WO2012139732A1 - Zubereitung enthaltend disc1 und/oder mindestens ein disc1-fragment zur anwendung bei der therapeutischen behandlung des menschlichen oder tierischen körpers - Google Patents

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WO2012139732A1 PCT/EP2012/001511 EP2012001511W WO2012139732A1 WO 2012139732 A1 WO2012139732 A1 WO 2012139732A1 EP 2012001511 W EP2012001511 W EP 2012001511W WO 2012139732 A1 WO2012139732 A1 WO 2012139732A1
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • the invention relates to a novel preparation for use in the therapeutic treatment of the human or animal body, in particular for the modulation of neurochemical processes and behavior, wherein in one embodiment the preparation has at least one DISC fragment in combination with an immunostimulating substance.
  • the DISC1 protein is thought to play a key role in genetic engineering studies (Chubb et al., 2008, Molecular Psychiatry 13:36) and reverse genetic studies on animal models (Shen et al., 2008, J. Neuroscience 48: 10893) Attributed to control of behavioral control and mental homeostasis. Inter alia, animals that modeled dysfunctionality of DISCI also had learning or memory disorders as well as disorders of sensory gating or depression-like symptoms (reviewed in Shen et al., 2008, J. Neuroscience 48: 10893).
  • DISCl is a protein whose function is not yet conclusively known. It plays a role in neuronal development both in the proliferation of neuronal progenitor cells and in neuronal differentiation, neuronal migration and the formation of a functional dopamine metabolism (Niwa et al., 2010, Neuw. ron 65: 480).
  • DISC1 is a cytosolic-expressed protein lacking typical signal sequences that allow export to the endoplasmic reticulum. In this respect, according to the state of the art, it is not to be expected that it will be present extracellularly in biologically-functionally relevant quantities and that it can be used as a target occurring outside the cell, for example.
  • WO 2009/154697 describes a method for the treatment of neurological disorders in which a DISCl activator is administered.
  • the activator may be e.g. to act DISCl.
  • no distinction is made between monomeric and multimeric DISC, which both activate differently, eg. with antagonistic effects.
  • immunogenic effects, in particular of multimeric DISC are not discussed.
  • DISCI fragments are designated in the publication with numbers indicating the position of the first and last amino acid of the fragment in the sequence of the DISC1 protein. This designation of DISCI fragments is also used in the present application.
  • the object of the invention is to provide new applications for DISC1 or DISC1 fragments.
  • a preparation containing DISC1 and / or at least one DISC1 fragment as a therapeutic for the treatment or modulation of neurochemical processes in the human or animal body or for influencing the proliferation or migration of cells.
  • a multimeric DISC1 fragment is used.
  • Open-field tests are animal experiments in which test animals are placed in open-top, mostly bright containers, usually with a footprint of 1 meter x 1 meter. During the experiment the conditions (lighting, temperature etc.) are kept constant. After a rat or a test animal is placed in the container, the location changes of the animal over a certain period of time observed and quantified. The tests are based on the fact that animals want to avoid the stay on an unknown, brightly lit open space as far as possible. If they are nevertheless brought into such an environment, they show a movement behavior that is dictated by timidity, readiness to flee and curiosity.
  • ABM-ZK consists of 0.5 mg trehalose dimycolate (TDM), 0.5 mg monophosphoryl lipid A (MPL), 0.5 mg Cell Wall Skeleton (CWS), 2% oil (squalene) and an unspecified amount of Tween 80th
  • DISC1 fragments e.g. DISCI 765-854, 598-854, DISCI 1-854, or fragments other than those mentioned in the above-cited publication have a similar effect. It is conceivable to use as a single protein or peptide or as a fusion protein.
  • Amphetamine sensitizations are used in animal studies to elicit neurochemical balance disorders similar to those in neuropsychiatric disorders with schizophrenia-typical symptoms.
  • DISC1 fragments may induce immunogenic and / or psychotropic effects, both of which are e.g. cause a modulation of anxiety behavior.
  • the ratios of rats can be transferred to humans, so that it is readily conceivable, for example drugs prepared from DISCI fragments as tranquilizers or for the therapy of neuropsychiatric disorders, in particular those disorders which interfere with the DISCI metabolism or the Dopaminstoff pads are correlated to use.
  • drugs prepared from DISCI fragments as tranquilizers or for the therapy of neuropsychiatric disorders, in particular those disorders which interfere with the DISCI metabolism or the Dopaminstoff crisps are correlated to use.
  • a DISC-dependent regulation of the dopamine metabolism which is modulated by the preparation according to the invention, it is conceivable, for example, for use in schizophrenia, (recurrent) depression, bipolar disorder, autism, addictions, Huntington's disease, Tourette syndrome, attention deficit hyperactivity disorder.
  • the preparation of the invention is also applicable to transient or chronic memory disorders such as mild cognitive impairment (MCI), or diseases such as Alzheimer's disease.
  • MCI mild cognitive impairment
  • the preparation according to the invention could be used for the treatment of side effects of certain drugs or substances which affect the dopamine metabolism, by favorably influencing them, including acute poisoning.
  • the preparation according to the invention can be used for the treatment of chronic pain conditions in which dopamine metabolism plays a role, including but not limited to chronic fatigue syndrome, fibromyalgia, "burning mouth syndrome".
  • Dopamine also plays a role in cognitive peculiarities or disorders such as anhedonia, disturbances of social interaction or overall “incentive salience” and the inventive preparation can therefore also be used as a cognitive enhancer in non-ill individuals.
  • the preparation according to the invention is conceivable for the treatment of the following non-brain-specific diseases in which the peripheral dopamine metabolism plays a role, for example cardiovascular diseases, arrhythmias, blood disorders. high pressure, obesity, diabetes, immune regulation, lactation disorders, ammenorrhea, libido and sexual dysfunction.
  • cardiovascular diseases for example cardiovascular diseases, arrhythmias, blood disorders. high pressure, obesity, diabetes, immune regulation, lactation disorders, ammenorrhea, libido and sexual dysfunction.
  • the preparation according to the invention can also influence the proliferation and migration of cells, since this is a core function of DISC1.
  • DISC1 a core function of DISC1.
  • DISC1 or DISC1 fragments are in secreted form suggests that DISC1 may act as a signaling molecule, possibly triggered by certain circumstances such as cellular stress, and may be delivered into the extracellular space by unknown transport mechanisms independent of the endoplasmic reticulum and then binds to specific molecules or receptors. These molecular mechanisms were not expected in the current state of the art because secretion of DISC1 or DISC1 fragments was unknown and considered impossible because DISC1 was classified as a cytosolic cytoskeleton-associated molecule. In this respect, the preparation of the invention justifies a new teaching.
  • the preparation according to the invention may be formulated for subcutaneous, intramuscular, intravenous, intracerebral, intranasal or intraperitoneal administration.
  • subcutaneous and intracerebral administration it is no problem for the person skilled in the art to also provide suitable formulations for the other stated administration possibilities.
  • the invention will be explained in more detail by means of examples and figures:
  • FIG. 1 shows in a bar chart the locomotion behavior of healthy ones
  • FIG. 2 shows, similar to FIG. 1, the effect of (subcutaneous) immunization of
  • FIG. 3 shows the locomotion behavior of amphetamine-sensitized rats determined under similar conditions as in FIG.
  • FIG. 4 shows a (e)
  • Figure 5 shows diagrams A and B showing the effect of DISC 1 immunization on the behavior in the bright field / dark field preference test (black bars, dark field, white bars, bright field).
  • Figure 6 shows a Western blot of cell lysates and the accompanying supernatant expressing DISC 1 and secreting full length DISC1 or a DISC1 fragment into the supernatant
  • Example 1 Examination of rats in an open-field experiment a) Influence of DISC1 on the locomotion behavior in healthy rats
  • TDM trehalose dimycolate
  • MPL monophosphoryl lipid A
  • CWS Cell Wall Skeleton
  • oil squalene
  • the rats were placed in the open-field environment 14 days after the last injection. The rats were observed over a period of 20 minutes and their movement measured by either measuring the total distance covered (Example 1) or dividing the open-field into nine parts (sectors) and the number of crosses from one sector into one adjacent was counted (Example 2). The two measurement methods are equivalent and allow the same statements. Ten rats were examined per group.
  • the results of the experiment are summarized in FIG.
  • the behavior of untreated rats (adjuvant only) is shown in the left bar.
  • the right panel shows the locomotion behavior of the rats injected with the DISC1 fragment (together with the adjuvant).
  • Example la the effect of (subcutaneous) immunization of DISC 1 (598-785) together with adjuvant (ABM-ZK, Linaris, as described) or adjuvant alone as control or only application of PBS as further control, examined for the basal behavior in the open field.
  • the experimental conditions of the open field measurement were as in Example 1a, but the immunized rats were about one year old and the time was determined for the rats to remain in the center of the open field after 15 minutes.
  • the experiment was carried out essentially as described under a). The only difference was that the rats were additionally sensitized with amphetamine before conducting the experiment. Sensitization was performed 2 weeks prior to insertion into the Open-Field container by intraperitoneal (i.p.) administration of 2 mg / kg / rat D-amphetamine daily for five days (dissolved in saline, 1 ml / kg injection volume). After a treatment-free interval of 2 weeks, the open-field testing was then carried out 24 hours after a single injection of 0.5 mg / kg / rat D-amphetamine.
  • DISC1 effects a modulation of the neurochemical processes disturbed by amphetamine sensitization. It is of it assume that such a modulation can be exploited in the treatment of DISC-associated diseases. In particular, for example, depressions associated with a significantly decreasing tendency to activities or movements, a positive effect can be postulated.
  • Example 2 Influence of exogenous DISCI application on the anxiety behavior in healthy rats
  • Wistar rats were stereotactically inoculated with approximately 5 ⁇ g of recombinant DISCI (598-785) protein in the nucleus accumbens (stereotactic coordinates in the head frame (AP: 1.2 mm, ML: ⁇ 0.8 mm, DV: -5.2 mm) Inoculation was used to study the bright field / dark field preference test and the open field test to measure anxiety-induced behavior In the bright field / dark field preference test, the rat is placed in a bright field (61 x 38 x 32 cm) connected to a neighboring dark field measured, which the rat spends in brightfield or darkfield.
  • DISCI recombinant DISCI
  • amphetamine the sensitivity to amphetamine was investigated in the open field experiment after a single intrperitoneal administration of 0.5 mg / kg body weight. Each study period was 15 minutes. The horizontal movement is measured automatically with the TruScan light barrier measuring system (Coulbourn Instruments, Allentown, USA).
  • Figure 4A shows fluorescence microscopy of a brain section of the rat nucleus accumbens stereotactically inoculated with Dylight-labeled (red) recombinant DISCL 598-785. Counterstaining with anti-NeuN antibody, a neuron-specific marker protein. The picture shows that recombinant DISC1 protein was taken up in the cytosol of neurons. Bar 20 ⁇ ⁇ ,
  • Fig. 4B shows a graph of the results of the light-dark preference test two weeks after bilateral inoculation of DyLight-labeled recombinant DISCI (598-785). or control (sham) in the nucleus accumbens of a wild-type rat.
  • the diagram shows that inoculation with DISCI (598-785) has an anxiolytic effect because the residence preference is changed towards the bright field.
  • the rats were screened in with the bright field / darkfield preference test to measure anxiety-induced behavior.
  • the rat is placed in a bright field (61 x 38 x 32 cm), which is connected to an adjacent dark field. During 5 minutes, the time spent by the rat in the bright field or in the dark field is measured.
  • Fig. 5 shows diagrams showing the effect of DISCl immunization on the behavior in the bright field / dark field preference test (black bars, dark field, white bars, bright field).
  • a human neuroblastoma cell line (SHSY-5Y) was retrovirally transfected with the full-length human DISC1 gene (1-854) or a C-terminal human DISC1 fragment fused to the greenfluorescent protein (GFP) can be triggered by the addition of tetrycycline 1 ug / ml ("tet-on") in the cell culture medium (retroviral inducible transfection system pTRE-TIGHT from Clontech / Invitrogen, USA); Tetracycline-induced expression has the advantage over other transient expression systems that the cells do not die as a result of the transfection and thus cytosolic constituents pass conditionally into the cell culture supernatant through cell death.
  • tetrycycline 1 ug / ml retroviral inducible transfection system pTRE-TIGHT from Clontech / Invitrogen, USA
  • Tetracycline-induced expression has the advantage over other transient expression systems that the cells do not die as
  • the cells were then induced for 2 days in serum-free medium with 1 .mu.l / .eta.1 tetracycline and the entire cell culture medium supernatant was finally centrifuged after two days to separate any existing dead cells precipitated with 7g ammonium sulfate / 10 ml of supernatant and separated on an SDS-PAGE gel and displayed in Western blot with standard methods and the antibody 14F2 against human DISC1 protein. As a control, the cell lysates were also examined.
  • Figure 6 shows a Western blot of supernatants (lanes 1-4) or cell lysates (lanes 5-8).
  • the even-numbered lanes 2, 4, 6 and 8 show tetracycline-induced, non-even-numbered lanes 1, 3, 5, 7 uninduced human SHSY-5Y cells.
  • Lanes 2 and 6 show full length human DISC1 protein or human DISC1 (598-854) fragment (lanes 4 and 8), c-terminally fused to green-fluorescent protein (GFP).
  • GFP green-fluorescent protein

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Abstract

Zubereitung enthaltend DISC1 und/oder mindestens ein DISC1 -Fragment zur Anwendung bei der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei bevorzugt zusätzlich mindestens eine immunstimulierende Substanz enthalten ist und bevorzugt das mindestens eine DISC1 -Fragment DISC1-598-785 ist.

Description

Zubereitung enthaltend DISCl und/oder mindestens ein DISCl -Fragment zur Anwendung bei der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers
Die Erfindung bezieht sich auf eine neuartige Zubereitung zur Anwendung bei der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere zur Modulation neurochemischer Prozesse und von Verhalten, wobei in einer Ausgestatlung die Zubereitung mindestens ein DISCl -Fragment in Kombination mit einer immunstimulierenden Substanz aufweist.
Dem DISCl Protein wird aufgrund von genetischen Untersuchungen (Chubb et.al. 2008 "Molecular Psychiatry" 13:36), sowie revers genetischen Untersuchungen an Tiermodellen (Shen et al., 2008, J. Neuroscience 48:10893) eine zentrale Rolle in der Steuerung der Verhaltenskontrolle und mentalen Homöostase zugeschrieben. Unter anderem hatten Tiere, die eine Dysfunktionalität von DISCl modellierten auch Lern- oder Gedächtnisstörungen, sowie Störungen des Sensory gating oder Depressions-ähnliche Symptome (Übersicht bei Shen et al., 2008, J. Neuroscience 48:10893).
DISCl ist ein Protein, dessen Funktion noch nicht abschließend bekannt ist. Es spielt eine Rolle in der neuronalen Entwicklung sowohl bei der Proliferation der neuronalen Vorläuferzellen als auch bei der neuronalen Differenzierung, der neuronalen Migration und der Ausbildung eines funktionalen Dopaminstoffwechsels (Niwa et al., 2010, Neu- ron 65:480). DISCl ist ein Protein, das zytosolisch exprimiert wird und keine typischen Signalsequenzen besitzt, die einen Export in das endoplasmatische Retikulum ermöglichen. Insofern ist nach dem Stand der Wissenschaft nicht zu erwarten, dass es in biolo- gisch-funktionell relevanten Mengen extrazellulär vorhanden ist und sich als z.B. außerhalb der Zelle auftretendes Target verwenden lässt.
Aus der US 2005/0210536 ist bekannt neurologische Störungen an Tiermodellen zu untersuchen, wobei ein Gen-Konstrukt enthaltend das DISCl-Gen ins Hirn der Tiere injiziert wird.
Aus der WO 02/058637 ist bekannt, DISCl als Marker bei klinischen Studien zur Ermittlung der Wirksamkeit von Medikamenten für DISC-korrelierte Erkrankungen einzusetzen.
Die WO 2009/154697 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung von neurologischen Störungen, bei dem ein DISCl -Aktivator verabreicht wird. Es kann sich bei dem Aktivator z.B. um DISCl handeln. Allerdings wird in der WO 2009/154697 nicht zwischen monomerem und multimerem DISC unterschieden, die beide unterschiedlich aktivieren, z.T. mit antagonistischen Effekten. Ausserdem wird nicht auf immunogene Effekte, insbesondere von multimerem DISCl eingegangen.
In der Veröffentlichung von Leliveld et.al. - Biochemistry 2009, 48, 7746-7755 - wird die Untersuchung unterschiedlicher DISCl -Fragmente beschrieben. Die DISCl - Fragmente sind in der Veröffentlichung mit Nummern bezeichnet, die die Position der jeweils ersten und letzten Aminosäure des Fragments in der Sequenz des DISCl - Proteins angeben. Diese Bezeichnung von DISCl -Fragmenten wird auch in der vorliegenden Anmeldung verwendet.
In der angesprochenen Veröffentlichung wurde gezeigt, dass ein C-terminales Fragment von DISCl auch in vivo im Zytosol auftritt. In derselben Veröffentlichung wird angenommen, dass noch weitere C-terminale DISCl -Fragmente in vivo vorliegen und eine bislang noch nicht bekannte Rolle bei der Modulation DISCl -abhängiger intrazellulärer Funktionen spielen können. Aber auch aus dieser Veröffentlichung ergibt sich, dass DISC1 -Fragmente im Zytosol und nicht in sekretierter Form vorliegen.
Aufgabe der Erfindung ist, neue Anwendungen für DISC1 oder DISC1 -Fragmente zu schaffen.
Gelöst wird die Aufgabe gemäß Anspruch 1.
Erfindungsgemäss ist vorgesehen, eine DISC1 und/oder mindestens ein DISC1- Fragment enthaltende Zubereitung als Therapeutikum zur Behandlung bzw. Modulation neurochemischer Prozesse im menschlichen oder tierischen Körper oder zur Beeinflussung der Proliferation bzw. Migration von Zellen einzusetzen.
Bevorzugt wird ein multimeres DISC1 -Fragment eingesetzt.
Es wurde überraschend herausgefunden, dass die exogene, subkutane Verabreichung einer Zubereitung, die ein DISC1 -Fragment enthielt, eine Modulation des Verhaltens bei Ratten in Offenfeld-Tests (Open-Field-Tests) und die Inokulation einer Zubereitung, die ein DISCl-Fragement enthielt, ins Hirn einen lindernden Effekt auf das Angstverhalten von Ratten im Hellfeld/Dunkelfeldpräferenztest bewirkte. Diese Effekte waren nicht zu erwarten, da das DISC1 Protein nach dem Stand der Forschung als zytosolisches Protein nicht extrazellulär vorkommen sollte und somit einer direkten Modulation unzugänglich sein sollte. Der Effekt war jedoch DISC1 -abhängig, da in einer DISC1 -freien Kontrolle keine von der gänzlich unbehandelten Kontrolle unterschiedlichen Ergebnisse erzielt wurden (siehe Figur 1, Beispiel la; Figur 4B, Beispiel lb)
Bei Open-Field-Tests handelt es sich um Tierexperimente, in denen Testtiere in oben offene, zumeist helle Behälter mit in der Regel einer Grundfläche von 1 Meter x 1 Meter gesetzt werden. Während des Experiments werden die Bedingungen (Beleuchtung, Temperatur etc.) konstant gehalten. Nachdem eine Ratte bzw. ein Testtier in den Behälter gesetzt wird, werden über eine bestimmte Zeitdauer die Ortsänderungen des Tieres beobachtet und quantifiziert. Den Tests liegt zugrunde, dass Tiere den Aufenthalt auf einer ihnen unbekannten, hell erleuchteten Freifläche möglichst vermeiden wollen. Werden sie dennoch in eine derartige Umgebung gebracht, zeigen sie ein Bewegungsverhalten, das durch Ängstlichkeit, Fluchtbereitschaft und Neugier diktiert wird.
In eine ähnliche Richtung geht der Hellfeld/Dunkelfeldpräferenztest, bei dem Ratten in ein Hellfeld (61 x 38 x 32 cm) gesetzt werden, das mit einem benachbarten Dunkelfeld verbunden ist. Während z.B. 5 Minuten wird die Zeit gemessen, die die Ratte jeweils im Hellfeld oder im Dunkelfeld verbringt.
In einigen Experimenten wurde eine Zubereitung eingesetzt, die aus dem Ratten- DISC1 -Fragment 598-785 und der immunstimulierenden Substanz ABM-ZK besteht (Linaris, Deutschland); ABM-ZK besteht aus 0,5 mg Trehalose Dimycolate (TDM), 0,5 mg Monophosphoryl Lipide A (MPL), 0,5 mg Cell Wall Skeleton (CWS), 2 % Öl (Squalene) und einer nicht näher angegebenen Menge Tween 80.
Es ist davon auszugehen, dass neben dem eingesetzten DISCl -Fragment auch andere DISCl -Fragmente, z.B. DISCl 765-854, 598-854, DISCl 1-854, oder andere als die in der oben zitierten Veröffentlichung angesprochenen Fragmente einen ähnlichen Effekt haben. Denkbar ist ein Einsatz als Einzelprotein bzw. -peptid oder auch als Fusionsprotein.
In einem ersten Experiment konnte gezeigt werden, dass nach Verabreichung des DISCl -Fragmentes an gesunden Ratten diese in Open-Field Tests eine geringere Loko- motion zeigten als eine nicht-behandelte Kontrollgruppe. Daraus lässt sich ableiten, dass das Fragment auf solche Ratten einen beruhigenden Einfluss hat (Figur 1).
Im Gegensatz dazu zeigten Ratten, die vorher durch chronische Verabreichung von D- Amphetamin einer Amphetamin-Sensitivierung unterzogen wurden, nach Verabreichung des DISCl -Fragmentes eine deutliche Lokomotionssteigerung gegenüber einer Amphetamin-sensitivierten Kontrollgruppe, der kein DISCl -Fragment verabreicht wurde (Figur 2). Amphetamin-Sensitivierungen werden in Tierversuchen eingesetzt, um Störungen des neurochemischen Gleichgewichtes hervorzurufen, die denen bei neuropsychiatrischen Erkrankungen mit schizophrenietypischen Symptomen entsprechen.
In der Regel führt eine Amphetamin-Sensitivierung bei z.B. Ratten in Open-field expe- rimenten dazu, dass diese eine gegenüber nicht sensitivierten Ratten gesteigerte Loko- motion zeigen. Die Tatsache, dass nach Gabe von DISCl -Fragmenten eine weitere Lo- komotionssteigerung zu beobachten war, lässt darauf schließen, dass durch das DISCl - Fragment eine Modulation der gestörten neurochemischen Prozesse erfolgt ist, speziell des Dopaminstoffwechsels, von dem bekannt ist, dass er sich bei einer Amphetaminsensitivierung ändert (Featherstone et al. 2007, Progress in Neuropsychopharmacology & Biological Psychiatry 31 : 1556).
In einem weiteren Experiment (Hellfeld/Dunkelfeldpräferenztest) konnte gezeigt werden, das durch Inokulation des DISCl -Fragments (598-785) ins Hirn ein anxiolytischer Effekt bei Ratten erreicht werden konnte.
Die Experimente deuten darauf hin, dass die Verabreichung von DISCl -Fragmenten immunogene und/oder psychotrope Effekte auslösen kann, die beide z.B. eine Modulation des Angstverhaltens bewirken.
In vom Anmelder durchgeführten Experimenten konnte weiterhin (mittels Elisa) gezeigt werden, dass mit einer Zubereitung aus dem Ratten-DISCl -Fragment 598-785 und der immunstimulierenden Substanz ABM-ZK immunisierte Ratten sämtlich Antikörper gegen DISC gebildet hatten.
In der Regel lassen sich die Verhältnisse von Ratten auf Menschen übertragen, so dass es ohne Weiteres denkbar ist, z.B. aus DISCl -Fragmenten hergestellte Medikamente als Beruhigungsmittel oder bei zur Therapie von neuropsychiatrischen Erkrankungen, insbesondere solchen Erkrankungen, die mit einer Störung des DISCl -Stoffwechsels oder des Dopaminstoffwechsels korreliert sind, einzusetzen. Im Sinne einer DISCl -abhängigen Regulation des Dopaminstoffwechsels, die von der erfindungsgemässen Zubereitung moduliert wird, ist beispielsweise ein Einsatz denkbar bei Schizophrenie, (rekurrente) Depression, bipolarer Störung, Autismus, Suchterkrankungen, Morbus Huntington, Tourette Syndrom, Aufmerksamkeits-Defizit- Hyperaktivitäts-Syndrom, Restless-legs Syndrom, sowie indirekt Synukleinopathien wie Demenz mit Lewykörperchen oder die Parkinson Erkrankung; bei der Parkinson Erkrankung auch z.B. als adjuvante Therapie beim "Dopamine Dysregulation Syndrom". Aufgrund der existierenden Gedächtnisstörungen bei Tiermodellen mit DISCl Mutationen ist die erfindungsgemässe Zubereitung auch bei transienen oder chronischen Gedächtnisstörungen wie des "Mild Cognitive Impairment" (MCI), oder Krankheiten wie der Alzheimer Erkrankung anwendbar.
Ausserdem könnte die erfindungsgemässe Zubereitung zur Behandlung von Nebenwirkungen bestimmter Medikamente oder Substanzen, die den Dopaminstoffwechsel beeiflussen, verwendet werden, indem diese günstig beeinflusst werden, inklusive akute Vergiftungen.
Weiterhin kann die erfindungsgemässe Zubereitung zur Behandlung von chronischen Schmerzzuständen verwendet werden, bei denen der Dopaminstoffwechsel eine Rolle spielt, inklusive aber nicht begrenzt auf Chronic Fatigue Syndrome, Fibromyalgie, "Burning mouth Syndrome".
Dopamin spielt auch bei kognitiven Eigenarten oder Störungen eine Rolle wie der Anhedonie, Störungen der sozialen Interaktion oder insgesamt der "incentive Salience" und die erfindungsgemässe Zubereitung kann daher auch als Kognitions- Verstärker bei nicht-kranken Individuen eingesetzt werden.
Ausserdem ist die erfindungsgemässe Zubereitung zur Behandlung folgender nicht- hirnspezifischer Erkrankungen denkbar, bei denen der periphere Dopaminstoffwechsel eine Rolle spielt wie zum Beispiel kardiovaskuläre Erkrankungen, Arrhythmien, Blut- hochdruck, Übergewicht, Diabetes, Immunregulation, Laktationsstörungen, Ammenorrhoe, Libidoverlust und sexuelle Funktionsstörungen.
Die erfindungsgemässe Zubereitung kann auch die Proliferation und Migration von Zellen beeinflussen, da dies eine Kernfunktion von DISC1 ist. Insofern ist auch an eine Anwendung bei Krebserkrankungen möglich oder eine Anwendung zur Eindämmung der Proliferation von Immunzellen, z.B. bei Autoimmunerkrankungen wie der Multiplen Sklerose.
Die genannten vielfältigen Einflüsse der erfindungsgemässen Zubereitung auf DISO - abhängige Funktionen wie neurochemische Prozesse, Zellproliferation und Migration, lassen erwarten, dass die erfindungsgemässe Zubereitung einen insgesamt lebensverlängernden Einfluss hat, so dass die erfindungsgemässe Zubereitung auch allgemein zur Regeneration eingesetzt werden kann.
Die überraschende Feststellung, dass DISC1 oder DISC1 Fragmente in sekretierter Form vorliegen, lässt vermuten, dass DISC1 als Signalmolekül, ggf. ausgelöst durch unter bestimmte Umständen wie zellulärem Stress, agieren kann und durch noch unbekannte Transportmechanismen unabhängig vom endoplasmatischen Retikulum in den Extrazellularraum abgegeben werden kann und dort dann an spezifische Moleküle oder Rezeptoren bindet. Diese molekularen Mechanismen waren nach dem bisherigen Stand der Wissenschaft nicht zu erwarten, da eine Sekretion von DISC1 oder DISC1 Fragmenten unbekannt war und als unmöglich erachtet wurde, weil DISC1 als ein zytosolisches, dem Zytoskelett assoziiertes Molekül klassifiziert wurde. Insofern begründet die erfindungsgemässe Zubereitung eine neue Lehre.
Die erfindungsgemässe Zubereitung kann zur subcutanen, intramuskulären, intravenösen, intracerebralen, intranasalen oder intraperitonealen Verabreichung formuliert sein. Ausgehend von den weiter unten angegebenen Beispielen, die die subcutane und intracerebrale Verabreichung beschreiben, stellt es für den Fachmann kein Problem dar, auch für die weiteren angegebenen Verabreichungsmöglichkeiten geeignete Formulierungen bereitzustellen. Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert werden:
Figur 1 zeigt in einem Balkendiagramm das Lokomotionsverhalten von gesunden
Ratten in einem Open-Field Test, in dem nicht-behandelte Ratten (nur Adjuvant) mit Ratten, denen das DISC 1 -Fragment (zusammen mit Adjuvant) injiziert wurde, verglichen wurden.
Figur 2 zeigt ähnlich wie Fig. 1 den Effekt der (subkutanen) Immunisierung von
DISC 1(598-785) auf das basale Verhalten von Ratten im Offenfeld.
Figur 3 zeigt das unter ähnlichen Bedingungen wie in Figur 1 ermittelte Lokomotionsverhalten von Amphetamin-sensitivierten Ratten.
Figur 4 zeigt ein(e)
A) Fluoreszenzmikroskopie eines Hirnschnitts des Nucleus accumbens einer Ratte, die mit Dylight-markiertem (rot), rekombinantem DISC1 598-785 stereotaktisch inokuliert wurde,
B) Diagramm der Resultate des Hell-Dunkelpräferenztests zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISC 1(598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte, und
C) Diagramm der Resultate eines Offenfeld (Openfield) Versuchs nach einer einzelnen, intraperitonealen Amphetamininjektion zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISC 1(598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte.
Figur 5 zeigt Diagramme A und B, die den Effekt von DISC 1 -Immunisierung auf das Verhalten im Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest zeigen (schwarze Balken, Dunkelfeld; weisse Balken, Hellfeld). Figur 6 zeigt einen Western blot von Zellysaten und dem dazugehörenden Überstand, die DISC 1 expremieren und volle Länge DISC1 oder ein DISC1 Fragment in den Überstand sekretieren
Beispiel 1: Untersuchung von Ratten in einem Open-Field Experiment a) Einfluss von DISC1 auf das Lokomotionsverhalten bei gesunden Ratten
Bei diesem Experiment wurde das Verhalten einer Gruppe nicht-behandelter Ratten im Vergleich zu einer anderen Gruppe Ratten untersucht, denen ein D IS Cl -Fragment verabreicht wurde.
Die Verabreichung erfolgte mittels Injektion (subkutan) einer Lösung, die 150 μg des Ratten-DISCl -Fragmentes 598 bis 785 enthielt und in 150 xL Adjuvant ABM-ZK (Linaris, Deutschland; bestehend aus 0,5 mg Trehalose Dimycolate (TDM), 0,5 mg Monophosphoryl Lipide A (MPL), 0,5 mg Cell Wall Skeleton (CWS), 2 % Öl (Squalene) und einer nicht näher angegebenen Menge Tween 80) aufgenommen wurde.
Es erfolgten insgesamt vier Injektionen der gleichen Menge im Abstand von jeweils drei Wochen.
Das Einsetzen der Ratten in die Open-Field Umgebung erfolgte 14 Tage nach der letzten Injektion. Die Ratten wurden über einen Zeitraum von 20 Minuten beobachtet und ihre Bewegung gemessen, indem entweder die gesamte zurückgelegte Distanz gemessen wurde (Beispiel 1) oder das Open-field in neun Teile (Sektoren) unterteilt wurde und die Anzahl der Übertritte von einem Sektor in einen anliegenden gezählt wurde (Beispiel 2). Die beiden Messmethoden sind gleichwertig und erlauben dieselben Aussagen. Pro Gruppe wurden 10 Ratten untersucht.
Die Ergebnisse des Experimentes sind in Fig. 1 zusammengefasst. Das Verhalten nicht-behandelter Ratten (nur Adjuvant) ist in dem linken Balken dargestellt. Der rechte Balken zeigt das Lokomotionsverhalten der Ratten, denen das DISC1- Fragment (zusammen mit dem Adjuvant) injiziert wurde.
Man erkennt, dass die behandelten Ratten eine deutlich geringere Bewegungsneigung zeigen als die nicht-behandelten. Da neuigkeit-induzierte Lokomotion mit dem Dopa- min-System in Verbindung gebracht werden kann, lässt dieser Befund Unterschiede im Dopamin-System der beiden Behandlungsgruppen vermuten
Daraus lässt sich ableiten, dass die periphere Einbringung von DISC1 in den Körper der Ratte einen deutlichen Effekt auf das Verhalten im Sinne einer Verminderung der Bewegung hat. b) Einfluss der (subkutanen) Immunisierung von DISCl(598-785) zusammen mit Adjuvant (ABM-ZK, Linaris, wie beschrieben) auf das basale Verhalten älterer Ratten im Offenfeld
Es wurde wie im Beispiel la der Effekt der (subkutanen) Immunisierung von DISC 1(598-785) zusammen mit Adjuvant (ABM-ZK, Linaris, wie beschrieben), oder nur mit Adjuvant als Kontrolle oder nur Applikation von PBS als weiterer Kontrolle, auf das basale Verhalten im Offenfeld untersucht. Die experimentellen Bedingungen der Offenfeldmessung waren wie in Beispiel la, allerdings waren die immunisierten Ratten diemal ca. ein Jahr alt und es wurde die Zeit bestimmt, die die Ratten sich im Zentrum des Offenfelds nach 15 Minuten aufhalten.
Die Ergebnisse zeigt Fig.2, wobei die Resultate für DISC 1 -immunisierte Ratten (n= 10 pro Gruppe) als schwarzer, die für Kontroll-immunisierte Ratten (nur Adjuvans) als grauer und die für PBS-immunisierten Ratten als weisser Balken wiedergegeben sind. Die Resultate wurden statistisch ausgewertet und als signifikant bewertet (Univariate ANOVA F(2, 13)=3.931 ; p=0.05. Post hoc LSD für 15 min bin: DISC vs. pbs: p=0.041 , DISC vs. adjuvant: p=0.030). Konsistent mit den Ergebnissen des Beispiel la, halten sich die DISC1 -immunisierten Ratten signifikant seltener im Zentrum auf, was wiederum einen Verhaltenseffekt der DISC1 Immunisierung demonstriert. c) Einfluss von DISC1 auf das Lokomotions verhalten Amphetamin- sensitivierter Ratten
Die Durchfuhrung des Experimentes erfolgte im Wesentlichen wie unter a) beschrieben. Der einzige Unterschied war, dass die Ratten zusätzlich vor Durchführung des Experimentes mit Amphetamin sensitiviert wurden. Die Sensitivierung erfolgte 2 Wochen vor dem Einsetzen in die Open-Field Behälter durch intraperitoneale (i.p.) Gabe von 2 mg/kg/Ratte D-Amphetamin täglich für fünf Tage (gelöst in Saline; 1 ml/kg Injektionsvolumen). Nach einem behandlungsfreien Intervall von 2 Wochen wurde dann 24 h nach einer einmaligen Injektion von 0,5 mg/kg/Ratte D-Amphetamin die Open-Field Testung durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in dem in Fig. 3 dargestellten Balkendiagramm wiedergegeben. Hier erkennt man, dass die Amphetamin-sensitivierten Ratten ohne DISC1 -Behandlung eine deutlich geringere Bewegungsneigung zeigten als die Ratten, denen DISC1 verabreicht wurde. In einer genaueren Analyse wurde die "Center time" der einzelnen Gruppen bestimmt, d.h. die Zeit die die Ratten in der Mitte der Open Field Box verbringen, und die ein Mass für Angst-induzierte Effekte ist. Diese war für alle Gruppen identisch, so dass ausgeschlossen werden konnte, dass es sich bei der erhöhten Lokomotion nach Immunisierung mit DISC1 (598-785) um eine Angst-induzierte Lokomotion handelt.
Dabei zeigt sich auch, dass das wiederholte Einbringen der erfindungsgemässen Zubereitung keine toxische Wirkung hatte, da über den gesamten Beobachtungszeitraum (ca. 10 Monate) keine Nebenwirkungen in Form neurologischer Symptome, Verhaltenssymptome, Störungen des Grooming- Verhaltens, Gewichtsverlust oder ähnliches beobachtet wurde. Die Anwendung ist somit als sicher zu bezeichnen.
Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass DISC1 eine Modulation der durch die Amphetamin-Sensitivierung gestörten neurochemischen Prozesse bewirkt. Es ist davon ausgehen, dass sich eine solche Modulation bei der Behandlung DISCl -assoziierter Erkrankungen ausnutzen lässt. Insbesondere bei zum Beispiel Depressionen, die mit einer deutlich abnehmenden Neigung zu Aktivitäten beziehungsweise Bewegungen einhergehen, lässt sich ein positiver Effekt postulieren.
Beispiel 2: Einfluss von exogener DISCl Applikation auf das Angstverhalten bei gesunden Ratten
Wistar Ratten wurde stereotaktisch ca. 5 μg rekombinantes DISCl (598-785) Protein in den Nukleus accumbens (stereotaktische Koordinaten im Kopf-Rahmen (AP: 1.2 mm; ML: ± 0.8 mm; DV: -5.2 mm) inokuliert. Zwei Wochen nach Inokulation wurden der Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest und der Offenfeldversuch zur Messung des Angstinduzierten Verhaltens untersucht. Beim Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest wird die Ratte in ein Hellfeld (61 x 38 x 32 cm) gesetzt, das mit einem benachbarten Dunkelfeld verbunden ist. Während 5 Minuten wird die Zeit gemessen, die die Ratte jeweils im Hellfeld oder im Dunkelfeld verbringt.
Weiterhin wurde im Offenfeldversuch nach einmaliger intrperitonealer Gabe von 0.5 mg / kg Körpergewicht Amphetamin, die Sensitivität auf Amphetamin untersucht. Jeder Untersuchungszeitraum betrug 15 Minuten. Die horizontale Bewegung wird automatisch mit dem TruScan Lichtschrankenmesssystem gemessen (Coulbourn Instruments, Allentown, USA).
Die Ergebnisse sind in den weiter unten kommentierten Fig 4B+C wiedergegeben.
Fig. 4A zeigt eine Fluoreszenzmikroskopie eines Hirnschnitts des Nucleus accumbens einer Ratte, die mit Dylight-markiertem (rot), rekombinantem DISCl 598-785 stereotaktisch inokuliert wurde. Gegenfärbung mit anti-NeuN Antikörper, einem Neuronspezifischen Markerprotein. Das Bild zeigt, dass rekombinantes DISCl Protein ins Zytosol von Neuronen aufgenommen wurde. Balken 20 μιη,
Fig.4 B zeigt ein Diagramm der Resultate des Hell-Dunkelpräferenztests zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISCl (598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte. Das Diagramm zeigt, dass die Inokulation mit DISCl (598-785) einen anxiolytischen Effekt hat, weil die Aufenthaltspräferenz zum Hellfeld hin verändert wird. F(l , 17)=4.671 ; * p=0.045.(ANOVA).
Fig. 4C zeigt Diagramm der Resultate eines Offenfeld (Openfield) Versuchs nach einer einzelnen, intraperitonealen Amphetamininjektion zwei Wochen nach bilateraler Inokulation von DyLight-markiertem rekombinantem DISCl (598-785) oder Kontrolle (sham) in den Nucleus accumbens einer Wildtyp Ratte. Die Inokulation mit multimerem rekombinantem DISCl führte zu einer erhöhten Amphetaminsensitivität da in diesen Ratten im Vergleich zur Kontrolle eine Hyperaktivität beobachtet wurde. Y-Achse: relative Lokomotion inbezug auf den Ausgangswert vor Amphetamingabe in %. F(l, 17) = 4.5; * p = 0.049 (ANOVA).
Beispiel 3: Untersuchung von mit DISCl /598-785 behandelten Ratten im
Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest
Nach erfolgter Immunisierung mit DISCl /598-785, oder den Kontrollen (nur Adjuvant oder PBS -Phosphatgepufferte Kochsalzlösung-) wurden die Ratten in mit dem Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest zur Messung des Angst-induzierten Verhaltens untersucht. Beim Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest wird die Ratte in ein Hellfeld (61 x 38 x 32 cm) gesetzt, das mit einem benachbarten Dunkelfeld verbunden ist. Während 5 Minuten wird die Zeit gemessen, die die Ratte jeweils im Hellfeld oder im Dunkelfeld verbringt.
Fig. 5 zeigt Diagramme, die den Effekt von DISCl -Immunisierung auf das Verhalten im Hellfeld / Dunkelfeldpräferenztest zeigen (schwarze Balken, Dunkelfeld; weisse Balken, Hellfeld).
A. Es ist zu sehen, dass die DISCl Immunisierung zu einem Wechsel in der relativen Präferenz von Aufenthalt und Aufenthaltsdauer vom Dunkelfeld zum Hellfeld bewirkt.
B. Dieser Effekt (aus A.) wird verdeutlicht wenn aus demselben Experiment die Aufenthaltsdauer im Hellfeld durch die im Dunkelfeld geteilt wird. Beispiel 4: Untersuchungen, die die Sekretion von DISCl zeigen
Eine humane Neuroblastomzelllinie (SHSY-5Y) wurde mit dem volle länge humanes DISCl-Gen (1-854) oder einem C-terminalen humanen DISCl -Fragment, fusioniert an das "greenfluorescent protein" (GFP), dergestalt retroviral transfiziert, dass eine Expression durch Zugabe von Tetryzyklin 1 μg/ml ("tet-on") in das Zellkulturmedium ausgelöst werden kann (retrovirales induzierbares Transfektionssystem pTRE-TIGHT von Clontech/Invitrogen, USA); die Tetrezyklin-induzierte Expression hat gegenübber anderen transienten Expressionssystemen den Vorteil, dass die Zellen durch die Transfektion nicht sterben und so zytosolische Bestandteile bedingt duch Zelltod in den Zellkultur- überstand übergehen. Die Zellen wurden dann für zwei Tage in Serum-freiem Medium mit 1 μ§/ηι1 Tetrazyklin induziert und der gesamte Zellkulturmedium-Überstand wurde schliesslich nach zwei Tagen zunächst abzentrifugiert um ggf. vorhandene tote Zellen abzusondern, mit 7g Ammoniumsulfat/ 10 ml Überstand gefällt und auf einem SDS- PAGE Gel aufgetrennt und im Western blot mit Standardmethoden und dem Antikörper 14F2 gegen humanes DISCl Protein dargestellt. Als Kontrolle wurden auch die Zellysate mit untersucht.
Figur 6 zeigt einen Western blot von Überständen (Spuren 1-4) oder Zelllysaten (Spuren 5-8). Die jeweils geradzahligen Spuren 2, 4, 6 und 8 zeigen Tetrazyklin-induzierte, die nicht-geradzahligen Spuren 1 , 3, 5, 7 nicht induzierte humane SHSY-5Y Zellen. Die Spuren 2 und 6 zeigen volle Läge humanes DISCl protein oder humanes DISCl (598- 854) Fragment (Spuren 4 und 8), C-terminal fusioniert an green-fluorescent protein (GFP).
Es ist zu sehen, dass grosse Mengen DISCl Immunreaktivität im Überstand zu finden sind (vergleiche korrespondierende Spuren "induziert" DISCl volle Länge (VL) oder GFP DISCl (598-854) vs. "nicht induziert"). Da während der schonenden Induktion mit Tetrazyklin keine toten Zellen beobachtet wurden, und die Menge an Immunreaktivität auch nicht durch wenige tote Zellen erklärbar ist, wird gefolgert, dass DISCl überraschenderweise aus den Zellen sekretiert wird.

Claims

Patentansprüche:
1. Zubereitung enthaltend DISC1 und/oder mindestens ein DISC1 -Fragment zur Anwendung bei der therapeutischen Behandlung bzw. Modulation neurochemischer Prozesse des menschlichen oder tierischen Körpers oder bei der therapeutischen Behandlung zur Beeinflussung der Proliferation bzw. Migration von Zellen im menschlichen oder tierischen Körper.
2. Zubereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie zur subcutanen, intramuskulären, intravenösen, intracerebralen, intranasalen oder intraperitonealen Verabreichung formuliert ist.
3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet dass sie zusätzlich mindestens eine immunstimulierende Substanz enthält.
4. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem mindestens einen Fragment um DISC1 -598-785 handelt.
5. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-4, zur Anwendung als Beruhigungsmittel bei Tieren und Menschen.
6. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-5 zur Therapie von Tieren und Menschen, deren neurochemische Prozesse gestört sind.
7. Zubereitung nach Anspruch 6 zur Anwendung bei der Behandlung von Störungen des Dopaminstoffwechsels oder bei der Modulation des Dopaminstoffwechsels.
8. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-4 zur Anwendung bei der Behandlung von Suchterkrankungen, von Störungen der Genussfähigkeit oder der Anhedonie.
9. Zubereitung nach Anspruch 7, zur Anwendung bei auf den peripheren Dopaminstoffwechsel zurückgehende Erkrankungen wie insbesondere kardiovaskuläre Erkrankungen, Übergewicht oder sexuelle Funktionsstörungen.
10. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 -7 zur Anwendung bei der Behandlung von Lemstörungen oder Beeinträchtigungen des Gedächtnisses, insbesondere von "Mild Cognitive Impairment" oder der Alzheimer Erkrankung.
11. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-7 zur Anwendung bei der Behandlung von Nebenwirkungen von Medikamenten oder Substanzen, die den Dopaminstoffwechsel beeinflussen, oder bei akuten Vergiftungen durch Substanzen.
12. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-4 zur Anwendung bei der Behandlung von Krebserkrankungen.
13. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-4 zur Anwendung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen wie der Multiplen Sklerose.
14. Zubereitung nach einem der Ansprüche 1-4 zur Anwendung bei der Beinflussung oder Verzögerung von Auswirkungen des biologischen Alterns.
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