WO2012160232A1 - Procedimiento de obtención y usos de vesículas de membrana plasmática extraídas de plantas enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana - Google Patents

Procedimiento de obtención y usos de vesículas de membrana plasmática extraídas de plantas enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana Download PDF

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Definitions

  • the present invention is framed within the chemical and pharmaceutical sectors, and specifically refers to plasma membrane vesicles of natural origin enriched in intrinsic membrane proteins capable of being applied for dermatological, pharmacological or therapeutic purposes. STATE OF THE TECHNIQUE
  • MP plasma membrane proteins
  • proteins differ in their hydrophobic nature, in the case of intrinsic proteins, and in the variability of their lipid content, which makes them not always easy to extract and purify. , especially proteins with several transmembrane domains immersed in the lipid phase of the membrane.
  • membrane vesicles containing a protein of interest capable of maintaining its functionality and properties, can be an additional advantage in terms of its stability and the economic cost of obtaining it.
  • transmembrane proteins that have a multitude of alpha helices immersed in the lipid matrix. This structure probably implies an entry route through hydrophilic protein environments that would cause a disruption in the highly hydrophobic medium constituted by lipids (Lodish et al., 2005). Proteins intervene in various ways in transport: they act both as ATP-driven pumps, that is, by metabolic energy, or as facilitated diffusion channels.
  • Some of these proteins are capable of transporting water, ions and small solutes through them, such as glycerol and urea, both hygroscopic agents widely used in cosmetics.
  • Liposomes have long been considered as the largest innovative contribution in dermatology for pharmaceutical and cosmetic purposes. However, due to their high cost, the variable purity of their phospholipids and their unstable nature, surfactants containing vesicles are an advantageous alternative. In addition, these vesicles contain intrinsic membrane proteins capable of acting as transporters of certain substances.
  • therapeutic and cosmetic substances that have been used in transport systems are: Name of therapeutic agent Therapeutic Category Reference
  • the extraction of membrane vesicles is obtained by the two-phase polymer system (Larsson et al., 1987) which manages to separate the plasma membrane fraction from the rest of the microsomal fraction. For this, cold homogenization of the tissue and separation into dextran / polyethylene glycol are carried out.
  • Peptide hydrolysates of plant origin have been used: Brassica napus (FR2925325), Triticum monoccocum (FR2925327), Zea mays L. (FR2925326), Triticum turgidum (FR2925328), Solanum tuberosum (FR2925330), Avena sativa L. (FR29259) faba L. (FR2925331), capable of activating the synthesis of aquaporins present in the human epidermis (mainly AQP3), either alone or in combination with other active ingredients.
  • AQP3 is present in the membrane plasma keratinocytes of the epidermis (Sougrat et al., 2002) and plays an important role in controlling the flow of water through the skin.
  • these aquaporins are capable of transporting glycerol which in turn is involved in the constitution of the hydrolipidic film that allows maintaining the flexibility and sensory qualities of the stratum corneum.
  • the hydration and content of AQP3 in keratinocytes are related and an increase in AQP3 in the skin means an improvement in the hydration of the epidermis (Dumas et al, 2007).
  • ingredients capable of activating the synthesis of aquaporins would be the use of naturally occurring vesicles enriched not only in aquaporins but in other membrane proteins that would be used as a lipid vehicle in the release of water or other substances in the epidermis .
  • Aquaporins have also been incorporated into cosmetic formulations (FR20010013463), determining the galenic formula for topical use in the form of an aqueous or oily solution.
  • FR20010013463 cosmetic formulations
  • membrane vesicles of natural (plant) origin that include in addition to these other membrane transport proteins and bioactive compounds or moisturizing agents, has not been included in said formulation, and which forms the basis of this invention.
  • the Brassicaceae family (also called Cruciferae or cruciferae family) contains up to 3500 plant species. Numerous epidemiological studies indicate that crucifixes, including broccoli (Brassica olerácea), are a rich source of bioactive compounds of the secondary metabolism rich in nitrogen-sulfur, glucosinolates, as well as natural phenolic antioxidants (flavonoids, anthocyanins, phenolic acids), vitamins (C, E, A, K, etc.) and essential minerals (nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, iron, manganese, magnesium, zinc, copper, selenium etc.) (Fahey et al. 2001; Moreno et al. 2006 )
  • Vegetable components are also used in the cosmetic industry, for example, the use of extracts of sprouts or sprouts of different fruits, berries and crucifixes, including broccoli, with applications in lotions, massage creams, nutritional creams, gels, to inhibit aging, for the detoxification of the skin or in relation to the treatment of diseases associated with the skin (US2009 / 0306219).
  • Vegetables and their bioactive compounds, including broccoli are also used as additives in anti-aging formulations, where in some cases they account for 0.1 to 10% by weight of plant extracts incorporated in solid powders, pills, capsules or oily precipitates (US 2009/0324522).
  • bioactive compounds can be incorporated into lipid vesicles for subsequent release into the epidermis.
  • the present invention relates to a method of obtaining plasma membrane vesicles from plant material (from a brassica) enriched in aquaporins and other membrane transport proteins, and which in turn can contain other substances such as natural bioactive compounds. , hygroscopic or chemical agents for dermatological, pharmacological and therapeutic purposes.
  • a first aspect of the invention refers to a methodology for increasing the amount of intrinsic membrane proteins associated with water permeability and solutes of the membrane in the product of plant origin.
  • a second aspect refers to membrane vesicles obtained according to the above methodology, which comprises an effective amount of membrane proteins for application in different fields.
  • a third aspect refers to the fields of application of plasma membrane vesicles that allow the release of water or other substances in the epidermis.
  • the present invention relates to a method of obtaining plasma membrane vesicles of plant origin enriched in intrinsic membrane transport proteins characterized in that it comprises:
  • a first stage of stimulation which involves subjecting a plant organism to an abiotic stress process combined with the application of a bioactive compound
  • a second stage which comprises removing membrane vesicles.
  • the enrichment procedure of aquaporins and other membrane transport proteins in vesicles of plant origin will be referred to as the "process of the invention".
  • the process of the invention comprises a stimulation method that involves an increase in membrane proteins in the whole plant, or in fragments thereof, which can be leaves, stem, root and inflorescence which will be used as starting plant material. for the extraction of membrane vesicles or any of their possible combinations.
  • the extraction of vesicles can be obtained from whole plants or fragments thereof, selected from root, stem, leaf, inflorescence or combinations thereof, from different vegetables and vegetables, preferably the Brassicaceae family also called Cruciferae), the family of the crucifers, more preferably Brassica spp. Therefore, a preferred embodiment is the process of the invention where the vegetable is a plant of the Brassicaceae family.
  • Vegetables are selected from turnip, watercress, radish, kohlrabi, cabbage, red cabbage (also called red cabbage), rutabagas, Brussels sprouts, mustards, cabbage, different varieties of broccoli (broccolini, broccoli or broccoli, Romanesco broccoli, white broccoli , purple or lilac broccoli, etc.), as well as other horticultural plants such as cabbage, cabbage, chard, escarole, spinach, beet, lettuce, sage, onion, or garlic.
  • the plant is selected from the group consisting of: turnip, watercress, radish, kohlrabi, cabbage, Lombard cabbage, rutabagas, Brussels sprouts, mustard, cabbage, collard greens, lettuce, spinach, chard, escarole, sage, onion and garlic
  • the vegetable is broccoli.
  • broccoli also called broccoli or broccoli
  • the process of the invention comprises stimulation through a bioactive compound, either a vitamin, a phenolic compound, a glucosinolate, an extract enriched in at least one of these compounds or the combination of at least two of them.
  • a bioactive compound either a vitamin, a phenolic compound, a glucosinolate, an extract enriched in at least one of these compounds or the combination of at least two of them.
  • the application of said bioactive compound varies between 1 and 78 hours, including both limits. More preferably, the application is carried out in the irrigation water in concentrations between 5 and 100 ⁇ , including both limits.
  • the plant is subjected to an abiotic stress process, preferably by varying the Electrical Conductivity (EC) of the irrigation water, which comprises watering said plant with an irrigation solution to which is added an osmotic shock substance, and whose temperature is more preferably between 15 and 35 ° C, including both limits.
  • EC Electrical Conductivity
  • the bioactive compound is also applied by previously varying the Electrical Conductivity of the irrigation water of the crop, being able to range between 0.5 and 6 dS m "1 , including both limits, after the addition of an osmotic shock substance in mM concentration , preferably in a concentration between 10 and 80 mM, combined with a variation of the temperature in the irrigation tanks, preferably between 0 and 10 ° C around the average ambient temperature of 25 ° C, since the electrical conductivity of a solution increases by approximately 2% for each degree its temperature rises
  • the osmotic shock substance that is added is selected from: CaCl 2 , NaCl, KC1, Na 2 S0 4 , K 2 S0 4 , (H ⁇ SC, MgS0 4 , KN0 3 , H 4 N0 3 , Mg (N0 3 ) 2 , Ca (N0 3 ) 2 , KH 2 P0 4 , 3 ⁇ 4H 2 P0 4 , mannitol
  • the vesicle extraction process was based on the technique of Larsson et al., 1987, which is incorporated herein by reference. However, some modifications were included in the methodology that make the process scalable on an industrial level, since the costs are reduced and the extraction time is shortened. Thus, instead of vacuum filtration and manual homogenization, a homogenate system with an automatic mechanical cold homogenizer (4-10 ° C) type polytron or mechanical mixer (Thermomix) with different combinations of speed and time was used. In other words, this means that the second stage of the process of the invention, referred to the removal of membrane vesicles, comprises at least one stage of homogenization with an automatic mechanical homogenizer.
  • the homogenate speed varied from 0 to 5000 rpm, with an initial stage of between 0 and 1 min and a speed of 1000-4000 rpm and a second stage of homogenate between 0 and 25 s with a speed of between 3000-5000 rpm. Modifications were also made to the preservation buffer, eliminating compounds that could be toxic or harmful to human health, such as the PIPES buffer that is absorbed through the skin and which is described in the method. published extraction, and was replaced by another buffer among the following: bicarbonate buffer, phosphate buffer and acetate buffer at the same concentration and pH. Therefore, the method of extracting membrane vesicles according to the invention comprises resuspending the extracted vesicles in a preservation buffer selected from phosphate buffer, bicarbonate buffer and acetate buffer.
  • a second aspect of the invention relates to membrane vesicles obtained according to the conditions described above comprising an effective amount of membrane transport proteins.
  • an effective amount is understood as the amount of membrane proteins sufficient in the vesicles obtained by the method of the invention to be effective at the level of hydration / sanitary application for both humans and animals, and are applicable for dermatological, pharmacological or therapeutic purposes.
  • a third aspect of the present invention relates to the use of membrane vesicles enriched in membrane transport proteins at the commercial exploitation level, since they can be a natural means of releasing either water, bioactive substances, hygroscopic agents, salts or other substances. Chemicals such as antibiotics or any formulation for cosmetic or therapeutic purposes. That is, these vesicles can be applied for dermatological, pharmacological or therapeutic purposes, incorporating additional substances, preferably a natural bioactive compound, a hygroscopic agent, a chemical agent or combinations thereof.
  • Liposomes are microscopic vesicles consisting of concentric phospholipid bilayers with aqueous compartments that have the ability to capture a wide variety of water-soluble, fat-soluble or amphiphilic active substances.
  • This invention thus refers to the use of plasma membrane vesicles of plant origin as a transport system or vectors of certain substances for topical and therapeutic application.
  • membrane vesicles contain membrane transport proteins in their structure allowing the release of water, ions and other substances such as ammonia, low molecular weight sugars, glucosinolates, urea and glycerol (moisturizing agents) capable of being transported by membrane proteins and therefore to be used in cosmetic or dermatological formulations for moisturizing purposes or in the healing of sutures, burns and other wounds.
  • ions and other substances such as ammonia, low molecular weight sugars, glucosinolates, urea and glycerol (moisturizing agents) capable of being transported by membrane proteins and therefore to be used in cosmetic or dermatological formulations for moisturizing purposes or in the healing of sutures, burns and other wounds.
  • the invention also refers to the use of membrane vesicles containing bioactive substances of plant origin, (either vitamin C, glucosinolates, or phenolic compounds) with antioxidant capacity for use in cosmetic formulations.
  • Another aspect of the invention relates to a vesicle obtainable by the process of the invention comprising an effective amount of intrinsic membrane transport proteins as a vehicle and stabilizer of at least one bioactive compound in a liquid formulation or beverage (such as a food liquid type dairy or juices).
  • a liquid formulation or beverage such as a food liquid type dairy or juices.
  • FIG. 1 Immunodetection by Western blot. The intensity of the signal obtained for a plasma membrane control protein (aquaporins) in the unstimulated plant material (control) and the plant material exposed to the stimulation method (elicitation) of the invention is shown.
  • aquaporins plasma membrane control protein
  • FIG. 1 Comparison of the hydrating effect of vesicles with and without hygroscopic agent.
  • concentration of plasma membrane protein present in vesicles for application was 2 ⁇ g ⁇ 1 .
  • Figure 4 Functionality of plasma membrane vesicles obtained from broccoli root in a cosmetic formulation. The measurements were made 5 days, 1 month and six months after the sample.
  • FIG. 5 Schematic representation of the healing test by scraping on cell tapestry.
  • 1 Making a uniform scraping on a cell tapestry to create an empty space devoid of cells.
  • 2 Migration of the cells to the empty space generated in 1.
  • 3 Cellular invasion of the empty space generated in 1.
  • Figure 6 Evolution of the cell healing test in a human keratinocyte tapestry (HaCaT) incubated in the presence of vesicles with glucosinates. Images taken after removing the cell tapestry insert and after 0 hours (left image), 8 hours (central image) and 16 hours (right image) incubation in the presence of said vesicles with glucosinates.
  • Figure 7 Graphical representation of the cell occupation area of a cell lacking street in a human keratinocyte tapestry (HaCaT) as a function of the tapestry incubation time (in hours) in the presence of vesicles with glucosinates.
  • the slope of the straight line indicates the area occupation speed expressed in ⁇ m 2 / hour.
  • FIG. 9 Survival percentage of human keratinocytes (HaCaT) treated with a UVB dose of 800 J / m 2 in the presence of different concentrations of vesicles containing glucosinolates and incubated for a period of 72 h. A protection of the cells is observed that is dependent on the dose used of the extract.
  • HaCaT human keratinocytes
  • the process of the invention comprises stimulation through a bioactive compound, a glucosinolate of the aliphatic family, such as sinigrin, which was added to the concentration of up to 50 ⁇ for 24 hours in the irrigation water, on a crop Broccoli
  • a bioactive compound such as sinigrin
  • This compound was also applied by previously varying the Electrical Conductivity (EC) of the crop irrigation water that was increased to 6 dS m "1 after the addition of an osmotic shock substance such as KC1 to the concentration of 40 mM.
  • Proteins were made automatically starting from leaf (20 g), and using a polytron with an initial stage of homogenization of 15 seconds at 4000 rpm and a second stage of 20 seconds at 5000 rpm.
  • the extraction buffer contained 50 mM HEPES and 0.5 M mannitol (pH 7.5), to this solution was subsequently added 1 mM dithiothreitol (DTT), 5 mM ascorbic acid and 0.6% (w / v) glycerol 10 insoluble polyvinyl pyrrolidone (PVP) % and 5 mM ⁇ -glycerophosphate.
  • DTT dithiothreitol
  • PVP polyvinyl pyrrolidone
  • the homogenate was centrifuged at 10,000 g for 20 minutes cold at 4 ° C and the supernatant was collected and centrifuged again at 55,000 g for 35 minutes at 4 ° C.
  • the precipitate was resuspended in resuspension buffer (0.3 M mannitol in 5 mM bicarbonate buffer pH 7.0 - 8.0)
  • the suspension was added to a double phase polymer system with a final composition of Dextran T500 (w / v) (Pharmacia), 6.0% (w / v) polyethylene glycol (PEG) 3,350 (Sigma) 6.0% (w / v ), 3 mM KC1, 5 mM phosphate buffer (pH 7.8) and 0.33 M mannitol or sucrose.
  • the phase system was centrifuged at 4,000 g for 5 minutes at 4 ° C. The upper phase is where the plasma membrane is collected to dilute it in a new buffer. In the 10 mM bicarbonate buffer buffer at pH 8.3 with 0.33 M sucrose.
  • Table 1 Comparison of the plasma membrane protein concentration present in membrane vesicles in vegetables and object of the invention. The concentration was obtained after stimulating the plant and using mechanical extraction.
  • Table 2 shows a list of membrane proteins identified by HPLC-MS-MS in Brassica olerácea var Italica.
  • Aquaporin PIP1-1 OS Arabidopsis thaliana 16.08
  • Aquaporin PIP1-2 OS Arabidopsis thaliana 9.79
  • At5g41260 OS Arabidopsis thaliana
  • type OS Arabidopsis thaliana
  • EXAMPLE 3 Hydration test of the vesicles on the skin.
  • the trial was conducted with 5 volunteers whose skin had extreme water loss values. The process was carried out with pure vesicles in a concentration of 2 ⁇ g ⁇ ⁇ L "1 in preservation buffer described in example 1.
  • a comparative study of vesicles containing a hygroscopic agent and without the hygroscopic agent was performed. It was compared with the hygroscopic agent. only The measurements were taken every 24 hours on the back of the hand The treatment ceased on the third day EXAMPLE 4. Skin hydration test with volunteers.
  • the trial was conducted with 15 volunteers.
  • the vesicles were applied to the skin of the face in the area attached to the eyes.
  • the process was performed with vesicles diluted in pH 6.5 buffered solution in preservation buffer described in example 1 in two different concentrations 20 and 0.2 ⁇ g ⁇ ⁇ L "1.
  • Glycerol (0.02%) was added to the vesicles as a hygroscopic agent Applications were made twice a day Two types of experiments were performed, at short times (0 hours, 10 min, 1 hour, 2 hours) and at long times (0 days, 2 days, 5 days and 7 days).
  • Table 3 Percentage of decrease in loss of water from the facial skin after application of rich solution in vesicles extracted from broccoli leaf in concentrated and diluted concentrations (20 and 0.2 ⁇ ig ⁇ L ⁇ 1 ), expressed in protein and glycerol concentration as a hydroscopic agent. The experiment was carried out at short times and in 15 volunteers.
  • Extracts of root and leaf membrane vesicles from broccoli plants enriched in membrane proteins were mixed with glucosinolate-rich extract obtained from broccoli seeds.
  • Previously washed broccoli seeds were used, disinfected and dried in an oven, for 24 hours at 100 ° C.
  • the seeds were homogenized with 70% methanol (v / v) until a mixture similar to a porridge was obtained.
  • the samples were heated 70 ° C for 20 hours. agitation. Subsequently, they were centrifuged (17,500 g at 4 ° C) for 15 minutes and evaporated with N 2 .
  • EXAMPLE 6 Stability of vesicles in cosmetic formulations.
  • This product was the basis for the addition of 0.02% broccoli root membrane vesicles extract.
  • the stability result was determined by measuring the response of the vesicles to the change in osmotic pressure of the medium by the stop-flow light scatering method.
  • the kinetics of volume adjustment of the gallbladder in light scattering ⁇ ex 515 nm at 90 °.
  • the measurements were made at 20 0 C in an SFM3 stopped flow spectrophotometer.
  • the measurement solutions were diluted in the same medium.
  • the hypo-osmotic shock associated with membrane dilution induced a transient opening of vesicles and balanced its interior with the extravesicular solution.
  • the K is the exponential constant and is related to the deflation rate.
  • EXAMPLE 7 Low cytotoxicity in human keratinocyte cultures (HaCaT). Cell viability through the MTT assay.
  • the HaCaT cell line (from ATCC, Rockville, MD) was cultured in DMEM medium with 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) penicillin-streptomycin (0.1 mg / ml and 100 U / ml respectively ) in a humidified atmosphere with C0 2 (5% v / v) at 37 ° C for 24 h.
  • the cells were trypsinized every three days following the manufacturer's recommendations and seeded in 96 or 6 well plates depending on the type of test to be performed.
  • the MTT assay was used as a simple, quantitative and reliable method to determine cell viability.
  • the MTT reagent (3- (4,5-dimethylthiazol-2- yl) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide) is reduced to formazan crystals in the mitochondria of the viable cells.
  • the cells were washed and with PBS buffer and incubated with MTT for 3-4 h at 37 ° C and 5% C0 2 .
  • the medium was then removed and 100 ⁇ of DMSO was added per well to dissolve the formazan crystals that are insoluble in water.
  • EXAMPLE 8 Healing test by scraping on cell tapestry in human keratinocytes (Wound healing assay).
  • the test is a technique used to determine cell polarization, remodeling of the extracellular matrix and cell migration in different cell types.
  • the test consists of making a uniform scraping on a cell tapestry confluent directly with a handle or by means of an insert of defined dimensions that prevents cell growth where it is deposited and creating a "corridor" of approx. 1 mm absent cells.
  • the invasion of the cells into the empty space can take from several hours to days depending on the cell type. Using a rack and a light-field microscope, the speed with which the cells invade the empty space is determined by measuring the invaded area per unit of time (a 24-hour video is made with a 15-minute frame rate) through the determination of the slope of said curve.
  • a human keratinocyte cell suspension (HaCaT) of 5 x 10 5 cells / ml was prepared and seeded in 35 mm plates at a density of 35,000 cells per well, in wells containing the appropriate inserts.
  • the cells were incubated in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Invitrogen) with 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) penicillin-streptomycin (0.1 mg / ml and 100 U / ml respectively) in a humidified atmosphere with C0 2 (5% v / v) at 37 ° C for 24 h and then the inserts were removed.
  • Keratinocytes were cultured in DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle' s Medium, Invitrogen), pH7.4, supplemented with 5% fetal bovine serum Invitrogen), 20 .mu.g my "1 gentamicin and 350 ug my" 1 fungizona. Keratinocytes were added vesicles enriched in membrane proteins at 0.1% concentration and their proliferation was determined by MTT.
  • DMEM Disulbecco 's Modified Eagle' s Medium, Invitrogen
  • pH7.4 supplemented with 5% fetal bovine serum Invitrogen
  • 20 .mu.g my "1 gentamicin and 350 ug my" 1 fungizona Keratinocytes were added vesicles enriched in membrane proteins at 0.1% concentration and their proliferation was determined by MTT.
  • EXAMPLE 10 Protection of human keratinocytes (HaCaT) against damage induced by UV radiation.
  • the HaCaT cell line (from ATCC, Rockville, MD) was cultured in DMEM medium with 10% (v / v) FBS, 1% (v / v) penicillin-streptomycin (0.1 mg / ml and 100 U / ml respectively ) in a humidified atmosphere with C0 2 (5% v / v) at 37 ° C for 24 h.
  • the cells were trypsinized every three days following the manufacturer's recommendations and seeded in 96-well plates. For treatment, the cells were kept on the plate after seeding for 24 h.
  • the cells When the cells reached a confluence of 70-90%, they were washed with PBS buffer and treated with a thin layer of PBS containing the extracts to be tested at various concentrations. The plate was then treated with a UVB light source (800 J / m 2 ) by using a UV radiation system (Bio-Link Crosslinker BLX-E312). Then, the PBS buffer was replaced with fresh medium and incubated for 72 h more. After incubating the cells in fresh medium for 72 h, they were washed with PBS buffer and incubated with MTT for 3-4 h at 37 ° C and 5% C0 2 . The medium was removed and 100 ⁇ of DMSO was added per well to dissolve the formazan crystals that are insoluble in water. The plates were stirred for 15 min and the well absorbance was quantified using a 570 nm plate reader (SPECTROstar Omega, BMG LabTech GmbH, Offenburg, Germany). The results are shown in Figure 9.
  • a UVB light source 800 J /
  • EXAMPLE 11 Cytotoxicity in B16 murine melanoma cells. Cell viability by MTT assay.
  • the cell line with high metastatic ability B16 (from ATCC, Rockville, MD) were seeded and cultured with DMEM (Dulbecco 's Modified Eagle' s Medium, Invitrogen), pH7.4, supplemented with 10% calf serum fetal Invitrogen), 10 mM HEPES, 100U / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin.
  • DMEM Dulbecco 's Modified Eagle' s Medium, Invitrogen
  • pH7.4 supplemented with 10% calf serum fetal Invitrogen
  • 10 mM HEPES 100U / ml penicillin and 100 mg / ml streptomycin.
  • the seeded cells were kept in a humid oven at 37 ° C and 5% C0 2 . After incubation for 24 hours, the culture medium was replaced again containing supernatant and vesicles with glucosinolates prepared as set forth in Example 3 and at

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de obtención de vesículas de membrana enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana de origen vegetal para su uso cosmético o terapéutico, que pueden contener a su vez otras sustancias como son compuestos bioactivos naturales. Preferiblemente se obtienen en vegetales, a partir de la familia Brassicaceae (cruciferas). Además, la presente invención también se refiere a un procedimiento para el incremento de estas proteínas de origen vegetal.

Description

Procedimiento de obtención y usos de vesículas de membrana plasmática extraídas de plantas enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana
SECTOR DE LA TÉCNICA
La presente invención se enmarca dentro de los sectores de química y farmacia, y concretamente se refiere a vesículas de membrana plasmática de origen natural enriquecidas en proteínas intrínsecas de membrana capaces de ser aplicadas con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos. ESTADO DE LA TÉCNICA
En células animales, las proteínas de membrana plasmática (MP) representan un punto estratégico para una posible intervención terapéutica, haciendo de las proteínas de membrana objetivos diana para fármacos, en investigación contra el cáncer, por ejemplo (Harvey et al., 2001). En células vegetales, los procesos de señalización que controlan las respuestas a estreses abióticos y bióticos ocurren también a nivel de MP. De hecho, tanto en células animales como vegetales, la MP controla numerosas funciones primarias tales como el transporte de metabolitos e iones, endocitosis, proliferación celular.... etc. Todos estos procesos implican una gran diversidad de proteínas altamente variables en cuanto a estructura y función.
Esta enorme variabilidad en la naturaleza de las proteínas de membrana, ha hecho que el número de procesos de extracción de las mismas sea a la vez extenso y específico. Así, además del amplio rango de pesos moleculares y puntos isoeléctricos, las proteínas difieren en su naturaleza hidrofóbica, en el caso de proteínas intrínsecas, y en la variabilidad de su contenido de lípidos, lo que hace que no siempre sean fáciles de extraer y purificar, especialmente proteínas con varios dominios transmembrana inmersos en la fase lipídica de la membrana.
Por tanto, el uso de vesículas de membrana que contengan una proteína de interés capaz de mantener su funcionalidad y propiedades, puede suponer una ventaja adicional en cuanto a su estabilidad y el coste económico de su obtención.
Los movimientos de casi todos los solutos a través de la membrana están mediados por proteínas transportadoras de membrana, más o menos especializadas en el transporte de moléculas concretas. Puesto que la diversidad y fisiología de las distintas células de un organismo está relacionada en buena medida con su capacidad de captar unos u otros elementos externos, se postula que debe existir un acervo de proteínas transportadoras específico para cada tipo celular y para cada momento fisiológico determinado (Lodish et al, 2005); dicha expresión diferencial se encuentra regulada mediante: la transcripción diferencial de los genes codificantes para esas proteínas y su traducción.
Se trata de proteínas transmembrana que poseen multitud de hélices alfa inmersas en la matriz lipídica. Dicha estructura probablemente implique una vía de entrada a través de entornos hidrofílicos proteicos que causarían una disrupción en el medio altamente hidrofóbico constituido por los lípidos (Lodish et al., 2005). Las proteínas intervienen de diversas formas en el transporte: actúan tanto como bombas impulsadas por ATP, esto es, por energía metabólica, o como canales de difusión facilitada.
Algunas de estas proteínas son capaces de transportar agua, iones y pequeños solutos a su través, tales como glicerol y urea, ambos agentes higroscópicos ampliamente usados en cosmética.
Un problema adicional en la extracción de proteínas integrales de membrana es el hecho de que éstas son constituyentes minoritarios comparado con otras proteínas solubles celulares. Hasta la fecha se ha conseguido extraer estas proteínas funcionales cuando se encuentran insertadas en la bicapa lipídica. Se ha conseguido obtener proteínas hidrofóbicas de las fracciones de membrana plasmática con un mayor rendimiento modificando el método de extracción (Gerbeau et al., 2002). Sin embargo, un método estimulador (también denominado "elicitador") de las proteínas intrínsecas combinado con un adecuado protocolo de extracción de vesículas de membrana plasmática, incrementa el rendimiento de vesículas que contienen proteínas de membrana de origen vegetal.
Durante mucho tiempo los liposomas se han considerado como la mayor contribución innovadora en dermatología con fines farmacéuticos y cosméticos. Sin embargo, debido a su alto coste, la pureza variable de sus fosfolípidos y su naturaleza inestable, los surfactantes que contengan vesículas suponen una ventajosa alternativa. Además, estas vesículas contienen proteínas de membrana intrínsecas capaces de actuar como transportadores de ciertas sustancias.
Algunas de las sustancias terapéuticas y cosméticas que se han empleado en sistemas transportadores son: Nombre del agente terapéutico Categoría Terapéutica Referencia
Levonorgestrel Agente anticonceptivo Jain NK et al, 1998
Flurbiprofeno Antiinflamatorio no esteroideo Mokhtar et al., 2008
(AINE)
Captopril Anti-hipertensivo Gupta et al., 2007
Estradiol Hormona femenina Tsai et al., 2001
Ketorolaco trometamina AINE Alsarra et al., 2005
Furosemida Diurético Azeem et al., 2008
Losarían potásico Antihipertensivo Thakur et al., 2009
Maleato de clorfeniramina Antihistamínico Varshosaz et al.,
2005
Pseudo-ceramida Antiarrugas Iwai et al., 1998
Benzofenona-4 / Metoxicinamato de Agente protector solar Briñón et al., 1999 octilo
Vitamina A Antioxidante Cioca et al., 1991
La extracción de vesículas de membrana se obtiene mediante el sistema de de polímeros de dos fases (Larsson et al., 1987) que consigue separar la fracción de membrana plasmática del resto de fracción microsomal. Para ello, se procede a la homogenización en frío del tejido y separación en dextrano/polietilénglicol.
Se han empleado hidrolizados peptídicos de origen vegetal: Brassica napus (FR2925325), Triticum monoccocum (FR2925327), Zea mays L. (FR2925326), Triticum turgidum (FR2925328), Solanum tuberosum (FR2925330), Avena sativa L. (FR2925329), Vicia faba L. (FR2925331), capaces de activar la síntesis de acuaporinas presentes en la epidermis humana (AQP3 fundamentalmente), bien solos o en combinación con otros ingredientes activos. AQP3 está presente en la membrana plasmática de los queratinocitos de la epidermis (Sougrat et al., 2002) y desempeña un importante papel en el control del flujo de agua a través de la piel. Así, estas acuaporinas son capaces de transportar glicerol el cual a su vez está involucrado en la constitución de la película hidrolipídica que permite mantener la flexibilidad y cualidades sensoriales del estrato córneo. La hidratación y el contenido de AQP3 en queratinocitos están relacionados y un incremento de AQP3 en la piel supone una mejora de la hidratación de la epidermis (Dumas et al, 2007).
Sin embargo, el reciente descubrimiento de que células del carcinoma de piel en humanos sobre-expresan altamente acuaporinas AQP3 (Hara-Chikuma and Verkman 2008b) sugiere ser cautos en el uso de moduladores de la expresión de acuaporinas para promover la hidratación de la piel.
Una alternativa al empleo de ingredientes capaces de activar la síntesis de acuaporinas sería el uso de vesículas de origen natural enriquecidas en no sólo en acuaporinas sino en otras proteínas de membrana que se emplearían como vehículo lipídico en la liberación de agua u otras sustancias en la epidermis.
Las acuaporinas también se han incorporado en formulaciones cosméticas (FR20010013463), determinando la fórmula galénica de uso tópico en forma de solución acuosa u oleosa. Sin embargo, el uso de vesículas de membrana de origen natural (vegetal) que incluyan además de estas otras proteínas transportadoras de membrana y compuestos bioactivos o agentes hidratantes, no se ha incluido en dicha formulación, y que constituye la base de esta invención.
La familia Brassicaceae (también llamada Cruciferae o familia de las cruciferas) contiene hasta 3500 especies vegetales. Numerosos estudios epidemiológicos indican que las cruciferas entre ellas el brócoli (Brassica olerácea), son una fuente rica de compuestos bioactivos del metabolismo secundario ricos en nitrógeno-azufre, glucosinolatos, así como de antioxidantes naturales fenólicos (flavonoides, antocianos, ácidos fenólicos), vitaminas (C, E, A, K, etc.) y minerales esenciales (nitrógeno, fósforo, potasio, calcio, hierro, manganeso, magnesio, zinc, cobre, selenio etc.) (Fahey et al. 2001; Moreno et al. 2006)
Los componentes vegetales se emplean también en la industria cosmética, por ejemplo, el empleo de extractos de brotes o germinados de diferentes frutos, bayas y cruciferas, incluyendo el brócoli, con aplicaciones en lociones, cremas de masajes, cremas nutritivas, geles, para inhibir el envejecimiento, para la detoxificación de la piel o en relación al tratamiento de enfermedades asociadas a la piel (US2009/0306219). También se utilizan los vegetales y sus compuestos bioactivos, incluyendo el brócoli, como aditivos en formulaciones anti-envejecimiento, donde en algunos casos suponen del 0.1 al 10% en peso de extractos vegetales incorporados en polvos sólidos, pildoras, cápsulas o precipitados oleosos (US 2009/0324522).
Algunos de estos compuestos bioactivos se pueden incorporar en vesículas lipídicas para su posterior liberación en la epidermis.
REFERENCIAS
Dumas et al. 2007. J. Drugs Dermatol., (6 Suppl):s20-4.
Fahey et al. 2001. Phytochemistry 56, 5-51.
Gerbeau et al. 2002. Plant J. 30, 71-8.
Hara-Chikuma and Verkman. 2008b. Molecular and Cellular Biology 28, 326-332.
Harvey et al. 2001. Physiol. Genomics 5, 129-136.
Larsson et al. 1987. Methods Enzymol. 148, 558-568.
Lodish et al. 2005. Biología celular y molecular. Buenos Aires: Médica Panamericana. ISBN 950-06-1974-3
Moreno et al. 2006. J. Pharmaceutical Biomedical Analysis 41 : 1508-1522
Sougrat et al. 2002. J. Invest. Dermatol. 118,678-85.
Jain NK, Khopade AJ, Vora B. J Control Reléase 1998, 54, 149-165.
Mokhtar M, Sammour O A, Hammad MA, Megrab NA. Int J Pharm 2008 361, 104- 111.
Gupta A, Prajapati SK, Balamurugan M, Singh M, Bhatia D.. Trop J Pharm Res 2007, 6, 687-693.
Tsai YH, Fang JY, Yu SY, Wu PC, Huang YB. Int J Pharm 2001, 215, 91-99.
Alsarra IA, Bosela AA, Ahmed SM, Mahrous GM. Eur J Pharm Biopharm 2005, 59, 485-490.
Azeem A, Jain N, Iqbal Z, Ahmad FJ, Aqil M, Talegaonkar S. Pharm Dev Technol
2008, 13, 155-163.
Thakur R, Anwer MK, Shams MS, Ali A, Khar RK, Shakeel F, Taha. J Drug Target
2009, 17, 442-449.
Varshosaz J, Pardakhty A, Mohsen S, Baharanchi H. Drug Deliv 2005, 12, 75-82. Iwai H, Fukasava J, Suzuki T. Int J Cosmet Sci 1998, 20(2), 87-102. Briñón L, Geiger S, Alard V, Doucet J, Tranchant JF, Couarraze G. J Control reléase. 1999, 60, 67-76.
Cioca, G., James, A.H., Manuel, L.T., Herstein, M, Walter, P.: US4999348 (1991).
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de vesículas de membrana plasmática a partir de material vegetal (procedente de una brassica) enriquecido en acuaporinas y otras proteínas transportadoras de membrana, y que pueden contener a su vez otras sustancias como son compuestos bioactivos naturales, agentes higroscópicos o químicos con fines dermatológicos, farmacológicos y terapéuticos.
Un primer aspecto de la invención hace referencia a una metodología para aumentar la cantidad de proteínas intrínsecas de membrana asociadas con la permeabilidad al agua y solutos de la membrana en el producto de origen vegetal.
Un segundo aspecto hace referencia a las vesículas de membrana obtenidas según la metodología anterior, que comprende una cantidad efectiva de proteínas de membrana para su aplicación en los diferentes campos.
Un tercer aspecto hace referencia a los campos de aplicación de las vesículas de membrana plasmática que permitan la liberación de agua u otras sustancias en la epidermis.
En concreto, en un primer aspecto la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de vesículas de membrana plasmática de origen vegetal enriquecidas en proteínas transportadoras intrínsecas de membrana caracterizado porque comprende:
una primera etapa de estimulación (o elicitación), que comprende someter a un organismo vegetal a un proceso de estrés abiótico combinado con la aplicación de un compuesto bioactivo,
una segunda etapa, que comprende extraer vesículas de membrana.
En adelante el procedimiento de enriquecimiento de acuaporinas y otras proteínas transportadoras de membrana en las vesículas de origen vegetal se denominará "procedimiento de la invención". Preferiblemente el procedimiento de la invención comprende un método de estimulación que supone un incremento de proteínas de membrana en la planta completa, o en fragmentos de la misma, que pueden ser hojas, tallo, raíz e inflorescencia las cuales se usarán como material vegetal de partida para la extracción de vesículas de membrana o cualquiera de sus posibles combinaciones.
Así, la extracción de vesículas puede obtenerse de plantas enteras o fragmentos de las mismas, seleccionadas entre raíz, tallo, hoja, inflorescencia o combinaciones de las mismas, de diferentes vegetales y hortalizas, preferiblemente la familia Brassicaceae también denominada Cruciferae), la familia de las cruciferas, más preferiblemente Brassica spp. Por lo que una realización preferida es el procedimiento de la invención donde el vegetal es una planta de la familia Brassicaceae. Los vegetales son seleccionados entre nabo, berro, rábano, colirrábano, col, coles lombardas (también llamadas coles rojas), rutabagas, coles de Bruselas, mostazas, repollo, diferentes variedades de brócoli (brocolini, brócoli o brécol, brócoli romanesco, brócoli blanco, brócoli morado o lila, etc.), así como de otras plantas hortícolas como berza, grelos, acelgas, escarola, espinaca, remolacha, lechuga, salvia, cebolla, o ajo. Más preferiblemente, la planta es seleccionada dentro del grupo compuesto por: nabo, berro, rábano, colirrábano, col, coles lombardas, rutabagas, coles de Bruselas, mostazas, repollo, berza, grelos, lechuga, espinaca, acelgas, escarola, salvia, cebolla y ajo. En una realización aún más preferida, el vegetal es brócoli.
En la presente invención se entiende "brócoli", también llamado brécol o bróculi, como cualquier variedad de Brassica olerácea crecida en un medio rico en minerales y en condiciones agronómicas controladas que favorezcan un incremento de la expresión de acuaporinas intrínsecas.
El procedimiento de la invención comprende la estimulación a través de un compuesto bioactivo, bien una vitamina, un compuesto fenólico, un glucosinolato, un extracto enriquecido en al menos uno de estos compuestos o la combinación de al menos dos de ellos. En una realización preferida, la aplicación de dicho compuesto bioactivo varía entre 1 y 78 horas, incluidos ambos límites. Más preferiblemente, la aplicación se realiza en el agua de riego en concentraciones comprendidas entre 5 y 100 μΜ, incluidos ambos límites. Además, de manera conjunta a la aplicación del compuesto bioactivo, la planta se somete a un proceso de estrés abiótico, de manera preferible variando la Conductividad Eléctrica (CE) del agua de riego, que comprende regar a dicha planta con una disolución de riego a la que se adiciona una sustancia de choque osmótico, y cuya temperatura está más preferiblemente comprendida entre 15 y 35 °C, incluidos ambos límites. Dicho de otro modo, el compuesto bioactivo se aplica además variando previamente la Conductividad Eléctrica del agua de riego del cultivo, pudiendo oscilar entre 0.5 y 6 dS m"1, incluidos ambos límites, tras la adición de una sustancia de choque osmótico en concentración mM, preferiblemente en una concentración comprendida entre 10 y 80 mM, combinada con una variación de la temperatura en las cubas de riego, de manera preferida entre 0 y 10 °C en torno a la temperatura ambiental media de 25 °C, pues la conductividad eléctrica de una disolución aumenta aproximadamente un 2 % por cada grado que se eleva su temperatura. En una realización preferida la sustancia de choque osmótico que se adiciona es seleccionada entre: CaCl2, NaCl, KC1, Na2S04, K2S04, ( H^SC , MgS04, KN03, H4N03, Mg(N03)2, Ca(N03)2, KH2P04, ¾H2P04, manitol, sorbitol, polietilenglicol y combinaciones de los mismos.
El proceso de extracción de vesículas se basó en la técnica de Larsson et al., 1987, que se incorpora como referencia en esta memoria. Sin embargo, en la metodología se incluyeron algunas modificaciones que hacen que el proceso se pueda escalar a nivel industrial, pues se abaratan los costes y se acorta el tiempo de extracción. Así, en lugar de filtración al vacío y homogenización manual se empleó un sistema de homogeinado con un homogeneizador mecánico automático en frío (4- 10°C) tipo politrón o batidora mecánica (Thermomix) con diferentes combinaciones de velocidad y tiempo. En otras palabras, esto quiere decir que la segunda etapa del procedimiento de la invención, referida a la extracción de vesículas de membrana, comprende al menos una etapa de homogenizado con un homogeneizador mecánico automático. La velocidad de homogeinado varió de 0 a 5000 rpm, con una etapa inicial de entre 0 y 1 min y una velocidad de 1000-4000 rpm y una segunda etapa de homogeinado entre 0 y 25 s con una velocidad de entre 3000-5000 rpm. Se realizaron también modificaciones en el tampón de conservación eliminando compuestos que pudieran resultar tóxicos o perjudiciales para la salud humana, como por ejemplo el tampón PIPES que se absorbe a través de la piel y que aparece descrito en el método de extracción publicado, y se sustituyó por otro tampón de entre los siguientes: tampón bicarbonato, tampón fosfato y tampón acetato a la misma concentración y pH. Por tanto, el procedimiento de extracción de vesículas de membrana según la invención, comprende resuspender las vesículas extraídas en un tampón de conservación seleccionado entre tampón fosfato, tampón bicarbonato y tampón acetato.
Un segundo aspecto de la invención se refiere a las vesículas de membrana obtenidas según las condiciones anteriormente descritas que comprende una cantidad efectiva de proteínas transportadoras de membrana.
En la presente invención se entiende como "cantidad efectiva" a la cantidad de proteínas de membrana suficiente en las vesículas obtenidas mediante el procedimiento de la invención para que sean eficaces a nivel de hidratación/aplicación sanitaria tanto para humanos como para animales, y sean aplicables con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos.
Un tercer aspecto de la presente invención se refiere al uso de vesículas de membrana enriquecidas en proteínas transportadoras de membrana a nivel de explotación comercial, ya que pueden ser un medio natural de liberación bien de agua, sustancias bioactivas, agentes higroscópicos, sales u otras sustancias químicas tales como antibióticos o cualquier formulación con fines cosméticos o terapéuticos. Es decir, estas vesículas pueden ser aplicadas con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos incorporando en su interior además sustancias adicionales, preferentemente un compuesto bioactivo natural, un agente higroscópico, un agente químico o combinaciones de ellos.
En el tratamiento de un proceso fisiopatológico, es deseable que la administración de medicamentos se realice de forma que el fármaco alcance su lugar de actuación a una determinada concentración. Se han empleado como vectores de fármacos lipoproteínas y glucoproteínas entre otros, que poseen la ventaja de ser biodegradables y endocitables.
Los liposomas son vesículas microscópicas constituidas por bicapas fosfolipídicas concéntricas con compartimentos acuosos que tienen la capacidad de captar una gran variedad de sustancias activas hidrosolubles, liposolubles o anfifílicas. Esta invención hace referencia pues al uso de vesículas de membrana plasmática de origen vegetal como sistema de transporte o vectores de determinadas sustancias para su aplicación tópica y terapéutica.
Estas vesículas de membranas contienen proteínas transportadoras de membrana en su estructura permitiendo la liberación de agua, iones y otras sustancias como amoniaco, azúcares de bajo peso molecular, glucosinolatos, urea y glicerol (agentes hidratantes) capaces de ser transportados por las proteínas de membrana y por tanto de ser empleadas en formulaciones cosméticas o dermatológicas con fines hidratantes o en la cura de suturas, quemaduras y otras heridas.
Así mismo la invención hace referencia al uso de vesículas de membrana que contienen sustancias bioactivas de origen vegetal, (bien vitamina C, glucosinolatos, o compuestos fenólicos) con capacidad antioxidante para emplearlas en formulaciones cosméticas. Otro aspecto de la invención se refiere a una vesícula obtenible mediante el procedimiento de la invención que comprende una cantidad efectiva de proteínas transportadoras intrínsecas de membrana como vehículo y estabilizador de al menos un compuesto bioactivo en una formulación líquida o bebida (como por ejemplo un alimento líquido tipo lácteos o zumos). En la presente invención se ha comprobado que las vesículas obtenidas siguiendo el procedimiento de la invención permiten aumentar la estabilidad de compuestos bioactivos, tales como los glucosinolatos, en formulaciones liquidas, como demuestra el ejemplo 5.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Inmunodetección mediante Western blot. Se muestra la intensidad de la señal obtenida para una proteína control de membrana plasmática (aquaporinas) en el material vegetal sin estimular (control) y el material vegetal expuesto al método de estimulación (elicitación) de la invención.
Figura 2. Comparativa del efecto hidratante de vesículas con y sin agente higroscópico. La concentración de proteína de membrana plasmática presente en vesículas para la aplicación fue de 2 μg μΐ 1. ® Aplicación de vesículas con agente higroscópico; # Aplicación de vesículas sin agente higroscópico; .4 Aplicación directa sin vesículas del agente higroscópico. Figura 3. Estabilidad de los glucosinolatos totales en vesículas de membrana plasmática obtenidas de raíz y hoja de bróculi (n=3).
Figura 4. Funcionalidad de vesículas de membrana plasmática obtenidas de raíz de bróculi en una formulación cosmética. Las medidas se realizaron a los 5 días, 1 mes y seis meses de realizar la muestra.
Figura 5. Representación esquemática del ensayo de cicatrización mediante raspado sobre tapiz celular. 1 : Realización de un raspado uniforme en un tapiz celular para crear un espacio vacío carente de células. 2: Migración de las células hacia el espacio vacío generado en 1. 3 : Invasión celular del espacio vacío generado en 1.
Figura 6. Evolución del ensayo de cicatrización celular en un tapiz de queratinocitos humanos (HaCaT) incubados en presencia de vesículas con glucosinatos. Imágenes tomadas después de eliminar el inserto del tapiz celular y transcurridas 0 horas (imagen izquierda), 8 horas (imagen central) y 16 horas (imagen derecha) de incubación en presencia de dichas vesículas con glucosinatos.
Figura 7. Representación gráfica del área de ocupación celular de una calle carente de células en un tapiz de queratinocitos humanos (HaCaT) en función del tiempo de incubación del tapiz (en horas) en presencia de vesículas con glucosinatos. La pendiente de la línea recta indica la velocidad de ocupación de área expresada en μm2/hora.
Figura 8. Comparación del crecimiento de las células HaCaT sin adición de vesículas y con vesículas de membrana plasmática obtenidas de raíz (n=3).
Figura 9. Porcentaje de supervivencia de queratinocitos humanos (HaCaT) tratados con una dosis de UVB de 800 J/m2 en presencia de diferentes concentraciones de vesículas conteniendo glucosinolatos e incubados por un periodo de 72 h. Se observa una protección de las células que es dependiente de la dosis utilizada de extracto.
Figura 10. Citotoxicidad de las células B16 de disoluciones de glucosinolatos en el sobrenadante de la mezcla de vesículas de membrana plasmática obtenidas de raíz y hoja de bróculi comparado con las vesículas que contienen los glucosinolatos (n=3). EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos se incluyen a título ilustrativo de la preparación y aplicaciones de las vesículas de la presente invención y de ningún modo debe interpretarse como limitantes del campo de aplicación. EJEMPLO 1: Procedimiento de estimulación de proteínas de membrana de origen vegetal (Fig 1)
El procedimiento de la invención comprende la estimulación a través de un compuesto bioactivo, un glucosinolato de la familia de los alifáticos, como la sinigrina, que se adicionó a la concentración de hasta 50 μΜ durante 24 horas en el agua de riego, sobre un cultivo de bróculi. Este compuesto se aplicó además variando previamente la Conductividad Eléctrica (CE) del agua de riego del cultivo que se incrementó hasta 6 dS m"1 tras la adición de una sustancia de choque osmótico como es KC1 hasta la concentración de 40 mM. La extracción de proteínas se hizo de forma automática partiendo de hoja (20 g), y empleando un politrón con una etapa inicial de homogenizado de 15 segundos a 4000 rpm y una segunda etapa de 20 segundos a 5000 rpm.
El tampón de extracción contenía HEPES 50 mM y manitol 0.5 M (pH 7.5), a esta disolución se le adicionó posteriormente ditiotreitol (DTT) 1 mM, ácido ascórbico 5 mM y polivinilpirrolidona (PVP) insoluble 0.6% (p/v) glicerol 10% y β- glicerofosfato 5 mM. El homogenado se centrifugó a 10.000 g durante 20 minutos en frío a 4°C y el sobrenadante se recolectó y se volvió a centrifugar a 55.000 g durante 35 minutos a 4°C. El precipitado se resuspendió en tampón de resuspensión (manitol 0.3 M en tampón bicarbonato 5 mM pH 7.0 - 8.0)
La suspensión se adicionó a un sistema de polímeros de doble fase con una composición final de Dextrano T500 (p/v) (Pharmacia), 6.0 % (p/v) de polietilenglicol (PEG) 3.350 (Sigma) 6.0 % (p/v), KC1 3 mM, tampón fosfato 5 mM (pH 7.8) y manitol o sacarosa 0.33 M. El sistema de fases se centrifugó a 4.000 g durante 5 minutos a 4°C. La fase superior es donde se recoge la membrana plasmática para diluirla en un nuevo tampón. En el tampón de conservación tampón bicarbonato 10 mM a pH 8.3 con sacarosa 0.33 M.
EJEMPLO 2. Rendimiento de la extracción del cultivo de Brassica
Se valoró el rendimiento de la extracción de vesículas de membrana plasmática para Brassica con respecto a otras plantas
En la tablal se puede apreciar el contenido proteico de las vesículas de membrana para distintos vegetales. El cultivo de Brassica después de la estimulación resultó en mayor cantidad de proteína de membrana plasmática. En la tabla se indica la cantidad de proteína expresada en μg μΐ 1. El rendimiento del proceso es más alto que el obtenido para el resto de los cultivos incluso para las vesículas aisladas de Beta vulgaris ya que la cantidad de material vegetal de partida era mayor. Además, teniendo en cuenta que la extracción mecánica supone una pérdida de rendimiento, los valores de proteína siguen estando por encima de la mayoría de los cultivos aplicando una metodología posible de escalar a nivel industrial.
Tabla 1. Comparativa de la concentración de proteína de membrana plasmática presente en vesículas de membrana en vegetales y objeto de la invención . La concentración se obtuvo después de estimular la planta y empleando extracción mecánica.
Figure imgf000015_0001
En la tabla 2 se puede apreciar un listado de proteínas de membrana identificadas mediante HPLC-MS-MS en Brassica olerácea var Itálica.
Tabla 2. Proteínas transportadoras de membrana plasmática identificadas en vesículas de membrana en Brassica olerácea var Itálica tras la digestión con 3 diferentes endoproteasas
Digestión con Tripsina
Número #AAs P.M[Da] cale. Descripción Zcobertura de pi
acceso
A5DXI9 362 41667,20 5,26 Proteína Actina regulatoria del cítosqueleto- 3,87
END3 OS=Lodderomyces elongisporus
GN=END3 PE=3 SV=1 - [END3_L0DEL]
P92935 618 67485,82 9,48 ADP.ATP proteína transportadora 2, 1 ,94
cloroplastídíca OS=Arabídopsís thalíana GN=AATP2 PE=1 SV=2 - [TLC2_ARATH]
P61837 286 30668,98 9,01 Aquaporina PIP1-1 OS=Arabidopsis thaliana 16,08
GN=PIP1-1 PE=1 SV=1 - [PIP11_ARATH]
Q06611 286 30578,01 9,03 Aquaporina PIP1-2 OS=Arabidopsis thaliana 9,79
GN=PIP1-2 PE=1 SV=1 - [PIP12_ARATH]
P30302 285 30409,69 7,84 Aquaporina PIP2-3 OS=Arabidopsis thaliana 3,86
GN=PIP2-3 PE=1 SV=1 - [PIP23_ARATH]
P19456 948 104334,99 6,99 ATPasa 2, membrana plasmática 4,64
OS=Arabidopsis thaliana GN=AHA2 PE=1 SV=2 - [PMA2_ARATH]
Q42556 954 105141 ,76 6,39 ATPasa 9, tipo membrana plasmática 2,41
OS=Arabidopsis thaliana GN=AHA9 PE=2 SV=2 - [PMA9_ARATH]
080899 757 84206,29 7,21 Celulosa sintasa B2 OS=Arabidopsis thaliana 1 ,72
GN=CSLB2 PE=2 SV=1 - [CSLB2_ARATH]
Q9SAE4 490 55969,76 7,99 Citocromo P450 71 B29 OS=Arabidopsis 2,65 thaliana GN=CYP71 B29 PE=2 SV=1 - [C71 BT_ARATH]
065782 499 56809,55 8,37 Citocromo P450 83B1 OS=Arabidopsis 2,40 thaliana GN=CYP83B1 PE=1 SV=1 - [C83B1_ARATH]
P0C7R4 658 73842,98 7,68 Repetición Pentapeptídica que contiene la 1 ,98 proteína At1g69290 OS=Arabidopsis thaliana GN=At1g69290 PE=2 SV=1 - [PP110_ARATH]
P46032 585 64379,59 5,67 Peptido transportador PTR2 OS=Arabidopsis 2,22 thaliana GN=PTR2 PE=1 SV=1 - [PTR2_ARATH]
Q8RY89 769 87347,74 8,68 F o sf ati d i I i n osi to I - 4-f osf ato 5-kinasa 8 2,60
OS=Arabidopsis thaliana GN=PIP5K8 PE=2 SV=1 - [PI5K8_ARATH]
P83970 951 104618,27 6,81 ATPasa de membrana plasmática 2,42
OS=Triticum aestivum GN=ha1 PE=2 SV=1 - [PMA1_WHEAT]
Q9ZVX8 278 29481 ,38 8,85 Probable aquaporina PIP2-8 OS=Arabidopsis 4,32 thaliana GN=PIP2-8 PE=2 SV=1 - [PIP28_ARATH]
082226 747 85386,45 9,28 Probable nucleótido cíclico unido a canal 1 ,87 iónico 6 OS=Arabídopsis thaliana GN=CNGC6 PE=1 SV=2 - [CNGC6_ARATH]
Q8LGI2 454 49649,88 8,29 Probable sacaropina deshidrogenasa 2,20 mitocondrial At5g39410 OS=Arabidopsis thaliana GN=At5g39410 PE=1 SV=2 - [SCPDH_ARATH]
A3LPW2 511 59735,82 8,63 Proteína FYV10 OS=Pichia stipitis 1 ,96
GN=FYV10 PE=3 SV=2 - [FYV10_PICST]
Q9M088 484 52681 ,84 6,18 Probable glucano endo-1 ,3-beta-glucosidasa 2,27
5 OS=Arabidopsis thaliana GN=At4g31140 PE=1 SV=1 - [E135_ARATH]
Q944A7 512 56781 ,73 5,78 Probable serina/treonina-protein kinasa 8,01
At4g35230 OS=Arabidopsis thaliana GN=At4g35230 PE=1 SV=1
[Y4523 ARATH] Q9FHD7 487 54590,20 6,33 Probable serlna/treonlna-proteln klnasa 3,70
At5g41260 OS=Arabidopsis thaliana
GN=At5g41260 PE=1 SV=1
[Y5126_ARATH]
Q96704 349 39206,65 8,46 Proteína asociada a la repllcaclón del virus, 4,01
del rizado de la hoja de la col GN=AC1 PE=3
SV=2 - [REP_CALCV]
P23586 522 57572,98 8,94 Proteína transportadora de azucares 1 2,30
OS=Arabidopsis thaliana GN=STP1 PE=1
SV=2 - [STP1_ARATH]
Q9SZN1 487 54270,67 5,15 Subunidad tipo-V de la protón ATPasa 2,87
OS=Arabidopsis thaliana GN=VHA-B2 PE=2
SV=1 - [VATB2_ARATH]
Digestión con Glu-C
Número #AAs P.M[Da] cale. Descripción Zcobertura de pi
acceso
Q43291 164 18641 ,07 10,46 60S proteína ríbosomal L21-1 10,37
OS=Arabidopsis thaliana GN=RPL21 A PE=2
SV=2 - [RL211_ARATH]
Q08733 286 30612,94 8,85 Aquaporina PIP1-3 OS=Arabidopsis thaliana 3,85
GN=PIP1-3 PE=1 SV=1 - [PIP13_ARATH]
081108 1014 110368,25 5,68 ATPasa 2 transportadora de calcio, de 1 ,68
membrana plasmática tipo OS= Arabidopsis
thaliana GN=ACA2 PE=1 SV=1 - [ACA2_ARATH]
P23980 704 77990,52 8,81 ATPasa 2 de membrana plasmática 1 ,99
(Fragmento) OS=Solanum lycopersicum
GN=LHA2 PE=3 SV=1 - [PMA2_SOLLC]
Q8VZU2 304 34203,93 6,44 Sintaxina-132 OS=Arabidopsis thaliana 5,59
GN=SYP132 PE=1 SV=1 - [SY132_ARATH]
Digestión con Lys.
#AAs P.M[Da] cale. Descripción Zcobertura
Número pi
de acceso
P42739 76 8535,58 7,25 Ubiquitina OS=Acetabularia cliftonii 21 ,05
PE=3 SV=1 - [UBIQ_ACECL]
P61837 286 30668,98 9,01 Aquaporina PIP1-1 OS=Arabidopsis 16,43
thaliana GN=PIP1-1 PE=1 SV=1 - [PIP11_ARATH]
Q08733 286 30612,94 8,85 Aquaporina PIP1-3 OS=Arabidopsis 10,14
thaliana GN=PIP1-3 PE=1 SV=1 - [PIP13_ARATH]
Q39571 203 22584,49 6,21 GTP- proteína de unión YPTC1 7,88
OS=Chlamydomonas reinhardtii
GN=YPTC1 PE=3 SV=1 - [YPTC1_CHLRE]
Q9SIH4 206 21955,77 8,29 UPF0497 proteína de membrana 7,28
At2g36100 OS=Arabidopsis thaliana GN=At2g36100 PE=2 SV=1 - [U4979_ARATH]
Q42962 401 42337,62 5,97 Fosfoglicerato kinasa, citosólica 4,24
OS=Nicotiana tabacum PE=2 SV=1 - [PGKY_TOBAC]
P30302 285 30409,69 7,84 Aquaporina PIP2-3 OS=Arabidopsis 3,86
thaliana GN=PIP2-3 PE=1 SV=1 - [PIP23_ARATH]
Q944A7 512 56781 ,73 5,78 Probable serina/threonina-protein 3,52
kinasa At4g35230 OS=Arabidopsis
thaliana GN=At4g35230 PE=1 SV=1 - [Y4523_ARATH]
Q42479 529 59298,66 6,37 proteln klnasa dependiente de calcio 3 2,84
OS=Arabidopsis thaliana GN=CPK3
PE=1 SV=1 - [CDPK3_ARATH]
048639 521 57219,68 9,01 Probable transportador de membrana 2,50
plasmática e fosfato inorgánico 1-3
OS=Arabidopsis thaliana GN=PHT1-3
PE=2 SV=1 - [PHT13_ARATH]
Q43128 947 104748,96 6,43 ATPasa 10, de membrana plasmática 1 ,80
tipo OS=Arabidopsis thaliana
GN=AHA10 PE=2 SV=2 - [PMA10_ARATH]
P19456 948 104334,99 6,99 ATPasa 2, de membrana plasmática 1 ,16
tipo OS=Arabidopsis thaliana GN=AHA2
PE=1 SV=2 - [PMA2_ARATH]
EJEMPLO 3. Ensayo de hidratación de las vesículas sobre la piel.
El ensayo se realizó con 5 voluntarios cuya piel tenía valores extremos de pérdida de agua. El proceso se realizó con vesículas puras en concentración de 2 μg·μL"1 en tampón de conservación descrito en el ejemplo 1. Se realizó un estudio comparativo de vesículas que contenían un agente higroscópico y sin el agente higroscópico. Se comparó con el agente higroscópico sólo. Las medidas se realizaron cada 24 h sobre la piel de dorso de la mano. El tratamiento cesó al tercer día. EJEMPLO 4. Ensayo de hidratación de la piel con voluntarios.
El ensayo se realizó con 15 voluntarios. La aplicación de las vesículas se realizó sobre la piel de la del rostro en la zona pegada a los ojos. El proceso se realizó con vesículas diluidas en disolución tamponada con pH 6.5 en tampón de conservación descrito en el ejemplo 1 en dos concentraciones diferentes 20 y 0.2 μg■μL"1. A las vesículas se les añadió un glicerol (0.02%) como agente higroscópico. Las aplicaciones se realizaron 2 veces al día. Se realizaron dos tipos de experimentos, a tiempos cortos (0 horas, 10 min, 1 hora, 2 horas) y a tiempos largos (0 días, 2 días, 5 días y 7 días).
Los resultados se exponen en las tablas 3 y 4: Tabla 3. Porcentaje de disminución de pérdida de agua de la piel del rostro después de la aplicación de disolución rica en vesículas extraídas de hoja de bróculi en concentraciones concentrada y diluida (20 y 0.2 \ig\ L~1), expresada en concentración de proteínas y glicerol como agente hidroscópico. El experimento se realizó a tiempos cortos y en 15 voluntarios.
% disminución de la perdida de agua
O h 10 min l h 2 h
Total Media 100 90,05 84,59 82,12
± SE 4,34 2,12 2,41
Concentradas Media 100 91,86 85,00 83,29
± SE 2,91 2,23 2,39 diluidas Media 100 88,55 84,25 81,15
± SE 5,31 2,11 2,48
Tabla 4. Porcentaje de disminución de pérdida de agua de la piel del rostro después de la aplicación de disolución rica en vesículas extraídas de hoja de bróculi en concentraciones concentrada y diluida (20 y 0.2 \ig\ L~1), expresada en concentración de proteínas y glicerol como agente hidroscópico. El experimento se realizó a tiempos largos y en 15 voluntarios.
% disminución de la perdida de agua
O d 2 d 5 d 7 d
Total Media 100 74,35 64,73 58,72
± SE 3,17 3,38 3,49
Concentradas Media 100 77,65 60,63 53,89
± SE 3,51 3,86 3,06 diluidas Media 100 71,60 68,14 62,74
± SE 2,79 2,75 3,55
EJEMPLO 5. Estabilidad de glucosinolatos en vesículas
Extractos de vesículas de membrana de raíz y de hoja de plantas de bróculi enriquecidas en proteínas de membrana (0.3 mg mi"1 de proteína), se mezclaron con extracto rico en glucosinolatos obtenido de semillas de bróculi. Se utilizaron semillas de bróculi previamente lavada, desinfectada y secada en estufa, durante 24 horas a 100°C. Las semillas se homogeneizaron con metanol al 70% (v/v) hasta obtener una mezcla semejante a una papilla. Las muestras se calentaron 70°C durante 20 con agitación. Posteriormente, se centrifugaron (17.500 g a 4 °C) durante 15 minutos y se evaporaron con N2. Finalmente la muestra se resuspendió en agua ultra pura Milli-Q y se filtró por malla de 0.45 μιη (Millex HV13 de polietersulfano, Millipore). Las mezcla de vesículas con glucosinolatos se ultracentrifugaron para eliminar los glucosinolatos restantes no incluidos en vesículas. Las vesículas se volvieron a resuspender en el volumen inicial. El control lo constituyeron los sobrenadantes. Los resultados se muestran en la figura 3.
EJEMPLO 6. Estabilidad de vesículas en formulaciones cosméticas.
Una formulación cosmética libre de grasas y constituyente en serum facial basado en disolución de proteoglicanos al 0.1%. Este producto fue la base para la adición de extracto de vesículas de membrana de raíz de brócoli al 0.02 %. El resultado de la estabilidad se determinó midiendo la respuesta de las vesículas al cambio de presión osmótica del medio por el método de stopped-flow light scatering. La cinética de ajuste de volumen de la vesícula en la dispersión de la luz λ ex = 515 nm a 90 °. Las medidas se realizaron a 20 0 C en un SFM3 espectrofotómetro de stopped flow. Las disoluciones de medida se diluyeron en el mismo medio. El choque hipo-osmótico asociado con dilución membrana inducido una apertura transitoria de vesículas y equilibrado de su interior con la solución extravesicular. La K es la constante de la exponencial y está relacionada con la velocidad de deshinchamiento.
Los resultados se exponen en figura 4.
EJEMPLO 7. Baja citotoxicidad en cultivos de queratinocitos humanos (HaCaT). Viabilidad celular mediante el ensayo MTT.
La línea celular HaCaT (procedente de la ATCC, Rockville, MD) se cultivó en medio DMEM con 10 % (v/v) FBS, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (0.1 mg/ml y 100 U/ml respectivamente) en atmósfera humidificada con C02 (5% v/v) a 37 °C durante 24 h. Las células fueron tripsinizadas cada tres días siguiendo las recomendaciones del fabricante y sembradas en placas de 96 o 6 pocilios dependiendo del tipo de ensayo a realizar.
El ensayo MTT se utilizó como un método simple, cuantitativo y fiable para determinar la viabilidad celular. El reactivo MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difenil tetrazolio) se reduce a cristales de formazano en la mitocondria de las células viables. Después de incubar las células en presencia de las vesículas con glucosinolatos durante 72 h, las células se lavaron y con tampón PBS y se incubaron con MTT durante 3-4 h a 37 °C y 5 % C02. Después se eliminó el medio y se añadieron 100 μΐ de DMSO por pocilio para disolver los cristales de formazano que son insolubles en agua. Las placas se agitaron durante 15 min y se cuantificó la absorbancia de los pocilios utilizando un lector de placas a 570 nm (SPECTROstar Omega, BMG LabTech GmbH, Offenburg, Germany). No se observó citotoxicidad de los extractos conteniendo vesículas con glucosinolatos hasta una concentración de proteína de 10 mg mi"1.
EJEMPLO 8. Ensayo de cicatrización mediante raspado sobre tapiz celular en queratinocitos humanos (Wound healing assay).
El ensayo de cicatrización mediante raspado sobre tapiz celular es una técnica utilizada para determinar polarización celular, remodelaje de la matriz extracelular y migración celular en distintos tipos celulares. El ensayo consiste en realizar un raspado uniforme en un tapiz celular confluente directamente con un asa o mediante un inserto de dimensiones definidas que impide el crecimiento celular donde se deposita y creando un "pasillo" de aprox. 1 mm ausente de células. La invasión de las células hacia el espacio vacío puede tardar desde varias horas hasta días dependiendo del tipo celular. Mediante una gradilla y un microscopio de campo claro se determina la velocidad con que las células invaden el espacio vacío midiendo el área invadida por unidad de tiempo (se realiza un video de 24h con una periodicidad de fotograma de 15 min) a través de la determinación de la pendiente de dicha curva.
En el ensayo, se preparó una suspensión celular de queratinocitos humanos (HaCaT) de 5 x 105 células/ml y se sembró en placas de 35 mm a una densidad de 35.000 células por pocilio, en pocilios conteniendo los insertos adecuados. Las células se incubaron en DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, Invitrogen) con 10 % (v/v) FBS, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (0.1 mg/ml y 100 U/ml respectivamente) en atmósfera humidificada con C02 (5% v/v) a 37 °C durante 24 h y después se eliminaron los insertos. Se observaron las calles libres de células al microscopio y se determinó la progresión del crecimiento celular durante 24 h, tomando una fotografía cada 15 min (figuras 5 y 6). Después se representó el área invadida por las células (mieras2) con respecto al tiempo, obteniéndose una curva de crecimiento como la de la figura 7. Se comparó la pendiente de la curva obtenida en el control = 2,4 x 105 μm2/hora (velocidad de ocupación de área) con la pendiente de la curva obtenida en presencia de (0.3 mg mi"1 de proteína) de vesículas con glucosinolatos preparadas como en el ejemplo 3. El resultado obtenido supuso un aumento de la velocidad de ocupación de área en las células que contenían las vesículas de un 11 ± 1 % (n=3), lo que indica su capacidad cicatrizante. EJEMPLO 9. Determinación del poder cicatrizante de la piel mediante un ensayo de proliferación de queratinocitos humanos.
Para la determinación del poder cicatrizante de las células epidérmicas, se realizó un ensayo de proliferación en queratinocitos humanos (HaCaT). Los queratinocitos se cultivaron en medio DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, Invitrogen), pH7.4, suplementado con un 5% de suero bovino fetal Invitrogen), 20 μg mi"1 de gentamicina y 350 μg mi"1 de fungizona. A los queratinocitos se les añadió vesículas enriquecidas en proteínas de membrana a concentración 0.1% y su proliferación se determinó por MTT.
Los resultados se muestran en la figura 8.
EJEMPLO 10. Protección de queratinocitos humanos (HaCaT) frente al daño inducido por la radiación UV.
La línea celular HaCaT (procedente de la ATCC, Rockville, MD) se cultivó en medio DMEM con 10 % (v/v) FBS, 1% (v/v) penicilina-estreptomicina (0.1 mg/ml y 100 U/ml respectivamente) en atmósfera humidificada con C02 (5% v/v) a 37 °C durante 24 h. Las células fueron tripsinizadas cada tres días siguiendo las recomendaciones del fabricante y sembradas en placas de 96 pocilios. Para el tratamiento, las células se mantuvieron en la placa después de la siembra durante 24 h. Cuando las células alcanzaron una confluencia de 70-90%, se lavaron con tampón PBS y fueron tratadas con una capa fina de PBS conteniendo los extractos a ensayar a diversas concentraciones. Después se trató la placa con una fuente de luz UVB (800 J/m2) mediante la utilización de un sistema de radiación UV (Bio-Link Crosslinker BLX-E312). Entonces, se remplazó el tampón PBS por medio fresco y se incubaron durante 72 h más. Después de incubar las células en medio fresco durante 72 h, se lavaron con tampón PBS y se incubaron con MTT durante 3-4 h a 37 °C y 5 % C02. Se eliminó el medio y se añadieron 100 μΐ de DMSO por pocilio para disolver los cristales de formazano que son insolubles en agua. Las placas se agitaron durante 15 min y se cuantificó la absorbancia de los pocilios utilizando un lector de placas a 570 nm (SPECTROstar Omega, BMG LabTech GmbH, Offenburg, Germany). Los resultados se muestran en la figura 9.
EJEMPLO 11. Citotoxicidad en células de melanoma murino B16. Viabilidad celular mediante ensayo MTT.
La línea celular con elevada capacidad metastática, B16 (procedentes de la ATCC, Rockville, MD) se sembraron y cultivaron con DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Médium, Invitrogen), pH7.4, suplementado con un 10% de suero bovino fetal Invitrogen), lOmM de HEPES, 100U/ml de penicilina y 100 mg/ml estreptomicina. Las células sembradas se mantuvieron en estufa húmeda a 37°C y 5% de C02. Después de la incubación durante 24 horas, el medio de cultivo se remplazó por nuevo que contenía sobrenadante y vesículas con glucosinolatos preparadas como se expone en el ejemplo 3 y a una concentración de 0.5%.
La viabilidad celular se midió por el ensayo de exclusión de azul tripán y el ensayo de la actividad lactato deshidrogenasa (figura 10).

Claims

REIVINDICACIONES
Procedimiento de obtención de vesículas de membrana plasmática de origen vegetal enriquecidas en proteínas transportadoras intrínsecas de membrana caracterizado porque comprende:
- una primera etapa de estimulación, que comprende someter a un organismo vegetal a un proceso de estrés abiótico combinado con la aplicación de un compuesto bioactivo,
- una segunda etapa, que comprende extraer vesículas de membrana.
Procedimiento según las reivindicación 1, caracterizado porque el estrés abiótico comprende regar el organismo vegetal con una disolución de riego a la que se adiciona una sustancia de choque osmótico combinado con una variación de la temperatura entre 0 y 10 °C con respecto a la temperatura ambiental media de 25 °C de dicha disolución, hasta alcanzar una conductividad eléctrica comprendida entre 0,5 y 6 dS m"1, incluidos ambos límites. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la sustancia de choque osmótico es seleccionada dentro del grupo compuesto por: CaCl2, NaCl, KC1, Na2S04, K2S04, ( H4)2S04, MgS04, KN03, H4N03, Mg(N03)2, Ca(N03)2, KH2P04, H4H2P04, manitol, sorbitol, polietilenglicol y combinaciones de los mismos.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque la sustancia de choque osmótico se adiciona en la disolución de riego hasta alcanzar una concentración comprendida entre 10 y 80 mM, incluidos ambos límites.
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el compuesto bioactivo está seleccionado entre una vitamina, un compuesto fenólico, un glucosinolato, un extracto enriquecido en al menos uno de estos compuestos, o la combinación de al menos dos de ellos.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el compuesto bioactivo se aplica durante un tiempo comprendido entre 1 y 78 horas, incluidos ambos límites.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el compuesto bioactivo se aplica en la disolución de riego en concentraciones comprendidas entre 5 y 100 μΜ, incluidos ambos límites.
8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el organismo vegetal es seleccionado entre una planta de la familia Cruciferae y una planta hortícola.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la planta es seleccionada dentro del grupo compuesto por: nabo, berro, rábano, colirrábano, col, coles lombardas, rutabagas, coles de Bruselas, mostazas, repollo, variedades de brócoli, berza, grelos, lechuga, espinaca, acelgas, escarola, remolacha, salvia, cebolla y ajo.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque la planta es seleccionada dentro del grupo compuesto por: nabo, berro, rábano, colirrábano, col, coles lombardas, rutabagas, coles de Bruselas, mostazas, repollo, berza, grelos, lechuga, espinaca, acelgas, escarola, salvia, cebolla y ajo.
11. Procedimiento según la reivindicación 8, donde la planta es una especie del género Brassica.
12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 11, donde la planta es una variedad de Brassica olerácea.
13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado porque en la segunda etapa, las vesículas de membrana se extraen de una parte del organismo vegetal seleccionada entre raíz, tallo, hojas, inflorescencia, o la combinación de al menos dos de estas partes.
14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado porque en la segunda etapa, la extracción de vesículas de membrana comprende al menos una etapa de homogenizado con un homogeneizador mecánico automático.
15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque en la segunda etapa, la extracción de vesículas de membrana comprende resuspender dichas vesículas en un tampón de conservación seleccionado entre tampón fosfato, tampón bicarbonato y tampón acetato.
16. Vesícula obtenible mediante el procedimiento descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende una cantidad efectiva de proteínas transportadoras intrínsecas de membrana para su aplicación con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos.
17. Vesícula de acuerdo a la reivindicación 16 que incorpora en su interior además sustancias adicionales capaces de ser aplicadas con fines dermatológicos, farmacológicos o terapéuticos.
18. Vesícula de acuerdo a la reivindicación 17, caracterizada porque dicha sustancia adicional está seleccionada entre al menos un compuesto bioactivo natural, un agente higroscópico, un agente químico y combinaciones de ellos.
19. Uso de una vesícula obtenible mediante el procedimiento descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 que comprende una cantidad efectiva de proteínas transportadoras intrínsecas de membrana como vehículo y estabilizador de al menos un compuesto bioactivo en una bebida.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2740463A4 (en) * 2011-07-28 2014-12-03 Consejo Superior Investigacion USE OF MEMBRANE VESICLES FROM A MARINE ORGANISM FOR INDUSTRIAL USE AND METHOD OF MANUFACTURING THEM
CN114009327A (zh) * 2021-09-02 2022-02-08 西北大学 一种富集硒与萝卜硫素的西兰花芽苗培育方法及应用

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109734771A (zh) * 2019-03-01 2019-05-10 浙江理工大学 一种用于蛋白质组学分析的罗汉果叶片总蛋白质的提取方法
WO2020180311A1 (en) * 2019-03-06 2020-09-10 Zen-Bio, Inc. Plant-based exosome compositions and use thereof for rejuvenating skin
CN110714012B (zh) * 2019-07-13 2022-07-08 周口师范学院 基因TaPT13在提高植物对禾顶囊壳小麦变种抗性方面的应用
WO2022031124A1 (ko) * 2020-08-07 2022-02-10 주식회사 엑소스템텍 브로콜리 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 항노화, 항산화 화장료 조성물 및 이를 포함하는 기능성 화장품
CN111905107B (zh) * 2020-08-19 2023-04-21 福建医科大学 一种能保护芦荟活性成分且可作为药物载体的芦荟外泌体样囊泡
JP2023107326A (ja) * 2022-01-24 2023-08-03 一丸ファルコス株式会社 スプラウト由来の細胞外膜小胞
CN114752604B (zh) * 2022-04-25 2023-07-14 山东农业大学 一种增强小麦生物抗性和产量的基因TaPIP2;8及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4999348A (en) 1987-12-11 1991-03-12 Estee Lauder Inc. Liquid crystal containing cosmetic and pharmaceutical compositions and methods for utilizing such compositions
FR2925325A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de colza en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925328A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de kamut en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925331A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de feve en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925326A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de mais en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925332A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat d'epeautre en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925330A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de pomme de terre en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
US20090306219A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Richard Presti Topical use of plant extract for skin detoxification
US20090324522A1 (en) 2008-06-18 2009-12-31 Western Holdings, Llc Skin protectant compositions

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2653664B1 (fr) * 1989-10-27 1992-02-07 Jean Daniel Compositions a base de suc et de protoplastes de vegetaux, leur procede d'obtention et leurs utilisations, notamment dans le domaine de la phytotherapie.
FR2831058B1 (fr) * 2001-10-18 2004-01-16 Jean Noel Thorel Composition cosmetique hydratante comprenant des aquaporines
JP2004121047A (ja) * 2002-09-30 2004-04-22 Japan Tobacco Inc 硝酸輸送タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子
EP2032119A1 (de) * 2006-04-27 2009-03-11 Beiersdorf AG Kosmetische zubereitung mit aquaporin-stimulatoren und deren verwendung
FR2925500B1 (fr) * 2007-12-21 2011-05-06 Vincience Peptide derive d'une proteine de la famille des aquaporines et composition cosmetique et/ou pharmaceutique le contenant
BRPI0922484A2 (pt) * 2008-12-18 2015-08-11 Dianaplantsciences Inc Cultura de célula de planta para produção de produtos naturais com contaminação de glucosinolato reduzida
ES2382299B1 (es) * 2010-11-11 2013-05-07 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Polvo vegetal para alimentación y protección vegetal y métodos de preparación.

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4999348A (en) 1987-12-11 1991-03-12 Estee Lauder Inc. Liquid crystal containing cosmetic and pharmaceutical compositions and methods for utilizing such compositions
FR2925325A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de colza en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925328A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de kamut en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925331A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de feve en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925326A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de mais en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925332A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat d'epeautre en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925327A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat d'epeautre en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
FR2925330A1 (fr) 2007-12-21 2009-06-26 Vincience Sa Utilisation d'un hydrolysat de pomme de terre en tant que principe actif activateur de la synthese des aquaporines
US20090306219A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 Richard Presti Topical use of plant extract for skin detoxification
US20090324522A1 (en) 2008-06-18 2009-12-31 Western Holdings, Llc Skin protectant compositions

Non-Patent Citations (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALSARRA IA; BOSELA AA; AHMED SM; MAHROUS GM, EUR J PHARM BIOPHARM, vol. 59, 2005, pages 485 - 490
AZEEM A; JAIN N; LQBAL Z; AHMAD FJ; AQIL M; TALEGAONKAR S, PHARM DEVTECHNOL, vol. 13, 2008, pages 155 - 163
BRINON L; GEIGER S; ALARD V; DOUCET J; TRANCHANT JF; COUARRAZE G, J CONTROL RELEASE, vol. 60, 1999, pages 67 - 76
DUMAS ET AL., J. DRUGS DERMATOL., vol. 6, 2007, pages 20 - 4
FAHEY ET AL., PHYTOCHEMISTRY, vol. 56, 2001, pages 5 - 51
GERBEAU ET AL., PLANT J., vol. 30, 2002, pages 71 - 8
GUPTA A; PRAJAPATI SK; BALAMURUGAN M; SINGH M; BHATIA D.; TROP J, PHARM RES, vol. 6, 2007, pages 687 - 693
HARA-CHIKUMA; VERKMAN, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 28, 2008, pages 326 - 332
HARVEY ET AL., PHYSIOL. GENOMICS, vol. 5, 2001, pages 129 - 136
IWAI H; FUKASAVA J; SUZUKI T, INT J COSMETSCI, vol. 20, no. 2, 1998, pages 87 - 102
JAIN NK; KHOPADE AJ; VORA B, J CONTROL RELEASE, vol. 54, 1998, pages 149 - 165
LARSSON ET AL., METHODS ENZYMOL., vol. 148, 1987, pages 558 - 568
LODISHET: "Biologia celular y molecular", 2005, BUENOS AIRES: MEDICA PANAMERICANA
LOPEZ-PEREZ L. ET AL.: "Changes in plasma membrane lipids, aquaporins and proton pump of broccoli roots, as an adaptation mechanism to salinity", PHYTOCHEMISTRY, vol. 70, no. 4, 4 March 2009 (2009-03-04), pages 492 - 500, XP026029325 *
MARTINEZ-BALLESTA M. C. ET AL.: "Two different effects of calcium on aquaporins in salinity-stressed pepper plants", PLANTA, vol. 228, no. 1, 4 March 2008 (2008-03-04), pages 15 - 25, XP019630311 *
MOKHTAR M; SAMMOUR OA; HAMMAD MA; MEGRAB NA, INT J PHARM, vol. 361, 2008, pages 104 - 111
MORENO ET AL., J. PHARMACEUTICALBIOMEDICALANALYSIS, vol. 41, 2006, pages 1508 - 1522
MURIES B. ET AL.: "Identification and differential induction of the expression of aquaporins by salinity in broccoli plants", MOLECULAR BIOSYSTEMS., vol. 7, no. 4, April 2011 (2011-04-01), pages 1322 - 1335, XP055124302 *
See also references of EP2716280A4
SOUGRAT ET AL., J. INVEST. DERMATOL., vol. 118, 2002, pages 678 - 85
THAKUR R; ANWER MK; SHAMS MS; ALI; A, KHAR RK; SHAKEEL F; TAHA. J, DRUG TARGET, vol. 17, 2009, pages 442 - 449
TSAI YH; FANG JY; YU SY; WU PC; HUANG YB, INT J PHARM, vol. 215, 2001, pages 91 - 99
VARSHOSAZ J; PARDAKHTY A; MOHSEN S; BAHARANCHI H, DRUG DELIV, vol. 12, 2005, pages 75 - 82

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2740463A4 (en) * 2011-07-28 2014-12-03 Consejo Superior Investigacion USE OF MEMBRANE VESICLES FROM A MARINE ORGANISM FOR INDUSTRIAL USE AND METHOD OF MANUFACTURING THEM
CN114009327A (zh) * 2021-09-02 2022-02-08 西北大学 一种富集硒与萝卜硫素的西兰花芽苗培育方法及应用

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