WO2012156094A1 - Mit dendritischem polyglycerolsulfat funktionalisierte nanopartikel - Google Patents

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WO2012156094A1
WO2012156094A1 PCT/EP2012/002136 EP2012002136W WO2012156094A1 WO 2012156094 A1 WO2012156094 A1 WO 2012156094A1 EP 2012002136 W EP2012002136 W EP 2012002136W WO 2012156094 A1 WO2012156094 A1 WO 2012156094A1
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mol
linker
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French (fr)
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Rainer Haag
Jonathan VONNEMANN
Jens Dernedde
Marie Weinhart
Dominic GRÖGER
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Charite Universitaetsmedizin Berlin
Freie Universitaet Berlin
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Charite Universitaetsmedizin Berlin
Freie Universitaet Berlin
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/04—X-ray contrast preparations
    • A61K49/0409—Physical forms of mixtures of two different X-ray contrast-enhancing agents, containing at least one X-ray contrast-enhancing agent which is not a halogenated organic compound
    • A61K49/0414—Particles, beads, capsules or spheres
    • A61K49/0423—Nanoparticles, nanobeads, nanospheres, nanocapsules, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer
    • A61K49/0428—Surface-modified nanoparticles, e.g. immuno-nanoparticles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Definitions

  • the present invention relates to nanoparticles with dendritic polyglycerol sulfates, processes for their preparation and their uses, in particular in the medical field.
  • the dendritic polyglycerol sulfates and the inorganic nanoparticles are linked together via linkers.
  • Inflammation is a characteristic response of human or animal tissue to a deleterious stimulus or invading pathogens, in which leukocytes play a key role due to their antimicrobial, secretory and phagocytic activities. In all forms of the inflammatory response, recruitment of leukocytes to the vascular endothelium and subsequent migration into the surrounding inflamed tissue is observed.
  • the acute inflammatory response is thus the body's first alarm signal designed to contain and eventually eliminate proinflammatory stimuli.
  • the first step of leukocyte emigration is the activation of vascular endothelial cells by signals (cytokines) that originate from the site of inflammation in the tissue. Activated endothelial cells secrete more cytokines.
  • chemokines that activate leukocytes. Furthermore, activation of the endothelial cells results in the expression of cell adhesion molecules on the vascular surface. Complementary cell adhesion molecules on leukocytes and endothelial cells are presented, which bind to each other and thus initiate the adhesion cascade at the end of which the migration of leukocytes is.
  • Selectins are transmembrane, homologous glycoproteins classified into L, E and P selectin according to their cellular abundance.
  • E-Selekin is presented on endothelial cells
  • P-selectin is expressed both by endothelial cells and on platelets (platelets)
  • leukocytes The initial contact of leukocytes with the endothelial cells takes place by interaction of L-selectin carbohydrate ligands of the endothelial cells.
  • L-selectin carbohydrate ligands of the endothelial cells An important role as a binding partner is presented on protein and lipids
  • Tetrasaccharide sialyl LewisX (sLeX), which is used as the standard ligand for structure-activity relationships for the characterization of binding properties as well as for the search for selectin inhibitors. Since selectin-ligand interactions initiate leukocyte emigration, their targeting / blockade provides a means for localization and therapeutic intervention of inflammation. Various selectin inhibitors are known in the art, but so far no therapeutic is on the market.
  • DE 102006036326 A1 discloses dendritic polyglycerol sulfates and sulfonates which have a high affinity for L- and P-selectin.
  • the IC 50 values of these compounds are between 10 and 40 nM.
  • EP 2123269 A1 discloses functionalized nanoparticles having a size of 15-50 nm.
  • the particles consist of a gold core and a shell of long-chain linear alkyl groups with sulfated amino alcohols as the functional group.
  • the particles are suitable inhibitors of selectin-ligand interactions and show
  • the object of the invention is therefore to provide improved substances which are particularly suitable for the localization and treatment of inflammation, are non-toxic and can be prepared simply and inexpensively.
  • nanoparticles having an inorganic core and a shell of linker and dendritic Polygycerolsulfaten (dPGS) according to the features of the claims.
  • dPGS dendritic Polygycerolsulfaten
  • the nanoparticles comprise
  • linker links polyglycerol sulfate and core together.
  • the PGS shell around the core is dendritic (tree-like) branched. Since glycerol has 3 OH groups, it can be used in the polymerization to polyglycerol - unlike, for example, in propanediol - create more or less cross-linked, three-dimensional structures (dendritic polymers).
  • the extent of dPGS branching can be specified by the degree of branching (DB).
  • the degree of branching is in The scope of this invention is defined by Frey (Wilms D., Wurm F., Nieberie J., Bohm P., Kemmer-Jonas U., Frey H., Macromolecules, 2009, 42, 3230-3236) by the following equation (1). :
  • D and L in equation (1) define the number of linear (L) or dendritic (D) glycerol units per nanoparticle.
  • L corresponds to the number of glycerol units (glycerol molecules) per nanoparticle, which are each connected to 2 other glycerol units.
  • D represents the number of
  • Glycerol units per nanoparticle which are each connected to 3 other glycerol units.
  • the theoretical maximum according to this formula amounts to 100%, in this case of maximally branched polyglycerols one speaks of so-called polyglycerol dendrimers.
  • T represents terminal (T) glycerol units, that is, glycerol units linked to only one glycerol molecule.
  • the terminal glycerol units form the end of the respective polyglycerol chain and are thus located on the surface of the nanoparticles.
  • the degree of branching of the polyglycerol can be adjusted as desired.
  • the degree of branching is 1-100%.
  • the degree of branching is from 30-80%, and more preferably from 55-65%.
  • the dPGS is preferably not perfect, i. it has a degree of branching of less than 100% (so-called dendritic polymers).
  • Dendritic polymers have several advantages over dendrimers (maximum branched). In dendrimers, the steric hindrance increases with increasing
  • dendritic polymers have the advantage of having free functional groups not only on their surface but also internally. These can be used, for example, for others
  • the layer thickness of the sheath of dPGS and linker is about 1-20 nm, preferably 2-10 nm.
  • the average molecular weight of the dPGS is about 100 to 1,000,000 g / mol, preferably 2,500 to 200,000 g / mol, and more preferably 5,000 to 15,000 g / mol.
  • the dPGS have sulfate groups -OSOaX; wherein X is H, an alkali metal atom such as Li, Na or K, or an ammonium ion such as triethylammonium or diisopropylethylammonium.
  • the sulfate groups can be introduced into the starting dendritic polyglycerols using suitable sulfation reagents (Türk H, Haag R, Alban S (2004) "Dendritic polyglycerol sulfate as new heparin analogue and potent inhibitor of the complement system", Bioconjugate Chem 15: 162
  • the dendritic polyglycerols can be prepared, for example, by a one-stage anionic polymerization (eg a so-called anionic multibranching ring-opening polymerization, Haag R, Mecking S, Schok H. DE 1021 1664A1, 2002) 3 is used with bases, such as pyridine or triethylamine. About the ratio of S0 3 to the OH groups of the dendritic polyglycerol, the resulting degree of sulfation can be adjusted.
  • the degree of sulfation is 1-100%, preferably 50-99%, and more preferably 80-99%, most preferably 84-99%.
  • degree of sulfation in the context of this invention expresses the percentage of -OH groups of the glycerol units of the dPG (dendritic polyglycerol) which is sulfated in the dPGS If, for example, half of the -OH groups of the glycerol units are sulfated, the degree of sulfation is 50%.
  • the core consists of a nanoscale inorganic material.
  • all metals and inorganic metal compounds which are inert and biocompatible, and water-insoluble are suitable. Because of their high biocompatibility, gold and iron oxide are particularly preferred and are therefore particularly suitable for use in the therapeutic or diagnostic field. Very particular preference is given to gold nanoparticles.
  • the core of the nanoparticles according to the invention has a diameter of 5-45 nm, preferably 10-30 nm.
  • the linkers may be covalently or coordinately attached to the nucleus via the terminal thio groups or phosphonate groups.
  • alpha-terminal thio groups are preferred.
  • the binding of the thio groups to the gold nanoparticles preferably takes place via a "soft base, soft acid” bond, the binding energy is generally 126-146 kJ / mol, which is comparable to weak covalent bonds (150-500 kJ / mol
  • alpha-terminal phosphonate groups are preferred, whereby the binding of the phosphonate group to the iron oxide nanoparticles preferably takes place via a coordinative bond.
  • thio groups are a preferred function by which the dPGS can be linked to the nucleus.
  • the linker molecules are preferably coupled to the surface of the inorganic nuclei via thio groups, such as thiol groups or sulfur-containing heterocycles.
  • thio groups such as thiol groups or sulfur-containing heterocycles.
  • sulfur-containing heterocycles are sulfur-containing five-membered rings such as dithiolanes.
  • Preferred linkers are C 1 -C 2 o-hydrocarbon chains, such as Ci-C 20 alkyl chains, for example, propyl, butyl, pentyl, hexyl, octyl or decyl. These can be connected to the nucleus via one or more, in particular 1, 2 or 3, sulfur atoms and to the dPGS via a carboxyl group.
  • linkers are disulfides, especially cyclic disulfides such as dithiolanes. These have an adsorption energy that is comparable to that of covalent bonds. This is exemplified in Scheme 1 for lipoic acid as a linker.
  • a suitable linker is, for example, lipoic acid. It has surprisingly been found that lipoic acid couples dPGS with an M w in the range from 10,000 g / mol to 15,000 g / mol of gold nanoparticles with high stability.
  • the linker molecule is linked to the dPGS via a covalent bond.
  • Binding of the linker to the dPGS occurs via a functional group of the linker which is linked to a free NH 2 or OH group of the dPGS, for example via an ester bond or a peptide bond.
  • the linking reaction is typically a condensation reaction in which the linker is linked to the dPGS via a functional group, eg, a free carboxyl group.
  • the linker generally forms an inner layer around the inorganic core around which there is an outer layer of dPGS.
  • the linker has a length of 0.5-10 nm, preferably 1-5 nm.
  • the nanoparticle according to the invention comprises a core of gold, a dPGS shell with an average molecular weight of 5,000-15,000 g / mol and a degree of branching of 55-65% and a lipoic acid linker coupled to the dPGS via an amide Binding.
  • the nanoparticles according to the invention may have the same or different dPGS and linker. Preference is given to using a linker type and a dPGS type.
  • the nanoparticles according to the invention have a very high affinity for selectins such as L-selectin.
  • selectins such as L-selectin.
  • the high affinity of the nanoparticles according to the invention for selectines makes them excellently suitable substances for use in the medical or diagnostic field, especially in inflammatory diseases.
  • the nanoparticles according to the invention can be combined with suitable medicinal active compounds to give conjugates.
  • conjugates of the nanoparticles according to the invention with active substances are likewise the subject matter of the present invention.
  • substances can be transported very selectively into inflamed tissue.
  • nanoparticles according to the invention are that no further targeting molecules such as antibodies, antibody fragments, proteins, peptides or oligonucleotides have to be used for the transport of the particles to the site of action, since the dPGS itself has a targeted effect. This reduces the synthetic effort and the associated costs and increases the robustness of the system. Furthermore, the nanoparticles according to the invention do not necessarily require signaling molecules in disgnostic applications, since the inorganic core materials such as gold or iron oxide themselves can act as signal transmitters, for example in MSOT (Multispectral Optoacoustic Tomography) measurements or in MRT.
  • MSOT Multispectral Optoacoustic Tomography
  • the nanoparticles may be e.g. be applied in the form of tablets, capsules, powders, suspensions, and infusions.
  • the pharmaceutical or pharmaceutical compositions may further contain carriers and / or excipients.
  • Suitable carriers and excipients include binders, suspending agents, lubricants, colors, flavors and preservatives.
  • a therapeutic treatment with the nanoparticles according to the invention e.g. all inflammatory processes in question, both acute and chronic.
  • the subject of the invention is therefore also the use as prophylactics or therapeutics for inflammatory diseases.
  • the substances according to the invention are preferably used in diseases in which the extravasation of leukocytes into the tissue plays a role and leads to tissue damage.
  • the nanoparticles according to the invention are particularly suitable for the treatment of chronic inflammatory diseases, in particular rheumatoid arthritis, psoriaris, Crohn's disease, ulcerative colitis, allograft rejection, asthma, beryliosis or autoimmune diseases or tissue rejection.
  • chronic inflammatory diseases in particular rheumatoid arthritis, psoriaris, Crohn's disease, ulcerative colitis, allograft rejection, asthma, beryliosis or autoimmune diseases or tissue rejection.
  • the nanoparticles according to the invention can also be used for the treatment of inflammatory diseases in which the selectin-mediated leukocyte adhesion is dysregulated. Chronic inflammatory processes cause tissue destruction
  • IFN cytokinin y
  • macrophages which in turn produce hydrolytic enzymes and reactive oxygen and nitrogen species, resulting in the destruction of surrounding tissue.
  • TNFa is released, causing the
  • the nanoparticles according to the invention bind selectins such as L- and P-selectin with particularly high affinity and thus block the interaction with their ligands. Of the Leukocyte / endothelial contact is reduced, thus suppressing the increased migration of leukocytes into the inflammatory foci.
  • the nanoparticles can therefore also be used as selective selectin inhibitors.
  • IC 50 values of up to 180 fM were observed with the nanoparticles according to the invention, which are lower by a factor of 100 than the IC 50 values for substances known from the prior art (eg EP 2123269 A1).
  • the nanoparticles according to the invention are thus particularly advantageously suitable for inhibiting selectin-mediated leukocyte adhesion.
  • the nanoparticles of the invention may also be used as diagnostics, e.g. as a contrast agent for use in imaging techniques such as MRI and MSOT.
  • diagnostics e.g. as a contrast agent for use in imaging techniques such as MRI and MSOT.
  • the use as diagnostics in inflammatory diseases e.g. be used as selectin indicators for the diagnosis, localization and visualization of the selectins, especially in vitro in inflamed tissue, in organs, in tissue sections but especially in vivo.
  • selectin indicators for the diagnosis, localization and visualization of the selectins, especially in vitro in inflamed tissue, in organs, in tissue sections but especially in vivo.
  • Due to the inorganic core of the nanoparticles according to the invention these are suitable directly as contrast agents, e.g. Gold Nanoparticles in Multispectral Optoacoustic Tomography (MSOT) and Iron Oxide Nanoparticles in MRI (Magnetic Resonance Tomography).
  • MSOT Multispectral Opto
  • the nanoparticles of the invention may also be loaded with other signaling molecules or bound to signaling molecules.
  • Preferred signaling molecules are, for example, radioactive isotopes such as iodine-124, iodine-125 or fluorine-18.
  • dyes in particular fluorophores such as e.g. Aminomethylcoumarin, fluorescein, cyanine, rhodamine and their derivatives can be used.
  • the signaling molecules can also be a fluorescence donor or reporter and a fluorescence acceptor or quencher, which can be used in particular as a pair of respectively one fluorescence donor / reporter and one fluorescence acceptor A quencher.
  • conjugates with signaling molecules are:
  • Gold nanoparticle dPGS covalently conjugated to chelators for radionuclides such as 1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-1, 4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), diethylenetriamine-pentaacetic acid (DTPA) or mercaptoacetyltriglycine (MAG 3 ).
  • radionuclides such as 1, 4,7,10-tetraazacyclododecane-1, 4,7,10-tetraacetic acid (DOTA), diethylenetriamine-pentaacetic acid (DTPA) or mercaptoacetyltriglycine (MAG 3 ).
  • the nanoparticles of the invention are also capable of specifically binding chemokines.
  • chemokines are, for example, proinflammatory cytokines, in particular TNF ⁇ , IL-1, IL-6, as well as IL-8 and MIP-1 ⁇ .
  • proinflammatory cytokines in particular TNF ⁇ , IL-1, IL-6, as well as IL-8 and MIP-1 ⁇ .
  • an inhibitory binding of the chemokines, such as INF or TNFa by the dPGS nanoparticles according to the invention, an interaction with receptors of the chemokines is prevented so that tissue damage and leukocyte extravasation are prevented.
  • the nanoparticles according to the invention can preferably also be used in in vitro applications.
  • Preferred matrices or surfaces for immobilization are inorganic and polymeric natural synthetic materials, for example glass, silica, dextran, agarose, sepharose or synthetic hydrophilic polymers.
  • the immobilized nanoparticles of the present invention may be used to fractionate biological samples such as body fluids, plasma, blood, serum, cell suspensions and supernatants from cell cultures, or to purify specific proteins, e.g. L-selectin, P-selectin, chemokines, coagulation factors are used.
  • the nanoparticles of the invention may also be used as scavengers, e.g. in the
  • ELISA can be used.
  • the nanoparticles of the invention thus have many advantages: they are very good biocompatible, easy to prepare, and have a very high affinity for L- and P-selectin.
  • AuNP gold nanoparticles
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • mPEG-SH 1000 methoxy-terminated polyethylene glycol thiol with a
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • MSOT Multispectral Optoacoustic Tomography
  • Fig. 1 Structure of dendritic polyglycerol. Terminal (T), linear (L) and dendritic (D) repeat units are grayed out.
  • Fig. 2 (Scheme 1): lipoic acid as a linker.
  • Figure 3 Reaction scheme for preparing an activated linker molecule exemplified by lipoic acid (NHS activation of lipoic acid) after the synthesis of Liu et al. (Liu, W. Journal of the American Chemical Society, 2008, 1274-1284 ).
  • Figure 4 Reaction scheme for the preparation of an amine-functionalized dendritic polyglycerol (Roller, S., Zhou, H., Haag, R. Molecular Diversity, 2005, 9, 305-316).
  • the dPG starting material was synthesized by a one-step ⁇ "anionic multibranching ring-opening polymerization ⁇ " (Haag R, Mecking S, Turk H. DE 10211664A1, 2002); Controlled amine functionalization of dPG.
  • FIG. 5 (Scheme 4): Reaction scheme for the sulfation of the OH groups of the dendritic polyglycerol (Türk H, Haag R, Alban S (2004) Dendritic polyglycerol sulfates as new heparin analogues and potent inhibitors of the complement system. Bioconjugate Chem 15: 162-167.); Sulfation of partially aminated dPG.
  • Figure 6 Reaction scheme for coupling a linker such as a lipoic acid linker to dPGS; Functionalization of dPGS with a lipoic acid linker.
  • FIG. 7 (Scheme 6): Ligand exchange of citrate-stabilized gold nanoparticles with dPGS in aqueous solution. The number of citrate or dPGS per gold nanoparticle is shown here only schematically (ligand exchange on citrate-stabilized gold nanoparticles with TA-dPGS in aqueous solution).
  • Figure 8 shows the mPEG-SH 1000 functionalization of CTAB-functionalized gold nanorods.
  • the gold nanorods are shown here only schematically; Ligand exchange on gold nanorods from CTAB bilayer to mPEG-SH 1000 layer.
  • Figure 9 shows the TA-dPGS 10,000 g / mol functionalization of mPEG-SH 1000 functionalized gold nanorods.
  • the gold nanorods are shown here only schematically; Ligand exchange on gold nanorods of mPEG-SH 1000 layer to TA-dPGS 10,000 g / mol layer.
  • Figure 10 ( Figure 1): SPR sensorgram of dPGS-TA functionalized gold nanoparticles.
  • Figure 11 ( Figure 2): SPR sensorgram of AuNR-TA-dPGS 10,000 g / mol.
  • the nanoparticles according to the invention can be prepared by first linking the dPGS with a linker and then reacting the reaction product with the core material of inorganic nanoparticles.
  • the linker e.g. Lipoic acid
  • the linker can be activated, e.g. by reacting with N-hydroxysuccinimide in dichloromethane and tetrahydrofuran to give the lipoic acid succinimide (see Figure 3, Scheme 2).
  • the dPG used as starting material can be obtained, for example, by a one-stage anionic multi-branching ring-opening polymerization "(Haag R, Mecking S, Mosk H., DE 10211664A1, 2002) .This can be functionalized before the reaction with the linker, for example with amine groups (FIG 4, Scheme 3).
  • the dPG can be converted to dPGS with sulfating agents such as SCyPyridine ( Figure 5, Scheme 4).
  • the linkage of the amine-functionalized dendritic dPGS with the linker occurs e.g. via a succinimide coupling in dichloromethane with / V, / V-diisopropylethylamine as the base (see Figure 6 (Scheme 5)).
  • the inorganic nanoparticles which are useful as a core for the preparation of the dPGS nanoparticles of the invention may be e.g. by a method described by X. Lou and C. Wang, C (Biomacromolecules, 2007, 8, 1385-1390), e.g. by reduction of HAuC with sodium citrate in aqueous solution at temperatures around 100 ° C.
  • the rod-shaped inorganic nanoparticles useful as nuclei for the preparation of the dPGS nanoparticles of the invention may be e.g. are synthesized by a protocol developed by Jana Nikhil (N., Small, 2005, 8, 875-882).
  • the CTAB-functionalized gold nanorods may then be coated e.g. as in the protocol of Xiaoge Hu and Xiaohu Gao (X. Hu, X. Gao, Phys. Chem. Chem. Phys., 2011, 13, 10028-10035) are functionalized with mPEG-SH 1000.
  • the dPGS is coupled to the core particles using the linker.
  • the linker e.g. those of Mei, B. C; Susumu, K .; Medintz, I. L .; Delehanty, J. B .; Mountziaris, T.J .; Mattoussi H. (Journal of Materials Chemistry, 2008, 18, 4949-4958), in which the citrate shell of the inorganic nanoparticles in the aqueous system is exchanged for the linker with a linker such as lipoic acid functionalized dPGS overnight at room temperature. Purification then takes place via dialysis in water (FIG. 7, Scheme 6).
  • the coupling of the TA-dPGS is 10,000 g / mol of mPEG-SH 1000 g / mol, e.g. at 60 ° C for 12 hours while stirring in water. Subsequently, the purification is carried out e.g. about washing by centrifugation.
  • Synthesis of conjugates of TA-dPGS 10,000 g / mol or 5,000 g / mol of functionalized gold nanoparticles or gold nanorods with drugs or other signaling molecules or chelators for signaling radioactive metals can be accomplished in two ways.
  • the drugs or signaling molecules can be linked to a linker with one or more alpha-terminal disulfide groups such as lipoic acid, for example via an ester bond, peptide bond or triazole moiety. Active substances can also be used, for example, via acid-labile bonds, such as, for example, acetal bonds. Ester bonds or hydrazone bonds are linked.
  • the linker-providing signaling molecules or drugs can be mixed in the incubation of gold nanoparticles or gold nanorods with the TA-dPGS 10,000 g / mol or TA-dPGS 5,000 g / mol statistically with.
  • the drugs or signaling molecules can be covalently linked to the TA-dPGS.
  • a dPG is functionalized with several azide groups as described in Scheme 3 (FIG. 4). Subsequently, only a portion of these azide groups is reduced to amine groups.
  • the linker unit e.g. Lipoic acid is coupled to the amine group as described in Scheme 5 ( Figure 6). Subsequently, the remaining azide groups for e.g. an azide-alkyne Huisgen cycloaddition (Huisgen, R., Proc. Chem. Soc., 1961, 357-396) to link the signaling molecule or drug to the TA-dPGS.
  • multiple azide groups can also be reduced and the linker moiety and the drug or signaling molecule randomly linked to the dPGS as in Scheme 5 ( Figure 6) via an amide coupling.
  • the TA-dPGS linked to the drug or signaling molecule can then be used to functionalize the gold nanoparticles or gold nanorods.
  • the TA-dPGS functionalized nanoparticles or nanorods according to the invention are outstandingly suitable for use as contrast agents for the diagnosis of inflammatory diseases such as, for example, by MSOT (Multispectral Optoacoustic Tomography). More information about MSOT
  • nanoparticles or nanorods functionalized as contrast agents for e.g. MSOT measurements may e.g. an LPS-induced arthritis model (Chen, W; Mahmood, U; Weissleder, R;
  • LPS mouse lipopolysaccharide
  • MSOT examination shows increased contrast in the arthritis-induced joints due to the strong attachment of the TA-dPGS functionalized nanoparticles or nanorods to the L-selectin of the inflamed Endothelium.
  • Labeling of the TA-dPGS functionalized nanoparticles or nanorods according to the invention with signaling molecules such as cyanine dyes, rhodamine dyes or chelators for radionuclides allows the use of further diagnostic methods such as fluorescence tomography, PET (positron emission tomography) or SPECT (single photon
  • TA-dPGS functionalized nanoparticles or nanorods of the present invention as an anti-inflammatory agent may be e.g. be demonstrated by an allergic contact dermatitis model.
  • an allergic contact dermatitis model e.g. be demonstrated by an allergic contact dermatitis model.
  • TMA trimellitic anhydride
  • PGS with molecular weights of 5,300 g / mol, or 10,000 g / mol and a degree of sulfation of 85% were prepared using lipoic acid (TA) as a linker as follows: Methods:
  • UV / Vis absorption spectra were recorded on a UV / Vis spectrophotometer from Scinco TM Co., LTD. Analysis of the data was performed on the associated LabProPlus TM software.
  • dPGS with a molecular weight of 10,000 g / mol with lipoic acid NHS was as follows.
  • dPGS 10,000 g / mol 500 mg, 0.05 mmol
  • a mixture of dimethylformamide (15 mL) and distilled water 13 mL
  • lipoic acid-NHS 15.15 mg, 0.05 mmol
  • DIPEA 0.017 mL, 0.1 mmol
  • the solvent was removed in vacuo and the crude product was dialyzed first against methanol, then with sodium chloride solution and then with distilled water. After freeze-drying, the product was obtained as a colorless powder (491 mg, 95%).
  • citrate-stabilized gold nanoparticles with a z-average diameter of 17 nm was prepared by a slightly modified protocol from Lou et al. Wang, C; He, L. biomacromolecules., 2007, 8, 1385-1390.)
  • the glassware and the stir bar were washed with aqua regia, purified with Millipore and then dried at 120 ° C.
  • HAuCl 3H 2 O 34.42 mg, 0.087 mmol
  • ultrapure water 340 mL
  • a trisodium citrate solution (187 mg, 0.524 mmol) in ultrapure water (20 mL) was added to the solution.
  • the concentration of the gold nanoparticles was then calculated on the assumption of a 100% gold acid conversion and the geometric factors of the nanoparticles.
  • the resulting concentration of 1.39 nanomolar was in very good agreement with the theory described in (Haiss, W .; Thanh, N., Aveyard, J, Fernig, D., Anal. Chem., 2007, 79, 4215-4221.) ,
  • a suspension of 17 nm citrated-stabilized gold nanoparticles (20 mL, 1.39E-9 mol / l, 2.79E-1 1 mol with TA-dPGS 5.3 kDa (4.3 mg) (synthesized according to Scheme 5 (FIG. 6)) were incubated overnight at room temperature with stirring and then purified by dialysis against H 2 O.
  • the amount of TA-dPGS used corresponded to 2 equivalents of TA-dPGS per gold surface atom on the particle, since 15 nm particles according to Mei et al Susumu, K., Farrell, D., Mountziaris, TJ, Mattoussi, H.
  • Example 5 Synthesis of AuNR with a length of 40 nm and a
  • the reaction solution turned deep purple to purple after 15 minutes and the excess of CTAB was removed by centrifuging twice.
  • the purified CTAB-functionalized gold nanorods were stored at 4 ° C in the dark.
  • Zeta potential measurements by dynamic light scattering in a 10 mM phosphate buffer at pH 7.4 gave a zeta potential of +30 mV and thus confirmed the positively charged CTAB envelope.
  • the proportions of the particles and distribution were determined by electron micrographs at an acceleration voltage of 100 kV and gave a particle length of 40 nm and a diameter of 10 nm.
  • UV-Vis spectra were used to investigate the optical properties of the particles and their dispersion and gave a transversal plasmon absorption maximum of 515 nm and a longitudinal plasmon absorption maximum of 788 nm.
  • the functionalization of AuNR-CTAB with mPEG-SH 1000 was based on the protocol of Xiaoge Hu and Xiaohu Gao (X. Hu, X. Gao, Phys. Chem. Chem.
  • mPEG-SH 1000 (0.134 g, 133 mmol, 1.24E5 eq.) was added to a CTAB-functionalized gold nanorod suspension (4 mL, 2.7E-7 mol / l, 1.08E-9 mol) and for 24 hours at room temperature touched.
  • the 1.24E5 equivalents used are based on an observation by Sanda C. Boca as described in (S. Boca, Nanotechnology, 2010, 21, 235601). Subsequently, the particles were washed by centrifuging twice with ultrapure water.
  • Example 8 Measurement of the binding affinity of AuNP-TA-dPGS 10,000 g / mol and AuNP-TA-dPGS 5,300 g / mol:
  • the IC 50 value indicates that concentration of a substance at which a half-maximal inhibition is observed. It was measured as follows.
  • Gold nanoparticles were pre-incubated with AuNP-TA-dPGS as a binding enhancer in increasing concentration and the relative decrease in binding was measured compared to the control. Finally, the IC 50 values were determined by calculating the concentration of AuNP-TA-DPGS, this leads to 50% of control binding signal.
  • the IC 50 Values are calculated.
  • the IC 50 values indicate the point of the curve at 50 percent relative binding of the control.
  • the 5,300 g / mol and the 10,000 g / mol AuNP-TA-dPGS particles gave IC 50 values of 210 fM, or of 180 fM, which are surprisingly low.
  • IC S0 value of 136 pM resulted. This value is very low compared to the nanomolar IC 50 value of dPGS (Dernedde
  • the particles can therefore be used to target high affinity selectins and thus provide the basis of the TA-dPGS functionalized nanoparticles or nanorods of the invention as a contrast agent and as an anti-inflammatory agent.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel, gekennzeichnet durch a) einen Kern aus einem anorganischen Material und b) eine Hülle aus Linker und dendritischem Polyglycerolsulfat, wobei das Polyglycerolsulfat aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH2)2CH-OR besteht, wobei R = H, oder weitere Glycerin-Einheiten sind, eine oder von mehrere OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch Sulfat-Gruppen der Formel -OSO3X, worin X gleich H, ein Alkalimetallatom wie Li, Na oder K, oder ein Ammoniumion ersetzt sind, und wobei der Linker Polyglycerolsulfat und Kern miteinander verbindet. Die Nanopartikel eignen sich für medizinischen Anwendungen, z.B. zur Diagnose und Behandlung von Entzündungskrankheiten.

Description

T DENDRITISCHEM POLYGLYCEROLSULFAT FUNKTIONALISIERTE NANOPARTIKEL
Die vorliegende Erfindung betrifft Nanopartikel mit dendritischen Polygycerolsulfaten, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendungen, insbesondere im medizinischen Bereich. Dabei sind die dendritischen Polyglycerolsulfate und die anorganischen Nanopartikel über Linker miteinander verbunden.
Eine Entzündung ist eine charakteristische Antwort von menschlichem oder tierischem Gewebe auf einen schädigenden Reiz oder der Invasion von Pathogenen, bei der Leukozyten aufgrund ihrer antimikrobiellen, sekretorischen und Phagozytose- Aktivitäten eine Schlüsselrolle spielen. Bei allen Formen der Entzündungsreaktion wird die Rekrutierung von Leukozyten an das Gefäßendothel und das nachfolgende Auswandern in das umliegende entzündete Gewebe beobachtet.
BESTÄTIGUNGSKOPIE Die akute Entzündungsreaktion ist somit das erste Alarmsignal des Körpers, das auf die Eindämmung und schließlich Eliminierung proinfllammatorischer Reize ausgerichtet ist. Neben dieser gewünschten, schützenden Eigenschaft der Entzündungsreaktion zur
Eliminierung von Antigenen in unserem Körper kann eine Fehlfunktion der Immunantwort jedoch zu schweren sekundären Gewebeschäden führen, wenn der proinflammatorische Reiz persistiert. Dies beobachtet man bei chronisch entzündlichen Erkrankungen wie beispielsweise Rheuma, Morbus Crohn, Colitis Ulcerosa, chronische Gewebeabstoßung bei Transplantaten, Asthma, Arthrose, Berylliose oder
Schuppenflechte.
Der erste Schritt der Leukozyten Auswanderung besteht in der Aktivierung der vaskulären Endothelzellen durch Signale (Cytokine) die vom Ort der Entzündung im Gewebe stammen. Aktivierte Endothelzellen ihrerseits sezernieren weitere
Signalmoleküle (Chemokine), die Leukozyten aktivieren. Weiterhin führt die Aktivierung der Endothelzellen zur Expression von Zelladhäsionsmolekülen auf der vaskulären Oberfläche. Es werden so komplementäre Zelladhäsionsmoleküle auf Leukozyten und Endothelzellen präsentiert, die einander binden und so die Adhäsionskaskade einleiten an deren Ende das Auswandern der Leukozyten steht.
Dieser komplexe Prozess der Rekrutierung der Leukozyten an das Endothel am Entzündungsort wird eingeleitet durch schwache Wechselwirkungen von Selektin- Ligandkomplexen, die zur Reduktion der Fließgeschwindigkeit der Zellen führt und das anschließende Anhaften der Leukozyten an der Blutgefässwand ermöglicht.
Selektine sind transmembranäre, homologe Glykoproteine, die entsprechend ihres zellulären Vorkommens in L-, E- und P- Selektin eingeteilt sind. E-Selekin wird auf Endothelzellen präsentiert, P-Selektin wird sowohl von Endothelzellen als auch auf Plättchen (Thrombozyten) exprimiert und L-Selektin von den weißen Blutkörperchen
(Leukozyten) gebildet.
Der initiale Kontakt von Leukozyten mit den Endothelzellen erfolgt durch Wechselwirkung von L-Selektin Kohlehydrat-Liganden der Endothelzellen. Eine wichtige Rolle als Bindungspartner stellt dabei das auf Protein und Lipiden präsentierte
Tetrasaccharid Sialyl LewisX (sLeX) dar, welches als Standardligand für Struktur- Wirkungs-Beziehungen zur Charakterisierung der Bindungseigenschaften sowie für die Suche nach Selektininhibitoren herangezogen wird. Da Selektin-Ligand Wechselwirkungen die Leukozyten Auswanderung einleiten, stellt ihre Addressierung/Blockade eine Möglichkeit zur Lokalisierung und therapeutischer Intervention von Entzündungen dar. Verschiedene Selektininhibitoren sind aus dem Stand der Technik bekannt, allerdings ist bislang kein Therapeutikum auf dem Markt.
So sind in DE 102006036326 A1 dendritische Polyglycerolsulfate und -sulfonate offenbart, die eine hohe Affinität zu L- und P-Selektin haben. Die IC50-Werte liegen dieser Verbindungen zwischen 10 und 40 nM.
Aus EP 2123269 A1 sind funktionalisierte Nanopartikel mit einer Größe von 15-50 nm bekannt. Die Partikel bestehen aus einem Goldkern und einer Hülle aus langkettigen linearen Alkylgruppen mit sulfatierten Aminoalkoholen als funktionelle Gruppe. Die Partikel eignen sich als Inhibitoren der Selektin-Ligand Wechselwirkungen und zeigen
ICso-Werte im pikomolaren Bereich.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, verbesserte Substanzen zur Verfügung zu stellen, welche sich besonders zur Lokalisierung und zur Behandlung von Entzündungen eignen, untoxisch sind und sich einfach und günstig herstellen lassen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Nanopartikel mit einem anorganischen Kern und einer Hülle aus Linker und dendritischen Polygycerolsulfaten (dPGS) gemäß den Merkmalen der Ansprüche gelöst.
Erfindungsgemäß umfassen die Nanopartikel
a) einen Kern aus einem anorganischen Material und
b) eine Hülle aus Linker und dendritischem Polyglycerolsulfat,
wobei das Polyglycerolsulfat aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH2)2CH-OR besteht, wobei R = H, oder weitere Glycerin-Einheiten sind, eine oder von mehrere OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch Sulfatgruppen der Formel -OS03X, worin X gleich H, ein Alkalimetallatom wie Li, Na oder K, oder ein Ammoniumion wie Triethylammonium oder Diisopropylethylammonium ist, ersetzt sind,
und wobei der Linker Polyglycerolsulfat und Kern miteinander verbindet.
Die PGS-Hülle um den Kern ist dendritisch (baumartig) verzweigt. Da Glycerin über 3 OH-Gruppen verfügt, lassen sich daraus bei der Polymerisierung zu Polyglycerol - anders als z.B. bei Propandiol - mehr oder weniger stark vernetzte, dreidimensionale Strukturen (dendritische Polymere) erzeugen. Wie stark das dPGS dabei verzweigt ist, lässt sich durch den Verzweigungsgrad (DB) angeben. Der Verzweigungsgrad ist im Rahmen dieser Erfindung definiert nach Frey (Wilms D., Wurm F., Nieberie J., Böhm P., Kemmer-Jonas U., Frey H., Macromolecules, 2009, 42, 3230-3236) durch die folgende Gleichung (1):
2D
DB =
2D + L
D und L in Gleichung (1 ) definieren dabei die Anzahl der linearen (L), bzw. dendritischen (D) Glycerineinheiten pro Nanopartikel. L entspricht der Anzahl der Glycerineinheiten (Glycerinmoleküle) pro Nanopartikel, die jeweils mit 2 weiteren Glycerineinheiten verbunden sind. D stellt entsprechend die Anzahl der
Glycerineinheiten pro Nanopartikel dar, die jeweils mit 3 weiteren Glycerineinheiten verbunden sind. Der theoretische maximale nach dieser Formel beläuft sich auf 100%, in diesem Fall von maximal verzweigten Polyglycerolen spricht man von sog. Polyglycerol-Dendrimeren.
Zur Veranschaulichung des Verzweigungsgrades ist in Fig. 1 der Ausschnitt eines dPGS-Moleküls exemplarisch dargestellt. T steht für terminale (T) Glycerineinheiten, das heißt, Glycerineinheiten, die mit nur einem Glycerinmolekül verbunden sind. Die terminalen Glycerineinheiten bilden das Ende der jeweiligen Polyglycerolkette und befinden sich somit auf der Oberfläche der Nanopartikel.
In Abhängigkeit der Polymerisationsbedingungen lässt sich der Verzweigungsgrad des Polyglycerols beliebig einstellen. Erfindungsgemäß beträgt der Verzweigungsgrad 1- 100 %. Vorzugsweise beträgt der Verzweigungsgrad von 30-80% und besonders bevorzugt von 55-65%.
Erfindungsgemäß ist das dPGS vorzugsweise nicht perfekt, d.h. es weist einen Verzweigungsgrad von weniger als 100% auf (sog. dendritische Polymere). Dendritische Polymere haben gegenüber Dendrimeren (maximal verzweigt) mehrere Vorteile. Bei Dendrimeren nimmt die sterische Hinderung mit zunehmendem
Verzweigungsgrad zu, so dass dem Wachstum der Hülle theoretisch Grenzen gesetzt sind und die Partikel einen bestimmten Durchmesser nicht überschreiten können. Bei dendritischen Polymeren ist das nicht der Fall. Außerdem haben dendritische Polymere den Vorteil, dass sie nicht nur an deren Oberfläche, sondern auch im Innern über freie funktionelle Gruppen verfügen. Diese kann man beispielsweise nutzen um andere
Moleküle, wie z.B. medizinisch wirksame Substanzen oder andere Markermoleküle zu koppeln. Des Weiteren haben dendritische Polymere eine größere Beweglichkeit (Flexibilität) als Dendrimere. Erfindungsgemäß beträgt die Schichtdicke der Hülle aus dPGS und Linker ca. 1-20 nm, vorzugsweise von 2-10 nm.
Das durchschnittliche Molekulargewicht der dPGS beträgt etwa 100 bis 1.000.000 g/mol, bevorzugt 2.500 - 200.000 g/mol und besonders bevorzugt von 5.000 - 15.000 g/mol.
Die dPGS weisen Sulfatgruppen -OSOaX auf; worin X gleich H, ein Alkalimetallatom wie Li, Na oder K, oder ein Ammoniumion wie Triethylammonium oder Diisopropylethylammonium ist. Die Sulfatgruppen können mit Hilfe geeigneter Sulfatierungsreagenzien in die als Ausgangsverbindung eingesetzten dendritischen Polyglycerole eingeführt werden (Türk H, Haag R, Alban S (2004) „Dendritic Polyglycerol sulfates as new heparin analogues and potent inhibitors of the complement System", Bioconjugate Chem 15:162-167.). Die dendritischen Polyglycerole sind z.B. herstellbar durch eine einstufige anionische Polymerisation (z.B. eine sog. anionic multibranching ringopening polymerization, Haag R, Mecking S, Türk H. DE 1021 1664A1 ; 2002). Als Sulfatierungsreagenz wird bevorzugt ein Komplex aus S03 mit Basen, wie Pyridin oder Triethylamin verwendet. Über das Verhältnis von S03 zu den OH-Gruppen des dendritischen Polyglycerols kann der resultierende Sulfatierungsgrad eingestellt werden.
Der Sulfatierungsgrad beträgt 1-100%, bevorzugt 50-99%, und besonders bevorzugt 80-99%, ganz besonders bevorzugt 84-99%.Der Begriff „Sulfatierungsgrad" drückt im Rahmen dieser Erfindung den Prozentsatz der -OH-Gruppen der Glycerineinheiten des dPG (dendritisches Polyglycerol) aus, die im dPGS sulfatiert sind. Ist z.B. die Hälfte der -OH Gruppen der Glycerineinheiten sulfatiert, so beträgt der Sulfatierungsgrad 50%.
Der Kern besteht aus einem nanoskaligen anorganischen Material. Grundsätzlich eignen sich alle Metalle und anorganischen Metallverbindungen, die inert und biokompatibel, und wasserunlöslich sind. Wegen ihrer hohen Biokompatibilität sind Gold und Eisenoxidbesonders bevorzugt und eignen sich daher besonders für die Verwendung im therapeutischen oder diagnostischen Bereich. Ganz besonders bevorzugt sind Gold Nanopartikel. Typischerweise hat der Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel einen Durchmesser von 5-45 nm vorzugsweise von 10-30 nm.
Als Linker eignen sich d-Czo-Kohlenwasserstoffreste, z.B. verzweigte oder lineare C C20-Alkylketten, optional unterbrochen mit -NH-, -O-, -S-, -(C=0)-NH-, -(C=0)-0-, -N- (C=0)-N-,-N-(C=S)-N-, -N-(0=O)-O-, -N-(C=S)-0-, oder -triazol-, welche alpha-terminal 1 , 2 oder 3 Thio-Gruppen oder Phosphonat-Gruppen aufweisen und omega-terminal eine oder mehrere, vorzugsweise eine reaktive Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe - (C=0)-OH, C-(C=0)-R, mit R = N-Hydroxysuccinimid, Cl, -N=C=S, -N3, oder -alkin.
Die Linker können über die terminalen Thio-Gruppen oder Phosphonatgruppen kovalent oder koordinativ an den Kern gebunden sein. Im Falle von Gold Nanopartikeln sind alpha-terminale Thio-Gruppen bevorzugt. Die Bindung der Thio-Gruppen zum Gold Nanopartikel findet vorzugsweise über eine „weiche Base, weiche Säure" Bindung statt, die Bindungsenergie beträgt dabei im Allgemeinen 126-146 kJ/mol, was vergleichbar ist zu schwachen kovalenten Bindungen (150-500 kJ/mol). Im Falle von Eisenoxid Nanopartikeln sind alpha-terminale Phosphonat-Gruppen bevorzugt. Dabei erfolgt die Bindung der Phosphonat-Gruppe zum Eisenoxid Nanopartikel bevorzugt über eine koordinative Bindung.
Wegen der hohen Affinität von Schwefel zu vielen Metallen bilden Thio-Gruppen eine bevorzugte Funktion, über die sich die dPGS mit dem Kern verknüpfen lassen.
Bevorzugt werden dabei die Linkermoleküle über Thio-Gruppen wie Thiol-Gruppen oder schwefelhaltige Heterocyclen an die Oberfläche der anorganischen Kerne gekoppelt. Beispiele für schwefelhaltige Heterocyclen sind schwefelhaltige Fünfringe wie Dithiolane.
Bevorzugte Linker sind C1-C2o-Kohlenwasserstoffketten wie Ci-C20-Alkylketten, z.B. Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Octyl oder Decyl. Diese können z.B. über eines oder mehrere, insb. 1, 2 oder 3 Schwefelatome mit dem Kern und über eine Carboxylgruppe mit dem dPGS verbunden sein.
Besonders bevorzugte Linker sind Disulfide, insbesondere cyclische Disulfide wie Dithiolane. Diese weisen eine Adsorptionsenergie auf, die mit der von kovalenten Bindungen vergleichbar ist. Dies ist beispielhaft im Schema 1 für Liponsäure als Linker dargestellt.
Ein geeigneter Linker ist zum Beispiel Liponsäure. Überraschend wurde gefunden, dass Liponsäure dPGS mit einem Mw im Bereich von 10.000 g/mol bis 15.000 g/mol an Gold Nanopartikel mit hoher Stabilität koppelt. Das Linkermolekül ist über eine kovalente Bindung mit dem dPGS verbunden. Die
Bindung des Linkers mit dem dPGS erfolgt über eine funktionelle Gruppe des Linkers, die mit einer freien NH2- oder OH-Gruppe des dPGS verknüpft wird, z.B. über eine Esterbindung oder eine Peptidbindung. Bei der Verknüpfungsreaktion handelt es sich typischerweise um eine Kondensationsreaktion, bei der der Linker über eine funktionelle Gruppe, z.B. eine freie Carboxyl-Gruppe, mit dem dPGS verknüpft wird.
Bei Liponsäure erfolgt die Bindung an dPGS beispielsweise über die Carboxylgruppe. Der Linker bildet im Allgemeinen eine innere Schicht um den anorganischen Kern, um die herum sich eine äußere Schicht aus dPGS befindet.
Typischerweise hat der Linker eine Länge von 0,5-10 nm, vorzugsweise von 1-5 nm.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Nanopartikel einen Kern aus Gold, eine dPGS-Hülle mit einem durchschnittlichem Molekulargewicht Mw von 500-100.000 g/mol und einem Verzweigungsgrad von 30-80% und einem Thio-Linker aus einer d-Ce-Alkyl-Gruppe, mit einer oder mehreren alpha-terminalen Disulfidgruppen und einer omega-terminalen Gruppe -C-(C=0)-OH, -C-(C=0)-Cl oder -
C-(C=0)-N-Hydroxysuccinimid.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst der erfindungsgemäße Nanopartikel einen Kern aus Gold, eine dPGS-Hülle mit einem durchschnittlichem Molekulargewicht von 5.000-15.000 g/mol und einen Verzweigungsgrad von 55-65% und einem Liponsäure-Linker gekoppelt an das dPGS über eine Amid-Bindung.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können gleiche oder voneinander verschiedene dPGS und Linker aufweisen. Bevorzugt wird ein Linkertyp und ein dPGS-Typ eingesetzt.
Überraschenderweise hat sich gezeigt, dass die erfindungsgemäßen Nanopartikel eine sehr hohe Affinität zu Selektinen wie L-Selektin aufweisen. Die hohe Affinität der erfindungsgemäßen Nanopartikel zu Selektinen macht diese zu hervorragend geeigneten Substanzen für den Einsatz im Medizin- oder Diagnostikbereich, vor allem bei entzündlichen Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können mit geeigneten medizinischen Wirkstoffen zu Konjugaten verbunden werden. Diese Konjugate aus den erfindungsgemäßen Nanopartikeln mit Wirkstoffen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Damit können beispielsweise Substanzen sehr selektiv in entzündetes Gewebe transportiert werden.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Nanopartikel liegt darin, dass keine weiteren zielführenden Moleküle wie z.B. Antikörper, Antikörperfragmente, Proteine, Peptide oder Oligonucleotiden für den Transport der Partikel an den Wirkungsort eingesetzt werden müssen, da das dPGS selbst zielführend wirkt. Dies verringert den synthetischen Aufwand und die damit verbundenen Kosten und erhöht die Robustheit des Systems. Weiterhin benötigen die erfindungsgemäßen Nanopartikel bei disgnostischen Anwendungen nicht notwendigerweise signalgebenden Moleküle, da die anorganischen Kernmaterialien wie Gold oder Eisenoxid selbst als Signalgeber wirken können, beispielsweise in MSOT (Multispektrale Optoakustische Tomographie) Messungen oder im MRT.
Als Arzneimittel oder pharmazeutische Zusammensetzung mit akzeptablen Träger können die Nanopartikel z.B. in Form Tabletten, Kapseln, Pulver, Suspensionen, und Infusionen angewendet werden. Die Arzneimittel oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können des Weiteren Träger und/oder Hilfsstoffe enthalten.
Geeignete Träger und Hilfsstoffe beinhalten Bindemittel, Suspensionsmittel, Gleitmittel, Farbstoffe, Geschmacksstoffe und Konservierungsmittel.
Für eine therapeutische Behandlung mit den erfindungsgemäßen Nanopartikeln kommen z.B. alle entzündlichen Prozesse in Frage, sowohl akuter wie chronischer Art.
Erfindungsgegenstand ist daher auch die Verwendung als Prophylaktika oder Therapeutika für Entzündungserkankungen. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Substanzen eingesetzt bei Erkrankungen bei denen die Extravasation von Leukozyten ins Gewebe eine Rolle spielt und zu Gewebsschädigungen führt.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel eigenen sich vor allem zur Behandlung von chronisch entzündlichen Erkrankungen, insbesondere von rheumatoider Arthritis, Psoriaris, Morbus Crohn, ulzerative Colitis, Allograft-Abstoßung, Asthma, Beryliose oder von Autoimmunerkrankungen oder Gewebeabstoßung.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen eingesetzt werden, bei denen die Selektin-vermittelte Leukozytenadhäsion dysreguliert ist. Bei chronisch entzündlichen Prozessen kommt es nach Gewebezerstörung zur
Entstehung von Fibrosen. Dabei spielen die beiden Cytokine IFN und TNFa eine wichtige Rolle. IFNy wird von einer bestimmten Population von Leukozyten abgesondert und führt zur Aktivierung von Makrophagen, die ihrerseits hydrolytische Enzyme und reaktive Sauerstoff- und Stickstoffspezies produzieren, was zur Zerstörung von umliegendem Gewebe führt. Außerdem wird TNFa freigesetzt, was zur
Expression von Zelladhäsionsmolekülen auf benachbarten Endothelien führt, wodurch vermehrt Leukozyten rekrutiert werden.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel binden Selektine wie L- und P-Selektin mit besonders hoher Affinität und blockieren so die Interaktion mit ihren Liganden. Der Leukozyten/Endothel-Kontakt wird reduziert und damit das vermehrte Auswandern der Leukozyten in die Entzündungsherde unterdrückt.
Die Nanopartikel können daher auch als selektive Selektin-Inhibitoren eingesetzt werden. Mit den erfindungsgemäßen Nanopartikeln konnten überraschenderweise ICso-Werte von bis zu 180 fM beobachtet werden, welche bis um den Faktor 100 niedriger sind als die IC50-Werte für aus dem Stand der Technik bekannte Substanzen (z.B. EP 2123269 A1). Die erfindungsgemäßen Nanopartikel eignen sich somit besonders vorteilhaft zur Inhibition der Selektin-vermittelten Leukozytenadhäsion.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können auch als Diagnostika verwendet werden, z.B. als Kontrastmittel zum Einsatz in bildgebenden Verfahren wie MRT und MSOT. Bevorzugt ist der Einsatz als Diagnostika bei Entzündungskrankheiten, z.B. als Selektinindikatoren zur Diagnose, Lokalisierung und Visualisierung der Selektine verwendet werden, insbesondere in vitro in entzündetem Gewebe, in Organen, in Gewebeschnitten aber insbesondere auch in vivo. Durch den anorganischen Kern der erfindungsgemäßen Nanopartikel eignen sich diese direkt als Kontrastmittel, z.B. Gold- Nanopartikel in der MultispektralenOptoakustischen Tomographie (MSOT) und Eisenoxid-Nanopartikel in der MRT (Magnetresonanz Tomographie).
Falls erforderlich oder erwünscht, können die erfindungsgemäßen Nanopartikel auch mit weiteren signalgebenden Molekülen beladen oder an signalgebende Moleküle gebunden werden.
Bevorzugte signalgebende Moleküle sind beispielsweise radioaktive Isotope wie lod- 124, lod-125 oder Fluor-18. Daneben können auch Farbstoffe, insbesondere Fluorophore wie z.B. Aminomethylcoumarin, Fluorescein, Cyanin, Rhodamin und deren Derivate verwendet werden. Bei den signalgebenden Molekülen kann es sich jedoch auch um einen Fluoreszenzdonor oder -reporter und einen Fluoreszenzakzeptor oder -quencher handeln, die insbesondere als Paar aus jeweils einem Fluoreszenzdonor/- reporter und einem FluoreszenzakzeptorA-quencher verwendet werden können.
Beispiele solcher Konjugate mit signalgebenden Molekülen sind:
1) Gold-Nanopartikel-dPGS, kovalent konjugiert mit Cyaninfarbstoff,
2) Gold-Nanopartikel-dPGS, kovalent konjugiert mit Rhodaminfarbstoff,
3) Gold-Nanopartikel-dPGS, kovalent konjugiert mit Chelatoren für Radionuklide wie z.B. 1 ,4,7,10-tetraazacyclododecan-1 ,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA), diethylenetriamin-pentaessigsäure (DTPA) oder Mercaptoacetyltriglycin (MAG3).
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel sind auch in der Lage, Chemokine spezifisch zu binden. Dabei handelt es sich z.B. um proinflammatorische Cytokine, insbesondere TNFa, IL-1 , IL-6, sowie IL-8 und MIP-1 ß. Bei einer inhibitorischen Bindung der Chemokine, wie INF oder TNFa, durch die erfindungsgemäßen dPGS-Nanopartikel wird eine Interaktion mit Rezeptoren der Chemokine verhindert, so das Gewebeschädigung und Leukozytenextravasation verhindert werden.
Aufgrund ihrer spezifischen Wechselwirkungen mit Proteinen wie Selektinen, Chemokinen und Gerinnungsfaktoren, insbesondere mit L- und P-Selektin können die erfindungsgemäßen Nanopartikel bevorzugt auch in in vitro Applikationen angewendet werden. Hierzu werden die erfindungsgemäßen Nanopartikel - analog zur kommerziell erhältlichen Heparinsepharose - an eine Matrix immobilisiert. Bevorzugte Matrices, bzw. Oberflächen zur Immobilisierung sind anorganische sowie polymere natürliche synthetische Materialien, beispielsweise Glas, Silica, Dextran, Agarose, Sepharose oder synthetische hydrophile Polymere. Die immobilisierten erfindungsgemäßen Nanopartikel können zur Fraktionierung von biologischen Proben wie Körperflüssigkeiten, Plasma, Blut, Serum, Zellsuspensionen und Überständen von Zellkulturen, oder zur Reinigung spezifischer Proteine wie z.B. L- Selektin, P-Selektin, Chemokine, Gerinnungsfaktoren eingesetzt werden. Schließlich können die erfindungsgemäßen Nanopartikel auch als Fänger, z.B. im
ELISA, verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel weisen damit viele Vorteile auf: Sie sind sehr gut biokompatibel, einfach herzustellen, und haben eine sehr hohe Affinität zu L- und P- Selektin.
HERSTELLUNG
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel wird in den folgenden Schemata und Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Dabei werden In den dargestellten Reaktionsschemata folgende Abkürzungen verwendet:
AuNP = Gold Nanopartikel
AuNR = Gold Nanostäbchen
DCC = Dicyclohexylcarbodiimid
MsCI = Methansulfonylchlorid
NHS = /V-Hydroxysuccinimid
DIPEA = Diisopropylethylamin
Pyr = Pyridin
TA = Liponsäure
mPEG-SH 1000=Methoxy-terminiertes Polyethylenglycol-Thiol mit einem
Molekulargewicht von 1000 g/mol
CTAB= Cetyltrimethylammoniumbromid
MSOT= Multispectral Optoacoustic Tomography
OD= Optische Dichte
Die Figuren zeigen:
Fig. 1: Aufbau von dendritischem Polyglycerol. Terminale (T), lineare (L) und dendritische (D) Wiederholungseinheiten sind grau unterlegt.
Fig. 2 (Schema 1): Liponsäure als Linker.
Fig. 3 (Schema 2): Reaktionsschema zur Herstellung eines aktivierten Linkermoleküls am Beispiel von Liponsäure (NHS-Aktivierung von Liponsäure) nach der Synthese von Liu et at. (Liu, W. Journal of the American Chemical Society. 2008, 1274-1284).
Fig. 4 (Schema 3): Reaktionsschema zur Herstellung eines Amin-funktionalisierten dendritischen Polyglycerols (Roller, S.; Zhou, H.; Haag, R. molecular diversity. 2005, 9, 305-316). Das dPG Ausgangsmaterial wurde durch eine einstufige „anionic multibranching ringopening polymerization" synthetisiert (Haag R, Mecking S, Türk H. DE 10211664A1 , 2002); Kontrollierte Amin-Funktionalisierung von dPG.
Fig. 5 (Schema 4): Reaktionsschema zur Sulfatierung der OH-Gruppen des dendritischen Polyglycerols (Türk H, Haag R, Alban S (2004) Dendritic Polyglycerol sulfates as new heparin analogues and potent inhibitors of the complement System. Bioconjugate Chem 15:162-167.); Sulfatierung von teilaminiertem dPG.
Fig. 6 (Schema 5): Reaktionsschema zur Kopplung eines Linkers wie eines Liponsäure-Linkers an dPGS; Funktionalisierung von dPGS mit einem Liponsäure- Linker.
Fig. 7 (Schema 6): Ligandenaustausch von Citrat-stabilisierten Gold Nanopartikeln mit dPGS in wässriger Lösung. Die Anzahl von Citrat bzw. dPGS pro Gold Nanopartikel ist hierbei nur schematisch dargestellt (Ligandenaustausch an citrat-stabilisierten Gold Nanopartikeln mit TA-dPGS in wässriger Lösung).
Fig. 8 (Schema 7): zeigt die mPEG-SH 1000 Funktionalisierung von CTAB- Funktionalisierten Gold Nanostäbchen. Die Goldnanostäbchen sind hierbei nur schematisch dargestellt; Ligandenaustausch auf Goldnanostäbchen von CTAB Doppelschicht zu mPEG-SH 1000 Schicht.
Fig. 9 (Schema 8): zeigt die TA-dPGS 10.000 g/mol Funktionalisierung von mPEG-SH 1000 Funktionalisierten Gold Nanostäbchen. Die Goldnanostäbchen sind hierbei nur schematisch dargestellt; Ligandenaustausch auf Goldnanostäbchen von mPEG-SH 1000 Schicht zu TA-dPGS 10.000 g/mol Schicht.
Fig. 10 (Abb. 1): SPR-Sensorgramm von dPGS-TA funktionalisierten Gold Nanopartikeln.
Fig. 11 (Abb. 2): SPR-Sensorgramm von AuNR-TA-dPGS 10.000 g/mol.
Die erfindungsgemäßen Nanopartikel können hergestellt werden, indem zunächst das dPGS mit einem Linker verknüpft wird und das Reaktionsprodukt anschließend mit dem Kernmaterial aus anorganischen Nanopartikeln umgesetzt wird.
Der Linker, z.B. Liponsäure, kann aktiviert werden, z.B. indem es mit N- Hydroxysuccinimid in Dichlormethan und Tetrahydrofuran zum Liponsäure-Succinimid umgesetzt wird (siehe Fig. 3, Schema 2).
Das als Ausgangsstoff verwendete dPG kann z.B. erhalten werden durch eine einstufige anionische mehrfachverzweigende ringöffnende Polymerisation" (Haag R, Mecking S, Türk H., DE 10211664A1 , 2002). Dieses kann vor der Umsetzung mit dem Linker funktionalisiert werden, z.B. mit Amingruppen (Fig. 4, Schema 3). Das dPG kann mit Sulfatierungsmitteln wie SCyPyridin zu dPGS umgesetzt werden (Fig. 5, Schema 4).
Die Verknüpfung des aminfunktionalisierten, dendritischen dPGS mit dem Linker erfolgt z.B. über eine Succinimid-Kupplung in Dichlormethan mit /V,/V-diisopropylethylamin als Base (siehe Fig.6 (Schema 5) ).
Die anorganischen Nanopartikel, die sich als Kern zur Herstellung der erfindungsgemäßen dPGS-Nanopartikel eignen, können z.B. durch ein von X. Lou und C. Wang, C (Biomacromolecules, 2007, 8, 1385-1390) beschriebenes Verfahren hergestellt werden, z.B. durch Reduktion von HAuC mit Natriumeitrat in wässriger Lösung bei Temperaturen um 100 °C.
Die anorganischen Nanopartikel stäbchenförmiger Art, die sich als Kern zur Herstellung der erfindungsgemäßen dPGS-Nanopartikel eignen, können z.B. durch eine von Jana Nikhil entwickelte Vorschrift synthetisiert werden (N., Small, 2005, 8, 875-882). Die CTAB-Funktionalisierten Gold Nanostäbchen können dann z.B. wie in der Vorschrift von Xiaoge Hu and Xiaohu Gao (X. Hu, X. Gao, Phys. Chem. Chem. Phys., 2011 , 13, 10028-10035) mit mPEG-SH 1000 funktionalisiert werden.
Zum Schluss erfolgt die Kupplung der dPGS mit Hilfe des Linkers an die Kernpartikel. Dazu kann z.B. die von Mei, B. C; Susumu, K.; Medintz, I. L.; Delehanty, J. B.; Mountziaris, T. J.; Mattoussi H. (Journal of Materials Chemistry. 2008, 18, 4949-4958) beschriebene Methode angewendet werden, in welcher die Citrathülle der anorganischen Nanopartikel im wässrigen System gegen das mit einem Linker wie Liponsäure funktionalisierte dPGS über Nacht bei Raumtemperatur ausgetauscht wird. Eine Aufreinigung erfolgt anschließend über Dialyse in Wasser (Fig. 7, Schema 6).
Bei den Goldnanostäbchen erfolgt die Kupplung des TA-dPGS 10.000 g/mol an mPEG-SH 1000 g/mol z.B. bei 60 °C über 12 Stunden unter Rühren in Wasser. Anschließend erfolgt die Aufreinigung z.B. über Waschen durch Zentrifugation.
Die Synthese von Konjugaten aus TA-dPGS 10.000 g/mol oder 5.000 g/mol funktionalisierten Gold Nanopartikeln oder Gold Nanostäbchen mit Wirkstoffen oder anderen signalgebenden Molekülen oder Chelatoren für signalgebende radioaktive Metalle kann über zwei Wege erfolgen.
In dem ersten Ansatz können die Wirkstoffe oder signalgebenden Moleküle mit einem Linker mit einer oder mehreren alpha-terminalen Disulfidgruppen wie z.B. Liponsäure verknüpft werden, z.B. über eine Esterbindung, Peptidbindung oder Triazoleinheit. Wirkstoffe können z.B. auch über säure-labile Bindungen wie z.B. Acetalbindungen, Esterbindungen oder auch Hydrazonbindungen verknüpft werden. Anschließend können die mit Linker versehenden signalgebenden Moleküle oder Wirkstoffe bei dem Inkubieren von Gold Nanopartikeln oder Gold Nanostäbchen mit dem TA-dPGS 10.000 g/mol oder TA-dPGS 5.000 g/mol statistisch mit untergemischt werden. Somit wird eine statistische Verteilung von Wirkstoffen, signalgebenden Molekülen und TA-dPGS auf der Oberfläche erreicht.
Alternativ können die Wirkstoffe oder signalgebenden Moleküle kovalent and das TA- dPGS gebunden werden. Hierbei wird ein dPG mit mehreren Azidgruppen funktionalisiert wie in Schema 3 (Fig. 4) beschrieben. Anschließend wird nur ein Teil dieser Azidgruppen zu Amingruppen reduziert. Die Linkereinheit wie z.B. Liponsäure wird an die Amingruppe wie in Schema 5 (Fig. 6) beschrieben gekoppelt. Anschließend können die noch vorhandenen Azidgruppen für z.B. eine Azid-Alkin Huisgen Cycloaddition benutzt werden (Huisgen, R., Proc. Chem. Soc, 1961 , 357-396) um das signalgebende Molekül oder den Wirkstoff mit dem TA-dPGS zu verbinden. Alternativ können auch mehrere Azidgruppen reduziert werden und die Linker Einheit und der Wirkstoff oder das signalgebende Molekül statistisch an das dPGS wie in Schema 5 (Fig. 6) über eine Amidkupplung verbunden werden. Das mit dem Wirkstoff oder signalgebende Molekül verbundene TA-dPGS kann dann für die Funktionalisierung der Gold Nanopartikel oder Gold Nanostäbchen verwenden werden. Verwendung
Aufgrund ihres anorganischen Kerns eignen sich die erfindungsgemäßen TA-dPGS funktionalisierten Nanopartikel oder Nanostäbchen hervorragend für die Verwendung als Kontrastmittel für die Diagnostik von Entzündungskrankheiten wie z.B. durch MSOT (Multispectral Optoacoustic Tomography). Genauere Informationen zu MSOT-
Messungen sind z.B. in dem Review von Vasiiis Ntziachristos enthalten. (Ntziachristos, V.; Razansky, D. chemical reviews 2010, 110, 2783-2794). Für die Untersuchung der Wirksamkeit der erfindungsgemäßen TA-dPGS funktionalisierten Nanopartikel oder Nanostäbchen als Kontrastmittel für z.B. MSOT-Messungen kann z.B. ein LPS- induziertes Arthritis Modell benutzt werden (Chen, W; Mahmood, U; Weissleder, R;
Tung, C, Arthritis Res Ther. 2005, 310-317). Hierbei wird einer Maus Lipopolysaccharide (LPS) intra-artikular injuziert. Anschließend wird der Maus z.B. die AuNR-TA-dPGS 10.000 g/mol Suspension (z.B. 100 μί, 100 OD) intravaskulär injiziert. Eine anschließende MSOT-Untersuchung zeigt einen erhöhten Kontrast bei den Arthritis-induzierten Gelenken aufgrund der starken Anlagerung der TA-dPGS funktionalisierten Nanopartikel oder Nanostäbchen an das L-Selektin des entzündetem Endothel. Eine Markierung der erfindungsgemäßen TA-dPGS funktionalisierten Nanopartikel oder Nanostäbchen mit signalgebenden Molekülen wie z.B. Cyaninfarbstoffe, Rhodaminfarbstoffe, oder Chelatoren für Radionuklide ermöglicht die Verwendung von weiteren Diagnostikmethoden wie z.B. Fluoresenztomographie, PET (Positronen Emmisions Tomographie) oder SPECT (Einzelphotononen
Emmisionscomputertomographie) über analoge Messungen.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen TA-dPGS funktionalisierten Nanopartikel oder Nanostäbchen als entzündungshemmendes Mittel kann z.B. durch ein Allergisches Kontaktdermatitis-Modell aufgezeigt werden. Hierbei wird wie in
(Dernedde J., Rausch A., Weinhart M., Enders S. Tauber R., Licha K., Schirner M. Zügel U. Von Bonin A. Haag R., Proc. Nat. Aca. Sei. USA 2010, 107, 19679-19684) beschrieben einer Maus durch die Injektion in das Ohr von dem Allergen Trimellitic Anhydrid (TMA) eine akute allergische Kontaktdermatitis induziert. Anschließend wird dosisabhängig die Ohrdicke bei gleichen Zeitabständen nach der Zugabe des entzündungshemmenden Mittels gemessen. Anhand der verringerten Ohrdicke im Vergleich zu der Kontrolle ohne Zugabe von entzündungshemmendem Mittel kann die Effizienz der Entzündungshemmung bestimmt werden.
AUSFÜHRUNGSBEISPIELE
Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert. Sphärische Nanopartikel mit einem Goldkem (AuNP) und einer Hülle aus dendritischen
PGS mit Molekulargewichten von 5.300 g/mol, bzw. 10.000 g/mol und einem Sulfatierungsgrad von 85% wurden unter Verwendung von Liponsäure (TA) als Linker wie folgt hergestellt: Methoden:
1 H-NMR und 13C-NMR wurden an einem Bruker™ ECX Spektrometer bei 400 MHz aufgenommen. Die Chemische Verschiebung wird als δ (ppm) angegeben und wurde auf das Lösemittelsignal bezogen. Multiplizitäten werden als s (singlet), d (doublet), t (triplet), q (quartet) und m (multiplet) angegeben. Die dazugehörigen Kopplungskonstanten J werden in Hertz (Hz) angegeben. Die Analyse der Daten wurde mit MestReNovaTM Version 6.0.2 vorgenommen.
UV/Vis Absorptionsspektra wurden an einem UV/Vis Spektrophotometer von Scinco™ Co., LTD aufgenommen. Die Analyse der Daten wurde an der dazugehörigen LabProPlus™ Software vorgenommen. DLS und Zeta-Potential Messungen wurden an einem Zetasizer Nano ZS analyzer aufgenommen mit einem integriertem 4 mW He-Ne laser, λ = 633 nm (Malvern Instruments™ Ltd, U.K.). DLS Messungen wurden entweder in Reinstwasser oder 10 mM Phosphatpuffer bei pH=7.4 aufgenommen. Alle Zeta Potential Messungen wurden einem 10 mM Phosphatpuffer bei pH=7.4 aufgenommen.
TEM Transmissions Elektronenmikroskopie wurde an einem CM-12 von FEI™ mit einer Beschleunigungsspannung von 100 kV aufgenommen. Die Daten wurden mit Jlmage vi .43 analysiert.
Die kompetetiven Oberflächenplasmonenresonanzmessungen für die Bestimmung der Selektin-Bindung wurden an einem Biacore™ X Gerät durchgeführt.
Beispiel 1 : Herstellung von TA-dPGS 10.000 g/mol:
Die Funktionalisierung von dPGS mit einem Molekulargewicht von 10.000 g/mol mit Liponsäure-NHS war wie folgt. dPGS 10.000 g/mol (500 mg, 0.05 mmol) wurden in einer Mischung aus Dimethylformamid (15 mL) und destilliertem Wasser (13 mL) gelöst. Anschließend wurden Liponsäure-NHS (15.15 mg, 0.05 mmol) und DIPEA (0.017 mL, 0.1 mmol) hinzugegeben und die Reaktionsmischung wurde für 3 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösemittel wurde in vacuo entfernt und das Rohprodukt wurde zunächst gegen Methanol, dann Natriumchlorid-Lösung und anschließend destilliertem Wasser dialysiert. Nach Gefriertrocknung wurde das Produkt als farbloses Pulver erhalten (491 mg, 95%).
1H-NMR (400 MHz, D20): δ (ppm) 4.64-3.00 (m, 331 H, PG-backbone, S-S-CH2-, S- S-CH2-, S-S-CH-), 2.38 (m, 1 H, S-CH2-CH2-), 2.19 (m, 2 H, CH2CO-), 1.9 (m,1 H, S-CH2-CH2-), 1.52 - 1.52 (m, 10 H, CH2-CH2-CH2-CH2CO-, -CH2- Initiator), 0.78 (m, 3 H, CH3- Initiator). 13C-NMR (400 MHz, D20): δ (ppm) 80-65 (PG-backbone).
Beispiel 2: Herstellung von citrat-stabilisierten Gold Nanopartikeln mit einem Durchmesser von 17 nm:
Die Herstellung von citrat-stabilisierten Gold Nanopartikeln mit einem z-average Durchmesser von 17 nm wurde nach einer leicht modifizierten Vorschrift von Lou et al. synthetisiert (Lou, X.; Wang, C; He, L. biomacromolecules. 2007, 8, 1385-1390.) Die Glasgeräte sowie der Rührfisch wurde mit aqua regia gewaschen, mit Millipore gereinigt und anschließend bei 120 °C getrocknet. HAuCI 3H20 (34.42 mg, 0.087 mmol) in Reinstwasser (340 mL) wurde unter Rückfluss für 20 Minuten erhitzt bei 110 °C. Anschließend wurde eine Trinatrium Citrat-Lösung (187 mg, 0.524 mmol) in Reinstwasser (20 mL) zu der Lösung gegeben. Nach 15 Minuten trat ein Farbwechsel von gelb zu tiefrot ein. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und durch ein Cellulosefilter (0.22 pm) gefiltert. Die erhaltene Goldkolloidsuspension wurde bei 4°C im Dunkeln gelagert. Partikelanalyse über Dynamische Lichtstreuung in Reinstwasser ergaben einen z-average Durchmesser von 17.17 nm bei einem Polydispersitätsindex von 0.06. Der Feret Durchmesser bestimmt durch die automatische Auszählung von Elektronenmikroskopie Aufnahmen bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV mithilfe des Programs Jlmage ergab einen Wert von 18 nm ± 2.8 nm und bestätigte den Durchmesser der Partikel. UV-Vis Messung der Partikel ergab ein Plasmonen Absorptionmaximum bei 520 nanometern. Die Konzentration der Goldnanopartikel wurde anschließend anhand der Annahme eines 100 prozentigen Goldsäure Umsatzes und der Geometrischen Faktoren der Nanopartikel berechnet. Die erhaltene Konzentration von 1.39 nanomolar stimmte sehr gut mit der Mie Theorie wie in (Haiss, W.; Thanh, N.; Aveyard, J.; Fernig, D, anal. Chem. 2007, 79, 4215-4221.) beschrieben überein.
Beispiel 3: Herstellung von AuNP-TA-dPGS mit 5.300 g/mol:
Für den Ligandenaustausch wurde eine Suspension von 17 nm citrat-stabilisierten Gold Nanopartikeln (20 mL, 1.39E-9 mol/l, 2.79E-1 1 mol mit TA-dPGS 5.3 kDa (4.3 mg) (synthetisiert nach Schema 5 (Fig. 6)) über Nacht bei Raumtemperatur unter Rühren inkubiert und anschließend über Dialyse gegen H20 aufgereinigt. Die Menge des eingesetzten TA-dPGS entsprach 2 Äquivalenten TA-dPGS pro Goldoberflächenatom auf dem Partikel. Da 15 nm Partikel nach Mei er al. (Mei, B. C; Oh, E.; Susumu, K.; Farrell, D.; Mountziaris, T. J.; Mattoussi, H. langmuir. 2009, 25, 10604-1061 1.) ungefähr 10000 Gold Atome auf der Oberfläche haben, entspricht dies bei 17 nm Partikeln ungefähr 14000 Gold Atomen auf der Oberfläche. Aus diesem Grund wurden 28000 Äquivalente TA-dPGS pro Gold Nanopartikel eingesetzt, wodurch eine vollständige Besetzung der Partikel gegeben war. Nach der Inkubation über Nacht und Aufreinigung durch Dialyse gegen Wasser konnte über Dynamische Lichtstreuung in Reinstwasser ein z-average Durchmesser von 22.68 nm bei einem Polydispersitätsindex von 0.18 gemessen werden. Ein Rotverschiebung des Plasmonen Absorptionsmaximums von 520 nanometern zu 523 nanometern bestätigte die Funktionalisierung.
Beispiel 4: Herstellung von AuNP-TA-dPGS mit 10.000 g/mol:
Die Herstellung erfolgt analog der Synthese in Beispiel 3, nur wurden hier 7.81 mg von TA-dPGS 10.000 g/mol eingesetzt, um 28000 Äquivalente dPGS 10.000 g/mol pro Gold Nanopartikel zu erreichen. Nach der Inkubation über Nacht und Aufreinigung durch Dialyse gegen Wasser konnte über Dynamische Lichtstreuung in Reinstwasser ein z-average Durchmesser von 22.90 nm bei einem Polydispersitätsindex von 0.18 gemessen werden. Beispiel 5: Synthese von AuNR mit einer Länge von 40 nm und einem
Durchmesser von 10 nm:
Stäbchenförmige Nanopartikel mit einem Goldkern (AuNR) und einer Hülle aus dendritischen PGS mit Molekulargewichten von 5.300 g/mol, bzw. 10.000 g/mol und einem Sulfatierungsgrad von 85% wurden unter Verwendung von Liponsäure (TA) als
Linker wie folgt hergestellt:
Die Synthese erfolgte angelehnt an die Vorschrift von Jana Nikhil (N., small, 2005, 8, 875-882). Alle Glasgeräte wurden zunächst gründlich mit aqua regia und Reinstwasser gereinigt. HAuCI4-3H20 (98 mg, 0.25 mmol) wurde in Reinstwasser (260 mL) gelöst. Anschließend wurden CTAB (18.2 g, 50 mmol), Silbernitrat (8.5 mg, 0.05 mmol) und Ascorbinsäure (88 mg, 0.5 mmol) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Ein Farbwechsel von leicht gelblich, zu rötlich zu farblos trat ein. Anschließend wurde NaBH4 (9.5 pg, 2.5E-7 mol) unter starkem Rühren zu der Reaktionsmischung gegeben. Die Reaktionslösung verfärbte sich nach 15 Minuten tiefrot bis purpurfarben und der Überschuss an CTAB wurde durch zweimaliges Zentrifugieren entfernt. Die gereinigten CTAB-Funktionalisierten Gold Nanostäbchen wurden bei 4 °C im Dunkel gelagert. Zeta-Potential Messungen über Dynamische Lichtstreuung in einem 10 mM Phosphatpuffer bei einem pH von 7.4 ergaben ein Zeta Potential von +30 mV und bestätigten somit die positiv geladene CTAB Hülle. Die Proportionen der Partikel und Verteilung wurden mittels Elektronenmikroskopischer Aufnahmen bei einer Beschleunigungsspannung von 100 kV bestimmt und ergaben eine Länge der Partikel von 40 nm und einem Durchmesser von 10 nm. UV- Vis Spektren wurden benutzt um die optischen Eigenschaften der Partikel sowie deren Dispersion zu untersuchen und ergaben ein transversalen Plasmonenabsorptionsmaximum von 515 nm und ein longitudinalen Plasmonenabsorptionsmaximum von 788 nm.
Beispiel 6: mPEG-SH 1000 Funktionalisierung von AuNR-CTAB
Die Funktionalisierung von AuNR-CTAB mit mPEG-SH 1000 erfolgte angelehnt an die Vorschrift von von Xiaoge Hu and Xiaohu Gao (X. Hu, X. Gao, Phys. Chem. Chem.
Phys., 201 1 , 13, 10028-10035). mPEG-SH 1000 (0.134 g, 133 mmol, 1.24E5 eq.) wurde zu einer CTAB-Funktionalisierte Gold Nanostäbchen Suspension (4 mL, 2.7E-7 mol/l, 1.08E-9 mol) gegeben und für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die 1.24E5 eingesetzten Äquivalente beruhen auf einer Beobachtung von Sanda C. Boca wie in (S. Boca, Nanotechnology, 2010, 21 , 235601) beschrieben. Anschließend wurden die Partikel durch zweimaliges Zentrifugieren mit Reinstwasser gewaschen. Die erfolgreiche mPEG-SH Funktionalisierung wurde mittels UV-Vis Spektroskopie anhand der Rotverschiebung von 4 nm sowie dem neutralen Zeta-Potential in 10 mM Phosphatpuffer bei pH=7.4 mittels Dynamischer Lichtstreuung bestätigt. Beispiel 7: TA-dPGS 10.000 g/mol Funktionalisierung von AuNR-PEG
TA-dPGS 10.000 g/mol (20 mg, 2E-6 mol) wurde zu einer AuNR-mPEG-SH 1000 Suspension (0.2 ml_, 7.23E-8 mol/l, 1.44E-6 mol) gegeben und für 12 Stunden bei 60 °C gerührt. Anschließend wurden die Partikel fünfmal durch Zentrifugieren mit Reinstwasser gewaschen. Die erfolgreiche Funktionalisierung wurde anhand des negativen Zetapotentials mittels Dynamischer Lichstreuung in einem 10 mM Phosphatpuffer bei pH=7.4 bestätigt.
Beispiel 8: Messung der Bindungsaffinität von AuNP-TA-dPGS 10.000 g/mol und AuNP-TA-dPGS 5.300 g/mol:
Um die Bindungsaffinität der hergestellten AuNP-TA-dPGS und AuNR-TA-dPGS zu L- Selektin zu quantifizieren, wurden die IC5o-Werte mittels Oberflächenplasmonenresonanz-Spektroskopie (SPR), in einem kompetetiven Bindungsassay ermittelt. Eine genaue Ausführung der Methode ist in (Enders S., Bernhard G., Zakrzewicz A., Tauber R., Biochim Biophys Acta, 2007, 10, 1441-1449) beschrieben.
Der ICso-Wert gibt dabei diejenige Konzentration einer Substanz an, bei der eine halbmaximale Inhibition beobachtet wird. Sie wurde wie folgt gemessen.
Zunächst wurde die Bindung von L-Selektin modifizierten Gold Nanopartikeln an einen auf der Chipoberfläche immobilisierten, synthetischen Selektin-Liganden (sLeX, 20 mol % + sulfo-Tyrosin 5 mol % gekoppelt auf linearem Polyacrylamid) als positive Kontrolle gemessen und auf 100 % Bindung normalisiert. Das Maß der Bindung wurde hierbei in Resonance Units (RU) gemessen. Anschließend wurden die Selektin-funktionalisierten
Gold Nanopartikel mit AuNP-TA-dPGS als Kompetitor der Bindung in ansteigender Konzentration vorinkubiert und die relative Abnahme der Bindung im Vergleich zur Kontrolle gemessen. Schließlich wurde der IC50 Werte über die Berechnung der Konzentration von AuNP-TA-dPGS bestimmt, das zu 50% des Kontroll- Bindungssignals führt.
Aus den Ansichten des SPR-Sensorgrammes für die AuNP-TA-dPGS 10.000 g/mol und AuNP-TA-dPGS 5.300 g/mol (Fig. 10, Abb. 1 und Fig. 2, Abb. 2) können anschließend die IC50-Werte berechnet werden. Die IC50-Werte geben den Punkt der Kurve bei 50 Prozent relativer Bindung der Kontrolle an.
Hierbei ergaben sich für die 5.300 g/mol und die 10.000 g/mol AuNP-TA-dPGS - Partikel IC50-Werte von 210 fM, bzw. von 180 fM, welche überraschend niedrig sind. Für die AuNR-TA-dPGS 10.000 g/mol ergab sich ein ICS0-Wert von 136 pM. Dieser Wert ist im Vergleich zu dem nanomolaren IC50-Wert von dPGS sehr gering (Dernedde
J., Rausch A., Weinhart M., Enders S. Tauber R., Licha K., Schirner M. Zügel U. Von Bonin A. Haag R., Proc. Nat. Aca. Sei. USA 2010, 107, 19679-19684). Die Partikel können daher verwendet werden, um hoch affin Selektine anzusteuern und bieten somit die Grundlage der erfindungsgemäßen TA-dPGS funktionalisierten Nanopartikel oder Nanostäbchen als Kontrastmittel und als entzündungshemmendes Mittel.

Claims

"Patentansprüche:"
1. Nanopartikel, gekennzeichnet durch
a) einen Kern aus einem anorganischen Material und
b) eine Hülle aus Linker und dendritischem Polyglycerolsulfat,
wobei das Polyglycerolsulfat aus sich wiederholenden Glycerin-Einheiten der Formel (RO-CH2)2CH-OR besteht, wobei R = H, oder weitere Glycerin-Einheiten sind, eine oder von mehrere OH-Gruppen der Glycerin-Einheiten durch Sulfat- Gruppen der Formel -OS03X, worin X gleich H, ein Alkalimetallatom wie Li, Na oder K, oder ein Ammoniumion ersetzt sind,
und wobei der Linker Polyglycerolsulfat und Kern miteinander verbindet.
2. Nanopartikel nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Sulfatierungsgrad des dendritischen Polyglycerolsulfats 1-100%, bevorzugt 50- 99%%, und besonders bevorzugt 80-99% beträgt.
3. Nanopartikel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das dendritische Polyglycerolsulfat ein durchschnittliches Molekulargewicht von 100 bis 1.000.000 g/mol, bevorzugt 2.500 bis 20.000 g/mol und besonders bevorzugt von 5.000 bis 15.000 g/mol aufweist.
4. Nanopartikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Kern aus Gold oder Eisenoxid, vorzugsweise aus Gold besteht.
5. Nanopartikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass der Linker einen C1-C20-Kohlenwasserstoffrest darstellt, der verzweigt oder linear ist und optional unterbrochen ist mit -NH-, -O-, -S-, -(C=0)- NH-, -(C=0)-0-, -N-(C=0)-N-,-N-(C=S)-N-, -N-(C=0)-0-, -N-(C=S)-0- oder -triazol-, und der alpha-terminal 1 , 2 oder 3 Thio-Gruppen oder Phosphonat-Gruppen aufweist und omega-terminal eine oder mehrere reaktive Gruppen, ausgewählt aus der Gruppe -(C=0)-OH, C-(C=0)-R, mit R = N-Hydroxysuccinimid oder Cl, -N=C=S, -N3, oder -alkin, vorzugsweise Liponsäure. 6. Nanopartikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass der Verzweigungsgrad des dendritischen Polyglycerolsulfats 1-100 %, bevorzugt 30-80% und besonders bevorzugt 55-65% beträgt.
Nanopartikel nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikel einen Durchmesser von 10-50 nm haben.
8. Verwendung von Nanopartikeln nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7 als Selektininhibitor.
9. Verwendung von Nanopartikeln nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7 als Träger für Wirkstoffsubstanzen.
10. Konjugat enthaltend Nanopartikel gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 -7 sowie einen oder mehrere Wirkstoffe oder Proteine.
11. Verwendung von Nanopartikeln nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7 oder von Konjugaten nach Anspruch 10 als Kontrastmittel.
12. Verwendung von Nanopartikeln nach einem oder mehreren der Ansprüche 1-7 oder von Konjugaten nach Anspruch 10 zur Diagnose oder zur Behandlung von Entzündungsprozessen.
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