WO2013015668A2 - Uso del péptido gk-1 expresado en el fago filamentoso m13 para la elaboración de productos farmacéuticos que aumentan la eficiencia de la respuesta inmune inducida por antígenos vacunales o patógenos - Google Patents

Uso del péptido gk-1 expresado en el fago filamentoso m13 para la elaboración de productos farmacéuticos que aumentan la eficiencia de la respuesta inmune inducida por antígenos vacunales o patógenos Download PDF

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Réne Alvaro SEGURA VELAZQUEZ
Jacquelynne Brenda CERVANTES TORRES
Karen Manucharyan
Abel BLANCAS CABRERA
Rutilia Marisela HERNANDEZ GONZALES
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Definitions

  • the present invention relates to the use of FGK1 as an immunopotentiator that increases the efficiency of the immune response induced by viral or vaccine antigens of viral origin.
  • FGK1 is composed of the peptide called GK-1 associated to the filamentous phage M13 in the form of phagemid to enhance the immunoprotective capacity generated by different vaccines as well as to increase the immune response capable of controlling the establishment and development of different pathogens.
  • the efficiency of the immune response against different pathogens induced by vaccination or by direct contact with them depends on a set of complex phenomena among those involved: the presentation of antigens by professional presenting cells, the activation of specific lymphocytes, cell differentiation, the production of antibodies and other humoral factors that mediate cellular communication.
  • the complexity that underlies the mechanisms of the immune response justifies the heterogeneous efficiency to control different infections or vaccination-induced responses. It is feasible that the phenomena that determine the induction of acquired immunity can be increased through the potentiation of the antigen presentation phenomenon, a critical phase for the induction of an effective immune response.
  • the use of adjuvants has been considered of particular relevance for the potentiation of vaccines with low protective capacity, such as the influenza vaccine.
  • Another adjuvant used in human vaccines is that described in EP0399843B1, which is an emulsion of water in oil with squalene, it is known as MF59 which is used in combination with the influenza vaccine.
  • MF59 which is used in combination with the influenza vaccine.
  • this adjuvant has managed to increase the humoral immune response when co-administered with the parenteral vaccine, the potentiating effect of MF59 is limited in age groups considered high risk, and the vaccine continues to present low efficiency in these groups.
  • Another limitation of the MF59 adjuvant is that only its effectiveness administered parenterally has been demonstrated. MF59 has not been shown to enhance the response of the vaccine administered intranasally or orally [Boyce TG. et.al. 2000].
  • MF59 potentiates only the production of IgG class antibodies, and fails to induce a co-administered protection efficiency with the influenza vaccine in the groups of higher risk equivalent to those induced in young individuals.
  • the potentiating effect of MF59 is limited to the parenteral administration of the vaccine.
  • the MX270782 patent describes the GK-1 peptide as SEQ ID No.1 which is a sequence of 18 .
  • GYYYPSDPNT-FYAPPYSA amino acids from a cengineer cDNA library of Taenia crassiceps containing at least one B epitope and a T cell epitope capable of stimulating the proliferation of CD8 + and CD4 + cells.
  • the GK-1 peptide itself has the ability to increase the activation status of the cells that participate in the antigen presentation (macrophages and dendritic cells). GK-1 has shown that when administered with vaccine antigens, the protective immune response induced by vaccination increases, measured in terms of the amount of antibodies produced and the viral titer recovered after challenge.
  • Patent MX228767 describes the filamentous phage M13 which has the property of exacerbating the specific immune response administered subcutaneously as well as administered intranasally.
  • S3Pvac-phage vaccine where one of the components is FGK1
  • FGK1 The capacity of the S3Pvac-phage vaccine (where one of the components is FGK1) is described, to decrease the prevalence of cysticercosis (caused by Taenia solium) and hydatidosis or echinococcosis (caused by the Echinococcus granulosus cathode) both studied in pigs . This effect is observed due to cross-reactivity given the high homology of the vaccine components in both gestations.
  • the present invention relates to a new application of FGK1 as an immunopotentiator that increases the immune response induced by vaccine antigens of viral origin.
  • FGK1 is a phagemid that expresses the GK-1 peptide on its surface, where GK1 is bound to the pVIII protein of the surface of the filamentous phage M13.
  • the present invention also relates to the use of FGK1 as an immunopotentiator that contributes to the action of vaccines to protect against influenza virus infection.
  • FGK1 immunopotentiator of the present invention has been tested for influenza vaccine, without limiting the invention and has been shown to be able to induce a greater humoral response in different age groups of mice including mice older than 18 months, which simulate one of the groups of the human population with the highest risk of morbidity and mortality from influenza.
  • FGK1 has been shown to enhance the production of antibodies in both serum and bronchial alveolar washes and in both IgG and IgA class, the latter being relevant antibodies in mucosal protection.
  • the synthetic GK-1 peptide co-administered with the influenza vaccine does not increase the levels of antibodies relative to those induced by only the vaccine in young mice.
  • co-administration of FGK1 with the influenza vaccine increases antibody levels by more than 60% in both young and old mice, demonstrating the increased capacity of FGK1 versus synthetic GK-1.
  • FGK1 also exhibits versus the synthetic GK-1 the ability to immunopotentiate the influenza vaccine when administered intranasally.
  • Synthetic GK-1 does not potentiate the vaccine administered intranasally.
  • FGK1 effectiveness of FGK1 in enhancing the local and systemic antibody response demonstrated using the influenza vaccine, allows considering its usefulness as an adjuvant to potentiate the response induced by different vaccines.
  • Another advantage is the low cost of the production of FGK1 and the stability of the phage-expressed product that has been shown to maintain its efficiency even after at least one year of its production.
  • An additional interest of FGK1 with respect to the synthetic version of the GK-1 peptide is the difference in production costs. The production of the recombinant form of FGK1 is cheaper than the synthetic version.
  • the immunopotentiator FGK1 of the present invention is composed of the peptide designated GK-1 of a sequence of 18 amino acids G-Y-Y-Y-P-S-D-P-N-T-F-Y-A-P-P-Y-S-A associated with protein, pVIII of the surface of filamentous phage M13;
  • the scope of the present invention relates to the ability of FGK1 to potentiate vaccines, whereby FGK1 is useful for preparing pharmaceutical products to be administered alone or co-administered with the vaccine to potentiate resulting in potentiating the immune response induced in mammals and birds against the different antigenic components of the respective vaccines when they are of viral origin, whether live, attenuated or inactivated vaccines, or constituted by native, synthetic or recombinant antigens for human use or for veterinary use.
  • the objective of the invention is to provide a new application for FGK1 as an immunopotentiator since being co-administered with vaccine enhances the immune response, both in mammals, including humans, and birds, applicable to any age group.
  • compositions comprising FGK1 and different vaccine antigens form part of the embodiments of the invention, either forming the same composition or as individual compositions, or a kit-shaped pharmaceutical product comprising the pharmaceutical composition of FGK1 and different antigens vaccines
  • the pharmaceutical components a) FGK1 and b) different vaccine antigens are applicable to a patient by any route of administration, where the preferred modality is the administration are the parenteral (subcutaneous or intramuscular) routes. ) and the nasal.
  • One embodiment of the invention relates to the application of FGK1 as an immunopotentiator for influenza vaccine, seeking to increase the production of specific antibodies detected in the serum of the immunized patient according to an appropriate protocol and with the appropriate doses.
  • Part of this modality refers to the possibility of increasing the production of specific antibodies detected in serum of IgG class, when the vaccine and FGK1 are administered intranasally presenting increases in a range of between 229% to 288%; or to increase by so minus 30% the production of IgG class antibodies detected in serum induced when FGK1 is co-administered with influenza vaccine subcutaneously.
  • Another part of the embodiment of the invention relates to the application of FGK1 as an immunopotentiator for influenza vaccine to increase the production of serum-induced IgA class antibodies when FGK1 is co-administered with the intranasal influenza vaccine ranging between 37 % at 54%; or to increase by at least 20% the production of IgA class antibodies detected in serum induced when FGK1 is co-administered with influenza vaccine subcutaneously
  • Another embodiment of the invention relates to the application of FGK1 as an immunopotentiator for an influenza vaccine, increasing the levels of IgA class antibodies detected in bronchioalveolar lavages up to 280% when FGK1 is co-administered with the intranasal influenza vaccine. .
  • Another embodiment of the invention relates to the clinical application of the pharmaceutical product that is in the context of the invention when administered following an immunization protocol designed by the medical expert, nephologist, immunologist and / or epidemiologist and related areas, and which is characterize precisely because it uses co-administration of FGK1 with the vaccine, to enhance the immune response in a patient that requires it.
  • the FGK1 immunopotentiator can be administered alone and sequentially upon administration of the vaccine, or it can be co-administered with the vaccine to be potentiated intranasally, subcutaneously or parenterally.
  • the FGK1 immunopotentiator can be included in the vaccine formulation to enhance its protective capacity when applied to mammals intranasally, as well as parenterally (subcutaneously or intramuscularly).
  • Figure 1 shows the levels of antibodies (IgG) in blood at 3 different times after immunization (21, 45 and 75 days), induced by the immunization of female BALB / cAnN mice subcutaneously with 1. Saline solution (control negative); 2. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine; 3. FGK1 plus FLUZONE ® vaccine and 4. Human influenza (VI) FLUZONE ® + M13 vaccine.
  • Figure 2 Presents blood antibody levels (IgG) induced by subcutaneous immunization with: 1. PBS as a negative control group; 2. Human influenza vaccine (VI) FLUZONE ® ; 3. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine with synthetic GK-1; 4. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine with FGK1 and 5. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine with M13, antibodies are detected 21 days after immunizations.
  • IgG blood antibody levels
  • Figure 3 presents the levels of antibodies (IgG) in blood detected 21 and 45 days after intranasal immunization with the treatments that were: 1. PBS as a negative control group; 2. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine; 3. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine with synthetic GK-1; 4. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine with FGK1; 5. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine with M13; 6. FGK1 and 7, synthetic GK-1.
  • IgG antibodies
  • Figure 4 Presents the levels of antibodies (IgG and IgA) in bronchioalveolar lavages detected 45 days after intranasal immunization with the treatments that were: 1. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine, 2. FLUZONE human influenza (VI) vaccine ® with synthetic GK-1; 3. Vaccine FLUZONE ® human influenza (VI) with FGK1; 4. FLUZONE ® human influenza (VI) vaccine with M13; 5. FGK1 and 6. GK- synthetic.
  • Figure 5 presents the levels of IgG antibodies detected in blood 21 days after immunization with the following treatments: 1. PBS as a negative control group; 2. FLUZONE ® human influenza vaccine; 3. FLUAD ® human influenza vaccine; 4. FLUZONE ® human influenza vaccine with FGK1; 5. FLUAD ® human influenza vaccine with FGK1 and 6. FGK1.
  • Figure 6 presents the levels of IgG antibodies detected in blood 45 days after immunization with the following treatments: 1. PBS as a negative control group; 2. FLUZONE ® human influenza vaccine; 3. FLUAD ® human influenza vaccine; 4. FLUZONE ® human influenza vaccine with FGK1; 5. FLUAD ® human influenza vaccine with FGK1 and 6. FGK1.
  • Figure 7 Presents the levels of IgG antibodies detected in pig plasma 30 and 45 days after immunization with the following treatments: 1. FLUSURE ® swine influenza vaccine; 2. FLUSURE ® swine flu vaccine; in a single dose with FGK1; 3. FLUSURE ® swine influenza vaccine two doses with FGK1.
  • Figure 8 Presents the levels of IgG antibodies detected in pig plasma 30 and 60 days after immunization with the following treatments: 1. FLUSURE ® swine influenza vaccine; 2. FLUSURE ® swine influenza vaccine in a single dose with FGK1; 3. FLUSURE ® swine influenza vaccine two doses with FGK.
  • Figure 9 presents the levels of IgG antibodies detected in mouse serum at 21 after immunization with the following treatments: 1. Baseline levels prior to immunization; 2. FLUZONE ® human influenza vaccine; 3. FLUAD ® human influenza vaccine; 4. FLUZONE ® human influenza vaccine with FGK1; 5. FLUAD ® human influenza vaccine with FGK1, 6. Vaccine FLUZONE ® human influenza with SP3Vac phage; 7. FLUAD ® human influenza vaccine with SP3Vac phage; 8. FGK1 and 9. SP3Vac phage.
  • Figure 10 Presents the levels of IgG antibodies detected in mouse serum at 45 after immunization with the following treatments: 1. Baseline levels prior to immunization; 2. FLUZONE ® human influenza vaccine; 3. FLUAD ® human influenza vaccine; 4. FLUZONE ® human influenza vaccine with FGK1; 5. FLUAD ® human influenza vaccine with FGK1, 6. FLUZONE ® human influenza vaccine with SP3Vac phage; 7. FLUAD ® human influenza vaccine with SP3Vac phage; 8. FGK1 and 9. SP3Vac phage.
  • EXAMPLE 1 CONSTRUCTION OF THE GK1-FAGO EXPRESSED IN THE FILAMENTARY PHAGO M13 (FGK1).
  • FGK1 the GK-1 peptide reported in the MX 211604 patent was used, which refers to the ability of this peptide, to improve the antigenic presentation phenomenon that mediates the specific immune response induced by the vaccine and a system of expression called M13 reported in the patent MX PA00008474A which refers to its ability to express vaccine antigens.
  • the GK-1 peptide was expressed recombinantly.
  • the DNA fragment encoding the GK-1 peptide was generated by alignment of the synthetic oligonucleotides (Invitrogen) 5'GK1: AATTAGGTTATTACTATCCATCTGATCCAAATACCTTCTACGCTCCACCCTA CAGC and 3'GK1: GATCGCTGTAGGGTGGAGCGTAGATGGAGCGTAGATGGAGCGTAGATGGAGCGTAGATG
  • FGK1 construct was titled for the determination of the phagemid titer in the culture supernatants.
  • TG1 cells are grown in 10 ml of 2xYT medium (Invitrogen) overnight at 37 ° C and 200 rpm.
  • the infection is carried out in microtubes with 200 ⁇ of TG1 cells and 50 ⁇ of supernatant of the dilutions (10 ⁇ 9 to 10 ⁇ 11 ) in 2x YT medium, incubated for 30 min at 37 ° C without shaking and plating all the LB ampicillin box volume (100 pg / ml), incubated overnight at 37 ° C and colony forming units per milliliter (CFU / ml) of each supernatant are determined.
  • EXAMPLE 2 DETERMINATION OF THE EFFECT OF FGK1 TO IMPROVE THE IMMUNE RESPONSE.
  • the levels of specific antibodies induced were determined, a parameter that was used to assess its effect on immune response.
  • different batches of influenza vaccines produced between 2001 and 2009 were used.
  • mice of the 7-9 week BALB / cAnN strain whose number of groups varies according to the test to perform. Mice received a single dose of each immunogen subcutaneously or intranasally. Mice were sacrificed 45 days after immunization. Blood samples were collected before, 21 and 45 days after immunization, and after 45 days bronchioalveolar lavage was collected.
  • a first group was immunized with PBS to be considered a negative control group, the second group received only influenza vaccine, the third group received influenza vaccine co-administered with FGK1, and the fourth group was immunized with influenza vaccine and phage M13 without the expression of GK-1.
  • the levels of IgG and IgA antibodies present in the sera and bronchial alveolar washes were determined by the ELISA technique, in the case of the IgG determination the serum was used at a 1: 100 dilution; For the determination of serum IgA a 1: 50 dilution was used and for the determination of IgAs and IgGs in bronchial alveolar lavages the samples were used undiluted.
  • the influenza vaccine was used at a dose of 1 g / mouse [strain: A / New Caledonia / 20/99 (H1 N1), A / Panama / 2007/99 (H3N2) (strain analogue A / Moscow 10/99, and BA / ictoria / 504/2000 (strain analogous to B / Sichuan / 379/99).]
  • the FLUZONE R vaccine was used for the 2004-2005 flu season containing 45 g of haemagglutinins HA per dose of 0.5 ml.
  • mice received single doses of each immunogen subcutaneously at the base of the tail and the induced response was evaluated in serum at different times after immunization that was 21, 45 and 75 days.
  • the sera were obtained from peripheral blood obtained by centrifuging at 5,000 rpm for 12 minutes and kept frozen in aliquots until use.
  • the co-immunization of the influenza vaccine with FGK1 generates a significant increase in the amount of specific antibodies against influenza compared to those induced by the vaccine alone that is maintained even after 75 days, which gives us indicates that the immune response induced by the human influenza vaccine is improved. It also becomes clear that FGK1 acts better as an immunopotentiator than M13 without the expression of GK-1, since the amount of induced antibodies is always greater when co-immunizing with FGK1.
  • EXAMPLE 4 DETERMINATION OF THE ANSWER INDUCED BY THE FGK1 COMPARED TO THE ANSWER INDUCED BY THE SYNTHETIC PEPTIDE GK-1 WHEN SUBCUTANEOUS IMMUNIZE.
  • the influenza vaccine was used at a dose of 1 pg / mouse [strain: A / New Caledonia / 20/99 (H1 N1), A / Panama / 2007/99 (H3N2) (analogue strain A / Moscow / 10/99, and B / Victoria / 504/2000 (strain analogous to B / Sichuan / 379/99)]
  • the FLUZONE vaccine was used for the 2004-2005 flu season containing 45 pg of haemagglutinins HA per dose of 0.5 ml.
  • the synthetic peptide GK-1 was used at its optimal dose (Segura-Velázquez et. Al. 2006) whose concentration is 10pg / mouse.
  • FGK1 and M13 were used in a title of 10 12 phage units per inactivated mouse as detailed in this document.
  • mice received single doses of each immunogen subcutaneously at the base of the tail and the induced response was evaluated in serum at 21 days after immunization.
  • the sera were obtained from peripheral blood obtained by centrifuging at 5,000 rpm for 12 minutes and kept frozen in aliquots until use.
  • the influenza vaccine was used at a dose of 1 pg / mouse [strain: A / New Caledonia / 20/99 (H1 N1), A / Panama / 2007/99 (H3N2) (analog strain A / Moscow / 10/99 , and B / Victoria / 504/2000 (strain analogous to B / Sichuan / 379/99).]
  • the FLUZONE R vaccine was used for the 2004-2005 flu season containing 45 pg of haemagglutinins HA per dose of 0.5 ml. used the synthetic peptide GK1 in the optimal dose previously determined (Segura-Velázquez et. al. 2006) of 10pg / mouse.
  • the sera were obtained from peripheral blood obtained by centrifuging at 5,000 rpm for 12 minutes and kept frozen in aliquots until use. Bronchioalveolar washes were obtained after intra-tracheal washes with 300 ⁇ of saline solution 45 dvas after immunizations.
  • FGK1 generates a higher serum IgG response
  • Figure 3 shows us that FGK1 induces a better immune response which is reflected by the induction of a greater amount of specific influenza antigen IgG antibodies detected in serum.
  • FGK1 generates an improvement in the response of IgG and IgA in bronchial-alveolar lavages.
  • Figure 4 shows that it is only possible to stimulate the specific immune response of the specific influenza antigen expressed in the levels of IgG and IgA antibodies detected in bronchioalveolar washes in the group that was co -immunized with influenza vaccine and FGK1. In the case of IgG antibodies induced in bronchial alveolar lavages, this response is much greater than the response induced by influenza vaccine alone.
  • the group immunized with influenza vaccine and FGK1 generated antibody levels 4 times higher than that induced by the group immunized only with influenza vaccine (438% higher). In both cases, only the group that received the FGK1 vaccine was the only one capable of inducing a specific immune response.
  • influenza vaccine was used in a dose of 1 pg / mouse of the FLUZONE ® vaccine [strain: A / New Caledonia / 20/99 (H1 N1), A Panama / 2007/99 (H3N2) (analogue strain A / Moscow / 10/99, and B / Victoria / 504/2000 (strain analogous to B / Sichuan / 379/99)] and g / FLUAD ® vaccine mouse [strain: A / Brisbane / 59/2007 (H1 N1) (strain analogous to: A / Brisbane / 59/2007, IVR-148), A / Brisbane / 10/2007 (H3N2) (analog strain: A / U ruguay /
  • FGK1 and M13 were used in a title of 10 12 phage units per mouse.
  • the mice received single doses of each immunogen subcutaneously at the base of the tail and the induced response was evaluated in serum at different times after immunization which were 21 and 45 days.
  • the sera were obtained by centrifuging at 5,000 rpm for 12 minutes the peripheral blood obtained and kept freezing in aliquots until use.
  • the groups were divided according to the immunization treatment they received, which were constituted as follows:
  • a group that only received treatment with PBS which was considered a negative control group a second group of 5 mice that only received treatment with commercial influenza vaccine without adjuvant (FLUZONE ® ), the third group, also of 5 mice, received treatment with commercial influenza vaccine with adjuvant (FLUAD); the fourth group of 5 mice received treatment with commercial influenza vaccine without adjuvant (FLUZONE ® ) co-administered with FGK1; The fifth group with 5 mice received treatment with commercial influenza vaccine containing adjuvant (FLUAD ® ) co-administered with FGK1 and finally a sixth group consisting of 5 mice that only received treatment with FGK1.
  • FGK1 co-administered with the commercial influenza vaccine that does not contain adjuvant induces in early stages levels of antibodies similar to those induced by the commercial vaccine with adjuvant (FLUAD ® )
  • FLUAD ® adjuvant
  • Figure 5 makes it clear that the commercial influenza vaccine containing the adjuvant MF59 (FLUAD ® ) generates a better response of antibodies that the FLUZONE ® commercial influenza vaccine generates, which does not contain any adjuvant, however, by placing FGK1 as an adjuvant together with the FLUZONE ® vaccine an antibody response similar to that generated by the commercial vaccine is generated with adjuvant
  • FGK1 co-administered [with the commercial influenza vaccine that does not contain adjuvant (FLUZONÉ ® ) generates an antibody response greater than that generated by the commercial vaccine with adjuvant (FLUAD ® ), also enhancing the antibody response induced by the vaccine commercial with adjuvant
  • the induced immune response (deduced by comparing the levels of IgG antibodies induced and detected in serum) was compared between the two types of commercial influenza vaccine available (with and without adjuvant ) administered alone or in combination with FGK1.
  • Pigs immunized with FLUSURE ® swine influenza vaccine under the conditions indicated by the manufacturer with FGK1.
  • the swine flu vaccine was used in a dose of 2mL (as indicated by the manufacturer) which consists of two influenza virus isolates swine type A subtypes H1 N1 and H3N2 each.
  • the FLUSURE ® vaccine was used for the 2009-2010 season.
  • FGK1 was used in a 2.5X10 12 phage units per inactivated pig as detailed in this document, using a single dose per pig.
  • the pigs received two doses of FLUSURE ® intramuscularly (as indicated by the manufacturer) and one dose of FGK1, in the neck of the pig and the induced response was evaluated in plasma at 30, 45 and 60 days after immunization.
  • the plasma was obtained from the peripheral blood obtained in the established time to immunization, centrifuging it at 2,500 rpm for 30 minutes and kept freezing in aliquots until its use.
  • immunization with a single dose of the swine influenza vaccine induces a lower antibody response to the response that is induced after the second immunization with the same vaccine (as indicated by the manufacturer) , a result that is evident both at 15 days (94% increase) and at 30 days (96% increase) after the second immunization and corresponding to the 45 and 60 days after the first immunization.
  • the antibody response generated 15 days after the second immunization with swine influenza vaccine increases by 84 % compared to the response induced by the swine flu vaccine alone.
  • the induced response is 69% higher to the response that the influenza vaccine induces after its two applications.
  • EXAMPLE 8 EFFECT OF IMPROVING FGK1 HUMOR IMMUNE RESPONSE due to trade Fluzone ® INFLUENZA VACCINE AND TRADE OF INFLUENZA VACCINE ADJUVANT ® FLUAD IMMUNE RESPONSE COMPARED WITH THE USE OF INDUCED S3PVAC-Phage.
  • 6 groups of female mice of the BALB / cAnN strain with ages of 7-8 weeks were used, in which the following treatment schemes were evaluated:
  • the influenza vaccine was used in a dose of I g / mouse of the FLUZONE ® vaccine [strain: A / New Caledonia / 20/99 (H1 N1), A / Panama / 2007/99 (H3N2) (analogue strain A / Moscow / 10/99, and BA / ictoria / 504/2000 (strain analogous to B / Sichuan / 379/99)] and g / mouse of the FLUAD ® vaccine [strain: A / Brisbane / 59/2007 (H1 N1) ( strain analogous to: A / Brisbane / 59/2007, IVR-148), A Brisbane / 10/2007 (H3N2) (analog strain: A / ought / 716/2007, NYMC X-175C) and B / FLORI DA / 4 / 2006]
  • the FLUZONE R vaccine was used for 2008-2009 flu season containing 45 g of hemagglutinins per dose of 0.5
  • FGK1, S3Pvac-phage and M13 were used in a title of 10 12 phage units per mouse.
  • Mice received single doses of each immunogen subcutaneously at the base of the tail and the induced response was evaluated in serum at different times after immunization that were 21 and 45 days after immunization.
  • the sera were obtained by centrifuging at 5,000 rpm for 12 minutes the peripheral blood obtained and kept freezing in aliquots until use.
  • the groups were divided according to the immunization treatment they received which were constituted as follows:
  • a group that only received treatment with PBS as a negative control group a second group of 5 mice that only received treatment with commercial influenza vaccine without adjuvant (FLUZONE ® ), the third group also of 5 mice received treatment with commercial influenza vaccine with adjuvant (FLUAD); the fourth group of 5 mice received treatment with commercial influenza vaccine without adjuvant (FLUZONE ® ) co-administered with FGK1; the fifth group with 5 mice received treatment with commercial influenza vaccine containing adjuvant (FLUAD ® ) co-administered with FGK1 and finally a sixth group consisting of 5 mice that only received treatment with FGK1.
  • induction of an IgG antibody response is generated from 21 days after immunization.
  • the immunopotentiating capacity of FGK1 is checked with respect to the response induced by 2 types of commercial influenza vaccine, one without adjuvant (FLUZONE) and the other with adjuvant (FLUAD). It is also shown that FGK1 generates the potentiation of the specific immune response in a more efficient way than the use of the S3Pvac-Phage vaccine could generate.

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Abstract

Esta invención presenta el uso del inmunopotenciador FGK1 integrado por el péptido denominado GK-1 caracterizado por la secuencia G-Y-Y-P-S-D-P-N-T- F-Y-A-P-P-Y-S-A asociado a la proteína pVIII de la superficie del fago filamentoso M13, el FGK1 para la preparación de productos farmacéuticos que potencian la respuesta inmunológica protectora de antígenos vacunales al utilizarse sólo o conjuntamente con estos antígenos administrados por vía intranasal así como subcutánea e intramuscular lográndose un aumento de la cantidad de anticuerpos específicos contra los antígenos vacunales en suero y en lavados bronqueoalveolares.

Description

USO DEL PÉPTIDO GK-1 EXPRESADO EN EL FAGO FILAMENTOSO M13 PARA LA ELABORACIÓN DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS QUE AUMENTAN LA EFICIENCIA DE LA RESPUESTA INMUNE INDUCIDA POR
ANTÍGENOS VACUNALES O PATÓGENOS
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere al uso del FGK1 como un inmunopotenciador que aumenta la eficiencia de la respuesta inmune inducida por antígenos virales o vacunales de origen viral. FGK1 se compone del péptido denominado GK-1 asociado al fago filamentoso M13 en la forma de fagémido para potenciar la capacidad inmunoprotectora generada por diferentes vacunas así como para aumentar la respuesta inmune capaz de controlar el establecimiento y desarrollo de diferentes patógenos.
ANTECEDENTES
La eficiencia de la respuesta inmune contra distintos patógenos inducida por vacunación o por el contacto directo con los mismos, depende de un conjunto de fenómenos complejos entre los que participan: la presentación de los antígenos por células presentadoras profesionales, la activación de los linfocitos específicos, la diferenciación celular, la producción de anticuerpos y otros factores humorales que median la comunicación celular. La complejidad que subyace en los mecanismos de la respuesta inmune, justifica la heterogénea eficiencia para controlar diferentes infecciones o respuestas inducidas por vacunación. Es factible que los fenómenos que determinan la inducción de inmunidad adquirida, pueda aumentarse a través de la potenciación del fenómeno de presentación del antígeno, fase crítica para la inducción de una respuesta inmune efectiva. El uso de adyuvantes se ha considerado de relevancia en particular para la potenciación de la vacunas con baja capacidad protectora, como por ejemplo la vacuna de la influenza.
En el estado de la técnica existen diversos inmunopotenciadores o adyuvantes entre ellos podemos mencionar el hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio. . Ese adyuvante se reportó desde 1926 y fue el primero autorizado para uso humano. Sin embargo, presenta ciertas limitaciones particularmente relacionadas con la inducción de una fuerte respuesta inmune mediada por células T [Chang S. et. al. 2009]; lo cual en ciertos tratamientos en vez de ser favorable resulta ser contraproducente. Además el hidróxido de aluminio exacerba particularmente la respuesta celular que no es la requerida para la prevención de ciertas enfermedades en las que la protección se asocia en particular a la respuesta inmune humoral.
Otro adyuvante utilizado en vacunas humanas es el descrito en la EP0399843B1 , que es una emulsión de agua en aceite con escualeno, es conocido como MF59 el cual es utilizado en combinación con la vacuna de influenza. Si bien este adyuvante ha logrado incrementar la respuesta inmune humoral cuando es co-administrado con la vacuna por vía parenteral, el efecto potenciador de MF59 es limitado en grupos de edades considerados de alto riesgo, y la vacuna continua presentando baja eficiencia en estos grupos. Otra limitante del adyuvante MF59 es que únicamente se ha demostrado su efectividad administrado por vía parenteral. MF59 no ha demostrado potenciar la respuesta de la vacuna administrada por vía intranasal u oral [Boyce TG. et.al. 2000].
El MF59 potencia solo la producción de anticuerpos de clase IgG, y no logra inducir una eficiencia de protección co-administrado con la vacuna de influenza en los grupos de mayor riesgo equivalente a los que se induce en los individuos jóvenes. Además, el efecto potenciador de MF59 se limita a la forma de administración parenteral de la vacuna. En el estado de la técnica la patente MX270782 describe el péptido GK-1 como SEQ ID No.1 que es una secuencia de 18. aminoácidos G-Y-Y-Y-P-S-D-P-N-T- F-Y-A-P-P-Y-S-A proveniente de una biblioteca de ADNc de cisticercos de Taenia crassiceps que contiene al menos un epítope B y un epítope de células T capaz de estimular la proliferación de CD8+ y de células CD4+. También se ha podido observar que el sobrenadante de células estimuladas específicamente con este péptido contiene altos niveles de IFN-γ así como de IL-2 y en menor grado de IL-4. Resultados similares se obtuvieron cuando se midió la producción de citocinas en células T por citometría de flujo, lo que señala la capacidad del péptido para promover una respuesta inflamatoria. [Toledo A, et al., Infection and Immun. 999; 67 (5): 2522-30].
El péptido GK-1 por sí mismo tiene la capacidad de aumentar el estado de activación de las células que participan en la presentación antigénica (macrófagos y células dendríticas). GK-1 ha demostrado que al ser administrado con antígenos vacunales aumenta la respuesta inmunológica protectora inducida por la vacunación, medida en términos de la cantidad de anticuerpos producidos y el título viral recuperado después del desafío. En la patente MX228767 se describe el fago filamentoso M13 que tiene la propiedad de exacerbar la respuesta inmune específica administrado por vía subcutánea así como administrado por vía intranasal.
En el documento Manoutcharian K. et. al., Veterinary Immunology and Immunopathology 99 (2004) 11-24, se presenta la capacidad protectora de la vacuna CPhV (4x1012 partículas de fago) integrada por los fagos recombinantes KETd , KETc12, GK1 y KETc7, evaluada en contra de la cisticercosis experimental murina y porcina demostrando que CPhV induce una respuesta inmune celular específica pero no de tipo humoral. En el documento Morales J. et. al., Vaccine 26 (2008) 2899-2905 se divulga al fagémido como componente de la vacuna recombinante contra cisticercosis denominada S3Pvac-fago. En el documento Morales J. et. al., Veterinary Parasitology 176 (2011) 53-58. se describe la capacidad de la vacuna S3Pvac-fago (en donde uno de los componentes es FGK1 ), para disminuir la prevalencia de cisticercosis (ocasionada por Taenia solium) y de hidatidosis o equinococosis (ocasionada por el céstodo Echinococcus granulosus) ambas estudiadas en porcinos. Este efecto se observa debido a la reactividad cruzada dada la alta homología de los componentes de la vacuna en ambos gestados.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una nueva aplicación del FGK1 como inmunopotenciador que aumenta la respuesta inmune inducida por antígenos vacunales de origen viral. FGK1 es un fagémido que expresa al péptido GK-1 en su superficie, donde el GK1 está unido a la proteína pVIII de la superficie del fago filamentoso M13. En particular y sin que esto límite la invención la presente invención también se refiere al uso del FGK1 como inmunopotenciador que coadyuva la acción de vacunas para proteger de infección por virus de influenza.
El desempeño del inmunopotenciador FGK1 de la presente invención, se ha probado para la vacuna de influenza, sin que esto limite la invención y ha demostrado ser capaz de inducir una mayor respuesta humoral en diferentes grupos de edades de ratones incluyendo ratones mayores de 18 meses, que simulan uno de los grupos de la población humana de mayor riesgo de morbi- mortalidad por influenza. Además, cabe señalar que, FGK1 ha demostrado potenciar la producción de anticuerpos tanto en suero como en lavados bronqueoalveolares y tanto de clase IgG como IgA, siendo estos últimos anticuerpos relevantes en la protección en las mucosas. Por otra parte, estudios realizados en ratones singénicos utilizando al FGK1 como adyuvante con la vacuna de influenza, han demostrado que coadministrando FGK1 con la vacuna de influenza por vía subcutánea se logra generar una respuesta de anticuerpos específicos contra influenza más elevada que la inducida con las condiciones equivalentes por la vacuna de influenza con MF59. El incremento de anticuerpos se observa tanto en clase IgG como en clase IgA y tanto en suero como en lavados bronqueoalveolares. Además de obtener una mayor respuesta humoral inmunizando por vía subcutánea, al utilizar la vacuna de influenza por vía intranasal en conjunto con FGK1 se obtienen mayores niveles de anticuerpos del subtipo IgG e IgA tanto en suero como en lavados bronqueoalveolares. Estos resultados resultan de interés para incluir a FGK1 en nuevas versiones de vacunas orales o intranasales, lo que representan una ventaja respecto al adyuvante MF59 que no presenta esta capacidad.
Inmunizando ratones por vía intranasal o parenteral con vacuna de influenza en presencia o no de M13 o de FGK1 y cuantificando los niveles de anticuerpos inducidos en suero y en lavados bronqueoalveolares, se ha observado que tanto M13 como FGK1 incrementan los niveles de anticuerpos sistémicos y locales esperados respecto a los inducidos por la inmunización de la vacuna. Sin embargo, la respuesta de anticuerpos en ambos compartimentos es significativamente mayor cuando la vacuna de influenza se co-administra con FGK1 que con solo M13.
Si bien el M13 y GK-1 por si solos aumentan la respuesta inmune, con la integración de M 3 y GK-1 para formar FGK1 se ha encontrado que se presenta un efecto sinérgico en el aumento de la respuesta inmune cuando es co-administrado con vacunas, por lo tanto no es posible deducirlo del estado de la técnica más cercano. De la misma forma el péptido sintético GK-1 ha demostrado que al ser coadministrado con la vacuna de influenza potencia la respuesta protectora inducida por la vacuna, en un modelo de influenza en ratones jóvenes y en ratones viejos, éstos últimos simulan la población humana de edad mayor a 65 años que presentan alto riesgo de morbi-mortalidad por influenza. A pesar de potenciar la respuesta protectora en ambas poblaciones, el péptido sintético GK-1 co-administrado con la vacuna de influenza no aumenta los niveles de anticuerpos relativos a los inducidos por solo la vacuna en los ratones jóvenes. En contraste, la co-administración de FGK1 con la vacuna de influenza aumenta los niveles de anticuerpos en más del 60% tanto en ratones jóvenes como en ratones viejos, lo que demuestra la mayor capacidad potenciadora de FGK1 versus GK-1 sintético.
FGK1 presenta además versus el GK-1 sintético la capacidad de inmunopotenciar la vacuna de influenza al ser administrados por vía intranasal. GK-1 sintético no potencia la vacuna administrada intranasalmente.
Por otra parte, también se ha demostrado que S3Pvac-phage co-administrada con la vacuna de influenza comercial FLUZONE (la cual no contiene adyuvante) y FLUAD (la cual contiene en su formulación al adyuvante MF59) genera una respuesta inmune muy similar a la que genera la administración sola de la vacuna comercial, lo cual indica que S3Pvac-Phage no tiene la capacidad de inmunopotenciar la respuesta de anticuerpos inducida por las vacunas comerciales de influenza con y sin adyuvante como lo hace la utilización de FGK1 con ambas vacunas
Por último, la efectividad de FGK1 para potenciar la respuesta local y sistémica de anticuerpos demostrada utilizando la vacuna de influenza, permite considerar su utilidad como adyuvante para potenciar la respuesta inducida por diferentes vacunas. Otra ventaja es el bajo costo de la producción de FGK1 y la estabilidad del producto expresado en fago que ha demostrado mantener su eficiencia aún después de al menos un año de su producción. Un interés adicional del FGK1 respecto a la versión sintética del péptido GK-1 es la diferencia en los costos de producción. La producción de la forma recombinante de FGK1 resulta más económica que la versión sintética.
El inmunopotenciador FGK1 de la presente invención se compone del péptido denominado GK-1 de una secuencia de 18 aminoácidos G-Y-Y-Y-P-S-D-P-N-T- F-Y-A-P-P-Y-S-A asociada a la proteina , pVIII de la superficie del fago filamentoso M13; el alcance de la presente invención se refiere a la capacidad del FGK1 para potenciar vacunas, por lo que el FGK1 es útil para preparar productos farmacéuticos para ser administrado solo o co-administrado con la vacuna a potenciar resultando en que potencia la respuesta inmunológica inducida en mamíferos y aves contra los diferentes componentes antigénicos de las respectivas vacunas cuando son de origen viral, ya sean vacunas vivas, atenuadas o inactivadas, o constituidas por antígenos nativos, sintéticos o recombinantes para uso humano o para uso veterinario.
La administración por vía intranasal, vía subcutánea o por vía parenteral de los productos farmacéuticos incluyendo en la fórmula vacunas más el FGK1 en mamíferos resulta en la potenciación de la respuesta inmunológica humoral inducida por la vacuna, incrementando la producción de anticuerpos específicos contra los correspondientes antígenos vacunales, en particular el IgA y el IgG. Con respecto a la respuesta inmune celular, se genera el mejoramiento de la presentación antigénica por parte de las células presentadoras de antígeno y favoreciendo así la eliminación de diferentes patógenos. MODALIDADES DE LA INVENCIÓN
El objetivo de la invención es proporcionar una nueva aplicación para el FGK1 como inmunopotenciador ya que al ser co-administrado con vacuna potencia la respuesta inmunológica, tanto en mamíferos, incluyendo al humano, como en aves, aplicable a cualquier grupo de edad.
Forma parte de las modalidades de la invención las composiciones farmacéuticas que comprenden FGK1 y diferentes antígenos vacunales, ya sea conformando una misma composición o bien como composiciones individuales, o bien un producto farmacéutico en forma de kit que comprenda la composición farmacéutica de FGK1 y diferentes antígenos vacunales.
Es una de las modalidades preferidas de la invención el uso del inmunopotenciador FGK1 para potenciar la respuesta inmune y favorecer la inmunidad inducida por la aplicación de diferentes antígenos vacunales.
Queda dentro del alcance de la invención la posibilidad de indicar que los componentes farmacéuticos a) FGK1 y b) diferentes antígenos vacunales, son aplicables a un paciente por cualquier vía de administración, donde la modalidad preferida es la administración son las vías parenteral (subcutánea o intramuscular) y la nasal.
Una modalidad de la invención se refiere a la aplicación del FGK1 como inmunopotenciador para la vacuna de influenza, buscando incrementar la producción de anticuerpos específicos detectados en el suero del paciente inmunizado de acuerdo con un protocolo adecuado y con las dosis adecuadas.
Parte de esta modalidad se refiere a la posibilidad de incrementar la producción de anticuerpos específicos detectados en suero de clase IgG, cuando la vacuna y el FGK1 se administran por vía intranasal presentando incrementos en un intervalo de entre 229% a 288%; o bien para incrementar en por lo menos un 30% la producción de anticuerpos de clase IgG detectados en suero inducidos cuando es co-administrado FGK1 con la vacuna de influenza por vía subcutánea. Otra parte de la modalidad de la invención se refiere a la aplicación del FGK1 como inmunopotenciador para la vacuna de influenza para incrementar la producción de anticuerpos de clase IgA en suero inducidos cuando se coadministra FGK1 con la vacuna de influenza por vía intranasal que oscila entre 37% a los 54%; o bien para incrementar en por lo menos un 20% la producción de anticuerpos de clase IgA detectados en suero inducidos cuando se coadministra FGK1 con la vacuna de influenza por vía subcutánea
Otra modalidad de la invención se refiere la aplicación del FGK1 como inmunopotenciador para una vacuna de influenza, incrementando los niveles de anticuerpos de clase IgA detectados en lavados bronquioalveolares de hasta un 280% cuando se co-administra FGK1 con la vacuna de influenza por vía intranasal.
Otra modalidad de la invención se refiere a la aplicación clínica del producto farmacéutico que está en el contexto de la invención cuando se administra siguiendo un protocolo de inmunización diseñado por el experto médico ¡nfectólogo, inmunólogo y/o epidemiólogo y áreas afines, y que se caracterice precisamente porque utiliza co-administración de FGK1 con la vacuna de, para potenciar la respuesta inmune en un paciente que lo requiera.
El inmunopotenciador FGK1 puede ser administrado solo y de manera secuencial a la administración de la vacuna, o bien puede ser co-administrado con la vacuna a potenciar por vía intranasal, vía subcutánea o por vía parenteral. El inmunopotenciador FGK1 se puede incluir en la formulación de la vacunas para potenciar su capacidad protectora cuando es aplicada a mamíferos por vía intranasal, así como por vía parenteral (subcutánea o intramuscular). BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : presenta los niveles de anticuerpos (IgG) en sangre en 3 diferentes tiempos posteriores a la inmunización (21 , 45 y 75 días), inducidos por la inmunización de ratones BALB/cAnN hembras por vía subcutánea con 1. Solución salina (control negativo); 2. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE®; 3. FGK1 más la vacuna FLUZONE® y 4. Vacuna influenza humana (VI) FLUZONE®+M13.
Figura 2: presenta los niveles de anticuerpos (IgG) en sangre inducidos por la inmunización subcutánea con: 1. PBS como grupo control negativo; 2. Vacuna influenza humana (VI) FLUZONE®; 3. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con GK-1 sintético; 4. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con FGK1 y 5. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con M13, los anticuerpos son detectados 21 días posteriores a las inmunizaciones.
Figura 3: presenta los niveles de anticuerpos (IgG) en sangre detectados 21 y 45 días posteriores a la inmunización intranasal con los tratamientos que fueron: 1. PBS como grupo control negativo; 2. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE®; 3. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con GK-1 sintético; 4. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con FGK1 ; 5. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con M13; 6. FGK1 y 7, GK-1 sintético.
Figura 4: presenta los niveles de anticuerpos (IgG e IgA) en lavados bronqueoalveolares detectados 45 días posteriores a la inmunización intranasal con los tratamientos que fueron: 1. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE®, 2. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con GK-1 sintético; 3. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con FGK1 ; 4. Vacuna influenza (VI) humana FLUZONE® con M13; 5. FGK1 y 6. GK- sintético.
Figura 5: presenta los niveles de anticuerpos IgG detectados en sangre 21 días posteriores a la inmunización con los siguientes tratamientos: 1. PBS como grupo control negativo; 2. Vacuna influenza humana FLUZONE®; 3. Vacuna influenza humana FLUAD®; 4. Vacuna influenza humana FLUZONE® con FGK1 ; 5. Vacuna influenza humana FLUAD® con FGK1 y 6. FGK1. Figura 6: presenta los niveles de anticuerpos IgG detectados en sangre 45 días posteriores a la inmunización con los siguientes tratamientos: 1. PBS como grupo control negativo; 2. Vacuna influenza humana FLUZONE®; 3. Vacuna influenza humana FLUAD®; 4. Vacuna influenza humana FLUZONE® con FGK1 ; 5. Vacuna influenza humana FLUAD® con FGK1 y 6. FGK1.
Figura 7: presenta los niveles de anticuerpos IgG detectados en plasma de cerdos 30 y 45 días después de la inmunización con los siguientes tratamientos: 1. Vacuna de influenza porcina FLUSURE®; 2. Vacuna de influenza porcina FLUSURE®; en una sola dosis con FGK1 ; 3. Vacuna de influenza porcina FLUSURE® dos dosis con FGK1.
Figura 8: presenta los niveles de anticuerpos IgG detectados en plasma de cerdos 30 y 60 días después de la inmunización con los siguientes tratamientos: 1. Vacuna de influenza porcina FLUSURE®; 2. Vacuna de influenza porcina FLUSURE® en una sola dosis con FGK1 ; 3. Vacuna de influenza porcina FLUSURE® dos dosis con FGK .
Figura 9: presenta los niveles de anticuerpos IgG detectados en suero de ratón a los 21 posteriores a la inmunización con los siguientes tratamientos: 1. Niveles básales previos a la inmunización; 2. Vacuna influenza humana FLUZONE®; 3. Vacuna influenza humana FLUAD®; 4. Vacuna influenza humana FLUZONE® con FGK1 ; 5. Vacuna influenza humana FLUAD® con FGK1 , 6. Vacuna influenza humana FLUZONE® con SP3Vac phage; 7. Vacuna influenza humana FLUAD® con SP3Vac phage; 8. FGK1 y 9. SP3Vac phage.
Figura 10. presenta los niveles de anticuerpos IgG detectados en suero de ratón a los 45 posteriores a la inmunización con los siguientes tratamientos: 1. Niveles básales previos a la inmunización; 2. Vacuna influenza humana FLUZONE®; 3. Vacuna influenza humana FLUAD®; 4. Vacuna influenza humana FLUZONE® con FGK1 ; 5. Vacuna influenza humana FLUAD® con FGK1 , 6. Vacuna influenza humana FLUZONE® con SP3Vac phage; 7. Vacuna influenza humana FLUAD® con SP3Vac phage; 8. FGK1 y 9. SP3Vac phage.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos son para ilustrar la invención pero en ningún momento es para limitarla.
EJEMPLO 1. CONSTRUCCIÓN DEL GK1-FAGO EXPRESADO EN EL FAGO FILAMENTOSO M13 (FGK1). Para la construcción del FGK1 se utilizó el péptido GK-1 reportado en la patente MX 211604, que hace referencia a la capacidad de este péptido, de mejorar el fenómeno de presentación antigénica que media la respuesta inmune específica inducida por la vacuna y un sistema de expresión denominado M13 reportado en la patente MX PA00008474A que hace referencia a su capacidad para expresar antígenos vacunales.
Para realizar los estudios de la presente invención el péptido GK-1 fue expresado en forma recombinante. El péptido GK-1 en la secuencia de aminoácidos 69-85 del antígeno KETc7 cuya secuencia específica es, GYYYPSDPNTFYAPPYSA, fue expresado en la superficie del fago M13 por clonación del correspondiente ADN en el vector fago/fagémido. El fragmento de ADN que codifica para el péptido GK-1 se generó por alineamiento de los oligonucleótidos sintéticos (Invitrogen) 5'GK1 : AATTAGGTTATTACTATCCATCTGATCCAAATACCTTCTACGCTCCACCCTA CAGC y 3'GK1 : GATCGCTGTAGGGTGGAGCGTAGAAGGTATTTGGATCAGATGGATA
GTAATAACCTque contienen los sitios de restricción EcoRI y BamHI, posteriormente el ADN fue digerido con EcoR\/Bam \, el fragmento GK1 fue purificado del gel de agarosa y precipitado en etanol. La secuencia correcta de cada aminoácido del péptido GK-1 asociado a las proteínas de superficie pVIII fue confirmada por secuenciación automática y manual. Para la secuenciación automática se utilizó el secuenciador AB1 Pris 310 (Applied Biosystems, Foster City, C. A) utilizando primer específicos. Para la secuenciación manual la construcción genética fue verificada por secuenciación usando [a-35S] dATP (Amersham-Life Science) y el kit de secuenciación Quick-Denature plasmid sequencing kit (Amersham).
La construcción FGK1 fue titulada para la determinación del título de fagémidos en los sobrenadantes del cultivo. Células TG1 se crecen en 10 mi de medio 2xYT (Invitrogen) durante toda la noche a 37 °C y 200 rpm. La infección se realiza en microtubos con 200 μΙ de células TG1 y 50 μΙ de sobrenadante de las diluciones (10~9 a 10~11) en medio 2x YT, se incuban durante 30 min a 37 °C sin agitación y se plaquea todo el volumen en cajas LB ampicilina (100 pg/ml), se incuban durante toda la noche a 37 °C y se para determina las unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml) de cada sobrenadante.
EJEMPLO 2. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEL FGK1 DE MEJORAR LA RESPUESTA INMUNE. Para determinar el efecto del FGK1 en mejorar la respuesta inmunológica generada por antígenos vacunales se determinaron los niveles de anticuerpos específicos inducidos, parámetro que se utilizó para evaluar su efecto en la respuesta inmune. Con el propósito de determinar el efecto inmunopotenciador de FGK1 se utilizaron diferentes lotes de vacunas contra influenza producidas entre los años 2001 al 2009. En los experimentos utilizamos grupos de ratones hembras de la cepa BALB/cAnN de 7-9 semanas cuyo número de grupos varía según la prueba a realizar. Los ratones recibieron una sola dosis de cada inmunógeno por vía subcutánea o intranasal. Los ratones fueron sacrificados a los 45 días después de la inmunización. Se colectaron antes, 21 y 45 días después de la inmunización, muestras de sangre y a los 45 días se colectó lavado bronqueoalveolar.
Los esquemas de tratamiento utilizados fueron los siguientes:
Un primer grupo fue inmunizado con PBS para ser considerado como grupo control negativo, el segundo grupo recibió únicamente vacuna de influenza, el tercer grupo recibió vacuna de influenza co-administrada con FGK1 , y el cuarto grupo fue inmunizado con vacuna de influenza y el fago M13 sin la expresión de GK-1. Los niveles de anticuerpos IgG e IgA presentes en los sueros y lavados bronqueoalveolares se determinaron por la técnica de ELISA, en el caso de la determinación de IgG se utilizó el suero a una dilución 1 :100; para la determinación de IgA en suero se utilizo una dilución 1 :50 y para la determinación de IgAs e IgGs en lavados bronqueoalveolares las muestras se utilizaron sin diluir. Se demostró que la administración conjunta de la vacuna con el producto FGK1 administrados tanto por vía intranasal como subcutánea aumentó de manera muy significativa los niveles séricos específicos tanto de IgG como de IgA en comparación con los niveles inducidos por los diferentes lotes de vacunas utilizadas. También se demostró que la co-administración de FGK1 con la vacuna de influenza provoca un aumento en los niveles de anticuerpos detectados en lavados bronqueoalveolares. Los datos obtenidos en estos experimentos demuestran que la construcción FGK1 puede utilizarse conjuntamente con antígenos vacunales para incrementar la respuesta inmunológica protectora. EJEMPLO 3. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEL FGK1 PARA MEJORAR LA RESPUESTA INMUNE GENERADA POR LA VACUNA VIRAL DE INFLUENZA.
Para demostrar el efecto potenciador de FGK1 sobre la respuesta inmunológica generada por la vacuna de la influenza y observarla a tiempos prolongados, se utilizaron 4 grupos de ratones hembras de la cepa BALB/cAnN con edades de 7 a 9 semanas en los cuales se evaluaron los siguientes esquemas de tratamiento en cuatro grupos: La vacuna contra influenza se empleó en una dosis de 1 g/ratón [cepa: A/New Caledonia/20/99(H1 N1), A/Panama/2007/99(H3N2) (cepa análoga A/Moscow 10/99, y BA/ictoria/504/2000 (cepa análoga a B/Sichuan/379/99)]. Se utilizó la vacuna FLUZONER para la temporada gripal 2004-2005 que contiene 45 g de hemaglutininas HA por dosis de 0.5 mi.
Los ratones recibieron dosis únicas de cada inmunógeno por vía subcutánea en la base de la cola y la respuesta inducida fue evaluada en suero a diferentes tiempos después de la inmunización que fue 21 , 45 y 75 días. Los sueros se obtuvieron a partir de la sangre periférica obtenida centrifugando a 5,000 rpm durante 12 minutos y se mantuvieron en congelación en alícuotas hasta su utilización.
Como se muestra en la Figura 1 es evidente que la co-inmunización de la vacuna de influenza con el FGK1 aumenta de manera significativa la cantidad de anticuerpos IgG antígeno de influenza específicos inducidos y detectados en suero en comparación a los niveles de anticuerpos que induce la vacuna de influenza sola, resultado que se observa desde tiempos tempranos a la inmunización (21 días posteriores a la inmunización) y se mantiene durante los 45 y 75 días posteriores a la misma. Incluso se hace evidente que los niveles de anticuerpos inducidos por la utilización de FGK1 se incrementa en el mismo grupo de ratones conforme se detecta en tiempos más tardíos (15% y 19% mas entre los días 21 y 45 así como entre los días 45 y 75 respectivamente).
Al comparar la respuesta de anticuerpos IgG detectados en suero inducidos por la coadministración de la vacuna de influenza y FGK1 versus los niveles de anticuerpos inducidos por la coadministración de la vacuna de influenza y el M13 (el fago sin expresión de GK-1) se puede observar que 21 días después de la co-administración con FGK1 se induce una mayor cantidad de anticuerpos que los inducidos con el M13 y a los 45 y 75 días esta mayor concentración de anticuerpos se hace evidente al observarse porcentajes de anticuerpos por arriba del 11 % (Figura 1).
En conclusión, la co-inmunización de la vacuna de influenza con el FGK1 genera un aumento significativo en la cantidad de anticuerpos específicos en contra de influenza en comparación a los que induce la vacuna sola que se mantiene aún después de 75 días, lo cual nos indica que se mejora la respuesta inmune inducida por la vacuna de influenza humana. También se hace evidente que FGK1 actúa mejor como inmunopotenciador que el M13 sin la expresión de GK-1 , ya que la cantidad de anticuerpos inducidos siempre es mayor al co-inmunizar con FGK1.
EJEMPLO 4. DETERMINACIÓN DE LA RESPUESTA INDUCIDA POR EL FGK1 COMPARADA CON LA RESPUESTA INDUCIDA POR EL PÉPTIDO SINTÉTICO GK-1 AL INMUNIZAR SUBCUTÁNEAMENTE. Para demostrar el efecto potenciador de FGK1 sobre la respuesta inmunológica generada por la vacuna de la influenza y compararla con la respuesta inmune inducida por la vacuna de influenza co-administrada con péptido sintético GK-1 , se utilizaron 5 grupos de ratones hembras de la cepa BALB/cAnN con edades de 7-8 semanas en los cuales se evaluaron los siguientes esquemas de tratamiento en grupos de 5 ratones: La vacuna contra influenza se empleó en una dosis de 1 pg/ratón [cepa: A/New Caledonia/20/99(H1 N1), A/Panama/2007/99(H3N2) (cepa análoga A/Moscow /10/99, y B/Victoria/504/2000 (cepa análoga a B/Sichuan/379/99)]. Se utilizó la vacuna FLUZONE para la temporada gripal 2004-2005 que contiene 45 pg de hemaglutininas HA por dosis de 0.5 mi.
Se utilizó el péptido sintético GK-1 a su dosis óptima (Segura-Velázquez et. al. 2006) cuya concentración es de 10pg /ratón.
El FGK1 y el M13 se utilizaron en un título de 1012 unidades de fago por ratón inactivado como se detalla en este documento.
Los ratones recibieron dosis únicas de cada inmunógeno por vía subcutánea en la base de la cola y la respuesta inducida fue evaluada en suero a los 21 días posteriores a la inmunización. Los sueros se obtuvieron a partir de la sangre periférica obtenida centrifugando a 5,000 rpm durante 12 minutos y se mantuvieron en congelación en alícuotas hasta su utilización.
Como se puede observar en la Figura 2, la co-inmunización de la vacuna de influenza con el péptido sintético GK-1 induce ligeramente una mejor respuesta de anticuerpos en comparación a la que induce la vacuna de influenza sola en ratones considerados jóvenes, aunque esta no es estadísticamente significativa, resultado que ya es conocido (Segura-Velázquez et. al. 2006) sin embargo, al comparar los niveles de anticuerpos que se inducen al inmunizar vacuna de influenza con FGK1 se observa un incremento en los niveles de IgGs detectados en suero que es significativamente mayor los que inducen la vacuna de influenza sola (85% mayor) y los que inducen la inmunización con vacuna de influenza y el péptido sintético GK1 juntos (52% más). Al comparar los niveles de anticuerpos detectados tras la co-inmunización de vacuna de influenza con FGK1 es mayor al 20% que los detectados al inmunizar vacuna de influenza con M 3. En conclusión estos resultados nos demuestran que la expresión de GK-1 en fago (FGK1) co-administrado con la vacuna de influenza induce una mejor respuesta inmune que la generada por la vacuna de influenza ya sea administrada sola o en conjunto con el GK-1 sintético o con el M13, lo cual se hace evidente por la mayor inducción de anticuerpos antígeno de influenza detectados en suero tras la inmunización subcutánea.
EJEMPLO 5. DETERMINACIÓN DE LA RESPUESTA INDUCIDA POR EL FGK1 COMPARADA CON LA RESPUESTA INDUCIDA POR EL PÉPTIDO SINTÉTICO GK-1 AL INMUNIZAR DE MANERA INTRANASAL.
Para demostrar el efecto potenciador de FGK1 sobre la respuesta ¡nmunológica generada por la vacuna de la influenza suministrada de forma intranasal y compararla con la respuesta inmune inducida por la vacuna de influenza coadministrada con péptido sintético GK-1 administrado por la misma ruta, se utilizaron 7 grupos de ratones hembras de la cepa BALB/cAnN con 7 a 8 semanas de edad en los cuales se evaluaron los siguientes esquemas de tratamiento en grupos de 5 ratones:
La vacuna contra influenza se empleó en una dosis de 1 pg/ratón [cepa: A/New Caledonia/20/99(H1 N1), A/Panama/2007/99(H3N2) (cepa análoga A/Moscow /10/99, y B/Victoria/504/2000 (cepa análoga a B/Sichuan/379/99)]. Se utilizó la vacuna FLUZONER para la temporada gripal 2004-2005 que contiene 45 pg de hemaglutininas HA por dosis de 0.5 mi. Se utilizó el péptido sintético GK1 en la dosis óptima previamente determinada (Segura- Velázquez et. al. 2006) de 10pg /ratón. Los ratones recibieron dosis únicas de cada inmunógeno por vía intranasal y la respuesta inducida fue evaluada en suero y lavados bronquiales en diferentes tiempos posteriores a la inmunización que fueron 21 y 45 días. Los sueros se obtuvieron a partir de la sangre periférica obtenida centrifugando a 5,000 rpm durante 12 minutos y se mantuvieron en congelación en alícuotas hasta su utilización. Los lavados bronqueoalveolares se obtuvieron tras hacer lavados intra-traqueales con 300 μΙ de solución salina 45 dvas posteriores a las inmunizaciones. FGK1 genera una mayor respuesta de IgG en suero
La Figura 3 nos muestra que FGK1 induce una mejor respuesta inmune la cual se ve reflejada con la inducción de en una mayor cantidad de anticuerpos IgGs antígeno de influenza específicos detectados en suero. Al co-inmunizar vacuna de influenza con el FGK1 por vía intranasal, se genera una mayor cantidad de anticuerpos IgG en comparación a los que se inducen al inmunizar únicamente con vacuna de influenza, esta observación se hace evidente desde los 21 días posteriores a la inmunización en los cuales, se obtienen niveles de anticuerpos en una proporción 7 veces mayor al co-inmunizar vacuna de influenza con FGK1 (la respuesta aumenta 564%) que los que se obtienen al inmunizar únicamente con vacuna de influenza. De igual manera, a los 21 días se puede observar que aunque los niveles de anticuerpos IgG detectados al co-inmunizar la vacuna de influenza con el M13 (el fago sin la expresión de GK-1) es también mayor a los niveles detectados tras la inmunización con la vacuna de influenza sola, la respuesta inmune inducida por la co-inmunizando con FGK1 con vacuna de influenza es 66% mayor a la que induce la co-inmunización con M13.
Cuando comparamos los niveles de IgGs detectados en suero tras la inmunización intranasal utilizando como adyuvantes al péptido sintético GK-1 o al FGK1 , es evidente que el FGK1 genera un mayor porcentaje de anticuerpos detectados en suero (415%) a los inducidos con el otro adyuvante. A los 45 días posteriores a la inmunización, los niveles de anticuerpos IgG detectados en suero son mayores a los detectados a los 21 días y las diferencias entre los diferentes grupos inmunizados se mantiene, siendo mayores siempre en aquellos grupos que recibieron inmunización de vacuna de influenza con el FGK1.
FGK1 genera mejora la respuesta de IgG e IgA en lavados bronqueoalveolares En la Figura 4 se observa que únicamente se logra estimular la respuesta inmune antígeno de influenza especifica expresada en los niveles de anticuerpos IgG e IgA detectados en los lavados bronqueoalveolares en el grupo que fue co-inmunizado con vacuna de influenza y FGK1. En el caso de los anticuerpos IgG inducidos en los lavados bronqueoalveolares dicha respuesta es mucho mayor a la respuesta que induce la vacuna de influenza sola. En el caso de los anticuerpos IgA detectados en los lavados bronqueoalveolares, el grupo inmunizado con vacuna de influenza y FGK1 generó niveles de anticuerpos 4 veces mayores que la que indujo el grupo inmunizado únicamente con vacuna de influenza (438% mayor). En ambos casos, solo el grupo que recibió la vacuna con el FGK1 fue el único capaz de inducir una respuesta inmune específica.
EJEMPLO 6. DETERMINACIÓN DEL EFECTO DEL FGK1 DE MEJORAR LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL GENERADA POR LA VACUNA COMERCIAL DE INFLUENZA FLUZONE® Y LA VACUNA COMERCIAL DE INFLUENZA CON ADYUVANTE FLUAD®.
Para evaluar el efecto potenciador de FGK1 sobre la respuesta de anticuerpos generada por dos diferentes tipos de vacuna de vacuna de influenza comerciales, se utilizaron 6 grupos de ratones hembras de la cepa BALB/cAnN con edades de entre 6 y 7 semanas en los cuales se evaluáron los siguientes esquemas de tratamiento: La vacuna contra influenza se empleó en una dosis de 1 pg/ratón de la vacuna FLUZONE® [cepa: A/New Caledonia/20/99(H1 N1), A Panama/2007/99(H3N2) (cepa análoga A/Moscow /10/99, y B/Victoria/504/2000 (cepa análoga a B/Sichuan/379/99)] y g/ratón de la vacuna FLUAD® [cepa: A/Brisbane/59/2007 (H1 N1)(cepa análoga a: A/Brisbane/59/2007,IVR-148), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) (cepa análoga: A/U ruguay/716/2007, NYMC X- 175C) y B/FLORIDA/4/2006] . Se utilizó la vacuna FLUZONER para la temporada gripal 2008-2009 que contiene 45 pg de hemaglutininas por dosis de 0.5 mi y la vacuna FLUADR temporada 2008-2009 que contiene 45 μg de hemaglutininas y el adyuvante MF59C.1 por dosis de 0.5 mi.
El FGK1 y el M13 se utilizaron en un título de 1012 unidades de fago por ratón. Los ratones recibieron dosis únicas de cada inmunógeno por vía subcutánea en la base de la cola y la respuesta inducida fue evaluada en suero a diferentes tiempos después de la inmunización que fueron 21 y 45 días. Los sueros se obtuvieron centrifugando a 5,000 rpm durante 12 minutos la sangre periférica obtenida y se mantuvieron en congelación en alícuotas hasta su utilización.
Los grupos se dividieron según el tratamiento de inmunización que recibieron, los cuales se constituyeron de la siguiente manera:
Un grupo que únicamente recibió tratamiento con PBS el cual fue considerado como grupo control negativo, un segundo grupo de 5 ratones que únicamente recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial sin adyuvante (FLUZONE®), el tercer grupo, también de 5 ratones, recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial con adyuvante (FLUAD); el cuarto grupo de 5 ratones recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial sin adyuvante (FLUZONE®) co-administada con FGK1 ; el quinto grupo con 5 ratones, recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial que contiene adyuvante (FLUAD®) co-administrada con FGK1 y por ultimo un sexto grupo conformado por 5 ratones que únicamente recibió tratamiento con FGK1. FGK1 co-administrado con la vacuna comercial de influenza que no contiene adyuvante (FLUZONÉ®) induce en tiempos tempranos niveles de anticuerpos similares a los inducidos por la vacuna comercial con adyuvante (FLUAD®) Al determinar la respuesta inmune inducida por parte de las vacunas de influenza comerciales, la cual se deduce comparando los niveles de anticuerpos IgG específicos 21 días posteriores a la inmunización determinados en suero, la Figura 5 hace evidente que la vacuna comercial de influenza que contiene el adyuvante MF59 (FLUAD®) genera una mejor respuesta de anticuerpos que la que genera la vacuna de influenza comercial FLUZONE® , la cual no contiene adyuvante alguno, sin embargo, al colocar al FGK1 como adyuvante junto con la vacuna FLUZONE® se genera una respuesta de anticuerpos similar a la que genera la vacuna comercial con adyuvante.
FGK1 co-adm[nistrado con la vacuna comercial de influenza que no contiene adyuvante (FLUZONÉ®) genera una respuesta de anticuerpos mayor a la que genera la vacuna comercial con adyuvante (FLUAD®), potenciando también la respuesta de anticuerpos inducida por la vacuna comercial con adyuvante
A los 45 días posteriores a la administración de los diferentes tratamientos se comparó la respuesta inmune inducida (deducida por la comparación de los niveles de anticuerpos IgG inducidos y detectados en suero) entre los dos tipos de vacuna de influenza comercial disponibles (con y sin adyuvante) administradas solas o en combinación con el FGK1.
Como se observa en la Figura 6, a los 45 días posteriores a la inoculación de los tratamientos, la respuesta inmune inducida por la vacuna comercial que contiene adyuvante (FLUAD®) sigue siendo mejor que la respuesta inmune inducida por la vacuna FLUZONE® (vacuna que no contiene adyuvante). Sin embargo, cuando comparamos la respuesta inmune inducida co-administrando FGK1 con ambos tipos de vacunas comerciales (con y sin adyuvante) generamos una mayor respuesta inmune en todos los grupos: primero podemos observar que al co-administrar la vacuna de influenza FLUZONE® (que no contiene adyuvante) con FGK1 y comparamos la respuesta inmune inducida por la vacuna FLUZONE® por sí sola, obtenemos 60% mas anticuerpos cuando la vacuna es co-administrada con FGK1. De la misma forma la respuesta inmune inducida por la co-inmunizacion de FGK1 con FLUZONE® genera 30% mas anticuerpos que los que genera la inmunización con la vacuna FLUD® (que contiene el adyuvante MF59) sola. Al inmunizar con vacuna FLUADR (vacuna con adyuvante MF59) acompañada con FGK1 obtenemos un 35% más de anticuerpos que los que se obtienen al inmunizar únicamente con FLUAD® sola. Además, la respuesta inmune inducida al coadministrar FGK1 tanto con FLUAD® como con FLUZONE® es similar entre ellos. EJEMPLO 7. DETERMINACIÓN DE LA RESPUESTA INDUCIDA POR EL FGK1 AL INMUNIZAR CERDOS INTRAMUSCULARMENTE.
Para demostrar el efecto potenciador de FGK1 sobre la respuesta inmunológica generada por la vacuna de la influenza porcina, se utilizaron 4 grupos de cerdos hembras y machos de la raza York/Landrace de 2 meses de edad, en los cuales se evaluaron los siguientes esquemas de tratamiento en grupos de 10 cerdos:
Grupos 1. Cerdos inmunizados con vacuna de influenza porcina marca FLUSURE®en las condiciones que indica el fabricante.
Grupo 2. Cerdos inmunizados con vacuna de influenza porcina marca FLUSURE®con una sola inmunización con FGK1.
Grupos 3. Cerdos inmunizados con vacuna de influenza porcina marca FLUSURE®en las condiciones que indica el fabricante con FGK1. La vacuna porcina contra influenza se empleó en una dosis de 2mL (como lo indica el fabricante) la cual consiste de dos aislados de virus de influenza porcina tipo A subtipos H1 N1 y H3N2 cada una. Se utilizó la vacuna FLUSURE® para la temporada 2009-2010.
El FGK1 se utilizó en un título de 2.5X1012 unidades de fago por cerdo inactivado como se detalla en este documento, utilizando una única dosis por cerdo. Los cerdos recibieron dos dosis de FLUSURE® por vía intramuscular (como lo indica el fabricante) y una dosis de FGK1 , en el cuello del cerdo y la respuesta inducida fue evaluada en plasma a los 30, 45 y 60 días posteriores a la inmunización.
El plasma se obtuvo a partir de la sangre periférica obtenida en los tiempos establecidos a la inmunización, centrifugándola a 2,500 rpm durante 30 minutos y se mantuvo en congelación en alícuotas hasta su utilización. Como se puede observar en las Figuras 7 y 8 la inmunización con una sola dosis de la vacuna de influenza porcina induce una respuesta de anticuerpos menor a la respuesta que se induce después de la segunda inmunización con la misma vacuna (como lo indica el fabricante), resultado que se hace evidente tanto a los 15 días (aumento del 94%) como a los 30 días (aumento del 96%) después de la segunda inmunización y que corresponden a los días 45 y 60 días posteriores a la primera inmunización. Cuando se co-inmuniza la vacuna de influenza porcina con el FGK1 en las condiciones que indica el fabricante (2 dosis de vacuna de influenza), la respuesta de anticuerpos generada 15 días posteriores a la segunda inmunización con vacuna de influenza porcina, aumenta un 84% en comparación a la respuesta que induce la vacuna de influenza porcina sola. Sin embargo, al analizar la respuesta de anticuerpos que se induce 30 días después de co-inmunizar la vacuna de influenza con el FGK1 , pero utilizando una sola dosis de vacuna de influenza en la coinmunización, se observa que la respuesta inducida es 69% mayor a la respuesta que induce la vacuna de influenza después de sus dos aplicaciones. Este aumento en la respuesta de anticuerpos inducida se mantiene 30 días después de la segunda inmunización, 94% aumenta cuando se co-inmuniza con las 2 dosis de vacuna de influenza y 69% aumenta la cantidad de anticuerpos cuando la co-inmunización se hace con una sola dosis de vacuna de influenza porcina. En conclusión estos resultados nos demuestran que la expresión de GK-1 en fago (FGK1) co-administrado intramuscularmente con la vacuna de influenza porcina en las condiciones que el fabricante de la vacuna comercial indica, induce una mayor respuesta inmune que la generada por la vacuna de influenza sola. Además, se demuestra que co-inmunizar FGK1 con la vacuna comercial pero esta última en una dosis menor a las que señala el fabricante, se logra inducir una mayor respuesta que la que induce la vacuna comercial en sus condiciones óptimas.
EJEMPLO 8. EFECTO DEL FGK1 DE MEJORAR LA RESPUESTA INMUNE HUMORAL GENERADA POR LA VACUNA COMERCIAL DE INFLUENZA FLUZONE® Y LA VACUNA COMERCIAL DE INFLUENZA CON ADYUVANTE FLUAD® COMPARADA CON LA RESPUESTA INMUNE INDUCIDA POR LA UTILIZACIÓN DE S3PVAC-PHAGE. Para evaluar el efecto potenciador de FGK1 y S3vac-phage sobre la respuesta de anticuerpos generada por los dos tipos comerciales de vacuna de influenza para humanos, se utilizaron 6 grupos de ratones hembras de la cepa BALB/cAnN con edades de 7-8 semanas, en los cuales se evaluaron los siguientes esquemas de tratamiento:
La vacuna contra influenza se empleó en una dosis de I g/raton de la vacuna FLUZONE® [cepa: A/New Caledonia/20/99(H1 N1), A/Panama/2007/99(H3N2) (cepa análoga A/Moscow /10/99, y BA/ictoria/504/2000 (cepa análoga a B/Sichuan/379/99)] y g/ratón de la vacuna FLUAD® [cepa: A/Brisbane/59/2007 (H1 N1)(cepa análoga a: A/Brisbane/59/2007,IVR-148), A Brisbane/10/2007 (H3N2) (cepa análoga: A/Uruguay/716/2007, NYMC X- 175C) y B/FLORI DA/4/2006] . Se utilizó la vacuna FLUZONER para la temporada gripal 2008-2009 que contiene 45 g de hemaglutininas por dosis de 0.5 mi y la vacuna FLUADR temporada 2008-2009 que contiene 45 μg de hemaglutininas y el adyuvante MF59C.1 por dosis de 0.5 mi. El FGK1 , el S3Pvac-phage y el M13 se utilizaron en un título de 1012 unidades de fago por ratón. Los ratones recibieron dosis únicas de cada inmunogeno por vía subcutánea en la base de la cola y la respuesta inducida fue evaluada en suero a diferentes tiempos después de la inmunización que fueron 21 y 45 días posteriores a la inmunización.
Los sueros se obtuvieron centrifugando a 5,000 rpm durante 12 minutos la sangre periférica obtenida y se mantuvieron en congelación en alícuotas hasta su utilización. Los grupos se dividieron según el tratamiento de inmunización que recibieron los cuales se constituyeron de la siguiente manera:
Un grupo que únicamente recibió tratamiento con PBS como grupo control negativo, un segundo grupo de 5 ratones que únicamente recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial sin adyuvante (FLUZONE®), el tercer grupo también de 5 ratones recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial con adyuvante (FLUAD); el cuarto grupo de 5 ratones recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial sin adyuvante (FLUZONE®) co-administada con FGK1 ; el quinto grupo con 5 ratones recibió tratamiento con vacuna de influenza comercial que contiene adyuvante (FLUAD®) co-administrada con FGK1 y por ultimo un sexto grupo conformado por 5 ratones que únicamente recibió tratamiento con FGK1.
Como se puede apreciar en la figura 9, desde los 21 días posteriores a la inmunización se genera la inducción de una respuesta de anticuerpos IgG
*
antígeno de influenza específicos, sin embargo es evidente que la vacuna comercial FLUAD (la cual contiene en su formulación adyuvante) genera una mayor cantidad de anticuerpos con relación a la que genera la vacuna comercial FLUZONE, la cual no contiene adyuvante. Sin embargo, cuando compramos el efecto inducido por la utilización de FGK1 co-administrado con la vacuna FLUZONE observamos que los niveles de anticuerpos inducidos son muy similares a los que induce la vacuna comercial con adyuvante, lo cual nos indica que FGK1 tiene la capacidad de incrementar los niveles de anticuerpos de manera similar a como lo hace el adyuvante utilizado por la vacuna comercial; sin embargo, cuando se coadministra FGK1 con la vacuna de influenza comercial con adyuvante, se genera una respuesta inmune muy similar a la que se induce con la sola administración de la vacuna de influenza con su adyuvante. Por otra parte se hace evidente que la utilización de S3Pvac-phage co-administrada con la vacuna de influenza comercial (tanto FLUZONE como FLUAD) genera una respuesta inmune muy similar a la que genera la administración sola de la vacuna comercial debido a que incluye en sus componentes FGK1 ; sin embargo, la respuesta inducida no es mayor a la generada por la co-administración de la vacuna de influenza comercial (tanto FLUZONE como FLUAD) con FGK1 dado que los otros componentes de S3Pvac-phage no tienen la capacidad de inmunopotenciar la respuesta.
Al observar en la figura 10 la respuesta inmune inducida 45 días posteriores utilización de vacunas comerciales de influenza cuyas formulaciones contienen o no adyuvantes (FLUAD y FLUZONE respectivamente) y son co-administradas con FGK1 o S3Pvac-Phage para observar la capacidad inmunopotenciadora de estos últimos podemos observar lo siguiente: La vacuna comercial de influenza cuya formulación contiene adyuvante (FLUAD) genera una mayor cantidad de anticuerpos en relación a los que induce la vacuna comercial de influenza sin adyuvante (FLUZONE). Sin embargo, es muy significativo que a este tiempo se observa que, el co-administrar FGK1 junto con la vacuna comercial de influenza sin adyuvante, FGK1 genera que se induzca una respuesta inmune significativamente mayor a la que se induce con la vacuna comercial de influenza que contiene adyuvante, lo que indica que FGK1 tiene una mayor capacidad de potenciar la respuesta inducida por la vacuna que la capacidad que tiene el adyuvante usado por la vacuna comercial. También es relevante observar que la co-administración de FGK1 con la vacuna de influenza comercial con adyuvante genera aun mas anticuerpos que los que generan la vacuna de influenza comercial con adyuvante sola, lo que nos indica que FGK1 aun tiene la capacidad de potenciar la ya en si eficiente respuesta inducida por la vacuna comercial con adyuvante. Ahora bien, es evidente que S3Pvac- Phage co-administrado junto con las vacunas de influenza comerciales no generan un aumento significativo de anticuerpos en comparación a la respuesta , inducida por las vacunas comerciales solas. Esto nos indica que S3Pvac-Phage no muestra la capacidad inmunopotenciadora que muestra FGK1.
Con este ejemplo se comprueba la capacidad inmunopotenciadora de FGK1 con respecto a la respuesta inducida por 2 tipos de vacuna de influenza de uso comercial, una sin adyuvante (FLUZONE) y la otra con adyuvante (FLUAD). También se demuestra que FGK1 genera la potenciación de la respuesta inmune específica de manera más eficiente a como la podría generar la utilización de la vacuna S3Pvac-Phage.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del inmunopotenciador FGK1 para la obtención de un producto farmacéutico para potenciar la inmunidad humoral y celular inducida por diferentes componentes antigénicos provenientes de componentes virales, vacunas virales, ya sean atenuadas, inactivadas o subunidades virales para uso humano y para uso veterinario, y en donde el inmunopotenciador FGK1 caracterizado porque se compone del péptido GK-1 constituido por una secuencia de 18 aminoácidos G-Y-Y-Y-P-S-D-P-N-T-F-Y-A-P-P-Y-S-A asociado a la proteina pVIII de la superficie del fago filamentoso M13.
2. El uso de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque el componente antigénico es una vacuna para el virus de influenza.
3. Uso del inmunopotenciador FGK1 de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 en donde el producto farmacéutico puede ser administrado solo o coadministrado con la vacuna a potenciar.
4. Uso del inmunopotenciador FGK1 de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3 en donde el producto farmacéutico es administrado por vía intranasal.
5. Uso del inmunopotenciador FGK1 de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3 en donde el producto farmacéutico es administrado por vía subcutánea.
6. Uso del inmunopotenciador FGK1 de conformidad con la reivindicación 1 , 2 ó 3 en donde el producto farmacéutico es administrado por vía intramuscular.
7. Uso del inmunopotenciador FGK1 de la reivindicación 1 a 6 para la preparación de productos farmacéuticos que incrementan los niveles de anticuerpos en especies de mamíferos o en aves.
8. El uso del inmunopotenciador FGK1 de conformidad con la reivindicación 7 donde el producto farmacéutico que incrementa los niveles de anticuerpos en especies de mamíferos ó en aves cuando estos forman parte de cualquier grupo etario.
Uso del inmunopotenciador FGK1 de conformidad con la reivindicación 8 para la preparación de productos farmacéuticos en donde los anticuerpos que incrementan son IgA e IgG.
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