6923, 7456
Set 7 (n=49) SEQ-ID Nummern: 32, 160, 383, 414, 493, 61 1 , 652, 679, 734, 885, 896, 946, 1 177, 1640, 1650, 1704, 1882, 2077, 2248, 2250, 2260, 2415, 2561 , 3086, 3488, 3623, 3624, 4135, 4156, 4160, 4510, 4525, 4530, 4742, 5137, 5204, 5247, 5730, 5950, 61 14, 6210, 6225, 6430, 6478, 6497, 6545, 6668, 7314, 7607 Set 8 (n=48) SEQ-ID Nummern: 359, 383, 515, 538, 544, 691 , 769, 813, 1024, 1039, 1092, 1409, 1519, 1640, 1649, 1665, 1696, 1731 , 1744, 2167, 2183, 2226, 2260, 2273, 2425, 2516, 2618, 2634, 2672, 3051 , 3168, 3202, 4160, 4754, 4966, 5373, 5465, 5493, 5541 , 5574, 5912, 6005, 6216, 6432, 6636, 6748, 6847, 7423
Set 9 (n=46) SEQ-ID Nummern: 160, 352, 544, 691 , 802, 885, 1 126, 1 147, 1 163, 1336, 1416, 1639, 1969, 2002, 2058, 2077, 2183, 2331 , 2332, 2426, 2526, 2742, 2855, 2860, 2891 , 3054, 3138, 3488, 3947, 4560, 4576, 4707, 4776, 5235, 5371 , 5400, 5431 , 5760, 5873, 6247, 6301 , 6417, 6673, 6820, 7447, 7604
Set 10 (n=49) SEQ-ID Nummern: 8, 164, 462, 494, 495, 510, 545, 567, 61 1 , 679, 941 , 1039, 1 105, 1 128, 1 147, 1318, 1533, 1649, 1918, 1973, 1975, 201 1 , 2077, 2080, 2370, 2537, 3051 , 3202, 3676, 4274, 4587, 4928, 5204, 5373, 5431 , 5465, 5541 , 5734, 5908, 5912, 5950, 6278, 6417, 6497, 6668, 6673, 7156, 7230, 7670
Set 1 1 (n=46) SEQ-ID Nummern: 89, 97, 160, 355, 359, 366, 374, 41 1 , 462, 475, 515, 538, 543, 691 , 1384, 1647, 1649, 1651 , 1724, 201 1 , 2058, 2064, 2242, 2369, 2859, 3414, 4000, 4742, 4765, 4870, 4966, 5040, 5232, 5247, 5276, 5373, 5431 , 5760, 5873, 5954, 6417, 6419, 6497, 6545, 6636, 7484
Set 12 (n=49) SEQ-ID Nummern: 8, 89, 515, 543, 585, 769, 969, 1 126, 1 163, 1526, 1583, 1639, 1744, 2019, 2393, 2415, 2453, 2618, 2690, 2692, 2810, 2855, 2863, 3153, 3158, 3190, 3408, 4000, 4083, 4104, 4248, 4479, 4491 , 4550, 4661 , 4877, 4995, 5176, 5276, 5599, 5695, 6073, 61 14, 6265, 6417, 6499, 6585, 6632, 6673
Set 13 (n=48) SEQ-ID Nummern: 414, 538, 946, 1263, 1384, 1512, 1895, 2077, 2248, 2260, 2516, 2676, 2975, 3168, 3414, 4083, 4274, 4776, 4800, 4919, 4923, 5179, 5204, 5431 , 5493, 5541 , 5619, 5695, 5819, 6005, 6073, 6099, 6210, 6247, 6265, 6350, 6417, 6432, 6499, 6536, 6545, 6636, 6668, 6689, 7040, 7062, 7472, 7604
Set 14 (n=47) SEQ-ID Nummern: 383, 428, 538, 553, 691 , 814, 871 , 896, 91 1 , 937, 1426, 1639, 1685, 1688, 1983, 2093, 2253, 2260, 2454, 2516, 2587, 2672, 2761 , 2865, 2975, 3086, 3781 , 4000, 4030, 4308, 4510, 4636, 4923, 5137, 5235, 5574, 5776, 5819, 5908, 6226, 6278, 6417, 6632, 7202, 7230, 7315, 7456
Set 15 (n=46) SEQ-ID Nummern: 97, 366, 383, 802, 1426, 1514, 1558, 1685, 1744, 1975, 201 1 , 2013, 2369, 2415, 2454, 2510, 2516, 2577, 2587, 2759, 2968, 3168, 3364, 3641 , 3780, 4083, 4230, 4294, 4587, 4638, 4817, 5040, 5164, 5276, 5371 , 5465, 5541 , 6073, 6098, 61 14, 6184, 6216, 6497, 6515, 7062, 7202
Set 16 (n=49) SEQ-ID Nummern: 10, 504, 541 , 553, 567, 652, 802, 1024, 1092, 1 136, 1 197, 1519, 1646, 1647, 1648, 1652, 2055, 2058, 2260, 2273, 2330, 2331 , 2415, 2491 , 2581 , 2618, 2676, 2742, 3053, 3408, 3652, 3915, 4216, 4870, 5235, 5641 , 5695, 5954, 61 14, 6278, 6419, 6461 , 6791 , 6820, 6847, 6923, 7428, 7604, 7670
Set 17 (n=20) SEQ-ID Nummern: 10, 160, 428, 871 , 941 , 1 136, 1 197, 1416, 1558, 1786, 1951 , 2386, 2510, 2560, 3488, 3652, 3781 , 5176, 5400, 6515
Set 18 (n=20) SEQ-ID Nummern:871 , 1 163, 1414, 1416, 1426, 1487, 2001 , 2055, 2369, 2386, 2552, 2577, 2865, 3051 , 4550, 4577, 5614, 6098, 7369, 7423
Set 19 (n=20) SEQ-ID Nummern: 567, 958, 2226, 2250, 2260, 2427, 2516, 3364, 4030, 4135, 5235, 5574, 5950, 61 14, 6226, 6267, 6278, 6418, 7069, 7518 Set 20 (n=20) SEQ-ID Nummern: 409, 1647, 1648, 1770, 1883, 1951 , 2013, 2386, 2423, 3152, 3491 , 4205, 4577, 4661 , 4765, 4919, 7428, 7604
Set 21 (n=20) SEQ-ID Nummern: 355, 480, 494, 667, 1492, 2475, 2855, 2948, 3155, 3158, 3408, 3780, 4661 , 51 13, 5232, 5368, 5574, 61 14, 6419, 6499
Set 22 (n=19) SEQ-ID Nummern: 769, 1 163, 1472, 2077, 2370, 2759, 3488, 3567, 3737, 3780, 4230, 4245, 4274, 4550, 5950, 6497, 7069, 7109, 7681
Set 23 (n=20) SEQ-ID Nummern: 160, 164, 355, 41 1 , 1 106, 1408, 1675, 1679, 2386, 2453, 2516, 2810, 3168, 3202, 3652, 4230, 5574, 5986, 7428, 7484
Set 24 (n=19) SEQ-ID Nummern: 10, 164, 885, 1263, 1318, 1416, 1492, 1508, 1647, 1951 , 2250, 2560, 2785, 2827, 3086, 4506, 5137, 5575, 5954
Set 25 (n=19) SEQ-ID Nummern: 32, 522, 679, 1519, 2001 , 2491 , 2516, 2676, 3412, 3737, 4205, 4294, 4560, 5235, 5954, 6005, 61 14, 6499, 6525
Set 26 (n=19) SEQ-ID Nummern: 958, 1449, 1472, 1582, 2332, 2516, 2552, 2891 , 2975, 3168, 3190, 3683, 3820, 3947, 4245, 4530, 7040, 7069, 7145
Set 27 (n=20) SEQ-ID Nummern: 428, 515, 544, 562, 567, 1263, 2002, 2332, 2526, 3438, 4577, 4754, 5574, 5614, 5912, 6328, 6515, 7156, 7423, 7456
Set 28 (n=20) SEQ-ID Nummern: 355, 508, 937, 1263, 1973, 2002, 2510, 4078, 4156, 4550, 4673, 4817, 5247, 5368, 5730, 6005, 6247, 6515, 7201 , 7207 Set 29 (n=20) SEQ-ID Nummern: 10, 544, 871 , 1408, 1487, 1649, 2002, 2415, 2690, 2859, 2975, 3126, 4577, 4636, 5541 , 6073, 6417, 6432, 6866, 6879
Set 30 (n=20) SEQ-ID Nummern: 896, 1248, 1318, 1472, 1786, 1830, 1983, 2386, 2865, 2975, 3641 , 3916, 4030, 4530, 4995, 5472, 5619, 6099, 6247, 6265
Set 31 (n=20) SEQ-ID Nummern: 355, 462, 1416, 1983, 201 1 , 2183, 2248, 2618, 3190, 3412, 4490, 4576, 4776, 4923, 5164, 6101 , 61 14, 6278, 7314, 7369
Set 32 (n=20) SEQ-ID Nummern: 310, 1226, 1895, 2248, 2427, 2516, 2552, 2690, 3086, 3438, 3915, 4216, 4587, 5235, 5276, 5954, 6265, 6478, 6515, 7207
Set 33 (n=20) SEQ-ID Nummern: 493, 584, 633, 937, 2330, 2377, 2491 , 2587, 3153, 3683, 4216, 4248, 4530, 61 14, 6419, 6478, 6525, 6689, 7202, 7456
Set 34 (n=20) SEQ-ID Nummern: 10, 359, 383, 478, 626, 1472, 1487, 1647, 2475, 3683, 3780, 4490, 4636, 5179, 5247, 5371 , 5950, 6748, 6923, 7670
Set 35 (n=20) SEQ-ID Nummern: 97, 626, 1039, 1 163, 1426, 1617, 1704, 2002, 2248, 2690, 3168, 4216, 4638, 5247, 5614, 5950, 6265, 6461 , 6632, 7428
Set 36 (n=20) SEQ-ID Nummern: 366, 414, 544, 734, 1263, 1416, 2167, 2208, 2250, 2370, 2491 , 2526, 2855, 3190, 3488, 4083, 4248, 6673, 6845, 6847 Set 37 (n=10): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431 , 3043, 1665, 5776, 2902, 6585, 3167 und 745;
Set 38 (n=7): SEQ-ID Nummern: 1983, 507, 5431 , 3043, 1665, 5776 und 7695.
21 . Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch
gekennzeichnet, dass Isoformen der Polynucleotide eingesetzt werden, insbesondere solche, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Polynucleotiden mit den SEQ-ID Nummern: 507,7695, 7696, 7697, 7698, 7699, 7700, 7701 ; 5431 , 4636; 7702, 7703, 7704.
22. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , dadurch
gekennzeichnet, dass Fragmente der Polynucleotide eingesetzt werden, insbesondere solche mit Längen von 20 bis 1000, insbesondere 15 bis 500 Nucleotiden, vorzugsweise 15 bis 200, bevorzugt 20 bis 200
Nucleotiden und/oder Fragmenten, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 20 %, vorzugsweise ca. 50% besonders bevorzugt ca. 80 % zu den Polynucleotiden aufweisen.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch
gekennzeichnet, dass der Score über Expressionssignale erfasst wird, wobei die Expressionssignale erhalten werden durch Hybridisierung und/oder Amplifikation, insbesondere PCR, bevorzugt quantitative PCR, vorzugsweise Real-time PCR und/oder Proteinnachweis
24. Verwendung einer Mehrzahl von Protein-Genprodukten der
Polynucleotide, welche ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, zur Erfassung eines Scores als Maß für den Schweregrad der Host Response eines Probanden, der sich in einem akut infektiösen und/oder akut
inflammatorischen Zustand befindet.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass solche Protein-Genprodukte der Polynucleotide von k-Tupeln an Polynucleotiden verwendet werden, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus m Polynucleotiden mit der SEQ-ID Nr. 1 bis SEQ-ID 7704, wobei k mindestens 7 beträgt und kleiner oder gleich der Anzahl der
Polynucleotide m in der Gruppe ist.
26. Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass Protein-Genprodukte verwendet werden, die ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus: TLR5, CD59, CPVL, FGL2, IL7R, HLA-DPA1 , HLA-DR; und CLU.
27. Verwendung nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch
gekennzeichnet, dass solche Fragmente der Proteine verwendet werden, die eine Sequenzhomologie von mindestens ca. 20 %, vorzugsweise ca. 50% besonders bevorzugt ca. 80 % zu den Proteinen aufweisen.
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