WO2012144861A2 - 세포 환경 내에서의 단일 분자 수준의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법 - Google Patents

세포 환경 내에서의 단일 분자 수준의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing protein-protein interactions, and a method for measuring activated protein concentration in a cell solution. More specifically, the protein-protein interaction in a real cell environment can be analyzed up to a single molecule level. In addition, in observing the interaction between the first protein and the second protein, a protein capable of comparing and diagnosing the state of each cell and the degree of activation of the first protein by comparing different types of cells providing the first protein. It relates to a method for analyzing protein interactions and a method for measuring activated protein concentration in a cell solution capable of quantitatively comparing the concentration of a specific activated protein in experimental and control cells.
  • Cells maintain life by performing various biological functions such as gene expression, cell growth, cell cycle, metabolism, and signaling through diverse and complex protein-protein interactions.
  • understanding protein-protein interactions and their functions within cells is the cornerstone of understanding life phenomena and an important foundation for drug development and disease treatment.
  • a typical method for investigating protein-protein interactions in vitro is affinity chromoatography.
  • the method for investigating protein-protein interaction according to the prior art for quantitative measurement is to purify each protein present in the cell and to separate them from other substances in the cell in order to analyze the protein-protein interaction. Because of their interaction analysis, the protein-protein interaction in the real cellular environment in which other proteins and the like are mixed cannot be analyzed at the single molecule level.
  • the method for investigating protein-protein interaction according to the prior art has a limitation in that the degree of activation cannot be compared and diagnosed according to the observation of the interaction of a protein provided with cells in different states with a specific protein.
  • the present invention provides a method for analyzing protein-protein interactions by comparing the types of cells to be compared to compare the cell types and the degree of activation of the first protein.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring the activated protein concentration in a cell solution capable of quantitatively measuring the concentration of the specific activated protein in the experimental group and the control cell.
  • Protein-protein interaction analysis method for achieving the above object, in the method for analyzing the interaction of the first protein and the second protein to a single molecule level, (a) the first protein is bound Providing two substrates to which the first protein binding molecular sieve, which is a biomolecular sieve, is attached; (b) supplying the first protein included in a control cell to a first substrate of the two substrates, and supplying the first protein included in an experimental group cell to a second substrate of the two substrates, wherein the first Inducing binding of the first protein and the first protein binding molecular sieve on a substrate and the second substrate, respectively; (c) when the first protein and the first protein binding molecular sieve are respectively bound to the first substrate and the second substrate, a cell solution of cells containing a second protein provided with a marker is added to the first substrate. And supplying to the second substrate, respectively; And (d) comparing the interaction of the first protein and the second protein on the first substrate and the second substrate with the cell solution supplied to
  • control cell is a normal cell
  • experimental cell is a cancer cell protein-protein interaction analysis method
  • the method may further include measuring a fluorescent signal of a specific wavelength generated by a marker provided in the second protein coupled to the first protein by using an optical device that generates a near field.
  • the fluorescence signal of the specific wavelength may be integrated for a predetermined time.
  • step (d) is characterized in that the fluorescence signal of the specific wavelength is measured in real time in the presence of the supplied cell solution on the substrate.
  • step (b) is characterized in that it comprises the step of supplying the cell solution of the control cells to the first substrate, the cell solution of the experimental group cells to the second substrate.
  • the method may further include supplying a buffer solution to the substrate.
  • the method of measuring the activated protein concentration in the cell solution comprising the steps of: (a) providing a substrate to which the first protein-binding molecular sieve, which is a biomolecular sieve to which the first protein is bound; (b) supplying a cell solution containing the first protein to the substrate to induce binding of the first protein and the first protein binding molecular sieve; (c) supplying a cell solution containing a second protein provided with a marker to the substrate when the first protein and the first protein binding molecular sieve are bound on the substrate; And (d) analyzing the interaction of the first protein with the second protein on the substrate.
  • step (e) increasing the concentration of the cell solution containing the first protein in step (b) at a predetermined rate, and repeating steps (b) to (d). It includes more.
  • step (d) is a step of measuring the generation period of the fluorescence signal of a specific wavelength generated by the marker provided in the second protein coupled to the first protein in the arbitrarily set observation region on the substrate Characterized in that it comprises a.
  • the first protein interacting with the second protein in the step (d) is characterized in that the first protein activated among the first proteins bound to the first protein binding molecular sieve.
  • the step (d) comprises the step of measuring the fluorescent signal of a specific wavelength generated by the marker provided in the second protein coupled to the first protein using an optical device for generating a near field. It features.
  • the method of measuring the activated protein concentration in the cell solution comprising: (a) having at least two substrates to which the first protein binding molecular sieve, which is a biomolecular sieve to which the first protein is bound, is attached; (b) supplying the first protein included in the control cell solution to the first substrate of the two substrates, and supplying the first protein included in the experimental cell solution to the second substrate of the two substrates.
  • step (e) increasing the concentration of the control cell solution and the experimental cell solution in step (b) at a predetermined ratio, and repeating steps (b) to (d). It includes more.
  • the step (d) may include fluorescence of a specific wavelength generated by a marker provided in the second protein coupled to the first protein in an arbitrarily set observation region on the first substrate and the second substrate. Comparatively measuring the generation period of the signal.
  • the first protein interacting with the second protein in the step (d) is characterized in that the first protein activated among the first proteins bound to the first protein binding molecular sieve.
  • the step (d) comprises the step of measuring the fluorescent signal of a specific wavelength generated by the marker provided in the second protein coupled to the first protein using an optical device for generating a near field. It features.
  • the present invention in observing the interaction between the first protein and the second protein, by comparing the types of cells providing the first protein, the state of each cell and the degree of activation of the first protein can be compared and diagnosed. Will be.
  • FIG. 1 is a flow chart illustrating a method for analyzing protein-protein interactions according to an embodiment of the present invention
  • FIGS. 2 to 3 are diagrams illustrating each step of the protein-protein interaction analysis method according to the present invention.
  • FIG. 4 is a view illustrating a cell state change process in another embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating a method for analyzing protein-protein interactions according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a view for explaining a method of comparing the concentration of the activated protein in the experimental group cells and control cells according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a view showing an experimental result of measuring the interaction of the first protein and the second protein while sequentially increasing the concentration of the first protein contained in the experimental group cells,
  • 10 and 11 are graphs for measuring the fluorescence signal measured in accordance with the increase in the concentration of the first protein contained in the experimental group cells
  • 12 and 13 are graphs of the measurement of the fluorescence signal measured according to the increase in the concentration of the first protein included in the control cell.
  • FIG. 14 is a graph comparing changes in frequency, respectively, as the concentration of the first protein included in the experimental group cells and the control cells increases.
  • FIG. 1 is a flow chart illustrating a method for analyzing protein-protein interactions according to an embodiment of the present invention.
  • the analyst analyzes the interaction of two specific proteins, the first protein and the second protein at a single molecule level
  • a first protein-binding antibody which is an antibody bound to a first protein, is attached to a substrate that is a polyethylene slide coated with a polyethyleneglycol (PEG) (S110) (S110). ).
  • PEG polyethyleneglycol
  • the first protein was a h-Ras protein
  • the second protein was a Ras-binding domain (RBD) protein of C-Raf.
  • a biomolecular sieve that binds to a first protein such as a liposome having DNA, RNA, a specific component that binds to the protein, or the like may be used as the antibody to bind to the first protein.
  • a first protein such as a liposome having DNA, RNA, a specific component that binds to the protein, or the like
  • the analyst induces the binding of the first protein and the first protein-binding antibody (S130) by supplying a substrate of the cytoplasm of the cell containing the first protein to the substrate (S120).
  • step S220 not only the cellular stock solution, but also a cell solution such as a cell stock solution, diluted cytoplasm stock, or diluted or purified stock stock may be used.
  • the analyst may pretreat the first protein to express a predetermined first fluorescent protein such as m-Cherry, and in this case, the first protein-binding antibody and the first protein may be bound.
  • a predetermined first fluorescent protein such as m-Cherry
  • the analyst may detect individual monomolecular signals generated from the first fluorescent protein expressed by the first fluorescent protein (ie, generated from the first fluorescent protein). By measuring) it may be determined whether the first protein is bound to the plurality of first protein binding antibodies attached to the substrate.
  • the first protein when expressed as the first fluorescent protein, whether the first protein is bound to the antibody can be determined through a total reflection microscope, so the number of first proteins bound to the antibody attached to the substrate and the binding thereof are The density can be measured accurately.
  • the analyst supplies a buffer solution to the substrate, thereby restoring the remaining substances contained in the cellular stock except for the first protein on the substrate. It is removed (S140).
  • the analyst manipulates the second fluorescent protein to be expressed in a second protein present in the cell in another cell identical to the cell described above (S150).
  • the second fluorescent molecule may be attached or linked to the second protein by a physicochemical method.
  • the above-described step S150 may be performed in advance of the above-described step S110 to facilitate the progress of the analysis, in the practice of the present invention, since the second fluorescent protein preferably has a different wavelength band from the first fluorescent protein
  • the second fluorescent protein may be an eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein).
  • the analyst supplies the entire cytoplasmic stock solution of the cell in which the second fluorescent protein is expressed in the second protein therein in step S150 described above (S160).
  • At least some of the plurality of first protein-binding antibodies attached to the surface of the substrate are bound to the first protein, and the entire cellular stock solution containing the second protein on the surface of the substrate is supplied as shown in FIG. 3.
  • the first protein on the substrate surface (Cellular Ras) is the same as in the intracellular environment in which the second protein (eGFP-cRBD) contained in the cytoplasmic stock and the native proteins in whole cell lysate coexist. The state interacts with the second protein.
  • each first protein (Cellular Ras) bound to each antibody (Anti-Ras Primary antibody) attached to the substrate surface as shown in Figure 3 is the second protein (eGFP-cRBD) and in the intracellular environment In the same state as, the interaction between the binding and separation at the single molecule level is repeated.
  • a cell solution such as a cell stock solution, diluted cellular stock solution, or diluted or purified cell stock solution may be used.
  • the first protein and the second protein are detected by detecting a fluorescence signal of a specific wavelength band (520 nm) generated from the second fluorescent protein (eGFP) located on the surface of the substrate through the binding between the first protein and the second protein.
  • the binding state can be confirmed, and the analyst continuously observes the change in wavelength of each antibody attached on the surface of the substrate so that the interaction between the first protein and the second protein, such as the frequency of binding and separation of the first protein Can be analyzed at the level (S170).
  • the present invention in the presence of the cellular stock solution supplied to the substrate in step S160 described above, by measuring the fluorescence signal of a specific wavelength in real time, the interaction such as the frequency of binding and separation of the first protein and the second protein, etc. It can be analyzed in the same environment as the environment.
  • the analyst interacts with the second protein of the first protein in the normal cell (control cell) and the second of the first protein in the abnormal cell (experimental cell). You can also analyze the interactions with proteins.
  • FIG. 5 is a process flow diagram illustrating a method for protein-protein interaction analysis according to another embodiment of the present invention.
  • the analyst is two polyethylene glycol (PEG) coated quartz slide (Quartz Slide) substrate of the same size Prepare your dog.
  • PEG polyethylene glycol
  • the analyst attaches the first protein-binding antibody (Anti-Ras Primary antibody), which is an antibody that binds to the first protein, on both substrates (the first substrate and the second substrate) (S210).
  • Anti-Ras Primary antibody an antibody that binds to the first protein
  • a biomolecular sieve that binds to a first protein such as a liposome having DNA, RNA, a specific component that binds to the protein, or the like may be used as the antibody to bind to the first protein.
  • a first protein such as a liposome having DNA, RNA, a specific component that binds to the protein, or the like
  • the analyst supplies the cytoplasmic solution of the control cells containing the first protein to the first substrate, and the cytoplasmic solution of the experimental group cells containing the first protein to the second substrate (S220). Induction of the first protein and the first protein binding antibody (Anti-Ras Primary antibody) in each of the substrate and the second substrate (S230).
  • the concentration of the first protein included in the control cell and the concentration of the first protein contained in the experimental cell should be the same, and for this purpose, the concentration of the first protein contained in the control cell and the experimental cell, respectively.
  • the concentration should be measured to determine whether the concentrations of the two are the same, and if not the same, the dilution or the like method of adjusting the concentration of the two will be performed after the above-mentioned step S230.
  • Korean Patent Application No. 10-2011-0088074 Applicant: Yoon Tae-young
  • the present specification includes the contents of the description and drawings of Korean Patent Application No. 10-2011-0088074 as part of it.
  • a cell solution such as a cell stock solution, diluted cytoplasm stock solution, or diluted or purified cell stock solution may be used.
  • the analyst may pretreat the first protein to express a predetermined first fluorescent protein such as m-Cherry, and in this case, the first protein-binding antibody and the first protein may be bound.
  • a predetermined first fluorescent protein such as m-Cherry
  • the analyst may detect individual monomolecular signals generated from the first fluorescent protein expressed by the first fluorescent protein (ie, generated from the first fluorescent protein). By measuring) it may be determined whether the first protein is bound to the plurality of first protein binding antibodies attached to the substrate.
  • the first protein when expressed as the first fluorescent protein, whether the first protein is bound to the antibody can be determined through a total reflection microscope, so the number of first proteins bound to the antibody attached to the substrate and the binding thereof are The density can be measured accurately.
  • the analyst supplies the buffer solution to the substrate, thereby being included in the cellular stock solution except the first protein.
  • the remaining materials are removed on the substrate (S240).
  • the analyst manipulates the second fluorescent protein to be expressed through genetic engineering to the second protein present in the specific cell (S250).
  • the second fluorescent protein may be attached or linked to the second protein by a physicochemical method.
  • the above-described step S250 may be performed before the above-described step S210 to facilitate the progress of the analysis, in the practice of the present invention, since the second fluorescent protein preferably has a different wavelength band from the first fluorescent protein
  • the second fluorescent protein may be an eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein).
  • step S250 the analyst supplies the entire cytoplasmic stock solution of the cell in which the second fluorescent protein is expressed in the internal second protein to the first substrate and the second substrate, respectively (S260).
  • the concentration of the second protein in the cytoplasmic stock solution to be supplied to the first substrate and the second substrate, respectively, for this purpose the concentration of the second protein contained in each of the two cytoplasmic stock solution
  • the concentration should be measured to determine whether the concentrations of the two are the same, if it is not the same, the dilution or the like method of adjusting the concentration of the two will have to perform the above-described step S260.
  • step S220 not only the cellular stock solution, but also a cell solution such as a cell stock solution, diluted cytoplasm stock, or diluted or purified stock stock may be used.
  • a plurality of first protein-binding antibodies attached to the surfaces of the first substrate and the second substrate, respectively, are bound to the first protein of the control cell and the first protein of the experimental group cell, respectively, the second protein on the surface of the substrate
  • the first protein (Cellular Ras) on each substrate surface is the second protein (eGFP-cRBD) included in the cytoplasm stock solution and other proteins in the cell ( Native proteins in whole cell lysate interact with the second protein in the same state as in the coexisting intracellular environment.
  • the analyst analyzed the fluorescence signal of a specific wavelength band (520 nm) generated from the second fluorescent protein (eGFP) located on the substrate surface through the binding between the first protein and the second protein.
  • the binding state can be confirmed, and the analyst continuously observes the change in wavelength at each antibody attached on the substrate surface.
  • Interactions such as the frequency of binding and separation of the first protein and the second protein on the first substrate and the second substrate can be analyzed at a single molecule level (S270).
  • Figure 6 is a graph showing the signal observed on the first substrate bound to the first protein in the control cell
  • Figure 7 is a graph showing the signal observed on the second substrate bound to the first protein in the experimental group cells.
  • the first protein interacting with the second protein will be the activated first protein, the first protein and the second protein in the control cell and the first protein and the agent in the experimental group cells
  • the two proteins By comparing the interaction of the two proteins, it is possible to quantitatively measure the degree of activation of the first protein in control cells and the degree of activation of the first protein in experimental cells.
  • FIG. 8 is a view for explaining a method of comparing the concentration of the activated protein in the experimental group and control cells according to another embodiment of the present invention.
  • the analyst prepares two quartz slide substrates of the same size coated with polyethylene glycol (PEG), and first and second substrates are formed on two substrates (a first substrate and a second substrate).
  • a first protein binding antibody (Anti-Ras Primary antibody), which is an antibody bound to the protein, is attached as shown in FIG. 2 (S310).
  • the analyst supplies the cell solution of the control cells containing the first protein to the first substrate (S320), and by supplying the cell solution of the experimental group cells containing the first protein to the second substrate (S330). Induction of the first protein and the first protein binding antibody (Anti-Ras Primary antibody) on the first substrate and the second substrate, respectively.
  • the concentration of the first protein included in the control cell and the concentration of the first protein contained in the experimental cell should be the same, and for this purpose, the concentration of the first protein contained in the control cell and the experimental cell, respectively.
  • the concentration should be measured to see if the concentrations are the same.
  • steps S320 to S330 should be performed after adjusting the concentration of the two to be the same through dilution or the like.
  • the analyst may pretreat the first protein to express a predetermined first fluorescent protein such as m-Cherry, and in this case, the first protein-binding antibody and the first protein may be bound.
  • a predetermined first fluorescent protein such as m-Cherry
  • the analyst may detect individual monomolecular signals generated from the first fluorescent protein expressed by the first fluorescent protein (ie, generated from the first fluorescent protein). By measuring) it may be determined whether the first protein is bound to the plurality of first protein binding antibodies attached to the substrate.
  • the first protein when expressed as the first fluorescent protein, whether the first protein is bound to the antibody can be determined through a total reflection microscope, so the number of first proteins bound to the antibody attached to the substrate and the binding thereof are The density can be measured accurately.
  • the analyst supplies the buffer solution to the substrate, thereby being included in the cellular stock solution except the first protein. The remaining material is removed from the substrate.
  • the analyst then manipulates the second fluorescent protein to be expressed through genetic engineering to the second protein present in the particular cell.
  • the second fluorescent molecule may be attached or linked to the second protein by a physicochemical method.
  • the second fluorescent protein preferably has a wavelength range different from that of the first fluorescent protein, when the first fluorescent protein is an m-Cherry protein, the second fluorescent protein is a green fluorescent protein, eGFP. (enhanced Green Fluorescent Protein).
  • the analyst supplies the entire cell solution of cells in which the second fluorescent protein is expressed in the second protein therein to the first substrate and the second substrate (S340).
  • the concentration of the second protein in the cell solution supplied to each of the first substrate and the second substrate should be the same, for this purpose, the concentration of the second protein contained in each of the two cytoplasmic stock solutions The concentration should be measured to determine whether the concentrations of the two are the same, and if not the same, such as through the dilution method to adjust the concentration of the two will be to execute the above-described step S340.
  • a plurality of first protein-binding antibodies attached to the surfaces of the first substrate and the second substrate, respectively, are bound to the first protein of the control cell and the first protein of the experimental group cell, respectively, the second protein on the surface of the substrate
  • the first protein (Cellular Ras) on each substrate surface is the second protein (eGFP-cRBD) and the cell contained in the cytoplasmic stock solution.
  • Native proteins in whole cell lysate interact with the second protein in the same state as in the coexisting intracellular environment.
  • the analyst analyzed the fluorescence signal of a specific wavelength band (520 nm) generated from the second fluorescent protein (eGFP) located on the substrate surface through the binding between the first protein and the second protein.
  • the binding state can be confirmed, and the analyst continuously observes the change in wavelength at each antibody attached on the substrate surface, thereby binding and separating the first protein and the second protein on the first substrate and the second substrate.
  • Interactions such as the frequency of can be compared and analyzed at the level of a single molecule (S350).
  • the analyst may measure the concentration of the first protein included in the control cell solution supplied to the first substrate and the second substrate and the concentration of the first protein included in the experimental group cells in steps S320 and S330 described above.
  • the above-described steps S320 to S350 are repeated while increasing the same in sequence.
  • FIG. 9 is a view showing the results of experiments measuring the interaction of the first protein and the second protein while sequentially increasing the concentration of the first protein contained in the experimental group cells.
  • FIG. 9 (a) after supplying a cell solution of an experimental group cell containing 1 nM concentration of a first protein (HRas) to a second substrate to induce binding of a first protein and a first protein binding molecular sieve, In the state that the cell solution containing the second protein with a marker is supplied to the second substrate, an optical device for generating a near field to generate a signal of a fluorescence signal of a specific wavelength generated by the marker provided with the second protein is provided. Measured.
  • the optics set up a region of interest (ROI) of 1.1 ⁇ m 2 and then center each ROI. The period of generation of the fluorescence signal is measured.
  • ROI region of interest
  • the cells of the experimental group cell including the first protein As the concentration of the solution is doubled, the point at which the fluorescence signal of a specific wavelength exceeding a predetermined threshold is detected twice as much as in FIG. 9 (a) (4 ROI ⁇ 8 ROI).
  • the generation period of the fluorescence signal measured on average in eight ROIs in FIG. 9B is the same as in FIG. 9A.
  • the average value of the frequency of the generation of the fluorescent signal in each ROI starts to increase. Then, as the concentration of the experimental cell solution continues to increase, the fluorescence signal at each ROI is increased. The average value of the occurrence period of is continuously increased.
  • a first protein (HRas) a first substrate and a generation period of increase in the average value of the fluorescent signal in each ROI of 1.1 ⁇ m size claim 2 in the case where the second substrate of 45 ⁇ 90 ⁇ m 2 is started in the experiment conducted in accordance with the invention
  • a fluorescent solution of a specific wavelength generated by the marker included in the second protein is supplied to the second substrate while a cell solution containing the second protein including the marker is supplied to the second substrate.
  • the frequency was measured as the average value of a plurality of ROIs using an optical device that generates a near field, the frequency of occurrence of the fluorescence signal was measured 20 times for 30 seconds.
  • the threshold concentration value as shown in FIG. Phosphorus remains constant until 5 nM, but increases after exceeding the threshold concentration value.
  • the analyst can calculate the ratio of the activated first protein among the first proteins contained in the cell solution of the experimental group cells.
  • the analyst repeats the experiment as described above in the control cell to compare the critical concentration value in the control cell with the threshold concentration value in the experimental cell, whereby the concentration of the activated first protein contained in the control cell and the experimental cell
  • concentration of the activated first protein contained within can be quantitatively calculated.
  • the analyst may measure the concentration of the cell solution of the control cell containing the first protein (HRas) in parallel with the above experimental procedure for obtaining the critical concentration value in the experimental group cells or before or after the experimental procedure for the experimental group cells. Is gradually increased to measure the critical concentration value in the control cell under the same conditions.
  • HRas first protein
  • the analyst supplied a cell solution of a control cell containing the first protein (HRas) of 3.5 nM concentration to the second substrate to induce binding of the first protein and the first protein binding molecular sieve Later, using an optical device that generates a near field frequency of occurrence of a fluorescence signal of a specific wavelength generated by the marker provided in the second protein while supplying a cell solution containing the second protein provided with the marker to the second substrate.
  • HRas the first protein
  • the frequency of occurrence of the fluorescence signal was only six times in 30 seconds.
  • the frequency of occurrence of the fluorescence signal measured by the average value in the plurality of ROI was constant 6 times for 30 seconds.
  • a cell solution of control cells containing 49 nM of first protein (HRas) was supplied to a second substrate to induce binding of the first protein and the first protein binding molecular sieve.
  • HRas first protein
  • an optical device that generates a near field frequency of occurrence of a fluorescence signal of a specific wavelength generated by the marker provided in the second protein while supplying a cell solution containing the second protein provided with the marker to the second substrate.
  • the value of the occurrence of the fluorescence signal was slightly increased to 7 times for 30 seconds.
  • the analyst determined that the concentration of the activated first protein contained in the experimental group cells, which is cancer cells, was normal. It can be confirmed that the concentration is 10 times greater than the concentration of the activated first protein contained in the control cells which are cells.

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Abstract

단일 분자 수준까지의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법이 개시된다. 본 발명은, 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 부착된 기판을 구비하고, 제1 단백질이 포함된 세포 용액을 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도하며, 기판에서 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체가 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 기판에 공급하고, 기판에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 분석하는 과정을 통해 구현된다. 본 발명에 따르면, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있게 된다.

Description

세포 환경 내에서의 단일 분자 수준의 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법
본 발명은 단백질-단백질 상호작용 분석 방법, 및 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있는 단백질-단백질 상호작용 분석 방법 및 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 비교 측정할 수 있는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 관한 것이다.
세포는 다양하고 복잡한 단백질-단백질 상호작용을 통하여 유전자 표현, 세포성장, 세포 주기, 대사, 신호전달 등의 여러 생물학적 기능을 수행함으로써 생명현상을 유지하고 있다. 따라서 세포내에서의 단백질-단백질 상호작용 및 상호작용의 기능을 이해하는 것은 생명현상들을 이해하는 초석이 되며 신약개발 및 질병 치료의 중요한 기반이 된다.
시험관 내에서 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법으로는 대표적인 방법으로는 친화성 크로마토 그래피(affinity chromoatography) 방법이 있다.
단백질 친화성 크로마토그래피(Protein affinity chromatography)의 경우, 정제된 단백질이 준비되어야하는 어려움이 있다. 또한 단백질 간 상호작용 확인이 시험관 내에서 일어나므로, 세포내에서는 상호작용하지 않는 단백질들이 컬럼을 통과하는 동안 정전기적 상호작용에 의하여 결합하는 것처럼 보일 수 있는 false-positive 결과를 도출 할 수 있다.
즉, 정량적 측정을 위해서 종래 기술에 따른 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법은 단백질-단백질 상호작용을 분석하기 위해서 세포 내에 존재하는 각각의 단백질을 정제하여 이들을 세포 내의 다른 물질들과 분리한 상태에서 상호작용을 분석하기 때문에, 다른 단백질 등이 혼재되어 있는 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준에서 분석할 수는 없다는 한계가 있다.
뿐만 아니라, 종래 기술에 따른 단백질-단백질 상호작용을 조사하기 위한 방법은 다른 상태의 세포에서 제공되는 단백질의 특정 단백질과의 상호 작용의 관찰에 따라 그 활성화 정도를 비교 진단할 수 없다는 한계가 있다.
또한, 종래에는 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 비교 측정할 수 없다는 한계가 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은, 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있는 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 제공함에 있다.
아울러, 본 발명의 목적은 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 비교 측정할 수 있는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법을 제공함에 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법은, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석하기 위한 방법에 있어서, (a) 상기 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 각각 부착된 두 개의 기판을 구비하는 단계; (b) 대조군 세포에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제1 기판에 공급하고, 실험군 세포에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제2 기판에 공급하여, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 각각 유도하는 단계; (c) 상기 제1 기판 및 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 각각 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포의 세포 용액을 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급하는 단계; 및 (d) 상기 세포 용액이 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급된 상태에서, 상기 제1 기판 및 제2 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 비교 분석하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 상기 (b) 단계에서, 상기 대조군 세포는 정상 세포이며, 상기 실험군 세포는 암 세포인 것인 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
또한, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 특정 파장의 형광 신호를 소정의 시간 동안 적분 측정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 기판에 상기 공급된 세포 용액이 존재하는 상황에서, 상기 특정 파장의 형광 신호를 실시간 측정하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (b) 단계는, 상기 대조군 세포의 세포 용액을 제1 기판에 공급하고, 상기 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (c) 단계 이전에, 상기 기판에 버퍼 용액을 공급하는 단계를 더 포함한다.
한편, 본 발명에 따른 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 있어서, (a) 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 부착된 기판을 구비하는 단계; (b) 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하여 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도하는 단계; (c) 상기 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하는 단계; 및 (d) 상기 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 분석하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, (e) 상기 (b) 단계에서의 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액의 농도를 소정의 비율로 증가시켜가며, 상기 (b) 단계 내지 상기 (d) 단계를 반복하는 단계를 더 포함한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 기판 상의 임의로 설정된 관측 영역에서의, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 주기를 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계에서 상기 제2 단백질과 상호 작용을 하는 상기 제1 단백질은 상기 제1 단백질 결합 분자체에 결합된 제1 단백질들 중에서 활성화된 제1 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
한편, 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 있어서, (a) 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 각각 부착된 적어도 두 개의 기판을 구비하는 단계; (b) 대조군 세포 용액에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제1 기판에 공급하고, 실험군 세포 용액에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두개의 기판 중 제2 기판에 공급하여, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 각각 유도하는 단계; (c) 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 각각 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급하는 단계; 및 (d) 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 비교 분석하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, (e) 상기 (b) 단계에서의 상기 대조군 세포 용액 및 상기 실험군 세포 용액의 농도를 소정의 비율로 증가시켜가며, 상기 (b) 단계 내지 상기 (d) 단계를 반복하는 단계를 더 포함한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판 상의 각각 임의로 설정된 관측 영역에서의, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 주기를 비교 측정하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 (d) 단계에서 상기 제2 단백질과 상호 작용을 하는 상기 제1 단백질은 상기 제1 단백질 결합 분자체에 결합된 제1 단백질들 중에서 활성화된 제1 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (d) 단계는, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 관측함에 있어서 제1 단백질을 제공하는 세포의 종류를 달리하여 이를 비교함으로써 각 세포의 상태 및 제1 단백질의 활성화 정도를 비교 진단할 수 있게 된다.
아울러, 본 발명에 따르면, 실제 세포 환경 내에서의 단백질-단백질 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석할 수 있게 된다.
아울러, 본 발명에 따르면, 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 특정 단백질의 농도를 정량적으로 측정할 수 있게 된다
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도,
도 2 내지 도 3은 본 발명에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법의 각 단계를 설명하는 도면,
도 4는 본 발명의 다른 실시예에서의 세포 상태 변화 과정을 설명하는 도면,
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도,
도 6은 대조군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제1 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프 도면,
도 7은 실험군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제2 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프 도면,
도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 단백질의 농도 비교 방법을 설명하는 도면,
도 9는 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도를 순차적으로 증가시켜가면서 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 측정한 실험 결과를 나타내는 도면,
도 10 및 도 11은 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도 증가에 따라 측정된 형광 신호를 측정한 그래프 도면,
도 12 및 도 13은 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도 증가에 따라 측정된 형광 신호를 측정한 그래프 도면, 및
도 14는 실험군 세포 및 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도 증가에 따라 각각 측정된 주파수의 변화를 비교하는 그래프 도면이다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 도면들 중 동일한 구성요소들은 가능한 한 어느 곳에서든지 동일한 부호들로 나타내고 있음에 유의해야 한다. 또한 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도이다. 도 1을 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하면, 먼저, 분석자는 특정한 두 개의 단백질인 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 단일 분자 수준에서 분석하기 위해서, 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide)인 기판에, 제1 단백질과 결합되는 항체인 제1 단백질 결합항체(Primary antibody)를 도 2에서와 같이 부착한다(S110).
본 발명에 따른 실험에 있어서, 제1 단백질은 h-Ras 단백질이고, 제2 단백질은 C-Raf의 Ras-binding domain(RBD) 단백질로 하였다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제1 단백질과 결합하는 항체에는, 항체 이외에도 DNA, RNA, 단백질과 결합하는 특정 성분을 갖는 리포좀(liposome) 등의 제1 단백질과 결합하는 생체 분자체가 사용될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 제1 단백질이 포함되어 있는 세포의 세포질 원액을 기판에 공급함으로써(S120), 제1 단백질과 제1 단백질 결합항체의 결합을 유도한다(S130).
한편, 전술한 S220 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서 분석자는 제1 단백질에 m-Cherry 등의 소정의 제1 형광 단백질이 발현되도록 사전 처리할 수 있을 것이며, 이 경우에 제1 단백질 결합항체와 제1 단백질이 결합된 경우에 분석자가 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행하면, 분석자는 제1 단백질에 발현되어 있는 제1 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터(즉, 제1 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 제1 단백질이 결합되었는지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
즉, 제1 단백질에 제1 형광 단백질인 발현된 경우에는 제1 단백질의 항체와의 결합여부를 전반사 현미경을 통해 파악할 수 있으므로, 기판에 부착된 항체와 결합된 제1 단백질의 개수 및 그에 따른 결합 밀도를 정확하게 측정할 수 있게 되는 것이다.
기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 각각 제1 단백질이 결합된 것으로 확인되면, 분석자는 기판에 버퍼 용액을 공급함으로써, 제1 단백질을 제외한 세포질 원액에 포함되어 있는 나머지 물질들을 기판상에서 제거하게 된다(S140).
그 다음, 분석자는 전술한 세포와 동일한 다른 세포에서 해당 세포에 존재하는 제2 단백질에 유전자 조작을 통해 제2 형광 단백질이 발현되도록 조작한다(S150). 한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제2 형광 분자를 물리 화학적인 방법에 의해서 제2 단백질에 부착 또는 연결시킬 수도 있을 것이다.
한편, 전술한 S150 단계는 원활한 분석의 진행을 위해 전술한 S110 단계 이전에 미리 실행할 수도 있을 것이며, 본 발명을 실시함에 있어서, 제2 형광 단백질은 제1 형광 단백질과 다른 파장 역역을 갖는 것이 바람직하므로, 제1 형광 단백질이 m-Cherry 단백질인 경우에 제2 형광 단백질은 녹색형광 단백질인 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 전술한 S150 단계에서의, 내부의 제2 단백질에 제2 형광 단백질이 발현되어 있는 세포의 세포질 원액 전체를 기판에 공급한다(S160).
기판의 표면에 부착되어 있는 복수개의 제1 단백질 결합항체의 적어도 일부는 각각 제1 단백질이 결합되어 있으며, 이와 같은 기판의 표면에 제2 단백질이 포함되어 있는 세포질 원액 전체가 도 3에서와 같이 공급되면, 기판 표면의 제1 단백질(Cellular Ras)은 세포질 원액에 포함되어 있는 제2 단백질(eGFP-cRBD) 및 세포 내의 다른 단백질들(Native proteins in whole cell lysate)이 공존하는 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 제2 단백질과 상호 작용을 하게 된다.
요컨대, 도 3에서와 같이 기판 표면상에 부착된 각각의 항체(Anti-Ras Primary antibody)에 결합되어 있는 각각의 제1 단백질(Cellular Ras)은 제2 단백질(eGFP-cRBD)과 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 단일 분자 수준에서 결합과 분리를 반복하는 상호 작용을 하게 되는 것이다.
한편, 전술한 S160 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
도 3에서와 같이 제1 단백질과 제2 단백질 간의 단일 분자 수준에서의 결합이 있는 경우에 분석자가 473nm의 파장을 갖는 전반사 현미경을 통해 기판의 표면을 관찰하면, 제2 단백질에 발현되어 있는 형광 단백질인 eGFP에 의해, 기판 표면에서의 파장이 473nm에서 520nm로 변화하는 것을 확인할 수 있다.
즉, 제1 단백질과 제2 단백질 간의 결합을 통해 기판 표면에 위치하게 된 제2 형광 단백질(eGFP)로부터 발생되는 특정 파장대역(520nm)의 형광 신호의 검출을 통해 제1 단백질과 제 2단백질의 결합상태를 확인할 수 있게 되고, 분석자는 기판 표면상에 부착된 각각의 항체에서의 파장의 변화를 지속적으로 관찰함으로써, 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 단분자 수준에서 분석할 수 있게 된다(S170).
아울러, 본 발명에서는 전술한 S160 단계에서 기판에 공급된 세포질 원액이 존재하는 상황에서, 특정 파장의 형광 신호를 실시간 측정함으로써 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 세포 환경과 동일한 환경에서 분석할 수 있게 되는 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 분석자는 각각 정상 상태의 세포(대조군 세포) 내에 있는 제1 단백질의 제2 단백질과의 상호작용과 비정상 상태의 세포(실험군 세포) 내에 있는 제1 단백질의 제2 단백질과의 상호 작용을 비교 분석할 수도 있을 것이다.
본 발명에 대한 실험에 있어서, 인체의 유방조직에서 분리된 세포에서 인위적으로 Ras 단백질의 활성을 극대화함으로써 도 4에서와 같이 정상 유방 조직 세포를 암세포로 변화시켰으며, 정상 유방 조직 세포를 대조군 세포로 사용하였으며, 암세포로 변화된 유방 조직 세포를 실험군 세포로 사용하였다.
도 5는 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하는 절차 흐름도이다. 도 5을 참조하여, 본 발명의 다른 실시예에 따른 단백질-단백질 상호작용 분석 방법을 설명하면, 먼저, 분석자는 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 동일한 크기의 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide) 기판 두 개를 준비한다.
그 다음 분석자는 두 개의 기판(제1 기판, 제2 기판)에 모두 제1 단백질과 결합되는 항체인 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)를 도 2에서와 같이 부착한다(S210).
한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제1 단백질과 결합하는 항체에는, 항체 이외에도 DNA, RNA, 단백질과 결합하는 특정 성분을 갖는 리포좀(liposome) 등의 제1 단백질과 결합하는 생체 분자체가 사용될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 제1 단백질이 포함되어 있는 대조군 세포의 세포질 원액을 제1 기판에 공급하고, 제1 단백질이 포함되어 있는 실험군 세포의 세포질 원액을 제2 기판에 공급함으로써(S220), 제1 기판 및 제2 기판 각각에서 제1 단백질과 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)의 결합을 유도한다(S230).
한편, 본 발명을 실시함에 있어서, 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 대조군 세포와 실험군 세포에 각각 포함된 제1 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 하며, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S230 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서는, 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있으며, 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다. 한편, 본 명세서에서는 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호의 명세서 및 도면의 기재 내용을 그 일부로 포함한다.
한편, 전술한 S230 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서 분석자는 제1 단백질에 m-Cherry 등의 소정의 제1 형광 단백질이 발현되도록 사전 처리할 수도 있을 것이며, 이 경우에 제1 단백질 결합항체와 제1 단백질이 결합된 경우에 분석자가 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행하면, 분석자는 제1 단백질에 발현되어 있는 제1 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터(즉, 제1 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 제1 단백질이 결합되었는지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
즉, 제1 단백질에 제1 형광 단백질인 발현된 경우에는 제1 단백질의 항체와의 결합여부를 전반사 현미경을 통해 파악할 수 있으므로, 기판에 부착된 항체와 결합된 제1 단백질의 개수 및 그에 따른 결합 밀도를 정확하게 측정할 수 있게 되는 것이다.
제1 기판 및 제2 기판 상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 각각 제1 단백질이 결합된 것으로 확인되면, 분석자는 기판에 버퍼 용액을 공급함으로써, 제1 단백질을 제외한 세포질 원액에 포함되어 있는 나머지 물질들을 기판상에서 제거하게 된다(S240).
그 다음, 분석자는 특정 세포에 존재하는 제2 단백질에 유전자 조작을 통해 제2 형광 단백질이 발현되도록 조작한다(S250). 한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제2 형광 단백질을 물리 화학적인 방법에 의해서 제2 단백질에 부착 또는 연결시킬 수도 있을 것이다.
한편, 전술한 S250 단계는 원활한 분석의 진행을 위해 전술한 S210 단계 이전에 미리 실행할 수도 있을 것이며, 본 발명을 실시함에 있어서, 제2 형광 단백질은 제1 형광 단백질과 다른 파장 역역을 갖는 것이 바람직하므로, 제1 형광 단백질이 m-Cherry 단백질인 경우에 제2 형광 단백질은 녹색형광 단백질인 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 전술한 S250 단계에서의, 내부의 제2 단백질에 제2 형광 단백질이 발현되어 있는 세포의 세포질 원액 전체를 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급한다(S260).
한편, 전술한 S260 단계를 실시함에 있어서도, 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급되는 세포질 원액에서의 제2 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 두 개의 세포질 원액에 각각 포함된 제2 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 하며, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S260 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서도 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있을 것이며, 전술한 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다.
한편, 전술한 S220 단계를 실시함에 있어서 세포질 원액뿐만 아니라, 세포 원액, 희석된 세포질 원액, 또는 희석 또는 정제된 세포 원액 등의 세포 용액이 사용될 수 있을 것이다.
제1 기판과 제2 기판의 표면에 각각 부착되어 있는 복수개의 제1 단백질 결합항체에는 각각 대조군 세포의 제1 단백질 및 실험군 세포의 제1 단백질이 결합되어 있으며, 이와 같은 기판의 표면에 제2 단백질이 포함되어 있는 세포질 원액 전체가 도 3에서와 같이 공급되면, 각각의 기판 표면의 제1 단백질(Cellular Ras)은 세포질 원액에 포함되어 있는 제2 단백질(eGFP-cRBD) 및 세포 내의 다른 단백질들(Native proteins in whole cell lysate)이 공존하는 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 제2 단백질과 상호 작용을 하게 된다.
분석자는 제1 단백질과 제2 단백질 간의 결합을 통해 기판 표면에 위치하게 된 제2 형광 단백질(eGFP)로부터 발생되는 특정 파장대역(520nm)의 형광 신호의 검출을 통해 제1 단백질과 제 2단백질의 결합상태를 확인할 수 있게 되고, 분석자는 기판 표면상에 부착된 각각의 항체에서의 파장의 변화를 지속적으로 관찰함으로써,
제1 기판과 제2 기판에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 단분자 수준에서 비교 분석할 수 있게 된다(S270).
도 6은 대조군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제1 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프이고, 도 7은 실험군 세포 내의 제1 단백질이 결합된 제2 기판에서 관측된 신호를 나타내는 그래프이다.
도 6과 도 7을 비교하면, 정상 세포인 대조군 세포 내의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용보다 암세포인 실험군 세포 내의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용이 보다 더 활발한 것을 확인할 수 있다. 이로부터 분석자는 암세포 내의 제1 단백질인 Ras 단백질이 과잉으로 활성화되어 있다는 것을 진단할 수 있게 된다.
한편, 제2 단백질과 상호 작용을 하는 제1 단백질은 활성화된 제1 단백질이 될 것이므로, 상술한 대조군 세포에서의 제1 단백질과 제2 단백질과의 상호 작용과 실험군 세포에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 비교함으로써 대조군 세포에서의 제1 단백질의 활성화 정도와 실험군 세포에서의 제1 단백질의 활성화 정도를 정량적으로 측정할 수 있게 된다.
이를 위해 본 발명에서는 도 8에서와 같은 방법을 사용하였다. 도 8은 본 발명의 다른 실시예에 따른 실험군 세포와 대조군 세포에서의 활성화된 단백질의 농도 비교 방법을 설명하는 도면이다.
도 8을 참조하면, 분석자는 폴리에틸렌 글리콜(polyethyleneglycol:PEG) 코팅처리된 동일한 크기의 퀄츠 슬라이드(Quartz Slide) 기판 두 개를 준비하고, 두 개의 기판(제1 기판, 제2 기판)에 각각 제1 단백질과 결합되는 항체인 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)를 도 2에서와 같이 부착한다(S310).
그 다음, 분석자는 제1 단백질이 포함되어 있는 대조군 세포의 세포 용액을 제1 기판에 공급하고(S320), 제1 단백질이 포함되어 있는 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급함으로써(S330), 제1 기판 및 제2 기판 각각에서 제1 단백질과 제1 단백질 결합항체(Anti-Ras Primary antibody)의 결합을 유도한다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서, 대조군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 대조군 세포와 실험군 세포에 각각 포함된 제1 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 한다.
만약, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S320 내지 S330 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서도, 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있으며, 전술한 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서 분석자는 제1 단백질에 m-Cherry 등의 소정의 제1 형광 단백질이 발현되도록 사전 처리할 수도 있을 것이며, 이 경우에 제1 단백질 결합항체와 제1 단백질이 결합된 경우에 분석자가 전반사 현미경을 이용한 기판의 표면 관찰을 수행하면, 분석자는 제1 단백질에 발현되어 있는 제1 형광 단백질에 의한 파장 변화로부터(즉, 제1 형광 단백질로부터 발생하는 개개의 단분자 신호를 측정하여) 기판상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 제1 단백질이 결합되었는지 여부를 확인할 수 있을 것이다.
즉, 제1 단백질에 제1 형광 단백질인 발현된 경우에는 제1 단백질의 항체와의 결합여부를 전반사 현미경을 통해 파악할 수 있으므로, 기판에 부착된 항체와 결합된 제1 단백질의 개수 및 그에 따른 결합 밀도를 정확하게 측정할 수 있게 되는 것이다.
제1 기판 및 제2 기판 상에 부착된 복수개의 제1 단백질 결합항체에 각각 제1 단백질이 결합된 것으로 확인되면, 분석자는 기판에 버퍼 용액을 공급함으로써, 제1 단백질을 제외한 세포질 원액에 포함되어 있는 나머지 물질들을 기판상에서 제거하게 된다.
그 다음, 분석자는 특정 세포에 존재하는 제2 단백질에 유전자 조작을 통해 제2 형광 단백질이 발현되도록 조작한다. 한편, 본 발명을 실시함에 있어서는, 제2 형광 분자를 물리 화학적인 방법에 의해서 제2 단백질에 부착 또는 연결시킬 수도 있을 것이다.
한편, 본 발명을 실시함에 있어서, 제2 형광 단백질은 제1 형광 단백질과 다른 파장 역역을 갖는 것이 바람직하므로, 제1 형광 단백질이 m-Cherry 단백질인 경우에 제2 형광 단백질은 녹색형광 단백질인 eGFP(enhanced Green Fluorescent Protein)가 될 수 있을 것이다.
그 다음, 분석자는 내부의 제2 단백질에 제2 형광 단백질이 발현되어 있는 세포의 세포 용액 전체를 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급한다(S340).
한편, 전술한 S340 단계를 실시함에 있어서도, 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급되는 세포 용액에서의 제2 단백질의 농도는 동일해야 하며, 이를 위해서 두 개의 세포질 원액에 각각 포함된 제2 단백질의 농도를 측정하여 양자의 농도가 동일한 지 여부를 확인해야 하며, 동일하지 않은 경우에는 희석화 등의 방법을 통해 양자의 농도가 동일해지도록 조정한 후에 전술한 S340 단계를 실행해야 할 것이다.
여기서 단백질의 농도를 측정함에 있어서도 종래 기술에 따른 다양한 단백질 농도 측정 방법이 사용될 수 있을 것이며, 전술한 한국 특허 출원 제10-2011-0088074호(출원인: 윤태영)에서의 단백질 농도 측정 방법이 활용될 수도 있을 것이다.
제1 기판과 제2 기판의 표면에 각각 부착되어 있는 복수개의 제1 단백질 결합항체에는 각각 대조군 세포의 제1 단백질 및 실험군 세포의 제1 단백질이 결합되어 있으며, 이와 같은 기판의 표면에 제2 단백질이 포함되어 있는 세포질 원액 등의 세포 용액 전체가 도 3에서와 같이 공급되면, 각각의 기판 표면의 제1 단백질(Cellular Ras)은 세포질 원액에 포함되어 있는 제2 단백질(eGFP-cRBD) 및 세포 내의 다른 단백질들(Native proteins in whole cell lysate)이 공존하는 세포내 환경에서와 동일한 상태에서 제2 단백질과 상호 작용을 하게 된다.
분석자는 제1 단백질과 제2 단백질 간의 결합을 통해 기판 표면에 위치하게 된 제2 형광 단백질(eGFP)로부터 발생되는 특정 파장대역(520nm)의 형광 신호의 검출을 통해 제1 단백질과 제 2단백질의 결합상태를 확인할 수 있게 되고, 분석자는 기판 표면상에 부착된 각각의 항체에서의 파장의 변화를 지속적으로 관찰함으로써, 제1 기판과 제2 기판에서의 제1 단백질과 제2 단백질의 결합과 분리의 빈도 등의 상호작용을 단분자 수준에서 비교 분석할 수 있게 된다(S350).
보다 구체적으로 설명하면, 분석자는 전술한 S320 단계 및 S330 단계에서 제1 기판과 제2 기판에 각각 공급되는 대조군 세포 용액에 포함된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도를 순차적으로 동일하게 증가시키면서 전술한 S320 단계 내지 S350 단계를 반복한다.
도 9는 실험군 세포에 포함된 제1 단백질의 농도를 순차적으로 증가시켜가면서 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용을 측정한 실험 결과를 나타내는 도면이다. 도 9의 (a)를 참조하면, 1nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 제2 기판에 부착된 제1 단백질 결합 분자체와 결합된 제1 단백질 중에서 활성화된 제1 단백질만이 제2 단백질과 상호 작용을 하게 되는 것이므로, 전술한 광학장치를 이용한 측정에서, 소정의 임계값(Threshold)을 초과하는 특정 파장의 형광 신호가 감지되는 지점을 중심으로 광학장치는 1.1μm2 크기의 임의의 관측 영역(Region of Interest:ROI)을 설정하고 이후에 각각의 ROI를 중심으로 형광 신호의 발생 주기를 측정하게 된다.
한편, 도 9의 (b)에서는, 2nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 제2 기판에 부착된 제1 단백질 결합 분자체와 결합된 제1 단백질 중에서 활성화된 제1 단백질만이 제2 단백질과 상호 작용을 하게 되는 것이므로, 제1 단백질이 포함된 실험군 세포의 세포 용액의 농도가 2배로 증가된 이상 소정의 임계값(Threshold)을 초과하는 특정 파장의 형광 신호가 감지되는 지점은 도 9의 (a)에서와 비교할 때 2배 많이 관측된다(4개의 ROI→8개의 ROI).
한편, 아직은 실험군 세포의 세포 용액의 농도가 비교적 높지 않기 때문에, 일정 크기를 갖는 하나의 ROI 내에서 활성화된 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용의 쌍이 하나씩만 관측되고 있다.
그렇기 때문에 도 9의 (b)에서 8개의 ROI에서 평균적으로 측정되는 형광 신호의 발생 주기는 도 9의 (a)에서와 동일하게 나타난다.
그렇지만, 제2 기판의 크기에 따라 ROI의 설정 가능한 개수는 제한이 되어 있기 때문에, 제1 단백질이 포함된 실험군 세포 용액의 농도가 임계값 이상을 넘어서게 되면 도 9의 (c)에서와 같이, 하나의 ROI 내에서 활성화된 제1 단백질과 제2 단백질의 상호 작용의 쌍이 2개 이상씩 관측되게 된다.
이와 같이 실험군 세포 용액의 농도가 임계값을 초과하게 되면, 각 ROI 에서의 형광 신호의 발생 주기의 평균값은 증가를 시작하게 되며, 이후 실험군 세포 용액의 농도가 계속적으로 증가할수록 각 ROI 에서의 형광 신호의 발생 주기의 평균값은 계속적으로 증가하게 된다.
본 발명에 따라 실시한 실험에서는 제1 기판 및 제2 기판의 크기가 45×90μm2인 경우에 1.1μm2 크기의 각 ROI 에서의 형광 신호의 발생 주기의 평균값의 증가가 시작된 제1 단백질(HRas)이 포함된 암세포인 실험군 세포 용액 농도의 임계값은 5nM로 측정되었다.
즉, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 3nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 8회에 불과하였다.
하지만, 도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 임계 농도값(5nM)을 초과하는 41.3nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에는 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 20회로 측정되었다.
즉, 제1 단백질(HRas)이 포함된 암세포인 실험군 세포의 세포 용액의 농도값을 증가시켜가며, 복수의 ROI에서의 형광 신호의 주파수의 평균값을 측정한 결과, 도 14에서와 같이 임계 농도값인 5nM까지는 일정하게 유지되다가, 임계 농도값을 초과한 이후부터는 증가됨을 확인할 수 있다.
여기서의 임계 농도값에 기초해서 분석자는 실험군 세포의 세포 용액에 포함된 제1 단백질 중 활성화된 제1 단백질의 비율을 계산할 수 있게 된다.
뿐만 아니라, 분석자는 대조군 세포에서 전술한 바와 같은 실험을 반복함으로써 대조군 세포에서의 임계 농도값과 실험군 세포에서의 임계 농도값을 비교함으로써, 대조군 세포내에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도와 실험군 세포내에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도의 비율을 정량적으로 계산할 수 있다.
즉, 분석자는 실험군 세포에서의 임계 농도값을 획득하기 위한 상기의 실험 절차와 병행하여, 또는 실험군 세포에 대한 실험 절차 이전 또는 이후에 제1 단백질(HRas)이 포함된 대조군 세포의 세포 용액의 농도를 서서히 증가시켜 가며 동일한 조건하에서 대조군 세포에서의 임계 농도값을 측정하게 된다.
한편, 대조군 세포의 세포 용액의 농도를 증가시킴에 있어서는 실험군 세포에서의 세포 용액의 농도 증가 비율과 동일한 비율로 증가시키는 것이 바람직할 것이다.
즉, 도 12를 참조하면, 분석자가 3.5nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 대조군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 6회에 불과하였다.
한편, 이후 대조군 세포의 세포 용액의 농도를 증가시킨 경우에도 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 형광 신호의 발생 빈도는 30초 동안 6회로 일정하였다.
다만, 도 13에서 확인할 수 있는 바와 같이, 49nM 농도의 제1 단백질(HRas)이 포함된 대조군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하여 제1 단백질과 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도한 후에 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 제2 기판에 공급한 상태에서 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 빈도를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 복수의 ROI에서 그 평균값으로 측정한 경우에는 형광 신호의 발생 빈도가 30초 동안 7회로 경미하게 증가된 값이 측정되었다.
이후 대조군 세포 용액의 농도를 증가시켜가며 형광 신호의 주파수의 평균값을 측정한 결과 도 14에서 확인되는 바와 같이, 50nM 농도를 임계 농도값으로 임계 농도값을 초과한 이후부터 뚜렷하게 증가됨을 확인할 수 있었다.
이상의 실험으로부터, 실험군 세포에서의 임계 농도값이 5nM이고, 대조군 세포에서의 임계 농도값이 50nM으로 측정된 사실에 기초하여, 분석자는 암세포인 실험군 세포 내에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도가 정상 세포인 대조군 세포에 포함된 활성화된 제1 단백질의 농도보다 10배 만큼 크다는 사실을 확인할 수 있게 된다.
이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예 및 응용예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시예 및 응용예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.
본 발명은 의료 산업 분야에서의 산업상 이용가능성이 인정된다.

Claims (17)

  1. 제1 단백질과 제2 단백질의 상호작용을 단일 분자 수준까지 분석하기 위한 방법에 있어서,
    (a) 상기 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 각각 부착된 적어도 두 개의 기판을 구비하는 단계;
    (b) 대조군 세포에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제1 기판에 공급하고, 실험군 세포에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제2 기판에 공급하여, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 각각 유도하는 단계;
    (c) 상기 제1 기판 및 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 각각 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포의 세포 용액을 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급하는 단계; 및
    (d) 상기 세포 용액이 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급된 상태에서, 상기 제1 기판 및 제2 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 비교 분석하는 단계
    를 포함하는 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서,
    상기 대조군 세포는 정상 세포이며, 상기 실험군 세포는 암 세포인 것인 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것인 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 특정 파장의 형광 신호를 소정의 시간 동안 적분 측정하는 것인 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 기판에 상기 공급된 세포 용액이 존재하는 상황에서, 상기 특정 파장의 형광 신호를 실시간 측정하는 것인 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는,
    상기 대조군 세포의 세포 용액을 제1 기판에 공급하고, 상기 실험군 세포의 세포 용액을 제2 기판에 공급하는 단계를 포함하는 것인 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계 이전에,
    상기 기판에 버퍼 용액을 공급하는 단계를 더 포함하는 단백질-단백질 상호작용 분석 방법.
  8. 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 있어서,
    (a) 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 부착된 기판을 구비하는 단계;
    (b) 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하여 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 유도하는 단계;
    (c) 상기 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 기판에 공급하는 단계; 및
    (d) 상기 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 분석하는 단계
    를 포함하는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법
  9. 제8항에 있어서,
    (e) 상기 (b) 단계에서의 상기 제1 단백질이 포함된 세포 용액의 농도를 소정의 비율로 증가시켜가며, 상기 (b) 단계 내지 상기 (d) 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 기판 상의 임의로 설정된 관측 영역에서의, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 주기를 측정하는 단계를 포함하는 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 상기 제2 단백질과 상호 작용을 하는 상기 제1 단백질은 상기 제1 단백질 결합 분자체에 결합된 제1 단백질들 중에서 활성화된 제1 단백질인 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  12. 제8항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  13. 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법에 있어서,
    (a) 제1 단백질이 결합되는 생체 분자체인 제1 단백질 결합 분자체가 각각 부착된 적어도 두 개의 기판을 구비하는 단계;
    (b) 대조군 세포 용액에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두 개의 기판 중 제1 기판에 공급하고, 실험군 세포 용액에 포함된 상기 제1 단백질을 상기 두개의 기판 중 제2 기판에 공급하여, 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체의 결합을 각각 유도하는 단계;
    (c) 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서 상기 제1 단백질과 상기 제1 단백질 결합 분자체가 각각 결합된 경우에, 표지자가 구비된 제2 단백질이 포함된 세포 용액을 상기 제1 기판 및 제2 기판에 각각 공급하는 단계; 및
    (d) 상기 제1 기판 및 상기 제2 기판에서의 상기 제1 단백질과 상기 제2 단백질의 상호작용을 비교 분석하는 단계
    를 포함하는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법
  14. 제13항에 있어서,
    (e) 상기 (b) 단계에서의 상기 대조군 세포 용액 및 상기 실험군 세포 용액의 농도를 소정의 비율로 증가시켜가며, 상기 (b) 단계 내지 상기 (d) 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 제1 기판 및 상기 제2 기판 상의 각각 임의로 설정된 관측 영역에서의, 상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호의 발생 주기를 비교 측정하는 단계를 포함하는 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 상기 제2 단백질과 상호 작용을 하는 상기 제1 단백질은 상기 제1 단백질 결합 분자체에 결합된 제1 단백질들 중에서 활성화된 제1 단백질인 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 (d) 단계는,
    상기 제1 단백질과 결합된 상기 제2 단백질에 구비된 표지자에 의해 발생하는 특정 파장의 형광 신호를 근접장을 발생시키는 광학장치를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것인 세포 용액에서의 활성화된 단백질 농도 측정 방법.
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