WO2012148017A1 - 바이오칩 제조용 졸-겔 키트 및 이를 이용한 바이오 칩의 제조방법 - Google Patents

바이오칩 제조용 졸-겔 키트 및 이를 이용한 바이오 칩의 제조방법 Download PDF

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WO2012148017A1
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sol
solbs
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조민정
이세람
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica

Definitions

  • the present invention uses a sol composition prepared by sequentially mixing specific solutions, or by directly dispensing the specific solution sequentially onto a substrate without a pretreatment process, and a method for simply preparing a biochip and a sol-gel kit for manufacturing a biochip. It is about.
  • Biochips are representative examples of technologies incorporating new nanotechnology (NT), biotechnology (BT), and information technology (IT) technologies.
  • Biochip is a high-density microarray of various kinds of biomaterials on the surface of a solid support, and according to the biomaterials attached to the surface, biochips are various kinds of chips such as DNA chips, protein chips, cell chips, and neuron chips. Can be divided.
  • biochips are being developed into lab-on-a-chip (LOC) combined with microfluidic technology. Details of biochips include technology for fixing biomaterials, technology for making solid supports biomaterials, technology for finely arranging biomaterials, assays for conducting various bioreactions on the resulting chip, and detecting reaction results.
  • a protein chip is a type of biochip, in which various kinds of proteins are highly integrated microarrays on the surface of a solid-phase support having a unit area.
  • efforts have been made to manufacture protein chips by introducing the principles of production and elements of production of commercially available DNA chips.
  • most of the commercialized DNA chips are produced by immobilizing DNA on a glass plate pre-treated with a coating material. Differences in the physicochemical properties of the target protein to be fixed when the protein chip is manufactured by a method similar to the method used to fabricate a DNA chip, that is, when the protein chip is prepared by immobilizing the protein on a glass plate pretreated with a coating material Due to this various problems are occurring.
  • the initial protein chip was a simple binding assay after attaching the protein on the surface-treated glass plate as it is, but it is difficult to achieve the original purpose because the actual operation depends on the activity of the immobilized protein Many (MacBeath and Schreiber, Science 289: 1760, 2000). This problem is caused by denaturation, inactivation, degradation, etc. of the protein, which is caused by the difference in the inherent physicochemical properties of the protein as described above.
  • researches on protein attachment surface treatment technology and protein fixation materials that meet the characteristics of proteins distinguished from DNA have been conducted. The research focuses on providing a method of maintaining the activity of a protein while simultaneously immobilizing a protein chip surface.
  • the hydrolysis of Packard Bioscience which was recently acquired by PerkinElmer, Examples include Gelgel TM coated slides, Prolinx's Versalinx chips, and Zyomyx's biochip PDC chips.
  • the sol-gel process has been used to make microstructures through microfabrication.
  • the sol-gel process instead of chemically attaching biomolecules to inorganic materials, the sol-gel process forms a network through a gentle process and shares the biological molecules in the network. This technique has been widely used for immobilization by non-binding methods (Gill I. and Ballesteros A., Trends Biotechnol., 18: 282, 2000).
  • biomolecules including enzymes
  • biosensors Reetz, Adv. Mater., 9: 943, 1997), especially because of their optical clarity. It is also used for detection (Edminston, et al., J. Coll. Interf. Sci., 163: 395, 1994).
  • biomolecules are known to be not only chemically stabilized but also thermally very stable when immobilized by a sol-gel reaction (Dave, et al., Anal. Chem., 66: 1120, 1994).
  • the sol-gel reaction is used not only for fixing but also for forming and patterning a microstructure on a solid support.
  • the patterning method is to form a gel in a sol state in the liquid phase by using a hydrodynamic, gelling, and then remove the mold to form a pattern.
  • MIMIC micro-moduling in-capillaries
  • the technique can be used for basic patterning of microfluidics.
  • the activity of the protein is influenced by various factors such as pH, it is important to set the conditions for maintaining the activity by adding the protein from the sol state in the sol-gel process.
  • techniques for patterning proteins by pre-mixing proteins and sol together using various mild conditions such as neutral pH (Kim, et al, Biotehnol. Bioeng., 73: 331, 2001) have been published.
  • pH the sol-gel process has been rapidly progressed, causing problems such as cracking and opacity depending on the selection of the additive.
  • the concentration of the spot is likely to be nonuniform because it has to go through a pretreatment process that mixes protein and sol together in advance.
  • the present inventors have made diligent efforts to prevent the degradation and destruction of the biomaterials during the preparation of the sol composition, and as a result, specific silicate monomers and additives are sequentially mixed in a specific order and dispensed on the substrate, or sequentially dispensed directly on the substrate.
  • specific silicate monomers and additives are sequentially mixed in a specific order and dispensed on the substrate, or sequentially dispensed directly on the substrate.
  • gelation it is possible to produce a much more uniform biochip by delaying the gelation time compared to a conventionally used manufacturing method, and also prevents the degradation and destruction of biomaterials by the above components, and thus has excellent sensitivity. It was confirmed that the production can be completed the present invention.
  • the main object of the present invention is to kit the sol-gel material so that anyone can easily make and analyze biochips without any special equipment or technology.
  • Another object of the present invention to provide a method for analyzing a target material using the biochip.
  • a method for preparing a biochip using gelation of a sol composition comprising: dissolving a solution containing SolBS, a detection protein, and distilled water onto a substrate and gelling the same.
  • methyltriethoxysilane MTES
  • ethyltriethoxysilane EOS
  • sodium silicate tetramethyl orthosilicate
  • TMOS tetraethyl orthosilicate
  • SolB 1 at least one first silicate monomer selected from the group consisting of tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS);
  • aminopropyltriethoxysilane APTES
  • 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane GPTMOS
  • N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane N-
  • SolB 3 triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU)
  • glycerol PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 is characterized in that it comprises one or more additives selected from the group consisting of.
  • the present invention is a method for producing a biochip using gelation of the sol composition, comprising the following steps,
  • SolB1 is methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate (Sodium Silicate), tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate at least one first silicate monomer selected from the group consisting of (tetraethyl orthosilicate, TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS);
  • SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (polyglycerylsilicate) , PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dikushinimidylcarbo N, N-dicusinimidilcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- ( 3- (triethoxysily) propyl sucinic unhydride, N- (3-triethoxysilyl propyl) -4-hydroxy butylamide (N- (3-triethoxysily propyl)- 4-hydroxy butylamid e, SIT8189.5
  • SolB3 is aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (N- triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 provides at least one additive selected from the group consisting of.
  • APTES aminopropyltriethoxysilane
  • GPTMOS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane N- triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU)
  • glycerol PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 provides at least one additive selected from the group
  • the present invention also provides a method for producing a biochip using gelation of the sol composition, comprising the following steps,
  • SolB1 is methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate (Sodium Silicate), tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate at least one first silicate monomer selected from the group consisting of (tetraethyl orthosilicate, TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS);
  • SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (polyglycerylsilicate) , PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dikushinimidylcarbo N, N-dicusinimidilcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- ( 3- (triethoxysily) propyl sucinic unhydride, N- (3-triethoxysilyl propyl) -4-hydroxy butylamide (N- (3-triethoxysily propyl)- 4-hydroxy butylamid e, SIT8189.5
  • SolB3 is aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (N- triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 provides at least one additive selected from the group consisting of.
  • APTES aminopropyltriethoxysilane
  • GPTMOS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane N- triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU)
  • glycerol PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 provides at least one additive selected from the group
  • the present invention also relates to (i) methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate, TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS), the first vessel comprising at least one first silicate monomer selected from the group consisting of SolB1; (ii) 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS) , Polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl metaacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dikushinimidyl carbonate (N , N-dicusinimidilcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammoni
  • SolB1, SolB2 and SolB3 sol composition by mixing in order in order from SolBH selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH, buffer solution SolBS and distilled water, biological material for detection It provides a kit for producing a biochip, characterized in that the mixture is gelled.
  • the present invention also provides a method for analyzing a biochip prepared by the method and the sol composition and a target material which is a biomaterial using the same, and interacting with a biological material that interacts with the target biological material on the biochip manufactured by the method.
  • Provided are methods of analyzing a target biological material comprising adding a sample containing a possible target biological material.
  • FIG. 1 shows a biochip prepared by dispensing a sol mixed solution prepared from a sol composition (S-Sol), a solution I, and a solution II of the present invention into an array.
  • Figure 2 shows the response to the serum of HIV patients in the spot containing five HIV1 antigens.
  • 1, 2, 3, 4, and 5 are p24, p31, gp41, gp120, and gp160 as antigen markers for the diagnosis of HIV1 antibody.
  • FIG. 3 shows the response to sera of HIV patients serially diluted in spots containing serially diluted antigens.
  • Figure 4 is a graphical representation of the quantification of the response to the HIV standard serum in the spot containing each of the five HIV1 antigens.
  • 1, 2, 3, 4, and 5 are p24, p31, gp41, gp120, and gp160 as antigen markers for the diagnosis of HIV1 antibody.
  • Figure 5 is a table comparing the detection results using the biochip of the present invention and the conventional diagnostic kit for the serum of HIV1 patient collected by date after infection.
  • FIG. 6 is an Axon GenePix scanner scan photograph (A) and a camera image photograph (B) of a chip fabricated using sciFLEXARRYER S11.
  • FIG. 7 is a diagram illustrating the shape of a biochip having microchannels on its surface while including a detection protein in an encapsulation structure according to the present invention.
  • FIG. 11 is a result of analyzing a specific antigen using a protein chip according to the present invention.
  • the present invention is a method for producing a biochip using gelation of the sol composition, comprising the following steps,
  • step (b) mixing SolBS, which is a buffer solution, and distilled water with the solution mixed in step (a), and then stabilizing at -20 ⁇ 4 ° C .;
  • step (c) mixing a solution comprising a biological material interacting with the target biological material with a solution stabilized in step (b), dispensing onto a substrate and gelling,
  • SolB1 is methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate (Sodium Silicate), tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (tetraethyl orthosilicate (TEOS)) and tetramethoxysilicate (TMS) methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TEMS) tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS) at least one first silicate monomer selected from the group consisting of;
  • SolB2 is methyltrimethoxysilicate (MTMS), 3-aminotrimethoxysilane (3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), polyglycerylsilicate (PGS), diglycerylsilane (diglycerylsilane) , DGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dikushinimidylcarbo N, N-dicusinimidilcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- ( 3- (triethoxysily) propyl sucinic unhydride, N- (3-triethoxysilyl propyl) -4-hydroxy butylamide (N- (3-triethoxysily propyl)- 4-hydroxy butylami de, SIT8189.5), N-
  • SolB3 is aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (N- triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 relates to a production method characterized in that at least one additive selected from the group consisting of.
  • APTES aminopropyltriethoxysilane
  • GPTMOS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • PEOU N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane
  • PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 relates to a production method characterized in that at least one additive selected from the group consisting of.
  • the SolBH may be characterized in that from 1mM to 100mM.
  • the SolBS may be one or more solutions selected from the group consisting of NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , Na 3 PO 4 in the concentration range of 1mM to 100mM.
  • the sol composition, the buffer, and the biological material interacting with the target biological material are randomly mixed in random order to form a sol mixed solution, and then vacuum treatment is performed.
  • the method of gelling through post-treatment has been used.
  • the sol composition, the buffer and the detection protein may be mixed by using vortex or ultrasonic vibration, and the method of forming the sol-gel may also form spots on the substrate wells, Has been coated with a sol-gel or poured into a mold and gelated.
  • the concentration of the biological material interacting with the target biological material contained in each spot formed with the sol composition mixture solution may not be constant, and the concentration may vary according to the practitioner.
  • the concentration may vary according to the practitioner.
  • the biological material which interacts with the target biological material simply and uniformly by the sol-gel method has a uniform concentration for each spot, and thus the biological material can be detected more accurately and with high efficiency.
  • a sol composition is prepared by mixing SolB1, which is the first silicate monomer, SolB2, which is the second silicate monomer, and SolB3, which is an additive, in that order.
  • the SolB1 is methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate (Sodium Silicate), tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (tetraethyl orthosilicate) , TEOS) and one or more substances selected from the group consisting of tetramethoxysilicate (TMS).
  • TEOS was selected and used as a component of the first silicate monomer.
  • the SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DIGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (polyglycerylsilicate, PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dikushinimidylcarbonate (N, N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- (tri 3- (triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N- (3-triethoxysilyl propyl) -4-hydroxy butylamide (N- (3-triethoxysily propyl) -4 -hydroxy but ylamide, SIT818
  • SolB3 is an additive, aminopropyltriethoxysilane (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O- polyethylene oxide urethane ( N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000 can be used at least one material selected from the group consisting of. In one embodiment of the present invention, PEG was used as the additive.
  • the first silicate, the second silicate monomer and the additive may be appropriately selected and used as necessary according to the nature of the monomer biomaterial and the shape of the sol gel chip to be made.
  • the first silicate monomer is about 2-30% by volume relative to the total volume of the sol composition
  • the second silicate monomer is about 2-8% by volume
  • the additive is about 0-5% by volume. It is preferred to be included. At this time, the sol composition is harmful when inhaled and prepared in a well-ventilated place.
  • the sol composition for producing a biochip of the present invention when gelled, is characterized in that to form a fine channel by the voids.
  • these channels provide a means to interact with the target material to be analyzed.
  • the additive of component (iii) is a component used to control the channel size in the gel.
  • the method may be performed by hand spotting without an arrayer or by using a non-contact arrayer.
  • the substrate used in step (c) is optimized to a temperature above the dew point before use, where the temperature above the dew point means a temperature higher than the temperature at which dew begins to form on the substrate, Depending on the humidity conditions, this dew point may vary, for example, 8.6 ° C. when the ambient temperature is 20 ° C. above 50% relative humidity, and typically 14-17 ° C. at 70-80% humidity.
  • the substrate may be polymethylmethacrylate (PMMA), plastic, silicon, glass, or the like.
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • the biological material interacting with the target biological material may be any one selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, peptides, small molecule materials and cells.
  • the solution and the sol mixture mixed in the step (a) can be stabilized by leaving for 30 minutes or more under the condition of temperature -20 ⁇ 4 °C, the container to put the sol composition in the arrayer is the temperature above the dew point, Normally 14 ⁇ 17 °C (above dew point temperature at 70 ⁇ 80% of humidity), dispensing environment can be optimized for sol-gel by adjusting humidity of 70 ⁇ 80% and ambient temperature of 20 °C.
  • the gelation rate of the sol composition may be slowed to facilitate spot formation, to prevent cracking of the spot after gelation, and to form fine channels in the chip.
  • the sol composition and the mixed solution of SolBH and SolBS, the distilled water and the biological material interacting with the target biological material may be mixed in the range of 3: 1: 4 and 1: 2: 8, respectively, Concentrations of SolBH and SolBS may be 1mM ⁇ 100mM.
  • the volume ratio of the SolBS: distilled water: biological material interacting with the target biological material is in the range between 1: 2: 1 and 2: 5: 1.
  • the buffer may be sodium phosphate (sodium phosphate) in the pH range of 3-8.
  • the substrate may be previously surface-treated, etched, or treated with PDMS or silicate monomers or polymer materials.
  • the present invention provides a method for producing a biochip using gelation of the sol composition, comprising the following steps,
  • SolB1 is methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate (Sodium Silicate), tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (tetraethyl orthosilicate (TEOS)) and tetramethoxysilicate (TMS) at least one first silicate monomer;
  • MTES methyltriethoxysilane
  • EOS ethyltriethoxysilane
  • TMOS tetramethyl orthosilicate
  • TEOS tetraethyl orthosilicate
  • TMS tetramethoxysilicate
  • SolB2 is 3-aminotrimethoxysilane (3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (polyglycerylsilicate) , PGS), polyvinylacetate, polyvinylpyrrolidone, glyceryl methacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dikushinimidylcarbo N, N-dicusinimidilcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, 3- ( 3- (triethoxysily) propyl sucinic unhydride, N- (3-triethoxysilyl propyl) -4-hydroxy butylamide (N- (3-triethoxysily propyl)- 4-hydroxy butylamid e, SIT8189.5
  • SolB3 is aminopropyltriethoxysilane (APTES), 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane (GPTMOS), N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (N- triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane (PEOU), glycerol, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000;
  • APTES aminopropyltriethoxysilane
  • GPTMOS 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane
  • PEOU N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane
  • glycerol PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 and PEG8000;
  • the SolBH solution is at least one solution selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH in a concentration range of 1 mM to 100 mM;
  • the SolBS solution relates to a production method characterized in that at least one solution selected from the group consisting of NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , and Na 3 PO 4 in the concentration range of 1mM to 100mM.
  • the substrate used in step (c) is optimized to a temperature above the dew point before use, where the temperature above the dew point means a temperature higher than the temperature at which dew begins to form on the substrate, Depending on the humidity conditions, this dew point may vary, for example, 8.6 ° C. when the ambient temperature is 20 ° C. above 50% relative humidity, and typically 14-17 ° C. at 70-80% humidity.
  • the gelation of the sol composition is slowed down when dispensing each solution in order to facilitate spot formation, to prevent cracking of the spot after gelation, and to form fine channels in the chip.
  • a solution I selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH is dispensed thereon.
  • Solution I serves to create a pH environment for inducing gelation of the sol composition.
  • the concentration of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 or CH 3 COOH is preferably 5 ⁇ 30mM. Titrate to pH 1-3.
  • Solution II comprising buffer SolBS, biological material interacting with the target biological material and distilled water is dispensed onto the substrate to gel.
  • the SolBS may be sodium phosphate (sodium phosphate) in the pH range of 3-8.
  • the buffer and secondary distilled water have a function of preventing destruction of a biological material (eg, protein).
  • Biomaterials are prone to degradation or destruction at pH outside the proper range, and gelation of sol proceeds slowly at higher pH and faster at lower pH. It is important to titrate the pH so that it can be done.
  • the biomaterial is stably present in the range of pH 5 to 8, and therefore, the buffer solution is used to prevent the destruction of the biomaterial in particular in the pH environment according to the solution I.
  • the buffer that can be used is not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately select and use the biomaterial to be added. In the present invention, sodium phosphate buffer in a pH range of 3-8 was used.
  • biomaterial included in Solution II refers to a substance in the living body which can interact with the target substance (eg, a target protein) to be detected.
  • target substance eg, a target protein
  • Appropriate buffer solutions may be used to incorporate these detection proteins or biomaterials into Solution II. That is, a biomaterial for implementation is put in a buffer solution to make a sample solution for detection.
  • PBS buffer phosphate-buffered saline
  • the antibody Human Immunodeficiency virus 1 (target protein) was used as an antibody, and five antigen markers capable of binding to the HIV antibody with the detection protein were added to the PBS buffer. Mix was used.
  • the mixing volume ratio of SolBS: distilled water: biological material interacting with the target biological material in the solution II is preferably in the range of 1: 2: 1 to 2: 5: 1, most preferably 1 : 2: 1.
  • the buffer may be about 20-30% by volume, distilled water about 40-60% by volume, and the biological material interacting with the target biological material may be 20-30% by volume.
  • the present invention was used by mixing 10 ⁇ l of the buffer solution, 20 ⁇ l of distilled water, 10 ⁇ l of a solution containing a detection protein (a biological substance that interacts with the target protein).
  • the present invention is characterized in that homogeneous biochips are prepared by sequentially dispensing the sol composition, solution I and solution II in the correct amounts.
  • the ratio of the dispensing amount of the sol composition: solution I: solution II, which is dispensed in the present invention, is between 3: 1: 4 and 1: 2: 8, preferably 3: 1: 4.
  • the dispensing amount of the sol composition is preferably 25 to 35 ⁇ l, most preferably about 30 ⁇ l.
  • the dispensing amount of the solution I is preferably 5-15 mu l, most preferably about 10 mu l.
  • the dispensing amount of the solution II is preferably 35 to 45 mu l, most preferably about 40 mu l.
  • a non-contact arrayer or a pipette or other tool is used directly. Spotting by hand is desirable.
  • the manufacturing method may be characterized in that there is no pretreatment process, the pretreatment process, (i) SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, or a biological material that interacts with the target biological material is mixed Process of doing; (ii) vortexing after mixing; And (iii) may be any one or more selected from the group consisting of the process of stabilizing the mixed solution.
  • the sol composition consisting of the SolB1, SolB2 and SolB3, SolBH, SolBS and the biological material interacting with the target biological material can be dispensed in the form of sucking up using a nozzle in a container before dispensing.
  • the dispensing nozzle prior to dispensing the sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3, SolBH, SolBS and the biological material interacting with the target biological material, in advance in the high-capacity cartridge to which the dispensing nozzle is connected and dispenses at once
  • the amount is more than 100 times that of dispensing in the form of sucking up using a nozzle, so mass production is possible.
  • the chip When the chip is fabricated by sequentially dispensing the sol composition, solution I and solution II directly onto the substrate without pretreatment, it may be carried out using an arrayer that dispenses the correct amount. At this time, it is preferable to use a non-contact arrayer as the array word that can be used to dispense the sol composition, the solution I and the solution II in the correct volume.
  • the contact arrayer uses a pin with a very thin space to detect the detection protein. Align to the surface.
  • This method allows the solution containing the detection protein to be slightly out of the fins and directly aligned with the surface to align the different types of detection protein in a short time, but it is possible to precisely control the volume of the solution. As a result, uniformity may be lowered.
  • the non-contact arrayer is a method in which a solution containing a detection protein is placed in a thin tube, placed directly on the chip surface, and aligned on the surface without direct contact by applying a constant pressure to the tube.
  • This method has the advantage that it is possible to accurately determine the volume of solution dispensed. Therefore, it is preferable to use such a contactless arrayer in the present invention because the volume dispensed of each solution can be adjusted according to the ratio when the sol composition and the solution I and the solution II are sequentially dispensed without the pretreatment process.
  • the sol composition; Solution I selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3 and CH 3 COOH; And Solution II, which is a mixed solution of biological material, buffer and distilled water, which interact with the target biological material, may be sequentially dispensed onto the substrate well using a non-contact arrayer that dispenses an accurate volume.
  • Solution II which is a mixed solution of biological material, buffer and distilled water, which interact with the target biological material, may be sequentially dispensed onto the substrate well using a non-contact arrayer that dispenses an accurate volume.
  • the surface tension of the solution causes the entire solution not to spread but to form a spot shape, which converts the surface energy generated when the solution drops into vibrations, thereby causing A flow (convection) occurs and the two solutions mix well.
  • the present invention has devised an automated method for manufacturing a sol-gel chip by spotting directly on a surface without pretreatment.
  • a Microarrayer from Scienion AG can be used.
  • the use of Scienion AG's dew point control technology eliminates the uncertainty of the concentration caused by the condensation of moisture on the surface of the plate, making it possible to produce spots with more accurate volume and size.
  • sciFLEXARRAYER S11 (Scienion AG, Germany) was used as the array word.
  • the biochip can be made more simply by dispensing each solution to the substrate by using the non-contact arrayer at the time of manufacturing the biochip, and the sol-gel monomer (sol It is possible to manufacture a more homogeneous biochip since there is no need for pretreatment such as -gel monomer), buffer, and detection protein sample.
  • the substrate used in the present invention utilizes the property of being transparent when the sol composition is gelled
  • the substrate well or slide should also be made of a material capable of maintaining good transparency.
  • a plastic, silicone or glass component such as polymethylmethacrylate (PMMA) component having excellent transparency can be used.
  • PMMA polymethylmethacrylate
  • the substrate may be selected from plastic, silicon, glass, and the like, in addition to polymethyl methacrylate.
  • the substrate used in the present invention should be surface treated so that the sol mixed solution can be fixed to the substrate while gelling.
  • One of the important conditions of the biochip of the present invention is that the sol mixed solution is firmly fixed to the substrate while gelling, so that the spot does not drop when reacted with the solution containing the target substance. Therefore, in the analysis of the target material using the biochip, a strong washing process is required after reacting with the target material, and therefore, a strong fixation of the spot is necessary to overcome this physical force. It is preferable to use a substrate, a plastic substrate surface-treated with plasma, an unsurfaced glass substrate, a surface-treated glass substrate (for example, an etched glass substrate, etc.), or a silicon chip having a porous structure.
  • the substrate may be previously plasma-treated, etched, or treated with PDMS or silicate monomers or polymeric materials.
  • the biochip uses a special material called sol and gels over time, so that the sol is dispensed as quickly as possible to avoid gelation in the middle of dispensing using an arrayer. It is very important.
  • Second is humidity and temperature.
  • the initial humidity and temperature are very important. Therefore, when manufacturing a biochip using the sol-gel at all times, it is very important to set the humidity and temperature around the arrayer in advance.
  • Preferred humidity in the present invention is about 50% or more, or more specifically 70 to 80%.
  • preferable temperature is about 25 degreeC or less, More specifically, it is the range of 10-25 degreeC which can be said to be the range of normal temperature.
  • the humidity must be prepared before the arraying is about 80%. Also, if the temperature is 25 ° C or higher, the sol gel tends to accelerate so that the lowest temperature is possible.
  • each solution is dispensed step by step.
  • the biological material that interacts with the target biological material may be a nucleic acid, a protein, a peptide, a small molecule material or a cell.
  • the present invention also provides, in another aspect, methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetra
  • a first vessel comprising SolB1, which is at least one first silicate monomer selected from the group consisting of ethyl orthosilicate (TEOS) and tetramethoxysilicate (TMS); 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS), polyvinyl Acetate (polyvinylacetate), polyvinylpyrrolidone, glyceryl metaacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dikushinimidylcarbonate (N, N- dicusinimidilcarbonate (DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cety
  • SolBH selected from the group consisting of HCl, H 2 SO 4 , HNO 3, and CH 3 COOH in the sol composition mixed with SolB1, SolB2, and SolB3, buffer SolBS and distilled water, and biological material interacting with the target biological material
  • the present invention relates to a kit for producing a biochip, wherein the sol mixture is gelled by mixing as it is.
  • kits may take the form of bottles, tubs, small sachets, envelopes, tubes, ampoules, etc., which may be partially or wholly plastic , Glass, paper, foil, wax, and the like.
  • the container may be equipped with a fully or partially separable stopper, which may initially be part of the container or attached to the container by mechanical, adhesive, or other means.
  • the kit may include an external package, which may include instructions for use of the components.
  • the present invention relates to a method for analyzing a target biological material using a biochip manufactured by the above method.
  • the present invention relates to a method for analyzing a target biological material, comprising adding a sample containing a target biological material that can interact with the biological material to interact with the target biological material.
  • the target biological material may be any one selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, peptides, small molecule materials, and cells, and radioisotopes or fluorescent dyes or other kinds capable of detecting the target biological materials. It may further comprise the step of further reacting with a biological material, such as protein, aptamer labeled with a labeling substance.
  • the biochip to react with the target biological material is prepared and then reacted with the solution containing the actual target biological material.
  • the reaction solution is appropriate in an amount of 50 to 100 ⁇ l for the 96-well type, and the reaction time is 1 hour.
  • the target biological material interacting with the biological material that interacts with the target biological material may also be a biological material, and may be a nucleic acid, a protein, a peptide, a small molecule material or a cell.
  • the reaction solution containing the target biological material penetrates into the spot through the microporous structure in the spot and meets and interacts with the biological material fixed in the capsule structure (1st incubation).
  • the target biological material may be reacted with a labeling protein, which is a labeling factor, to detect the target biological material.
  • a labeling protein which is a labeling factor
  • an antibody to a target protein to which a fluorescent dye (Cy3) is attached was used (2nd incubation). At this time, the reaction time is 30 minutes and the amount of the reaction solution is 50 ⁇ 100 ⁇ m.
  • the above 1st and 2nd incubations are all performed at room temperature.
  • a blocking process is performed before the 1st incubation process to prevent nonspecific binding of the biological substance interacting with the target biological substance in the biochip.
  • the blocking solution required for this procedure may be used, such as skim milk, BSA (bovine serum albumin) or IgG.
  • the washing liquid may be a conventional one, and in one embodiment of the present invention, a PBS buffer containing 0.2% Tween-20 is used. It was.
  • the 1 st and the washing process is used for the ELISA washer as washing, do the washing 4 times and subjected to washing 4 times with 2 nd washing process. After the washing process, it is dried until all the solutions are removed from the wells.
  • the method for analyzing the target biological material of the present invention further comprises the step of further reacting with a biological material such as a protein or aptamer labeled with radioisotopes, fluorescent dyes, luminescent materials, dyes or other types of labeling materials, etc. do.
  • a biological material such as a protein or aptamer labeled with radioisotopes, fluorescent dyes, luminescent materials, dyes or other types of labeling materials, etc. do.
  • the aptamer refers to a small single-stranded oligonucleic acid capable of specifically recognizing a biological substance that interacts with a target biological substance with high affinity.
  • the present invention also includes a detection kit comprising a biochip manufactured by the above method.
  • Detection kits for biological material detection may take the form of bottles, tubs, sachets, envelopes, tubes, ampoules, etc., which may be partially or wholly plastic, glass, paper, foil , Wax and the like.
  • the container may be equipped with a fully or partially separable stopper, which may initially be part of the container or attached to the container by mechanical, adhesive, or other means.
  • the kit may include an external package, which may include instructions for use of the components.
  • the sol composition was prepared by mixing 20 ⁇ l of selected SolB1, 6 ⁇ l of SolB2, and 4 ⁇ l of SolB3, one each selected from the components illustrated in Table 1 below. And 10 microliters of SolBH was prepared for the solution I.
  • Table 1 Components of each solution division ingredient SolB1 Methyltriethoxysilane (MTES), ethyltriethoxysilane (ETrEOS), sodium silicate, tetramethyl orthosilicate (TMOS), tetraethyl orthosilicate (TEOS) And tetramethoxysilicate (TMS); one first silicate monomer selected from the group consisting of SolB2 3-aminotrimethoxysilane (3-ATMS), diglycerylsilane (DGS), methyltrimethoxysilicate (MTMS), polyglycerylsilicate (PGS) polyvinylacetate (polyvinylacetate), polyvinylpyrrolidone, glyceryl metaacrylate, hydroxyethyl acrylate, N, N-dicusinimidylcarbonate (N, N-dicusinimidilcarbonate , DSC), 1,3,5-trimethylbenzene, cetyltrimethylammonium chloride
  • 10 ⁇ l of one or more SolBS selected from the group consisting of NaH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , and Na 3 PO 4 and 20 ⁇ l of double distilled water (DDW) are mixed, while interacting with the HIV1 antibody.
  • About 10 to 200 ng of five detectable proteins (p24, p31, gp41, gp120, and gp160) are mixed in PBS buffer to make 10 ⁇ l of sample solution, which is added to the mixture, followed by vortexing and spin-down for 5 seconds.
  • Solution II was prepared.
  • a commercially available PMMA 96-well plate prepared by plasma surface treatment was purchased from SPL (Korea).
  • the arrayer was set at a temperature of 16 ° C. and a humidity of 80% before spotting, and a general 384-well was prepared as a source well into which the sol mixed solution obtained in Example 1 was placed.
  • a target well the PMMA 96-well plate of (1) was prepared.
  • the sciFLEXARRYER S11 (Scienion, Germany) arrayer was prepared to dispense the correct volume as set.
  • sol composition prepared by mixing 20 ⁇ l of SolB1, 6 ⁇ l of SolB2, and 4 ⁇ l of SolB3 in Example 1 to a source plate of sciFLEXARRYER S11 (Scienion, Germany) arrayer, 10 ⁇ l of SolBH (solution) I) and 40 [mu] l of the solution II were each added to the source plate of the arrayer.
  • the sol composition, solution I, and solution II were dispensed in order by a predetermined volume on PMMA 96-well plates prepared in advance.
  • the amount dispensed was to be less than 450 pl per spot, using a nozzle PDC90 (ScienionAG, Germany).
  • Spotting frequency was set to 500 Hz.
  • the spot size formed was about 300 ⁇ m (8 drops per spot).
  • FIG. 6 shows photograph A scanned with an Axon GenePix scanner (Axon) at 532 nm and image photograph B by sciFLEXARRAYER equipped with a camera.
  • the dot pitch between the proteins on the protein chip was 600 ⁇ m.
  • protein chips were prepared by conventional methods known as controls. Silicate monomers, HCl, DW, SP and the sample solution was prepared by mixing sequentially, and then the pin solution was used to spot the mixed solution dispensed in the source plate on a PMMA 96-well plate. OnmiGrid Accent Arrayer (Genomic Solutions, USA) was used as the pin arrayer.
  • Example 2 After blocking the protein chip prepared in Example 2 using a 10% skim milk solution, 50 ⁇ l of the diluted HIV patient was added to each well, followed by primary culture at room temperature for 1 hour. After completion of the primary culture, the serum was removed, the washing solution containing 0.2% Tween-20 was added using a washing machine for ELISA, and the step of vortex for 5 minutes was repeated four times (first wash). After the first wash, 50 ⁇ l of a ⁇ -Human antibody ( ⁇ -Human-Cy3, Jackson ImmunoResearch), which is labeled with a Cy3 fluorescent material and recognizes human antibodies, was added thereto, and then incubated for 2 hours at room temperature. It was. After the secondary culture, ⁇ -Human-Cy3 was removed, and the washing solution was added using a washing machine for ELISA and vortexed for 5 minutes was repeated four times (secondary washing).
  • ⁇ -Human antibody ⁇ -Human-Cy3, Jackson ImmunoResearch
  • the well in which the reaction was terminated was left to dry at room temperature for at least 10 minutes, and the spot where the reaction occurred was scanned with a laser scanner, FUJI FLA-9000 image scanner.
  • the intensity of the fluorescence signal of each spot in which the reaction occurred was measured and quantified using ImageQuant TL, an image analysis program, to analyze the degree of reaction.
  • Figure 3 shows the best response among the four antigens (p24, p31, gp41, gp120) and one successive dilution of one O-type antigen of HIV1 spotted in the wells, HIV standard serum The diluting and reaction results were shown sequentially, confirming that the quantification was performed quantitatively as expected. Based on the above results, it can be seen that the antigen-antibody reaction occurs specifically on the protein chip produced in the present invention.
  • Figure 4 shows the results of quantifying the response to the HIV1 standard serum in each spot containing five antigens.
  • X-axis of the figure shows the titer measured when diagnosing HIV with the standard ELISA diagnostic kit, showing that the analysis result of the protein chip of the present invention and the analysis result of the conventional diagnostic chip are correlated.
  • PRB204-00 on the X-axis is available from Bostonbiomedica, Inc. Serum standard sample of the patient, purchased from Anti-HIV1 mixed titer performance panel and product number PRB204 (M).
  • the Titer value is the s / co value measured by the existing diagnostic kit, indicating the signal to cut-off (positive and negative reference value) ratio.
  • the Y axis of the figure refers to a value obtained by dividing the intensity (“signal”) value of the fluorescence signal of the spot by the intensity (“control”) value of the fluorescence signal of the negative control spot.
  • Figure 5 is a table comparing the response to the seroconversion panel collected by date in patients with HIV compared with the conventional diagnostic kit.
  • the patient's serum was taken from Bostonbiomedica, Inc. It is a standard sample purchased from, and the detection result using the existing diagnostic kit is also provided with the standard sample.
  • the sample name for this sample is Anti-HIV1 seroconversion panel V and product number PRB922.
  • the existing antibody diagnostic ELISA diagnostic kit did not detect HIV infection, but it can be seen that the protein chip of the present invention can detect positively from the initial stage of infection as in the antigen detection kit.
  • the biochip has a much improved sensitivity than the conventional antibody diagnostic ELISA.
  • Western blots and immunostaining are techniques for finding a specific protein from a mixture of several proteins, which are used to detect the presence of a specific protein by triggering an antigen-antibody reaction using an antibody against the desired protein.
  • the process of finding a specific protein by western blot involves electrophoresis on SDS-polyacrylamide gel, separating it by size, transferring it to nitrocellulose or nylon membrane, and antigen-antibody on the membrane to which the protein is transferred.
  • the reaction is used to find an antigen for a specific antibody.
  • the antibody used is labeled with a radioisotope, a specific enzyme (horseradish peroxidase, etc.) or a fluorescence dye is bound to visualize the protein to be found.
  • the protein mixture prepared in Example 2 is used to fix the protein mixture, and then assay with an antibody having a fluorescence-binding dye to bind the protein. Specific proteins could be found in the mixture.
  • the sol-gel protein chip according to the present invention is more useful because it can immobilize the protein in its original form.
  • sol-gel chip according to the present invention was found to be able to identify both denature and native forms.
  • E. coli crude extract expressing p24 protein was fixed to the sol-gel protein chip by concentration (Lysate 1, 2, 3) and then assayed with an antibody against the expressed protein. Was positive in (FIG. 10).
  • N is a negative control group to fix the E. coli crude extract that does not express a specific protein
  • Lysate 1 is a specific protein E. coli crude extract
  • Lysate 2 is expressed in a concentration of 0.09ug / ul
  • Lysate 3 in which protein is expressed at a concentration of 0.18 ug / ul
  • P is a positive control group to which the Cy3 fluorescent substance is fixed.
  • N is a negative control chip without fixing the antibody
  • Ab1 and Ab2 fix the antibody by concentration (0.063ug / ul, 0.125ug / ul).
  • P fixed the Cy3 fluorescent material as a positive control.
  • a specific compound bisphenol A was fixed to the sol gel chip prepared in Example 2, and only the buffer solution used to dissolve the compound as a negative control was fixed to the chip. And, it was analyzed using a single strand DNA aptamer (commercially available from PCL Co., Ltd.) labeled with a fluorescent substance (cy3) and capable of binding to bisphenol A.
  • a single strand DNA aptamer commercially available from PCL Co., Ltd.
  • Protein-protein binding can be confirmed by yeast to hybrid or Immunoprecipitation (IP), but there are not a variety of methods for easily confirming compound-to-protein binding or compound-to-DNA binding.
  • IP Immunoprecipitation
  • the protein chip prepared in Example 2 can fix various kinds of materials from low molecular materials, such as compounds or DNA, to proteins, antibodies, so that the binding of various materials can be easily confirmed.
  • the sol composition is obtained by mixing a sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3 with SolBH, SolBS, DW and a buffer solution in order and then stabilizing at a low temperature.
  • a sol composition consisting of SolB1, SolB2 and SolB3 with SolBH, SolBS, DW and a buffer solution in order and then stabilizing at a low temperature.

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Abstract

본 발명은 바이오칩 제조용 졸-겔 키트 및 이를 이용한 바이오 칩의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 바이오 칩을 제조함에 있어서, SolB1, SolB2, SolB3 와 같은 특정 실리케이트 단량체들의 혼합물 및 SolBH, SolBS 및 증류수와 탐지 생물학적 물질의 혼합물을 순서대로 혼합함으로써 졸 조성물의 겔화 시간을 늦추어 안정화된 겔화(gelation)을 유도하며, 졸 혼합물을 분주할 때 어레이어를 사용하거나 파이펫등의 도구를 이용하여 손으로 분주하는 등 간편하게 바이오칩을 제작할 수 있고 한편으로는, 혼합과 같은 통상적인 전처리과정 없이도, 졸 조성물, SolBH 인 용액 I 과 완충액 SolBS, 증류수 및 탐지단백질의 혼합물인 용액 II 를 순서대로 기판에 분주함으로써 균질한 바이오 칩을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

바이오칩 제조용 졸-겔 키트 및 이를 이용한 바이오 칩의 제조방법
본 발명은 특정 용액들을 순차적으로 혼합하여 제조한 졸 조성물을 이용하거나, 또는, 전처리 과정 없이 이러한 특정 용액을 순차적으로 기판에 직접 분주하여 간단하게 바이오 칩을 제조하는 방법 및 바이오칩 제조용 졸-겔 키트에 관한 것이다.
바이오 칩은 새로운 나노테크놀로지(nanotechnology, NT), 바이오테크놀로지(biotechnology, BT), 정보테크놀로지(information technology, IT)가 융합된 기술의 대표적인 예이다. 바이오 칩은 다양한 종류의 생체물질을 고체상 지지체의 표면에 고집적 미세배열(high-density microarray)한 것으로서, 표면에 붙이는 생체물질에 따라서 DNA칩, 단백질 칩, 셀 칩, 뉴론 칩 등 다양한 종류의 칩으로 나뉠 수 있다. 또한, 바이오 칩은 미세유체학 기술과 합쳐져서 LOC(lab-on-a-chip)로 발전하고 있다. 바이오 칩의 세부기술로는 생체물질을 고정시키는 기술, 고체 지지체를 생체물질 친화적으로 만드는 기술, 생체물질을 미세 배열하는 기술, 만들어진 칩 상에서 여러 가지 생체 반응을 실시하는 어세이 기술, 반응 결과를 감지하는 기술, 고정화 대상인 생체물질을 만드는 단백질 공학, 유전자 재조합 기술 등이 있다.
단백질 칩은 바이오 칩(biochip)의 한 종류로서, 다양한 종류의 단백질을 단위 면적의 고체상 지지체의 표면에 고집적 미세 배열(intense microarray)한 것이다. 최근, 이미 개발되어 상용화된 DNA 칩의 제작 원리 및 제작 기술 요소를 도입하여 단백질 칩을 제작하려는 노력이 행해지고 있다. 일반적으로, 상용화된 DNA 칩의 대부분은 코팅 물질로 표면을 전처리한 유리판 위에 DNA를 고정화시켜 제작한 것이다. DNA 칩의 제작에 사용되는 방법과 유사한 방법으로 단백질 칩을 제조하는 경우, 즉 코팅 물질로 표면을 전처리한 유리판 위에 단백질을 고정화하여 단백질 칩을 제조하는 경우는 고정되는 표적 단백질의 물리화학적 특성의 차이로 인해 다양한 문제점이 발생되고 있다.
초기 단백질 칩은 표면 처리된 유리판 위에 단백질을 그대로 부착시킨 후, 간단한 결합 분석(binding assay)을 수행하는 것이었으나, 고정화된 단백질의 활성 여부에 따라 실제 작동 여부가 좌우되어 본래의 목적을 달성하는데 어려움이 많았다 (MacBeath and Schreiber, Science 289:1760, 2000). 이러한 문제점은 전술한 바와 같이 단백질이 갖는 고유한 물리화학적 특성의 차이로 인하여 발생되는 단백질의 변성(denaturation) 혹은 불활성화, 분해(degradation) 등으로부터 야기되는 것이다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, DNA와는 구별되는 단백질의 특성에 부합하는 단백질 부착 표면 처리 기술 및 단백질 고정 물질 등에 대한 연구가 이루어지고 있다. 이에 대한 연구는 단백질 칩 표면상에 고정 반응을 일으키면서, 동시에 단백질의 활성을 유지하는 방법을 제공하는데 초점이 맞추어진 것으로서, 퍼킨 엘머(PerkinElmer)에 최근 인수된 패커드 바이오사이언스(Packard Bioscience)의 히드로겔(Hydrogel)™ 코팅 슬라이드, 프로링스(Prolinx)의 버사링스(versalinx) 칩, 지오믹스(Zyomyx)의 바이오 칩인 PDC 칩 등을 그 예로 들 수 있다.
한편, 졸-겔 공정은 미세 가공을 통해 미세 구조를 만드는데 이용되어온 기술로서, 특히 무기 물질에 생체 분자들을 화학적으로 부착시키는 대신 온화한 공정을 통해 결합망을 형성하고, 이 결합망 안에 생체 분자들을 공유 결합이 아닌 방법으로 고정화하는데 많이 이용되어 온 기술이다 (Gill I. and Ballesteros A.,Trends Biotechnol., 18:282, 2000).
나아가, 효소를 비롯한 많은 생체 분자들이 괴상 졸-겔 매트릭스 안에 고정되어 생체 촉매나 바이오센서의 제작에도 이용되고 있으며(Reetz, Adv. Mater., 9:943, 1997), 특히 투명한 광학적 성질 때문에 광학적 발색 검출에도 이용되고 있다 (Edminston, et al., J. Coll. Interf. Sci., 163:395, 1994). 또한, 생체 분자는 졸-겔 반응에 의해 고정화되면 화학적으로 안정화될 뿐 아니라, 열적으로도 매우 안정화된다고 알려져 있다 (Dave, et al., Anal. Chem., 66:1120, 1994).
바이오 센서의 경우, 상기 졸-겔 반응은 단순한 고정뿐만 아니라, 고체 지지체 위에 미세 구조를 형성하여 패턴화(patterning)하는 방법으로 이용되고 있다. 이때, 패턴화 방법은 유체역학을 이용하여 액체 상인 졸 상태에서 몰드로 모양을 만들어서 겔화시킨 후, 몰드를 떼내어 패턴을 만드는 것이다. 예컨대, 모세관 내 마이크로-모듈링(micro-moduling in-capillaries, MIMIC) 기법(Kim, J. Ferment. Bioeng., 82:239, 1995; Marzolin, Adv. Mater., 10:571, 1998; Schuller, et al., Appl. Optics., 38:5799, 1999)으로 지칭되는 기술은 중시(mesoscopic) 실리카를 패턴화하는 기술이다. 상기 기술은 미시 유체 공학의 기본적인 패턴화에 이용될 수 있다.
그러나, 단백질의 활성은 pH 등의 여러 인자에 의해 영향을 받기 때문에, 졸-겔 과정에서는 졸 상태에서부터 단백질을 첨가하여 활성을 유지하는 조건을 설정하는 것이 중요하다. 이를 위해, 중성 pH 등 여러 가지 온화한 조건을 이용하여 단백질과 졸을 함께 미리 섞어주어 단백질을 패턴화하는 기술(Kim, et al, Biotehnol. Bioeng., 73:331, 2001)이 발표되고 있지만, 중성 pH에서는 졸-겔 과정이 급격히 진행되어 첨가제의 선택에 따라서 균열이 생기거나 불투명하게 되는 등의 문제점이 있어 왔다. 또한, 단백질과 졸을 함께 미리 섞어주는 전처리과정 등을 거쳐야 하기 때문에 스팟의 농도가 불균일하기 쉬운 문제점도 있어왔다.
또한, 졸-겔 공정에 관한 선행 특허들로써, 생체 물질을 포함한 졸 혼합물을 칩 기재 상에서 겔화 반응시킴으로써, 생체 물질이 겔 매트릭스에 의해 형성된 포어 안에 담지되고 겔 매트릭스로 형성된 스팟에 의해 캡슐화된 상태로, 생체 물질의 반응성을 향상 시키는 졸-겔 바이오칩이 있고, 또는 이러한 졸-겔 공정을 이용한 바이오칩의 제조에 있어서, 고정된 생체 물질의 변형을 막거나, 민감도를 높이는 졸-겔 바이오칩용 졸 조성물의 스크리닝 방법에 관한 특허들이 있으나, 제조 방법이 복잡하며, 졸 조성물의 제작 과정에 있어서 생체 물질의 활성 저하, 파괴 등의 문제점이 발생되어 왔다.
이에, 본 발명자들은 졸 조성물의 제조시 생체물질의 활성 저하 및 파괴를 방지하기 위하여 예의 노력한 결과, 특정 실리케이트 단량체 및 첨가제를 특정 순서로 순차적으로 혼합하여 기판에 분주하거나, 이들을 순차적으로 기판에 직접 분주하여 겔화 시키는 경우, 종래 사용되어 오는 제조방법에 비해 겔화 시간을 늦추어 훨씬 균일한 바이오 칩을 제작할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 성분들에 의하여 생체물질의 활성 저하 및 파괴가 방지되어 민감도가 매우 우수한 바이오 칩을 제작할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은 졸겔물질을 키트화 하여 특별한 장비나 기술 없이도 누구나 쉽게 바이오칩을 만들고 분석할 수 있도록 하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 특정 졸 조성물을 순차적으로 혼합하여 기판에 분주하거나, 이들을 순차적으로 기판에 직접 분주하는 등의 제조 방법을 확립하여, 전처리과정 없이 균일한 바이오 칩을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오 칩을 이용한 표적 물질의 분석방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 일 구현예로,
(a) 졸-겔 키트 (SolB 키트) 에서 SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS 로 구성되어 있는 액체를 순차적으로 혼합하여, 탐지 물질 (예를 들어, 단백질) 과 섞은 뒤 기판에 분주하는 제조방법,
(b) 전처리 과정 없이 바이오칩을 제조하기 위해 SolB1, SolB2, SolB3 로 구성된 졸 조성물을 기판 위에 분주하는 단계; SolBH를 분주하는 단계; SolBS, 탐지 단백질 및 증류수를 포함하는 용액을 기판 위에 분주한 후 겔화시키는 단계를 포함하는, 졸 조성물의 겔화를 이용한 바이오 칩의 제조방법을 제공한다.
이 때, 사용될 수 있는 바이오 칩 제조를 위한 SolB 키트 중 SolB1, SolB2, 및 SolB3로서는,
(i) SolB 1 에서 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체;
(ii) SolB 2 에서 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체; 및
(iii) SolB 3 에서 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000 로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
구체적으로, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 졸 조성물의 겔화를 이용한 바이오 칩의 제조방법으로서,
(a) SolB1, SolB2 및 SolB3를 포함하는 졸 조성물에 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH (용액 I) 를 혼합하는 단계; (b) 완충액인 SolBS 와 증류수를 (a)단계에서 혼합된 용액과 혼합한 다음, -20~4℃에서 안정화 시키는 단계; 및 (c) 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 포함하는 용액을 (b)단계에서 안정화된 용액과 혼합하여 기판 위에 분주한 후 겔화시키는 단계,
이 때,
(i) 상기 SolB1 은 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체이고;
(ii) 상기 SolB2 는 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체이고; 그리고
(iii) 상기 SolB3 는 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제인 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는, 졸 조성물의 겔화를 이용한 바이오 칩의 제조방법으로서,
(a) SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성된 졸 조성물을 기판 위에 분주한 다음, HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH (용액 I) 를 분주하는 단계; 및 (b) 완충액인 SolBS, 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질 및 증류수를 포함하는 용액II를 기판 위에 분주한 후 겔화시키는 단계,
이 때,
(i) 상기 SolB1 은 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체이고;
(ii) 상기 SolB2 는 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체이고; 그리고
(iii) 상기 SolB3 는 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제인 것을 특징으로 하는 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법에서 사용되는, (i) 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체인 SolB1을 포함하는 제1용기; (ii) 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체인 SolB2를 포함하는 제2용기; (iii) 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제 인 SolB3을 포함하는 제3용기; (iv) HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH를 포함하는 제4용기; 및 (v) 완충액인 SolBS를 포함하는 제5용기로 구성되고,
상기 SolB1, SolB2 및 SolB3를 혼합한 졸 조성물에 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH, 완충액인SolBS와 증류수, 탐지 하기 위한 생물학적 물질 순으로 순서대로 혼합함으로써 졸 혼합물이 겔화되는 것을 특징으로 하는 바이오 칩 제조용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 방법 및 졸 조성물로 제조한 바이오 칩 및 이를 이용하여 생체물질인 표적 물질을 분석하는 방법으로써, 상기 방법으로 제조된 바이오 칩에 상기 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질과 상호작용가능한 표적 생물학적 물질을 함유하는 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 표적 생물학적 물질의 분석 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 졸 조성물(S-Sol), 용액 I 및 용액 Ⅱ로 제조한 졸 혼합용액을 어레이어로 분주하여 제작한 바이오 칩을 나타낸 것이다.
도 2는 5종의 HIV1 항원을 포함한 스팟에서 HIV 환자의 혈청에 대한 반응을 나타난 것이다. ①, ②, ③, ④, 및 ⑤ 은 HIV1 항체 진단을 위한 항원 마커로써 차례로 p24, p31, gp41, gp120, gp160 이다.
도 3은 연속적으로 희석한 항원을 포함한 스팟에서 연속적으로 희석한 HIV 환자의 혈청에 대한 반응을 나타낸 것이다.
도 4는 5 종의 HIV1 항원 각각을 포함한 스팟에서 HIV standard 혈청에 대한 반응을 정량화 하여 그래프로 나타낸 것이다. ①, ②, ③, ④, 및 ⑤ 은 HIV1 항체 진단을 위한 항원 마커로써 차례로 p24, p31, gp41, gp120, gp160 이다.
도 5는 감염 후 날짜별로 채취한 HIV1 환자의 혈청에 대해 본 발명의 바이오 칩과 기존의 진단키트를 이용한 검출 결과를 비교한 표이다.
도 6은 sciFLEXARRYER S11를 이용하여 제작한 칩의 Axon GenePix scanner 스캔 사진(A) 및 카메라 이미지 사진(B)이다.
도 7은 본 발명에 따른 캡슐화 구조 안에 탐지 단백질을 포함하면서 표면에 미세 채널을 가지는 바이오 칩의 형상을 도식화한 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 바이오 칩(오른쪽)과 종래 방법에 따른 바이오 칩(왼쪽)의 균질도를 비교한 사진이다.
도 9는 본 발명에 따른 졸 혼합물 (A) 와 순서 없이 용액을 혼합하였을 때의 졸 혼합물 (B) 의 균질도 및 겔화되는 속도를 비교한 사진이다.
도 10은 본 발명에 따른 단백질 칩을 이용하여 특정 단백질을 분석한 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 단백질 칩을 이용하여 특정 항원을 분석한 결과이다.
도 12는 본 발명에 따른 단백질 칩을 이용하여 특정 질병에 대한 항체를 분석한 결과이다.
도 13는 본 발명에 따른 졸겔칩을 이용하여 특정 화합물 (비스페놀 에이) 와 DNA 압타머의 결합을 확인한 결과이다.
도 14은 본 발명에 따른 졸-겔 바이오 칩을 상용화한 제품의 이미지이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
일 관점에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 졸 조성물의 겔화를 이용한 바이오 칩의 제조방법으로서,
(a) SolB1, SolB2 및 SolB3를 포함하는 졸 조성물에 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH (용액 I) 를 혼합하는 단계;
(b) 완충액인 SolBS 와 증류수를 (a)단계에서 혼합된 용액과 혼합한 다음, -20~4℃에서 안정화 시키는 단계; 및
(c) 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 포함하는 용액을 (b)단계에서 안정화된 용액과 혼합하여 기판 위에 분주한 후 겔화시키는 단계,
이 때,
(i) 상기 SolB1 은 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS) 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체이고;
(ii) 상기 SolB2 는 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체이고; 그리고
(iii) 상기 SolB3 는 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000 으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제인 것을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 SolBH는 1mM 에서 100mM 인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SolBS은 1mM 에서 100mM 농도 범위의 NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4 로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액일 수 있다.
졸-겔 법을 이용하여 바이오 칩을 제작하는 종래의 방법에서는, 졸 조성물, 완충액, 및 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질 등을 순서없이 임의로 혼합하여 우선 졸 혼합용액을 만든 후에 진공 처리 등의 후처리를 거쳐 겔화 시키는 방법이 이용되어 왔다. 또한, 졸 조성물과 완충액 및 탐지 단백질을 혼합하는 방법은 볼텍스 (vortex) 나 초음파 진동 (ultrasonic) 을 이용하는 방법 등이 있으며, 졸-겔의 모양을 만드는 방법 또한 기판용 웰 위에 스팟을 형성하거나, 표면을 졸-겔로 코팅하거나 틀에 부어 넣은 뒤 겔화시키는 방법 등이 이용되어 왔다.
이와 같은 방법은 졸 조성물 혼합용액으로 형성시킨 스팟마다 함유하고 있는 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질의 농도가 일정하지 않을 수 있고, 또한 실시자에 따른 농도 역시 차이가 날 수 있으며, 혼합할 때 오염 가능성이 크며, 샘플에 따라 졸겔 혼합물의 점도가 변화하기도 하므로 스팟의 형성 정도나 모양, 크기에서의 차이가 있을 수 있다. 따라서, 이러한 문제점들을 해결할 수 있는, 균질의 바이오 칩을 제조할 수 있는 방법의 필요성이 존재하여 왔다.
본 발명의 바이오 칩 제작방법에 따르면, 졸-겔법을 이용하여 간편하면서도 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질이 스팟마다 균일한 농도를 이루고 있어 보다 정확하고 높은 효율로 생물학적 물질의 탐지가 가능하다.
본 발명의 바이오 칩의 제조방법의 일 태양의 구체적인 설명은 이하와 같다,
우선, 제1실리케이트단량체인 SolB1, 제2실리케이트단량체인 SolB2 및 첨가제인 SolB3 를 순서대로 혼합하여 졸 조성물을 제조한다.
상기 SolB1 은 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 사용한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 제1실리케이트 단량체의 성분으로 TEOS를 선택하여 사용하였다.
그리고, 상기 SolB2 는 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 사용한다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 제2실리케이트 단량체의 성분으로 DGS를 선택하여 사용하였다.
그리고, 상기 SolB3 는 첨가제로서, 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000 으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 첨가제로서 PEG를 선택하여 사용하였다.
상기 제1실리케이트, 제2실리케이트 단량체 및 첨가제는 단량체 내부 생체물질의 성질이나 만들려고 하는 졸겔칩의 모양에 따라 필요에 의해 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 바이오 칩 제조용 졸 조성물에서, 제1실리케이트단량체는 졸 조성물 전체 부피 대비 약 2~30 부피%, 상기 제2실리케이트단량체는 약 2~8 부피%, 그리고 첨가제는 약 0~5 부피%로 포함되는 것이 바람직하다. 이 때, 상기 졸 조성물은 흡입 시 유해하므로 통풍이 잘되는 곳에서 제조한다.
본 발명의 상기 바이오 칩 제조용 상기 졸 조성물은 겔화시켰을 때, 공극에 의한 미세 채널을 형성하는 것을 특징으로 한다. 즉, 이러한 채널이 분석할 표적 물질과 상호작용을 일으킬 수 있게 되는 수단이 되는 것이다. 특히, 상기 (iii) 구성요소의 첨가제는 겔 내의 채널 크기를 조절하기 위해 이용되는 성분이다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 어레이어 없이 손으로 스팟팅을 수행하거나, 비접촉형 어레이어를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, (c) 단계에서 사용되는 기판은, 사용되기 전에 미리 이슬점 이상의 온도로 최적화되고, 여기서, 이슬점 이상의 온도라고 하는 것은 기판에 이슬이 맺히기 시작하는 온도보다 높은 온도를 의미하는 것이며, 습도 조건에 따라 이러한 이슬점은 달라질 수 있으며, 예컨대, 상대 습도 50% 이상에서 대기 온도가 20℃ 일 때 8.6℃이고, 통상은 습도 70~80%에서 14~17℃이다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA), 플라스틱, 실리콘, 유리 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질은 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 및 세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (a)단계에서 혼합된 용액, 졸 혼합물은 온도 -20~4℃ 의 조건에서 30분 이상 방치하여 안정화시킬 수 있고, 어레이어에서 졸 조성물을 넣을 용기는 이슬점 이상의 온도, 통상 14~17℃ (습도 70~80% 시 이슬점 온도 이상), 분주 환경은 습도 70~80%, 대기 온도 20℃ 의 조건을 맞추어 졸겔에 최적화 시킬 수 있다.
이러한 안정화 및 최적화 과정을 통하여, 졸 조성물의 겔화 되는 속도를 늦추어 스팟 형성을 용이하게 하고 겔화된 후 스팟의 갈라짐을 방지하며 칩 내의 미세 채널이 잘 형성될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 졸 조성물과 SolBH와 SolBS의 혼합 용액, 증류수 및 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질은 각각 3: 1: 4 와 1: 2: 8 사이의 범위로 혼합될 수 있고, 상기 SolBH 및 SolBS의 농도는 1mM ~ 100mM 일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 SolBS : 증류수 : 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질의 부피비는 1:2:1 와 2:5:1 사이의 범위이다.
본 발명에 있어서, 상기 완충액은 pH 3~8 범위의 소디움 포스페이트 (sodium phosphate)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 미리 플라즈마 표면처리 되거나, 에칭되거나, PDMS 나 실리케이트 단량체 또는 고분자 물질로 처리된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 다음 단계를 포함하는, 졸 조성물의 겔화를 이용한 바이오 칩의 제조방법으로서,
(a) SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성된 졸 조성물을 기판 위에 분주한 다음, HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH (용액 I) 를 분주하는 단계; 및
(b) 완충액인 SolBS, 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질 및 증류수를 포함하는 용액II를 기판 위에 분주한 후 겔화시키는 단계,
이 때,
(i) 상기 SolB1 은 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS) 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체이고;
(ii) 상기 SolB2 는 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체이고; 그리고
(iii) 상기 SolB3는 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000 으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제이고;
(iv) 상기 SolBH 용액은 1mM 에서 100mM 농도 범위의 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 1 종 이상의 용액이며;
(v) 상기 SolBS 용액은 1mM 에서 100mM 농도 범위의 NaH2PO4, Na2HPO4, 및 Na3PO4 로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 용액인 것을 특징으로 하는 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, (c) 단계에서 사용되는 기판은, 사용되기 전에 미리 이슬점 이상의 온도로 최적화되고, 여기서, 이슬점 이상의 온도라고 하는 것은 기판에 이슬이 맺히기 시작하는 온도보다 높은 온도를 의미하는 것이며, 습도 조건에 따라 이러한 이슬점 은 달라질 수 있으며, 예컨대, 상대 습도 50% 이상에서 대기 온도가 20℃ 일 때 8.6℃이고, 통상은 습도 70~80%에서 14~17℃이다.
이러한 최적화 과정을 통해, 각 용액을 순서대로 분주 시 졸 조성물의 겔화 되는 속도를 늦추어 스팟 형성을 용이하게 하고 겔화된 후 스팟의 갈라짐을 방지하며 칩 내의 미세 채널이 잘 형성될 수 있도록 할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 졸 조성물의 분주 후 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 용액 I 인 SolBH 를 그 위에 분주한다. 용액 I 은 상기 졸 조성물의 겔화를 유도하기 위한 pH 환경을 조성하는 역할을 한다. 상기 HCl, H2SO4, HNO3 또는 CH3COOH의 농도는 5~30mM가 바람직하다. pH 1~3 으로 적정시킨다.
마지막으로, 완충액인 SolBS, 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질 및 증류수를 포함하는 용액 II 를 기판 위에 분주하여 겔화시킨다.
본 발명에 있어서, 상기 SolBS는 pH 3~8 범위의 소디움 포스페이트 (sodium phosphate)일 수 있다.
상기 완충액 및 2차 증류수는 생체물질(예를 들어, 단백질)의 파괴를 방지하는 기능을 가진다. 생체물질은 적정 범위를 벗어난 pH에서는 활성이 저하되거나 파괴되기 쉽고, 졸의 겔화는 pH가 높을수록 천천히, pH가 낮을수록 빨리 진행되므로, 생체물질의 활성 저하 및 파괴를 방지하면서 적정 시간 동안 겔화를 수행할 수 있도록 pH를 적정하는 것이 중요하다. 통상적으로, 생체물질은 pH 5~8의 범위에서 안정적으로 존재하므로, 특히, 상기 용액 I 에 따른 pH 환경이 생체물질의 파괴하는 것을 방지하기 위해서 상기 완충액을 사용한다. 사용할 수 있는 완충액은 특별히 제한되는 것은 아니며, 첨가하는 생체물질에 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 본 발명에서는 pH 3~8 범위의 소디움 포스페이트 (sodium phosphate) 버퍼를 사용하였다. 또한, 용액 II 에 포함되어 있는 “표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질” 또는 “생체물질”이라 함은 검출하고자 하는 대상물질(예, 표적 단백질)과 상호 작용할 수 있는 생체 내의 물질을 지칭하는 것으로, 예를 들어, 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 또는 세포 등이 될 수 있다. 이러한 탐지 단백질 또는 생체물질을 용액 II 에 포함시키기 위하여 적당한 버퍼(buffer)용액을 사용할 수 있다. 즉, 실시를 위한 생체물질을 버퍼 용액에 넣어 검출을 위한 샘플 용액(sample solution)을 만든다. 예를 들어, 상기 생체물질이 단백질인 경우에는 PBS buffer (phosphate-buffered saline)를 섞어 사용하고, 효소 반응(enzyme reaction)이 있을 때에는 HEPES, NaCl, EDTA 등을 필요에 따라 적절히 농도를 달리하여 섞어 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 대상물질(표적 단백질)로 HIV1 (Human Immunodeficiency virus 1) 환자의 항체를 사용하였고, 상기 탐지 단백질로 상기 HIV 항체에 결합할 수 있는 5 종의 항원 마커를 PBS 버퍼에 섞어 사용하였다.
이 때, 상기 용액 II 에서 완충액인 SolBS : 증류수 : 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질의 혼합되는 부피비는 1:2:1 에서 2:5:1 사이의 범위인 것이 바람직하며 가장 바람직하게는 1 : 2 : 1이다. 예를 들어, 용액II 전체중량 기준으로 완충액은 약 20~30 부피%, 증류수는 약 40~60% 부피%, 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질은 20~30 부피%일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 완충액은 10㎕, 증류수는 20㎕, 탐지 단백질(표적 단백질과 상호작용하는 생물학적 물질) 등을 포함하는 용액 10㎕로 혼합하여 사용하였다.
본 발명은 상기 졸 조성물, 용액I 및 용액 Ⅱ를 정확한 양으로 순차적으로 분주함으로써 균질한 바이오 칩을 제작하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 분주되는, 상기 졸 조성물 : 용액 I : 용액 Ⅱ의 분주량의 비는 3:1:4 에서 1:2:8 사이 인 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 3:1:4이다. 예를 들어, 상기 졸 조성물의 분주량은 25~35㎕가 바람직하고, 약 30㎕가 가장 바람직하다. 상기 용액I 의 분주량은 5~15㎕가 바람직하고, 약 10㎕가 가장 바람직하다. 상기 용액 II 의 분주량은 35~45㎕가 바람직하고, 약 40㎕가 가장 바람직하다.
본 발명에 따른 바이오 칩 제조방법에서 졸 조성물과 용액 I 및 용액 II 를 미리 혼합한 뒤 기판에 분주할 때는 비접촉형 어레이어 (non-contact arrayer) 를 사용하거나, 파이펫 혹은 다른 도구를 이용하여 직접 손으로 스팟팅 하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 전처리 과정이 없는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 전처리 과정은, (i) SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, 또는 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 혼합하는 과정; (ii) 혼합한 후 볼텍싱(vortexing)하는 과정; 및 (iii) 상기 혼합된 용액을 안정화하는 과정으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성된 졸 조성물, SolBH, SolBS 및 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 분주 전에 용기에 담아 노즐을 이용하여 빨아올리는 형태로 분주할 수 있다.
아울러, 본 발명에 있어서, SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성된 졸 조성물, SolBH, SolBS 및 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 분주 전에 미리, 분주하는 노즐이 연결되어 있는 대용량 카트리지에 넣어, 한번에 분주하는 양이, 노즐을 이용하여 빨아올리는 형태로 분주하는 것에 비해 100배 이상이어서 대량 생산이 가능하다.
전처리 과정 없이 기판 위에 직접 졸 조성물과 용액 I 및 용액 II 를 순차적으로 분주하여 칩을 제작할 때는 정확한 양으로 분주해 주는 어레이어(arrayer)를 사용하여 실시될 수 있다. 이 때, 상기 졸 조성물, 용액 I 및 용액 II 를 정확한 부피로 분주하는 데 사용될 수 있는 어레이어로는 비접촉형 어레이어(non-contact arrayer)를 사용하는 것이 바람직하다.
바이오 칩 상에서 탐지 물질을 정렬(array)시키는 방식에 따라 '접촉형'과 '비접촉형'으로 구분하는데, 접촉형 어레이어는 매우 가는 공간이 속에 있는 핀(pin) 등을 이용해서 탐지 단백질을 칩 표면에 정렬시킨다. 이러한 방법은 탐지 단백질이 포함된 용액이 핀 바깥으로 약간씩 빠져 나와 표면에 직접 접촉되어 정렬되는 방식으로, 짧은 시간에 여러 종류의 탐지 단백질을 정렬시킬 수 있는 장점이 있으나 용액의 부피를 정확하게 조절할 수 없으므로 균일성이 낮아질 수 있다. 반면 비접촉형 어레이어는 가는 관에 탐지 단백질이 포함된 용액을 넣고 칩 표면의 바로 위에 위치 시킨 후 관에 일정한 압력을 가함으로써 직접적인 접촉 없이 표면 위에 정렬시키는 방법이다. 이 방법은 분주되는 용액의 부피를 정확하게 결정하는 것이 가능한 장점이 있다. 따라서 전처리 과정 없이 졸 조성물과 용액 I 및 용액 II 를 순차적으로 분주하여 칩을 제작할 때 각 용액의 분주되는 부피를 비율에 맞게 조절할 수 있으므로 본 발명에서는 이러한 비접촉형 어레이어를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 졸 조성물; HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 용액I; 및 상기 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질, 완충액 및 증류수의 혼합용액인 용액Ⅱ를, 정확한 부피를 분주해 주는 비접촉형 어레이어를 이용하여 순차적으로 기판용 웰 상에 분주시킬 수 있다. 표면에 분주되어 있는 작은 스팟에 다른 용액이 분주될 때 용액의 표면장력 때문에 전체 용액은 퍼지지 않고 스팟 모양을 형성하게 되는데 용액이 떨어질 때 발생하는 표면 에너지가 진동으로 전환되고 이에 의해 스팟 내에서 물질의 흐름 (대류)이 발생하여 두 용액이 잘 섞이게 된다. 이러한 원리를 이용하여 본 발명에서는 전처리 없이 표면에 직접 스팟팅을 통해 졸-겔 칩을 제작하는 자동화 방법을 고안하였다.
예를 들어, Scienion AG사의 Microarrayer를 사용할 수 있다. 특히, Scienion AG사의 dew point control technology 를 이용하면, 플레이트 표면에 습기가 응결되어 생기는 농도의 불확실성을 최대한으로 배제할 수 있어 보다 정확한 부피 및 크기의 스팟이 제작 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 어레이어로 sciFLEXARRAYER S11(Scienion AG, 독일)를 사용하였다.
즉, 본 발명에서는 바이오 칩 제작 시에 상기 비접촉형 어레이어를 이용하여 기판에 각각의 용액을 정확한 부피만큼 분주해 주는 것만으로 바이오 칩을 보다 간편하게 만들 수 있고, 종래 방법처럼 졸-겔 모노머(sol-gel monomer), 완충액, 탐지 단백질 샘플 등을 미리 혼합하는 (premixing) 등의 전처리 과정이 필요 없으므로 보다 균질한 바이오 칩 제작이 가능하다.
한편, 본 발명에서 사용하는 기판은, 졸 조성물이 겔화되었을 때 투명하다는 성질을 이용한 것이기 때문에, 상기 기판용 웰(well) 또는 슬라이드 또한 좋은 투명도를 유지할 수 있는 재료로 만들어진 것이어야 좋다. 예를 들어, 투명성이 매우 좋은 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA) 성분과 같은 플라스틱, 실리콘이나 유리 성분으로 제작된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 기판은 폴리메틸메타크릴레이트 이외에도, 플라스틱, 실리콘, 유리 등에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 기판은 졸 혼합용액이 겔화되면서 기판에 고정될 수 있도록 표면처리가 되어있어야 한다. 본 발명의 바이오 칩의 중요한 조건 중 한 가지는 졸 혼합용액이 겔화되면서 기판에 강하게 고정되어, 표적 물질이 들어있는 용액과 반응시킬 때 스팟이 떨어지지 않아야 한다는 점이다. 따라서, 상기 바이오 칩을 이용한 표적 물질 분석에 있어서, 표적 물질과 반응시킨 후 강한 세척과정이 필요하고, 따라서, 이러한 물리적 힘을 극복하기 위해서는 스팟의 강한 고정이 필수이며, 이를 위해 표면처리 되지 않은 플라스틱 기판, 플라즈마로 표면처리 된 플라스틱 기판이나 표면처리 되지 않은 유리 기판, 표면처리된 유리 기판 (예컨대, 에칭 (etching) 된 유리 기판 등), 혹은 포러스 구조를 가지는 실리콘 칩 등을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 기판은 미리 플라즈마 표면처리 되거나, 에칭되거나, PDMS 나 실리케이트 단량체 또는 고분자 물질로 처리된 것일 수 있다.
본 발명의 바이오 칩 제조방법에 있어서, 어레이어를 사용함에 있어 주의해야 할 사항은 다음과 같다.
첫째, DNA 칩과는 달리 상기 바이오 칩은 졸이라는 특수한 재료를 사용하고 시간이 지남에 따라 겔화되는 성질이 있기 때문에 어레이어를 이용하여 분주하는 중간에 졸이 겔화되지 않도록 가능한 한 빠른 시간 안에 분주시키는 것이 매우 중요하다.
둘째, 습도와 온도이다. 기판에 스팟이 찍힘과 동시에 주위의 습기 양과 온도에 따라 상기 스팟이 겔화 되는 속도 및 스팟의 활성이 좌우되기 때문에, 초기의 습도와 온도가 매우 중요하다. 그러므로 항시 상기 졸-겔을 이용한 바이오 칩을 제작 시에는 어레이어 주변의 습도와 온도를 사전에 맞춰놓는 것이 매우 중요하다.
본 발명에서 바람직한 습도는 약 50% 이상, 또는, 더욱 구체적으로는 70~80%이다. 그리고 바람직한 온도는 약 25℃이하, 더욱 구체적으로는 상온의 범위라고 할 수 있는 10~25℃의 범위이다. 특히, 스팟의 겔화에 있어서 초기의 높은 습도가 중요한 요인이므로, 반드시 arraying 전 습도를 80% 정도로 준비하여야 하고, 또한, 온도가 25℃ 이상일 경우에는 졸의 겔화가 빨리 진행되는 경향이 있으므로 최대한 낮은 온도에서 실험하는 것이 좋다.
이처럼 사전의 온도, 습도 준비와 빠른 시간 안에 집적시킬 수 있는 프로그램을 준비한 후, 각 용액들을 단계별로 분주하게 된다.
본 발명에 있어서, 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질은 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 또는 세포일 수 있다.
본 발명은 또한, 다른 관점에서, 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체인 SolB1 을 포함한 제1용기; 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체인 SolB2 를 포함한 제2용기; 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제 인 SolB3 를 포함하는 제3용기; (iv) HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH를 포함하는 제4용기; 및 (v) 완충액인 SolBS를 포함하는 제5용기로 구성되고,
상기 SolB1, SolB2 및 SolB3를 혼합한 졸 조성물에 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH, 완충액인 SolBS와 증류수, 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질 순으로 순서대로 혼합함으로써 졸 혼합물이 겔화되는 것을 특징으로 하는 바이오 칩 제조용 키트에 관한 것이다.
상기 용기는 그 재질에 제한이 없으며, 이러한 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 바이오 칩을 이용하여 표적 생물학적 물질을 분석하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 방법으로 제조된 바이오 칩에 상기 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질과 상호작용가능한 표적 생물학적 물질을 함유하는 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 표적 생물학적 물질의 분석 방법에 관한 것이다. 여기서, 상기 표적 생물학적 물질은 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 및 세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 표적 생물학적 물질을 탐지할 수 있는 방사성 동위원소 또는 형광염료 혹은 다른 종류의 표지물질로 표지된 단백질, 압타머 등의 생체물질과 추가로 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
앞서 설명한 바에 의하여, 표적 생물학적 물질과 반응 시킬 바이오 칩이 준비된 후 실제 표적 생물학적 물질이 들어 있는 용액과 반응시킨다. 반응 용액은 96-웰(well) 타입의 경우 50 ~ 100 ㎕의 양이 적절하며, 반응 시간은 1시간으로 한다. 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질과 상호작용하는 표적 생물학적 물질도 역시 생체 내 물질로서, 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 또는 세포일 수 있다.
표적 생물학적 물질이 들어있는 반응용액은 스팟 내의 미세 공극구조를 통해 스팟 내로 스며들어 캡슐 구조 안에 고정되어 있는 생물학적 물질과 만나 상호작용을 통해 결합하게 된다 (1st incubation). 상기 반응 후, 스팟 내에서 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질과 결합된 표적 생물학적 물질을 분석하기 위하여, 상기 표적생물학적 물질을 탐지할 수 있도록 표지 인자인 표지 단백질과 반응시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 형광염료(Cy3)가 부착된 표적 단백질에 대한 항체를 사용하였다 (2nd incubation). 이 때 반응시간은 30분으로 하며 반응 용액의 양은 50 ~ 100㎕로 한다. 위의 1st, 2nd incubation과정은 모두 실온에서 수행한다. 표적 생물학적 물질이 들어 있는 반응 용액이 여러 물질이 섞여 있는 혼합물의 경우에 바이오 칩에 들어 있는 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질과의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 1st 인큐베이션 과정 전에 블로킹 (blocking) 과정을 수행할 수 있다. 이 과정에 필요한 블로킹 용액은 skim milk 나 BSA (bovine serum albumin) 혹은 IgG 와 같은 것이 사용될 수 있다.
상기 1st, 2nd 인큐베이션을 마친 후에는 세척과정(washing)을 거치게 되는데, 세척액의 성분으로는 통상적인 것을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예서는 0.2% Tween-20 이 포함되어 있는 PBS 버퍼를 사용하였다. 세척기로는 ELISA용 washer를 사용한다 1st 세척공정으로, 4번의 세척을 수행하고 2nd 세척공정으로 4번의 세척을 실시한다. 상기 세척공정을 거친 후 웰에서 용액이 모두 제거 될 때까지 건조시킨다.
건조과정이 끝난 후 형광염료를 탐지할 수 있는 이미지 스캐너를 통해 반응을 일으킨 웰을 스캔하여 실제 반응여부를 알 수 있고, 이미지를 소프트웨어를 이용하여 진하기 정도를 측정해 봄으로써 어느 정도의 반응을 일으켰는지를 알 수도 있다. 즉, 본 발명의 표적 생물학적 물질을 분석하는 방법은 방사성 동위원소, 형광염료, 발광성물질, 염료 혹은 다른 종류의 표지물질 등으로 표지된 단백질 또는 압타머 등의 생체물질과 추가로 반응시키는 단계를 포함한다. 이 때, 압타머란 높은 친화성으로 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 특이적으로 인지할 수 있는 작은 단일가닥 올리고핵산을 일컫는다.
본 발명은 또한 상기 제조방법에 의해 제조된 바이오 칩을 포함하는 검출용 키트를 포함한다.
탐지 생물학적 물질 검출용 키트는 병, 통(tub), 작은 봉지(sachet), 봉투(envelope), 튜브, 앰플(ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 바이오칩 제조용 각 구성용액의 제조
다음 표 1에 예시된 성분들 중 각각 하나씩을 선택한 SolB1 20㎕, SolB2 6㎕ 및 SolB3 4㎕를 혼합하여 졸 조성물을 제조하였다. 그리고, 용액 I 으로는 10㎕의 SolBH를 준비하였다.
표 1 각 용액의 성분
구분 성분
SolB1 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종의 제1 실리케이트 단량체
SolB2 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS) 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily), propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종의 제2 실리케이트 단량체
SolB3 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종의 첨가제
SolBH HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 1종
다음으로, NaH2PO4, Na2HPO4, Na3PO4 로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 SolBS 10㎕ 및 2차 증류수(double distilled water, DDW) 20㎕를 섞는 한편, HIV1 항체와 상호 작용할 수 있는 5종의 탐지 단백질 (p24, p31, gp41, gp120 및 gp160)약 10~200ng씩을 PBS buffer에 섞어 샘플용액 10㎕를 만들어 이를 상기 혼합물에 첨가한 후, 5초 동안 볼텍싱하고 스핀-다운하여 용액 II를 제조하였다.
표 2 졸 조성물, 용액 I, 용액 II 및 탐지 단백질의 구성 성분
구성 성분
졸 조성물 SolB1 20㎕, SolB2 6㎕ 및 SolB3 4㎕
용액I SolBH 10㎕
용액II SolBS 10㎕ 및 DDW 20㎕5종의 HIV1 항원 포함 PBS solution 10㎕
실시예 2: 바이오 칩의 제작
(1) 기판용 웰의 준비
플라즈마 표면 처리되어 시판되고 있는 PMMA 96-웰 플레이트를 SPL사 (한국)로부터 구입하여 준비하였다.
(2) 바이오 칩(단백질 칩)의 제작
단백질 칩을 제작하기 위하여, 스팟팅하기 전에 온도 16℃, 습도 80%로 어레이어를 셋팅하였고, 상기 실시예 1에서 수득된 졸 혼합용액을 넣을 소스 웰(source well)로는 일반 384-웰을 준비하고, 표적 웰(target well)로는 상기 (1)의 PMMA 96-웰 플레이트를 준비하였다. 그리고 설정한 대로 정확한 부피를 분주해주는 sciFLEXARRYER S11(Scienion사, 독일) 어레이어를 준비하였다.
그 다음, sciFLEXARRYER S11 (Scienion사, 독일) 어레이어의 source plate에, 상기 실시예 1에서의 SolB1 20㎕, SolB2 6㎕ 및 SolB3 4㎕를 혼합하여 제조한 졸 조성물 30㎕, SolBH 10㎕ (용액 I) 및 상기 용액 II 40㎕씩 각각 어레이어의 소스 플레이트에 넣어주었다.
미리 준비한 PMMA 96-웰 플레이트 상에 상기 졸 조성물, 용액 I 및 상기 용액 II을 순서대로 정해진 부피량 만큼을 분주하였다. 분주되는 양이 스팟 당 450pl이하가 되도록 하였으며, 이 때, 노즐 PDC90(ScienionAG, 독일)을 사용하였다. spotting frequency는 500Hz로 하였다. 형성된 스팟 크기는 약 300 ㎛ 정도였다(스팟 당 8 drops).
도 6에 532 nm에서 Axon GenePix scanner(Axon사)로 스캔한 사진 A 및 카메라가 장착된 sciFLEXARRAYER에 의한 이미지 사진 B를 도시하였다. 단백질 칩 상의 서로간의 스팟 간격(dot pitch)은 600㎛였다.
비교예 1: 종래의 단백질 칩과의 균질도 비교
본 발명의 방법에 따른 단백질 칩이 기존에 사용되고 있는 단백질 칩과 비교하여 현저히 우수한 균질도를 가지고 있는지 여부를 확인하였다.
우선, 대조군으로 공지되어 있는 기존의 방법에 의하여 단백질 칩을 제작하였다. Silicate monomer, HCl, DW, SP 및 샘플 용액을 순차대로 혼합하여 제조한 후, pin arrayer를 이용하여 source plate에 분주된 혼합용액을 PMMA 96-웰 플레이트에 스팟팅하였다. pin arrayer로는 OnmiGrid Accent Arrayer(Genomic Solutions, 미국)를 사용하였다.
그리고, 실시예 1 및 2의 방법으로 제작한 본 발명의 방법에 따라 제작된 단백질 칩의 카메라 이미지 사진(도 6의 B)과, 상기 방법에 따라 제작된 단백질 칩이 현미경에서 관찰되는 상을 디지털 카메라로 찍어 비교하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이 본 발명의 특정 졸 조성물의 사용 및; 용액 I, 용액 II와 혼합하는 전처리 공정없이 순차적으로 분주함으로써 제작된 단백질 칩의 경우에는 스팟의 모양 및 크기가 일정하게 배열되어 있으나, 종래 방법에 따른 경우 스팟의 모양이나 크기가 일정하지 않았다. 즉, 본 발명에 따른 단백질 칩이 기존의 단백질 칩보다 그 균일한 정도가 현저히 우수함을 확인할 수 있었다.
비교예 2: 순서를 다르게 혼합하였을 때의 비교
본 발명의 방법에 따른 혼합 순서대로 용액을 혼합하였을 때와 순서를 다르게 혼합하였을 때 졸 혼합물의 차이를 비교하였다.
본 발명의 혼합 순서에 따라 SolB1, SolB2 및 SolB3 로 된 졸 조성물에 차례대로 SolBH 와 SolBS 및 증류수와 버퍼 용액을 섞어 혼합물을 준비하였고, 비교를 위해 동일한 용액을 사용하되 SolBH 를 맨 마지막에 섞어 혼합물을 준비하여 두 혼합물의 차이를 디지털 카메라로 찍어 비교하였다.
그 결과 도 9 에 나타난 바와 같이 본 발명의 혼합 순서를 지켜 혼합물을 준비하였을 때는 용액이 서로 잘 용해되어 맑고, 오랫동안 겔화가 진행되지 않았으나 (도9의 A), 혼합 순서를 다르게 하여 준비하였을 때는 용액이 잘 녹지 않았고, 겔화도 빨리 진행됨을 확인할 수 있었다 (도 9의 B).
실시예 3: 단백질 칩을 이용한 HIV 분석 및 진단
상기 실시예 2에서 제작된 단백질 칩을 10% skim milk 용액을 이용하여 블로킹 (blocking) 해준 후, 각 웰에 희석된 HIV 환자의 혈청을 50㎕씩 넣고, 실온에서 1시간 동안 1차 배양하였다. 1차 배양이 끝난 후, 혈청을 제거하고, ELISA용 세척기를 이용하여 0.2% Tween-20 이 포함된 세척액을 넣고 5 분간 볼텍스 (vortex) 하는 단계를 4회 반복하였다 (1차 세척). 상기 1차 세척 후, Cy3 형광물질로 표지되어 있으며, 인간의 항체를 인지하는∂-Human 항체 (∂-Human-Cy3, Jackson ImmunoResearch) 를 희석하여 50㎕를 넣고, 실온에서 1 시간 동안 2차 배양하였다. 상기 2차 배양 후, ∂-Human-Cy3를 제거하고, ELISA용 세척기를 이용하여 세척액을 넣고 5분간 볼텍스 하는 단계를 4회 반복하였다 (2차 세척).
상기 2차 세척 후, 반응이 종결된 웰을 실온에서 10분 이상 방치하여 건조시키고, 레이저 스캐너인 FUJI FLA-9000 이미지 스캐너로 반응이 일어난 스팟을 스캐닝하였다. 또한, 이미지 분석 프로그램인 ImageQuant TL을 이용하여 반응이 일어난 각 스팟의 형광 신호의 세기를 측정하고 정량화하여 반응이 일어난 정도를 분석하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 환자 혈청에 따라 5개의 마커들 (p24, p31, gp41, gp120 및 gp160 (Abcam사, Fitzerald사에서 입수) 이 각각 혈청에 대해 반응을 나타내었으며 항원 마커가 들어가지 않은 음성 대조군 칩은 반응을 나타내지 않았다.
도 3은 5종의 항원 중 가장 반응이 잘 일어났던 4종의 항원 (p24, p31, gp41, gp120)과 HIV1 의 O-type 항원 1종을 연속적으로 희석하여 웰에 스팟팅하고, HIV 표준 혈청을 차례로 희석한 것과 반응시킨 결과를 나타낸 것으로, 예상대로 quantification이 정량적으로 이루어 졌음을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 바탕으로, 본 발명에서 제작한 단백질 칩 상에서 항원-항체 반응이 특이적으로 일어난다는 것을 알 수 있다.
도 4 는 5종의 항원을 각각 포함하는 스팟에서 HIV1 standard 혈청에 대한 반응을 정량화한 결과를 나타낸 것이다. 도면의 X 축은 표준 혈청을 기존의 ELISA 진단키트로 HIV 를 진단하였을 때 측정된 타이터 (Titer) 를 나타낸 것으로 본 발명의 단백질 칩의 분석 결과와 기존 진단칩으로 분석한 결과가 상관성이 있음을 보였다. X 축의 PRB204-00 은 Bostonbiomedica, Inc. 에서 구매한 환자의 혈청 표준샘플이며 제품명은 Anti-HIV1 mixed titer performance panel 이며 제품 번호는 PRB204(M) 이다. Titer 값은 기존의 진단키트로 측정한 s/co 값으로써 signal to cut-off (양성과 음성의 기준치) ratio 를 나타내는 것이며 1 이상일 때 양성으로 한다. 도면의 Y 축은 스팟의 형광 신호의 세기 (“signal”) 값을 음성 대조군 스팟의 형광 신호의 세기 (“control”) 값으로 나눈 값을 말한다.
도 5 는 HIV 감염된 환자에서 날짜 별로 채혈한 seroconversion panel 에 대한 반응을 기존의 진단 키트와 비교한 표이다. 환자의 혈청은 Bostonbiomedica, Inc. 에서 구매한 표준샘플이며 기존의 진단키트를 이용한 검출 결과 또한 표준 샘플과 함께 제공받은 것이다. 이 샘플의 제품명은 Anti-HIV1 seroconversion panel V 이고, 제품번호는 PRB922 이다.
감염된지 얼마 되지 않았을 때는 기존의 항체 진단 ELISA 진단키트로는 HIV 감염을 검출해 내지 못하였으나 본 발명의 단백질 칩에서는 항원 검출 키트와 마찬가지로 감염 초기부터 양성으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
따라서 상기 바이오 칩이 기존의 항체 진단 ELISA보다 훨씬 향상된 민감도를 가지고 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 단백질 칩을 이용한 웨스턴 블럿 방법의 대체
웨스턴 블럿과 면역 염색법은 여러 단백질의 혼합물로부터 어떤 특정 단백질을 찾아내는 기법으로써 찾고자 하는 단백질에 대한 항체를 사용하여 항원-항체 반응을 일으킴으로써 특정 단백질의 존재 여부를 밝혀내는 방법이다.
일반적으로 웨스턴 블럿(western blot)으로 특정 단백질을 찾아내는 과정은, 단백질 혼합물을 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동하여 크기 별로 분리시킨 후 니트로셀룰로오스 또는 나일론 멤브레인에 옮기고, 단백질이 옮겨진 멤브레인에서 항원-항체 반응을 이용하여 특정 항체에 대한 항원을 찾아내는데, 이때 사용하는 항체는 방사성 동위원소로 표지하거나 특정 효소 (horseradish peroxidase 등) 또는 형광을 나타내는 색소가 결합되어 있어 찾고자 하는 단백질을 가시화 할 수 있다.
상기와 같이, 복잡한 단계를 거쳐야 하는 웨스턴 블럿 대신에, 상기 실시예 2에서 제작된 단백질 칩을 이용하여, 단백질 혼합물을 고정화 한 후 형광을 나타내는 색소가 결합되어 있는 항체로 어세이 하여, 쉽고 간편하게 단백질 혼합물 내에서 특정 단백질을 찾아낼 수 있었다.
또한, 일반적으로 단백질을 전기영동할 때 환원 상태 하에서 실시하므로 단백질이 변성(denature)된 상태에서 항체와 결합을 시키게 되는데, 특정 항체가 단백질의 본래(native) 형태만을 인식한다면, 일반적인 웨스턴 블럿(western blot)으로는 단백질을 찾아낼 수 없게 되는 문제점이 발생되나, 본 발명에 따른 졸-겔 단백질칩은 단백질을 본래 형태로 고정화시킬 수 있으므로 더 유용하다.
상기 실시예 2에서 제조된 졸-겔 칩을 이용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
(1) p24 단백질의 Native form 및 denature form에 따른 결합 비교 실험
(i) 먼저, Native 형태에만 결합하고, denature 형태에는 결합하지 않는 항체를 이용하여 실험하였다. 그 결과, 웨스턴 블럿에서는 밴드가 보이지 않고, 졸-겔 단백질 칩에서만 양성으로 나타났다.
(ii) 동일한 항원에 대한 항체이지만 denature 형태에 결합하는 항체를 이용하여 웨스턴 블럿과 졸-겔 단백질 칩에 실험한 결과, 모두 양성으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 졸-겔 칩은 denature 및 native 형태 모두를 확인할 수 있는 것으로 나타났다.
(2) p24 단백질이 발현된 E. coli crude extract를 이용한 실험
(i) p24 단백질이 발현되어 있는 E.coli crude extract를 졸-겔 단백질 칩에 농도별로 (Lysate 1, 2, 3) 고정한 후 발현된 단백질에 대한 항체로 어세이한 결과, 졸-겔 단백질 칩에서 양성으로 나타났다 (도 10).
(ii) 특정 단백질이 발현되어 있지 않은 E.coli crude extract (N) 를 졸-겔 단백질 칩에 고정한 후 위와 같은 항체로 어세이한 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 졸-겔 단백질 칩에서 음성으로 나타났다 (도 10).
도 10에서 N 은 음성대조군으로써 특정 단백질이 발현되어 있지 않은 E. coli crude extract를 고정한 것이며, Lysate 1 은 특정 단백질이 0.09ug/ul 의 농도로 발현되어 있는 E. coli crude extract, Lysate 2 는 특정 단백질이 0.18ug/ul 의 농도로 발현되어 있는 E. coli crude extract, Lysate 3 는 특정 단백질이 0.27ug/ul 의 농도로 발현되어 있는 E. coli crude extract 를 고정한 것이다. P 는 양성대조군으로써 Cy3 형광 물질을 고정한 것이다.
(3) (i) p24 단백질에 대한 항체를 농도별로 졸-겔 단백질 칩에 고정한 후 샌드위치 어세이 방법을 이용하여, p24 단백질이 과발현되어 있는 E. coli crude extract 로 어세이 하고 다시 항체를 결합시켜 확인한 결과, 졸-겔 칩에서는 양성으로 나타났다 (도 11).
(ii) 탐색하고자 하는 항원에 대한 항체를 농도별로 졸-겔 단백질 칩에 고정한 후 샌드위치 어세이 방법을 이용하여 특정 항원이 발현되지 않은 E. coli crude extract 로 어세이 하고 다시 항체를 결합시켜 확인한 결과, 졸-겔 칩에서는 음성으로 나타났다 (도 11).
도 11 에서 N 은 음성대조군으로써 항체를 고정하지 않은 칩이며 Ab1 및 Ab2 는 항체를 농도별로 (0.063ug/ul, 0.125ug/ul) 고정한 것이다. P 는 양성 대조군으로써 Cy3 형광 물질을 고정한 것이다.
(4) (i) 탐색하고자 하는 질병(AIDS)의 항체에 대한 항원 (p24, p31, gp41, gp120 및 gp160)을 졸-겔 단백질 칩에 고정한 후 환자 혈청 등 특정 항체가 포함되어 있는 물질 (양성 혈청) 로 어세이 하여 확인한 결과, 졸-겔 칩에서 양성으로 나타났다 (도 12).
(ii) 탐색하고자 하는 항체에 대한 항원을 졸-겔 칩에 고정한 후 혈청 등 특정 항체가 포함되어 있지 않은 물질 (음성 혈청) 로 어세이 하여 확인한 결과, 졸-겔 칩에서 음성으로 나타났다 (도 12).
실시예 5: 화합물과 결합하는 단백질 또는 특정 물질의 탐색
도 13에 나타난 바와 같이, 특정 화합물 (비스페놀 에이) 을 실시예 2에서 제작한 졸겔칩에 고정하고, 음성 대조군으로써 화합물을 녹이는데 사용하는 버퍼용액 만을 칩에 고정하였다. 그리고, 형광물질 (cy3) 로 표지되어 있으며 비스페놀 에이와 결합할 수 있는 single strand DNA 압타머 (피씨엘㈜ 사에서 구입) 를 이용하여 분석하였다.
단백질-단백질의 결합은 yeast to hybrid나 Immunoprecipitation (IP) 등으로 확인할 수 있으나 화합물과 단백질의 결합 또는 화합물과 DNA의 결합을 손쉽게 확인할 수 있는 방법은 다양하지 않다. 상기 실험 결과, 실시예 2에서 제작된 단백질칩은 화합물이나 DNA를 비롯한 저분자 물질부터 단백질, 항체에 이르기까지 다양한 종류의 물질을 고정할 수 있으므로, 다양한 물질의 결합을 손쉽게 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명에 따른 상기 졸 조성물의 겔화를 이용하여 바이오 칩을 제조하는 경우, SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성되는 졸 조성물과 SolBH, SolBS, DW 와 버퍼 용액을 순서대로 혼합한 뒤 저온 에서 안정화 시킴으로써 졸 조성물의 겔화 시간을 늦추며 안정화된 겔화(gelation)을 유도하여 졸 용액의 분주가 용이하며, 스팟의 활성을 유지할 수 있다. 또한 사전에 혼합 (premixing)하는 전처리 과정 없이 어레이어를 이용한 표면 스팟팅만을 이용하여 간편하게 균질한 바이오 칩 제작이 가능하다는 유리한 효과가 있어 유용하다.

Claims (29)

  1. 다음 단계를 포함하는, 졸 조성물의 겔화를 이용한 바이오 칩의 제조방법으로서,
    (a) SolB1, SolB2 및 SolB3를 포함하는 졸 조성물에 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH (용액 I) 를 혼합하는 단계;
    (b) 완충액인 SolBS 와 증류수를 (a)단계에서 혼합된 용액과 혼합한 다음, -20~4℃에서 안정화 시키는 단계; 및
    (c) 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 포함하는 용액을 (b)단계에서 안정화된 용액과 혼합하여 기판 위에 분주한 후 겔화시키는 단계,
    이 때,
    (i) 상기 SolB1 은 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체이고;
    (ii) 상기 SolB2 는 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체이고; 그리고
    (iii) 상기 SolB3 는 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 어레이어 없이 손으로 스팟팅을 수행하거나, 비접촉형 어레이어를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 기판은 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate, PMMA), 플라스틱, 실리콘, 및 유리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질은 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 및 세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 혼합된 용액은 -20~4℃ 의 조건에서 30분 이상 방치하여 안정화시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 사용되는 기판은, 사용되기 전에 미리 이슬점 이상의 온도로 최적화하고, (c) 단계에서 습도 50% 이상의 조건에서 분주하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 졸 조성물과 SolBH와 SolBS의 혼합 용액, 증류수 및 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질은 각각 3: 1: 4 와 1: 2: 8 사이의 범위로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 SolBH 및 SolBS의 농도는 1mM ~ 100mM 인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 SolBS : 증류수 : 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질의 부피비는 1:2:1 와 2:5:1 사이의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 완충액은 pH 3~8 범위의 소디움 포스페이트 (sodium phosphate)인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 기판은 미리 플라즈마 표면처리 되거나, 에칭되거나, PDMS 나 실리케이트 단량체 또는 고분자 물질로 처리된 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 다음 단계를 포함하는, 졸 조성물의 겔화를 이용한 바이오 칩의 제조방법으로서,
    (a) SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성된 졸 조성물을 기판 위에 분주한 다음, HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH (용액 I) 를 분주하는 단계; 및
    (b) 완충액인 SolBS, 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질 및 증류수를 포함하는 용액II를 기판 위에 분주한 후 겔화시키는 단계,
    이 때,
    (i) 상기 SolB1 은 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체이고;
    (ii) 상기 SolB2 는 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체이고; 그리고
    (iii) 상기 SolB3 는 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 어레이어 없이 손으로 스팟팅을 수행하거나, 비접촉형 어레이어를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 방법은 전처리 과정이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 전처리 과정은, (i) SolB1, SolB2, SolB3, SolBH, SolBS, 또는 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 혼합하는 과정; (ii) 혼합한 후 볼텍싱(vortexing)하는 과정; 및 (iii) 상기 혼합된 용액을 안정화하는 과정으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 12 항에 있어서, 상기 SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성된 졸 조성물, SolBH, SolBS 및 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 분주 전에 용기에 담아 노즐을 이용하여 빨아올리는 형태로 분주하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 SolB1, SolB2 및 SolB3 로 구성된 졸 조성물, SolBH, SolBS 및 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질을 분주 전에 미리, 분주하는 노즐이 연결되어 있는 대용량 카트리지에 넣어, 한번에 분주하는 양이, 노즐을 이용하여 빨아올리는 형태로 분주하는 것에 비해 100배 이상이어서 대량 생산이 가능한 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제12항에 있어서, 상기 기판은 폴리메틸메타크릴레이트(polymethylmethacrylate, PMMA), 플라스틱, 실리콘, 및 유리로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제12항에 있어서, 상기 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질은 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 및 세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제12항에 있어서, 상기 기판은 이슬점 이상의 온도로 최적화 되고, 분주는 습도 50% 이상의 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제12항에 있어서, 상기 졸 조성물, 용액 I 및 용액 II 의 분주량은 각각 3: 1: 4 와 1: 2 :8 사이의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제12항에 있어서, 상기 SolBH 및 SolBS 의 농도는 1mM ~ 100mM인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제12항에 있어서, 상기 용액II은 SolBS : 증류수 : 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질의 부피비가 1:2:1 와 2:5:1사이의 범위인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제12항에 있어서, 상기 SolBS 는 pH 3~8 범위의 소디움 포스페이트 (sodium phosphate)인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제12항에 있어서, 상기 기판은 미리 플라즈마 표면처리 되거나, 에칭되거나, PDMS 나 실리케이트 단량체 또는 고분자 물질로 처리된 것을 특징으로 하는 방법.
  26. (i) 메틸트리에톡시실란(methyltriethoxysilane, MTES), 에틸트리에톡시실란(ethyltriethoxysilane, ETrEOS), 소디움 실리케이트 (Sodium Silicate), 테트라메틸 오르토실리케이트(tetramethyl orthosilicate, TMOS), 테트라에틸 오르토실리케이트(tetraethyl orthosilicate, TEOS) 및 테트라메톡시실리케이트(tetramethoxysilicate, TMS)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제1 실리케이트 단량체인 SolB1을 포함하는 제1용기; (ii) 3-아미노트리메톡시실란(3-aminotrimethoxysilane, 3-ATMS), 디글리세릴실란(diglycerylsilane, DGS), 메틸트리메톡시실리케이트(methyltrimethoxysilicate, MTMS), 폴리글리세릴실리케이트(polyglycerylsilicate, PGS), 폴리비닐아세테이트(polyvinylacetate), 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 글리세릴 메타크릴레이트(glyceryl metaacrylate), 하이드록시에틸 아크릴레이트(hydroxyethyl acrylate), N,N-디쿠시니미딜카르보네이트(N,N-dicusinimidilcarbonate, DSC), 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드(cetyltrimethylammonium chloride), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide), 3-(트리에톡시실릴) 프로필 숙시닉 언하이드라이드(3-(triethoxysily) propyl sucinic unhydride), N-(3-트리에톡시실릴 프로필)-4-하이드록시 부틸아마이드(N-(3-triethoxysily propyl)-4-hydroxy butylamide, SIT8189.5), N-(트리에톡시실릴 프로필) 글루콘아마이드(N-(triethoxysilyl propyl) gluconamide, SIT8189.0) 50%, 플루로닉 L121(pluronic L121) 및 테트라메틸 암모늄 하이드록시드(tetramethyl ammonium hydroxide)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 제2 실리케이트 단량체인 SolB2를 포함하는 제2용기; (iii) 아미노프로필트리에톡실란 (aminopropyltriethoxysilane, APTES), 3-글리시독시프로필트리메톡시실란(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS), N-트리에톡시실릴프로필-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄(N-triethoxysilylpropyl-O-polyethylene oxide urethane, PEOU), 글리세롤, PEG200, PEG400, PEG600, PEG1350 및 PEG8000으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제 인 SolB3을 포함하는 제3용기; (iv) HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH를 포함하는 제4용기; 및 (v) 완충액인 SolBS를 포함하는 제5용기로 구성되고,
    상기 SolB1, SolB2 및 SolB3를 혼합한 졸 조성물에 HCl, H2SO4, HNO3 및 CH3COOH로 구성된 군에서 선택된 SolBH, 완충액인 SolBS와 증류수, 탐지 하기 위한 생물학적 물질 순으로 순서대로 혼합함으로써 졸 혼합물이 겔화되는 것을 특징으로 하는 바이오 칩 제조용 키트.
  27. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 바이오 칩에 상기 표적 생물학적 물질과 상호작용하는 생물학적 물질과 상호작용가능한 표적 생물학적 물질을 함유하는 시료를 첨가하는 단계를 포함하는 표적 생물학적 물질의 분석 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 표적 생물학적 물질은 핵산, 단백질, 펩타이드, 저분자 물질 및 세포로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 표적 생물학적 물질을 탐지할 수 있는 방사성 동위원소, 형광염료, 염료, 또는 발광성 물질로 표지된 단백질, 항체 또는 압타머와 추가로 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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