WO2012146364A1 - Mikro- und/oder nanopartikel-vakzin zur prophylaktischen und/oder therapeutischen anwendung - Google Patents

Mikro- und/oder nanopartikel-vakzin zur prophylaktischen und/oder therapeutischen anwendung Download PDF

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    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
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    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to a micro- and / or nanoparticle vaccine for prophylactic and / or therapeutic use, in particular for topical application to the skin surface. Moreover, the invention relates to a pharmaceutical preparation containing the micro- and / or nanoparticle vaccine, as well as the use of the micro- or nanoparticle vaccine or such a pharmaceutical preparation for the treatment or prophylaxis of a disease.
  • a topical vaccination in contrast to the simple, flexible and painless handling also the targeted addressing of relevant structures of the immune system in the skin, which allow an effective immunization without burdening the entire organism with the often poorly tolerated substances, and the Avoidance of any risk of infection. Trained medical staff is often expendable.
  • the topical application of medicaments to the skin is based on the direct application of the active ingredient formulation to the surface of the skin, the passage of the optionally carrier-bound active ingredients through the skin and the penetration / diffusion of the active components to the site of action.
  • the topical application of only the adjuvants is described in order to intensify the immune reaction triggered by parenterally administered vaccines.
  • the skin penetration mediation technology used conforms to the above principle involving separation of the upper epidermal layer. Thereafter, the patch is adhered and the exiting wound fluid wets the vaccine, which is then to diffuse into the skin.
  • the transfer through liquid intercellular channels between the keratinocytes are discussed.
  • the hair follicles and sweat glands are expressly granted a "minimal role" in transcutaneous drug delivery, particles are proposed only for better stabilization of suspensions and as depots for the delayed release of the active ingredient components.
  • liposomes have also been used as transport systems for topically applied drugs in and through the barrier of human skin (Barry 2002). Investigations have shown that these vesicular structures do not penetrate the skin barrier as intact units, but release the active ingredients, which then further penetrate on their own.
  • nanoscale carrier systems have been developed, the main purpose of which is to transport the carrier-bound drugs directly to and into the immunocompetent cells.
  • Si0 2 nanoparticles having a size of 25 nm are used as the antigen carrier, the effectiveness of the uptake in the antigen-presenting cells of the lymph nodes and thus of the immunization via the size of the particles being controllable.
  • the addressing of the immunocompetent cells is achieved by size and geometry of the carrier particles, largely independent of their composition. The application is parenteral in both cases by intradermal or subcutaneous injection.
  • the carrier particles, together with the covalently bound active ingredients, are taken up directly by the antigen-presenting cells of the lymph nodes.
  • PAMPs Pathogen-Associated Molecular Patterns
  • bacterial lipopeptides which primarily stimulate the T-cellular immune response, are of great importance (Brown et al., 2005). Because the TLRs for lipopeptides, unlike the TLRs for most other immunomodulators, are expressed on the surfaces of the cells, bacterial lipopeptides are particularly well suited for targeting. In addition, these can be replaced by synthetic analogues, which are characterized by the unusual amino acid S- [2,3-di (hydroxy) -propyl] - [f?] Cysteine at the N-terminus, bound to the two or three fatty acids as a characteristic feature , exhibit.
  • TLR 1 / TLR2 heterodimer also reacts to triacylated synthetic lipopeptides, such as the Pam 3 Cys derivatives (EP 0210412).
  • TLR6 / TLR 2 heterodimers are sensitive to diacylated synthetic lipopeptides, such as the Pam 2 Cys derivatives (EP 0519327).
  • the lipopeptides preferably Pam 3 Cys and Pam 2 Cys derivatives as TLR 2 targeting substance, this mixed with an antigenic component for B lymphocytes or for cytotoxic T cells and other excipients to induce synergistic effects (WO 2007 / 103322, WO 2006/104389, US Pat. No. 7,387,271).
  • WO 2006/040076 also describes a topical application of such an active ingredient formulation.
  • formulations as liposomes or virus like particles which, in addition to antigens and optionally cytostatics, also contain lipopeptides, preferably Pam 3 Cys, are claimed for the treatment of various diseases and allergies (WO 2005/063201, WO 2005/063288).
  • conjugates of Pam 2 Cys and Pam 3 Cys derivatives and antigens as vaccines to specifically bind or infiltrate the antigens to the immunocompetent cells in WO 2007/078879 a combination of a membrane protein of the influenza virus and a Pam 3 Cys derivative, in WO 2009/046498 a DNA A vaccine which is coupled by polar amino acids to a Pam 2 Cys derivative, in WO 2007/079448 a linear tandem molecule consisting of a B cell epitope, a T cell epitope and Pam 3 Cys or in WO 2004/014956 and WO 2004/014957 a molecule of a B-cell or CTL epitope and a helper T-cell epitope, which are bridged by a Pam 3 Cys lipopeptide.
  • WO 2007/079448 a linear tandem molecule consisting of a B cell epitope, a T cell epitope and Pam 3 Cys or in WO 2004/014956 and WO 2004/014957 a
  • a topically applicable micro- and / or nanoparticle vaccine as defined in claim 1.
  • This vaccine can be used for prophylactic and / or therapeutic use in infections, cancer, autoimmune diseases and inflammatory and allergic conditions.
  • a vaccine according to the present invention is typically able to address with the DCs the sensor cells of the immune organ skin directly through the hair follicle as portal of entry and additionally to stimulate by a TLR-based adjuvant. Summary of the invention
  • micro- and / or nanoparticle vaccine also referred to hereinafter as a micro- and / or nanoparticle vaccine, as well as uses and methods based on this vaccine.
  • the present invention relates to novel topical vaccines which, with the aid of a particle-based carrier system, specifically target the dendritic cells (DC) of the skin via the hair follicle as portal of entry and thus induce effective prophylactic and / or therapeutic T-cell-mediated immunity.
  • DC dendritic cells
  • the present invention further relates to the composition of such a vaccine of antigenic determinants for cytotoxic effector T cells and helper T cells, and to the use of synthetic analogs of bacterial lipopeptides as TLR-based adjuvants for enhancing the specific immune response.
  • a combination of the vaccine components is immobilized on micro- and / or nanoscale carrier particles, transported to the skin by these in an active transport process in the hair follicles and temporarily deposited there.
  • the active ingredients released under the physiological conditions in the hair follicle diffuse to the target structures in the skin, stimulate the cell surface receptors of the DCs and induce a targeted vaccine antigen-specific T cell immune response.
  • the new topical microparticles and / or nanoparticle vaccines and their formulations are / are suitable as medicines on the one hand for the prevention and on the other hand for the treatment of diseases such as infections, cancer, autoimmune diseases, chronic inflammations and allergies in humans and animals.
  • the present invention provides a micro and / or nanoparticle vaccine.
  • the vaccine has basic components as individual molecules or conjugates.
  • the vaccine has a first basic component, which is one or more antigenic determinants of cytotoxic effector T cells.
  • the vaccine has a second basic component, which is one or more antigenic determinants of helper T cells.
  • the vaccine has a third basic component, which is one or more immunomodulators for activating the antigen-presenting dendritic cells.
  • the vaccine components are coupled to micro- and / or nanoscale carrier particles.
  • the micro- and / or nanoscale carrier particles are designed in such a way that after topical application to the skin surface they are actively transported into the hair follicles where they are temporarily deposited.
  • the vaccine components induce T cell-mediated immunity via stimulation of the skin's dendritic cells.
  • the micro- and / or nanoparticle vaccine according to the first aspect is a vaccine for medical use.
  • the micro- and / or nanoparticle vaccine is, in some embodiments, for therapeutic and / or prophylactic use.
  • the micro- and / or nanoparticle vaccine is a vaccine for use in a therapeutic and / or prophylactic process.
  • the present invention provides a prophylactic and / or therapeutic method using a micro- and / or nanoparticle vaccine.
  • the method comprises inducing T-cell mediated immunity.
  • Inducing T-cell mediated immunity occurs by stimulating the dendritic cells of the skin by the micro- and / or nanoparticle vaccine.
  • the vaccine has basic components as individual molecules or conjugates.
  • the vaccine has a first basic component, which is one or more antigenic determinants of cytotoxic effector T cells.
  • the vaccine has a second basic component, which is one or more antigenic determinants of helper T cells.
  • the vaccine has a third basic component, which is one or more immunomodulators for activating the antigen-presenting dendritic cells.
  • the vaccine components are coupled to the micro- and / or nanoscale carrier particles.
  • the vaccine is a vaccine according to the first aspect.
  • the method further typically includes topically applying the micro- and / or nanoparticle vaccine to the skin surface of a subject.
  • the method further comprises allowing the micro- and / or nanoscale particles to be actively transported into the hair follicles.
  • the procedure includes allowing temporary storage of the micro- or nanoscale particles in hair follicles.
  • the vaccine components induce T cell-mediated immunity via stimulation of the skin's dendritic cells.
  • the method according to the second aspect is typically a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of a disease of a subject, ie a disease in humans and / or animals.
  • the method according to the second aspect is a method for the prophylactic and / or therapeutic treatment of a disease in humans and / or animals associated with infections, cancer, an autoimmune disease, or an inflammatory and / or allergic condition.
  • the method according to the second aspect is a method for prophylactically specific immunization against and / or for therapeutic vaccination in a disease.
  • the method according to the second aspect is a method of supporting a conventional vaccine.
  • the method according to the second aspect is one A method of enhancing the immune response following vaccination performed by conventional vaccination techniques.
  • the present invention provides a method of vaccinating a subject.
  • the method comprises administering to a subject a pharmaceutically acceptable quality of a micro and / or nanoparticle composition.
  • the method typically involves topically applying the micro- and / or nanoparticle composition to the skin surface of a subject.
  • administering the micro and / or nanoparticle composition is sufficient to trigger an immune response of the subject.
  • the micro / nanoparticle composition comprises micro- and / or nanoparticles.
  • Basic components of the micro- and / or nanoparticle composition are coupled to the micro- and / or nanoparticles. The basic components are present as single molecules or as conjugates.
  • the micro / nanoparticle composition has a first base component that is one or more antigenic determinants of cytotoxic effector T cells.
  • the micro and / or nanoparticle composition has a second base component which is one or more antigenic determinants of helper T cells.
  • the micro / nanoparticle composition has a third basic component, which is one or more immunomodulators for activating the antigen-presenting dendritic cells.
  • the micro / nanoparticle composition is a vaccine according to the first aspect.
  • the method further comprises allowing the micro- and / or nanoparticles to be actively transported into the hair follicles.
  • the method involves allowing the micro- and / or nanoparticles to be temporarily deposited in the hair follicles. This allows the basic components of the micro / nanoparticle composition to induce T-cell mediated immunity by stimulating the dendritic cells of the skin.
  • the present invention provides a pharmaceutical preparation.
  • the pharmaceutical preparation contains a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the first aspect, alone or in combination.
  • the preparation is in a formulation suitable for topical application.
  • the pharmaceutical preparation contains a therapeutically effective amount of the micro- and / or nanoparticle vaccine.
  • the pharmaceutical preparation according to the fourth aspect is present as a paste, ointment, cream, lotion, emulsion, gel, hydrogel, suspension, solution, spray or patch.
  • a preparation contains further constituents, such as otherwise therapeutically relevant pharmaceutical active ingredients and adjuvants, as well as further pharmaceutically suitable ingredients.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients include, but are not limited to, excipients, adjuvants and / or adjuvants. Substances such as detergents, stabilizers and preservatives.
  • Such other ingredients which may be included in the preparation may be mixed, dissolved or associated with a physical or biological carrier.
  • the present invention relates to the use of a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the first aspect or a pharmaceutical preparation according to the fourth aspect for a medical indication.
  • Such a medical indication can cause a disease such as an infection, cancer, an autoimmune disease, or an inflammatory and / or allergic condition.
  • a microparticle nanoparticle vaccine or pharmaceutical preparation according to the fifth aspect relates to prophylactic specific immunization against disease and / or therapeutic vaccination in a disease.
  • the use relates to enhancement of the immune response following vaccination performed by conventional vaccination techniques.
  • the use relates to the preparation of a medicament for human and / or animal for immunization.
  • immunization may be a prophylactic specific immunization against a disease.
  • immunization may also be a therapeutic vaccination in a disease.
  • immunization may be to enhance the immune response following vaccination performed by a conventional vaccination procedure.
  • Fig. 1 Principle of pH triggered adsorption and desorption of the polarized by a charge tag vaccine components on a ® in the LBL method with charged polymers coated carrier particles.
  • the release of the vaccine components takes place by recharging the top polymer layer as a function of the pH, as a result of which the electrostatic attraction is abolished.
  • FIG. 2 Dependence of the loading of the carrier particles on the order of addition of the vaccine components and the residence time in the loading solution with sequential addition
  • GILG GILGFVFTL-KKKKK fluorescein, SEQ ID NO: 11 coupled to the fluorescent dye fluoerszein
  • P2C Pam 2 Cys-GDPKHPKSF-KKKKK-Tamra, SEQ ID NO: 9 coupled to the fluorescent dye Tamra
  • Cha aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C-KKKKK-Cy5, SEQ ID NO: 10 coupled to the fluorescent dye Cy5).
  • Fig. 4 Schematic drawing of a loaded with the individual vaccine components carrier particle.
  • the number of components, the loading of the particles and the real stoichiometric ratios are variably adjustable according to the spectrum of action of the vaccine (the epitopes are shown by way of example for the antigenic determinants).
  • Fig. 5 Schematic drawing of a carrier particle loaded with a conjugate of the vaccine components.
  • the loading of the particles is variably adjustable according to the spectrum of action of the vaccine (the epitopes are shown by way of example for the antigenic determinants).
  • FIG. 6 Penetration of the micro- / nanoparticle vaccine into the hair follicle of the pig ear model (laser scan microscopic image of the cryosections) 60 min after application to the skin.
  • the rhodamine-labeled epitope GILGFVFTL-K4 penetrates further into the hair follicle after detachment from a silica carrier particle (labeled with Cy5).
  • Fig. 7 penetration depth of the silica carrier particles as a function of the particle size compared to the length of the terminal hair / Vellushaar follicles.
  • the target region Infundibulum is reached at about 600 ⁇ depth.
  • FIG. 8 Accumulation and residence time of the silica carrier particles in the hair follicles and in the stratum corneum.
  • FIG. 9 Effect of the oligoamino acid tags on the immunological activity of the CTL epitope GILGFVFTL in the cytotoxicity assay with the human CD8 T cell line 10-21A and the B lymphoblastoid target cell line JY (titration in the radiochrome release assay).
  • the insert shows the values transformed to Clark.
  • the functional avidity values in the table indicate the peptide concentration for half-maximal cytolysis. Factors for activity loss are related to the functional avidity of the untethered peptide.
  • FIG. 10 Comparison of the immunological activity of the particle-bound and the free individual components in the ELISpot assay on IFN- ⁇ with human CD8 T cells. 11 Titration of the immunological activity of mixtures of the particle-bound and the free vaccine components in the ELISpot assay on IFN- ⁇ with human CD8 T cells (ordinate: optical units of the densitometric measurement).
  • TNF- ⁇ , IL-1- ⁇ and IL-6 is an inflammatory cytokine cocktail as a positive control.
  • TNF, IL-4 and IL-6 is an inflammatory cytokine cocktail as a positive control (above: proportion of memory T cells formed, below: proliferation rate).
  • TNF, IL-4 and IL-6 is an inflammatory cytokine cocktail as a positive control (proliferation rate).
  • FIG. 16 Induction of antigen-specific T cell reactions by various combinations of the vaccine components on silica particles using the example of the CMV epitope
  • NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6), detected by recombinant tetramerized MHC-peptide complexes.
  • FIG. 17 Induction of antigen-specific T-cell reactions by various combinations of the vaccine components on silica particles using the example of the influenza epitope GILGFVFTL, detected on the basis of the recombinant tetramerized MHC-peptide complexes.
  • the present invention relates to a micro- and / or nanoparticle vaccine and its use.
  • This vaccine comprises a micro- or nanoparticle to which immunologically active components are coupled.
  • the vaccine may also include both a microparticle and a nanoparticle to which immunologically active components are coupled.
  • the vaccine is a nanoparticle to which are coupled three basic components as defined below.
  • the vaccine has a plurality of micro- and / or nanoparticles to which immunologically active components are coupled.
  • microparticle refers to any particle that has an extent of about 5000 nm or less in one or more dimensions, such as an extent, eg, a diameter, in the range of about 500 nm to about 3000 nm, in the range from about 500 nm to about 2000 nm, in the range of about 500 nm to about 1000 nm, in the range of about 700 nm to about 1500 nm, in the range of about 500 nm to about 800 nm, or in the range of about 600 nm to about 900 nm.
  • nanoparticle refers to any particle having an extent in one or more dimensions, eg a diameter of about 500 nm or less, such as about 400 nm or less, about 300 nm or less, for example, in the range of about 1 nm to about 500 nm, about 5 nm to about 450 nm, about 1 nm to about 250 nm or from about 10 nm to about 150 nm.
  • a micro- and such a nanoparticle is suitably dimensioned in order to be transported to hair follicles (see below).
  • a particle contained in a vaccine according to the present invention typically has an extent of about 5000 nm or less in one or more dimensions, such as an extent, eg, a diameter, of about 3000 nm or less, a diameter of about 1000 nm, a diameter of about 700 nm or less, about 500 nm or less, about 250 nm or less, about 100 nm or less, about 80 nm or less, about 60 nm or less, about 50 nm or less , about 35 nm or less, or about 35 nm or less.
  • an extent eg, a diameter, of about 3000 nm or less, a diameter of about 1000 nm, a diameter of about 700 nm or less, about 500 nm or less, about 250 nm or less, about 100 nm or less, about 80 nm or less, about 60 nm or less, about 50 nm or less , about 35 nm or less, or about 35 nm or less.
  • a micro- or nanoparticle may have a maximum extension in the range of about 1 nm to about 1000 nm, such as about 1 nm to about 500 nm, or about 1 nm to about 100 nm.
  • nanoparticles include, but are not limited to, a nanocrystal, a nanosphere, a nanorod, a nanoshell or a nanofilament such as a nanotube or a nanowire.
  • a nanoparticle, as well as a microparticle according to the invention is an inorganic particle.
  • a micro- and / or nanoparticle may contain any suitable material - or consist thereof - such as carbon Semi-metal such as boron, germanium or silicon, or a metal such as gold, silver or copper, including an alloy thereof or a polymer.
  • a corresponding micro- and / or nanoparticle may be of any surface finish.
  • a microparticle and / or nanoparticle may have a polar or apolar surface and thus be hydrophilic or hydrophobic.
  • Hydrophobic material is water repellent or tends to separate from water. Typically, hydrophobic material has a uniform electron density distribution. In contrast, hydrophobic material contains molecules or regions which can enter into dipole-dipole interactions with water molecules and thus have a high wettability for water.
  • a use or method according to the present invention based on the use of the micro- and / or nanoparticles may be applied to any subject, such as e.g. carried out on a mammal.
  • a suitable mammal include, but are not limited to, a mouse, rabbit, rat, guinea pig, hamster, dog, cow, pig, goat, sheep, horse, rhesus monkey Schimpanze, a gorilla or a human.
  • a use or method according to the invention directly addresses the sensor cells of one of the most important organs of the immune system, namely the DCs of the skin, including the Langerhans cells.
  • DCs In their role as mediators of immunity, DCs have two key functions that can be clearly distinguished in time. As immature cells, they are responsible for the uptake and processing of antigens. Only a little later, after activation, they provide as mature cells for the stimulation mainly of T cells and indirectly via the T cells also of B cells, by giving them the processed antigen in the form of MHC-peptide complexes, together with costimulatory molecules, present on their surface while releasing cytokines that support and stabilize immune responses. As guardians and alerters of the immune system, they thus exercise a higher-level control function over the actual actors of the cellular immune response. Only one DC is needed to activate 100 to 3,000 antigen-specific T cells.
  • DCs Because of their ability to induce, enhance, and build immune responses, DCs have become an important cellular tool for immunotherapy. New approaches to fully activate and differentiate these immunocompetent cells can significantly increase the efficacy of prophylactic and therapeutic vaccines, as only mature DCs have a specific T cell-based cytotoxic immune response and the expression of proinflammatory cytokines can trigger. At the same time, mature DCs are able to reverse the effect of tumors on immunosuppressive factors.
  • DCs are the Langerhans cells. These are still inactive antigen-presenting cells that form a continuous network in the epidermis of the skin. Upon contact with the antigen, their activation and differentiation into mature DCs transports the antigens into the regional lymph nodes where they are presented to the T lymphocytes.
  • the DCs of the skin are ideal target structures for topical vaccination.
  • the hair follicle is particularly well suited, since the epidermis is crossed in this area with a particularly dense network of immunocompetent cells, which serves to monitor and defend against by the non-closed hair barrier in the hair follicle penetrating foreign substances.
  • the system of the micro- and / or nanoparticle vaccines according to the invention has succeeded for the first time in rendering carrier-bound active substances into the hair follicles and thus into the deeper layers of the epidermis by targeted utilization of a natural transport mechanism. the stratum spinosum, to convey.
  • the micro- and / or nanoparticles of a vaccine of the present invention are typically configured so that, after being administered by application to the skin surface, it may be allowed for the nanoparticles to be transported into the hair follicles. Components of the vaccine coupled to the micro- and / or nanoparticles thus likewise reach the hair follicle.
  • it may be allowed for the micro- and / or nanoparticles to remain in the hair follicle for a certain period of time (see below).
  • the highest density of immunocompetent cells of the skin is located, so that the vaccine components come in close proximity to the target structures and only have to diffuse a short distance after detachment from the carrier particle.
  • the carrier particles typically have a quadruple function.
  • the dimension of the micro- / nanoparticles is / are significant. It has been shown that one or more particles, in particular one or more spherical particles, in a size range of 100 nm to 3,000 nm, for example 300 nm to 1,500 nm (supra), are / are particularly well suited to the various vaccine components to be transported by the described pumping mechanism to the optimal position in the hair follicle, wherein the penetration depth can be adjusted by the particle size (Fig. 7). After only 1 h, the infundibulum is reached at a depth of 600 ⁇ m, where the highest density of DC of the skin is found in human terminal hair. Further penetration within the next 24 h is insignificant for vaccination success.
  • reversible adsorption may be based on electrostatic interactions, van der Waals bonds, hydrophobic interactions, and / or hydrogen bonds. For example, an interaction can occur between a polarized surface of carrier particles and charged regions of the vaccine components, which leads to adsorption. If necessary, negative or positive net charge regions may be incorporated into vaccine components in the form of one or more additional molecular tags, called tags.
  • the pH shift within the hair follicle can advantageously be used.
  • Particles were designed whose surface potential ( ⁇ -potential) changes in dependence on the pH in such a way that the vaccine components stably bind to the carrier particles during loading and transport and desorb again under the physiological conditions in the hair follicles.
  • particles were coated in the layer-by-layer (LBL) process.
  • LBL ® technology uses the electrostatic interaction between charged polymers (polyelectrolytes) and surfaces.
  • a reloading of the particles takes place, whereby the deposited amount of polymer by itself to a thickness of about 2-7 nm regulated.
  • the process can be repeated with an oppositely charged polymer. In this way, any number of layers can be built up on substrates.
  • any biocompatible polymer can be used.
  • the cationic polymers used are poly (allylamine hydrochloride) (PAH), poly (diallyldimethylammonium chloride) (PDA) and poly (acryloyloxyethyltrimethylammonium chloride) (PAOET) and as anionic polymers, the sodium salts of poly (vinyl sulfate) (PVS), sulfoethyl cellulose and polystyrene sulfonate (PSS) have been found to be particularly suitable.
  • PAH poly (allylamine hydrochloride)
  • PDA diallyldimethylammonium chloride
  • PAOET poly (acryloyloxyethyltrimethylammonium chloride)
  • anionic polymers the sodium salts of poly (vinyl sulfate) (PVS), sulfoethyl cellulose and polystyrene sulfonate (PSS) have been found to be particularly suitable.
  • LBL® surfaces having 2 to 20 layers can be used, using a weak polyanion or polycation for at least the outermost layer which alters its charge as a function of pH, such as chitosan.
  • a weak polyanion or polycation for at least the outermost layer which alters its charge as a function of pH, such as chitosan.
  • Natural proteins are also suitable as pH-switchable materials, depending on their isoelectric point.
  • an appendage having charged molecular regions such as amino acids.
  • Amino acids are known as organic molecules having a carboxylic acid group (carboxyl group) and an amino group, typically ⁇ - or ⁇ -amino acids.
  • an appendage may have about two to about 20, about three to about 15, or about 4-10 charged ⁇ -amino acids, or be composed of such amino acids. Any number of amino acids can be used, including naturally occurring amino acids and isomers thereof.
  • An appendage that has a positive or negative charge under physiological conditions is also referred to below as a charge tag.
  • such an appendage is over a peptide segment of up to about 8 amino acids in length, e.g. 1,2,3,4,5,6 or 7 amino acids coupled to a vaccine component.
  • a corresponding peptide segment can also be referred to as a spacer.
  • Such a charge tag contains one or more amino acids which have a side chain which have a positive or negative total charge under physiological conditions or consists of such amino acids.
  • a chemical group or an amino acid having a total positive charge under physiological conditions is also referred to as a basic group or amino acid.
  • a chemical group or an amino acid with a total negative charge is also referred to as an acidic group or amino acid.
  • the basic amino acids lysine, 5-hydroxy-lysine, pyrrolysine, hypusine (N6- (4-amino-2-hydroxybutyl) -lysine), histidine, ornithine, and / or arginine may be used as positively charged amino acids under physiological conditions become.
  • the presence of such amino acid units can serve for positive polarization.
  • Glutamic acid-aspartic acid or sulfotyrosine units are illustrative examples of amino acids that can be used for negative polarization. They can ensure that the vaccine components accumulate in analogy to the polymers on the oppositely charged particles and are desorbed when the particle surface is recharged by pH.
  • the length and composition of the charge tags as well as an optionally insertable spacer must be individually tailored to the respective vaccine component, since these molecules may be sterically hindered or further interactions, such as hydrogen bonds or hydrophobic interactions, may occur with the polymer surfaces.
  • the capacity and efficiency of the loading process as well as the separation kinetics can be individually adjusted by modifying the charge tags.
  • PAH / PSS PAH / PMAA coated silica particles
  • PAH / PSS PAH / PMAA coated silica particles
  • the loading of the LBL® particles in some embodiments takes place under basic conditions, the desorption of the vaccine components in such embodiments typically occurs after the transport process in the acidic environment of the hair follicle and vice versa. Due to the increased hydrogen ion concentration occurs below about pH 7 to protonate the PMAA ⁇ - groups, whereby the outer LBL discharges ® layer or recharges cationic by said underlying PAH layer. This leads to repulsion of the positively polarized vaccine components from the particle surface ( Figure 1). An additional positive effect on the release of the vaccine is the increased salt concentration in the hair follicle.
  • the individual vaccine components modified with corresponding oligoamino acid tags per 1 mg of silica carrier particles were adsorbed by this method.
  • the loading for each vaccine component can be adjusted individually.
  • the stoichiometric composition of the microparticle and / or nanoparticle vaccine according to the invention can be adjusted in accordance with the individual medical indication, the form of administration and the efficiency of the vaccine components (Example B).
  • the simultaneous loading of a carrier particle with different, differently interacting vaccine components in a defined molar ratio, as well as their simultaneous and uniform release at the site of action could be realized for the micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention, using the example of some active ingredient combinations.
  • a system be found particles which enables stable, effective and uniform adsorption of the vaccine components and their uniform release in the hair follicle - could therefore with the example described in the embodiments LBL ®.
  • the yields of the released in the hair follicles active ingredients in the order of 30 - 90% of the adsorbed amount are in a sufficient for vaccination order of magnitude.
  • Unwanted aggregation effects could be low loading methods, the choice of coating materials and the order of the polymer layers can be prevented.
  • composition of the subject typically topical, micro- and / or nanoparticle vaccine of the present invention may be minimized Components and lowest levels of drugs are limited.
  • a synthetic minimal vaccine which consists of the following essential basic components for addressing various synergistic targets:
  • a vaccine according to the present invention these components are interchangeable according to the medical indication and combined in any ratio.
  • any antigenic determinants for T cells e.g. multiple peptides, polyepitopes, biopolymers, or other antigenic information carriers, such as a nucleic acid, e.g. DNA or RNA, a lipid and / or an oligo- or polysaccharide.
  • antigenic determinant refers to one or more regions of an antigen or hapten that can be bound by an immunoglobulin, a T cell receptor, or a binding reagent such as a lipocalin mutein
  • An antigenic determinant has at least one epitope (see below)
  • the antigenic determinants for CTL epitopes are selected according to the desired immunization
  • the helper T-cell epitope Pan-DR-E is universal for all HLA-DR allotypes, but must be adapted to the specific species and may be advantageous when a vaccine contains a plurality of antigen determinants / epitopes to achieve adequate vaccine protection in an immunogenetically heterogeneous population.
  • nucleic acid refers to any nucleic acid in any configuration, such as single-stranded, double-stranded, or a combination thereof, to nucleic acids include DNA molecules, eg, genomic DNA or cDNA, RNA molecules, such as mRNA, analogues of DNA or RNA prepared by nucleotide analogues or by chemical nucleic acid synthesis, such as protein nucleic acid (PNA) .
  • a nucleic acid may, of course, contain non-native nucleotide analogs or be coupled to an affinity tag or label. Numerous nucleotide analogs that may be included are known to those skilled in the art.
  • a nucleotide analog is a nucleotide having a modification to, for example, the base, the sugar and / or the phosphate group.
  • a substitution of 2'-OH residues of siRNA with 2'F, 2'O-Me or 2'H residues increases the wVO stability of the RNA in question.
  • Modifications to the base group include natural and synthetic modifications of A, C, G and T / U, various purine or pyrimidine bases such as uracil-5-yl, hypoxanthine-9-yl, and 2-aminoadenine-9-yl, as well as non Purine or non-purine bases.
  • Other nucleotide analogues serve as universal bases.
  • universal bases include 3-nitropyrrole and 5-nitroindole. Universal bases are able to form a base pair with each base. Often, base modifications can be combined with, for example, a sugar modification, eg, 2-O-methoxyethyl, for example, to achieve unique properties such as improved duplex stability.
  • a sugar modification eg, 2-O-methoxyethyl
  • the third basic component of a vaccine of the present invention is an immunomodulator, i. a compound that activates or slows down or inhibits a subject's immune response.
  • An example of an immunomodulator is immunostimulator-lipopolysaccharide (LPS).
  • Another example of an immunomodulator is cationic lipid and lipid protamine DNA, which are described in U.S. Pat. 7,303,881.
  • Another example of an immunomodulator is a synthetic bacterial lipopeptide. Lipopeptides are part of the bacterial cell wall and are recognized by the Toll-like receptors TLR 1, 2, 6 and 10 of the dendritic and other immunocompetent cells.
  • a corresponding intracellular mechanism usually the expression of specific, the antigen-specific defense of pathogens serving genes is triggered in the TLR carrier cells, which leads to the differentiation of pathogen-specific T cells.
  • the nonspecific immune response is initiated, which subsequently follows the response of the acquired immune system to the formation of specific antibodies.
  • Examples of a synthetic analog of a bacterial lipopeptide having immunostimulatory effect are e.g. disclosed in the German patent application DE 102009034779 A1.
  • the lipopeptide immunomodulator can be particularly advantageous, since with a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention specifically the DCs of the skin are addressed, which have a high density of all TLR and in their guard function for Entrittspforte skin via particularly effective mechanisms as the first line of defense of the innate immune system.
  • the TLRs for the lipopeptides are expressed on the surfaces of the cells so that the lipopeptides can act directly on the cells, if appropriate also particle-bound, without being recorded in advance.
  • an immunomodulator is murabutide (N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamine-alpha-n-butyl-ester), a derivative of the bacterial muramyl dipeptide.
  • immunomodulators that are immunosuppressants are cyclosporin and methotrexate.
  • Two other immunomodulating modulators are 4- (3-chlorophenyl) -N- (4- (trifluoromethyl) phenyl) pyrimidin-2-amine (VAF347) and fingoli- mod (720, 2-amino-2- (2- (4- octylphenyl) ethyl) propane-1,3-diol).
  • the direct coupling of the antigen-specific vaccine components with the immunomodulatory effective adjuvant allows a highly focused abolition of the conditioned immunosuppressive state of the skin and thus a marked increase in the T cell induced by the micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention -based, specific immune response. This further minimizes the possibility of immunological side effects.
  • a lipopeptide immunomodulator according to the present invention has the following general structure (I):
  • R1 and R2 which may be the same or different, represent a saturated or unsaturated acyl radical containing from about 6 to 28 carbon atoms or from about 7 to about 25, e.g. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 C atoms, for example for a saturated acyl radical having 16 C atoms,
  • R3 is a saturated or unsaturated acyl radical containing from about 6 to 28 carbon atoms or from about 7 to about 25, e.g. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 C atoms, for example for a saturated acyl radical having 16 C atoms, or H and R4 is a from 1 to 25 amino acid residues, such as 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 amino acid residues, physiologically acceptable and in the treated species not per se immunogenic peptide, for example with the amino acid sequence GDPKHPKSF (SEQ ID NO: 1).
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence GDPKHPKSF
  • Treating species refers to the species that belongs to the subject being treated or in this context, the use of other known adjuvants, such as squalene or alumina, is not excluded.
  • the induction of the desired immunological reaction is fundamentally dependent on the simultaneous administration of all three components, which however should be coupled to the same or different carrier particles depending on the situation and antigen (embodiment D).
  • the vaccine of the invention consists of a plurality of micro / nanoparticles.
  • each component can be bound to the polarized particle surface via its own charge tag (Figure 4).
  • conjugates are the following general structures (II), (III) or (IV).
  • n is in each case a natural number from 0 to 8, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7.
  • R 1, R 2, R 3, R 4, R 5 and R 6 are molecular units which may be identical or different can.
  • R1, R2, R3, R4, R5 and R6 are independently selected peptide regions having amino acid sequences that are from 0 to about 8 amino acids in length, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6 or 7 amino acids. Any such peptide region can serve as a molecular spacer and accordingly can be referred to as an amino acid spacer.
  • T cell epitope and T cell epitope 2 represent an amino acid sequence of an epitope for cytotoxic effector T cells or an epitope for helper T cells. T cell epitope and T cell epitope 2 may be the same or different.
  • An “epitope” is antigenic and thus may be understood to be defining as an "antigenic structure” or an “antigenic determinant.”
  • Immunoglobulins and T cell receptors can recognize and bind an epitope, and an epitope is also a region of an antigen to which An epitope is a region of a molecule that may be linear, ie, an amino acid sequence, for example, in a linearly contiguous form, that is derived from, for example, an immunoglobulin, a T cell receptor, or a binding reagent such as a lipocalin mutein Imunglobulin or T cell receptor recognized epitope.
  • a linear epitope generally contains at least three, and typically at least about 5, eg, 8-10 amino acids.
  • An epitope may also be a conformationally-dependent epitope in which, unlike a linear epitope, the primary amino acid sequence is not the only component of the recognized epitope, for example because it can not be recognized as such by an immunoglobulin or T cell receptor.
  • An immunoglobulin, a T-cell receptor, or a binding reagent such as a lipocalin mutein recognize a three-dimensional structure of the antigen in a conformationally-dependent epitope.
  • a conformationally-dependent epitope typically contains a greater number of amino acids than a linear epitope.
  • a conformation-dependent epitope can be determined, for example, by X-ray crystallography, two-dimensional NMR spectroscopy, site-directed spin labeling, and electron paramagnetic resonance spectroscopy.
  • lipopeptide stands for an immunomodulator according to formula (I)
  • day stands for a sequence of 4 to 12, e.g. 4-10, including about 5, about 6, about 7, about 8, or about 9 basic (positive charge) or acid (negative charge) amino acids.
  • Such a conjugate is then immobilized on the polarized carrier particle over the charge tag, as shown in FIG.
  • vaccines such or similar conjugates are advantageous, depends on the medical indication as well as the contained vaccine components and antigen determinants. In the investigations it could be shown that the spatial proximity of certain epitopes in some cases has an advantageous effect on the immunization success, in other cases has no influence.
  • the form of binding to the carrier particle charge tags, single / mixed loading
  • the type of conjugation must also be specifically adjusted.
  • the present invention therefore relates to a micro- and / or nanoparticle vaccine which is suitable for prophylactic and / or therapeutic use.
  • the vaccine consists of at least the basic components
  • CTL epitopes polyepitopes, biopolymers, proteins, DNA, RNA, polysaccharides,
  • Glycolipids glycoproteins or similar carriers of antigenic information
  • DCs preferably synthetic analogs of bacterial lipopeptides
  • the vaccine components are reversibly coupled by a charge tag to micro / nano-scale carrier particles
  • the immunological potential of the micro- and / or nanoparticle vaccines according to the invention was determined by means of in vitro experiments with model vaccines containing the CTL epitopes GILGFVFTL (SEQ ID NO: 5) from the influenza matrix protein M1 or NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6 ) out the cytomegalovirus CMV early antigen pp65 containing helper T-cell epitope Pan-DR-E (aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C) and Pam 2 Cys-GDPKHPKSF as immunomodulator (Examples C and D) ).
  • the carrier particles are deposited in the hair follicles for about 5 to 10 days and by a
  • the particle-bound vaccine components of the model vaccines in human effector T cells elicit a specific T cell mediated immune response that is qualitatively and quantitatively comparable to the response to the unbound vaccine components and also the charge tags have no deleterious effect on the have immunological activity of the vaccine components;
  • helper T cell epitope Pan-DR-E additionally stimulates the T cells and, via the T cells, also the DCs;
  • helper T-cell epitope Pan-DR-E and lipopeptide immunomodulator enhances or even makes possible the proliferation and differentiation of naive T cells.
  • Another object of the invention is the preparation of the vaccine components according to the invention and their modification with charge tags (see above), as illustrated in Example A.
  • the synthesis of the epitopes, as well as the charge tags, in some embodiments consisting of a series of 4-10 basic (positive charge) or acid (negative charge) amino acids, can be carried out in solution or solid phase synthesis according to methods of protecting group chemistry known to those skilled in the art ,
  • the charge tags attached N-terminal or C-terminal, in some embodiments C-terminal, are already considered in the construction of the amino acid sequence.
  • a payday may consist of a sequence of identical amino acid units or of a sequence of different amino acid units.
  • a charge tag contains or consists of negatively charged but not positively charged amino acid units or positively charged but not negatively charged amino acid units.
  • a charge tag may also have uncharged amino acid units. Usually, however, one charge day contains more charged than uncharged amino acid units.
  • a vaccine or a nanoparticle or microparticle of the invention contains a charge tag that is a series of four, five, six, or seven lysine units, a series of four, five, six, or seven pyrrolysine units, a series of four , has five, six or seven histidine units and / or a sequence of four, five, six or seven arginine units or consists thereof.
  • a vaccine or a nanoparticle or microparticle of the invention contains a payday that is a series of four, five, six or seven sulfotyrosine units, a series of four, five, six or seven aspartate units and / or a sequence of four, five, six or seven glutamate units or consists thereof.
  • the target compound is obtained as a stereochemically defined derivative consisting of L-amino acids, of the modified amino acid S- [2,3-di (hydroxy) - (2f-J-propyl] - [/!] - cysteine and of two or three Acyl residues is constructed and has a higher biological activity.
  • a vaccine component according to the invention can also be modified as a so-called "prodrug compound", for example as prodrug ester, prodrug peptides or the like
  • a prodrug compound is understood as meaning a molecule which in some cases is itself pharmacologically inactive, but in In other cases, a prodrug compound is less active than a pharmacologically (fully) active agent formed therefrom in the body of the subject, thus allowing a prodrug compound to function as a precursor molecule
  • a prodrug compound may contain residues that are cleaved from the molecule in vivo, for example, by an enzymatically catalyzed reaction such as hydrolysis or oxidation, Thus, a hydroxy group present in a pharmacologically active compound may be present in a prodrug.
  • Verbindun g may be in the form of an ester, an amine may be in the form of an amide, or a carboxyl group may be in the form of an ester or an amide.
  • a carboxyl group present in a pharmacologically active compound can also be present as a hydroxy group which can be oxidized in vivo.
  • coupling of cell-penetration promoting molecules, e.g. Biotin or maleimidopropionic acid, optionally via suitable spacer molecules, to the primary amino group or the acylation of the amino group, the bioavailability and thus the effectiveness of the compounds of the invention can be improved.
  • Another object of the invention is the use of a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention for the preparation of a pharmaceutical preparation for humans and / or animals for a medical application.
  • One such application may be the prophylactic specific immunization against and / or for therapeutic vaccination in a disease such as an infection, cancer, autoimmune disease, or an inflammatory and / or allergic condition, as well as for the support of a conventional vaccine.
  • Such an immunostimulatory active composition containing a therapeutically effective amount of at least one microparticle and / or nanoparticle vaccine according to the invention may further comprise one or more immunological-action-enhancing adjuvants, pharmaceutically suitable excipients, auxiliaries and / or additives, such as, for example, detergents, Solubilizers, stabilizers or preservatives, as well as otherwise otherwise treatment-relevant agents or skin care products.
  • immunological-action-enhancing adjuvants such as, for example, detergents, Solubilizers, stabilizers or preservatives, as well as otherwise otherwise treatment-relevant agents or skin care products.
  • Pharmaceutically acceptable materials are the substances known to be useful in the pharmaceutical and food technology industries and in adjacent fields, in particular those listed in the relevant pharmacopoeias whose properties do not preclude physiological application.
  • micro- / nanoparticle vaccine The effects produced by a micro- / nanoparticle vaccine according to the invention are also dependent on its formulation.
  • a corresponding pharmaceutical preparation should allow the direct application of the drug to the untreated skin.
  • suitable formulations for the micro- and / or nanoparticle vaccines according to the invention for example, pastes, ointments, creams, lotions, emulsions, gels, hydrogels, suspensions, solutions, sprays or patches, or for example aqueous or ethanolic gels and suspensions or oil Water emulsions.
  • a sustained-release formulation is also suitable which can be prepared by methods of pharmaceutical galenics known to the person skilled in the art.
  • composition of a pharmaceutical preparation according to the invention is carried out in the usual way by methods known to those skilled in the art, as described in the relevant pharmacopoeias, wherein the components can be mixed together, dissolved or associated with a physical or biological carrier.
  • a pharmaceutical preparation according to the invention can additionally be sterilized.
  • the invention also relates to the use of a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention or a pharmaceutical preparation containing it for the treatment and prevention of one or more human and animal diseases associated with infections, cancer, autoimmune diseases or inflammatory and allergic conditions stand.
  • a subject that is to say a person or an animal requiring such a treatment, has a therapeutically effective amount of a microparticle and / or nanoparticle vaccine according to the invention or a pharmaceutical preparation according to the invention applied directly to the untreated skin.
  • the formulation can be massaged in with a finger or optionally with a massage applicator.
  • additional templates can be used for the size of the treated area of the skin.
  • the order quantity can be specified by the packaging unit.
  • the efficiency of uptake of the micro- and / or nanoparticle vaccine may optionally be increased. Occlusal volumes or patches are other ways to make the drug application.
  • micro- / nanoparticle vaccines and pharmaceutical preparations according to the invention can be used alone, in combination with other micro / nanoparticle vaccines or pharmaceutical preparations contained in the present invention or in combination with one or more active substances which are suitable for the respective medical indication are relevant.
  • the temporal sequence of the application is not restricted. It may be administered either at the same time, before or after the other active substances, as a separate medicinal product or combination preparation and on the same or different routes of administration.
  • the application of different vaccines or parts thereof at different locations and at different times corresponds to the subject matter of the invention.
  • the exact therapeutically effective amount for a subject to be treated, as well as the molar composition of the vaccine or vaccine combination, will depend on various factors, including the nature and course of the disease, size, stature, age and health of the patient, the route of administration, and the specifics used Antigen determinants and, if appropriate, of the other medicaments used. Thus it does not make sense to specify the exact quantity at this time. However, one can in principle start from a 1 to 3-fold application of the pharmaceutical preparations according to the invention over a period of a few weeks to a half year.
  • the amount of active ingredient used should usually be in the range of 0.5 pg to 2.0 mg per application and vaccine component.
  • the exact dosage specification depends on the specific application and composition of the micro- and / or nanoparticle vaccine and requires further investigation in the clinical trials.
  • the main advantages of a vaccine and a method or an application of the present invention in which this is used consist in the non-invasive application, the direct transport of the vaccine components through the hair follicle to the target structures and the amplification of the immune reaction by the lipopeptide Immunomodulators.
  • the topical application form of a microparticle and / or nanoparticle vaccine according to the invention is simple and flexible to handle and, as such, independent of medical personnel.
  • topical vaccination with a micro- and / or
  • Nanoparticle vaccine superior to the previously dominant systemic and invasive route of administration.
  • a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention is on the one hand suitable for the prevention of infectious diseases. Due to the unspecific approach of the vaccination strategy according to the invention, a wide range of known infectious diseases can be covered by the selection and combination of T cell epitopes and antigens for B cells.
  • a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention has decisive advantages in the self-medication of chronically ill patients and in the immunization of vaccine intolerances.
  • topical vaccination is extremely beneficial for the vaccination of children as it saves the children the painful experience associated with the injection.
  • the non-invasive principle of the micro- and / or nanoparticle vaccine significantly reduces the risk of infection in vaccines and avoids significant amounts of clinical waste.
  • a micro- and / or nanoparticle vaccine according to the invention a new dimension of vaccine development is opened, which allows a rational vaccine design based on the known immunological knowledge and the specific selection of the epitopes.
  • the principle underlying the invention for overcoming the skin barrier is also open to further development as a general principle for topically applicable drug delivery systems.
  • the general method for preparing the vaccine components according to the invention in particular the peptidic epitopes and the synthetic analogs of bacterial lipopeptides, as well as their modification with the peptidic charge tags with the methods of solid phase synthesis will be described.
  • Structural modifications can be made by skipping individual synthetic steps or adding steps known to the skilled synthetic chemist.
  • a) Synthesis of the Amino Acid Sequences with Automated Solid-Phase Synthesis The synthesis of the peptides proceeds according to classical techniques known from the literature in solution or in an automated process on the solid phase. The solid phase synthesis procedures are the same for almost all amino acid sequences. For this reason, in the example, only the basic synthesis procedure is described, without going into the peculiarities of individual peptides.
  • the peptides are synthesized using a synthesis robot starting from a Fmoc-L-Lys (Boc) -loaded synthesis resin according to the Fmoc peptide synthesis method. If other amino acids are used for the C-terminal charge tag, one starts in an analogous manner with the corresponding Fmoc-protected derivatives.
  • the loaded trityl chloride-polystyrene resin (8 mg, 7 pmol) is weighed into a reactor.
  • the amino acids are dissolved in a 1-hydroxybenzotriazole solution (0.5 M in N, N-dimethylformamide) to 0.5 molar solutions.
  • the filled reactors and vials are placed on the intended positions of the synthesis robot.
  • the cleavage of the Fmoc protective group takes place according to the program sequence shown in Tab. Tab. 1: Cycle for cleavage of the Fmoc protective group.
  • the program sequence of the synthesizer robot is shown in the following table.
  • reaction solution is stirred for 3 h at room temperature and then evaporated to dryness using the rotary evaporator.
  • the solution is then evaporated to half the volume on a rotary evaporator, mixed with potassium hydrogen sulfate solution (5%, 5.2 mL) and stored at -2 ° C. for 16 h.
  • the product is extracted with dichloromethane (3x50 mL). After drying with sodium sulfate, the organic phase is evaporated on a rotary evaporator to dryness.
  • a side chain protected peptide GDPKHPKSF-KKKK (SEQ ID NO: 2) loaded synthesis resin (5.22 pmol) is added with N, N-dimethylformamide (100 pL) and allowed to swell in a reactor for 5 minutes.
  • the resin (5.22 pmol) loaded with Na-fluorenylmethoxycarbonyl-S- [2,3-di (hydroxy) - (2f-S) -propyl] - [ ⁇ ] cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK is treated with N, N-dimethylformamide ( 100 pL) and allowed to swell for 5 min in a reactor.
  • N-dimethylformamide supernatant After filtering off the N, N-dimethylformamide supernatant, ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine (3 M in N, N-dimethylformamide, 24.4 pL, 73.2 pmol, 14 equivalents), palmitic acid (1 M in N, N-dimethylformamide / dichloromethane (1: 1); 104 ⁇ _; 104 ⁇ ; 20 equivalents) and N, N-diisopropylcarbodiimide (3 M in N, N-dimethylformamide; 24.4 L; 73.2 ⁇ mol; 14 equivalents) are pipetted to the resin.
  • the cleavage of the Fmoc and the side-chain protective groups is carried out by the amino acid sequences of the epitope peptides.
  • the cleavage solution trifluoroacetic acid / triisopropylsilane / water (92.5: 5: 2.5, 300 L) is pipetted to the resin (2.6 pmol) and the suspension left at room temperature for 2 h. Subsequently, the cleavage solution is filtered with compressed air into a test tube. Subsequently, another 200 ⁇ _ cleavage solution is pipetted to the resin and the suspension is left for another 30 minutes at room temperature. After re-filtration of the cleavage solution with compressed air, the resin is washed with dichloromethane (200 ⁇ L). The filtrates and the washings are combined and evaporated on a rotary evaporator. The residue is digested with diethyl ether (3 ⁇ 300 ⁇ _) and then centrifuged. The sediment is taken up in tert-butyl alcohol / water (4: 1, 2 mL) and freeze-dried (18 h).
  • the resin (2.6 pmol) loaded with S- [2,3-bis (palmitoyloxy) - (2RS) -propyl] - [/ -] cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK (SEQ ID NO: 3) is labeled with N, N-dimethylformamide (100 ⁇ _) and allowed to swell for 5 min in a reactor.
  • the cleavage of the product from the resin is carried out according to the method described under h).
  • Example B Reversible immobilization of the vaccine components on the carrier particles
  • the vaccine components were labeled with different fluorescent dyes and the decrease in color in the supernatant of the loading solutions was monitored by UV / vis or fluorescence spectroscopy. The results are shown in the following table and Fig. 2.
  • the unlabeled vaccine components were adsorbed on the surface of the carrier particles in analogy to the respectively optimized loading strategy.
  • the particles were incorporated at pH 8 (10 mM TRIS buffer) in aqueous agarose gel 0.5%. After adding a preservative (ethyl paraben, benzalkonium chloride, ethyl hydrobenzoate), the finished and storage-stable formulations were stored until use.
  • a preservative ethyl paraben, benzalkonium chloride, ethyl hydrobenzoate
  • Example C Transport of the micro / nanoparticle vaccine into the hair follicles and to the
  • the penetration depth of the particles is controllable by the particle size, wherein the nature of the particles plays almost no role. While particles with a diameter of approx. 500 nm to 600 nm reach penetration depths of> 1000 pm, smaller and larger particles penetrate much less deeply (FIG. 7). Explanation for this phenomenon is a mainly mechanical effect. Since the thickness of the hair shells is also about 500 nm, a gear pump effect can be assumed, which is initiated by the movement of the hair in the hair follicle. This is the more pronounced, the more similar particle size and Haarschuppendicke are. In vitro, this effect can be simulated by massage.
  • the target structures of the topical vaccine, the DCs, are particularly abundant in the infundibulum area of the hair follicles. This is located at a depth of up to 600 pm and is reached by the vaccine components already after 1 h. Within In the next 24 h a minimal further diffusion takes place, which is of little importance for the vaccination.
  • spherical silica particles with a diameter of 300 nm to 1,500 nm have proven to be particularly suitable carrier particles. b) Long-term storage of the carrier particles in the hair follicle
  • GILGFVFTL (SEQ ID NO: 5) from the influenza matrix protein M1 (GILG) or
  • NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6) from the cytomegalovirus CMV early antigen pp65
  • PBMC peripheral white blood cells
  • iDC immature dendritic cells
  • mDC mature dendritic cells
  • the model epitope GILG was titrated with different variants of C-terminal extension by histidine (H), lysine (K) or glutamate (E) over 12 orders of magnitude and the induction of cytolytic activity in the human cytotoxic T-cell clone 10-21A tested against the B-lymphoblastoid cell line JY.
  • H histidine
  • K lysine
  • E glutamate
  • the modification of the C-terminus of the epitope is expected to reduce the stimulatory capacity.
  • the epitope with the H 4 -tag is 45-fold, that with K t -tag 131-fold and that with E 4 -tag 708-fold less potent than the unmodified epitope.
  • the vaccination effect i. the stimulation of the adaptive immune system, and especially the effector T cells, depends on the successful induction of the differentiation of iDCs into mDCs and their activation into potent immunostimulatory cells. This process can be monitored by expression of costimulatory surface molecules on the DCs.
  • DCs which were differentiated and activated as described under c) with differently loaded carrier particles or which were not or only partially matured because of the lacking immunomodulator, were labeled with T cells of the same donor from whose PBMC the DCs were generated Incubated for 7 days. The T cells were then examined by flow cytometry for proliferation and differentiation. Separate detection of the CD45RA-expressing naive T cells and the CD45RO-expressing memory T cells were separated from PBMC on the basis of specific antibodies using magnetic separation and incubated separately with the DCs.
  • CFSE Proliferation was detected by CFSE assay.
  • the T cells are labeled with the cell-stable fluorescent dye CFSE before stimulation.
  • the dye is diluted 1: 1 so that the rate of proliferation can be determined from the decrease in cell-associated fluorescence.
  • the differentiation of naive to memory T cells could be detected with differentiation markers.
  • naive T cells Figure 14
  • DCs preincubated with particles loaded with the P2C immunomodulator induce proliferation but hardly any differentiation, similar to an inflammatory cytokine cocktail (TNF + IL-4 + IL-6).
  • the helper T cell epitope PADRE has a similar but much weaker effect.
  • DCs pretreated with P2C and PADRE-bearing particles induce both high proliferation and differentiation of a high proportion of naive T cells, and thus exactly the immunological effect expected of a prophylactic vaccine.
  • the DCs induce proliferation after incubation with the immunomodulator P2C or the helper T cell epitope PADRE, as well as with the cytokine cocktail.
  • the immunomodulator P2C or the helper T cell epitope PADRE as well as with the cytokine cocktail.
  • no qualitative differentiation can be observed here, but a clear enhancement of the effect when PADRE and P2C-bearing particles are combined. This effect reflects the situation of therapeutic vaccination or revaccination of immune individuals.
  • human peripheral blood iDCs were cultured for two days with carrier particles coated with the T-cell epitopes NLVPMVATV [SEQ ID NO: 6] ( Figure 16) or GILGFVFTL [SEQ ID NO: 5] ( Figure 17), the immunomodulator P2C, or combinations thereof, and then combined with CD8 T cells and incubated for 7 days. Thereafter, the proliferation of effector T cells with specificity for influenza or CMV was investigated by recirculating tetramerized HC-peptide complexes (HLA-A2.1 molecules carrying the respective peptides GILG and NLVP, respectively) by flow cytometry in the cell cultures. The iDCs and effector T cells were each generated from peripheral blood of the same healthy donor.
  • the strongest immune stimulation was achieved with a mixture of particles carrying the epitope and the immunomodulator separately. So here is no coupling request. A mixture of the particles is more advantageous.
  • induction of antigen-specific T cells depends on the concomitant administration of the specific epitope and the immunomodulator, which, depending on the situation and antigen, should be coupled to the same particles or uncoupled.
  • the few tetramer and CD8-positive cells that have already been detected in the T-cell cultures with or without iDCs show that the donors in these examples have long been in contact with the viruses from which the epitopes originate have had. The experiments carried out thus correspond to the situation of a therapeutic or Revakzinleiter.
  • the investigated concentration range from 1 f M to 500 ⁇ for the model epitopes Pan-DR-E, GILGFVFTL (SEQ ID NO: 5) and NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6 ) and for the lipopeptide adjuvants no evidence of a toxic effect of the micro- / nanoparticle vaccine according to the invention.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue topische Vakzine, die mit Hilfe eines Partikel-basierten Trägersystems gezielt die dendritischen Zellen der Haut adressieren und damit eine effektive prophylaktische und/oder therapeutische T-Zell-vermittelte Immunität induzieren. Die Erfindung betrifft weiterhin die Zusammensetzung eines solchen Vakzins aus Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen und Helfer-T-Zellen sowie die Verwendung von synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide als TLR-basierte Adjuvantien für die Verstärkung der spezifischen Immunantwort. Eine Kombination der Vakzinkomponenten wird an mikro- und/oder nanoskaligen Trägerpartikeln immobilisiert, nach Auftragen auf die Haut durch diese in einem aktiven Transportprozess in die Haarfollikel befördert und dort temporär deponiert. Die unter den physiologischen Bedingungen im Haarfollikel freigesetzten Wirkstoffe diffundieren zu den Zielstrukturen in der Haut, stimulieren die Zelloberflächenrezeptoren der dendritischen Zellen und induzieren eine gezielte T-zelluläre Immunantwort. Die neuen topischen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine und deren Formulierungen eignen sich einerseits zur Vorbeugung und andererseits zur Behandlung von Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunkrankheiten, chronischen Entzündungen und Allergien bei Mensch und Tier.

Description

Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin zur prophylaktischen und/oder therapeutischen
Anwendung
Die vorliegende Anmeldung beansprucht die Priorität einer Anmeldung über Topische Nano- partikel-Vakzine zur Immunstimulation der dendritischen Zellen in der Haut", die am 21. April 2011 beim Deutschen Patent- und Markenamt eingereicht wurde, wo ihr das Aktenzeichen DE 102011 018499.6 zugeteilt wurde. Der Inhalt der genannten Anmeldung, die am 21. April 2011 eingereicht wurde, wird hiermit durch Bezug für alle Zwecke aufgenommen, inklusive der Aufnahme eines Bestandteils oder Elements oder eines Teils der Beschreibung, der Ansprüche oder der Zeichnungen, die hier nicht enthalten und in Regel 20.5(a) des PCT genannt sind, gemä Regel 4.18 der PCT.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Anwendung, insbesondere zur topischen Applikation auf die Hautoberfläche. Darüber hinaus betrifft die Erfindung ein pharmazeutisches Präparat, das das Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin enthält, sowie die Verwendung der Mikro- bzw. Nanopar- tikel-Vakzine oder eines solchen pharmazeutischen Präparats zur Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung.
Hintergrund der Erfindung
Die Suche nach Alternativen zu den üblichen Vakzinierungsverfahren über die parenteralen und oralen Applikationswege findet immer mehr Beachtung (O'Hagan etal.2004).
Bei der systemischen Aufnahme der Wirkstoffe, die über das Blut- und Lymphsystem im gesamten Körper verteilt werden, kommt nur ein Bruchteil der pharmakologisch aktiven Bestandteile an den Zielstrukturen an. Zudem weisen viele Wirkstoffe aufgrund ihrer physikochemischen Eigenschaften nur eine geringe Bioverfügbarkeit auf. Weniger stabile Verbindungen werden durch enzymatische Abbauprozesse, vor allem im Gastrointestinaltrakt, metabolisiert, bevor sie den Wirkort erreichen. Somit werden mit den bisher üblichen Vakzinierungsverfahren sehr oft hohe Dosierungen benötigt, um einen adäquaten Immunisierungserfolg zu erzielen, entsprechende Nebenwirkungen inbegriffen.
Deshalb wurden in der letzten Zeit zunehmende Anstrengungen unternommen, über gezielte Drug Delivery Systeme die Wirkstoffe kontrolliert, in stabilisierter Form und in ausreichend hoher Dosis an einen festgelegten Wirkort zu bringen und dort mit einem definierten Freisetzungsprofil abzugeben.
Weitere einschränkende Bedingungen sind die mit den systemischen, meist invasiven Applikationsformen verbundenen Risiken und Nebenwirkungen, wie z.B. Sekundärinfektio- nen, allergische Reaktionen, Reizungen, Intoxikation, Hämatome und ähnliches. Nicht zuletzt fällt durch die Injektionsnadeln eine große Menge potentiell infektiösen Sondermülls an.
Vorteile einer topischen Vakzinierung dagegen, sind neben der einfachen, flexiblen und schmerzarmen Handhabung auch die gezielte Adressierung von relevanten Strukturen des Immunsystems in der Haut, die eine effektive Immunisierung ermöglichen, ohne dabei den gesamten Organismus mit den oftmals wenig verträglichen Substanzen zu belasten, sowie die Vermeidung jeglichen Infektionsrisikos. Geschultes medizinisches Personal ist oftmals entbehrlich.
Die topische Anwendung von Arzneimitteln auf der Haut basiert auf der direkten Auftragung der Wirkstoffformulierung auf die Hautoberfläche, dem Durchtritt der gegebenenfalls Trägergebundenen Wirkstoffe durch die Haut und der Penetration / Diffusion der aktiven Komponenten zum Wirkort.
Dazu wurden bereits einige Applikationsstrategien entwickelt. Jedoch wurden nur wenige Konzepte in die klinische Anwendung, d.h. in klinische Studien überführt.
Bereits im Jahr 1998 begründete die Firma lomai Corporation die Entwicklung der Pflaster- Technologie mit einer Patentanmeldung, die die transkutane Immunisierung über die Langerhans-Zellen der Haut durch Applikation von Antigen-Determinanten im Kombination mit ADP- ribosylierenden Exotoxinen oder anderen Adjuvantien direkt auf die Hautoberfläche, zum Gegenstand hat (W0 1999/43350). Jedoch ist es auch Gegenstand dieser Anmeldung, dass der Penetrationsprozess durch die Haut durch die Anwendung von physikalischen oder chemischen Methoden zur Barriereschädigungen unterstützt wird.
In einer weiteren Anmeldung (WO 2002/074244) wird die topische Applikation lediglich der Adjuvantien beschrieben, um die durch parenteral applizierte Vakzine ausgelöste Immunreaktion zu verstärken. Die angewandte Technologie zur Vermittlung der Hautpenetration entspricht dem oben genannten Prinzip, das eine Abtrennung der oberen Epidermisschicht beinhaltet. Danach wird das Pflaster aufgeklebt und die austretende Wundflüssigkeit benetzt den Impfstoff, der dann in die Haut diffundieren soll. Für den Mechanismus dieser Penetration werden u.a. die interzellulare Penetration innerhalb der Lipidschichten und, vorrangig für polare Substanzen, der Transfer durch flüssige interzelluläre Kanäle zwischen den Keratinozyten diskutiert. Den Haarfollikeln und Schweißdrüsen wird ausdrücklich eine „minimale Rolle" beim transkutanen Wirkstofftransport zugebilligt. Partikel werden lediglich zur besseren Stabilisierung von Suspensionen und als Depots für die verzögerte Freisetzung der Wirkstoffkomponenten vorgeschlagen. Eine Transportfunktion dieser Partikel ist nicht beschrieben. Auf Basis dieser Erfindungen hat die Firma Intercell AG inzwischen ein Impf-Pflaster gegen Reise-Diarrhöe entwickelt (WO 2005/103073). Das Zulassungsverfahren wurde allerdings gestoppt, da in den klinischen Studien der Phase III keine ausreichende Wirksamkeit nachgewiesen werden konnte. Ein System zur Impfung gegen Influenza, bei dem die immunisierende Wirkung von niedrigen Dosen der konventionell verabreichten Antigene durch ein ein toxisches Adjuvans enthaltendes Pflaster verstärkt wird sowie ein Impfstoff-Pflaster gegen Krankenhauskeime sind in der Entwicklung (WO 2003/047602, Glenn etal. 2007).
Andere Ansätze zur topischen Vakzinierung erzielen die transdermale / intradermale Applikation von Antigenen durch nadelfreie Injektion mittels Luft, Flüssigkeiten und/oder Druck (W01999/31262, Chen etal. 2000, 2002, Mitragotri 2006) oder Mikro-Nadeln (Choi et al. 2007). Mit Intanza® und IDflu® von Sanofi Pasteur wurde im Dezember 2008 das erste intradermale Mikroinjektions-Impfsystem für die saisonale Influenza-Impfung in der EU zugelassen. Durch die nur 1 ,5 mm langen Mikro-Nadeln wird das Antigen minimal-invasiv direkt in die Haut injiziert. Allerdings wird damit nicht die mit den immunkompetenten Zellen besonders dicht durchzogene Epidermis als ideale Zielregion erreicht. Sullivan etal. (2010) schlagen die Verwendung von Pflastern mit selbstauflösenden Mikro-Nadeln aus Polyvinylpyrrolidon vor, in die die Vakzine eingeschlossen sind.
Versuche mit zellpenetrierenden Peptiden hatten weniger Erfolg. Durch die Kopplung von TAT-Peptiden an Lipid-Nanopartikel konnten diese bis zu einer Tiefe von 120 μιτι in die Epider- mis gelangen. Auch in den Haarfollikeln waren Partikel in dieser Tiefe nachweisbar. Für die Adressierung der für die Immunisierung notwendigen DCs reicht dies aber nicht aus (Patlolla et al.2010). In anderen Arbeiten ist der Transporteffekt auf wenige Proteine beschränkt (Huang et al.2010).
Seit einigen Jahren werden auch Liposomen als Transportsysteme für topisch applizierte Wirkstoffe in und durch die Barriere der menschliche Haut eingesetzt (Barry 2002). Untersuchungen ergaben, dass diese vesikulären Strukturen die Hautbarriere nicht als intakte Einheiten durchdringen, sondern die Wirkstoffe freisetzen, die dann eigenständig weiter penetrieren.
Es gibt jedoch Untersuchungen, dass Nanopartikel unterhalb einer bestimmten Größe in der Lage sind, die Hautbarriere nach Vorschädigung zu durchdringen. Vogt et al. applizierten beispielsweise Nanopartikel mit einem Durchmesser von 40 - 1.500 nm auf exzidierte Haut, deren Barriere vorher mit einem Cyanacrylat-Abriss geschädigt wurde. In diesem Fall konnte nachgewiesen werden, dass insbesondere die kleinsten untersuchten Partikel in das Gewebe eindringen konnten und dort von den Langerhans-Zellen aufgenommen wurden (Vogt et al. 2006). Eine darauf aufbauende Vakzinierungsstrategie mit klassischen Influenza-Vakzin- Suspensionen befindet sich in der klinischen Phase la (Combadiere etal. 2010, WO 2006/ 136959). Dasselbe Prinzip beinhaltet der DNA-basierte HIV-Impfstoff DermaVir von Genetic Immunity (klinischen Phase II), bei dem die Nukleinsäuren an Nanopartikel aus mannosyliertem Polyethylenimin gebunden sind. Eine Freisetzung der Wirkstoffe ist in diesen Konzepten nicht vorgesehen. Vielmehr geht man von der partikulären Struktur der Antigene z.B. in Form von viralen Partikeln, Nanopartikel oder DNA aus.
Zahlreiche nanoskalige Trägersysteme sind entwickelt worden, deren Ziel vor allem darin besteht, die Träger-gebundenen Wirkstoffe direkt zu den und in die immunkompetenten Zellen zu befördern. In WO 2010/006753 werden Si02-Nanopartikel einer Größe von 25 nm als Antigen-Träger eingesetzt, wobei die Effektivität der Aufnahme in die antigenpräsentieren- den Zellen der Lymphknoten und damit der Immunisierung über die Größe der Partikel steuerbar ist. Auch in WO 2008/118861 wird die Adressierung der immunkompetenten Zellen durch Größe und Geometrie der Trägerpartikel, weitestgehend unabhängig von deren Zusammensetzung, erzielt. Die Applikation erfolgt in beiden Fällen parenteral durch intradermale oder subkutane Injektion. Die Trägerpartikel werden, zusammen mit den kovalent gebundenen Wirkstoffen, direkt von den antigenpräsentierenden Zellen der Lymphknoten aufgenommen. Ähnliche Ansätze basieren auf biologisch abbaubaren Trägerpartikeln (WO 2008/048298, WO 2007/067744, W0 1998/28357), wobei die Wirkstoff-Komponenten in die Matrix integriert oder durch adsorptive Wechselwirkungen oder Komplexbildung an die Oberfläche gebunden sein können. Auch werden Trägerpartikel mit intrinsischem adjuvantem Effekt beschrieben (Chen et al. 2010, Florindo et al. 2010).
Durch nicht-kovalente Kopplung der Wirkstoffe an die Trägerpartikel auf der Basis von physikalisch-chemischen Wechselwirkungen, ergibt sich die Möglichkeit der kontrollierten Wirkstoff-Freisetzung nach Erreichen des Wirkortes (WO 2009/046498, WO 2007/067744).
Bisher ist es jedoch in keiner Anwendung gelungen, den transdermalen Wirkstofftransport für beliebige und beliebig viele Vakzinkomponenten ohne eine Vorschädigung der Haut oder Injektionssysteme und ohne Eintritt des Trägers in das lebende Körpergewebe zu realisieren (Prausnitzetal. 2008). Während die Penetration von Nanopartikeln in die Haarfollikel inzwischen recht gut erforscht ist, sind die Anwendung größerer und damit nicht zellgängiger Trägerpartikel, die effektive Bindung und gezielte Freisetzung der Wirkstoffe und auch die eigenständige Diffusion der Wirkstoffe zu den immunkompetenten Strukturen der Haut, noch Gegenstand aktueller Forschungen.
Die Entwicklung von Impfstoffen, weg von den kompletten Organismen hin zu hochreinen synthetischen Vakzinkomponenten, erhöht die Erfordernis von Adjuvantien zur Verstärkung der Immunantwort. Viele klassische Adjuvantien simulieren durch bestimmte molekulare Strukturen, Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs), die immunologisch effektiven Komponenten der Pathogene und werden von den immunkompetenten Zellen des angeborenen Immunsystems, einschließlich der antigenpräsentierenden Zellen, wie z.B. DCs, bevorzugt über die Toll-Like-Rezeptoren (TLR) erkannt. Diese Zellen spielen durch die Präsentation der Antigene an die Lymphozyten und die Expression von Zytokinen auch eine wichtige Rolle bei der Ausprägung der Antigen-spezifischen adaptiven Immunantwort.
Unter einigen anderen kommt den bakteriellen Lipopeptiden, die vor allem die T-zelluläre Immunantwort stimulieren, eine große Bedeutung zu (Brown etal. 2005). Weil die TLR für Lipopeptide, im Gegensatz zu den TLR für die meisten anderen Immunmodulatoren, auf den Oberflächen der Zellen exprimiert werden, sind bakterielle Lipopeptide besonders gut zum Targeting geeignet. Zudem können diese durch synthetische Analoga ersetzt werden, die als charakteristisches Merkmal die ungewöhnliche Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-propyl]-[f?]- cystein am N-Terminus, an die zwei oder drei Fettsäuren gebunden sind, aufweisen. So reagiert das TLR 1 /TLR2-Heterodimer ebenfalls auf triacylierte synthetische Lipopeptide, wie die Pam3Cys-Derivate (EP 0210412). TLR6/TLR 2-Heterodimere sind sensitiv für diacylierte synthetische Lipopeptide, wie die Pam2Cys-Derivate (EP 0519327).
Z.B. wird von Mühlradt etal. ein diacyliertes Dihydroxypropylcystein-Peptid mit einem von der Spezies Mycoplasma fermentans abgeleiteten Peptid (MALP-2) für verschiedene Anwendungen in der Immunologischen Medizin beansprucht (W0 1998/27110, WO 1999/59610, WO 2002/028887, WO 2003/084568, WO 2004/108145).
Ausgehend von diesen Erkenntnissen wurden bereits verschiedene Medikamente und Impfstoffe, die Zusätze von acylierten Lipopeptiden als Adjuvantien enthalten, zur Verwendung im Rahmen von immunmodulatorischen Therapien entwickelt. Typischerweise werden die Lipopeptide, bevorzugt Pam3Cys- und Pam2Cys-Derivate als TLR 2 targetierende Substanz, hierzu mit einer antigenen Komponente für B-Lymphozyten oder für zytotoxische T-Zellen sowie weiteren Hilfsstoffen vermischt, um synergistische Effekte zu induzieren (WO 2007/ 103322, WO 2006/104389, US 7,387,271 ). In WO 2006/040076 wird auch eine topische Applikation einer solchen Wirkstoff-Formulierung beschrieben.
Auch Formulierungen als Liposomen oder Virus Like Particles, die neben Antigenen und gegebenenfalls Zytostatika auch Lipopeptide, bevorzugt Pam3Cys, enthalten, werden für die Behandlung von verschiedenen Erkrankungen und Allergien beansprucht (WO 2005/063201 , WO 2005/063288).
Ebenfalls werden Konjugate aus Pam2Cys- bzw. Pam3Cys-Derivaten und Antigenen als Impfstoffe beschrieben, um die Antigene spezifisch an die immunkompetenten Zellen zu binden bzw. in diese einzuschleusen; so in WO 2007/078879 eine Kombination aus einem Membran- Proteinen des Influenza-Virus und einem Pam3Cys-Derivat, in WO 2009/046498 eine DNA- Vakzine, die durch polare Aminosäuren an ein Pam2Cys-Derivat gekoppelt ist, in WO 2007/ 079448 ein lineares Tandem-Molekül aus einem B-Zell-Epitop, einem T-Zell-Epitop und Pam3Cys oder in WO 2004/014956 und WO 2004/014957 ein Molekül aus einem B-Zell- bzw. CTL-Epitop und einem Helfer-T-Zell-Epitop, die durch ein Pam3Cys-Lipopeptid miteinander verbrückt sind. Bereits Borges etal. (1994) beschreiben den immunverstärkenden Effekt durch die direkte Kopplung von Pam2Cys- und/oder Pam3Cys-Derivaten mit CTL- und/oder Helfer-T- Zell-Epitopen.
Im Zusammenhang mit partikulären Biotransportern für Lipopeptide sind sehr wenige konkrete Anwendungen bekannt. Schwerpunkt diesbezüglicher Patentanmeldungen ist die Beschaffenheit der Partikel. In der Regel sind die Wirkstoffkomponenten nicht näher spezifiziert. Lipopeptide werden unter einer Vielzahl möglicher Verbindungen als Immun- zellen-targetierende Substanzen erwähnt. Eine Anwendung lipid-ähnlicher Strukturen sind nanoskalige Fett- und fettähnliche Tröpfchen als Wirkstoffträger (EP 0605497). Heuking et al. 2009 beschreiben ein System aus Pam3Cys-PEG gekoppelt an Chitosan (Partikel) als potentielles Drug Delivery System, wobei das Lipopeptid als Ankermolekül zur Zielsteuerung der Chitosan-Biotransporter fungiert. Durch das Lipopeptid als TLR-Ligand sollen die Wirkstoffträger spezifisch an die immunkompetenten Zellen gebunden werden, um eine intensive Wechselwirkung bzw. Aufnahme in die Zelle zu ermöglichen.
Aufgabenstellung Ausgehend von den dargestellten Vor- und Nachteilen derzeit verfügbarer Vakzinierungs- verfahren besteht ein Bedarf an weiteren Vakzinierungsstrategien für Prophylaxe und/oder Therapie, die die Vorteile einer topischen Vakzinierung gegenüber der bisher dominanten systemischen und invasiven Applikationsform nutzen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, neue trägerbasierte und topisch appli- zierbare prophylaktische und/oder therapeutische Vakzine zur Verfügung zu stellen, welche eine effektive und zugleich einfache wie schmerzarme Immunisierung ohne Nebenwirkungen und Risiken ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch ein topisch applizierbares Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin wie es in Anspruch 1 definiert ist. Dieses Vakzin kann zur prophylaktischen und/oder thera- peutischen Anwendung bei Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen sowie entzündlichen und allergischen Leiden eingesetzt werden. Ein Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung ist typischerweise in der Lage, mit den DCs die Sensorzellen des Immunorgans Haut direkt durch den Haarfollikel als Eintrittspforte zu adressieren und zusätzlich durch ein TLR- basiertes Adjuvans zu stimulieren. Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin, im Folgenden auch als eine Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine bezeichnet, sowie Verwendungen und Verfahren, die auf diesem Vakzin beruhen.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue topische Vakzine, die mit Hilfe eines Partikel-basierten Trägersystems gezielt die dendritischen Zellen (DC) der Haut über den Haarfollikel als Eintrittspforte adressieren und damit eine effektive prophylaktische und/oder therapeutische T-Zell-vermittelte Immunität induzieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Zusammensetzung eines solchen Vakzins aus Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen und Helfer-T-Zellen sowie die Verwendung von synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide als TLR-basierte Adjuvanten für die Verstärkung der spezifischen Immunantwort.
Eine Kombination der Vakzinkomponenten wird an mikro- und/oder nanoskaligen Trägerpartikeln immobilisiert, nach Auftragen auf die Haut durch diese in einem aktiven Transportprozess in die Haarfollikel befördert und dort temporär deponiert. Die unter den physiologischen Bedingungen im Haarfollikel freigesetzten Wirkstoffe diffundieren zu den Zielstrukturen in der Haut, stimulieren die Zelloberflächenrezeptoren der DCs und induzieren eine gezielte Vakzinantigen-spezifische T-zelluläre Immunantwort.
Das neue topische Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine und dessen Formulierungen eignet/eignen sich als Arzneimittel einerseits zur Vorbeugung und andererseits zur Behandlung von Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunkrankheiten, chronischen Entzündungen und Allergien bei Mensch und Tier.
In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Mikro- und/oder Nanopartikel- Vakzin bereit. Das Vakzin weist Grundkomponenten als einzelne Moleküle oder Konjugate auf. Das Vakzin weist eine erste Grundkomponente auf, bei der es sich um eine oder mehrere Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen handelt. Das Vakzin weist eine zweite Grundkomponente auf, bei der es sich um eine oder mehrere Antigen-Determinanten für Helfer-T-Zellen handelt. Ferner weist das Vakzin eine dritte Grundkomponente auf, bei der es sich um einen oder mehrere Immunmodulatoren zur Aktivierung der antigenpräsentieren- den dendritischen Zellen handelt. Die Vakzinkomponenten sind an mikro- und/oder nanoska- lige Trägerpartikel gekoppelt. Die mikro- und/oder nanoskaligen Trägerpartikel sind so gestaltet, dass sie nach topischer Applikation auf die Hautoberfläche aktiv in die Haarfollikel transportiert und dort temporär deponiert werden. Dadurch induzieren die Vakzinkomponenten über die Stimulierung der dendritischen Zellen der Haut eine T-Zell-vermittelte Immunität. In einigen Ausführungsformen ist das Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin gemäß dem ersten Aspekt ein Vakzin zur medizinischen Verwendung. Das Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin ist in einigen Ausführungsformen zur therapeutischen und/oder prophylaktischen Verwendung. In einigen Ausführungsformen ist das Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin ein Vakzin zur Verwendung in einem therapeutischen und/oder prophylaktischen Verfahren.
In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein prophylaktisches und/oder therapeutisches Verfahren bereit, bei dem ein Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin eingesetzt wird. Das Verfahren umfasst Induzieren einer T-Zell-vermittelte Immunität. Das Induzieren einer T-Zell-vermittelten Immunität erfolgt durch Stimulieren der dendritischen Zellen der Haut durch das Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin. Das Vakzin weist Grundkomponenten als einzelne Moleküle oder Konjugate auf. Das Vakzin weist eine erste Grundkomponente auf, bei der es sich um eine oder mehrere Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen handelt. Das Vakzin weist eine zweite Grundkomponente auf, bei der es sich um eine oder mehrere Antigen-Determinanten für Helfer-T-Zellen handelt. Ferner weist das Vakzin eine dritte Grundkomponente auf, bei der es sich um einen oder mehrere Immunmodulatoren zur Aktivierung der antigenpräsentierenden dendritischen Zellen handelt. Die Vakzinkomponenten sind an die mikro- und/oder nanoskaligen Trägerpartikel gekoppelt. Typischerweise ist das Vakzin ein Vakzin gemäß dem ersten Aspekt. Das Verfahren umfasst des Weiteren typischerweise ein topisches Applizieren des Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins auf die Hautoberfläche eines Subjekts. Das Verfahren umfasst ferner, dass zugelassen wird, dass die mikro- und/oder nanoskaligen Partikel aktiv in die Haarfollikel transportiert werden. Darüber hinaus umfasst das Verfahren, dass zugelassen wird, dass die mikro- oder nanoskaligen Partikel in den Haarfollikeln temporär deponiert werden. Dadurch induzieren die Vakzinkomponenten über die Stimulierung der dendritischen Zellen der Haut eine T-Zell-vermittelte Immunität.
Das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt ist typischerweise ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Erkrankung eines Subjekts, d.h. einer Erkrankung bei Mensch und/oder Tier. In einigen Ausführungsformen ist das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Erkrankung bei Mensch und/oder Tier, die mit Infektionen, Krebs, einer Autoimmunerkrankung oder einem entzündlichen und/oder allergischen Leiden in Zusammenhang steht. In einigen Ausführungsformen ist das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt ein Verfahren zur prophylaktischen spezifischen Immunisierung gegen und/oder zur therapeutischen Vakzinierung bei einer Erkrankung. In einigen Ausführungsformen ist das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Unterstützung einer konventionellen Impfung. In einigen Ausführungsformen ist das Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt ein Verfahren zur Verstärkung der Immunantwort nach einer durch konventionelle Impfverfahren durchgeführten Vakzinierung.
In einem verwandten dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Impfen eines Subjekts bereit. Das Verfahren umfasst, einem Subjekt eine pharmazeutisch akzeptable Qualität einer Mikro- und/oder Nanopartikel-Zusammensetzung zu verabreichen. Das Verfahren umfasst typischerweise ein topisches Applizieren der Mikro- und/oder Nanopartikel-Zusammensetzung auf die Hautoberfläche eines Subjekts. Typischerweise ist das Verabreichen der Mikro- und/oder Nanopartikel-Zusammensetzung ausreichend, um eine Immunantwort des Subjekts auszulösen. Die Mikro-/Nanopartikel-Zusammensetzung weist Mikro- und/oder Nanopartikel auf. An die Mikro- und/oder Nanopartikel sind Grundkomponenten der Mikro- und/oder Nanopartikel-Zusammensetzung gekoppelt. Die Grundkomponenten liegen als einzelne Moleküle oder als Konjugate vor. Die Mikro-/Nanopartikel-Zusammensetzung weist eine erste Grundkomponente auf, bei der es sich um eine oder mehrere Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen handelt. Die Mikro- und/oder Nanopartikel-Zusammensetzung weist eine zweite Grundkomponente auf, bei der es sich um eine oder mehrere Antigen- Determinanten für Helfer-T-Zellen handelt. Ferner weist die Mikro-/Nanopartikel-Zusammen- setzung eine dritte Grundkomponente auf, bei der es sich um einen oder mehrere Immunmodulatoren zur Aktivierung der antigenpräsentierenden dendritischen Zellen handelt. Typischerweise ist die Mikro-/Nanopartikel-Zusammensetzung ein Vakzin gemäß dem ersten Aspekt. Das Verfahren umfasst ferner, dass zugelassen wird, dass die Mikro- und/oder Nanopartikel aktiv in die Haarfollikel transportiert werden. Darüber hinaus umfasst das Verfahren, dass zugelassen wird dass die Mikro- und/oder Nanopartikel in den Haarfollikeln temporär deponiert werden. Dadurch können die Grundkomponenten der Mikro-/Nanopar- tikel-Zusammensetzung über die Stimulierung der dendritischen Zellen der Haut eine T-Zell- vermittelte Immunität induzieren.
In einem vierten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein pharmazeutisches Präparat bereit. Das pharmazeutische Präparat enthält ein Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin gemäß dem ersten Aspekt allein oder in Kombination. Das Präparat liegt in einer zur topischen Applikation geeigneten Formulierung vor. Typischerweise enthält das pharmazeutische Präparat eine therapeutisch effektive Menge des Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins.
In einigen Ausführungsformen liegt das pharmazeutische Präparat gemäß dem vierten Aspekt als Paste, Salbe, Creme, Lotion, Emulsion, Gel, Hydrogel, Suspension, Lösung, Spray oder Pflaster vor. Ein solches Präparat enthält in einigen Ausführungsformen weitere Bestandteile wie anderweitig therapierelevante pharmazeutische Wirkstoffe und Adjuvantien sowie weitere pharmazeutisch geeignete Inhaltsstoffe. Beispiele weiterer pharmazeutisch geeigneter Inhaltsstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Trägersubstanzen, Hilfs- und/oder Zusatz- Stoffe wie z.B. Detergentien, Stabilisatoren und Konservierungsmittel. Derartige weitere Bestandteile, die im Präparat enthalten sein können, können gemischt, gelöst oder mit einem physikalischen oder biologischen Träger assoziiert sein.
In einem fünften Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins gemäß dem ersten Aspekt oder eines pharmazeutischen Präparates gemäß dem vierten Aspekt für eine medizinische Indikation.
Eine solche medizinische Indikation kann eine Erkrankung wie z.B. eine Infektion, Krebs, eine Autoimmunerkrankung oder ein entzündliches und/oder allergisches Leiden sein. In einigen Ausführungsformen betrifft die Verwendung eines Mikro-/Nanopartikel-Vakzins oder eines pharmazeutischen Präparates gemäß dem fünften Aspekt eine prophylaktische spezifische Immunisierung gegen eine Erkrankung und/oder die therapeutische Vakzinierung bei einer Erkrankung. In einigen Ausführungsformen betrifft die Verwendung die Verstärkung der Immunantwort nach einer durch konventionelle Impfverfahren durchgeführten Vakzinierung.
In einigen Ausführungsformen betrifft die Verwendung die Herstellung eines Arzneimittels für Mensch und/oder Tier zur Immunisierung. Eine solche Immunisierung kann eine prophylaktische spezifische Immunisierung gegen eine Erkrankung sein. Eine solche Immunisierung kann auch eine therapeutische Vakzinierung bei einer Erkrankung sein. Des Weiteren kann eine solche Immunisierung zur Verstärkung der Immunantwort nach einer durch ein konventionelles Impfverfahren durchgeführten Vakzinierung sein.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Fig. 1 Prinzip der pH-Wert getriggerten Adsorption und Desorption der durch einen Ladungs-Tag polarisierten Vakzinkomponenten auf einem im LBL®-Verfahren mit geladenen Polymeren beschichteten Trägerpartikel. Die Freisetzung der Vakzinkomponenten erfolgt durch Umladung der obersten Polymerschicht in Abhängigkeit vom pH-Wert, in deren Folge die elektrostatische Anziehung aufgehoben wird.
Fig. 2 Abhängigkeit der Beladung der Trägerpartikel von der Reihenfolge der Zugabe der Vakzinkomponenten und der Verweildauer in der Beladungslösung bei sequentieller Zugabe (GILG = GILGFVFTL-KKKKK-Fluoreszein, SEQ-ID-NO: 11 gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff Fluoerszein, P2C = Pam2Cys-GDPKHPKSF-KKKKK-Tamra, SEQ-ID-NO: 9 gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff Tamra, Cha = aK-L-Cha- VAAWTLKAAa-Aca-C-KKKKK-Cy5, SEQ-ID-NO: 10 gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff Cy5). Fig. 3 Freisetzungskinetik der drei Vakzinkomponenten GILGFVFTL-KKKKK-Fluoreszein (GILG), Pam2Cys-GDPKHPKSF-KKKKK-Tamra (P2C) und aK-L-Cha-VAAWTLKAAa- Aca-C-KKKKK-Cy5 (Cha) nach Überführung in eine 10 mM Acetatpuffer-Lösung pH 5 mit Zusatz von 0,1 M Natriumchlorid (1 %-ige Suspension).
Fig. 4 Schematische Zeichnung eines mit den einzelnen Vakzinkomponenten beladenen Trägerpartikels. Die Zahl der Komponenten, die Beladung der Partikel sowie die realen stöchiometrischen Verhältnisse sind entsprechend dem Wirkspektrum der Vakzine variabel einstellbar (beispielhaft für die Antigen-Determinanten sind die Epitope dargestellt).
Fig. 5 Schematische Zeichnung eines mit einem Konjugat der Vakzinkomponenten beladenen Trägerpartikels. Die Beladung der Partikel ist entsprechend dem Wirkspektrum der Vakzine variabel einstellbar (beispielhaft für die Antigen- Determinanten sind die Epitope dargestellt).
Fig. 6 Penetration der Mikro-/Nanopartikel-Vakzine in den Haarfollikel des Schweineohr- Modells (Laser-Scan-Mikroskopische Aufnahme der Kryoschnitte) 60 min nach Auftragen auf die Haut. Das mit Rhodamin markierte Epitop GILGFVFTL-K4 dringt nach Ablösen von einem Silika-Trägerpartikel (mit Cy5 markiert) weiter in den Haarfollikel ein.
Fig. 7 Penetrationstiefe der Silika-Trägerpartikel in Abhängigkeit von der Partikelgröße im Vergleich zur Länge der Terminalhaar-/ Vellushaar-Follikel. Die Zielregion Infundibu- lum ist bei ca.600 μητι Tiefe erreicht.
Fig. 8 Anreicherung und Aufenthaltsdauer der Silika-Trägerpartikel in den Haarfollikeln und im Stratum corneum.
Fig. 9 Auswirkung der Oligoaminosäure-Tags auf die immunologische Aktivität des CTL-Epi- tops GILGFVFTL im Zytotoxizitäts-Assay mit der humanen CD8-T-Zelllinie 10-21A und der B-lymphoblastoiden Zielzelllinie JY (Titration im Radiochromfreisetzungs- Assay). Im Insert sind die nach Clark transformierten Werte dargestellt. Die funktionellen Aviditätswerte in der Tabelle geben die Peptidkonzentration für halbmaximale Zytolyse an. Die Faktoren für die Aktivitätsverluste sind auf die funktionelle Avidität des ungetagten Peptids bezogen.
Fig. 10 Vergleich der immunologischen Aktivität der Partikel-gebundenen und der freien Einzelkomponenten im ELISpot-Assay auf IFN-γ mit humanen CD8-T-Zellen. Fig. 11 Titration der immunologischen Aktivität von Gemischen der Partikel-gebundenen und der freien Vakzinkomponenten im ELISpot-Assay auf IFN-γ mit humanen CD8-T- Zellen (Ordinate: optische Einheiten der densitometrischen Messung).
Fig. 12 Differenzierung und Reifung von DCs unter Verwendung von Gemischen unter- schiedlich beladener Trägerpartikel anhand der Expression der kostimulatorischen
Zelloberflächenmoleküle CD80 (A) und CD86 (C) sowie des DC-Aktivierungsmarkers CD83 (B). Komponenten in Klammern wurden zusammen an einen Silika-Trägerparti- kel gekoppelt.
Fig. 13 Aktivierung von DCs unter Verwendung von Gemischen unterschiedlich beladener Trägerpartikel anhand der Expression der kostimulatorischen Zelloberflächenmoleküle
CD80, CD86, CD40 und HLA-DR sowie des DC-Aktivierungsmarkers CD83. Komponenten in Klammern wurden zusammen an einen Trägerpartikel gekoppelt. TNF-α, IL- 1-ß und IL-6 ist ein inflammatorischer Zytokin-Cocktail als Positiv-Kontrolle.
Fig. 14 Differentielle biologische Effekte bei der Induktion von T-Zellen und Zusammenwirken des Helfer-T-Zell-Epitops PADRE und des Immunmodulators P2C bei der Proliferation und Differenzierung von naiven T-Zellen durch mit Mikro-/Nanopartikel-Vakzinen aktivierte DCs. TNF, IL-4 und IL-6 ist ein inflammatorischer Zytokin-Cocktail als Positiv-Kontrolle (oben: Anteil gebildeter Gedächtnis-T-Zellen, unten: Proliferationsrate).
Fig. 15 Differentielle biologische Effekte bei der Induktion von T-Zellen und Zusammenwirken des Helfer-T-Zell-Epitops PADRE und des Immunmodulators P2C bei der Proliferation von Gedächtnis-T-Zellen durch mit Mikro-/Nanopartikel-Vakzinen aktivierte DCs. TNF, IL-4 und IL-6 ist ein inflammatorischer Zytokin-Cocktail als Positiv-Kontrolle (Proliferationsrate).
Fig. 16 Induktion Antigen-spezifischer T-Zellreaktionen durch verschiedene Kombinationen der Vakzinkomponenten auf Silika-Partikeln am Beispiel des CMV-Epitops
NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6), nachgewiesen anhand der rekombinanten tetrameri- sierten MHC-Peptidkomplexe.
Fig. 17 Induktion Antigen-spezifischer T-Zellreaktionen durch verschiedene Kombinationen der Vakzinkomponenten auf Silika-Partikeln am Beispiel des Influenza-Epitops GILGFVFTL, nachgewiesen anhand der rekombinanten tetramerisierten MHC-Peptidkomplexe. Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin sowie dessen Anwendung. Dieses vakzin umfasst ein Mikro- oder Nanopartikel, an das immunologisch aktive Komponenten gekoppelt sind. Das Vakzin kann auch sowohl ein Mikro- als auch ein Nanopartikel aufweisen, an das immunologisch aktive Komponenten gekoppelt sind. In einigen Ausführungsformen handelt es sich bei dem Vakzin um ein Nanopartikel, an das drei im Folgenden näher definierte Grundkomponenten gekoppelt sind. Typischerweise weist da Vakzin eine Mehrzahl an Mikro- und/oder Nanopartikeln, an das immunologisch aktive Komponenten gekoppelt sind. Der Begriff „Mikropartikel" wie hier verwendet bezeichnet jedes Partikel, das in einer oder mehr Dimensionen eine Ausdehnung von etwa 5000 nm oder weniger hat, wie beispielsweise eine Ausdehnung, z.B. einen Durchmesser, im Bereich von etwa 500 nm bis etwa 3000 nm, im Bereich von etwa 500 nm bis etwa 2000 nm, im Bereich von etwa 500 nm bis etwa 1000 nm, im Bereich von etwa 700 nm bis etwa 1500 nm, im Bereich von etwa 500 nm bis etwa 800 nm oder im Bereich von etwa 600 nm bis etwa 900 nm. Der Begriff „Nanopartikel" wie hier verwendet bezeichnet jedes Partikel mit einer Ausdehnung in einer oder mehr Dimensionen, z.B. einen Durchmesser, von etwa 500 nm oder weniger, wie von etwa 400 nm oder weniger, von etwa 300 nm oder weniger, beispielsweise im Bereich von etwa 1 nm bis etwa 500 nm, von etwa 5 nm bis etwa 450 nm, von etwa 1 nm bis etwa 250 nm oder von etwa 10 nm bis etwa 150 nm. Ein solches Mikro- und ein solches Nanopartikel ist geeignet dimensioniert, um zu Haarfolikeln transportiert werden zu können (s.u.).
Ein Partikel, das in einem Vakzin gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten ist, weist typischerweise in einer oder mehr Dimensionen eine Ausdehnung von etwa 5000 nm oder weniger hat, wie beispielsweise eine Ausdehnung, z.B. einen Durchmesser, von etwa 3000 nm oder weniger, einen Durchmesser von etwa 1000 nm, einen Durchmesser von etwa 700 nm oder weniger, von etwa 500 nm oder weniger, von etwa 250 nm oder weniger, etwa 100 nm oder weniger, etwa 80 nm oder weniger, etwa 60 nm oder weniger, etwa 50 nm oder weniger, etwa 35 nm oder weniger oder etwa 35 nm oder weniger. Beispielsweise kann ein Mikro- oder Nanopartikel eine maximale Ausdehnung im Bereich von etwa 1 nm bis etwa 1000 nm haben wie etwa 1 nm bis etwa 500 nm oder etwa 1 nm bis etwa 100 nm. Zu Beispielen von Nanopartikeln zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, ein Nanokristall, eine Nanosphäre, ein Nanostab, eine Nanoschale (engl. Nanocup) oder ein Nanofilament wie eine Nanoröhre oder ein Nanodraht. Typischerweise ist ein Nanopartikel, ebenso wie ein Mikropartikel gemäß der Erfindung ein anorganisches Partikel. Ein Mikro- und/oder Nanopartikel kann jedes geeignete Material enthalten - oder daraus bestehen - wie z.B. Kohlenstoff, ein Halbmetall wie Bor, Germanium oder Silizium, oder ein Metall wie Gold, Silber oder Kupfer, inklusive einer Legierung daraus oder ein Polymer.
Ein entsprechendes Mikro- und/oder Nanopartikel kann von beliebiger Oberflächenbeschaffenheit sein. Beispielsweise kann ein Mikro- und/oder Nanopartikel eine polare oder eine unpolare Oberfläche aufweisen und somit hydrophil oder hydrophob sein. Hydrophobes Material ist wasserabweisend bzw. zeigt die Tendenz, sich von Wasser zu trennen. Typischerweise hat hydrophobes Material eine gleichmässige Elektronendichteverteilung. Hydrophobes Material enthält demgegenüber Moleküle oder Bereiche, die mit Wassermolekülen Dipol- Dipol-Wechselwirkungen eingehen können und die somit eine hohe Benetzbarkeit für Wasser haben.
Eine Verwendung oder ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, das auf dem Einsatz der Mikro- und/oder Nanopartikel basiert, kann an jedem Subjekt, wie z.B. an einem Säugetier erfolgen bzw. durchgeführt werden. Zu Beispielen eines geeigneten Säugetiers zählen, ohne darauf beschränkt zu sein, eine Maus, ein Kaninchen, eine Ratte, ein Meerschweinchen, ein Hamster, ein Hund, eine Kuh, ein Schwein, eine Ziege, ein Schaf, ein Pferd, ein Rhesusaffe, ein Schimpanze, ein Gorilla oder ein Mensch. Eine Verwendung oder ein Verfahren nach der Erfindung adressiert direkt die Sensorzellen eines der wichtigsten Organe des Immunsystems, nämlich die DCs der Haut einschließlich der Langerhans-Zellen.
DCs haben in ihrer Rolle als Vermittler der Immunität zwei zeitlich voneinander klar abgrenz- bare Schlüsselfunktionen. Als unreife Zellen sind sie zuständig für die Aufnahme und Verarbeitung von Antigenen. Nur wenig später nach der Aktivierung sorgen sie dann als reife Zellen für die Stimulierung hauptsächlich von T-Zellen und indirekt über die T-Zellen auch von B-Zellen, indem sie diesen das prozessierte Antigen in Form von MHC-Peptid-Komplexen, zusammen mit kostimulierenden Molekülen, an ihrer Oberfläche präsentieren und gleichzeitig Zytokine freisetzen, welche die Immunantworten unterstützen und stabilisieren. Gleichsam als Wachposten und Alarmgeber des Immunsystems üben sie somit eine übergeordnete Kontrollfunktion über die eigentlichen Akteure der zellulären Immunantwort aus. Hierbei ist nur eine DC notwendig, um 100 bis 3.000 Antigen-spezifische T-Zellen zu aktivieren.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, Immunantworten zu induzieren, zu verstärken sowie ein immunolo- gisches Gedächtnis aufzubauen, sind die DCs ein wichtiges zelluläres Hilfsmittel für die Immuntherapie geworden. Durch neue Ansätze für die vollständige Aktivierung und Differenzierung dieser immunkompetenten Zellen kann die Effizienz prophylaktischer und therapeutischer Vakzine entscheidend erhöht werden, da nur gereifte DCs eine spezifische T- Zell-basierte zytotoxische Immunantwort sowie die Expression proinflammatorischer Zytokine auslösen können. Gleichzeitig sind reife DCs in der Lage, die Wirkung durch Tumore gebildeter immunsuppressiver Faktoren aufzuheben.
Eine spezielle Form der DCs sind die Langerhans-Zellen. Es handelt sich hierbei um noch inaktive antigenpräsentierende Zellen, die in der Epidermis der Haut ein durchgängiges Netzwerk bilden. Nach Kontakt mit dem Antigen erfolgt ihre Aktivierung und Differenzierung zu reifen DCs, die die Antigene in die regionären Lymphknoten transportieren und dort an die T-Lymphozyten präsentieren.
Vor diesem Hintergrund sind die DCs der Haut ideale Zielstrukturen für eine topische Vakzinierung. Als Eintrittspforte für die topischen Vakzine ist der Haarfollikel besonders gut geeignet, da die Epidermis in diesem Bereich mit einem besonders dichten Netz immunkompetenter Zellen durchzogen ist, das der Überwachung und Abwehr von durch die im Haarfollikel nicht geschlossene Hautbarriere eindringenden Fremdstoffe dient.
Mit den üblichen Verfahren zur topischen Vakzinierung ist es bisher jedoch nicht gelungen, diese Strukturen für die Überwindung der Hautbarriere zu nutzen. Alle bisher bekannten Verfahren basieren auf einer Penetration der Wirkstoffe direkt durch die Hornschicht der Haut oder auf der Penetration von mikro- oder nanoskaligen partikulären Antigenen direkt in die DCs der Haut, in den meisten Fällen nach chemischer oder physikalischer Vorschädigung oder Quellung der Haut. Für solide Partikel konnte zwar eine Penetration in die Haarfollikel nachgewiesen werden. Für den Durchtritt in den Bereich der lebenden Zellen ergaben sich jedoch keine Hinweise (Lademann et al. 2009).
Um so überraschender ist es, dass es mit dem System der erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine erstmals gelungen ist, Träger-gebundene Wirkstoffe durch gezielte Ausnutzung eines natürlichen Transportmechanismus in den Haarfollikel und damit in die tieferen Schichten der Epidermis, wie z.B. das Stratum spinosum, zu befördern. In dieser Hinsicht sind die Mikro- und/oder Nanopartikel eines Vakzins der vorliegenden Erfindung typischwerweise so konfiguriert, dass es nach Verabreichen durch Auftragen auf die Hautoberfläche zugelassen werden kann, dass die Nanopartikel in die Haarfolikel transportiert werden. An die Mikro- und/oder Nanopartikel gekoppelte Bestandteile des Vakzins erreichen somit ebenfalls den Haarfollikel. Ferner kann in Ausführungsformen der Erfindung zugelassen werden, dass die Mikro- und/oder Nanopartikel für einen bestimmten Zeitraum im Haarfollikel verbleiben (s.u.).
In dieser Region befindet sich die höchste Dichte an immunkompetenten Zellen der Haut, sodass die Vakzinkomponenten in unmittelbare Nähe zu den Zielstrukturen gelangen und nach Ablösung vom Trägerpartikel nur ein kurzes Stück diffundieren müssen. Den Trägerpartikeln kommt dabei typischerweise eine vierfache Funktion zu. Erstens ermöglichen sie als Vektoren für eine effiziente Zielfindung der Vakzine den aktiven Transport in die Haarfollikel unter Nutzung eines biomimetischen Prinzips. Zweitens organisieren sie als multifunktionale Träger die molekularen Einzelkomponenten der Vakzine in hoch-wirksamer räumlicher Nähe zueinander. Drittens fungieren sie nach erfolgtem Transport als Modulatoren der gezielten Freisetzung der Vakzin-komponenten. Viertens verstärken sie durch die multivalente Organisation der Vakzinkomponenten deren Wirkung. Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, konnte in den Untersuchungen überraschend gefunden werden, dass durch die Bewegung des Haares im Haarfollikel eine Art Pumpmechanismus in Gang gesetzt wird, der den Transport von Partikeln in den Haarfollikel bewirkt. Es wird angenommen, dass für diesen rein mechanischen Effekt die partikuläre Struktur der Trägermaterialien sowie das Einmassieren essentiell sind. Der Transportmechanismus ist umso effektiver, je besser die Partikelgröße und die Schuppendichte des Haares aufeinander abgestimmt sind. Es wird angenommen, dass die Struktur und die Oberflächenbeschaffenheit der Partikel einen geringeren Einfluss haben.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festzulegen, wird angenommen, das zum Erreichen einer immunologisch relevanten Tiefe in den Haarfolikel insbesondere die Dimension des/der Mikro-/Nanopartikel bedeutend ist/sind. Es konnte gezeigt werden, dass ein oder mehrere Partikel, insbesondere ein oder mehrere sphärische(s) Partikel, in einem Größenbereich von 100 nm - 3.000 nm, beispielsweise 300 nm - 1.500 nm (supra), besonders gut geeignet ist/sind, um die verschiedenen Vakzinkomponenten durch den beschriebenen Pumpmechanismus an die optimale Position im Haarfollikel zu transportieren, wobei die Penetrationstiefe über die Partikelgröße eingestellt werden kann (Fig. 7). Bereits nach 1 h ist das Infundibulum in 600 μητι Tiefe erreicht, wo sich beim menschlichen Terminalhaar die höchste Dichte an DCs der Haut befindet. Eine weitere Penetration innerhalb der folgenden 24 h ist unwesentlich für den Vakzinierungserfolg.
Außerdem konnte überraschend gefunden werden, dass zusätzlich zu dem Transport in den Haarfollikel eine Langzeitspeicherung der Trägerpartikel erfolgt (Fig. 8). Erst nach einem Zeitintervall von ca. 5 - 10 Tagen werden die Trägerpartikel typischerweise durch Sebumsekretion und Haarwuchs wieder aus dem Haarfollikel heraustransportiert, während die im Stratum corneum liegenden Partikel durch die kontinuierliche Abschilferung der Hornzellen relativ schnell wieder abgestoßen werden. Dies ermöglicht die Entwicklung retardierender topischer Formulierungen. Gleichzeitig ist über natürliche Prozesse garantiert, dass die Trägerpartikel wieder aus dem Haarfollikel heraustransportiert werden.
Die Möglichkeit einer transfollikulären Penetration der Partikel durch die Barriere des Haarfollikels in den Bereich der lebenden Zellen ist nicht auszuschließen, konnten aber bisher nicht nachgewiesen werden. Ein solcher Übergang wurde nur nach Vorschädigung der Hautstruktur, beispielsweise durch Cyanacrylat-Abriss und für Partikelgrößen unterhalb 50 nm beobachtet. Lediglich die freigesetzten Wirkstoffe diffundieren in das Körpergewebe, wo sie die DCs als Zielstrukturen erreichen und eine spezifische Immunantwort auslösen.
Für die effektive Beladung der Trägerpartikel mit den Vakzinkomponenten, deren stabile Bindung und sicheren Transport in den Haarfollikel sowie die gezielte Freisetzung der weiterhin uneingeschränkt wirksamen Wirkstoffe an den Zielstrukturen, kann ein reversibler Kopplungsmechanismus auf der Basis physikalischer oder chemischer Wechselwirkungen genutzt werden.
In einigen Ausführungsformen kann hierbei eine reversible Adsorption auf der Grundlage von elektrostatischer Wechselwirkungen, van-der Waals-Bindungen, hydrophoben Wechselwirkungen und/oder Wasserstoffbrückenbindungen erfolgen. Beispielsweise kann zwischen einer polarisierten Oberfläche von Trägerpartikeln und geladenen Bereichen der Vakzinkomponenten eine Wechselwirkung eintreten, die zur Adsorption führt. Falls erforderlich, lassen sich Bereiche mit negativer oder positiver Nettoladung in Vakzinkomponenten in Form von einem oder mehreren zusätzlichen molekularen Anhängseln, sogenannten Tags, einfügen.
Als Triggerung für die Freisetzung der Vakzinkomponenten am Zielort kann vorteilhafterweise der pH-Shift innerhalb des Haarfollikels genutzt werden. Es wurden Partikel konstruiert, deren Oberflächenpotential (ζ-Potential) sich in Abhängigkeit vom pH-Wert in der Weise ändert, dass die Vakzinkomponenten während der Beladung und des Transports stabil an den Trägerpartikel binden und unter den physiologischen Bedingungen in den Haarfollikeln wieder desorbieren.
Dazu wurden in exemplarischen Ausführungsformen Partikel im Layer-by-Layer (LBL) Verfahren beschichtet. Die LBL®-Technologie nutzt die elektrostatische Wechselwirkung zwischen geladenen Polymeren (Polyelektrolyten) und Oberflächen. Durch Adsorption von einem oder mehreren Polymeren an entgegengesetzt geladenen Partikeloberflächen, in der vorliegenden Erfindung beispielsweise an Silika-Partikeln mit negativem Oberflächenpotential, findet eine Umladung der Partikel statt, wodurch sich die abgeschiedene Polymermenge von selbst auf eine Dicke von etwa 2 - 7 nm einreguliert. Für eine zweite Schicht lässt sich der Vorgang entsprechend mit einem entgegengesetzt geladenen Polymer wiederholen. Auf diese Weise lassen sich beliebig viele Schichten auf Substraten aufbauen.
Es kann jedes biologisch verträgliche Polymer eingesetzt werden. Für die gegebene Anwendung haben sich als kationische Polymere Poly(allylaminhydrochlorid) (PAH), Poly(diallyl- dimethylammoniumchlorid) (PDA) und Poly(acryloyloxyethyltrimethylammoniumchlorid) (PAOET) sowie als anionische Polymere die Natriumsalze von Poly(vinylsulfat) (PVS), Sulfoethylcellulose und Polystyrolsulfonat (PSS) als besonders geeignet erwiesen.
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können LBL®-Oberflächen mit 2 bis 20 Schichten eingesetzt werden, wobei für mindestens die äußerste Schicht ein schwaches Polyanion- bzw. Polykation verwendet wird, welches seine Ladung in Abhängigkeit vom pH- Wert ändert, wie z.B. Chitosan, Polyvinylpyridin, Polyvinylcarbazol, Polyacrylat (RAA) oder Polymethacrylat (PMAA). Auch natürliche Proteine sind in Abhängigkeit von ihrem isoelektrischen Punkt als pH-schaltbare Materialien geeignet.
Für die Polarisation der Vakzinkomponenten können diese mit einem Tag, d.h. einem Anhäng- sei, versehen werden, das geladene Molekülbereiche wie etwa Aminosäuren aufweist. Aminosäuren sind als organische Moleküle bekannt, die eine Carbonsäuregruppe (Carboxylgruppe) und eine Aminogruppe aufweisen, typischerweise a- oder ß-Aminosäuren. Beispielsweise kann ein Anhängsel etwa zwei bis 20, etwa drei bis 15 oder etwa 4 - 10 geladene a-Amino- säuren aufweisen oder aus solchen Aminosäuren aufgebaut sein. Es lassen sich beliebige Aminosäuren einsetzen, inklusive natürlich vorkommenden Aminosäuren und Isomeren davon. Ein Anhängsel, das unter physiologischen Bedingungen über eine positive oder negative Ladung verfügt, wird im Folgenden auch als Ladungs-Tag bezeichnet. In einigen Ausführungsformen ist ein solches Anhängsel über ein Peptidsegment mit einer Länge bis zu etwa 8 Aminosäuren, z.B. 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren, an eine Vakzinkomponente gekoppelt. Ein entsprechendes Peptidsegment kann auch als Spacer bezeichnet werden. Ein solcher Ladungs-Tag enthält eine oder mehrere Aminosäuren, die eine Seitenkette aufweisen, die unter physiologischen Bedingungen über eine positive oder negative Gesamtladung verfügen oder besteht aus solchen Aminosäuren. Eine chemische Gruppe oder eine Aminosäure mit einer positiven Gesamtladung unter physiologischen Bedingungen wird auch als basische Gruppe bzw. Aminosäure bezeichnet. Eine chemische Gruppe oder eine Aminosäure mit einer negativen Gesamtladung wird auch als saure Gruppe bzw. Aminosäure bezeichnet.
In einigen Ausführungsformen können die basischen Aminosäuren Lysin-, 5-Hydroxy-Lysin, Pyrrolysin, Hypusine( N6-(4-Amino-2-hydroxybutyl)-lysin), Histidin, Ornithin und/oder Arginin als unter physiologischen Bedingungen positiv geladene Aminosäuren eingesetzt werden. Die Gegenwart solcher Aminosäure-Einheiten können für eine positive Polarisation dienen. Glutaminsäure- Asparaginsäure- oder Sulfotyrosin-Einheiten sind illustrative Beispiele für Aminosäuren, die für eine negative Polarisation zum Einsatz kommen können. Sie können gewährleisten, dass sich die Vakzinkomponenten in Analogie zu den Polymeren an den entgegengesetzt geladenen Partikeln anlagern und bei pH-bedingter Umladung der Partikeloberfläche wieder desorbiert werden. Die Länge und Zusammensetzung der Ladungs-Tags sowie ein gegebenenfalls einzufügender Spacer müssen individuell auf die jeweilige Vakzinkomponente zugeschnitten werden, da diese Moleküle sterisch behindert sein oder weitere Wechselwirkungen, wie z.B. Wasserstoffbrückenbindungen oder hydrophobe Wechselwirkungen, mit den Polymeroberflächen einge- hen können. Zudem sind die Kapazität und die Effektivität des Beladungsvorganges sowie die Ablösekinetik durch Modifikation der Ladungs-Tags individuell einstellbar.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung haben sich (PAH/PSS)2PAH/PMAA-beschichtete Silika-Partikel als besonders geeignet erwiesen. Während die Beladung der LBL®-Partikel in einigen Ausführungsformen unter basischen Bedingungen stattfindet, erfolgt die Desorption der Vakzinkomponenten in solchen Ausführungsformen typischerweise nach dem Transport- prozess im sauren Milieu des Haarfollikels und umgekehrt. Durch die erhöhte Wasserstoffionen-Konzentration kommt es unterhalb von etwa pH 7 zur Protonierung der PMAA~- Gruppen, wodurch sich die äußere LBL®-Schicht entlädt bzw. durch die darunter gelegene PAH-Schicht wieder kationisch auflädt. Das führt zur Abstoßung der positiv polarisierten Vakzinkomponenten von der Partikeloberfläche (Fig. 1 ). Einen zusätzlichen positiven Effekt auf die Freisetzung der Vakzine hat die erhöhte Salzkonzentration im Haarfollikel.
Mit diesem Verfahren ließen sich typischerweise zwischen 20 [ig und 150 pg der einzelnen, mit entsprechenden Oligoaminosäure-Tags modifizierten Vakzinkomponenten pro 1 mg von Silika-Trägerpartikeln adsorbieren. Mit der zugegebenen Menge, der Adsorptionszeit, der Tag- Länge sowie der Tag-Struktur kann die Beladung für jede Vakzinkomponente individuell eingestellt werden. Dadurch ist die stöchiometrische Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins entsprechend der individuellen medizinischen Indikation, der Applikationsform und des Wirkungsgrades der Vakzinkomponenten einstellbar (Ausführungsbeispiel B).
Neben der sortenreinen Beladung konnten für das erfindungsgemäße Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin auch die gleichzeitige Beladung eines Trägerpartikels mit verschiedenen, unterschiedlich wechselwirkenden Vakzinkomponenten in einem definierten molaren Verhältnis, sowie deren simultane und gleichmäßige Freisetzung am Wirkort, am Beispiel einiger Wirkstoffkombinationen realisiert werden.
Somit konnte mit den in den Ausführungsbeispielen beispielhaft beschriebenen LBL®- Partikeln ein System gefunden werden, welches die stabile, effektive und gleichmäßige Adsorption der Vakzinkomponenten sowie deren gleichmäßige Freisetzung im Haarfollikel ermöglicht. Insbesondere die Ausbeuten der im Haarfollikel freigesetzten Wirkstoffe in der Größenordnung von 30 - 90% der adsorbierten Menge, liegen in einer für die Vakzinierung ausreichenden Größenordnung. Unerwünschte Aggregationseffekte konnten durch entspre- chende Beladungsverfahren, die Auswahl der Beschichtungsmaterialien sowie die Reihenfolge der Polymerschichten verhindert werden.
Durch die direkte Adressierung der immunkompetenten Zellen der Haut mit der Möglichkeit, zusätzlich zur Antikörper-vermittelten Immunität eine T-Zell-vermittelte Immunität zu induzieren, kann die Zusammensetzung der erfindungsgemäßen, typischerweise topischen, Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins auf ein Mindestmaß an Komponenten und geringste Mengen an Wirkstoffen beschränkt werden.
Für die in den Ausführungsbeipielen angeführten exemplarischen Untersuchungen wurde ein synthetisches Minimalvakzin eingesetzt, das zur Adressierung verschiedener synergistisch wirkender Targets, aus den folgenden essentiellen Grundkomponenten besteht:
(i) Epitop für zytotoxische Effektor-T-Zellen (CTL),
(ii) Epitop für Helfer-T-Zellen, beispielsweise ein Pan-DR-Epitop und
(iii) bakterielles Lipopeptid als Immunmodulator.
Allgemein kann ein Vakzine gemäß der vorliegenden Erfindung sind diese Komponenten entsprechend der medizinischen Indikation austausch- und in beliebigem Verhältnis kombinierbar. Anstatt einzelner Epitope könnten beliebige Antigen-Determinanten für T-Zellen, wie z.B. mehrere Peptide, Polyepitope, Biopolymere oder auch andere Träger antigener Information, wie eine Nukleinsäure, z.B. DNA oder RNA, ein Lipid und/oder ein Oligo- oder Polysaccharid, eingesetzt werden. Der Begriff „Antigen-Determinante" bezeichnet eine oder mehrere Bereiche eines Antigens oder Haptens, die von einem Immunglobulin, einem T-Zell- Rezeptor oder einem Bindungsreagenz wie z.B. einem Lipocalinmutein gebunden werden kann. Eine Antigen-Determinante weist mindestens ein Epitop auf (s.u.). Die Antigen- Determinanten für CTL-Epitope werden entsprechend der gewünschten Immunisierung ausgewählt. Das Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E ist universell für alle HLA-DR-Allotypen, muss jedoch artspezifisch angepasst werden. Es kann vorteilhaft sein, wenn ein Vakzin eine Mehrzahl an Antigen-Determinanten / Epitopen enthält, um einen ausreichenden Impfschutz in einer immungenetisch heterogenen Population erreichen zu können.
Der Begriff „Nukleinsäure" betrifft, wenn hier verwendet, jedwede Nukleinsäure in jeder möglichen Konfiguratio, wie z.B. einzelsträngig, doppelsträngig oder eine Kombination daraus. Zu Nukleinsäuern zählen DNA-Moleküle, z.B. genomische DNA oder cDNA, RNA- Moleküle wie z.B. mRNA, Analoga von DNA oder RNA, die mittels Nukleotidanaloga oder durch chemische Nukleinsäuresynthese hergestellt sind, sowie z.B. PNA (engl, protein nucleic acid). Eine Nukleinsäure kann natürlich nicht vorkommende Nukleotidanaloga enthalten oder an eine Affinitätsanhängsel („Tag") oder Label gekoppelt sein. Zahlreiche Nukleotidanaloga, die enthalten sein können, sind dem Fachmann bekannt. Ein Nukleotidanalogon ist ein Nukleotid, das eine Modifikation an beispielsweise der Basen-, der Zucker- und/oder der Phosphatgruppe aufweist. Zur Veranschaulichung sei als Beispiel genannt, dass bekanntermaßen eine Substitution von 2'-OH-Resten von siRNA mit 2'F-, 2'O-Me- oder 2'H-Resten die in wVo-Stabilität der betreffenden RNA erhöht. Zu Modifikationen an der Basengruppe zählen natürliche und synthetische Modifikationen von A, C, G und T/U, verschieden Purin- oder Pyrimidinbasen wie Uracil-5-yl, Hypoxanthin-9-yl, und 2-Aminoadenin-9-yl, sowie Nicht-Purin- oder Nicht-Purin-Basen. Andere Nukleotidanaloga dienen als universelle Basen. Zu universellen Basen zählen beispielsweise 3-Nitropyrrol und 5-Nitroindol. Universelle Basen sind in der Lage, mit jeder Base ein Basenpaar zu bilden. Oft können Basenmodifikationen mit beispielsweise einer Zuckermodifikation, z.B. 2 -O-methoxyethyl, kombiniert werden, beispielsweise um einzigartige Eigenschaften wie eine verbesserte Duplexstabilität zu erreichen.
Die dritte Grundkomponente eines Vakzins der vorliegenden Erfindung ist ein Immunmodulator, d.h. eine Verbindung, die die Immunantwort eines Subjekts aktiviert oder bremst bzw. hemmt. Ein Beispiel für einen Immunmodulator ist Immunstimulator-Lipopolysaccharid (LPS). Ein anderes Beispiel für einen Immunmodulator ist ein kationisches Lipid und Lipid-Protamin- DNA, die in U.S. 7,303,881 offenbart ist. Ein weiteres Beispiel für einen Immunmodulator ist ein synthetisches bakterielles Lipopeptid. Lipopeptide sind Bestandteil der bakteriellen Zellwand und werden durch die Toll-Like-Rezeptoren TLR 1 , 2, 6 und 10 der dendritischen und anderer immunkompetenter Zellen erkannt. Über eine biochemische Signalkaskade wird in den TLR-Trägerzellen ein entsprechender intrazellulärer Mechanismus, meist die Expression bestimmter, der Antigen-spezifischen Abwehr von Krankheitserregern dienender Gene, ausgelöst, der zur Differenzierung Erreger-spezifischer T-Zellen führt. Infolgedessen wird in der ersten Stufe der Infektionsabwehr die unspezifische Immunantwort initiiert, der im weiteren Verlauf die Reaktion durch das erworbene Immunsystem, mit der Bildung spezifischer Antikörper, folgt. Beispiele für ein synthetisches Analogon eines bakteriellen Lipopeptids mit immunstimulatorischer Wirkung sind z.B. in der deutschen Patentanmeldung DE 102009034779 A1 offenbart.
Der Einsatz des Lipopeptid-Immunmodulators kann besonders vorteilhaft sein, da mit einem erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin speziell die DCs der Haut adressiert werden, die über eine hohe Dichte aller TLR und in ihrer Wächterfunktion für die Entrittspforte Haut über besonders effektive Mechanismen als erste Abwehrkette des angeborenen Immunsystems verfügen. Zudem sind die TLR für die Lipopeptide auf den Oberflächen der Zellen exprimiert sodass die Lipopeptide direkt, ggf. auch partikelgebunden auf die Zellen wirken können, ohne vorher aufgenommen zu werden.
Ein weiteres Beispiel eines Immunmodulators ist Murabutid (N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D- glutamin-alpha-n-butyl-ester), ein Derivat des bakteriellen Muramyldipeptids. Zwei illustrative und gut bekannte Beispiele für Immunmodulatoren, bei denen es sich um Immunsuppresso- ren handelt, sind Cyclosporin und Methotrexat. Zwei weitere hemmender Immunmodulatoren sind 4-(3-Chlorophenyl)-N-(4-(trifluoromethyl)phenyl)pyrimidin-2-amin (VAF347) und Fingoli- mod (ΠΎ720, 2-Amino-2-(2-(4-octylphenyl)ethyl)propan-1 ,3-diol).
Durch die direkte Kopplung der Antigen-spezifischen Vakzinkomponenten mit dem immunmo- dulatorisch wirksamen Adjuvans, lässt sich eine hochgradig fokussierte Aufhebung des konditioniert immunsuppressiven Zustandes der Haut und damit eine deutliche Steigerung der durch das erfindungsgemäße Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin induzierten T-Zell-basier- ten, spezifischen Immunantwort, erzielen. Dadurch wird die Möglichkeit immunologischer Nebenwirkungen weiter minimiert.
In einigen Ausführungsformen weist ein Lipopeptid-Immunmodulator gemäß der vorliegenden Erfindung folgende allgemeine Struktur (I) auf:
R1-0— CH2
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In der Strukturformel (I)
stehen R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit etwa 6 bis 28 C-Atomen oder etwa 7 bis etwa 25, wie z.B. 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 C-Atomen, beispielsweise für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen,
steht R3 für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit etwa 6 bis 28 C-Atomen oder etwa 7 bis etwa 25, wie z.B. 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 C-Atomen, beispielsweise für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen, oder H und steht R4 für ein aus 1 bis 25 Aminosäure-Resten, wie z.B. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16. 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23 oder 24 Aminosäure-Resten bestehendes, physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid, beispielsweise mit der Aminosäuresequenz GDPKHPKSF (SEQ ID NO: 1 ). Der Begriff
„behandelte Spezies" betrifft die Spezies, der das Subjekt angehört, das behandelt wird oder zu behandeln beabsichtigt ist, In diesem Zusammenhang ist auch der Einsatz anderer bekannter Adjuvantien, wie z.B. Squalen oder Aluminiumoxid, nicht ausgeschlossen.
Die Induktion der gewünschten immunologischen Reaktion ist grundsätzlich von der gleichzeitigen Gabe aller drei Komponenten abhängig, die jedoch je nach Situation und Antigen auf demselben oder verschiedenen Trägerpartikeln gekoppelt sein sollten (Ausführungsbeispiel D). In letzteren Fall besteht das Vakzin der Erfindung aus einer Mehrzahl an Mikro-/Nanoparti- keln.
Zur gleichzeitigen Beladung eines Trägerpartikels mit mehreren Vakzinkomponenten kann jede Komponente über einen eigenen Ladungs-Tag an der polarisierten Partikeloberfläche gebunden werden (Fig. 4).
In einigen Ausführungsformen, beispielsweise wo peptidische Vakzinkomponenten vorliegen, sind zwei oder mehr Vakzinkomponenten durch eine kovalente Verknüpfung zu Konjugaten verbunden. Beispiele solcher Konjugate sind die folgenden allgemeinen Strukturen (II), (III) oder (IV).
Lipopeptid O R5— Tag R6
Figure imgf000024_0001
(Ii)
T-Zell-Epitop,
Figure imgf000025_0001
T-Zell-Epitop,
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In diesen Strukturformeln steht n jeweils für eine natürliche Zahl von 0 bis 8, beispielsweise 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7. R1 , R2, R3, R4, R5 und R6 sind molekulaer Einheiten, die gleich oder verschieden sein können. Typischerweise sind R1 , R2, R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander ausgewählte Peptidbereiche mit Aminosäuresequenzen, die eine Länge von 0 bis etwa 8 Aminosäuren aufweisen, wie etwa 1 , 2, 3, 4, 5, 6 oder 7 Aminosäuren. Jeder derartige Peptidbereich kann als molekularer Abstandhalter dienen und kann dementsprechend als Aminosäure-Spacer bezeichnet werden. T-Zell-Epitt^ und T-Zell-Epitop2 stehen für eine Aminosäure-Sequenz eines Epitops für zytotoxische Effektor-T-Zellen oder eines Epitops für Helfer-T-Zellen. T-Zell-Epitopi und T-Zell-Epitop2 können gleich oder verschieden sein.
Ein„Epitop" ist antigenisch und kann somit als eine„antigenische Struktur" oder eine„antigenische Determinante" definierend aufgefasst werden. Immunglobuline und T-Zell-Rezeptoren können ein Epitop erkennen und binden. Ein Epitop ist auch ein Bereich eines Antigens, an das ein Immunglobulin, ein T-Zell-Rezeptor oder ein Bindungsreagenz wie z.B. ein Lipocalin- mutein binden kann. Ein Epitop ist ein Bereich eines Moleküls, der linear sein kann, d.h. eine Aminosäuresequenz enthält beispielsweise, in linear zusammenhängender Form, das vom Imunglobulin oder T- Zell-Rezeptor erkannte Epitop auf. Ein lineares Epitop enthält im Allgemeinen wenigstens drei, und typischerweise wenigstens etwa 5, z.B. 8 bis 10 Aminosäuren. Ein Epitop kann auch ein konformationsabhängiges Epitop sein, bei dem im Gegensatz zu einem linearen Epitop die primäre Aminosäuresequenz nicht die einzige Komponente des erkannten Epitops darstellt, da sie beispielsweise nicht als solche von einem Immunglobulin oder T-Zell-Rezeptor erkannt werden kann. Ein Immunglobulin, ein T-Zell-Rezeptor oder ein Bindungsreagenz wie z.B. ein Lipocalinmutein erkennen bei einem konformationsabhängigen Epitop eine dreidimensionale Struktur des Antigens. Ein konformationsabhängiges Epitop enthält typischerweise eine größere Anzahl an Aminosäuren als ein lineares Epitop. Ein konformationsabhängiges Epitop lässt sich beispielsweise durch Röntgenstrukturanalyse, zweidimensionale NMR-Spektroskopie, Site-directed Spin Labeling und Elektronen-Paramagnetische Resonanzspectroskopie bestimmt werden.
In den Strukturformeln (II) bis (IV) steht Lipopeptid für einen Immunmodulator gemäß Formel (I), Tag steht für eine Folge von 4 bis 12, wie z.B. 4 - 10, inklusive etwa 5, etwa 6, etwa 7, etwa 8 oder etwa 9 basischen (positive Ladung) oder sauren (negative Ladung) Aminosäuren.
Ein solches Konjugat wird dann, wie in Fig. 5 dargestellt, über den Ladungs-Tag an dem polarisierten Trägerpartikel immobilisiert.
Für welche Vakzine solche oder ähnliche Konjugate vorteilhaft sind, ist abhängig von der medizinischen Indikation sowie den enthaltenen Vakzinkomponenten und Antigen-Determi- nanten. In den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass sich die räumliche Nähe bestimmter Epitope in einigen Fällen vorteilhaft auf den Immunisierungserfolg auswirkt, in anderen Fällen aber keinen Einfluss hat.
Wie die Komponenten des Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins und dessen molare Verhältnisse, müssen auch die Form der Bindung an das Trägerpartikel (Ladungs-Tags, einzelne / gemischte Beladung) sowie die Art der Konjugation spezifisch eingestellt werden.
Ausgehend von diesen Untersuchungen konnte ein überraschend effektives System zur topischen Vakzinierung gefunden und gezeigt werden, dass die Vakzinkomponenten nach Applikation auf die Hautoberfläche mit Hilfe von mikro-/nanoskaligen Trägerpartikeln in einem aktiven Transportprozess und unter Nutzung eines biomimetischen Prinzips, in den Haarfolli- kel und somit in die unmittelbare Nähe der immunkompetenten Zellen der Haut gelangen, wo sie nach Diffusion zu den Zielstrukturen, den DCs der Haut, die gewünschte spezifischen T- zelluläre Immunantwort auslösen.
Dies überrascht um so mehr, als dass alle bisherigen topischen Impfstrategien von einer Notwendigkeit der direkten Penetration der Wirkstoffe durch die Haut ausgehen, teilweise sogar den Transport durch die Haarfollikel als möglichen Weg zur Überwindung der Hautbarriere explizit ausschließen.
Weiter konnte überraschend festgestellt werden, dass durch die unmittelbare Anwesenheit des Lipopeptid-Immunmodulators in räumlicher Nähe zu den anderen Vakzinkomponenten, eine deutliche Steigerung der T-Zell-basierten spezifischen Immunantwort erzielt werden konnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin, das sich zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Anwendung eignet. Das Vakzin besteht mindestens aus den Grundkomponenten
(i) eine oder mehrere Antigen-Determinanten für zytotoxische Effektor-T-Zellen
(CTL-Epitope, Polyepitope, Biopolymere, Proteine, DNA, RNA, Polysaccharide,
Glykolipide, Glykoproteine oder ähnliche Träger antigener Informationen),
(ii) eine oder mehrere Antigen-Determinanten für Helfer-T-Zellen, bevorzugt
Pan-DR-Epitope als degenerierte Peptide für alle HLA-DR-Allotypen, und
(iii) ein oder mehrere Immunmodulatoren zur Aktivierung der antigenpräsentierenden
DCs, bevorzugt synthetische Analoga bakterieller Lipopeptide,
als einzelne Moleküle oder Konjugate,
bei denen
(a) die Vakzinkomponenten durch einen Ladungs-Tag reversibel an mikro-/nanoskalige Trägerpartikel gekoppelt sind,
(b) die nach topischer Applikation auf die Hautoberfläche aktiv in den Haarfollikel
transportiert und dort temporär deponiert werden, bei denen
(c) die Vakzinkomponenten unter den dort herrschenden physiologischen Bedingungen gezielt freigesetzt werden und dann
(d) durch Diffusion zu den Zielstrukturen, den DCs in der Epidermis der Haut, gelangen, (e) wo sie eine T-Zell-basierte Vakzinantigen-spezifische Immunreaktion auslösen, sowie deren Verwendung für verschiedene medizinische Indikationen, wie beipielsweise zur prophylaktischen spezifischen Immunisierung gegen und/oder zur therapeutischen Vakzinierung bei Erkrankungen wie Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen und/oder entzündlichen und/oder allergischen Leiden, sowie zur Verstärkung der Immunantwort nach einer durch konventionelle Impfverfahren durchgeführten Vakzinierung in der Human- und Veterinärmedizin.
Das immunologische Potential der erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine wurde anhand von in vitro Experimenten mit Modellvakzinen, die die CTL-Epitope GILGFVFTL (SEQ ID NO: 5) aus dem Influenza-Matrixprotein M1 bzw. NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6) aus dem frühen Antigen pp65 des Zytomegalovirus CMV, das Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E (aK- L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C) sowie Pam2Cys-GDPKHPKSF als Immunmodulator enthielten, nachgewiesen (Ausführungsbeispiele C und D).
Im Einzelnen konnte in den weiterführenden Experimenten gezeigt werden, dass
(i) eine definiert einstellbare Beladung der Trägerpartikel und eine unter Beladungs-,
Lagerungs- und Transportbedingungen stabile Bindung der Vakzinkomponenten an der polarisierten Oberfläche der Partikel möglich ist;
(ii) ein zuverlässiger aktiver Transport der Vakzinkomponenten in den Haarfollikel bis
zu ca. 600 pm Tiefe erfolgt;
(iii) die Trägerpartikel für ca. 5 - 10 Tage in den Haarfollikeln deponiert und durch einen
natürlichen Reinigungsprozess wieder ausgeschieden werden;
(iv) eine gleichmäßige und simultane Freisetzung der Vakzinkomponenten in der gewünschten Tiefe der Follikelstruktur erfolgt;
(v) die freigesetzten Vakzinkomponenten zu den DCs der Haut (Langerhans-Zellen)
diffundieren und von diesen aufgenommen werden;
(vi) die freigesetzten Vakzinkomponenten weiterhin uneingeschränkt immunologisch
aktiv sind;
(vii) die Partikel-gebundenen Vakzinkomponenten der Modellvakzine bei humanen Effektor- T-Zellen eine spezifische T-Zell-vermittelte Immunantwort auslösen, die qualitativ und quantitativ vergleichbar zur Reaktion auf die ungebundenen Vakzinkomponenten ist und auch die Ladungs-Tags keinen nachteiligen Effekt auf die immunologische Wirksamkeit der Vakzinkomponenten haben;
(viii) die Lipopeptide zur Aktivierung der antigenpräsentierenden DCs führen, was eine
Steigerung der T-Zell-basierten spezifischen Immunantwort und eine deutliche Verstärkung des Vakzinierungseffektes hervorruft;
(ix) das Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E die T-Zellen und über die T-Zellen auch die DCs zusätzlich stimuliert;
(x) der Vorteil der räumlichen Nähe der Vakzinkomponenten, speziell deren Konjugation mit dem Lipopeptid, individuell von den verwendeten Antigen-Determinanten für CTL- Zellen abhängig ist;
(xi) die Kombination von Helfer-T-Zell-Epitop Pan-DR-E und Lipopeptid-Immunmodulator die Proliferation und Differenzierung von naiven T-Zellen verstärkt oder erst möglich macht.
Toxische Effekte oder Unverträglichkeiten der erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nano- partikel-Vakzine wurden bei den bisherigen in vitro und in vivo Tests in den relevanten Konzentrationsbereichen, sowie bei Zytotoxizitätstests an RKO-Zellen nicht beobachtet. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzinkomponenten sowie deren Modifizierung mit Ladungs-Tags (s.o.), wie in Ausführungsbeispiel A veranschaulicht.
Die Synthese der Epitope, wie auch der Ladungs-Tags, in einigen Ausführungsformen bestehend aus einer Folge von 4 - 10 basischen (positive Ladung) oder sauren (negative Ladung) Aminosäuren, kann in Lösungs- oder Festphasensynthese nach dem Fachmann bekannten Verfahren der Schutzgruppenchemie erfolgen. Dabei werden die Ladungs-Tags, die N- oder C-terminal, in einigen Ausführungsformen C-terminal, angefügt werden, bereits beim Aufbau der Aminosäuresequenz berücksichtigt.
Wie bereits im Vorangehenden erläutert, können als basische Aminosäuren beispielsweise Lysin-, Pyrrolysin, Histidin und/oder Arginin zum Einsatz kommen. Ein Ladungstag kann aus einer Abfolge identischer Aminosäureeinheiten oder aus einer Abfolge unterschiedlicher Aminosäureeinheiten bestehen. Typischerweise enthält ein Ladungstag negativ geladene, nicht jedoch positiv geladene Aminosäureeinheiten oder positiv geladene, nicht jedoch negativ geladene Aminosäureeinheiten oder besteht daraus. Neben geladenen Aminosäureeinheiten kann ein Ladungstag in einigen Ausführungsformen auch nicht geladene Aminosäureeinheiten aufweisen. Üblicherweise enthält allerdings ein Ladungstag mehr geladene als ungeladene Aminosäureeinheiten. In einigen Ausführungsformen enthält ein Vakzin bzw ein Nano- oder Mikropartikel der Erfindung ein Ladungstag, das eine Folge von vier, fünf, sechs oder sieben Lysin-Einheiten, eine Folge von vier, fünf, sechs oder sieben Pyrrolysin-Einheiten, eine Folge von vier, fünf, sechs oder sieben Histidin-Einheiten und/oder eine Folge von vier, fünf, sechs oder sieben Arginin-Einheiten aufweist oder daraus besteht. In einigen Ausführungsformen enthält ein Vakzin bzw ein Nano- oder Mikropartikel der Erfindung ein Ladungstag, das eine Folge von vier, fünf, sechs oder sieben Sulfotyrosin-Einheiten, eine Folge von vier, fünf, sechs oder sieben Aspartat-Einheiten und/oder eine Folge von vier, fünf, sechs oder sieben Glutamat-Einheiten aufweist oder daraus besteht.
Für die Herstellung der synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide nach Formel (I) wird typischerweise die ungewöhnliche Aminosäure Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hy- droxy)-(2RS)-propyl]-[f?]-cystein (Fmoc-RS-Dhc-OH) in Lösung oder an fester Phase mit dem an einem Synthese-Harz aufgebauten Seitenketten-geschützten Peptid verknüpft. Diese Vorstufe kann nachfolgend an den Hydroxygruppen bisacyliert werden. Bei der Synthese des Pam3Cys-Derivates erfolgt zusätzlich die Acylierung der N-terminalen Aminogruppe.
Wird die Synthese der erfindungsgemäßen Lipopeptide mit dem Baustein Noc-Fluorenylmeth- oxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2 )-propyl]-[R]-cystein (Fmoc-f?f?-Dhc-OH) durchgeführt, wird die Zielverbindung als stereochemisch definiertes Derivat erhalten, welches aus L- Aminosäuren, aus der modifizierten Aminosäure S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?J-propyl]-[/?]-cystein sowie aus zwei oder drei Acyl-Resten aufgebaut ist und eine höhere biologische Aktivität aufweist.
Eine erfindungsgemäße Vakzinkomponente kann auch als sogenannte„Prodrug-Verbindung", wie zum Beispiel als Prodrug-Ester, Prodrug-Peptide oder ähnliches modifiziert werden. Unter einer Prodrug-Verbindung wird ein Molekül verstanden, das in manchen Fällen selbst pharmakologisch inaktiv ist, jedoch in vivo im Körper eines Subjekt durch metabolische Umwandlung in ein pharmakologisch aktives Molekül überführt wird. In anderen Fällen ist eine Prodrug-Verbindung weniger aktiv als ein daraus im Körper des Subjekts gebildeter pharmakologisch (voll) aktiver Wirkstoff. Eine Prodrug-Verbindung kann somit als ein Vorläufermolekül eines pharmakologisch aktiven Wirkstoffs verstanden werden. Eine Prodrug- Verbindung kann Reste enthalten, die in vivo vom Molekül abgespalten werden, beispielsweise durch eine enzymatisch katalysierte Reaktion wie eine Hydrolyse oder eine Oxidation. So kann eine in einer pharmakologisch aktiven Verbindung vorhandene Hydroxygruppe in einer Prodrug-Verbindung in Form eines Esters vorliegen, ein Amin kann in Form eines Amids vorliegen oder eine Garboxylgruppe kann in Form eines Esters oder eines Amids vorliegen. Eine in einer pharmakologisch aktiven Verbindung vorhandene Carboxylgruppe kann auch als Hydroxygruppe vorliegen, die in vivo oxidiert werden kann. In bestimmten Fällen kann durch die Kopplung von die Zellpenetration fördernden Molekülen, wie z.B. Biotin oder Maleimidopropionsäure, optional über geeignete Spacermoleküle, an die primäre Aminogruppe oder die Acylierung der Aminogruppe die Bioverfügbarkeit und damit die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen verbessert werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates für Mensch und/oder Tier für eine medizinische Anwendung. Eine solche Anwendung kann die prophylaktische spezifische Immunisierung gegen und/oder für die therapeutische Vakzinierung bei einer Erkrankung sein, wie eine Infektion, Krebs, eine Autoimmunerkrankung oder ein entzündliches und/ oder allergisches Leiden sowie für die Unterstützung einer konventionellen Impfung.
Eine solche immunstimulatorisch wirksame Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch effektive Menge wenigstens eines erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins, kann weiterhin ein oder mehrere die immunologische Wirkung verstärkende Adjuvantien, pharmazeutisch geeignete Träger-, Hilfs- und/oder Zusatzstoffe, wie z.B. Detergentien, Lösungsvermittler, Stabilisatoren oder Konservierungsmittel, sowie gegebenenfalls anderweitig therapierelevante Wirkstoffe oder Hautpflegeprodukte enthalten. Pharmazeutisch geeignete Materialien sind die im Bereich der Pharmazie und Lebensmitteltechnologie sowie in angrenzenden Gebieten bekanntermaßen verwendbaren Stoffe, insbesondere die in den einschlägigen Arzneibüchern gelisteten, deren Eigenschaften einer physiologischen Anwendung nicht entgegenstehen.
Die Effekte, die durch ein erfindungsgemäßes Mikro-/Nanopartikel-Vakzin hervorgerufenwird, ist auch abhängig von dessen Formulierung. Ein entsprechendes pharmazeutisches Präparat sollten die direkte Applikation des Arzneimittels auf die unbehandelte Haut ermöglichen. Zur topischen Applikation geeigneten Formulierungen für die erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine können beispielsweise Pasten, Salben, Cremes, Lotionen, Emulsionen, Gele, Hydrogele, Suspensionen, Lösungen, Sprays oder Pflaster, oder beispielsweise wässrige oder ethanolische Gele sowie Suspensionen oder Öl-Wasser-Emulsionen sein.
Aufgrund der Langzeitspeicherung (Depotwirkung) eines typischen erfindungsgemäßen Mikro-/Nanopartikel-Vakzins im Haarfollikel bietet sich auch eine Retard-Formulierung an, die nach dem Fachmann bekannten Methoden der pharmazeutischen Galenik hergestellt werdenkann.
Die Herstellung eines erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparats erfolgt in üblicher Weise nach dem Fachmann bekannten Verfahren, wie in den einschlägigen Arzneibüchern beschrieben, wobei die Bestandteile miteinander vermischt, gelöst oder mit einem physikalischen oder biologischen Träger assoziiert sein können. Ein erfindungsgemäßes pharmazeutisches Präparat kann zusätzlich sterilisiert werden.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins oder eines diese enthaltenden pharmazeutischen Präparates zur Behandlung und Vorbeugung von einer oder mehreren Erkrankungen bei Mensch und Tier, die mit Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen und allergischen Leiden in Zusammenhang stehen.
Hierzu trägt man einem Subjekt, also einer Person oder einem Tier, die oder das einer derartigen Behandlung bedarf, eine therapeutisch effektive Menge eines erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins oder eines erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparates direkt auf die unbehandelte Haut auf. Anschliessend kann die Formulierung mit dem Finger oder gegebenenfalls mit einem Massageapplikator einmassiert werden. Zur exakten Dosierung können zusätzlich Schablonen für die Größe des behandelten Haut-Areals verwendet werden. Die Auftragmenge kann durch die Verpackungseinheit vorgegeben werden.
Durch eine Vorbehandlung des zu behandelnden Haut-Areals durch Stripping oder einen Cyanacrylat-Abriss, bei der bereits abgestorbene Hornhautzellen, abgestorbene Korneozyten und getrocknetes Sebum aus der Öffnung der Haarfollikel entfernt werden, kann gegebenenfalls die Effektivität der Aufnahme des Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins erhöht werden. Okklusiwerbände oder Pflaster sind weitere Möglichkeiten, die Wirkstoffapplikation vorzunehmen.
Die erfindungsgemäßen Mikro-/Nanopartikel-Vakzine und pharmazeutischen Präparate können allein, in Kombination mit anderen, in der vorliegenden Erfindung enthaltenen, Mikro- /Nanopartikel-Vakzinen bzw. pharmazeutischen Präparaten oder in Kombination mit einem oder mehreren Wirkstoffen, die für die jeweilige medizinische Indikation relevant sind, angewendet werden. Die zeitliche Abfolge der Applikation ist dabei nicht eingeschränkt. Sie kann entweder zeitgleich, vor oder nach den anderen Wirkstoffen, als separates Arzneimittel oder Kombinationspräparat und auf demselben oder unterschiedlichen Applikationswegen verabreicht werden. Auch die Applikation verschiedener Vakzine oder Teilen davon an unterschiedlichen Stellen und zu unterschiedlichen Zeitpunkten entspricht dem Gegenstand der Erfindung.
Die exakte therapeutisch effektive Menge für ein zu behandelndes Subjekt sowie die molare Zusammensetzung der Vakzine oder Vakzinkombination hängt von verschiedenen Faktoren, unter anderem von Art und Verlauf der Erkrankung, von Größe, Statur, Alter und Gesundheitszustand des Patienten, vom Applikationsweg, von den angewandten konkreten Antigen-Deter- minanten und gegebenenfalls von den weiteren verwendeten Arzneimitteln ab. Somit ist es zum jetzigen Zeitpunkt nicht sinnvoll, die exakte Menge zu spezifizieren. Jedoch kann man prinzipiell von einer 1- bis 3-fachen Applikation der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Präparate über einen Zeitraum von wenigen Wochen bis zu einem halben Jahr ausgehen. Die eingesetzte Wirkstoffmenge sollte üblicherweise im Bereich von 0,5 pg bis 2,0 mg pro Applikation und Vakzinkomponente liegen. Die genaue Spezifikation der Dosierung ist abhängig von der konkreten Anwendung und Zusammensetzung des Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins und erfordert weitere Untersuchungen in den klinischen Studien.
Die wesentlichen Vorteile eines Vakzins und eines Verfahrens bzw. einer Anwendung der vorliegenden Erfindung, bei der dieses eingesetzt wird, bestehen in der nicht-invasiven Applikation, dem direkten Transport der Vakzinkomponenten durch den Haarfollikel zu den Zielstrukturen und der Verstärkung der Immunreaktion durch die Lipopeptid-Immunmodula- toren.
Mit den DCs der Haut wird eine ideale Zielstruktur adressiert.
Durch Einbeziehen der synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide als Modulatoren für das angeborene Immunsystem ist eine deutliche Steigerung der Effektivität der Immuni- sierung möglich. Dies eröffnet die Möglichkeit zur Verstärkung des Immunisierungserfolges von konventionell verabreichten Vakzinen durch die zusätzliche Applikation eines Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins.
Die topische Applikationsform eines erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel- Vakzins ist einfach und flexibel handhabbar und als solche unabhängig von medizinischem Personal. Die mit der parenteralen Applikation verbundenen Nebenwirkungen und Risiken, wie z.B. Sekundärinfektionen, können vermieden, bei enteraler Gabe übliche Metabolismen umgangen werden.
Die Beschränkung auf ein Mindestmaß und geringste Mengen von Vakzinkomponenten, vermindert das potentielle Risiko von Unverträglichkeiten bei dennoch guter immunstimulatori- scher Wirkung. Negative Einflüsse wurden in den bisherigen in vitro und in vivo Modellen nicht beobachtet.
Damit ist die topische Vakzinierung mit einem erfindungsgemäßen Mikro- und/oder
Nanopartikel-Vakzin der bisher dominanten systemischen und invasiven Applikationsform überlegen.
Ein Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin gemäß der Erfindung eignet sich einerseits zur Vorbeugung von Infektionskrankheiten. Aufgrund des unspezifischen Ansatzes der erfindungsgemäßen Vakzinierungsstrategie kann durch die Auswahl und Kombination der T- Zell-Epitope und Antigene für B-Zellen, eine große Breite bekannter Infektionskrankheiten abgedeckt werden.
Einsatzgebiete sind vor allem Impfkampagnen gegen weit verbreitete Infektionskrankheiten, Pandemien sowie Schutzimpfungen vor allem in der Pädiatrie. Auch die therapeutische Behandlung und Vorbeugung von Erkrankungen wie Infektionskrankheiten, Krebs, Autoimmunkrankheiten, chronischen Entzündungen und Allergien sind erfolgversprechende Anwendungsfelder für das dargestellte Prinzip der topischen Vakzinierung.
Nicht zuletzt weist ein erfindungsgemäßes Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin entscheidende Vorteile bei der Selbstmedikation chronisch Kranker und der Immunisierung bei Impfstoff- Unverträglichkeiten auf. Ebenso ist die topische Vakzinierung für die Schutzimpfung von Kindern außerordentlich vorteilhaft, da sie den Kindern die mit der Injektion verbundenen schmerzhaften Erfahrungen erspart.
Zudem reduziert das nicht-invasive Prinzip der Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine das Infektionsrisiko bei Vakzinationen erheblich und vermeidet erhebliche Mengen an klinischen Abfällen. Mit einem erfindungsgemäßen Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin wird eine neue Dimension der Vakzinentwicklung eröffnet, die anhand des bekannten immunologischen Wissens und durch die spezifische Auswahl der Epitope ein rationales Vakzindesign erlaubt.
Das der Erfindung zugrundeliegende Prinzip zur Überwindung der Hautbarriere ist auch für die Weiterentwicklung als allgemeines Prinzip für topisch applizierbare Drug Delivery Systeme offen.
Näheres zu einzelnen Ausführungsformen sowie weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen, wobei die vorstehend genannten und nachstehend noch zu erläuternden individuellen Merkmale jeweils für sich und in beliebigen Kombinationen miteinander beansprucht sind. Die folgenden Ausführungsbeispiele sind rein illustrativ und schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein.
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Ausführungsbeispiele
Beispiel A - Herstellung und Modifizierung der Vakzinkomponenten
In diesem Ausführungsbeispiel wird die allgemeine Methodik zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vakzinkomponenten, insbesondere der peptidischen Epitope und der synthetischen Analoga bakterieller Lipopeptide, sowie deren Modifizierung mit den peptidischen Ladungs- Tags mit den Methoden der Festphasensynthese beschrieben. Strukturmodifikationen können durch das Auslassen einzelner Syntheseschritte bzw. das Hinzufügen von dem erfahrenen Synthesechemiker bekannten Schritten vorgenommen werden. a) Synthese der Aminosäuresequenzen mit automatisierter Festphasensynthese Die Synthese der Peptide erfolgt nach klassischen, literaturbekannten Techniken in Lösung oder in einem automatisierten Verfahren an der festen Phase. Die Verfahrensschritte für die Synthese an fester Phase sind für nahezu alle Aminosäure-Sequenzen gleich. Aus diesem Grund wird in dem Beispiel lediglich der prinzipielle Syntheseablauf beschrieben, ohne auf Besonderheiten einzelner Peptide einzugehen.
Die Peptide werden mit einem Syntheseroboter ausgehend von einem mit Fmoc-L-Lys(Boc) beladenen Synthese-Harz nach der Fmoc-Peptidsynthese-Methode aufgebaut. Werden andere Aminosäuren für den C-terminalen Ladungs-Tag verwendet, beginnt man in analoger Weise mit den entsprechenden Fmoc-geschützten Derivaten.
Dazu wird das beladene Tritylchlorid-Polystyrol-Harz (8 mg; 7 pmol) in einen Reaktor einge- wogen. Die Aminosäuren werden in einer 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung (0,5 M in N,N-Di- methylformamid) zu 0,5 molaren Lösungen gelöst. Anschließend werden die befüllten Reaktoren und Vials auf die vorgesehenen Positionen des Syntheseroboters gestellt. Im ersten Syntheseschritt erfolgt die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe nach dem in Tab. 1 dargestellten Programmablauf. Tab. 1 : Zyklus zur Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe.
Syntheseschritt Reagenzien Volumina [μί] Dauer [min]
Start Harz quellen N,N-Dimethylformamid 800 2
1. Deblockierung 30% Piperidin in 200 5
N,N-Dimethylformamid
2. Waschen, 3 x N,N-Dimethylformamid 300 1
3. Deblockierung 30% Piperidin in 200 10
N.N-Dimethylformamid
4. Waschen, 7 x N,N-Dimethylformamid 300 1 Anschließend wird das entsprechende Peptid, beginnend vom C-terminalen Ende aufgebaut. Dies erfolgt durch die schrittweise Verknüpfung der jeweiligen Aminosäuren. Unmittelbar nach jeder Kupplung wird die Fmoc-Schutzgruppe der soeben gekoppelten Aminosäure abgespalten, um die Anbindung der nächsten Aminosäure an der freigewordenen Amino- gruppe zu ermöglichen.
Der Programmablauf des Syntheseroboters ist in der folgenden Tabelle dargestellt.
Tab. 2: Zyklus zur Synthese der Peptide.
Syntheseschritt Reagenzien Volumina [μΙ_] Dauer [min]
1. Kupplung 3 M N.N-Diisopropylethylamin 25 120
3 M N,N-Diisopropylcarbodiimid 25
in N,N-Dimethylformamid,
Aminosäure-Lösung 100
2. Waschen, 3 x N,N-Dimethylformamid 300 1
3. Deblockierung 30% Piperidin in 200 5
N,N-Dimethylformamid
4. Waschen, 3 x N.N-Dimethylformamid 300 1
5. Deblockierung 30% Piperidin in 200 10
N.N-Dimethylformamid
6. Waschen, 7x N.N-Dimethylformamid 300 1
7. weiter bei Schritt 1. b) Synthese von N,N-Bis(fluorenylmethoxycarbonyl)-[ 7]-cystein-bis-ierf.-butylester (Fmoc-Cys-OtBu)2 als Baustein für die Lipopeptid-Komponente
L-Cystein-bis-tert.-butylester (5,5 g; 13 mmol) und Fmoc-N-hydroxysuccinimidylester (7,04 g; 21 mmol) werden in Tetrahydrofuran (15 mL) gelöst. Unter Rühren wird N-Ethylmorpholin (3,83 g; 4,2 mL; 30 mmol) in Tetrahydrofuran (7,5 mL) dazugegeben.
Die Reaktionslösung wird 3 h bei Raumtemperatur gerührt und anschließend mit Hilfe des Rotationsverdampfers bis zur Trockene eingedampft.
Der Rückstand wird in Ethylacetat (100 mL) gelöst und im Scheidetrichter mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 3 x80 mL) sowie Wasser (3x80 mL) gewaschen. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer eingedampft und als Rückstand ein Öl erhalten.
Dieser Rückstand wird mit Hilfe eines Ultraschallbades in Dichlormethan / Methanol (1 :4; 385 mL) gelöst und umkristallisiert (18 h; -20°C). Der erhaltene farblose Niederschlag wird über eine Filternutsche abfiltriert, mit tert.-Butylalkohol/2-Propanol (1 :1 ; 2 x 100 mL) gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ausbeute (Fmoc-Cys-OtBu)2: 7,48 g (72%); [M+H]+: 797 c) Synthese von Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2 ?S)-propyl]-[ ?J- cystein-te/i.-butylester (Fmoc-RS-Dhc-OtBu): Einführung von Dhc
Das (Fmoc-Cys-OtBu)2 (4,96 g; 6,2 mmol) wird in Dichlormethan (39 mL) gelöst. Anschließend werden Zink (2,84 g; 43,4 mmol) sowie eine Lösung aus Methanol, Salzsäure (32%) und Schwefelsäure (98%) (100:7:1 ; 20,7 mL) unter starkem Rühren zugegeben. Nach 15 min Reaktionszeit bei Raumtemperatur wird f?S-2,3-Epoxy-1-propanol (45,9 g; 41 ,3 mL; 62 mmol) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Das Ganze wird im Ölbad (5 h; 40°C) weiter gerührt. Anschließend wird die Lösung am Rotationsverdampfer auf das halbe Volumen eingedampft, mit Kaliumhydrogensulfat-Lösung (5%; 5,2 mL) versetzt und 16 h bei -2°C aufbewahrt. Das Produkt wird mit Dichlormethan (3x50 mL) extrahiert. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird die organische Phase am Rotationsverdampfer bis zur Trockene eingedampft.
Ausbeute (Fmoc-f?S-Dhc-OtBu): 5,67 g (96%); [M+H]+: 474
Wird bei der Synthese, wie oben beschrieben, der außergewöhnlichen Aminosäure S-[2,3-di- (hydroxy)-(2 S)-propyl]-[f?]-cystein (Dhc) der racemische Synthesebaustein ?S-2,3-Epoxy-1- propanol verwendet, erhält man ein Diastereomeren-Gemisch der Zielverbindung. Durch Einsatz des Enantiomers R-2,3-Epoxy-1-propanol wird in analoger Weise das immunmodula- torisch aktivere fif?-Stereoisomer von Dhc erhalten. d) Synthese von Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2/?S)-propyl]-[ ?]- cystein (Fmoc-/?S-Dhc-OH): Hydrolyse des fert.-Butylesters
Fmoc- ?S-Dhc-OtBu (5,67g; 12 mmol) wird in Trifluoressigsäure (99%; 142 mL) gelöst und das Reaktionsgemisch 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wird anschließend am Rotationsverdampfer eingedampft, mit N-Hexan (50 mL) und Diethylether (30 mL) versetzt und wieder am Rotationsverdampfer eingedampft. Der zähflüssige, ölige Rückstand wird anschließend in tert.-Butylalkohol / Wasser (80%; 100 mL) gelöst und lyophilisiert (64 h).
Ausbeute (Fmoc-f?S-Dhc-OH): 3,03 g (60%); [M+H]+: 418 e) Synthese von Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2 ?S)-propyl]-[/?]- cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK: Kopplung der Aminosäuresequenz
Ein mit dem Seitenketten-geschützten Peptid GDPKHPKSF-KKKK (SEQ ID NO: 2) beladenes Synthese-Harz (5,22 pmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 pL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Dimethylformamid- Überstandes werden Ν,Ν-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylformamid; 12,2 pL; 36,6 pmol; 7 Equivalente), Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propyl]- [ft]-cystein (15,5 mg in 100 μί einer 0,5 M 1-Hydroxybenzotriazol-Lösung in N,N-Dimethyl- formamid; 36,6 μΐΎΐοΙ; 7 Equivalente) und N.N-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N- Dimethylformamid; 12,2 μΙ_; 36,6 pmol; 7 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Die Harz- Suspension wird anschließend für 2 h bei 37 °C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N.N-Dimethylformamid (3 χ 600 μί) und Dichlormethan (3 χ 600 μΙ_) gewaschen. f) Veresterung von Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2/?S)-propyl]-[ ?]- cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK mit Palmitinsäure
Das mit Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-di(hydroxy)-(2f?S)-propyl]-[^]-cysteinyl- GDPKHPKSF-KKKK beladene Harz (5,22 pmol) wird mit N.N-Dimethylformamid (100 pL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des N,N-Di- methylformamid-Überstandes werden Ν,Ν-Diisopropylethylamin (3 M in N,N-Dimethylform- amid; 24,4 pL; 73,2 pmol; 14 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N.N-Dimethylformamid/ Dichlormethan (1 : 1 ); 104 μΙ_; 104 μιτιοΙ; 20 Equivalente) und N.N-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N.N-Dimethylformamid; 24,4 L; 73,2 μmol; 14 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Nach 5 min wird 4-Dimethylaminopyridin (1 M in Ν,Ν-Dimethylformamid; 30 [iL; 30 pmol; 5,7 Equivalente) zugegeben. Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N.N-Dimethylformamid (3 χ 600 μΙ_) und Dichlormethan (3 x 600 [iL) gewaschen.
Die Veresterung wird ein weiteres Mal unter den gleichen Versuchsbedingungen wiederholt. g) Abspaltung der Fmoc- sowie der Seitenketten-Schutzgruppen
Das mit Na-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-[2,3-bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[f?]-cysteinyl- GDPKHPKSF-KKKK beladene Harz (5,22 μπιοΙ) wird mit Dichlormethan (100 [iL) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des Dichlormethan-Überstan- des wird Piperidin (30 % in N.N-Dimethylformamid; 200 pL) zum Harz pipettiert und die Mischung 10 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit Ν,Ν-Dimethyl- formamid (3 x 600 [iL) gewaschen. Anschließend wird nochmals Piperidin (30% in N,N-Di- methylformamid; 200 pl_) zu dem Harz pipettiert und die Suspension 20 min bei Raumtemperatur belassen. Danach wird das Harz mit N.N-Dimethylformamid (3 χ 600 μΙ_), Dichlormethan (3 x 600 [iL) und Diethylether (4 x 600 [iL) gewaschen.
Die Vollständigkeit der Reaktion wird mit Hilfe des Ninhydrin-Testes kontrolliert.
In analoger Weise erfolgt die Abspaltung der Fmoc- sowie der Seitenketten-Schutzgruppen von den Aminosäuresequenzen der Epitop-Peptide. h) Abspaltung des Lipopeptides S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2 ?S)-propyl]-[ ?]-cysteinyl- GDPKHPKSF-KKKK bzw. der Epitop-Peptide vom Synthese-Harz
Die Abspaltlösung Trifluoressigsäure /Triisopropylsilan /Wasser (92,5:5:2,5; 300 L) wird zu dem Harz (2,6 pmol) pipettiert und die Suspension 2 h bei Raumtemperatur belassen. Anschließend wird die Abspaltlösung mit Druckluft in ein Reagenzglas filtriert. Nachfolgend werden weitere 200 μΙ_ Abspaltlösung zu dem Harz pipettiert und die Suspension nochmals 30 min bei Raumtemperatur belassen. Nach erneuter Filtration der Abspaltlösung mit Druckluft wird das Harz mit Dichlormethan (200 μ1_) gewaschen. Die Filtrate und die Waschlösung werden vereinigt und am Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rückstand wird mit Diethylether (3 χ 300 μΙ_) digeriert und anschließend zentrifugiert. Das Sediment wird in tert.-Butylalkohol /Wasser (4: 1 ; 2 mL) aufgenommen und gefriergetrocknet (18 h).
Ausbeute (Pam2-(2RS)-Dhc-GDPKHPKSF-KKKK) [(SEQ ID NO: 3)]: 5,5 mg (97%);
M: 2179; [M+2H]2+: 1091 ; [M+3H]3+: 727 i) Acylierung von S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2 ?S)-propyl]-[ ?l-cysteinyl-GDPKHPKSF- KKKK mit Palmitinsäure
Das mit S-[2,3-Bis(palmitoyloxy)-(2RS)-propyl]-[/?]-cysteinyl-GDPKHPKSF-KKKK (SEQ ID NO: 3) beladene Harz (2,6 pmol) wird mit N,N-Dimethylformamid (100 μΙ_) versetzt und 5 min in einem Reaktor quellen gelassen. Nach dem Abfiltrieren des N.N-Dimethylformamid- Überstandes werden Ν,Ν-Diisopropylethylamin (3 M in N.N-Dimethylformamid; 12,2 μΐ_; 36,6 μητιοΙ; 7 Equivalente), Palmitinsäure (1 M in N.N-Dimethylformamid / Dichlormethan (1 :1 ); 52 pL; 52 μηηοΙ; 10 Equiva-Iente) und N,N-Diisopropylcarbodiimid (3 M in N,N-Dimethylform- amid; 12,2 [iL; 36,6 μπιοΙ; 7 Equivalente) zu dem Harz pipettiert. Die Harz-Suspension wird anschließend für 2 h bei 37°C im Heizblock inkubiert. Danach wird das Harz mit N.N-Dimethyl- formamid (3 χ 600 μΙ_) und Dichlormethan (3 x 600 pL) gewaschen.
Die Abspaltung des Produktes vom Harz erfolgt nach dem unter h) beschriebenen Verfahren.
Ausbeute (Pam3-(2RS)-Dhc-GDPKHPKSF-KKKK) [(SEQ ID NO: 4)]: 5,6 mg (89%);
M: 2417; [M+2H]2+: 1210; [M+3H]3+: 807
Beispiel B - Reversible Immobilisierung der Vakzinkomponenten an den Trägerpartikeln
Silika-Partikel mit einem Durchmesser von 1 .000 nm wurden mittels LBL®-Technologie mit der Schichtsequenz PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/PMAA beschichtet und nach mehrfachem Waschen mit 10 mM TRIS-Puffer auf pH 8 gebracht. Sodann wurde eine sequentielle Beladung mit jeweils 20%-igen DMSO-Lösungen der verschiedenen Vakzinkomponenten durchgeführt, wobei die adsorbierte Menge je Komponente durch die Reihenfolge und Menge der zugegebenen Vakzinkomponenten sowie die Inkubationszeit definiert wurde.
Zur Kalibrierung der Beladungsmenge wurden die Vakzinkomponenten mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen gelabelt und die Abnahme der Färbung im Überstand der Beladungslösungen mit UV/Vis- bzw. Fluoreszenzspektroskopie verfolgt. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle sowie Fig. 2 dargestellt.
Tab. 3: Prozentualer Anteil der bei pH 8 auf den Trägerpartikeln adsorbierten und bei pH 5 desorbierten Masse der Vakzinkomponenten bezogen auf die Masse der Trägerpartikel. (GILG = GILGFVFTL-KKKKK-Fluoreszein, SEQ-ID-NO: 11 gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff Fluoreszein, P2C = Pam2Cys-GDPKHPKSF-KKKKK- Tamra, SEQ-ID-NO: 9 gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff Tamra, Cha = aK-L- Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C-KKKKK-Cy5, SEQ-ID-NO: 10 gekoppelt an den Fluoreszenzfarbstoff Cy5). auf Partikeln adsorbierte Menge GILG [%] P2C [%] Cha [%]
Zugabe GILG, 30 min 2.0 — -
Zugabe GILG, 120 min 2,09 - -
Zugabe P2C, 30 min 17,6 16,6 -
Zugabe P2C, 120 min 16,7 15,3 -
Zugabe Cha, 30 min 12,4 12,0 6,3
Zugabe Cha, 120 min 8,3 9,5 8,4
Desorption in 10 mM Acetat 3,2 4,4 2,5
Desorption in 10 mM Acetat + 0,1 M NaCI 2,2 3,6 1 ,1
Desorption in 10 mM Acetat + 20% DMSO 1 ,9 6,1 · 3,2 Mit den beladenen Trägerpartikeln wurden Freisetzungsversuche in wässriger Lösung durchgeführt, wobei verschiedene Freisetzungsmedien simuliert wurden. Einerseits wurden die Vakzinkomponenten in einer 10 mM wässrigen Acetatpuffer-Lösung bei pH 5 freigesetzt. Zur Simulation von potentiellen Löslichkeitsvermittlern in den Haarfollikeln, wie Lipiden oder Salzen, wurden der Lösung auch NaCI bzw. 20% DMSO zugesetzt.
Die Ergebnisse in Tab. 3 zeigen, dass der Freisetzungsgrad und damit das Verhältnis der freigesetzten Vakzinkomponenten stark von der Zusammensetzung des Freisetzungsmediums und der Zusammensetzung des Mikro-/ Nanopartikel-Vakzins abhängen.
Fluoreszenzspektrometrische Untersuchungen zur Kinetik der Freisetzung der drei Vakzinkomponenten in 1 %-igen Suspensionen der beladenen Trägerpartikel in 10 mM wässriger Acetatpuffer-Lösung mit Zusatz von 0,1 M NaCI bei pH 5, zeigen die unterschiedlichen Freisetzungskinetiken der Vakzinkomponenten (Fig. 3). Innerhalb von 20 min wurden jedoch alle drei Komponenten zu mehr als 50% des Maximalwertes freigesetzt. 80% des Maximalwertes der Freisetzung wurden nach ca. 1 h erreicht.
Für die biologischen Tests wurden, in Analogie zu der jeweils optimierten Beladungsstrategie, die ungelabelten Vakzinkomponenten auf der Oberfläche der Trägerpartikel adsorbiert.
Zur Herstellung gebrauchsfertiger Muster für die Applikation wurden die Partikel bei pH 8 (10 mM TRIS-Puffer) in wässriges Agarose-Gel 0,5% eingearbeitet. Nach Zugabe eines Konservierungsmittels (Ethylparaben, Benzalkoniumchlorid, Hydrobenzoesäureethylester) wurden die fertigen und lagerstabilen Formulierungen bis zur Anwendung aufbewahrt.
Beispiel C - Transport des Mikro-/Nanopartikel-Vakzins in die Haarfollikel und zu den
Zielstrukturen
In diesem Ausführungsbeispiel wird die Effektivität des Transportes der Vakzinkomponenten zu den Zielstrukturen in Abhängigkeit von der Beschaffenheit der Trägerpartikel beschrieben. a) Steuerung der Penetrationstiefe über die Partikelgröße
Die Untersuchungen zur Abhängigkeit der im Haarfollikel erzielten Penetrationstiefe von der Größe und dem Material der Partikel erfolgten in vitro am Modellgewebe Schweineohr, welches sowohl in Struktur als auch bezüglich der physiologischen Eigenschaften der menschlichen Haut sehr ähnlich ist. Die Bestimmung der Penetrationstiefe erfolgte nach topischer Applikation von fluoreszenzmarkierten Trägerpartikeln, Entnahme von Stanzbiopsien und Auswertung der angefertigten Kryoschnitte mittels Laser-Scan-Mikroskopie.
Es konnte gezeigt werden, dass die Penetrationstiefe der Partikel durch die Partikelgröße steuerbar ist, wobei die Beschaffenheit der Partikel fast keine Rolle spielt. Während Partikel mit einem Durchmesser von ca.500 nm bis 600 nm Penetrationstiefen von > 1000 pm erreichen, penetrieren kleinere und größere Partikel deutlich weniger tief (Fig. 7). Erklärung für dieses Phänomen ist ein hauptsächlich mechanischer Effekt. Da die Dicke der Haarschup- pen ebenfalls etwa 500 nm beträgt, lässt sich ein Zahnradpumpeneffekt vermuten, der durch die Bewegung des Haares im Haarfollikel in Gang gesetzt wird. Dieser ist umso deutlicher ausgeprägt, je ähnlicher Partikelgröße und Haarschuppendicke sind. In vitro kann dieser Effekt durch Massage simuliert werden.
Die Zielstrukturen des topischen Vakzins, die DCs, sind vor allem im Infundibulum-Bereich der Haarfollikel in besonders großer Anzahl vorhanden. Dieser ist in einer Tiefe von bis zu 600 pm lokalisiert und wird von den Vakzinkomponenten bereits nach 1 h erreicht. Innerhalb der nächsten 24 h findet eine minimal weitere Diffusion statt, die für die Vakzinierung aber von geringer Bedeutung ist.
Für die Herstellung eines topischen Vakzins zur Anwendung beim Menschen haben sich deshalb sphärische Silika-Partikel mit einem Durchmesser von 300 nm - 1.500 nm als besonders gut geeignete Trägerpartikel erwiesen. b) Langzeitspeicherung der Trägerpartikel im Haarfollikel
Zur Bestimmung der in vivo Aufenthaltsdauer der Trägerpartikel in der menschlichen Haut wurden fluoreszenzmarkierte Partikel auf die Wadenhaut freiwilliger Probanden appliziert. Anschließend wurde die Menge der im Stratum corneum bzw. in den Haarfollikeln eingelager- ten Partikel mit Hilfe des Differentiellen Strippings (Teichmann etal.2005) erfasst. Bereits nach einem Tag waren nahezu keine Partikel mehr in den oberen Hautschichten (Stratum corneum) nachweisbar, während noch etwa 80% der Ausgangsmenge im Haarfollikel wiedergefunden werden konnten. Auch nach 10 Tagen waren noch etwa 20% der Partikel im Haarfollikel nachweisbar (Fig. 8). c) Kinetik der Freisetzung
Die Kinetik der Freisetzung wurde mit Cy5-gelabelten Silika-Partikeln, die mit Rhodamin- gelabelten Vakzinkomponenten beladen wurden, am Schweineohr-Modell untersucht. Es wurden erneut Kryoschnitte angefertigt und die Penetrationstiefen der beiden Fluoreszenzfarbstoffe Laser-Scan-Mikroskopisch untersucht.
Anhand der unterschiedlichen Penetrationstiefen konnte gezeigt werden, dass die Vakzinkomponenten im Haarfollikel freigesetzt werden und signifikant tiefer penetrieren als die transportierenden Partikel (Fig. 6). d) Aufnahme der Vakzinkomponenten in die Langerhans-Zellen
Für diese Untersuchungen wurden doppelt gelabelte Mikro-/Nanopartikel-Vakzine auf menschliche exzidierte Haut topisch appliziert. Anhand der Fluoreszenz-Färbung von ca.80% der untersuchten Langerhans-Zellen konnte nachgewiesen werden, dass die Vakzinkomponenten in das Zellinnere der Langerhans-Zellen aufgenommen wurden. Dagegen konnte eine Aufnahme der Trägerpartikel durch die Langerhans-Zellen nicht beobachtet werden. Auch dies spricht für die effektive Freisetzung der Vakzinkomponenten in räumlicher Nähe zu den Zielstrukturen. Beispiel D - Immunologische Aktivität der Mikro-/Nanopartikel-Vakzine und ihrer
Komponenten
Die immunologische Aktivität einer Modell-Vakzine mit den Komponenten:
(i) GILGFVFTL (SEQ ID NO: 5) aus dem Influenza-Matrixprotein M1 (GILG) bzw.
NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6) aus dem frühen Antigen pp65 des Zytomegalovirus CMV
(NLVP)
als Modelle für ein Epitop für CD8-Effektor-T-Zellen,
(ii) Pan-DR-Epitop aK-L-Cha-VAAWTLKAAa-Aca-C (PADRE) [SEQ ID NO: 7], wobei„a" für D-Alanin,„Cha" für Cyclohexylalanin und„Aca" für 6-Aminocapronsäure stehen, als Modell für ein Epitop für Helfer-T-Zellen sowie
(iii) Pam2Cys-GDPKHPKSF (P2C) [SEQ ID NO: 8]
als Modell für einen Immunmodulator,
wurde in in vitro Zellkulturen humaner Zellsysteme untersucht. Dabei kamen je nach spezifischer Fragestellung etablierte T-Zell-Klone, periphere weiße Blutzellen (PBMC), Subfraktio- nen dieser PBMC (Monozyten, CD8-T-Zellen, CD4-T-Zellen, naive T-Zellen, Gedächtnis-T- Zellen) oder aus diesen Zellen generierte differenzierte Zelltypen (unreife dendritische Zellen (iDC), reife dendritische Zellen (mDC)) zum Einsatz. Getestet wurden die Einzelkomponenten in freier wie in Partikel-gebundener Form sowie verschiedene Kombinationen dieser Komponenten auf den Trägerpartikeln. a) Auswirkung der Modifizierung der Epitope mit Oligoaminosäure-Tags
In einem Radiochromfreisetzungs-Assay wurde das Modellepitop GILG mit unterschiedlichen Varianten einer C-terminalen Verlängerung durch Histidin (H), Lysin (K) oder Glutamat (E) über 12 Größenordnungen titriert und die Induktion der zytolytischen Aktivität im humanen zytotoxischen T-Zell-Klon 10-21A gegen die B-lymphoblastoide Zelllinie JY getestet. Wie aus den in Fig. 9 dargestellten Ergebnissen zu erkennen ist, führt die Modifikation des C-Terminus des Epitops erwartungsgemäß zu einer Reduktion der stimulatorischen Kapazität. Das Epitop mit dem H4-Tag ist 45-fach, das mit Kt-Tag 131-fach und das mit E4-Tag 708-fach weniger potent als das unmodifizierte Epitop. Dieser Aktivitätsverlust ist angesichts der sehr hohen funktionellen Avidität des Epitops von 1 ,52 pM (Peptidkonzentration, die für halbmaximale Zytolyse erforderlich ist), zumindest bei dem H - und dem K/pTag tolerabel. b) Immunologische Aktivität Partikel-gebundener Vakzinkomponenten
Zum Vergleich der immunologischen Aktivitäten der Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzine mit der der freien Vakzinkomponenten, wurden primäre humane T-Zellen aus peripherem Blut eines gesunden Spenders mit den freien Komponenten, Gemischen derselben, den einzeln oder in Kombination an die Trägerpartikel gebundenen Komponenten sowie Gemischen beladener Partikel über 14 Tage inkubiert. Alle Komponenten waren mit einem IC-Tag versehen. Die Induktion vakzinantigen-spezifischer CD8-T-Zellen wurde im ELISpot-Assay auf IFN-γ quantifiziert.
Die erzielten Ergebnisse sind repräsentativ für den Erfolg von prophylaktischen Vakzinierungen, weil die T-zellulären Immunreaktionen im Zellkultursystem ohne vorherige in vivo Vakzinierung induziert werden. Es zeigte sich, dass das Partikel-gekoppelte Epitop GILG im Zellkultursystem gleichermaßen aktiv ist, wie das freie Peptid. D.h., dass die Trägerpartikel sowie die Ladungs-Tags die biologische Aktivität der Vakzinkomponenten nicht wesentlich beeinflus- sen (Fig. 10). Bei der Titration von Gemischen Partikel-gebundener und freier Vakzinkomponenten konnte eine höhere Aktivität für die Partikel-gebundene Vakzine gegenüber einem Gemisch der freien Komponenten nachgewiesen werden (Fig. 11 ). c) Induktion der Reifung und Aktivierung von iDCs durch den Immunmodulator
Der Vakzinierungseffekt, d.h. die Stimulation des adaptiven Immunsystems und besonders der Effektor-T-Zellen, hängt von der erfolgreichen Induktion der Differenzierung der iDCs zu mDCs und deren Aktivierung zu potenten immunstimulatorischen Zellen ab. Dieser Prozess kann anhand der Expression von kostimulatorischen Oberflächenmolekülen auf den DCs verfolgt werden. CD80, CD86 und CD40, wie auch der DC-Aktivierungsmarker CD83, sollten hochreguliert werden.
Diese immunmodulierende Funktion der Mikro-/Nanopartikel-Vakzine wurde mit iDCs aus dem peripheren Blut freiwilliger Spender untersucht. Hierzu wurden PBMC in Plastikgefäßen inkubiert und die adhärenten Monozyten für 5 Tage in Zellkulturmedium mit IL-4 und GM-CSF kultiviert, wodurch sich diese zu nichtadhärenten iDCs entwickelten. Diese wurden dann zur Reifung und Aktivierung mit unterschiedlich beladenen Trägerpartikeln inkubiert. Nach zwei Tagen wurde die Expression der kostimulatorischen Oberflächenmoleküle und des Aktivie- rungsmarkers per Durchflusszytometrie untersucht.
Diese Untersuchungen wurden in unabhängigen Experimenten mit PBMC von 10 Probanden durchgeführt, um die Variationen in humanen Populationen abzubilden. Die Daten belegen, dass der Partikel-gekoppelte Immunmodulator P2C allein oder in Kombination mit anderen Vakzinkomponenten die Differenzierung, Reifung und Aktivierung der iDCs induziert (Fig. 12 A-C). Durch das Helfer-T-Zell-Epitop PADRE wird die Expression der kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 und des DC-Aktivierungsmarkers CD83 induziert, jedoch nicht die von MHC-Klasse-Il-Molekülen (HLA-DR) und von CD40, einem kostimulatorischen Molekül auf DCs, das für die primäre Induktion von zytotoxischen Effektor-T-Zellen erforderlich ist. Eine komplette Aktivierung der DCs wird dagegen mit P2C erreicht (Fig. 13). d) Induktion von T-Zellen durch DCs, die mittels Mikro-/Nanopartikel-Vakzine aktiviert wurden
DCs, die wie unter c) beschrieben, mit Hilfe unterschiedlich beladener Trägerpartikel differenziert und aktiviert wurden oder die wegen des fehlenden Immunmodulators nicht oder nur unvollständig ausgereift waren, wurden mit T-Zellen des gleichen Spenders, aus dessen PBMC die DCs generiert worden sind, für 7 Tage inkubiert. Die T-Zellen wurden anschließend per Durchflusszytometrie hinsichtlich Proliferation und Differenzierung untersucht. Zur getrennten Erfassung der CD45RA-exprimierenden naiven T-Zellen und der CD45RO-ex- primierenden Gedächtnis-T-Zellen wurden diese auf der Basis spezifischer Antikörper mittels Magnetseparation aus PBMC separiert und getrennt mit den DCs inkubiert.
Die Proliferation wurde mittels CFSE-Assay nachgewiesen. Bei diesem Assay werden die T- Zellen vor der Stimulation mit dem zellstabilen Fluoreszenzfarbstoff CFSE markiert. Bei jeder Zellteilung wird der Farbstoff 1 :1 verdünnt, sodass sich anhand des Abfalls der zellassoziierten Fluoreszenz die Proliferationsrate bestimmen lässt. Die Differenzierung von naiven zu Gedächtnis-T-Zellen konnte mit Differenzierungsmarkern nachgewiesen werden. Bei naiven T-Zellen (Fig. 14) induzieren DCs, die mit mit dem P2C-lmmunmodulator beladenen Partikeln vorinkubiert worden waren, Proliferation aber kaum Differenzierung, ähnlich wie bei einem entzündlichen Zytokin-Cocktail (TNF + IL-4 + IL-6). Das Helfer-T-Zell-Epitop PADRE hat einen ähnlichen, jedoch deutlich schwächeren Effekt. Im Gegensatz dazu induzieren DCs, die mit P2C- und PADRE-tragenden Partikeln vorbehandelt wurden, sowohl eine starke Proliferation als auch die Differenzierung eines hohen Anteils der naiven T-Zellen und damit genau den immunologischen Effekt, der von einer prophylaktischen Vakzine erwartet wird.
Bei Gedächtnis-T-Zellen (Fig. 15) induzieren die DCs nach Inkubation mit dem Immunmodulator P2C oder dem Helfer-T-Zell-Epitop PADRE, ebenso wie mit dem Zytokin-Cocktail, eine Proliferation. Hier ist erwartungsgemäß keine qualitative Differenzierung zu beobachten, allerdings eine deutliche Verstärkung des Effektes, wenn PADRE- und P2C-tragende Partikel kombiniert werden. Dieser Effekt spiegelt die Situation einer therapeutischen Vakzinierung oder einer Revakzinierung von Immunindividuen wider. e) Induktion Antigen-spezifischer T-Zell-Reaktionen durch das Mikro-/Nanopartikel- Vakzin
Zur Untersuchung der Induktion spezifischer Immunantworten durch die Mikro-/Nanopartikel- Vakzine wurden iDCs aus peripherem humanem Blut für zwei Tage mit Trägerpartikeln kultiviert, die mit den T-Zell-Epitopen NLVPMVATV [SEQ ID NO: 6] (Fig. 16) oder GILGFVFTL [SEQ ID NO: 5] (Fig. 17), dem Immunmodulator P2C oder Kombinationen davon beladen waren und anschließend mit CD8-T-Zellen zusammengegeben und für 7 Tage inkubiert. Danach wurde in den Zellkulturen die Proliferation von Effektor-T-Zellen mit Spezifität für Influenza bzw. CMV über rekombinante tetramerisierte HC-Peptidkomplexe (HLA-A2.1- Moleküle, die die jeweiligen Peptide GILG bzw. NLVP trugen) per Durchflusszytometrie untersucht. Die iDCs und Effektor-T-Zellen wurden dabei jeweils aus peripherem Blut derselben gesunden Spender generiert.
Gegen das CMV-Epitop konnten mit das Epitop allein tragenden Partikeln, schwache T-Zell- Reaktivitäten induziert werden. Von Partikeln, die mit dem Epitop und dem Immunmodulator gleichzeitig beladen waren, wurde eine deutliche stärkere Reaktion hervorgerufen. Dieser Effekt belegt, dass das CMV-Epitop und der Immunmodulator gekoppelt sein müssen, um eine optimale Wirksamkeit zu entfalten.
Im für das Influenza-Epitop gezeigten Beispiel hingegen wurde die stärkste Immunstimulation mit einer Mischung von Partikeln erreicht, die das Epitop und den Immunmodulator separat trugen. Hier liegt also keine Kopplungsanforderung vor. Ein Gemisch der Partikel ist vorteilhafter.
In jedem Fall ist die Induktion Antigen-spezifischer T-Zellen, wie bereits in den vorhergehenden Experimenten gezeigt, von der gleichzeitigen Gabe des spezifischen Epitops und des Immunmodulators abhängig, die je nach Situation und Antigen gekoppelt auf denselben Partikeln oder ungekoppelt vorliegen sollten. Die wenigen Tetramer- und CD8-postiven Zellen, die bereits in den T-Zell-Kulturen mit oder ohne iDCs nachgewiesen werden konnten, zeigen, dass die Spender in diesen Beispielen bereits längere Zeit zuvor mit den Viren, aus denen die Epitope stammen, Kontakt gehabt hatten. Die durchgeführten Experimente entsprechen damit der Situation einer therapeutischen oder Revakzinierung.
Beispiel E - Toxizität der Modellvakzine
In den Zellkultur-, Organkultur- und in vivo Untersuchungen ergaben sich im untersuchten Konzentrationsbereich von 1 f M bis 500 μΜ für die Modell-Epitope Pan-DR-E, GILGFVFTL (SEQ ID NO: 5) und NLVPMVATV (SEQ ID NO: 6) sowie für die Lipopeptid-Adjuvantien keine Hinweise auf eine toxische Wirkung des erfindungsgemäßen Mikro-/Nanopartikel-Vakzins.
Bei Untersuchungen zur Zytotoxizität der Trägerpartikel auf RKO-Zellen konnte für 2%-ige Suspensionen unterschiedlich beschichteter Trägerpartikel keine Beeinflussung der Überle- bensrate festgestellt werden.
Auch im Tierexperiment am Schwein konnten nach Auftragen von 2 mL einer 1 %-igen, in Agarose-Gel formulierten Mikro-/Nanopartikel-Vakzine, keine Nebenwirkungen beobachtet werden. Insgesamt konnte in den experimentellen Untersuchungen gezeigt werden, dass die mit den Vakzinkomponenten beladenen Trägerpartikel effektiv in die Haarfollikel transportiert werden und dort für ca. 5 - 10 Tage verbleiben sowie dass die Wirkstoffe erst im Haarfollikel gezielt freigesetzt werden, anschließend zu den DCs in der Epidermis der Haut diffundieren und von diesen aufgenommen werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Partikel-gekoppelten Vakzinkomponenten eine zu den freien Wirkstoffen vergleichbare und teilweise effektivere spezifische T-Zell-Reaktion induzieren, die von den peptidischen Ladungs-Tags nicht beeinträchtigt wird.

Claims

Patentansprüche
1. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin, aufweisend die Grundkomponenten
(i) eine oder mehrere Antigen-Determinante(n) für zytotoxische Effektor-T-Zellen,
(ii) eine oder mehrere Antigen-Determinante(n) für Helfer-T-Zellen und
(iii) einen oder mehrere lmmunmodulator(en) zur Aktivierung von
antigenpräsentierenden dendritischen Zellen,
wobei die Vakzinkomponenten an ein mikro- und/oder nanoskaliges Trägerpartikel gekoppelt sind.
2. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 1 , wobei das mikro- und/oder nanoskalige Trägerpartikel so gestaltet ist, dass es nach topischer Applikation auf die Hautoberfläche aktiv in die Haarfollikel transportiert und dort temporär deponiert wird, so dass die Vakzinkomponenten über die Stimulierung der dendritischen Zellen der Haut eine T-Zell-vermittelte Immunität induzieren.
3. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 1 oder 2, wobei das mikro- und/oder nanoskalige Trägerpartikel einen Durchmesser im Bereich von 100 nm bis 3.000 nm aufweist.
4. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 3, wobei das mikro- und/oder
nanoskalige Trägerpartikel einen Durchmesser im Bereich von 300 nm bis 1.500 nm aufweist.
5. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die eine oder mehreren Antigen-Determinante(n) für zytotoxische Effektor-T-Zellen und/oder die eine oder mehreren Antigen-Determinante(n) für Helfer-T-Zellen eine Aminosäuresequenz eines geeigneten Epitops aufweist/aufweisen.
6. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die eine oder mehreren Antigen-Determinante(n) für zytotoxische Effektor-T-Zellen ein CTL- Epitop, ein Polyepitop, ein Biopolymer, ein Protein, DNA, RNA, ein Polysaccharid, ein Glykolipid und/oder ein Glykoprotein aufweist/aufweisen.
7. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
Kopplung der Vakzinkomponenten an das mikro- und/oder nanoskaligen Trägerpartikel auf chemischen und/oder physikalischen Wechselwirkungen basiert.
8. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 7, wobei die chemischen und/oder physikalischen Wechselwirkungen eine kovalente Wechselwirkung, eine ionische Wechselwirkung, eine Van-der-Waals-Wechselwirkung, eine Wasserstoffbrückenbindung, eine adhäsive Bindung, eine elektrostatische Wechselwirkung und/oder eine magnetische Wechselwirkung aufweisen.
9. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 8, wobei eine oder mehrere
Vakzinkomponenten Ladungs-Tags aufweisen und wobei die Kopplung der Vakzinkomponenten an das mikro- und/oder nanoskalige Trägerpartikel auf elektrostatischer Wechselwirkung zwischen der polarisierten Oberfläche eines mit einer Folge geladener Polymere beschichteten Kerns und dem Ladungs-Tag der Vakzinkomponente(n) basiert.
10. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 9, wobei das Ladungs-Tag eine Folge von 4- 10 basischen oder sauren Aminosäuren aufweist.
11. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die eine oder mehreren Antigen-Determinante(n) für Helfer-T-Zellen ein Pan-DR-Epitop als degeneriertes Peptid für alle HLA-DR-Allotypen aufweist/aufweisen.
12. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei der eine oder die mehreren lmmunmodulator(en) zur Aktivierung der antigenpräsentierenden dendritischen Zellen ein synthetisches Analogon eines bakteriellen Lipopeptids aufweist/aufweisen.
13. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei zwei oder mehr der drei Grundkomponenten kovalent oder nicht-kovalent miteinander verbunden sind.
14. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Immunmodulator ein Lipopeptid mit der allgemeinen Struktur (I) ist, R1 -0— CH,
Figure imgf000051_0001
wobei
R1 und R2, die gleich oder verschieden sein können, für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen,
R3 für einen gesättigten oder ungesättigten Acyl-Rest mit 7 bis 25 C-Atomen oder H und
R4 für ein aus 1 bis 25 Aminosäure-Resten bestehendes, physiologisch verträgliches und in der behandelten Spezies nicht per se immunogenes Peptid stehen,
einschließlich der entsprechenden pharmazeutisch akzeptablen Salze, Tautomere, Stereoisomere, Stereoisomeren-Gemische, Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide.
15. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 14, wobei das Lipopeptid als RR- Stereoisomer des Dihydroxypropylcysteins vorliegt.
16. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 14 oder 15, wobei R1 , R2 und/oder R3 für einen gesättigten Acyl-Rest mit 16 C-Atomen stehen.
17. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 14 bis 16, wobei R4 für ein Peptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1 steht.
18. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Trägerpartikel jeweils eine, mehrere oder alle Vakzinkomponenten in einem entsprechend dem Wirkspektrum des Vakzins definierten molaren Verhältnis trägt.
19. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 18, wobei die Vakzinkomponenten einzeln oder als Konjugat an das Trägerpartikel gekoppelt sind.
20. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 18 oder 19, wobei die
Vakzinkomponenten zu einem Konjugat nach einer der folgenden allgemeinen
Strukturen (II), (III) der (IV) verknüpft sind Lipopeptid
Figure imgf000052_0001
T-Zell-Epitop1
Figure imgf000052_0002
T-Zell-Epitop,
Figure imgf000052_0003
wobei
n jeweils für eine natürliche Zahl von 0 bis 6,
R1 , R2, R3, R4, R5 und R6, die gleich oder verschieden sein können, für einen Aminosäure-Spacer mit einer Länge von 0 bis 6 Aminosäuren, T-Zell-Epitop! und T-Zell-Epitop2, die gleich oder verschieden sein können, für eine Aminosäure-Sequenz eines Epitops für zytotoxische Effektor-T-Zellen oder eines Epitops für Helfer-T-Zellen,
Lipopeptid für einen Immunmodulator gemäß Formel (I) nach einem der
Ansprüche 14 und 15 und
Tag für eine Folge von 4- 10 basischen oder sauren Aminosäuren stehen,
einschließlich der entsprechenden pharmazeutisch akzeptablen Salze, Tautomere, Stereoisomere, Stereoisomeren-Gemische, Prodrug-Ester oder Prodrug-Peptide.
21. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der vorangehenden Ansprüche zur medizinischen Anwendung.
22. Pharmazeutisches Präparat, enthaltend eine therapeutisch effektive Menge eines Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzins nach einem der vorhergehenden Ansprüche allein oder in Kombination, wobei das Präparat in einer zur topischen Applikation geeigneten Formulierung vorliegt.
23. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach Anspruch 21 , wobei die medizinische
Anwendung aufweist, dass die reversibel gekoppelten Vakzinkomponenten
(i) unter den im Haarfollikel herrschenden physiologischen Bedingungen gezielt freigesetzt werden,
(ii) durch Diffusion zu den Zielstrukturen, den dendritischen Zellen in der
Epidermis der Haut, gelangen und
(iii) dort eine T-Zell-basierte Vakzinantigen-spezifische Immunreaktion auslösen.
24. Mikro- und/oder Nanopartikel-Vakzin nach einem der Ansprüche 21 oder 23 zur
Anwendung in der prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von
Erkrankungen bei Mensch und Tier, die mit Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen und allergischen Leiden in Zusammenhang stehen bzw. zur
Unterstützung einer konventionellen Impfung wobei die Behandlung bei dem
behandelten Subjekt nach Applikation einer therapeutisch effektiven Menge einer oder mehrerer Vakzine durch Einmassieren in die Haut an einer oder mehreren räumlich getrennten Stellen sowie zum gleichen oder unterschiedlichen Zeitpunkten, eine für die eingesetzten Antigen-Determinanten spezifische Immunantwort hervorrufen.
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