WO2012141546A2 - 미생물 발효를 통해 제조된 생성물을 흡착제를 이용하여 분리 정제하는 장치 및 방법 - Google Patents

미생물 발효를 통해 제조된 생성물을 흡착제를 이용하여 분리 정제하는 장치 및 방법 Download PDF

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    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to an apparatus and a separation purification method for continuously separating and purifying a product produced by fermentation of microorganisms.
  • Butanol is an intermediate compound with a wide range of applications, such as cosmetics, perfumes, hormones, hygiene, industrial coatings, paint additives, fibers, plastic monomers, medical supplies, vitamins, antibiotics, and pesticides (Durre, Biotechnol). J, 2: 1525-1534, 2007].
  • this method has a disadvantage in that only butanol is selectively adsorbed to activated carbon, and the concentration of butanol is low, so that butanol is difficult to recover, and the physical stability of activated carbon is insufficient and cannot be reused.
  • the amount of butanol adsorbed is proportional to the concentration of butanol, but the amount of butanol adsorbed is very small because the concentration of butanol produced by continuous culture is low. Due to this problem, the productivity does not exceed 1 g / L / h despite the continuous culture process.
  • due to the aggregation of the strain may cause problems in the process due to physical clogging of the column filled with activated carbon.
  • the aggregated mass of cells blocks the column and forms a channel in the flow of the culture medium, making it difficult to adsorb products such as butanol, acetone, isopropanol or ethanol to the entire adsorbent, thereby lowering the adsorption efficiency.
  • adsorb products such as butanol, acetone, isopropanol or ethanol
  • adsorb products such as butanol, acetone, isopropanol or ethanol
  • the adsorbent must be recovered again in the culture medium, and the loss of the adsorbent inevitably occurs during the recovery process.
  • impurities and microorganisms generated by the microorganisms are adsorbed at the same time during the culturing process, thereby lowering the purity and productivity when recovering butanol.
  • the amount of butanol adsorbed is proportional to the amount of adsorbent added to the culture, which causes a limitation in the amount of adsorbent added to the culture.
  • this method is relatively limited in the method of increasing the concentration of butanol because the relatively high concentration of ethanol and acetone acts to desorb the adsorbed butanol.
  • It includes a conversion unit for adjusting the culture solution containing the product is supplied to the specific column from the culture tank,
  • the conversion unit stops the supply of the culture medium to the first column when the product is sufficiently adsorbed in the first column to which the culture medium is supplied, and changes the flow of the culture medium so that the culture medium is supplied to the second column, continuous fermentation of the product A separation purification apparatus is provided.
  • the product in the microbial culture can be separated and purified at a simple and high speed.
  • FIG. 1 shows a fermentation separation and purification apparatus of a product produced through microbial fermentation according to one embodiment of the present invention.
  • 2 is a comparative graph showing relatively butanol adsorption performance of the adsorbents.
  • Figure 4 shows the culture results cultured in a culture method according to an embodiment of the present invention.
  • ABE acetone, butanol and ethanol.
  • the present invention is a.
  • It includes a conversion unit for adjusting the culture solution containing the product is supplied to the specific column from the culture tank,
  • the conversion unit stops the supply of the culture medium to the first column when the product is sufficiently adsorbed in the first column to which the culture medium is supplied, and changes the flow of the culture medium so that the culture medium is supplied to the second column, continuous fermentation of the product
  • a separate purification apparatus FIG. 1.
  • fermentation separation and purification device of the product produced through the microbial fermentation (hereinafter referred to as “fermentation separation and purification device") and fermentation of the product produced through the microbial fermentation according to the present invention
  • the separation purification method (hereinafter referred to as 'fermentation separation purification method') will be described in detail.
  • the fermentation separation purification apparatus of the present invention includes two or more columns packed with an adsorbent.
  • the fermentation separation and purification apparatus of the present invention includes 2 to 20 columns filled with the adsorbent, more preferably 2 to 10, even more preferably 2 to 5, and most preferably Includes two to three.
  • the columns may be represented by a first column, a second column, a third column, a fourth column, a fifth column, a sixth column, and the like. However, hereinafter, it will be described using two columns for convenience of explanation.
  • the terms "first column” and "second column” used in the following description are arbitrarily numbered for convenience of description and do not mean that the fermentation separation and purification apparatus of the present invention includes only two columns.
  • the present invention is to supply the culture solution to several columns continuously, the description of one column is equally applied to the other column.
  • the culture tank 130 receives the raw material and the medium from the supply tank 140 to culture the microorganisms. As a result, in the culture tank 130, a fermentation broth of the microorganisms (hereinafter referred to as "culture medium") is produced, and the culture broth contains a product produced by the microorganisms through fermentation.
  • culture medium a fermentation broth of the microorganisms
  • the culture solution discharged from the culture tank 130 is supplied to the first column 110 using the pump 160.
  • the supply may be continuous or discontinuous.
  • the culture solution supplied to the first column 110 includes a product produced by the microorganism through fermentation, and the product in the culture solution is adsorbed to the adsorbent 112 in the column.
  • the fermentation separation purification apparatus of the present invention may further include a stirrer (not shown) for stirring the adsorbent and the product in the column.
  • a stirrer for stirring the adsorbent and the product in the column.
  • the culture medium and the adsorbent inside the first column 110 are evenly mixed to prevent the culture medium and the adsorbent from agglomerating in the column, in particular, the portion to which the culture solution is supplied or the discharge liquid is discharged out of the column. I can keep it.
  • the culture may be circulated from the top of the first column 110 to the bottom, but is not limited thereto.
  • the connection between the culture tank 130 and the first column 110 is blocked by the first conversion unit 170, so that the culture solution to the first column 110 Supply is interrupted.
  • the first converter 170 and the third converter 174 are opened in a direction in which the culture tank 130 and the second column 120 are connected to each other, and the culture solution is supplied to the second column 120. That is, when the product is sufficiently adsorbed in the first column 110, the supply of the culture solution to the first column 110 is stopped, and the flow of the culture solution is changed so that the culture solution is supplied to the second column 120.
  • the first conversion unit 170 and the third conversion unit 174 may include a 4-way valve.
  • desorption may proceed in the first column 110 in which the supply of the culture solution is blocked.
  • Desorption means eluting the product adsorbed to an adsorbent from an adsorbent, and making an adsorbent the state which can be resorbed.
  • the desorption may be performed using heat or an eluting agent, but is not limited thereto.
  • the type is not limited as long as it is suitable for the process conditions.
  • the desorption is carried out using heat or an eluent, so that the desorption can be performed at any time, and a sufficient amount of the product can be separated and purified even with a small amount of the adsorbent 112.
  • the desorption of the present invention can be carried out by applying heat to the adsorbed product to vaporize the product, which is preferably costly heat and can be applied in the form of steam or hot air.
  • the steam is steam, and may be applied at a pressure of 0,01-6.bar.
  • the hot air can be applied at a pressure of 0.01 ⁇ 6 bar, and has a temperature that can elute the product without damaging the column and the adsorbent.
  • the temperature of the hot air is 100 to 200 ° C, preferably 110 to 150 ° C, more preferably 120 to 140 ° C, and most preferably 130 ° C.
  • the desorption of the present invention can be carried out using an eluent
  • the eluent may be an organic solvent, an acidic aqueous solution or a basic aqueous solution.
  • the organic solvent may be tetrahydrofuran, alcohol, ketone, ether or ester, preferably methanol, acetone, ethyl acetate, diethyl ether or methyl ethyl ketone, but is not limited thereto.
  • desorption is flowing a tetrahydrofuran solvent or passing water vapor.
  • desorption may be carried out by flowing a tetrahydrofuran solvent twice the volume of the adsorbent at a flow rate of 10 mL / min, or by passing a steam at 130 ° C. at a pressure of 2 bar.
  • the desorption proceeds in a state in which the adsorbent in the first column 110 is not taken out, that is, in-situ.
  • the culture solution may be supplied to the second column 120 to continuously flow the culture solution.
  • the adsorption proceeds continuously in the second column 120 to which the culture solution is supplied, fermentation separation and purification of the product is continuously performed.
  • the fermentation separation purification apparatus of the present invention may further include a filter 114 at the top or bottom of the column to prevent the adsorbent 112 from being eluted and lost.
  • the case where the product in the column is sufficiently adsorbed is when the product is sufficiently adsorbed to the adsorbent in the column. That is, when the product is sufficiently adsorbed, the product is sufficiently adsorbed in the first column, and the adsorption of the product in the first column is stopped rather than continuously producing and adsorbing the product in the first column, and the second column is It is the case that it is better to adsorb the product at.
  • the adsorption rate of the product to the adsorbent is low or the concentration of the product in the discharge liquid discharged from the column is 80% or more of the concentration of the product in the culture liquid supplied to the column.
  • the microbial fermentation broth of the present invention includes a product produced by the microorganism, in particular butanol.
  • the concentration of butanol in the culture reaches about 12 g / L, the microorganism may be fatally affected by the toxicity of butanol.
  • the discharge liquid discharged from the column of the present invention is supplied to the culture tank, and as the discharge liquid is continuously supplied to the culture tank, the concentration of the product in the culture tank, especially butanol, is increased, and as a result, Microbial culture in the culture tank may be inhibited. Therefore, the case where the product of the present invention is sufficiently adsorbed may be a case where the growth of microorganisms in the culture tank is inhibited by an increase in product concentration, or when the product productivity of the microorganism is lowered.
  • the culture The growth of microorganisms in the tank may be inhibited by an increase in the concentration of the product, or the productivity of the microorganisms may be reduced, which may be determined by those skilled in the art according to the type of microorganism, the type of adsorbent, the type and composition of the product, and the like.
  • the productivity of the microorganisms may be reduced, which may be determined by those skilled in the art according to the type of microorganism, the type of adsorbent, the type and composition of the product, and the like.
  • the connection between the culture tank 130 and the second column 120 is blocked by the first converter 170 and the third converter 174.
  • the supply of the culture solution flowing into the second column 120 is stopped.
  • the conversion unit is opened in a direction in which the culture tank 130 and the other column are connected, and the culture solution is supplied to the other column.
  • desorption proceeds, and in another column, adsorption of the product in the culture solution proceeds, thereby separating and purifying the product continuously.
  • the desorption in the second column 120 proceeds as in the desorption in the first column 110.
  • the 'other column' may be the first column 110 or the third column. This may vary depending on the number of columns included in the fermentation separation purification apparatus. That is, if there are three or more columns in the fermentation separation purification apparatus, the 'other column' will be the third column. If there are two columns in the fermentation separation and purification device, the 'other column' will be the first column 110, and the first column 110 will be adsorbed by the product in the second column 120. Desorption will be completed. In this case, the first converter 170 is opened in the direction in which the culture tank 130 and the first column 110 are connected, and the culture solution is supplied to the first column 110. The adsorption of the product will proceed in the first column 110 while the desorption proceeds in the second column 120.
  • the fermentation separation purification apparatus of the present invention can not only reuse the adsorbent in the columns by repeating the above process, but also can continuously fermentation separation and purification of the product.
  • the fermentation separation purification apparatus of the present invention may further include a storage tank 150 for storing the product desorbed from the adsorbent filled in the first column (110). While the desorption is performed in the first column 110, the second converter 172 and the fourth converter 176 are opened in a direction in which the reservoir 150 and the first column 110 are connected. As a result, the product desorbed from the first column 110 is moved to the reservoir 150.
  • the second converter 172 and the fourth converter 176 may include a four-way valve.
  • the desorbed product may also be stored in the reservoir 150.
  • the fourth conversion unit 176 is opened in the direction in which the reservoir 150 and the second column 120 are connected, thereby moving the desorbed product to the reservoir 150.
  • At least a portion of the discharge liquid discharged from the column of the present invention may be supplied to the culture tank.
  • the amount of the discharge liquid supplied to the culture tank may be equal to or less than the amount of the culture solution supplied to the column from the culture tank.
  • the fermentation separation purification apparatus and the fermentation separation purification method of the present invention can be easily and continuously fermentation separation and purification of the product produced through the microbial culture, and the adsorption efficiency is also high because the desorption is properly performed when the product is sufficiently adsorbed on the adsorbent. . Therefore, the fermentation separation purification apparatus and the fermentation separation purification method of the present invention can separate and purify products produced through microbial culture with high efficiency.
  • the microorganism of the present invention may be any microorganism having the ability to produce a biofuel product from a raw material, and is not particularly limited.
  • the microorganism of the present invention may be a bacterium, a yeast or a fungus and the like, preferably a bacterium or a yeast.
  • the microorganism of the present invention may be a wild type microorganism or a genetically modified microorganism.
  • the microorganism of the present invention may be Clostridium genus or Escherichia coli, which is genetically recombined so that the productivity of a wild type or a specific product is high, but it will be apparent to those skilled in the art.
  • a Clostridium microorganism lacking a gene (buk) encoding a butyrate kinase enzyme as the microorganism of the present invention, butanol, acetone, isopropanol or ethanol under anaerobic conditions without producing much butyric acid
  • the genetically engineered Clostridium can be prepared according to the method disclosed in the published paper (Microbiology (1996), 142, 2079-2086).
  • a mutant PJC4BK or BKM19 (KCTC 10558BP) is prepared by deleting the butyrate kinase gene (buk) in Clostridium acetobutylicum.
  • mutant strains are prepared by deleting phosphotransacetylase gene (pta) and acetic acid kinase gene (ackA), respectively, in the strain.
  • pta phosphotransacetylase gene
  • ackA acetic acid kinase gene
  • the microorganism of the present invention can be cultured by fed-batch or continuous culture method.
  • the continuous culture method is a method of fermenting while maintaining a constant culture medium in the culture tank by supplying fresh medium to the culture tank at a constant rate and simultaneously discharging the same amount of microbial fermentation broth.
  • the fed-batch culture method is a method of intermittently supplying a medium, and is a method of arbitrarily controlling the substrate concentration in the culture solution.
  • the raw material of this invention should just be what a microorganism can use for fermentation, and can produce a product, The kind in particular is not restrict
  • the raw material of the present invention may be biomass, sugars or fatty acids.
  • the biomass may be wood, grains, or the like, but is not limited thereto.
  • the sugars may be monosaccharides, polysaccharides, polysaccharides, and the like, may be sugars composed of C 3 to C 12, and include polysaccharides generated during hydrolysis of biomass.
  • the sugar may be glycerol, glucose, sucrose, xylose, starch, cellulose, and the like, but is not limited thereto.
  • the fatty acid may be a C2 to C24 fatty acid, but may be acetic acid, butyric acid, propionic acid, and the like, but is not limited thereto.
  • the products of the present invention are fermentation products produced by microorganisms.
  • the product of the present invention is a biofuel, but may be alcohol, ketone, ester or carboxylic acid and the like, but is not limited thereto.
  • the alcohol may be a C2 to C6 alcohol, preferably C4 or less alcohol, more preferably ethanol, propanol, isopropanol (2-propanol), 1,2-propanediol, 1,3- Propanediol, 1,3-butanediol, 1,4-butanediol, butanol, and the like, but is not limited thereto.
  • the ketone may be a C3 ⁇ C8 ketone, for example, but may be acetoacetate, acetone, but is not limited thereto.
  • the ester may be a C4 ⁇ C8 ester, for example, may be, but is not limited to, ethyl acetate, ethyl butylate, butyl acetate, butyl butylate, and the like.
  • the carboxylic acid may be C2 to C8 carboxylic acid, for example, may be acetic acid, butyric acid, propionic acid, but is not limited thereto.
  • the product of the present invention may be butanol, isopropanol, ethanol or acetone, but is not limited thereto.
  • the adsorbent 112 of the present invention may be filled with a volume of the column in which it is contained, i.e., from 0.1% to 99% by volume. If the adsorbent 112 is less than 0.1% by volume relative to the volume of the column, the amount of the adsorbent 112 may be insufficient and thus adsorption may not be performed properly. In addition, when the adsorbent 112 is 99% by volume or more, the adsorbent 112 or agglomerated masses of cells may be formed inside the column, and thus adsorption may not be performed properly.
  • the column form into which the culture fluid is supplied may be in the form of a slurry reactor, a flow reactor or a packed reactor.
  • the fluidized reactor type is a low amount of adsorbent and high fluidity
  • the slurry reactor type is an adsorbent suspended in a culture medium
  • the packed reactor type is a substantially full adsorbent in a column. (packed) form.
  • the intermediate forms of the three forms may be classified into the three forms according to which of the three forms are close to each other, and the inside of the column does not belong to any of the three forms as the intermediate state of the three forms. Not.
  • the adsorbent may be classified into a filling reactor, or if it is determined that it is suspended to some extent, may be classified into a slurry reactor.
  • the converter of the present invention changes and regulates the flow of the culture solution or the discharge liquid, and controls the culture solution to be supplied from the culture tank 130 to a specific column, or sends the discharge liquid discharged from the specific column to the storage tank 150.
  • One or more conversion units may be used, which may be appropriately installed by those skilled in the art according to the design of the fermentation separation and purification apparatus of the present invention.
  • butanol adsorption performance of various adsorbents of Mitsubishi Corporation was compared.
  • Several kinds of adsorbents were added to 50 mL of 50 mM phosphate buffer solution containing 2% butanol, and the mixture was allowed to stand for 1 hour while stirring, and then the concentration of butanol remaining in the solution was analyzed by gas chromatography.
  • the adsorbent SP850 had the best performance (FIG. 2), but the type of the adsorbent is not limited to the SP850.
  • Analysis of products such as butanol, acetone, isopropanol or ethanol was performed by gas chromatography (Agilent, USA), the analysis conditions are shown in Table 1 below.
  • butanol adsorption rate is very important because the culture medium has to adsorb butanol for a short time passing through the column.
  • 3 g (dry weight) adsorbent was added to 50 mL of CGM liquid medium containing various concentrations of butanol, followed by sampling at 30 seconds, 1 minute, 2 minutes, 5 minutes, 10 minutes, 30 minutes, and 1 hour while stirring at 200 rpm. Butanol concentration remaining in the solution was confirmed by gas chromatography analysis.
  • Recombinant Clostridium strains were prepared to confirm the amount of adsorbent and fermentation conditions suitable for fed-batch fermentation.
  • Recombinant Clostridial microorganisms C. acetobutylicum PJC4BK-IPA2 containing secondary alcohol dehydrogenase required for microbial fermentation were prepared.
  • CGM Chrotridium Growth Media
  • Electroporation buffer solution was prepared by mixing 15 mL of 270 mM sucrose and 0.11 mL of 686 mM NaH 2 PO 4 (pH 7.4). The cell pellet was washed three times with the electroporation buffer prepared as described above, and then suspended in 2 mL of the same buffer to prepare transformed cells. In this manner, 0.5-2.0 g of plasmid containing the secondary alcohol dehydrogenase gene was added to 500 l of the transformed cell, and electroporation was performed using Bio-Rad's Gene pulser II (4 mm cuvette, 2.5 kV, ⁇ ).
  • the plasmids used for transformation were all methylated in Escherichia coli ER2275 transformed with the pAN1 vector prior to electroporation so as to be insensitive to the restriction system of the Clostridium strain.
  • the concentration of sugar and organic acid can be determined by centrifuging the culture, obtaining a supernatant, using high pressure liquid chromatography (HPLC), gas chromatography, and a sugar analyzer.
  • HPLC conditions used water containing 0.01 N sulfuric acid as the mobile phase and the flow rate is 0.6 mL / min.
  • Aminex87H and Aminex87P (Bio-rad, USA) were used for the column, and the resulting sugar and organic acid were analyzed using a Reflective Index (RI) detector.
  • Products such as butanol, acetone, isopropanol and ethanol were prepared using the fed-batch culture method based on the optimized results in the above experimental examples.
  • Experimental methods and analysis were performed in the same manner as in ⁇ Experimental Example 3>, but the concentration of CGM culture medium containing 250 mL of adsorbent was increased to 1 and 2 times, respectively, while fermenting the glucose contained in the culture medium, such as butanol, acetone, isopropanol and ethanol. The amount of product produced was compared.
  • the fed-batch culture apparatus shown in FIG. 1 was produced, and at this time, two columns were included.
  • a stirrer was installed after mounting a filter of about 150 m. Thereafter, 300 mL of the SP850 adsorbent was packed into two columns (the first column and the second column, respectively). This was connected to the culture tank using a silicone tube and equipped with a pump so that the culture fluid circulated the column.
  • the four-way valve was adjusted to change the flow of the culture medium and the product to the first column where desorption was completed.
  • the adsorbents of the first column and the second column can be reused.
  • the circulation direction of the culture solution was circulated from the top of the column but the direction is not a problem.
  • a C. acetobutylicum PJC4BK strain having a production capacity of butanol, acetone, and ethanol was prepared using a fed-batch culture apparatus, and cultured as in the experimental examples.
  • the incubation was started by inoculating 300 mL of the spawn anaerobic incubator overnight in a CGM liquid medium in a reactor containing 2.7 L of CGM liquid medium.
  • the seed was cultivated by a general batch fermentation, but in order to produce a high concentration of butanol, acetone, and ethanol at a higher cell concentration, it may be cultured in a cell-immobilized form.
  • the culture solution was passed through a first column through a pump at a flow rate of 30 mL / min.
  • the adsorbent SP850 was suspended in the culture solution to form a slurry phase, and the flow of the culture solution was confirmed to pass through the first column without being blocked by the aggregated mass of cells.
  • the culture medium samples were taken immediately before and after the passage of the first column, and the concentrations of butanol, acetone, ethanol and the like were analyzed by gas chromatography.
  • the sugar concentration was maintained at 20 g / L during the incubation process using HPLC and glucose analyzer.
  • the amount of products such as butanol, acetone, isopropanol or ethanol was confirmed by gas chromatography.
  • the fed-batch culture was performed stably for about 150 hours, and it was confirmed that the concentration of the product in the discharge liquid (after adsorption) discharged from the column was significantly lower than the concentration of the product in the culture solution (before adsorption) supplied to the column. That is, it was confirmed that products such as butanol, acetone, and ethanol in the discharge liquid discharged from the column were maintained at very low concentrations. In addition, it was confirmed that the product was maintained at a constant concentration even in the culture apparatus, so that the microorganisms were not affected by the toxicity of butanol, thereby stably producing the product.
  • first conversion unit 172 second conversion unit

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Abstract

본 발명은 미생물 배양을 통하여 생산한 생성물의 발효 분리 정제 장치 및 발효 분리 정제 방법에 대한 것이다. 본 발명의 발효 분리 정제 장치 및 발효 분리 정제 방법은 미생물 배양을 통하여 생산한 생성물을 간편하고 연속적이면서도 높은 효율로 분리 정제할 수 있다.

Description

미생물 발효를 통해 제조된 생성물을 흡착제를 이용하여 분리 정제하는 장치 및 방법
본 발명은 미생물을 발효 배양하여 생산한 생성물을 연속적으로 분리 정제하는 장치 및 분리 정제 방법에 대한 것이다.
부탄올은 화장품, 향수, 호르몬, 위생제, 산업용 코팅제, 페인트 첨가제, 섬유, 플라스틱 모노머, 의료용품, 비타민, 항생제, 농약 등 활용범위가 매우 넓은 중간체 화합물로 그 효용성이 매우 크다(문헌 [Durre, Biotechnol J, 2:1525-1534, 2007]).
기존의 부탄올 제조방법은 클로스트리디움(Clostridium) 균주로 당을 발효하여 부탄올, 아세톤 및 에탄올을 생산하는 방법(문헌 [미국공개특허 제1,315,585호])이 80년대까지 이용되었으나 이후로는 석유로부터 얻어진 프로필렌으로부터 부탄올을 합성하는 옥소법(oxo process)이 널리 이용되어 왔다. 그러나 석유 기반의 부탄올 제조법은 고온 고압을 사용하여 공정이 복잡하며 다량의 유해성 폐기물과 이산화탄소를 배출하는 문제점(문헌 [Tsuchida 등, Ind. Eng. Chem.Res., 45:8634, 2006])으로 최근에는 다시 재생가능 자원으로부터 미생물의 발효를 통해 친환경적으로 부탄올을 생산하기 위한 요구가 증가하고 있다.
그러나 앞서 언급한 바와 같이 현재 부탄올은 대부분 화학합성법에 의해 생산되고 있다. 유가 상승과 환경 문제 야기 등으로 세계 각국에서는 바이오부탄올 연구에 대한 관심이 급속하게 증가되고 있는 상황이나, 아직까지 바이오 부탄올을 효율적으로 생산한 예는 없었다.
부탄올의 경우 지금까지 발효를 통하여 생산한 예는 대부분 클로스트리디움을 이용하여 생산한 것으로, 벡터에 adc(아세토아세트산 탈탄산 효소), ctfA(CoA 전달 효소 A) 및 ctfB(CoA 전달 효소 B)의 3가지 유전자를 넣고 adc의 프로모터를 사용하여 인위적 오페론을 제작하고, 이 플라스미드(pFNK6)를 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824 균주에 도입한 결과, 야생형에 비해 아세톤, 부탄올 및 에탄올의 생산성을 각각 95%, 37% 및 90% 증가시킨 예가 있다(문헌 [Mermelstein 등, Biotechnol. Bioeng., 42:1053, 1993]). 또한, aad(알코올/알데히드 탈수소 효소)를 클로닝한 후 발현시켜 야생형과 비교한 결과, 아세톤의 생성량에 비해 부탄올 및 에탄올의 생성량이 높게 나타낸 예(문헌 [Nair 등, J. Bacteriol., 176:871, 1994])가 있다. 이 외에 유전자의 기능을 불활성화시키는 방법으로 buk(부티르산 인산화 효소)와 pta(인산화아세트산 전달 효소)를 불활성화시킨 예가 있는데 buk 유전자를 불활성화한 균주(PJC4BK)를 pH 5.0 이상으로 발효한 결과, 부탄올 생성량이 16.7 g/L까지 상당히 증가하는 것으로 보고되었다(문헌 [Harris 등, Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000]). 그러나, pta 불활성화의 경우는 야생형과 비교하였을 때 용매 생산에서 유의한 차이를 보이지 못한 것으로 보고되어 있다(문헌 [Harris 등, Biotechnol. Bioeng., 67:1, 2000]). 또한, 무작위 돌연변이로 유발된 돌연변이주 클로스트리디움 바이에링키(Clostridium beijerinckii) BA101 균주를 이용하여 탄소원으로 말토덱스트린(maltodextrin)을 사용하여 발효한 결과, 18.6 g/L의 부탄올이 생성된다는 것을 보고한 예도 있다(문헌 [Ezeji 등, Appl. Microbiol. Biotechnol., 63:653, 2004]). 하지만, 상기의 이러한 재조합 균주를 이용하더라도 모두 최종 산물인 부탄올의 독성으로 인하여 배양액 내 부탄올 생산량이 20g/L이하로 매우 낮아 산업적 이용이 불가능하다. 따라서 배양 과정에서 생산되는 부탄올을 인-시츄로 추출하여 배양액 내에 부탄올 농도를 세포독성을 야기하지 않는 수준으로 유지하기 위한 여러 가지 방법이 개발되었다. 예를 들어, 연속배양 동안 생산되는 부탄올을 활성탄을 이용해 흡착하여 생산성을 높인 결과가 보고되었다(문헌 [미국등록특허 제4520104호]).
그러나 이 방법은 활성탄에 부탄올만 선택적으로 흡착되고, 흡착되는 부탄올의 농도도 낮아 부탄올의 회수가 힘들고 활성탄의 물리적 안정성이 부족하여 재사용할 수 없기 때문에 부탄올 추출에 많은 비용이 드는 단점이 있다. 흡착되는 부탄올의 양이 부탄올의 농도에 비례하는데 연속배양에 의해 생산되는 부탄올의 농도가 낮아 흡착되는 부탄올의 양 또한, 매우 적다. 이런 문제로 인하여 연속 배양공정임에도 불구하고 생산성이 1g/L/h를 넘지 못한다. 또한, 균주의 응집으로 인하여 활성탄이 충진된 칼럼이 물리적으로 막히는 문제로 인하여 공정상의 문제를 야기할 수 있다. 이 방법은 세포들의 응집 덩어리가 칼럼을 막고, 배양액의 흐름에 채널을 형성하여 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물이 흡착제 전체에 흡착되는 것을 어렵게 하여 흡착 효율이 낮아진다. 활성탄 외에 흡착제를 이용하여 용매의 생산성과 농도를 높이고, 재생 가능한 흡착제를 이용하는 방법이 보고되었다(문헌 [Nielsen 등, Bioeng. Biotech. 102:811-821, 2009]). 이 방법은 흡착제를 배양액 내에 첨가하여 배양과정에서 생성되는 부탄올을 흡착제로 흡착하여 회수하는 방법이다. 이 방법에 의하면, 배양액 내에서 다시 흡착제를 회수해야 하며 회수 과정에서 필연적으로 흡착제의 손실이 발생한다. 또한, 배양과정에서 미생물이 생성하는 불순물과 원료물질인 당이 동시에 흡착되어 부탄올 회수 시 순도 및 생산성이 낮다. 또한, 흡착되는 부탄올의 양은 배양액 내에 첨가하는 흡착제의 양에 비례하는데, 이 방법은 배양액 내에 흡착제를 첨가하는 양에 한계가 발생한다. 또한, 이 방법은 상대적으로 에탄올과 아세톤의 농도가 높아지면서 흡착된 부탄올을 탈착시키는 작용을 하므로 부탄올의 농도를 높이는 방법으로는 한계가 있다.
본 발명의 목적은 미생물 발효 배양액으로부터 생성물을 연속적으로 분리 정제할 수 있는 장치 및 분리 정제 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
미생물이 원료 물질과 함께 배양되어 생성물을 생산하는 배양조;
흡착제가 충진된 2개 이상의 칼럼;및
생성물이 포함된 배양액이 배양조로부터 특정 칼럼으로 공급되도록 조절하는 변환부를 포함하되,
상기 변환부는 배양액이 공급되는 제 1 칼럼에서 생성물이 충분히 흡착된 경우, 상기 제 1 칼럼으로의 배양액의 공급을 중단하고, 제 2 칼럼으로 배양액이 공급되도록 배양액의 흐름을 변경하는, 생성물의 연속적 발효 분리 정제 장치를 제공한다.
또한 본 발명은,
미생물을 원료 물질과 함께 배양하여 생성물을 생산하는 단계;
상기 생성물이 포함된 배양액을 흡착제가 충진된 제 1 칼럼에 공급하는 단계;및
상기 제 1 칼럼에서 생성물이 충분히 흡착된 경우, 제 1 칼럼으로의 배양액의 공급을 중단하고 제 2 칼럼으로 배양액을 공급하는 단계를 포함하는,
생성물의 연속적인 발효 분리 정제 방법을 제공한다.
본 발명의 발효 분리 정제 장치 및 발효 분리 정제 방법을 이용하여, 미생물 배양액 내 생성물을 간단하면서도 빠른 속도로 분리, 정제할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 발효를 통하여 생산된 생성물의 발효 분리 정제 장치를 나타낸다.
도 2는 흡착제들의 부탄올 흡착 성능을 상대적으로 나타낸 비교 그래프이다.
도 3은 다양한 농도의 부탄올이 흡착제에 흡착하는 속도를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 배양법으로 배양한 배양 결과를 나타낸다. ABE: 아세톤, 부탄올 및 에탄올.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성요소를 지칭한다.
본 발명은
미생물이 원료 물질과 함께 배양되어 생성물을 생산하는 배양조;
흡착제가 충진된 2개 이상의 칼럼;및
생성물이 포함된 배양액이 배양조로부터 특정 칼럼으로 공급되도록 조절하는 변환부를 포함하되,
상기 변환부는 배양액이 공급되는 제 1 칼럼에서 생성물이 충분히 흡착된 경우, 상기 제 1 칼럼으로의 배양액의 공급을 중단하고, 제 2 칼럼으로 배양액이 공급되도록 배양액의 흐름을 변경하는, 생성물의 연속적 발효 분리 정제 장치에 대한 것이다(도 1).
또한 본 발명은,
미생물을 원료 물질과 함께 배양하여 생성물을 생산하는 단계;
상기 생성물이 포함된 배양액을 흡착제가 충진된 제 1 칼럼에 공급하는 단계;및
상기 제 1 칼럼에서 생성물이 충분히 흡착된 경우, 제 1 칼럼으로의 배양액의 공급을 중단하고 제 2 칼럼으로 배양액을 공급하는 단계를 포함하는,
생성물의 연속적인 발효 분리 정제 방법에 대한 것이다.
또한 본 발명은,
미생물을 원료 물질과 함께 배양하여 생성물을 생산하는 단계;
상기 생성물이 포함된 배양액을 흡착제가 충진된 제 1 칼럼에 공급하는 단계;
상기 제 1 칼럼에서 생성물이 충분히 흡착된 경우, 제 1 칼럼으로의 배양액의 공급을 중단하고 제 2 칼럼으로 배양액을 공급하는 단계;및
배양액이 공급되는 제 2 칼럼에서 생성물의 흡착이 진행되는 동안 상기 배양액의 공급이 중단된 제 1 칼럼에서는 흡착제에 흡착된 생성물의 탈착이 진행되는 단계를 포함하는, 생성물의 연속적인 발효 분리 정제 방법에 대한 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 미생물 발효를 통하여 생산된 생성물의 발효 분리 정제 장치(이하, '발효 분리 정제 장치'라 한다) 및 본 발명에 따른 미생물 발효를 통하여 생산된 생성물의 발효 분리 정제 방법(이하, '발효 분리 정제 방법'이라 한다)을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 발효 분리 정제 장치는 흡착제가 충진된 칼럼을 2개 이상 포함한다. 바람직하게는 본 발명의 발효 분리 정제 장치는 상기 흡착제가 충진된 칼럼을 2 내지 20개 포함하며, 더욱 바람직하게는 2 내지 10개 포함하고, 더더욱 바람직하게는 2 내지 5개 포함하며, 가장 바람직하게는 2 내지 3개 포함한다. 상기 칼럼들은 제 1 칼럼, 제 2 칼럼, 제 3 칼럼, 제 4 칼럼, 제 5 칼럼, 제 6 칼럼...과 같은 식으로 나타낼 수 있다. 그러나 이하에서는 설명의 편의를 위하여 2개의 칼럼을 이용하여 설명하기로 한다. 하기의 설명에서 사용하는 제 1 칼럼, 제 2 칼럼이라는 용어는 설명의 편의를 위하여 임의로 넘버링한 것이며 본 발명의 발효 분리 정제 장치가 칼럼을 2개만 포함한다는 것을 의미하는 것은 아니다. 또한 본 발명은 배양액을 여러 칼럼에 연속적으로 공급하는바, 한 칼럼에 대한 설명은 다른 칼럼에도 동일하게 적용된다.
배양조(130)에서는 공급조(140)로부터 원료 물질과 배지를 공급받아 미생물을 배양한다. 그 결과, 배양조(130)에서는 미생물의 발효 배양액(이하, '배양액'이라 한다)이 생성되게 되며, 상기 배양액 내에는 미생물이 발효를 통하여 생산한 생성물이 포함되게 된다.
배양조(130)로부터 배출된 배양액은 펌프(160)를 이용하여 제1 칼럼(110)으로 공급된다. 상기 공급은 연속적 또는 비연속적으로 이루어질 수 있다. 상기 제1 칼럼(110)에 공급된 상기 배양액 내에는 미생물이 발효를 통하여 생산한 생성물이 포함되어 있으며, 상기 배양액 내 생성물이 칼럼 내 흡착제(112)에 흡착된다.
이 때, 본 발명의 발효 분리 정제 장치는 상기 칼럼 내에서 흡착제 및 생성물을 교반하는 교반기(도시하지 않음)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 교반기를 이용하여, 제1 칼럼(110) 내부의 배양액 및 흡착제가 골고루 혼합됨으로써, 칼럼 내, 특히 배양액이 공급되는 부분 또는 칼럼 밖으로 배출액이 배출되는 부분 등에 배양액 및 흡착제가 뭉치는 것을 방지할 유지할 수 있다. 배양액은 제 1 칼럼(110)의 위쪽에서 아래쪽으로 순환될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
제1 칼럼(110)에서 생성물이 충분히 흡착되면, 배양조(130)와 제1 칼럼(110)의 연결은 제1 변환부(170)에 의해 차단되어, 제1 칼럼(110)으로의 배양액의 공급이 중단된다. 그리고 배양조(130)와 제2 칼럼(120)이 연결되는 방향으로 제1 변환부(170) 및 제3 변환부(174)가 개방되어, 제2 칼럼(120)으로 배양액이 공급된다. 즉, 제1 칼럼(110)에서 생성물이 충분히 흡착되면, 상기 제 1 칼럼(110)으로의 배양액의 공급이 중단되고, 제 2 칼럼(120)으로 배양액이 공급되도록 배양액의 흐름이 변경되는 것이다. 이때, 상기 제1 변환부(170) 및 제3 변환부(174)는 4방 밸브(4-way valve)를 포함할 수 있다.
배양액이 공급되는 제 2 칼럼(120)에서 흡착이 진행되는 동안, 배양액의 공급이 차단된 제1 칼럼(110)에서는 탈착이 진행될 수 있다. 탈착이란, 흡착제에 흡착된 생성물을 흡착제로부터 용출시켜, 흡착제를 재흡착이 가능한 상태로 만드는 것이다.
상기 탈착은 열 또는 용출제를 이용하여 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며 공정 조건에 적합한 한 그 종류는 제한되지 않는다. 상기 탈착이 열 또는 용출제를 이용하여 수행됨으로써 수시로 탈착하는 것이 가능하며, 적은 양의 흡착제(112)로도 충분히 많은 양의 생성물을 분리 정제할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 탈착은 흡착된 생성물에 열을 가하여 생성물을 기화시킴으로써 수행될 수 있는데, 상기 열은 공정 상에서 발생하는 열인 것이 비용 상 바람직하며, 스팀 또는 뜨거운 공기의 형태로 가해질 수 있다. 상기 스팀은 수증기 상태이며, 0,01~6.bar의 압력으로 가해질 수 있다. 또한 상기 뜨거운 공기는 0.01~6 bar의 압력으로 가해질 수 있으며, 칼럼 및 흡착제를 손상시키지 않으면서도 생성물을 용출시킬 수 있는 온도를 갖는다. 예컨대, 상기 뜨거운 공기의 온도는 100~200 ℃이며, 바람직하게는 110~150 ℃이고, 더욱 바람직하게는 120~140 ℃이고, 가장 바람직하게는 130 ℃이다. 또한 본 발명의 탈착은 용출제를 이용하여 수행할 수 있으며, 상기 용출제는 유기 용매, 산성 수용액 또는 염기성 수용액이 될 수 있다. 상기 유기 용매는 테트라하이드로퓨란, 알코올, 케톤, 에테르 또는 에스테르일 수 있으며, 바람직하게는 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 디에틸에테르 또는 메틸에틸 케톤이나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 탈착의 한 예는 테트라하이드로퓨란 용매를 흘려주거나, 수증기를 통과시키는 것이다. 예컨대, 흡착제 부피의 2배의 테트라하이드로퓨란 용매를 10mL/min의 유량으로 흘려주거나, 바람직하게는 2bar의 압력으로 130 ℃의 증기를 통과시켜 탈착을 수행할 수 있다.
상기 탈착은 제1 칼럼(110) 내부의 흡착제를 외부로 꺼내지 않은 상태, 즉 인-시츄(in-situ) 상태에서 진행된다. 이렇게 생성물이 흡착제(112)에 인-시츄로 흡착되면, 제1 칼럼(110)에 존재하는 배양액 내에 부탄올이 미생물의 생장이나 생성물의 생산성에 저해를 주지 않는 수준의 농도로 유지된다. 제1 칼럼(110)에서 탈착이 진행되는 동안, 배양액이 제2 칼럼(120)으로 공급되어 배양액의 흐름이 연속적으로 이루어질 수 있다. 또한 배양액이 공급되는 제2 칼럼(120)에서는 연속적으로 흡착이 진행됨으로써, 생성물의 발효 분리 정제가 연속적으로 이루어지게 된다.
본 발명의 발효 분리 정제 장치는 흡착제(112)가 용출되어 유실되는 것을 방지하기 위하여 컬럼의 상부 또는 하부에 필터(114)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 칼럼 내 생성물이 충분히 흡착된 경우란, 칼럼 내 흡착제에 생성물이 충분히 흡착된 경우이다. 즉, 상기 생성물이 충분히 흡착된 경우란 제 1 칼럼에서의 생성물 흡착이 충분히 이루어져, 제 1 칼럼에서 계속하여 생성물을 생산, 흡착시키는 것보다는 제 1 칼럼에서의 생성물의 흡착을 중단하고, 제 2 칼럼에서 생성물을 흡착하는 것이 낫다고 판단되는 경우이다.
예컨대, 본 발명의 생성물이 충분히 흡착된 경우란 흡착제에 대한 생성물의 흡착률이 낮아지는 경우 또는 칼럼으로부터 배출되는 배출액 내 생성물의 농도가 칼럼으로 공급되는 배양액 내 생성물의 농도의 80% 이상인 경우가 될 수 있다. 한편, 본 발명의 미생물 발효 배양액에는 미생물이 생산한 생성물, 특히 부탄올이 포함되는데, 배양액 내 부탄올의 농도가 약 12g/L에 도달하면, 미생물이 부탄올의 독성에 치명적인 영향을 받을 수 있다. 그런데, 본 발명의 칼럼에서 배출된 배출액은 적어도 일부가 배양조로 공급되게 되는바 배출액이 배양조로 계속적으로 공급됨에 따라 배양조 내 생성물, 특히 부탄올이 누적되어 부탄올의 농도가 높아지게 되며, 그 결과 배양조 내 미생물 배양이 저해될 수 있다. 그러므로 본 발명의 생성물이 충분히 흡착된 경우란 배양조 내 미생물의 생장이 생성물 농도 증가에 의하여 저해되는경우 또는 미생물의 생성물 생산성이 낮아지는 경우가 될 수 있다.
결국, 상기 생성물이 충분히 흡착된 경우는, 흡착제에 대한 생성물의 흡착률이 낮아지는 경우, 칼럼으로부터 배출되는 배출액 내 생성물의 농도가 칼럼으로 공급되는 배양액 내 생성물의 농도의 80% 이상인 경우, 배양조 내 미생물의 생장이 생성물 농도 증가에 의하여 저해되는 경우 또는 미생물의 생성물 생산성이 낮아지는 경우 등이 될 수 있는데, 이는 미생물의 종류, 흡착제의 종류, 생성물의 종류 및 조성 등에 따라 당업자가 적절히 판단할 수 있을 것이다.
그 후, 제2 칼럼(120) 내 생성물이 충분히 흡착되면, 배양조(130)와 제2 칼럼(120)의 연결은 제1 변환부(170) 및 제3 변환부(174)에 의해 차단되어, 제2 칼럼(120)으로 유입되는 배양액의 공급이 중단된다. 그 후 배양조(130)와 다른 칼럼이 연결되는 방향으로 변환부가 개방되어 상기 다른 칼럼으로 배양액이 공급된다. 그리고 제 2 칼럼(120)에서는 탈착이 진행되며, 상기 다른 칼럼에서는 배양액 내 생성물의 흡착이 진행됨으로써, 생성물의 분리 정제가 계속하여 연속적으로 이루어지게 된다. 이 때, 제 2 칼럼(120)에서의 탈착 역시 상기 제 1 칼럼(110)에서의 탈착과 마찬가지로 진행된다.
상기 '다른 칼럼'은 제 1 칼럼(110)일 수도 있고, 제 3 칼럼일 수도 있다. 이는 발효 분리 정제 장치 내 포함되는 칼럼의 개수에 따라 달라질 수 있다. 즉, 발효 분리 정제 장치 내 칼럼이 3개 이상인 경우, 상기 '다른 칼럼'은 제 3 칼럼이 될 것이다. 만약 발효 분리 정제 장치 내 칼럼이 2개인 경우, 상기 '다른 칼럼'은 제 1 칼럼(110)이 될 것이며, 상기 제 1 칼럼(110)은 상기 제 2 칼럼(120) 내 생성물의 흡착이 진행되는 동안 탈착이 완료된 상태일 것이다. 이 경우, 배양조(130)와 제1 칼럼(110)이 연결되는 방향으로 제1 변환부(170)가 개방되어, 제1 칼럼(110)으로 배양액이 공급된다. 그리고 제 2 칼럼(120)에서 탈착이 진행되는 동안 제 1 칼럼(110)에서는 생성물의 흡착이 진행될 것이다. 본 발명의 발효 분리 정제 장치는 상기의 과정을 반복함으로써 칼럼들 내 흡착제를 재사용할 수 있을 뿐 아니라, 생성물을 연속적으로 발효 분리 정제할 수 있다.
한편, 본 발명의 발효 분리 정제 장치는 제 1 칼럼(110)에 충진된 흡착제로부터 탈착되는 생성물을 저장하는 저장조(150)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제1 칼럼(110)에서 탈착이 진행되는 동안, 제2 변환부(172) 및 제4 변환부(176)는 저장조(150)와 제1 칼럼(110)이 연결되는 방향으로 개방된다. 이로 인하여, 제 1 칼럼(110)에서 탈착된 생성물이 저장조(150)로 이동하게 된다. 이 때, 제2 변환부(172) 및 제4 변환부(176)는 4방 밸브(4-way valve)를 포함할 수 있다.
제 2 칼럼(120)에서 탈착을 진행하는 경우도 역시 상기 저장조(150)에 탈착된 생성물을 저장할 수 있다. 이 때는 저장조(150)와 제2 칼럼(120)이 연결되는 방향으로 제4 변환부(176)가 개방되며, 이로써 탈착된 생성물을 저장조(150)로 이동시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 칼럼에서 배출된 배출액은 적어도 일부가 배양조로 공급될 수 있다. 이 때 배양조로 공급되는 배출액의 양은 배양조로부터 칼럼으로 공급되는 배양액의 양과 동일하거나 이보다 적을 수 있다.
상기에서 본 발명의 발효 분리 정제 장치 및 발효 분리 정제 방법에 대하여 간략히 설명하였다. 이하, 본 발명에 대하여 더욱 자세히 설명한다.
본 발명의 발효 분리 정제 장치 및 발효 분리 정제 방법은 미생물 배양을 통하여 생산한 생성물을 간편하면서도 연속적으로 발효 분리 정제할 수 있으며, 흡착제에 생성물이 충분히 흡착된 때 탈착이 적절히 이루어지기 때문에 흡착 효율 역시 높다. 그러므로 본 발명의 발효 분리 정제 장치 및 발효 분리 정제 방법은 미생물 배양을 통하여 생산한 생성물을 높은 효율로 분리 정제할 수 있다.
본 발명의 미생물은 원료물질로부터 바이오 연료인 생성물을 생산할 수 있는 능력을 미생물이면 되고, 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 본 발명의 미생물은 박테리아, 효모 또는 곰팡이 등이 될 수 있으며, 바람직하게는 박테리아 또는 효모이다. 본 발명의 미생물은 야생형 미생물일 수도 있고 유전자 조작 미생물일 수도 있다. 바람직하게는 본 발명의 미생물은 야생형 또는 특정 생성물의 생산성이 높도록 유전자가 재조합된 클로스트리디움(Clostridium)속 또는 대장균 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니라는 점은 당업자에게 자명할 것이다.
예컨대, 본 발명의 미생물로서 부티레이트 키나아제 효소를 코딩하는 유전자(buk)가 결실된 클로스트리디움속 미생물을 이용하는 경우, 부틸산을 많이 생성하지 않으면서도, 혐기적 조건에서 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물을 고농도로 생성할 수 있는 장점이 있다. 예컨대, 본 발명의 미생물로서 부티레이트 키나아제 효소를 코딩하는 유전자(buk), 포스포트란스아세틸라아제를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산 카나아제를 코딩하는 유전자(ackA) 등이 결실된 클로스트리디움속 미생물을 이용하는 경우, 다른 유기산은 많이 생성하지 않으면서, 혐기적 조건에서 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물을 고농도로 생성하는 장점이 있다. 또한 본 발명의 미생물로서, 아세토아세트산 탈탄산효소(acetoacetic acid decarboxylase)를 코딩하는 유전자(adc)가 결실된 클로스트리디움속 미생물을 이용하는 아세톤을 생성하지 않으면서, 부탄올을 선택적으로 고농도로 생성할 수 있는 장점이 있다. 또한, 아세톤으로부터 이소프로필알콜로 전환시키는 효소인 2차 알코올 디하이드로게나아제(ald)를 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질 전환된 클로스트리디움 속 미생물을 이용하는 경우, 고부가가치의 부탄올, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물을 생성할 수 있는 장점이 있다.
상기 유전자 조작 클로스트리디움은 발행논문(문헌 [Microbiology (1996), 142, 2079-2086])에 개시된 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)에서 부티레이트 키나아제 유전자(buk)를 결실시켜 변이주인 PJC4BK 또는 BKM19(KCTC 10558BP)를 제조한다. 이후, 상기 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta)와 아세트산 키나아제 유전자(ackA)가 각각 결실되도록 하여 변이균주들을 제조한다. 이후, 이를 혐기적 조건에서 배양하면 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물을 고농도로 생성되는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 미생물은 유가식 또는 연속식 배양 방법으로 배양될 수 있다. 연속식 배양법은 신선한 배지를 일정한 속도로 배양조로 공급하면서 동시에 같은 양의 미생물 발효 배양액을 배출시켜 배양조 내의 배양액을 항상 일정하게 유지하면서 발효하는 방법이다. 한편, 유가식 배양법은 배지를 간헐적으로 공급하는 배양법으로서 배양액 중의 기질농도를 임의로 제어하는 방법이다.
본 발명의 원료 물질은 미생물이 발효 시에 이용하여 생성물을 생산할 수 있는 것이면 되고, 그 종류가 특별히 제한되는 것은 아니다. 예컨대, 본 발명의 원료 물질은 바이오매스, 당류 또는 지방산 등이 될 수 있다. 상기 바이오매스는 목질, 곡류 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 당류는 단당류, 다당류, 다당류 등이 될 수 있으며, C3~C12로 이루어진 당류일 수 있고, 바이오매스의 가수분해 과정에서 생성되는 다당류를 포함한다. 예컨대, 상기 당류는 글리세롤, 글루코오스, 수크로오스, 자일로오스, 전분, 셀룰로오스 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 지방산은 C2~C24의 지방산일 수 있으며, 아세트산, 부틸산, 프로피온산 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 생성물은 미생물이 생산한 발효 산물이다. 바람직하게는 본 발명의 생성물은 바이오 연료로, 알코올, 케톤, 에스테르 또는 카르복실산 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니다. 예컨대, 상기 알코올은 C2~C6의 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 C4 이하의 알코올이고, 더욱 바람직하게는 에탄올, 프로판올, 이소프로판올(2-프로판올), 1,2-프로판다이올, 1,3-프로판다이올, 1,3-부탄다이올, 1,4-부탄다이올, 부탄올 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 케톤은 C3~C8 케톤일 수 있으며, 예컨대, 아세토아세테이트, 아세톤 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 에스테르는 C4~C8 에스테르일 수 있으며, 예컨대, 에틸 아세테이트, 에틸 부틸레이트, 부틸 아세테이트, 부틸 부틸레이트 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 카르복실산은 C2~C8 카르복실산일 수 있으며, 예컨대, 아세트산, 부틸산, 프로피온산 등이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 생성물은 부탄올, 이소프로판올, 에탄올 또는 아세톤이 될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 흡착제(112)는 그것이 포함된 칼럼의 용량, 즉 부피 대비 0.1% 내지 99%의 부피로 충진될 수 있다. 흡착제(112)가 칼럼의 부피 대비 0.1 부피% 미만일 경우에는 흡착제(112)의 양이 부족하여 흡착이 제대로 이루어지지 않을 수 있다. 또한 흡착제(112)가 99 부피% 이상일 경우에는 칼럼 내부에 흡착제(112) 또는 세포의 응집덩어리가 형성되어 흡착이 제대로 이루어지지 않을 수 있다.
배양액이 공급되는 칼럼 형태는 슬러리 반응기, 유동 반응기 또는 충진 반응기 형태일 수 있다. 상기 유동(fluidized) 반응기 형태란 흡착제의 양이 적고, 유동성이 높은 형태이며, 상기 슬러리(slurry) 반응기 형태란 흡착제가 배양액 내 현탁된 형태이고, 상기 충진 반응기 형태란 칼럼 내 흡착제가 실질적으로 가득 찬(packed) 형태이다. 이 때, 상기 세 형태의 중간인 형태들은 그것들이 상기 세 형태 중 어느 쪽에 가까운지에 따라 상기 세 형태로 분류될 수 있으며, 칼럼 내부가 상기 세 형태의 중간 상태라고 하여 상기 세 형태 중 어디에도 속하지 않는 것은 아니라 할 것이다. 예컨대, 유동성의 정도에 따라 실질적으로 유동성이 없을 정도로 흡착제가 찼다고 판단되면, 충진 반응기 형태로 분류할 수도 있고, 어느 정도 현탁된다고 판단되면, 슬러리 반응기 형태로 분류할 수도 있다.
본 발명의 변환부는 배양액 또는 배출액의 흐름을 변경 및 조절하는 것으로, 배양액이 배양조(130)로부터 특정 칼럼으로 공급되도록 조절하거나, 특정 칼럼으로부터 배출된 배출액을 저장조(150)로 보낼 수 있다. 상기 변환부는 하나 또는 복수 개 사용할 수 있으며, 이는 본 발명의 발효 분리 정제 장치의 설계에 따라 당업자가 적절히 설치할 수 있다.
<실험예 1>
본 발명의 일 실시예에 사용되는 적절한 흡착제를 선정하기 위하여 미쓰비시(Mitsubishi)사의 다양한 흡착제의 부탄올 흡착 성능을 비교하였다. 2% 부탄올을 포함하는 50mM 인산 버퍼용액 50mL에 여러 종류의 흡착제를 첨가하고 교반하면서 1시간방치 후, 용액에 잔류하고 있는 부탄올의 농도를 가스 크로마토그래피를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 흡착제 SP850가 가장 우수한 성능을 가지는 것으로 분석되었으나(도 2), 흡착제의 종류가 SP850에 제한되는 것은 아니다. 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물의 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였으며, 분석 조건은 아래의 표 1과 같다.
표 1
인젝터(injector) 온도 320℃
감지기 온도 320℃
인젝터 스플릿 비(injector split ratio) 20/1
주입 부피 0.1μL
오븐 조건 80℃/20분
공기 유량 300mL/분
H2 유량 30mL/분
칼럼: Supelco CarboWAX
가스크로마토그래피 분석 조건
<실험예 2>
흡착제 SP850에 부탄올이 흡착하는 속도를 확인하기 위해 부탄올의 흡착에 대하여 역학적 분석을 수행하였다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 배양에서는 배양액이 칼럼을 통과하는 짧은 시간 동안 부탄올을 흡착해야 하기 때문에 부탄올의 흡착 속도는 매우 중요하다. 먼저 부탄올이 다양한 농도로 포함된 CGM 액체배지 50mL에 3g(건조중량)의 흡착제를 첨가하고 200rpm으로 교반하면서 30초, 1분, 2분, 5분, 10분, 30분, 1시간 단위로 샘플링하여 용액에 잔류하고 있는 부탄올 농도를 가스 크로마토그래피 분석을 통해 확인하였다.
그 결과, 다양한 농도 범위에서 부탄올이 약 1분 이내에서 흡착되는 것을 확인할 수 있었다(도 3).
<실험예 3>
유가식 발효에 적절한 흡착제의 양과 발효 조건을 확인하기 위하여 재조합 클로스트리디움 균주를 제조하였다. 미생물 발효에 필요한 2차 알코올 디하이드로게나아제를 함유하는 재조합 클로스트리디움 미생물(C. acetobutylicum PJC4BK-IPA2)을 제조하였다. 클로스트리디움 균주를 CGM(Chlostridium Growth Media) 액체배지(0.75g/L K2HPO4, 0.75g/L KH2PO4, 0.7g/L, MgSO4H2O, 0.017g/L MnSO4H2O, 0.01g/L, FeSO4H2O, 2g/L (NH4)2SO4, 1g/L NaCl, 2g/L 아스파라긴(asparagine), 0.004g/L p-아미노 벤조산(p-aminobenzoic acid), 5g/L 효소 추출물(yeast extract), 4.08g/L CH3COONaH2O, 및 80g/L 글루코오스) 60mL에서 OD600=0.5가 될 때까지 혐기 조건에서 배양하였다. 이후, 배양액을 얼음에서 10분 동안 방치하고, 배양액을 7000G로 10분 동안 4 ℃에서 원심 분리한다. 270mM 수크로오스 15mL 및 686mM NaH2PO4(pH 7.4임) 0.11mL를 혼합하여 전기천공(electroporation) 완충용액을 제조하였다. 세포 펠릿을 상기와 같이 제조된 전기천공 완충용액으로 3회 씻은 다음, 같은 완충용액 2mL에 현탁하여 형질전환용 세포를 제작하였다. 이렇게 제작된 형질전환용 세포 500l에 2차 알코올 디하이드로게나아제 유전자를 포함하는 0.5~2.0g의 플라스미드를 첨가하여 Bio-Rad사의 Gene pulser II를 이용하여 전기천공(4mm 큐벳, 2.5kV, ∞Ω, 25uF)을 수행하고 항생제가 첨가된 배양액에서 혐기 배양한 후 형질전환 균주를 완성하였다. 형질 전환을 위해 사용한 플라스미드는 모두 전기천공 전에 pAN1 벡터로 형질 전환된 대장균 ER2275에서 메틸화되어 클로스트리디움 균주의 제한 시스템(restriction system)에 작용을 받지 않게 제작된 것들이다.
위에서 배양한 클로스트리디움 균주 PJC4BK-IPA2를 CGM/클로람페니콜(Chlorampenicol) 평판 배지에 도말하여 37 ℃에서 밤새 혐기 배양하였다. 배양된 콜로니 2개를 CGM/클로람페니콜 배양액 20mL가 포함된 50mL 일회용 튜브에 접종하고, 37 ℃에서 정치하며 OD600=3이 될 때까지 혐기 배양하였다. 배양된 종균을 다시 8% 글루코오스 100mL를 포함하는 CGM 액체배지에 접종하고 37 ℃에서 정치하며 OD600=2~3이 될 때까지 혐기 배양하여 CGM 액체배지 1L와 흡착제가 각각 0(0g/L, 건조중량), 200(60g/L), 250(75g/L), 300(90g/L), 350(105g/L), 400mL(120g/L)이 포함된 배양조에 접종하여 배양을 시작하였다. 배양 시작 후 20g/L 이상의 포도당 농도를 계속 유지하면서 3시간 마다 생성되는 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등의 농도를 분석하였다. 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등의 생성물의 분석은 가스 크로마토그래피(Agilent, USA)를 이용하였으며, 분석 조건은 표 1의 조건과 동일하게 수행하였다.
당과 유기산의 농도는 배양액을 원심 분리한 후, 상등액을 수득하고, 고압 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography; HPLC), 가스 크로마토그래피(gas chromatography), 당분석기를 이용해 확인할 수 있다. HPLC 조건은 이동상으로 0.01N 황산을 함유한 물을 이용하였으며 유속은 0.6mL/min이다. 칼럼은 Aminex87H 및 Aminex87P(Bio-rad, USA)가 이용되었으며, 생성되는 당과 유기산은 반사율(Reflective Index; RI) 검출기를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 위에서 배양된 재조합 및 돌연변이 균주는 흡착제를 포함하는 배양액에서 더 많은 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등의 생성물을 생성하는 것을 확인할 수 있으며 흡착제의 양이 250mL/L일 때 최적임을 확인할 수 있었다.
표 2
흡착제의 양(mL/L) 생성물 (g/L) 수율(%) 생성속도(g/L/시간) 글루코오스소비량(g/L)
아세톤 에탄올 부탄올 IPA 합계
0 0.4 4.1 16.8 3.3 25 35 0.6 70
200 0.6 7.7 23.1 9.6 40 33 1.35 120
250 3.6 8.4 27.6 6.2 46 34 1.2 132
300 2.3 6.2 27.1 7.8 43.3 30 1.09 153
350 7.0 7.2 25.1 5.4 44.7 28 1.06 161
400 6.4 8.53 27.2 7.6 49.7 30 1.10 166
<실험예 4>
상기 실험예에서와 동일한 배양액과 배양 방법 및 분석방법을 이용하고, 흡착제는 200mL를 사용하여, 흡착제의 반복 사용 가능성을 시험하였다. 배양 완료 후 흡착제에 흡착된 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올의 생성물을 탈착용 칼럼으로 회수하여 테트라하이드로퓨란 용매를 10mL/min의 유량으로 흡착제 부피의 2배에 해당하는 부피로 흡착된 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물을 용출하여, 생성물의 총 양을 가스 크로마토그래피를 이용하여 분석하고, 매회 흡착된 용매의 총 양을 비교하여 흡착제의 성능을 분석하였다.
그 결과, 흡착제를 반복하여 재사용하더라도 생성물의 흡착이 양호하게 이루어지는 것을 확인하였다(표 3).
표 3
재사용회수 생성물(g/L) 수율(%) 생성속도(g/L/h) 배양시간(h) 포도당소모량(g/L)
아세톤 에탄올 부탄올 IPA 합계
1 2.2 6.6 26.9 6.6 42 36 1.02 41 117
2 1.8 6.4 20.0 7.7 36 35 1.20 30 104
3 0.6 7.7 23.1 9.6 40 33 1.35 30 120
4 1.8 7.1 23.2 7.6 40 33 1.32 30 121
5 1.7 4.7 23.4 6.5 37 34 1.23 30 110
6 1.5 7.3 22.9 9.0 41 37 1.03 40 110
7 1.4 6.9 22.3 8.5 39 33 1.02 39 118
8 3.3 5.6 21.4 5.5 36 32 1.00 36 110
9 1.5 6.7 20.9 7.1 36 32 1.01 36 112
10 2.1 6.3 22.9 6.5 38 36 1.26 36 104
<실험예 5> 유가식 배양 방법을 통한 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등의 생성물의 제조
상기 실험예들에서 최적화된 결과를 바탕으로 유가식 배양 방법을 이용해 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등의 생성물을 제조하였다. 실험 방법 및 분석은 <실험예 3>과 동일하게 수행하였으나 250mL의 흡착제를 포함하는 CGM 배양액의 농도를 각각 1배와 2배로 하여 배양액에 포함된 글루코오스를 발효하면서 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등의 생성물이 제조된 양을 비교하였다.
그 결과, 표 4에 나타낸 것과 같이, 위에서 배양된 재조합 및 돌연변이 균주는 배양과정에서 영양분(nutrient)의 양에 의존하여 더 많은 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등을 제조하는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 본 발명의 실시예의 배양방법으로 배양 시 영양분과 탄소원을 동시에 투여할 경우 유가식 배양은 물론 연속배양으로 고농도의 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 및 에탄올 등의 생성물을 높은 수율로 생합성 할 수 있다는 것을 의미한다.
표 4
배양조건 생성물 (g/L) 용매 증가율(%) 수율(%) 생성속도(g/L/h)
흡착제 CGM 농도 아세톤 에탄올 부탄올 IPA 합계
O 2 0.77 9.70 32.4 9.06 52 108 33 1.24
O 1 3.63 8.4 27.6 6.2 46 84 35 1.21
X 1 0.43 4.1 16.8 3.3 25 0 35 0.6
<실험예 6> 유가식 배양 장치의 제작 및 배양방법을 이용한 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 생성물의 제조
도 1에 나타낸 유가식 배양 장치를 제작하였으며, 이 때, 칼럼은 2 개 포함하도록 하였다. 500mL의 부피를 가지는 칼럼의 상부 및 하부에 흡착제가 용출돼 유실되는 것을 방지하기 위하여, 약 150m 정도의 필터를 장착한 후에 교반기를 장착하였다. 이후, SP850 흡착제 300mL를 칼럼 2개(각각 제1 칼럼, 제2 칼럼)에 충진하였다. 이것을 실리콘 튜브를 이용하여 배양조에 연결하고, 배양액이 칼럼을 순환하도록 펌프를 장착하였다. 칼럼의 투입구 및 배출구에 4방 밸브를 장착하여, 배양 과정에서 칼럼내의 흡착제에 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 생성물이 충분히 흡착되었을 때 용출제를 흘려 실시간으로 탈착할 수 있도록 하였다. 제1 칼럼에 생성물이 충분히 흡착된 때, 4방 밸브를 조정하여 배양액 및 생성물의 흐름을 제2 칼럼으로 변경했다. 배양액 및 생성물의 흐름이 차단된 제1 칼럼에서는 제1 칼럼 내부의 흡착제를 외부로 꺼내지 않은 상태에서 탈착이 진행되었다. 제1 칼럼에서 탈착이 진행되는 동안, 배양액 및 생성물이 공급되는 제2 칼럼에서는 연속적으로 흡착이 진행되었다. 마찬가지로 제2 칼럼에 생성물이 충분히 흡착된 때, 4방 밸브를 조정하여 배양액 및 생성물의 흐름을 탈착이 완료된 제1 칼럼으로 변경하였다. 상기의 과정을 반복함으로써 제1 칼럼 및 제2 칼럼의 흡착제를 재사용할 수 있다. 배양액의 순환 방향은 칼럼의 위쪽에서 아래로 순환하였으나 그 방향은 문제가 되지 않는다.
한편, 유가식 배양장치를 이용하여 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 생성 능력을 가지는 C. 아세토부틸리쿰(C. acetobutylicum) PJC4BK 균주를 제조하여 상기 실험예들과 같이 배양하였다. 먼저 2.7L의 CGM 액체배지가 포함된 반응기에 밤새 CGM 액체배지에서 혐기 배양한 종균 300mL를 접종하면서 배양을 시작하였다. 본 발명의 실험예에서는 일반 배치(batch) 발효로 종균을 배양하였으나, 더 높은 세포 농도로 고농도의 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 생성물을 제조하기 위해서는 세포 고정화 형태로 배양할 수 있을 것이다. 배양 시작과 동시에 배양액을 펌프를 통해 30mL/min의 유속으로 제1 칼럼을 통과시켰다. 제1 칼럼으로 배양액이 통과하면서 흡착제 SP850이 배양액에 현탁되어 슬러리상을 형성하면서 배양액의 흐름이 세포의 응집 덩어리에 의해 막히지 않고 제1 칼럼을 통과하는 것을 확인하였다. 또한, 제1 칼럼의 통과 직전과 통과 직후의 배양액 시료를 채취하여 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 농도를 가스 크로마토그래피를 통하여 분석하였다.
배양 과정 동안 당 농도는 HPLC 및 당분석기를 이용하여 20g/L을 유지하였다. 부탄올, 아세톤, 이소프로판올 또는 에탄올 등의 생성물의 양은 가스 크로마토그래피를 통해 확인하였다.
그 결과, 약 150시간 안정적으로 유가식 배양을 수행하였으며, 칼럼에 공급되는 배양액(흡착 전) 내 생성물의 농도보다 칼럼에서 배출된 배출액(흡착 후) 내 생성물의 농도가 현저히 낮아진 것을 확인하였다. 즉, 칼럼에서 배출된 배출액 내 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 생성물이 매우 낮은 농도로 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 배양 장치 내에서도 생성물이 일정한 농도를 유지되어, 미생물이 부탄올의 독성에 영향을 받지 않아 안정적으로 생성물을 제조할 수 있다는 것이 확인되었다. 또한 제1 칼럼에 흡착된 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 생성물을 95 ℃의 물로 탈착하였으며, 그 결과, 부탄올, 아세톤, 및 에탄올 등의 생성물이 우수하게 흡착 및 탈착되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 20회 이상 칼럼의 교체를 반복하여도, 칼럼의 흡착 성능이 감소되지 않는 것을 확인할 수 있었다(표 5, 표 6 및 도 4).
표 5
Figure PCTKR2012002845-appb-T000001
아세톤, 에탄올 및 부탄올의 제조 결과.
표 6
Figure PCTKR2012002845-appb-T000002
Figure PCTKR2012002845-appb-I000001
* a와 b는 각각 제1 칼럼과 제 2 칼럼을 의미함
단위: g/L
<부호의 설명>
100: 발효 분리 정제 장치
110: 제 1 칼럼 120: 제 2 칼럼
112: 흡착제 114: 필터
130: 배양조 140: 공급조
150: 저장조 160: 펌프
170: 제1 변환부 172: 제2 변환부
174: 제3 변환부 176: 제4 변환부

Claims (27)

  1. 미생물이 원료 물질과 함께 배양되어 생성물을 생산하는 배양조;
    흡착제가 충진된 2개 이상의 칼럼;및
    생성물이 포함된 배양액이 배양조로부터 특정 칼럼으로 공급되도록 조절하는 변환부를 포함하되,
    상기 변환부는 배양액이 공급되는 제 1 칼럼에서 생성물이 충분히 흡착된 경우, 상기 제 1 칼럼으로의 배양액의 공급을 중단하고, 제 2 칼럼으로 배양액이 공급되도록 배양액의 흐름을 변경하는, 생성물의 연속적 발효 분리 정제 장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 생성물이 충분히 흡착된 경우는, 흡착제에 대한 생성물의 흡착률이 낮아지는 경우 또는 칼럼으로부터 배출되는 배출액 내 생성물의 농도가 칼럼으로 공급되는 배양액 내 생성물의 농도의 80% 이상인 경우인 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 칼럼으로부터 배출되는 배출액의 적어도 일부가 배양조로 공급되는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 생성물이 충분히 흡착된 경우는, 흡착제에 대한 생성물의 흡착률이 낮아지는 경우, 칼럼으로부터 배출되는 배출액 내 생성물의 농도가 칼럼으로 공급되는 배양액 내 생성물의 농도의 80% 이상인 경우, 배양조 내 미생물의 생장이 생성물 농도 증가에 의하여 저해되는 경우 또는 미생물의 생성물 생산성이 낮아지는 경우인 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  5. 제 1항에 있어서,
    배양액이 공급되는 제 2 칼럼에서 생성물의 흡착이 진행되는 동안 상기 배양액의 공급이 중단된 제 1 칼럼에서는 흡착제에 흡착된 생성물의 탈착이 진행되는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 탈착은 열 또는 용출제를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 탈착은 흡착제에 흡착된 생성물에 열을 가하여 기화시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 탈착은 유기 용매, 산성 수용액, 또는 염기성 수용액인 용출제를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 생성물은 알코올, 케톤, 에스테르 또는 카르복실산인 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 흡착제는 칼럼의 부피 대비 0.1% 내지 99%의 부피로 충진되는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  11. 제 1항에 있어서,
    배양액이 공급되는 칼럼의 형태는 슬러리 반응기, 유동 반응기 또는 충진 반응기 형태인 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 원료 물질은 지방산 또는 당류인 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  13. 제 1항에 있어서,
    흡착제로부터 탈착되는 생성물을 저장하는 저장조를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 칼럼 내에서 흡착제 및 생성물을 교반하는 교반기를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  15. 제 1항에 있어서,
    흡착제가 용출되어 유실되는 것을 방지하는 필터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 연속적 발효 분리 정제 장치.
  16. 미생물을 원료 물질과 함께 배양하여 생성물을 생산하는 단계;
    상기 생성물이 포함된 배양액을 흡착제가 충진된 제 1 칼럼에 공급하는 단계;및
    상기 제 1 칼럼에서 생성물이 충분히 흡착된 경우, 제 1 칼럼으로의 배양액의 공급을 중단하고 제 2 칼럼으로 배양액을 공급하는 단계를 포함하는,
    생성물의 연속적인 발효 분리 정제 방법.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 생성물이 충분히 흡착된 경우는, 흡착제에 대한 생성물의 흡착률이 낮아지는 경우 또는 칼럼으로부터 배출되는 배출액 내 생성물의 농도가 칼럼으로 공급되는 배양액 내 생성물의 농도의 80% 이상인 경우인 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  18. 제 16항에 있어서,
    상기 원료 물질은 지방산 또는 당류인 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  19. 제 16항에 있어서,
    상기 생성물은 알코올, 케톤, 에스테르 또는 카르복실산인 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  20. 제 16항에 있어서,
    상기 흡착제는 칼럼의 부피 대비 0.1% 내지 99%의 부피로 충진되는 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  21. 제 16항에 있어서,
    배양액이 공급되는 칼럼의 형태는 슬러리 반응기, 유동 반응기 또는 충진 반응기 형태인 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  22. 제 16항에 있어서,
    상기 제 1 칼럼으로부터 배출되는 배출액의 적어도 일부를 다시 미생물 배양에 이용하는 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 생성물이 충분히 흡착된 경우는, 흡착제에 대한 생성물의 흡착률이 낮아지는 경우, 칼럼으로부터 배출되는 배출액 내 생성물의 농도가 칼럼으로 공급되는 배양액 내 생성물의 농도의 80% 이상인 경우, 배양조 내 미생물의 생장이 생성물 농도 증가에 의하여 저해되는 경우 또는 미생물의 생성물 생산성이 낮아지는 경우인 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  24. 제 16항에 있어서,
    배양액이 공급되는 제 2 칼럼에서 생성물의 흡착이 진행되는 동안 상기 배양액의 공급이 중단된 제 1 칼럼에서는 흡착제에 흡착된 생성물의 탈착이 진행되는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 탈착은 열 또는 용출제를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  26. 제 24항에 있어서,
    상기 탈착은 흡착제에 흡착된 생성물에 열을 가하여 기화시켜 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
  27. 제 24항에 있어서,
    상기 탈착은 유기 용매, 산성 수용액, 또는 염기성 수용액인 용출제를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 발효 분리 정제 방법.
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