WO2013024763A1 - 核酸アプタマーの作製方法 - Google Patents

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stranded nucleic
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路子 平尾
横山　茂之
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    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to an efficient method for producing a nucleic acid aptamer, particularly a DNA aptamer.
  • nucleic acid aptamers have attracted attention as other active nucleic acids such as siRNA as a new active ingredient for drugs or diagnostic agents that replace low molecular weight compounds, and various research and development have been promoted in various countries around the world. ing.
  • a nucleic acid aptamer is a functional nucleic acid that binds firmly and specifically to a target substance such as a protein by its three-dimensional structure and can inhibit or suppress its function.
  • Nucleic acid aptamers are usually used as nucleic acid molecules that bind to a target substance from a nucleic acid library containing a random base sequence by an in vitro selection method (in vitro selection method) called the SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) method.
  • in vitro selection method in vitro selection method
  • SELEX systematic evolution of ligands by exponential enrichment
  • RNA aptamers composed of RNA have been the mainstream of nucleic acid aptamers.
  • RNA is unstable and high in production cost, so in recent years it is stable in vivo and can be produced at low cost.
  • Patent Document 4 Non-Patent Documents 5 to 8
  • it has been difficult to efficiently produce DNA aptamers as compared to RNA aptamers.
  • SELEX method as a method for isolating a complex formed by binding a target substance and a nucleic acid aptamer, (1) a complex is obtained by trapping a protein on a nitrocellulose filter using hydrophobic interaction.
  • a method of recovering a complex by shifting the gel mobility during gel electrophoresis or (3) A target substance is labeled in advance, and the target substance is affinityd based on the label.
  • a method of immobilizing it on a carrier and mixing it with a DNA library is employed.
  • An object of the present invention is to develop and provide a method for efficiently and simply producing a nucleic acid aptamer having high specificity and binding property to a target substance, particularly a DNA aptamer.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule that contains non-Watson-Crick base pairing in a double-stranded region and can specifically and firmly bind to a target substance.
  • an object of the present invention is to provide a target substance function inhibitor containing the nucleic acid molecule as an active ingredient and a pharmaceutical composition containing the same.
  • the present inventors have developed a method for producing a new nucleic acid aptamer that can suppress non-specific adsorption of DNA or the like and reduce the background by modifying the SELEX method.
  • Successful in the conventional SELEX method, a target substance is first bound to a solid phase carrier, and a single-stranded nucleic acid library is added thereto, whereby a nucleic acid aptamer bound to the target substance on the solid phase carrier is recovered.
  • the target substance and the single-stranded nucleic acid library were first mixed to form a complex of the single-stranded nucleic acid and the target substance, and then adsorbed to the target substance and / or the solid phase carrier.
  • a method for producing a nucleic acid aptamer wherein a single-stranded nucleic acid library and a target substance are mixed in a solution to form a complex of a single-stranded nucleic acid and a target substance.
  • the solution after the formation step and the solid phase carrier are mixed, and the complex is immobilized on the solid phase carrier via the binding substance adsorbed on the target substance and / or the solid phase carrier, and immobilized on the solid phase carrier.
  • a recovery step of recovering the conjugated complex from the solution an amplification step of amplifying the single-stranded nucleic acid by a nucleic acid amplification method after recovering the single-stranded nucleic acid in the complex, and a double strand obtained in the amplification step
  • the said manufacturing method including the single-stranded nucleic acid preparation process of forming a three-dimensional structure within a molecule
  • the secondary structure contains one or more double-stranded regions in which 5 to 20 consecutive bases base pair with each other, and
  • a nucleic acid molecule that binds to a target substance comprising at least one double-stranded region in which consecutive 5 to 20 bases base pair with each other, and 1 to 10 base pairs in the double-stranded region
  • the nucleic acid molecule comprising a Watson-Crick base pair.
  • nucleic acid molecule according to (11), wherein the nucleic acid molecule is a single-stranded nucleic acid or a double-stranded nucleic acid.
  • nucleic acid molecule according to any one of (11) to (13), wherein the target substance is a peptide.
  • nucleic acid molecule according to (14), wherein the peptide is a transcriptional regulatory factor, a signal transduction factor, a protein ligand, or a receptor protein.
  • nucleic acid molecule according to (17) comprising a double-stranded region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 3 and 4, SEQ ID NOs: 5 and 6, or SEQ ID NOs: 7 and 8.
  • a target substance function inhibitor comprising the nucleic acid molecule according to any one of (11) to (19) as an active ingredient.
  • (22) A method for detecting a target substance to which a nucleic acid molecule present in a sample binds using the nucleic acid molecule according to any one of (11) to (15).
  • a nucleic acid aptamer having high specificity and binding property to a target substance, particularly a DNA aptamer can be produced efficiently and simply.
  • nucleic acid molecule containing the non-Watson-Crick base pairing in the double-stranded region of the present invention it is possible to provide a nucleic acid molecule that can specifically and firmly bind to the target substance.
  • consensus sequence (a) found in the double-stranded region of the nucleic acid molecule of the present invention targeting NF- ⁇ B p50 and the consensus sequence found in the DNA aptamer obtained by the production method of the present invention The base sequence ((b) to (d)), the sequence number of each chain, and their base pairing are shown.
  • the base sequence of the consensus sequence (a) the base pair described as “W-W” indicates “a-t” or “t-a”.
  • ” between the bases of the double-stranded region is a Watson-Crick base pair, “ ⁇ ” or “ ⁇ ” is “ag” or “ga”, or “gt” or “tg”, respectively.
  • the top is the sequence of the single-stranded nucleic acid library used in the production method.
  • a sequence similar to the natural consensus DNA sequence (SEQ ID NO: 29) to which NF- ⁇ B binds is surrounded by a black frame.
  • the underline indicates a region presumed to form a double-stranded region (stem structure) by base pairing in the molecule.
  • Bold letters indicate bases that are mutated in similar clone sequences compared to 5R01 or 5R14 or 5R05 sequences.
  • a hyphen (-) indicates a single nucleotide deletion mutation.
  • suction of the single stranded DNA to the various magnetic beads as a solid-phase carrier by real-time PCR is shown.
  • the top is a known NF- ⁇ B p50 binding consensus sequence.
  • the white box indicates the 5'-end primer binding region
  • the black box indicates the 3'-end primer binding region.
  • SPR Surface plasmon resonance
  • FIG. 9 shows an SPR sensorgram in which the interaction between the three clones shown in FIG. 8 and the control Cont-68 and NF- ⁇ B p50 was detected.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” refers to a biopolymer composed of nucleotides as structural units in principle and linked by phosphodiester bonds.
  • a DNA in which only deoxyribonucleotides having any base of adenine, guanine, cytosine and thymine are linked
  • an RNA in which only ribonucleotides having any base of adenine, guanine, cytosine and uracil are linked, or those Natural nucleic acids that exist in nature such as combinations are applicable.
  • the nucleic acid of the present invention can include a non-natural nucleotide or a non-natural nucleic acid in part or in whole.
  • non-natural nucleotide refers to an artificially constructed or artificially chemically modified nucleotide having similar properties and / or structure to the natural nucleotide, or a natural nucleotide.
  • a nucleotide that does not exist in nature including a nucleoside or base having properties and / or structures similar to those of the nucleoside or base constituting the type nucleotide. Examples include abasic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxyuridines, ⁇ -deoxyribonucleosides, ⁇ -L-deoxyribonucleosides, and other nucleosides with sugar modifications.
  • nucleoside having the above-mentioned sugar modification includes substituted pentasaccharide (2′-O-methylribose, 2′-deoxy-2′-fluororibose, 3′-O-methylribose, 1 ′, 2′-deoxy. Ribosides), arabinose, substituted arabinose sugars, substituted hexamonosaccharides and alpha-anomeric sugar modifications.
  • the non-natural nucleotide of the present invention may be an artificially constructed base analog or an artificially chemically modified base (modified base).
  • Base analog includes, for example, 2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 5-substituted-2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 2-amino-6- (2 -Thiazolyl) purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-thiazolyl) purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-oxazolyl) purin-9-yl group and the like.
  • Modified bases include, for example, modified pyrimidines (eg, 5-hydroxycytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil), modified purines (eg, 6-methyladenine, 6-thioguanosine) and other heterocyclic rings. Examples include bases.
  • non-natural nucleic acid refers to an artificially constructed nucleic acid analog having a structure and / or property similar to that of a natural nucleic acid.
  • examples include peptide nucleic acids (PNA: Peptide Nucleic Acid), peptide nucleic acids having a phosphate group (PHONA), cross-linked nucleic acids (BNA / LNA: Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid), morpholino nucleic acids, and the like.
  • nucleic acids and nucleic acid analogs such as methylphosphonate DNA / RNA, phosphorothioate DNA / RNA, phosphoramidate DNA / RNA, 2′-O-methyl DNA / RNA can also be included.
  • modified nucleic acids hereinafter, for convenience, the above-mentioned non-natural nucleotides or non-natural nucleic acids are collectively referred to as “modified nucleic acids”.
  • nucleic acid aptamer is an aptamer composed of nucleic acids, and is targeted by a three-dimensional structure formed based on the secondary structure and tertiary structure of a single-stranded nucleic acid via hydrogen bonding or the like.
  • a ligand molecule that binds strongly and specifically to a substance and has the ability to specifically inhibit or suppress a function such as physiological activity of a target substance.
  • an RNA aptamer composed only of RNA and a DNA aptamer composed only of DNA are generally known, but the nucleic acid constituting the nucleic acid aptamer in the present specification is not particularly limited.
  • a DNA aptamer for example, a DNA aptamer, an RNA aptamer, an aptamer composed of a combination of DNA and RNA, an aptamer including a modified nucleic acid as a part thereof, an aptamer composed only of a modified nucleic acid, and the like are included.
  • it is a DNA aptamer.
  • target substance refers to a substance that can be bound by a nucleic acid molecule, particularly a nucleic acid aptamer.
  • the type of target substance is not particularly limited as long as it is a biological substance to which a nucleic acid molecule can bind. Examples include peptides (oligopeptides or polypeptides), nucleic acids, lipids, sugars (including sugar chains), or low molecular compounds. Preferably it is a peptide, more preferably a polypeptide, ie a protein.
  • the target substance can be appropriately selected according to the purpose. Usually, it is selected for the purpose of inhibiting, suppressing or enhancing the specific biological function of the biological material.
  • Specific biological functions include, for example, catalytic function or gene expression control function (including control of transcription, translation, transport, etc.), apoptosis control function, and protein-protein interaction that is widely responsible for cell information transmission. Examples include interactions between biological materials.
  • the target substance to be used may be any naturally derived substance, chemically synthesized substance, genetically modified substance or the like. It is preferable to use a purified single substance free from impurities. Further, when the target substance is a polypeptide, it may be a fusion polypeptide in which a tag sequence is fused. Examples of the tag sequence include hexahistidine (His), FLAG, HA, myc, and GFP.
  • a first embodiment of the present invention is a method for producing a nucleic acid aptamer. According to the present invention, a background due to nonspecific adsorption of a single-stranded nucleic acid can be reduced, and a nucleic acid aptamer having high specificity for a target substance, particularly a DNA aptamer, can be produced efficiently and simply. .
  • the production method of the present invention comprises a complex formation step (101), an immobilization step (102), a recovery step (103), an amplification step (104), and a single-stranded nucleic acid preparation step (105).
  • the manufacturing method of this invention can include the repetition process (106) and / or the selection process (107) as arbitrary processes as needed.
  • the selection step (107) can be performed between the amplification step (104) and the single-stranded nucleic acid preparation step (105) and / or after the repetition step (106).
  • each process will be specifically described.
  • Complex formation step 101) is a step of mixing a single-stranded nucleic acid library and a target substance in a solution to form a complex of the single-stranded nucleic acid and the target substance. It is.
  • the “single-stranded nucleic acid library” refers to a pool composed of a plurality of identical and / or different single-stranded nucleic acids including candidate nucleic acid aptamer molecules.
  • a double-stranded nucleic acid formed by pairing all or part of the bases of the single-stranded nucleic acid may be included in a part thereof. Since a single-stranded nucleic acid library is a library containing nucleic acid aptamer candidates as described above, each single-stranded nucleic acid constituting the library forms a higher-order structure by self-folding in principle. .
  • the primary structure of the single-stranded nucleic acid constituting the library has primer binding regions (201, 203) to which a primer binds on the 5 ′ end side and the 3 ′ end side, and is located between them.
  • a central region (202) The base length of each primer region is 15 to 40 bases.
  • the base length of the central region is 20 to 80 bases. Therefore, the base length of the single-stranded nucleic acid constituting the single-stranded nucleic acid library is in the range of 50 to 160 bases.
  • the primer binding regions (201, 203) on the 5 ′ end side and 3 ′ end side have a base sequence corresponding to the forward primer (204) and a base sequence complementary to the reverse primer (205), respectively.
  • the base sequence of each primer is a sequence in which the primer does not form a secondary structure in the molecule and / or a sequence in which the forward primer and the reverse primer do not form a continuous double-stranded region, and the Tm value is 50 to 80 °C, 55-75 °C, or within the range of 60-70 °C, Tm value of both primers should not be significantly different, and the GC content of each primer is 40-60% or 45-55% Is preferred.
  • the base sequence of the central region (202) of each single-stranded nucleic acid constituting the single-stranded nucleic acid library is composed of a random or specific base sequence.
  • the central region is desirably random in principle.
  • the specific base sequence refers to a base sequence in a single-stranded nucleic acid subjected to a predetermined selection pressure.
  • “single-stranded nucleic acid subjected to a predetermined selection pressure” is used after the second round (second round), for example, when the production method of the present invention includes an iterative process (106) described later. This constitutes a single-stranded nucleic acid constituting a single-stranded nucleic acid library.
  • the single-stranded nucleic acid library may be appropriately prepared according to a method known in the art.
  • the method of the present invention aims to produce an unknown nucleic acid aptamer that can bind to a target substance
  • the single-stranded nucleic acid library used for the first time is composed of a large number of different single-stranded nucleic acid populations. It is preferable that Therefore, in this case, for example, a single-stranded nucleic acid library may be prepared by chemical synthesis using a nucleic acid synthesizer.
  • a target library can be obtained by inputting the designed base sequence into a synthesis program using a DNA synthesizer.
  • the base sequence may be outsourced to each manufacturer to produce a desired single-stranded nucleic acid library.
  • the production method of the present invention includes an iterative process (106) described later, a single-stranded nucleic acid library used in the second and subsequent rounds is obtained in the round immediately before the iterative process (106). It may be prepared based on the single-stranded nucleic acid.
  • the single-stranded nucleic acid library used for the first time is preliminarily subjected to the intramolecular higher-order structure formation treatment of the single-stranded nucleic acid described in the single-stranded nucleic acid preparation step (105) described later. It is preferable to go.
  • the single-stranded nucleic acid library is preliminarily stored in a solid-phase carrier (two or more kinds). When using these solid phase carriers, it is preferable to remove single-stranded nucleic acids that bind nonspecifically to each solid phase carrier). This process involves adding and mixing an appropriate amount of the solid phase carrier used in the solid phase immobilization step in the solution containing the single stranded nucleic acid library, and then recovering and removing the solid phase carrier. Use as a rally is enough.
  • complex refers to a single-stranded nucleic acid constituting a single-stranded nucleic acid library, specifically, a nucleic acid aptamer candidate molecule formed by a single-stranded nucleic acid and a target substance.
  • the type and properties of the solution used in this step are not particularly limited as long as the solution can form a complex between the nucleic acid and the target substance.
  • it is water or aqueous solution.
  • the pH may be in the range of 5.0 to 9.0, preferably 6.0 to 8.0, more preferably 6.5 to 7.6.
  • the salt concentration may be in the range of 20 to 500 mM, preferably 50 to 300 mM, more preferably 90 to 180 mM in the final concentration.
  • a preferred aqueous solution is a buffer.
  • an appropriate salt eg, NaCl, CH 3 COOK
  • a pH buffer solution eg, phosphate buffer, citrate-phosphate buffer, Tris-HCl buffer or HEPES buffer
  • PBS buffer 1.1 mM KH 2 PO 4 , 155 mM NaCl, 3 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4
  • the composition of the pH buffer is based on the known composition described in, for example, Sambrook, J. et.al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. Fine adjustments may be made as necessary.
  • the above solution may further contain a reducing agent or a surfactant as required.
  • the reducing agent examples include DTT (dithiothreitol) and 2-mercaptoethanol.
  • the final concentration of the reducing agent in the solution may be in the range of 0.5 to 10 mm, preferably 1 to 5 mm.
  • the surfactant is preferably a nonionic surfactant.
  • a nonionic surfactant for example, Nonidet P40 (NO-40), Triton X-100, Triton X-114, Brij-35, Brij-58, Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80, n-octyl- ⁇ - Examples include glucoside, MEGA-8, MEGA-9, and MEGA-10.
  • the final concentration of the surfactant in the solution may be in the range of 0.005% to 0.1%, preferably 0.01% to 0.08% by volume / volume (V / V).
  • the solution used in this step may contain a competitive substance.
  • “competitive substance” refers to a substance that competes with the target substance for binding with the single-stranded nucleic acid.
  • the type of the competitive substance is not particularly limited as long as it can compete with the single-stranded nucleic acid for the target substance.
  • a nucleic acid, peptide, lipid, sugar, or low molecular weight compound can be mentioned.
  • a substance having the same properties as the single-stranded nucleic acid that is the target nucleic acid aptamer for example, a substance having the same binding site on the target substance is preferable.
  • Such a substance corresponds to a nucleic acid (single-stranded nucleic acid and / or double-stranded nucleic acid) having a base sequence similar to the target single-stranded nucleic acid.
  • the target substance is a transcriptional regulatory factor
  • the base sequence on the genome sequence to which the transcriptional regulatory factor originally binds corresponds.
  • the competitor is the nucleic acid, even if the competitor forms a complex with the target substance, it is designed and prepared so that it does not have a primer binding region (201, 203) like a single-stranded nucleic acid By doing so, it can be removed without being amplified in the amplification step (104) described later.
  • By containing the competitive substance in the solution it becomes possible to produce a nucleic acid aptamer that binds to the target substance more firmly.
  • a single-stranded nucleic acid library and a target substance are mixed at 9: 1 to 1: 9, preferably 5: 5 (volume: volume), and 4 to 40 ° C., preferably Incubation may be performed within a range of 15 to 37 ° C. for 5 minutes to 30 minutes or more, for example, about 10 minutes to 1 hour, preferably about 20 minutes to 40 minutes.
  • the formed complex may be washed before the next immobilization step (102).
  • the washing of the complex may be performed using a method known in the art based on the type of the target substance, the molecular size and characteristics of the complex. For example, when the target substance is a protein, the complex can be separated from the free single-stranded nucleic acid using an ultrafiltration membrane through which only the nucleic acid passes depending on the molecular size.
  • the composition of the washing buffer may be the same composition as the buffer used for forming the complex.
  • the cleaning buffer may contain a reducing agent or a surfactant.
  • concentration and composition of the reducing agent and surfactant may be the same as the buffer used for complex formation.
  • the remaining free single-stranded nucleic acid can be removed by washing operation in the subsequent immobilization step (102) and recovery step (103). Strand nucleic acids can be removed. Therefore, washing may be performed as necessary.
  • the “immobilization step” (102) is a step of mixing the solution after the previous step and the solid phase carrier to immobilize the complex on the solid phase carrier.
  • the “solid phase carrier” is a solid state carrier, for example, a magnetic bead, a polymeric polysaccharide support (eg, Sepharose, Sephadex, agarose), silica, glass, metal (eg, gold, Platinum, silver), plastics, ceramics, resins (natural or synthetic resins), or combinations thereof.
  • a polymeric polysaccharide support eg, Sepharose, Sephadex, agarose
  • silica glass
  • metal eg, gold, Platinum, silver
  • plastics ceramics
  • resins natural or synthetic resins
  • the solid phase carrier itself may be hydrophilic, or the solid phase carrier may be hydrophobic and the surface thereof may be subjected to a hydrophilic coating treatment.
  • the shape of the carrier is not particularly limited. For example, a spherical shape, a substantially spherical shape, a flat plate shape, a substantially flat plate shape, a fiber shape, and the like can be given.
  • a substantially spherical particle such as a bead is particularly preferable as the shape of the solid phase carrier in this step because of its large binding surface area and high operability.
  • immobilization refers to linking the complex to a solid phase carrier.
  • the complex is immobilized on the solid phase carrier through a target substance and / or a binder adsorbed on the solid phase carrier.
  • the “binding agent” refers to a molecule that mediates the connection between a target substance and a solid phase carrier.
  • the binder can include not only a single molecule but also two or more different molecules to be linked, as long as it can intervene the linkage between the target substance and the solid phase carrier.
  • Specific examples of the connector include, for example, a low molecular weight compound, an amino acid or peptide, a nucleic acid or a constituent thereof (including nucleoside or nucleotide), or a combination thereof.
  • the low molecular compound herein is a natural product or a chemical synthesis product having a molecular weight of about several hundred to several thousand.
  • vitamins including biotin
  • terpenoids eg carotenoids, heme, chlorophyll
  • polyphenols eg flavonoids, catechins, tannins
  • Peptides include proteins (including recombinant antibodies such as humanized antibodies or multivalent antibodies) or proteins including enzymes or functional fragments thereof.
  • Nucleic acids include DNA, RNA, nucleic acid analogues such as LNA (Locked Nucleic Acid: LNA is a registered trademark) or PNA (Peptide Nucleic Acid), or fragments thereof.
  • Preferred conjugates in the present invention include, for example, a conjugate consisting of biotin and avidin or streptavidin, a lectin-biotin and avidin in which lectin is further bound to the biotin, a conjugate consisting of streptavidin or neutravidin, and one or more antibodies Or a binder consisting of an antibody and protein A, G or L.
  • the binder is adsorbed on the target substance, the solid support or both.
  • adsorption refers to immobilizing a binder on a target substance or solid phase carrier by chemical adsorption, physical adsorption and / or affinity.
  • chemical adsorption includes chemical bonds such as covalent bonds, ionic bonds, and hydrogen bonds
  • physical adsorption includes Coulomb forces, van der Waals forces, and hydrophobic interactions.
  • the binder When the binder is adsorbed only on one of the target substance or the solid phase carrier, the binder can specifically recognize and bind to the partner substance on which the binder is not adsorbed. For example, when a binder is adsorbed on the solid phase carrier, the binder specifically recognizes and binds to the target substance. More specifically, for example, when protein A or protein A bound to the antibody is adsorbed on a solid phase carrier as a binder, the antibody specifically recognizes and binds to the target substance. Therefore, by mixing the target substance and the solid phase carrier in the solution, the target substance and the solid phase carrier are linked via the connector.
  • Part or all of the target substance after the complex formation step (101) forms a complex with a single-stranded nucleic acid that is a candidate for a nucleic acid aptamer. Therefore, the complex can be immobilized on the solid phase carrier by this step.
  • the binder When the binder is adsorbed on each of the target substance and the solid phase carrier, the binder (for convenience, the binder adsorbed on the target substance is hereinafter referred to as “first binder” and adsorbed on the solid phase carrier.
  • the combined binders are referred to as “second binders” and can bind specifically to each other.
  • biotin which is the first binder
  • avidin, streptavidin, or neutravidin which is the second binder
  • the target substance and the solid phase carrier are linked through the binding of biotin and avidin, streptavidin, or neutravidin.
  • the target substance when the target substance is adsorbed with the anti-target substance mouse monoclonal IgG antibody as the first binder and the rabbit anti-mouse IgG antibody or protein A as the second binder with the solid phase carrier, the target substance and By mixing the solid phase carrier in the solution, the anti-target substance mouse monoclonal IgG antibody and the rabbit anti-mouse IgG antibody or protein A specifically bind to each other.
  • the target substance and the solid phase carrier are linked via an antibody-antibody or antibody-protein A bond.
  • the complex can be immobilized on a solid phase carrier.
  • this step it is the target substance in the complex that directly contributes to the immobilization of the complex to the solid phase carrier via the binder. Therefore, in this step, not only the complex but also a free target substance that does not form the complex can be simultaneously immobilized on the solid phase carrier. However, even if a target substance in a free state that does not carry a single-stranded nucleic acid is immobilized on a solid phase carrier, the effect on the present invention is aimed at reducing nonspecific adsorption of single-stranded nucleic acid. Or very minor and does not constitute a particular impediment to achieving the present invention.
  • the adsorption method of the binder to the target substance and the solid phase carrier varies depending on the type of the target substance, the solid phase carrier and / or the binder. Therefore, what is necessary is just to adsorb
  • the binder and / or the adsorption method does not inhibit or dissociate the binding between the single-stranded nucleic acid in the complex and the target substance.
  • the target substance or the solid phase carrier has a functional group
  • a functional group for example, an active functional group capable of covalent bonding with the functional group (for example, an aldehyde group, a carboxyl group, a sulfo group, an amino group, A thiol group, a cyano group, a nitro group), or a bond into which such an active functional group is introduced, a nucleophilic addition reaction, a nucleophilic substitution reaction or an electrophilic substitution between the two functional groups.
  • the binder can be adsorbed to the target substance or the solid phase carrier through a covalent bond by a chemical reaction such as a reaction.
  • Such a combination of functional groups capable of covalent bonding includes, for example, an amino group and an aldehyde group, an amino group and an ester group, a thiol group and a maleimide group, an azide group and an acetylene group, an azide group and an amino group, a hydrazine group and a ketone.
  • a method of covalently bonding these functional groups by chemical reaction is a technique well known in the art.
  • the target is a protein and the protein is adsorbed using biotin as a binder
  • an active ester group is introduced into biotin using N-hydroxysuccinimide ester (NHS), and then the amino group of the protein and the ester By forming an amide bond with the group, the protein can be adsorbed with biotin.
  • biotinylation reagents are commercially available from manufacturers, and they may be used.
  • the first binder is an antibody that specifically recognizes and binds to the epitope of the antigen
  • the first substance is brought into contact with the first in an appropriate solution by affinity binding.
  • the binder can be adsorbed to the target substance.
  • the target substance is a polypeptide and an antibody capable of specifically recognizing the polypeptide is present
  • the antibody can be adsorbed to the polypeptide as a first binder.
  • the tag sequence can be specifically recognized if it is possible to synthesize a fusion polypeptide of the polypeptide and the tag sequence.
  • the resulting antibody can be adsorbed to the polypeptide as the first binder.
  • the adsorption time of the binder is not limited, but when the binder is adsorbed to the target substance, it is preferably after the complex formation step (101) and before this step. This is because, when the binder is adsorbed to the target substance before the complex formation step (101), the binding between the target substance and the single-stranded nucleic acid may be suppressed or inhibited by the adsorption of the binder. Therefore, when the binder is adsorbed to the target substance, after the complex formation step (101), an appropriate time before this step, for example, a solution containing the complex obtained after the complex formation step (101).
  • the binder may be adsorbed to the target substance by any of the adsorption methods described above.
  • the binder When the binder is adsorbed on the solid phase carrier, it is preferably adsorbed before mixing the solution containing the complex and the solid phase carrier at least in this step. This is because the use of the solid phase carrier on which the binder is adsorbed makes it possible to more reliably fix the target substance to the solid phase carrier. Therefore, when the binder is adsorbed to the solid phase carrier, the binder can be adsorbed to the solid phase carrier by any of the above adsorption methods before mixing the solution containing the complex and the solid phase carrier at least in this step. That's fine.
  • the biotin adsorption to the protein is
  • the solution containing the complex obtained after the complex formation step (101) may be adsorbed according to the attached protocol using, for example, a commercially available biotinylation reagent. Thereafter, unadsorbed biotin is preferably washed and removed by a method known in the art such as ultrafiltration.
  • the adsorption of streptavidin to the magnetic beads may be performed by previously adsorbing the streptavidin to the magnetic beads using a known method, independently of the complex formation step (101).
  • a magnetic bead when a magnetic bead has a Tosyl group or an epoxy group, it can be adsorbed as it is with a primary amino group of streptavidin as it is by simply mixing with streptavidin. Further, when the magnetic beads have a carboxyl group, they can be adsorbed by a covalent bond with the primary amino group of streptavidin by activation with carbodiimide. These are methods well known in the art. Further, commercially available magnetic beads on which streptavidin is adsorbed in advance may be purchased and used.
  • binders used for immobilizing the target substance on the solid phase carrier.
  • this is a case where a plurality of different first binders are adsorbed on the target substance.
  • a case where biotin and an anti-target substance antibody are adsorbed to one target substance as independent first binders can be mentioned.
  • the immobilization step (102) and the recovery step (103) described later are performed using different solid phase carriers on which the second binders corresponding to the respective first binders are adsorbed.
  • the background of the single-stranded nucleic acid mixed by nonspecific adsorption can be further reduced.
  • a target substance in which the aforementioned biotin and anti-target substance antibody are adsorbed as a first binder using magnetic beads that are solid phase carriers in which streptavidin is adsorbed as a second binder, After performing the immobilization step (102) and the recovery step (103), again using the Sepharose beads that are solid phase carriers on which protein G is adsorbed as the second binder, the immobilization step (102) and the recovery step ( 103).
  • the target substance in a free state that does not form a complex with the single-stranded nucleic acid together with the complex is also immobilized on the solid phase carrier.
  • the target substance that does not form such a complex is also removed at the same time. It will not be.
  • Recovery Step 103) is a step of recovering the complex immobilized on the solid phase carrier from the solution.
  • the complex is immobilized on the solid phase carrier after the immobilization step (102) via a connector.
  • This step is characterized in that the complex-solid phase carrier is separated from the solution and recovered based on the characteristics of the solid phase carrier.
  • the characteristics of the solid phase carrier refer to properties specific to the solid phase carrier. For example, magnetic force, specific gravity, fluorescence, luminescence, affinity, etc. are included.
  • the complex-solid phase carrier in the solution after the immobilization step (102) is recovered using a magnet (magnetic magnet), and then the buffer is stored. It can be recovered by washing and removing the single-stranded nucleic acid non-specifically adsorbed to the target substance or solid phase carrier.
  • the solid support is a polymer polysaccharide support, silica, metal (including magnetic beads) or glass, the complex-solid support is precipitated by centrifugation, the supernatant is removed, and then a buffer is used. By washing, the complex-solid phase carrier can be similarly recovered.
  • the solid phase carrier is a polymer polysaccharide support or the like carrying a fluorescent substance, it can be recovered by a fluorescence detector such as FACS.
  • FACS fluorescence detector
  • a buffer having the same composition as the buffer used in the complex formation step (101) can be used.
  • the buffer may contain a reducing agent or a surfactant as necessary.
  • the reducing agent to be used include DTT (dithiothreitol) and 2-mercaptoethanol.
  • the final concentration of the reducing agent in the solution may be in the range of 0.5 to 10 ⁇ mM and 1 to 5 ⁇ mM.
  • the surfactant is preferably a nonionic surfactant.
  • Nonidet P40 (NO-40), Triton X-100, Triton X-114, Brij-35, Brij-58, Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80, n-octyl- ⁇ - Glucoside, MEGA-8, MEGA-9 and MEGA-10 are preferred.
  • the final concentration of the surfactant in the solution may be in the range of 0.005% to 0.1%, 0.01% to 0.08% by volume / volume (V / V).
  • Washing may be performed once to several times using the above buffer. Two to three times are preferable.
  • the washing temperature and washing time are not particularly limited, but may be 15 to 50 ° C. or 20 to 40 ° C. for 10 minutes to 1 hour.
  • the “amplification step” (104) is a step of recovering the single-stranded nucleic acid in the complex and amplifying it by a nucleic acid amplification method.
  • the complex is eluted from the complex-solid phase carrier recovered in the recovery step (103).
  • the elution method varies depending on the type of the binder.
  • the binder is an antibody
  • the complex-solid phase carrier is dissociated by acid treatment or the like, and then alkali is added as necessary to neutralize the complex-solid phase carrier.
  • the complex can be eluted.
  • the binder is biotin and avidin, streptavidin or neutravidin
  • the biotin and avidin or streptoid can be treated by heating in a solution containing 7 M or more urea and / or 2 M or more ⁇ -mercaptoethanol.
  • the binding of avidin or neutravidin can be dissociated and the complex can be eluted. Furthermore, when the target substance is a sugar chain-modified substance and the binder is a lectin, the complex can be eluted by adding a sugar such as glucose. These methods may be appropriately performed according to methods known in the art.
  • the method for recovering the complex single-stranded nucleic acid differs depending on the type of target substance forming the complex. Therefore, it may be carried out based on a method known in the art for recovering nucleic acid from a complex consisting of the target substance and nucleic acid.
  • the target substance is a peptide such as a protein
  • the target single-stranded nucleic acid can be recovered by coagulating and removing the protein by a protein denaturation method such as an alkali method or a phenol / chloroform method.
  • the target substance is a lipid or low molecular weight compound
  • heat treatment is performed to destroy the double-stranded structure of the nucleic acid
  • a chelating agent is added to the elution buffer, or elution One that has been dissociated by the alcohol precipitation method or the like after dissociating the binding between the target substance and nucleic acid by destroying the double-stranded structure of the nucleic acid by heat treatment with the buffer pH changed from the binding buffer Strand nucleic acids can be recovered.
  • a linker capable of being cleaved with light irradiation or a reducing agent is added to the binder, so that the solid phase carrier is combined with the nucleic acid to which the target substance is bound.
  • the nucleic acid molecule can also be recovered by the alcohol precipitation method or the like by the above-described operation.
  • the target substance that is immobilized on the solid phase carrier together with the complex in the immobilization step (102) and that does not form the complex can also be removed in this step.
  • nucleic acid amplification method refers to a method of amplifying a specific region of a nucleic acid serving as a template using an enzyme such as a primer and a polymerase.
  • an enzyme such as a primer and a polymerase.
  • any method known in the art may be used.
  • PCR polymerase chain reaction
  • ICAN isothermal gene amplification
  • the polymerase used in the reaction is appropriately determined depending on the nucleic acid amplification method to be used, but usually a DNA polymerase, particularly a heat resistant DNA polymerase is used.
  • a DNA polymerase particularly a heat resistant DNA polymerase is used.
  • thermostable nucleic acid polymerases are commercially available from manufacturers such as TaKaRa, New England Biolab, Roche, Life Technology, Roche, and Promega. You can also.
  • a polymerase having high fidelity is preferred as a polymerase used in the nucleic acid amplification method, but the polymerase used in this step does not necessarily need to have high fidelity, and often like Taq polymerase. It may be a polymerase into which an error can be introduced.
  • the reaction conditions for the nucleic acid amplification method take into account the length of the base sequence to be amplified, the amount of the template nucleic acid, that is, the amount of recovered single-stranded nucleic acid, the Tm value of the primer, the optimum reaction temperature and the optimum pH of the polymerase to be used, etc. And decide.
  • the sequence corresponding to the 5'-end primer binding region (201) constituting each single-stranded nucleic acid of the single-stranded nucleic acid library is used as the forward primer (204), and the 3'-end side.
  • a sequence complementary to the primer binding region (203) is used for the reverse primer (205).
  • the double-stranded nucleic acid as the amplification product is selectively separated and purified from the reaction solution after the amplification reaction based on the label,
  • the other single-stranded nucleic acid complementary to the target single-stranded nucleic acid among the double-stranded nucleic acids can be conveniently separated and removed based on the label.
  • the temperature and reaction time for each step are, for example, a heat denaturation step at 90 ° C to 98 ° C for 30 seconds to 1 minute, and an annealing step at 50 ° C to 60 ° C.
  • the extension step may be performed at 70 ° C. to 75 ° C. for 40 seconds to 2 minutes for 30 seconds to 1 minute.
  • the number of cycles is usually 10 to 40 cycles. Preferably it is 15 to 20 cycles.
  • the obtained amplified nucleic acid may be purified as necessary before the single-stranded preparation step. Unreacted deoxynucleotides and primers, polymerase, etc. can be removed by purification.
  • the purification method may be any method known in the art. For example, an ethanol precipitation method or a purification method using a spin gel filtration column can be used. The latter is preferable because the nucleic acid can be purified quickly and easily. Such columns are commercially available from companies in the bio-related business, and they can also be used.
  • the “single-stranded nucleic acid preparation step” (105) is a step of making the double-stranded nucleic acid obtained in the amplification step (104) into a single strand.
  • the nucleic acid after the amplification step (104) is usually not a nucleic acid aptamer composed of a single-stranded nucleic acid that specifically binds to a target substance, but two single-stranded nucleic acids having a base sequence complementary thereto. It exists in the state of a strand nucleic acid. Therefore, in this step, after preparing the double-stranded nucleic acid into a single strand, an intramolecular higher-order structure is formed in the target single-stranded nucleic acid to prepare a nucleic acid aptamer.
  • Single-stranded double-stranded nucleic acid is generally performed by heat denaturation.
  • Thermal denaturation may be performed in the range of 60 to 90 ° C.
  • the solution used at the time of denaturation may contain 1 to 7 M urea.
  • electrophoresis can be performed using a denaturing gel, and a double-stranded single strand can be purified and purified by a method known in the art, such as purification by eluting a band of the desired size from the gel. .
  • the single-stranded nucleic acid prepared in this step includes a mixture of a nucleic acid capable of forming a target nucleic acid aptamer and a pair having a base sequence complementary to the target single-stranded nucleic acid.
  • the single-stranded nucleic acid having such a complementary base sequence is removed to form a target nucleic acid aptamer. Only the nucleic acid may be separated. Separation of only one single-stranded nucleic acid having such a desired base sequence can be achieved, for example, by labeling the reverse primer with a label as described above.
  • the purified double-stranded nucleic acid is denatured, single-stranded, and fractionated by the difference in mobility of both strands by denaturing gel electrophoresis, and only the desired single-stranded nucleic acid is separated from the gel and purified. can do.
  • the single-stranded nucleic acid may be heated and cooled.
  • a single-stranded nucleic acid is dissolved in a buffer (for example, PBS buffer) used in the complex formation step (101) and dissolved at 80 to 98 ° C., preferably 85 to 95 ° C. for 30 seconds to 5 minutes, preferably May be heat-denatured for 30 seconds to 3 minutes, and then allowed to stand at room temperature or the like, and then slowly cooled or stepwise cooled to form an intramolecular higher-order structure.
  • the stepwise cooling may be carried out by once cooling at 50 to 70 ° C. for about 1 to 20 minutes, and then lowering the temperature to 15 to 35 ° C. for cooling.
  • nucleic acid aptamer that specifically binds to the target substance can be produced.
  • the nucleotide sequence of the obtained nucleic acid aptamer can be identified using a normal nucleic acid cloning technique known in the art.
  • the nucleic acid aptamer obtained can be denatured linearly and inserted into a suitable cloning vector, and then the base sequence can be determined by cycle sequencing reaction or the like.
  • cycle sequencing reaction or the like are known methods and can be carried out using a sequencer using a commercially available kit such as Big ⁇ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit from Life Technologies.
  • Step “Repeat Step” (106) means from complex formation step (101) to single-stranded nucleic acid preparation step (105) (hereinafter, a series of these steps is referred to as “round”. This is a step of repeating a plurality of times.
  • This step is an optional step as described above. However, in order to narrow down nucleic acid aptamers having higher specificity with the target substance after the single-stranded nucleic acid preparation step (105), it is preferable to repeat this step two or more rounds. Specifically, for example, 2 to 15 rounds, 2 to 8 rounds, or 2 to 5 rounds.
  • the single-stranded nucleic acid library used in the complex formation step (101) is basically a single-stranded nucleic acid obtained in the immediately preceding round of single-stranded nucleic acid preparation step (105) except for the first round.
  • the first round is preferably composed of a large number of different single-stranded nucleic acid populations as described above, it is generally desirable to use a single-stranded nucleic acid library prepared by chemical synthesis.
  • the conditions in each round, that is, the complex formation step (101) to the single-stranded nucleic acid preparation step (105) are the same as necessary.
  • round conditions include, for example, changing the composition of the solution and buffer used in each round. Specifically, in the first half of the buffer, wash conditions should be mild to acquire more nucleic acid aptamer candidates, and in the second half of the buffer, about 3 M urea should be mixed to make the washing conditions stricter. Thus, it is possible to separate only single-stranded nucleic acids that bind more strongly to the target substance. Furthermore, the concentration of the target substance and the single-stranded nucleic acid library in the complex formation step (101) can be changed in each round.
  • the concentration of the target substance and single-stranded nucleic acid library is lowered each time the rounds are repeated, and the complex formation conditions are made stricter, so that only single-stranded nucleic acids that bind tightly to the target substance are separated. Can do.
  • the “selection step” (107) is a step of selecting a single-stranded nucleic acid molecule having a predetermined structure from the single-stranded nucleic acid obtained after the repeating step (106). This step is an optional step, and can be selectively performed when the purpose is to produce a nucleic acid aptamer that binds more strongly to the target substance, as will be described later.
  • the predetermined structure here means that when a single-stranded nucleic acid molecule forms a secondary structure as a nucleic acid aptamer, the predicted secondary structure includes one or more double-stranded regions, and at least one of the two This refers to a structure containing non-Watson-Crick base pairs in the chain region.
  • the present inventors have a non-Watson-Crick base pair in a double-stranded region predicted to be a binding region with a target substance. It has been found that it binds very firmly. This process is based on the knowledge.
  • This step is for the single-stranded nucleic acid preparation step (105) described above for each single-stranded nucleic acid obtained after the repeating step (106), that is, after the single-stranded nucleic acid preparation step (105) that is the final step of the round.
  • the secondary structure includes one or more double-stranded regions in which 5 to 20 bases, 7 to 18 bases, 8 to 17 bases, or 10 to 15 bases base pair with each other, that is, a stem region.
  • a single-stranded nucleic acid in which at least one of the double-stranded regions comprises 1 to 5 base pairs, 1 to 7 base pairs, 1 to 8 base pairs, or 1 to 10 base pairs consisting of non-Watson-Crick base pairs Select an array.
  • non-Watson-Crick base pair means guanine and cytosine (g), guanine (g), adenine (a), cytosine (c), thymine (t) and uracil (u).
  • gc A base pair other than adenine and thymine (at) or uracil (au). Also included are base pairs in a hydrogen bonding mode different from the base pairs formed with normal double-stranded DNA (Nagaswamy U., et al., Nucl. Acid Res. 2000, 28: 375-376).
  • This step can be performed after each round and before the start of the next round, in addition to the end of the final round.
  • the single-stranded nucleic acid having a predetermined structure obtained in this step as a single-stranded nucleic acid library in the next round, by tightening the conditions of each step in one round, It is possible to produce a nucleic acid aptamer that binds to a target substance even more firmly.
  • a nucleic acid aptamer having high specificity and having a binding ability 100 to 1000 times stronger than that of a conventional method for producing a nucleic acid aptamer, particularly a DNA aptamer, is efficiently produced. can do.
  • Nucleic acid molecule The second embodiment of the present invention is a nucleic acid molecule that binds to a target substance.
  • the nucleic acid molecule of the present invention contains one or more double-stranded regions in the molecule, and at least one of the double-stranded regions contains non-Watson-Crick base pairs.
  • the nucleic acid molecule of the present invention is, in principle, a natural nucleic acid such as DNA, RNA, or a combination thereof, as described in the section “1. Definition” above. Moreover, the nucleic acid of the present invention may partially or entirely contain non-natural nucleotides or non-natural nucleic acids.
  • a preferred nucleic acid form of the invention is DNA.
  • Double-stranded region refers to a region in which base pairs are continuously formed between nucleotide strands constituting a nucleic acid molecule.
  • the length of consecutive base pairs is 5 to 20 bases, 7 to 18 bases, 8 to 17 bases, or 10 to 15 bases.
  • each double-stranded region is composed of the same or different base pairs.
  • the length of each double-stranded region may be the same or different.
  • each double-stranded region may be separated by a region that does not form base pairs with each other (for example, including a mismatch site, a gap, a bulge structure, or an internal loop structure), or may be continuous Good.
  • non-Watson-Crick base pair refers to a base pair other than guanine and cytosine, adenine and thymine, or uracil in each base of guanine, adenine, cytosine, thymine, and uracil.
  • a base pair consisting of guanine and adenine or thymine, or guanine and guanine (g-g), adenine and adenine (a-a), or the like is preferable.
  • the non-Watson-Crick base pair may be contained in at least one of the double-stranded regions present in the nucleic acid molecule of the present invention.
  • the non-Watson-Crick base pairs contained in one double-stranded nucleic acid region are 1 to 5 base pairs, 1 to 7 base pairs, 1 to 8 base pairs, or 1 to 10 base pairs.
  • the position of the non-Watson-Crick base pair in one double-stranded nucleic acid region is not particularly limited.
  • the double-stranded region containing non-Watson-Crick base pairs is a region directly involved in binding to the target substance. Therefore, the base sequence differs depending on the target substance. Based on the base sequence of a double-stranded region already known to bind to the target substance, any base sequence may be used as long as a non-Watson-Crick base pair is introduced.
  • the nucleic acid molecule of the present invention that binds to a specific target substance has a base sequence of a double-stranded region that is expected to be a target substance binding site in a known decoy DNA, RNA aptamer, or DNA aptamer that binds to the target substance. Any non-Watson-Crick base pair may be introduced into both strands.
  • the nucleic acid molecule of the present invention binds to a target substance.
  • the “target substance” refers to a biological substance that can be a binding target of a nucleic acid molecule, as described in the section “1. Definition” above.
  • the type of the target substance is not particularly limited, and examples thereof include peptides, nucleic acids, lipids, sugars, and low molecular compounds. Preferably it is a peptide, more preferably a polypeptide, ie a protein.
  • a transcriptional regulatory factor a signal transducing factor, a protein ligand (including cytokines and chemokines), or a receptor protein that binds to a nucleic acid having a specific base sequence is preferable as a target substance of the nucleic acid molecule of the present invention.
  • transcription regulatory factors include NF- ⁇ B, SP1, E2F, AP-1, and STAT-1.
  • signal transducing factor examples include Raf, Cytohesin 1, Phospholipase A 2 and HER3.
  • protein ligands include, for example, VEGF, EGF, NGF, HGF, KGF, bFGF, PDGF, IL-2, -3, -6, -8, -10, -20, IFN- ⁇ , - ⁇ , - ⁇ , TGF- ⁇ , BMP, Activin, TNF- ⁇ , Wnt, RANKL.
  • the nucleic acid molecule of the present invention can inhibit, suppress or enhance the specific biological function of the target substance by binding to the target substance. Usually, it has a function inhibiting or suppressing action.
  • the nucleic acid molecule of the present invention consists of a double-stranded nucleic acid and / or a single-stranded nucleic acid.
  • each of the double-stranded nucleic acid and the single-stranded nucleic acid fragment will be specifically described.
  • each nucleotide chain is not limited, but is preferably in the range of 5 to 50-mer, 7 to 40-mer, or 10 to 35-mer, for example.
  • the length of each strand that is base paired need not be the same.
  • one nucleotide chain may be 7-mer or longer than the other nucleotide chain.
  • the long-side nucleotide chain may form a hairpin structure by intramolecular annealing in a single-stranded region that does not correspond to the other nucleotide chain.
  • the stem region formed in the hairpin structure is also included in the double-stranded region of the present invention.
  • each nucleotide chain constituting the double-stranded nucleic acid can include a single-stranded region that does not form base pair with each other on the 5 ′ side and / or 3 ′ side of the double-stranded region.
  • the double-stranded nucleic acid also includes a dumbbell-shaped closed circular nucleic acid in which these single-stranded regions form a loop structure like a linker nucleic acid, and both nucleotide strands of the double-stranded nucleic acid are linked.
  • dumbbell-type nucleic acid has a degradation resistance against a nucleolytic enzyme such as a nuclease compared to a linear double-stranded nucleic acid, and is preferable as the nucleic acid molecule of the present invention.
  • one or both of the nucleotide strands constituting the double-stranded nucleic acid is the hairpin DNA described in International Application No. PCT / JP2011 / 059619 on the 5 ′ side and / or 3 ′ side, preferably 3 ′ side. It can also be included.
  • this hairpin type DNA the three DNA nucleic acid regions of the first nucleic acid region, the second nucleic acid region, and the third nucleic acid region are linked in order from the 5 ′ end side to the 3 ′ end side, respectively. It has a structure.
  • the “first nucleic acid region” is a nucleic acid region consisting of an arbitrary nucleotide of 2 to 5-mer.
  • the base of this nucleic acid region may be guanine, adenine, cytosine or thymine, but is preferably guanine or cytosine. This is because when the stem structure is formed with the third nucleic acid region described later, the Tm value increases as the gc content increases, and the stem structure can be stably maintained. Therefore, it is most preferable that the entire base sequence of the first nucleic acid region is composed of g and / or c.
  • the “second nucleic acid region” is a nucleic acid region consisting of a 5′-gna-3 ′ or 5′-gnna-3 ′ base sequence. Each n in the sequence independently consists of either a natural base (g, a, t, or c), a base analog, or a modified base.
  • the “third nucleic acid region” is a nucleic acid region having a base sequence complementary to the first nucleic acid region. Therefore, the base sequence of the third nucleic acid region is determined by the base sequence of the first nucleic acid region, and the first nucleic acid region and the third nucleic acid region form a base pair in the molecule. As a result, the first nucleic acid region and the third nucleic acid region have a stem structure that is completely base-paired with each other, and the second nucleic acid region that exists between the first nucleic acid region and the third nucleic acid region has a loop structure. As a whole, for example, a hairpin DNA consisting of 7 to 14-mer nucleotides having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37 or 38 is formed.
  • the degradation resistance of the double-stranded nucleic acid to the nucleolytic enzyme is improved and stable in vivo. It becomes possible to improve the nature.
  • the single-stranded nucleic acid constituting the nucleic acid molecule of the present invention forms a secondary structure by intramolecular annealing, and has one or more stem structures and one or more loop structures in the molecule.
  • the double-stranded region is contained within this stem structure.
  • the stem structure may include one or more mismatch sites and / or one or more bulge structures.
  • the length of the nucleotide chain of the single-stranded nucleic acid is not particularly limited as long as it has a length that can include at least one double-stranded region in the molecule. For example, a range of 15 to 100-mer, 20 to 90-mer, or 30 to 80-mer is preferable.
  • the single-stranded nucleic acid can also contain the above-mentioned hairpin DNA on the 5 'side and / or 3' side, preferably 3 'side.
  • a suitable form includes a nucleic acid aptamer.
  • DNA aptamers are particularly preferred from the standpoint of nucleic acid stability.
  • DNA encoding double-stranded RNA or single-stranded RNA consists of double-stranded RNA or single-stranded RNA (for example, RNA aptamer).
  • DNA encoding them can also be used.
  • the base sequence of such DNA is, for example, a base sequence in which uracil (U) in the base sequence constituting double-stranded RNA or single-stranded RNA is replaced with thymine (T).
  • RNA aptamer is used as a template, and all or part of the DNA is complementary to the 3 'terminal nucleotide sequence of the aptamer.
  • It can be prepared by performing a reverse transcription reaction using a plumer.
  • a technique known in the art may be used.
  • it can be carried out according to the method described in Molecular Cloning described above.
  • the DNA of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods known in the art based on the base sequence information of double-stranded RNA and single-stranded RNA.
  • the DNA encoding the double-stranded RNA or single-stranded RNA may be inserted into an expression vector in a state where it can be expressed.
  • “Expressable state” means that DNA encoding a double-stranded RNA or a single-stranded RNA is linked downstream of a promoter in an expression vector so that the corresponding RNA can be expressed.
  • a plasmid or virus capable of autonomously growing in a host can be used. Examples of such plasmids include pET, pGEX6p, pMAL, pREST, etc. when the host is Escherichia coli, pUB110, pTP5, etc.
  • the host when the host is Bacillus subtilis, and the host is yeast. In this case, YEp13, YEp24, YCp50, etc., and when the host is a plant, pBI, pRI, or pGW binary vectors can be mentioned.
  • the virus when the host is E. coli, ⁇ phage ( ⁇ gt11, ⁇ ZAP, etc.), when the host is a mammal, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, vaccinia virus, etc., when the host is an insect, When the host is a plant such as baculovirus, cauliflower mosaic virus (CaMV), kidney bean golden mosaic virus (BGMV), tobacco mosaic virus (TMV) and the like can be mentioned.
  • CaMV cauliflower mosaic virus
  • BGMV kidney bean golden mosaic virus
  • TMV tobacco mosaic virus
  • nucleic Acid Molecules with NF- ⁇ B as Target Substances The nucleic acid molecules of the present invention with NF- ⁇ B as a target substance are described below with specific examples.
  • NF- ⁇ B is one of the transcription factors that play a major role in the immune response, and is involved in inflammatory reactions, cell proliferation, apoptosis, etc., so it has attracted attention as a drug discovery target and can inhibit its function.
  • Molecular development is taking place around the world. For example, decoy DNA containing a double-stranded DNA fragment having a common sequence to which NF- ⁇ B binds (WO / 1996/035430; Miyake T., et al., Mol. Ther., 2001, 19: 181-187; Kim KH, et al., Exp. Mol. Pathol., 2008, 86: 114-120; Isomura I., A. Morita, Microbiol.
  • RNA aptamers Lebruska LL and Maher III LJ, Biochemistry, 1999, 38: 3168-3174; NJ Reiter, LJ Maher III, SE Butcher, Nucleic Acids Res., 2008, 36: 1227-1236; Chan R., et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34, e36; SE Wurster, LJ Maher III, RNA, 2008, 14: 1037-1047).
  • both of these nucleic acid molecules had a binding ability (dissociation constant, Kd) to NF- ⁇ B of about several nM.
  • the nucleic acid molecule of the present invention has a binding ability to NF- ⁇ B on the order of pM, and has a binding ability 100 times higher than that of known nucleic acid molecules.
  • the nucleic acid molecule of the present invention that targets p50 of NF- ⁇ B as a target substance includes a double-stranded region consisting of the base sequence represented by SEQ ID NOs: 1 and 2 shown in FIG. 3 (a) as a consensus sequence. .
  • the base pair described as “W-W” indicates “a-t” or “t-a”.
  • ” between the bases of the double-stranded region is Watson-Crick base pairing, “ ⁇ ” or “ ⁇ ” is “ag” or “ga”, or “gt” or “tg”, respectively.
  • the nucleic acid molecule of the present invention targeting p50 of NF- ⁇ B contains one or more double-stranded regions comprising the above consensus sequence
  • double-stranded nucleic acid and / or single-stranded nucleic acid Either form may be sufficient.
  • the hairpin DNA may be contained on the 5 ′ side and / or 3 ′ side, preferably 3 ′ side of the consensus sequence.
  • a DNA aptamer is a suitable example.
  • these DNA aptamers have a binding ability 100 to 1000 times or more stronger than conventionally known RNA aptamers and DNA aptamers using NF- ⁇ B p50 as a target substance.
  • at least one double-stranded region contained in the nucleic acid molecule has a non-Watson-Crick base pair, so that the binding ability of a conventional nucleic acid aptamer to a target substance can be increased. It can be improved dramatically.
  • Target substance function inhibitor The third embodiment of the present invention is a target substance function inhibitor.
  • the target substance function inhibitor of the present invention contains the nucleic acid molecule of Embodiment 2 as an active ingredient.
  • target substance function inhibition refers to biological functions such as catalytic function or gene expression control function (including control of transcription, translation, transport, etc.) and apoptosis control function possessed by the target substance. Inhibiting or suppressing by binding of a nucleic acid molecule as an active ingredient.
  • the content of the nucleic acid molecule in the target substance function inhibitor of the present invention may be a pharmaceutically effective amount.
  • the “pharmaceutically effective amount” means a dose necessary for the nucleic acid molecule of the second embodiment, which is an active ingredient of a target substance function inhibitor, to exhibit target substance function inhibition, which is its medicinal effect, In addition, it refers to a dose that has little or no harmful side effects on the living body or the like to be administered.
  • the specific amount depends on the type of the target substance, the inhibitory activity of the nucleic acid molecule, the dosage form to be used, and, for the purpose of administration to the living body, information on the living body that is the subject and the administration route. Different.
  • a pharmaceutically effective amount range and a suitable route of administration are generally formulated based on data obtained from cell culture assays and animal experiments.
  • the final dose is determined and adjusted according to the judgment of the doctor according to the individual subject.
  • the information of the subject to be considered includes the degree or severity of the disease, the general health condition, age, weight, sex, diet, drug sensitivity, resistance to treatment, and the like.
  • the content of the nucleic acid molecule of the present invention per dosage unit of the target substance function inhibitor is, for example, the above-described NF- ⁇ B p50 for a human adult male (body weight 60 kg) that does not require the use of other drugs.
  • the nucleic acid molecule of the present invention having a target substance as a target substance is administered by injection, about 0.01% (w / v) to about 20% (w / v), preferably about 0.1% ( W / v) to about 10% (w / v) may be included.
  • the nucleic acid can be divided into several times to reduce the burden on the subject.
  • composition A fourth embodiment of the present invention is a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains at least one target substance function inhibitor described in the third embodiment.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • “Pharmaceutically acceptable carrier” refers to its action in order to facilitate the formulation of a pharmaceutical composition ordinarily used in the field of pharmaceutical technology and application to a living body, and to maintain the effect of the target substance function inhibitor. A substance added within a range not inhibiting or suppressing.
  • Carriers include, for example, excipients, binders, disintegrants, fillers, emulsifiers, flow control agents, lubricants or surfactants.
  • excipient examples include sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, Including dextrin, maltodextrin, starch and cellulose), metal salts (eg, sodium phosphate or calcium phosphate, calcium sulfate, magnesium sulfate), citric acid, tartaric acid, glycine, low, medium, high molecular weight polyethylene glycol (PEG), Pluronics, or combinations thereof.
  • sugars such as monosaccharides, disaccharides, cyclodextrins and polysaccharides (specifically, but not limited to, glucose, sucrose, lactose, raffinose, mannitol, sorbitol, inositol, Including dextrin, mal
  • binder examples include starch paste, corn, wheat, rice, or potato starch, gelatin, tragacanth, methylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and / or polyvinylpyrrolidone.
  • disintegrant examples include the starch, carboxymethyl starch, cross-linked polyvinyl pyrrolidone, agar, alginic acid, sodium alginate or salts thereof.
  • filler examples include the sugar and / or calcium phosphate (for example, tricalcium phosphate or calcium hydrogen phosphate).
  • emulsifier examples include sorbitan fatty acid ester, glycerin fatty acid ester, sucrose fatty acid ester, and propylene glycol fatty acid ester.
  • Examples of the “flow additive modifier” and “lubricant” include silicate, talc, stearate or polyethylene glycol.
  • the drug composition of the present invention comprises a flavoring agent, a solubilizing agent (solubilizing agent), a suspending agent, a diluent, a surfactant, a stabilizer, an absorption accelerator (if necessary)
  • a flavoring agent for example, quaternary ammonium salts, sodium lauryl sulfate, etc., extenders, moisturizers, humectants (eg, glycerin, starch, etc.), adsorbents (eg, starch, lactose, kaolin, bentonite, colloidal silicic acid, etc.
  • Disintegration inhibitors eg, sucrose, stearin, cocoa butter, hydrogenated oil, etc.
  • coating agents colorants, preservatives, antioxidants, fragrances, flavoring agents, sweetening agents, buffering agents, and the like.
  • surfactant examples include lignosulfonic acid, naphthalene sulfonic acid, phenol sulfonic acid, alkali metal salt, alkaline earth metal salt and ammonium salt of dibutyl naphthalene sulfonic acid, alkyl aryl sulfonate, alkyl sulfate, alkyl sulfonate.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can include one or more of the above carriers.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can also contain other drugs as long as the pharmacological effect of the nucleic acid of the present invention is not lost.
  • a predetermined amount of antibiotics may be contained.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is a form that does not inactivate the active ingredient and can exhibit its pharmacological effect in vivo after administration. Usually, it varies depending on the administration method and / or prescription conditions.
  • dosage forms suitable for oral administration include solid preparations (including tablets, pills, sublinguals, capsules, drops, troches), granules, powders, powders, liquids, and the like.
  • the solid preparation can be made into a dosage form known in the art, for example, a sugar-coated tablet, a gelatin-encapsulated tablet, an enteric tablet, a film-coated tablet, a double tablet, or a multilayer tablet, if necessary. .
  • Parenteral administration is subdivided into systemic administration and local administration, and local administration is further subdivided into intra-tissue administration, transepidermal administration, transmucosal administration, and rectal administration.
  • the dosage form can be made suitable for.
  • dosage forms suitable for systemic or intra-tissue administration include injections that are liquids.
  • Suitable dosage forms for transepidermal or transmucosal administration include, for example, liquids (including coating agents, eye drops, nasal drops, and inhalants), suspensions (including emulsions and creams), and powders (points). Nasal and suction agents), pastes, gels, ointments, plasters and the like.
  • Examples of dosage forms suitable for rectal administration include suppositories.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition may be liquid, solid (including semi-solid), or a combination thereof. Solutions, oily dispersions, emulsions, suspensions, powders, powders, pastes, gels, pellets, tablets and granules can be used.
  • each dosage form are not particularly limited as long as the dosage form is within the range of dosage forms known in the art for each dosage form.
  • the nucleic acid molecule of the second embodiment is dissolved in a pharmaceutically acceptable solvent, a pharmaceutically acceptable carrier is added as necessary, and a method commonly used in the art is used. Can be manufactured.
  • Examples of the “pharmaceutically acceptable solvent” include water, ethanol, propylene glycol, ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters and the like. These are preferably sterilized and preferably adjusted to be isotonic with blood as necessary.
  • the pharmaceutical composition of the present embodiment can be administered to a living body in a pharmaceutically effective amount for treatment or prevention of a target disease or the like.
  • the living body to be administered is a vertebrate, preferably a mammal, more preferably a human.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be either systemic administration or local administration. It can select suitably according to the kind of disease, onset location, or a progression degree. If the onset site is a local disease, local administration directly administered to and around the onset site by injection or the like is preferable. This is because a sufficient amount of the nucleic acid molecule of the present invention can be administered to a site (tissue or organ) to be treated, and other tissues are hardly affected. On the other hand, when the treatment site cannot be specified or the onset is a systemic disease, systemic administration by intravenous injection or the like is preferable, although there is no limitation. This is because the nucleic acid molecule of the present invention is distributed throughout the body through the bloodstream, so that it can be administered even to a lesion that cannot be found by diagnosis.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered by any appropriate method that does not deactivate the active ingredient.
  • it may be parenteral (for example, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop) or oral.
  • parenteral for example, injection, aerosol, application, eye drop, nose drop
  • oral Preferably, it is an injection.
  • the injection site is not particularly limited. Any site may be used as long as the nucleic acid molecule as an active ingredient can bind to the target substance and suppress its function.
  • Intravenous injection such as intravenous injection or intraarterial injection is preferable. This is because the pharmaceutical composition of the present invention can be distributed throughout the body through the blood stream as described above, and is less invasive.
  • Target Substance Detection Method is a method for detecting a target substance using the nucleic acid molecule described in the second embodiment.
  • the nucleic acid molecule described in the second embodiment can bind to the target substance of the nucleic acid molecule very firmly and specifically, the target substance present in the sample is detected using the property of the nucleic acid molecule. can do.
  • a known detection method may be used as the detection method itself.
  • SPR method quartz crystal microbalance method, turbidimetric method, colorimetric method, or fluorescent method can be used.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the SPR method is a measurement method that utilizes this phenomenon, and can measure the adsorbate on the surface of the metal thin film that is the sensor portion with high sensitivity.
  • the nucleic acid molecule of the second embodiment is immobilized on the surface of the metal thin film in advance, and the sample passes through the surface of the metal thin film, and the sample passes through the binding between the nucleic acid molecule and the target substance.
  • the target substance in the sample can be detected by detecting the difference between adsorbates on the front and back metal surfaces.
  • a substitution method, an indirect competition method, and the like are known, and any of them may be used.
  • the QCM (Quartz Crystal Microbalance) method uses a phenomenon in which when a substance is adsorbed on the surface of an electrode attached to a crystal resonator, the resonance frequency of the crystal resonator decreases according to its mass. .
  • a QCM sensor using this method can quantitatively capture an extremely small amount of adsorbate based on the amount of change in the water resonance frequency.
  • the amount of change in the water resonance frequency caused by the binding between the nucleic acid molecule and the target substance by immobilizing the nucleic acid molecule in advance on the electrode surface in the same manner as in the SPR method and bringing the sample into contact with the electrode surface.
  • the target substance in the sample can be detected quantitatively.
  • This technique is well known in the art. For example, see Christopher J., et al. (2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review, 105: 1103-1169.
  • the turbidimetric method irradiates a solution with light and optically measures the attenuation of scattered light scattered by a substance suspended in the solution or transmitted light that has passed through the solution using a colorimeter or the like. It is a method of measuring the amount of substance in it.
  • the target substance in the sample can be quantitatively detected by measuring the absorbance before and after adding the nucleic acid molecule of the second embodiment to the sample.
  • the target substance can be detected by using it together with an antibody against the target substance.
  • a method using an ELISA sandwich method may be used. In this method, first, the nucleic acid molecule of the second embodiment is immobilized on a solid phase carrier, and then a sample is added to bind the target substance present in the sample and the nucleic acid molecule. Subsequently, after washing the sample, an anti-target substance antibody is added to bind to the target substance. After washing, the target substance in the sample can be detected by detecting the anti-target substance antibody using a secondary antibody with an appropriate label.
  • beads made of materials such as polystyrene, polycarbonate, polyvinyltoluene, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, nylon, polymethacrylate, latex, gelatin, agarose, cellulose, sepharose, glass, metal, ceramics or magnetic materials
  • Insoluble carriers in the form of microplates, test tubes, sticks or test pieces can be used.
  • the nucleic acid molecule is represented by SEQ ID NOS: 1 and 2 shown in FIG. 3A as the consensus sequence described in the second embodiment.
  • a nucleic acid molecule comprising a double-stranded region consisting of a base sequence.
  • the base sequences shown by SEQ ID NOs: 3 and 4 shown in FIG. 3 (b) the base sequences shown by SEQ ID NOs: 5 and 6 shown in FIG. 3 (c), and SEQ ID NOs: 7 and 7 shown in FIG.
  • the hairpin described in the second embodiment is more specifically, for example, on the 5 ′ side and / or 3 ′ side, preferably 3 ′ side of the consensus sequence. 4 or a DNA aptamer containing the central region represented by SEQ ID NOs: 9 to 21 in FIG. 4, more specifically, for example, clones 5R01, 5R09, 5R43, 5R14, 5R13, 5R34, 5R10, 5R26, 5R27, 5R11, 5R05, 5R28 and 5R19.
  • the sample may be used after treating the sample with a nuclease inhibitor before measurement.
  • NF- ⁇ B p50 detection kit The sixth embodiment of the present invention is a kit for detecting NF- ⁇ B p50 containing one or more NF- ⁇ B p50-binding nucleic acid molecules of the second embodiment. This kit can detect NF- ⁇ B p50 in a sample using the NF- ⁇ B p50-binding nucleic acid according to the above embodiment.
  • this kit is used for diluting and washing a labeled secondary antibody, a substrate necessary for detection of a label, a positive control and a negative control, or a sample as necessary.
  • the buffer solution to be used can be included.
  • instructions for using the kit can be included.
  • Example 1 Development of highly efficient production method of nucleic acid aptamer> I. Examination of conditions for solid phase carrier In the method for producing the nucleic acid aptamer of the present invention, the optimum conditions for the solid phase carrier were examined in order to reduce non-specific adsorption of the single-stranded nucleic acid to the solid phase carrier used.
  • Magnetic beads A (NewEngland Biolabs, Hydrophilic Streptavidin Magentic Beads) have a hydrophilic bead surface
  • magnetic beads B (NewEngland Biolabs, Streptavidin Magnetic Beads) have a hydrophobic bead surface.
  • These magnetic beads were used to verify nonspecific adsorption of single-stranded DNA on the magnetic beads.
  • the amount of DNA adsorbed non-specifically to the magnetic beads was detected by real-time PCR.
  • a reverse primer represented by SEQ ID NO: 23 and a forward primer represented by SEQ ID NO: 24 were used.
  • the reverse primer complementary to the single-stranded DNA constituting the library is biotinylated at the 5 'end thymine (t). Therefore, the PCR amplified product was mixed with streptavidin and then subjected to denaturing gel electrophoresis, whereby the unreacted reverse primer and the complementary sequence of the single-stranded DNA shown in sequence 22 in which the 5 'end was biotinylated Since it binds to streptavidin and has a low mobility, the target single-stranded DNA amplification product can be selectively prepared by the gel shift method.
  • PCR reaction conditions were as follows: in the presence of SYBR® Green® I (Lonza®) and ROX® Dye (Life Technologies), 95 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 30 seconds, and 65 ° C for 3 minutes in 2 steps.
  • the amplification process was detected by Mx3005P (Agilent Technologies).
  • the target substance is NF- ⁇ B p50, which is a transcription factor, and a DNA aptamer that binds strongly thereto is prepared. It was.
  • magnetic beads A Hydrophilic Streptavidin Beads, NewngEngland Biolabs
  • streptavidin magnetic beads Hydrophilic Streptavidin Beads, New England Biolabs. Incubate at room temperature for 30 minutes, remove the magnetic beads by a magnetic stand and centrifugation, and collect the supernatant.
  • the target protein recombinant human NF- ⁇ B p50 (rhNF- ⁇ B, Promega) was mixed at the ratio shown in Table 1, and incubated at 25 ° C. for 30 minutes, whereby single-stranded DNA and NF- ⁇ B p50 were mixed.
  • the complex of was formed.
  • the single-stranded nucleic acid library for complex formation, the concentration ratio of NF- ⁇ B p50, the volume of the reaction solution used in this step, and the like were adjusted for each round. Details are described in the repetitive step (106) described later.
  • Biotin and streptavidin were used as binders.
  • Biotin is the first binder adsorbed on the target substance, and streptavidin corresponds to the second binder adsorbed on the magnetic beads.
  • NF- ⁇ B p50 Since the used NF- ⁇ B p50 is not biotinylated, first, 0.09 volume of 10 mM biotinylation reagent (EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Thermo Scientific) was added and incubated at 25 ° C. for 15 minutes. As a result, NF- ⁇ B50p50 contained in the complex in the solution and free NF- ⁇ B p50 not formed of the complex were biotinylated.
  • biotinylation reagent EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin, Thermo Scientific
  • the unreacted biotinylation reagent was removed by a washing operation by ultrafiltration using Microcon 50 (Merck).
  • the washed solution containing the biotinylated complex is mixed with streptavidin magnetic beads (Hydrophilic Streptavidin Beads, New England Biolabs) (6.8 to 8 ⁇ g per pmol in terms of p50 monomer) and incubated at room temperature for 10 minutes, and biotin-strept
  • streptavidin magnetic beads Hydrophilic Streptavidin Beads, New England Biolabs
  • the magnetic beads are washed with 40 ⁇ mL of PBS buffer containing 0.05% Nonidet P-40 and 2.5 mM DTT (hereinafter referred to as ⁇ Buffer A ”) and incubated at 37 ° C. with stirring for 30 minutes. This washing operation was repeated once more.
  • PCR a reverse primer represented by SEQ ID NO: 26 and a forward primer represented by SEQ ID NO: 27 were used.
  • the reverse primer is biotinylated at the 5 'end thymine (t).
  • PCR was performed using ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) at a final concentration of 0.025 U / ⁇ L and an attached buffer.
  • Double-stranded DNA was recovered from the PCR solution containing the amplified product after the amplification step (104) by ethanol precipitation, and then single-stranded DNA was prepared by gel shift method using streptavidin. Specifically, the recovered double-stranded DNA (0.4 mL of PCR solution) is suspended in 10 ⁇ L of SA buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.6, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) at 75 ° C. After heating for 3 minutes, 10 ⁇ L of streptavidin solution (5 mg / mL, dissolved in SA buffer) was added and incubated at 25 ° C. for 30 minutes.
  • SA buffer 10 mM Tris-HCl pH 7.6, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA
  • the obtained single-stranded DNA was dissolved in PBS buffer solution (1.1 mM KH 2 PO 4 , 155 mM NaCl, 3 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4), heated at 90 ° C. for 3 minutes, and then at 60 ° C. for 3 minutes. The mixture was cooled and then heated and cooled at 25 ° C. to form a higher order structure in the single-stranded DNA molecule. Thereafter, this solution was mixed with PBS buffer containing 0.1% Nonidet P-40 and 5 mM DTT in an equal amount, and used as a new single-stranded nucleic acid library in the next round.
  • PBS buffer solution 1.1 mM KH 2 PO 4 , 155 mM NaCl, 3 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4
  • a single-stranded nucleic acid library consisting of single-stranded DNA prepared by chemical synthesis and gel purification as described above was directly used.
  • the total number of molecular species of single-stranded DNA in this round was 333 pmol. This corresponds to about 2 ⁇ 10 13 molecules of single-stranded DNA.
  • the concentrations of the single-stranded nucleic acid library and NF- ⁇ B p50 were gradually lowered in order to tighten the conditions for complex formation of single-stranded DNA-NF- ⁇ B p50.
  • NF- ⁇ B mini46 46-mer
  • SEQ ID NO: 28 An amount was added.
  • 40 mL of buffer A was used, and washing was performed twice at 37 ° C. for 30 minutes.
  • washing was further performed by inverting and mixing for 15 minutes at room temperature with 1 mL of buffer with 3 M urea added to buffer A. As a result, washing conditions were tightened, and single-stranded DNA fragments that strongly bind to NF- ⁇ B p50 were selected.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence, clone name, clone number, and SEQ ID NO of the obtained NF- ⁇ B p50-binding DNA aptamer.
  • the base region of the central region is roughly divided into three sequence groups, that is, a sequence group having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 9 to 11, a sequence group having a base sequence represented by SEQ ID NOs: 12 to 18, And it was classified into a sequence group having the base sequence shown in SEQ ID NO: 19-21.
  • Each sequence had a sequence similar to the natural consensus DNA sequence to which NF- ⁇ B binds as shown in SEQ ID NO: 29. Sequences similar to those consensus were found to be located in the stem portion of the hairpin structure, as shown in FIG. Interestingly, it was revealed that the sequence of the stem portion contained non-Watson-Crick base pairs of GA and GT, unlike the natural DNA sequence.
  • Example 2 Binding ability of DNA aptamer binding to NF- ⁇ B> Among the NF- ⁇ B p50-binding DNA aptamer clones obtained in Example 1, 5R01, 5R14, and 5R05 (see FIG. 4), which had a large number of clones in each sequence group, were used to bind to NF- ⁇ B p50. Was analyzed.
  • Example 1 Single-stranded DNA (full length 95-mer) of each clone was PCR-amplified using the clone plasmid obtained in Example 1 as a template and the biotinylated primers of Sequence 26 and Sequence 27, and then the Example 1 was prepared by the gel shift method using streptavidin in the same procedure as the single-stranded nucleic acid preparation step shown in 1.
  • the binding ability of each NF- ⁇ Bp50 binding DNA aptamer clone to NF- ⁇ Bp50 was measured by the surface plasmon resonance (SPR) method using BIACORE3000 (GE Healthcare).
  • SPR surface plasmon resonance
  • buffer A was used as a running buffer, and measurement was performed at a set temperature of 25 ° C.
  • the sensor chip (SA chip) coated with streptavidin has a base sequence complementary to the 3 ′ end region of each clone, and the base at the 5 ′ end is represented by SEQ ID NO: 30
  • Detection of binding / dissociation between immobilized clonal DNA and NF- ⁇ B50p50 is achieved by injecting 2.5 nM or 5 nM NF- ⁇ B p50 solution (diluted with buffer A and converted to dimer) using Kinetic Injection mode. Monitored.
  • the measurement conditions were a flow rate of 20 ⁇ L / min, a protein injection of 6 minutes, and a protein dissociation measurement after completion of the injection of 6 minutes.
  • Regeneration of the chip was performed by injecting 5 ⁇ L (corresponding to 15 seconds) of 2 ⁇ M NaCl solution.
  • the DNA immobilized by hybridization can be removed by injection of 0.05 ⁇ M NaOH solution at a flow rate of 25 ⁇ L / min by 5 ⁇ L (corresponding to 12 seconds), and the same chip is used for binding analysis with different DNA sequences. I was able to use it.
  • FIG. This figure is a sensorgram in which the interaction between the above three clones and NF- ⁇ B p50 is detected.
  • both clones bind very strongly to NF- ⁇ B p50, and from the pattern of the sensorgram after completion of NF- ⁇ B p50 injection, dissociation of the bound clone from NF- ⁇ B p50 was found to be extremely slow.
  • Example 3 Binding ability of DNA aptamer mutant binding to NF- ⁇ B p50> NF- ⁇ B p50 binding DNA aptamer clones 5R01, 5R14, and 5R05 that were verified in Example 2 were analyzed for their ability to bind to NF- ⁇ B p50.
  • the immobilization of various single-stranded DNAs on the SA chip by hybridization to the probe was performed at 20 ⁇ L / min at a flow rate of 20 ⁇ L / min with various DNA fragment (68-mer) solutions diluted to 250 nM with PBS. It was performed by injecting ⁇ L (equivalent to 1 minute).
  • FIG. 9 shows the result. This figure is a sensorgram of SPR in which the interaction between Cont-68 and NF- ⁇ B p50 for the above three clones and control was detected.
  • Example 4 Binding ability of NF- ⁇ B p50-binding DNA aptamer 5R01-68 mutant to NF- ⁇ B p50>
  • the common structure of each clone of the NF- ⁇ B p50-binding DNA aptamer obtained in Example 1 includes non-Watson-Crick base pairs that are different from ordinary double-stranded DNA (FIG. 4). .
  • FIG. This figure shows SPR sensorgrams when mutant 5R01mut-68 (A), control 5R01-68 (B) and Cont-68 (C) were detected for interaction with NF- ⁇ B p50. It is. Mutant 5R01mut-68 was more than 20 times more potent than Cont-68, but the dissociation rate constant was 10 times greater than 5R01-68, and 5R01-mut with non-Watson-Crick base pairs. It was found that it was easier to dissociate from NF- ⁇ B p50 than 68.
  • Example 5 Binding specificity of NF- ⁇ B p50-binding DNA aptamer to NF- ⁇ B p50> The NF- ⁇ B p50 binding selectivity of the NF- ⁇ B p50 binding DNA aptamer obtained in Example 1 was examined.
  • a 59-mer DNA fragment Taq-59 (SEQ ID NO: 36) incorporating a known anti-Taq DNA aptamer was prepared by chemical synthesis and applied to various proteins in the same manner as 5R01-68 and 5R01mut-68. The binding was verified by SPR method.
  • FIG. This figure shows NF- ⁇ B p50 ( ⁇ ), Taq DNA polymerase ( ⁇ ), and AP-1 ( ⁇ ) for 5R01-68 (A), 5R01mut-68 (B), and Taq-59 for control. It is a sensorgram of SPR when the interaction with is detected. From this figure, the binding ability of 5R01-68 and 5R01mut-68 to AP-1 and Taq DNA polymerase is very weak, and the DNA aptamer obtained by the production method of the present invention is specific to the target substance NF- ⁇ B p50. It became clear that they could be combined.
  • Table 2 summarizes the dissociation constants (Kd values) for NF- ⁇ B p50 calculated from the results of the SPR method for DNA aptamers and the like verified in the above examples.

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Abstract

　標的物質との特異性及び結合性が高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的、かつ簡便に製造する方法を開発し、提供することを目的とする。　一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる複合体形成工程、前工程後の溶液と固相担体を混合して、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して複合体を固相担体に固定化する固定化工程、固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する回収工程、複合体中の一本鎖核酸を回収後、核酸増幅法によって増幅させる増幅工程、及び増幅工程で得られた二本鎖核酸を一本鎖化した後、分子内立体構造を形成させる一本鎖核酸調製工程を含む核酸アプタマーの製造方法を提供する。

Description

核酸アプタマーの作製方法
　本発明は、核酸アプタマー、特にDNAアプタマーの効率的な作製方法に関する。
　近年、低分子化合物に代わる医薬又は診断薬の新たな有効成分として核酸アプタマーが、siRNA等の他の機能性核酸と共に注目され、その医療応用に向けて様々な研究及び開発が世界各国で進められている。
　核酸アプタマーは、それ自身が有する立体構造によってタンパク質等の標的物質と強固、かつ特異的に結合し、その機能を阻害又は抑制することができる機能性核酸である。核酸アプタマーは、通常、SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法と呼ばれるin vitroセレクション法（試験管内選別法）によって、ランダムな塩基配列を含む核酸ライブラリーから、標的物質に結合する核酸分子として製造される（特許文献１～３、非特許文献１～４）。
　従来、核酸アプタマーは、RNAで構成されるRNAアプタマーが主流であったが、RNAは不安定であり、また製造コストが高いことから、近年では、生体内で安定であり、かつ安価に製造できるDNAアプタマーに研究開発がシフトしつつある（特許文献４、非特許文献５～８）。しかし、RNAアプタマーと比べて、DNAアプタマーを効率的に製造するのは困難であった。通常、SELEX法では、標的物質と核酸アプタマーが結合して形成される複合体を単離する方法として、（１）疎水性相互作用を利用してタンパク質をニトロセルロースフィルターにトラップすることによって複合体を回収する方法、（２）ゲル電気泳動時のゲル移動度のシフトによって複合体を回収する方法、又は（３）標的物質を予め標識化しておき、その標識に基づいて標的物質をアフィ二ティ担体等に固定化し、これをDNAライブラリーと混合する方法が採用される。
　しかし、DNAの場合、RNAよりも疎水性が高いことから、ニトロセルロースフィルター上に非特異的に吸着してしまうため（１）の方法ではバックグラウンドが高くなってしまうという問題があった。また（２）の方法では、泳動可能なゲルサイズに制限があるため、大容量での標的物質-DNA複合体形成には不適であり、複数種類の異なる配列からなるDNAライブラリーは、電気泳動上でそのバンドが乱れやすく、ニトロセルロースフィルター法のようにトラップ後の複合体の洗浄操作ができない等の問題点があった。さらに、（３）の方法は、標的物質の固相結合面にDNAが結合しにくいため、結合能の高いアプタマーが得られないことや、標的物質と固相担体の双方に結合したDNAも得られてしまう結果、バックグラウンドが高くなる等の問題があった。
WO1991/019813 WO1994/008050 WO1996/040159 WO1992/014843
Lauhon C.T. and Szostak J.W., 1995, J. Am. Chem. Soc., 117: 1246-1257 Zhao X., et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34: 3755-3761 Fan X., et al., 2004, J. T. Lis, 101: 6934-6939 Jeong S., et al., 2010, Oligonucleotides, 20: 155-161 Cho M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 107: 15373-15378 Tok J., et al., Electrophoresis, 2010, 31: 2055-2062 Hamula C.L., et al., 2008, Anal. Chem. 80: 7812-7819 Bock L.C., et al., 1992 Nature, 355: 564-566
　本発明は、標的物質との特異性及び結合性が高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的、かつ簡便に製造する方法を開発し、提供することを目的とする。
　また、本発明は、非ワトソン・クリック型塩基対合を二本鎖領域内に含み、標的物質に特異的に、かつ強固に結合することのできる核酸分子を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、前記核酸分子を有効成分とする標的物質の機能阻害剤及びそれを含む医薬組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために、SELEX法を改変することで、DNA等の非特異的吸着を抑え、バックグラウンドを低減することのできる新たな核酸アプタマーの製造方法の開発に成功した。すなわち、従来のSELEX法では、標的物質を固相担体に先に結合し、これに一本鎖核酸ライブラリーを加えることによって、固相担体上の標的物質に結合した核酸アプタマーを回収する方法が採用されていたが、先に標的物質と一本鎖核酸ライブラリーを混合して一本鎖核酸と標的物質との複合体を形成させ、次いで、標的物質及び／又は固相担体に吸着している結合子に基づいて、標的物質を固相担体に固定化し、遊離状態の一本鎖核酸を洗浄することで、複合体を形成した一本鎖核酸のみを効率的に回収することに成功した。これによって、非特異的吸着に基づくバックグラウンドを低減すると共に、標的物質に極めて強固、かつ特異的に結合する核酸アプタマーを製造することが可能となった。本発明は、上記開発結果に基づくものであって、以下を提供する。
（１）核酸アプタマーの製造方法であって、一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる複合体形成工程、複合体形成工程後の溶液と固相担体を混合し、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して、複合体を固相担体に固定化する固定化工程、固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する回収工程、複合体中の一本鎖核酸を回収後、該一本鎖核酸を核酸増幅法によって増幅させる増幅工程、及び増幅工程で得られた二本鎖核酸を一本鎖化した後、分子内立体構造を形成させる一本鎖核酸調製工程を含む前記製造方法。
（２）一本鎖核酸調製工程で得られる一本鎖核酸を新たな一本鎖核酸ライブラリーに用いて、複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを複数回繰り返す反復工程をさらに含む、（１）に記載の製造方法。
（３）反復工程において複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを2～15回繰り返す、（２）に記載の製造方法。
（４）反復工程後に得られる一本鎖核酸の中から、連続する5～20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を二次構造中に一以上含み、かつ前記二本鎖領域内の1～10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる一本鎖核酸を選択する選択工程をさらに含む、（２）又は（３）に記載の製造方法。
（５）複合体形成工程において、溶液が標的物質との結合を前記一本鎖核酸との間で競合し合う競合物質を含む、（１）～（４）のいずれかに記載の製造方法。
（６）前記核酸がDNAである、（１）～（５）のいずれかに記載の製造方法。
（７）前記標的物質がペプチドである、（１）～（６）のいずれかに記載の製造方法。
（８）前記結合子がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである、（１）～（７）のいずれかに記載の製造方法。
（９）前記固相担体が親水性である、（１）～（８）のいずれかに記載の製造方法。
（１０）複合体形成工程及び／又は回収工程で使用する溶液又はバッファが界面活性剤を含む、（１）～（９）のいずれかに記載の製造方法。
（１１）標的物質に結合する核酸分子であって、連続する5～20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を一以上含み、かつ前記二本鎖領域内の1～10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる前記核酸分子。
（１２）前記核酸分子が一本鎖核酸又は二本鎖核酸からなる、（１１）に記載の核酸分子。
（１３）前記核酸分子がDNAである、（１２）に記載の核酸分子。
（１４）前記標的物質がペプチドである、（１１）～（１３）のいずれかに記載の核酸分子。
（１５）前記ペプチドが転写調節因子、シグナル伝達因子、タンパク質リガンド、又は受容体タンパク質である、（１４）に記載の核酸分子。
（１６）前記転写調節因子がNF-κBである、（１５）に記載の核酸分子。
（１７）前記NF-κBがp50であって、配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、（１６）に記載の核酸分子。
（１８）配列番号３及び４、配列番号５及び６、又は配列番号７及び８で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、（１７）に記載の核酸分子。
（１９）配列番号９～２１で示される塩基配列を含む、（１８）に記載の核酸分子。
（２０）（１１）～（１９）のいずれかに記載の核酸分子を有効成分とする標的物質の機能阻害剤。
（２１）（２０）に記載の標的物質機能阻害剤を含む医薬組成物。
（２２）（１１）～（１５）のいずれかに記載の核酸分子を用いて試料中に存在するその核酸分子が結合する標的物質を検出する方法。
（２３）（１６）～（１９）のいずれかに記載の核酸分子を用いて試料中のNF-κB p50を検出する方法。
（２４）表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス測定法、比濁法、比色法又は蛍光法を用いて検出する、（２２）又は（２３）に記載の方法。
（２５）（１６）～（１９）のいずれかに記載の核酸分子を一以上含むNF-κB p50検出用キット。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2011-177112号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明の核酸アプタマーの製造方法によれば、標的物質との特異性及び結合性が高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的、かつ簡便に製造することができる。
　本発明の非ワトソン・クリック型塩基対合を二本鎖領域内に含む核酸分子によれば、標的物質に特異的に、かつ強固に結合することのできる核酸分子を提供することができる。
本発明の核酸アプタマーの製造方法の工程フロー図である。図中、実線で囲んだ工程は必須工程であり、破線で囲んだ工程は任意工程であることを示す。 本発明の核酸アプタマーの製造方法で使用する一本鎖核酸ライブラリーを構成する一本鎖核酸の一次構造の概念図を示す。 NF-κB p50を標的物質とする本発明の核酸分子の二本鎖領域にみられる、コンセンサス配列（ａ）、及び本発明の製造方法で得られたDNAアプタマーに見られたコンセンサス配列の具体的塩基配列（（ｂ）～（ｄ））、各鎖の配列番号、及びそれらの塩基対合を示す。コンセンサス配列（ａ）の塩基配列中、「W-W」で記載した塩基対は、「a-t」又は「t-a」を示す。また、二本鎖領域の各塩基間における「｜」は、ワトソン・クリック型塩基対を、「○」、又は「●」は、それぞれ「a-g」若しくは「g-a」、又は「g-t」若しくは「t-g」からなる非ワトソン・クリック型塩基対を示す。 本発明の核酸アプタマー製造方法で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの塩基配列、クローン名、クローン数及び中央領域における塩基配列の配列番号を示す。最上部は、製造方法に用いた一本鎖核酸ライブラリーの配列である。各DNAアプタマーの塩基配列において、NF-κBの結合する天然型のコンセンサスDNA配列（配列番号２９）と類似した配列を黒枠で囲っている。下線は分子内で塩基対合によって二本鎖領域（ステム構造）を形成すると推測される領域を示す。太字は5R01または5R14または5R05の配列と比較して、その類似クローン配列中で変異している塩基を示す。ハイフン（-）は一塩基欠失変異を示す。 固相担体としての各種磁気ビーズへの一本鎖DNAの非特異的吸着をリアルタイムPCRにより検出した結果を示す。 図４に示したNF-κB p50結合性DNAアプタマーのうち3つのクローン（5R01、5R14、5R05）について、そのコンセンサス配列及び二次構造と、各クローンにおけるNF-κB p50との解離定数（Kd値）を示す。最上部は、公知のNF-κB p50結合コンセンサス配列である。白ボックスは、5′末端側プライマー結合領域を、黒ボックスは、3′末端側プライマー結合領域を示す。 本発明の方法で製造された３つのNF-κB p50結合性DNAアプタマークローン（5R01、5R14、5R05）とNF-κB p50との相互作用を検出した表面プラズモン共鳴（SPR：Surface Plasmon Resonance）のセンサグラムを示す。 図7で示した各NF-κB p50結合性DNAアプタマークローンから5′末端側のプライマー配列領域を含む配列を取り除いた一本鎖DNA変異体（5R01-68、5R14-68、5R05-68）及び非ワトソン・クリック型塩基対を除いた対照用のCont-68（公知のNF-κB p50結合コンセンサス配列を含む）の塩基配列及び二次構造を示す。 図８で示した３つのクローン及び対照用のCont-68と、NF-κB p50との相互作用を検出したSPRのセンサグラムを示す。 変異体5R01mut-68（A）、対照用の5R01-68（B）及びCont-68（C）のそれぞれについて、塩基配列及び二次構造、NF-κB p50との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラム並びにNF-κB p50との解離定数（Kd値）を示す。 5R01-68（A）、対照用の5R01mut-68（B）、対照用のTaq-59（C）のそれぞれについて、塩基配列及び二次構造、NF-κB p50、Taq DNAポリメラーゼ、及びAP-1との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラムを示す。
１．定義
　本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
　本明細書において、「核酸」又は「核酸分子」とは、原則としてヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドのみが連結したDNA、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドのみが連結したRNA、又はそれらの組み合わせのような自然界に存在する天然型核酸が該当する。また、本発明の核酸は、その一部又は全部が非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸も含むことができる。
　本明細書において、「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾されたヌクレオチドであって、前記天然型ヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有する、又は天然型ヌクレオチドを構成するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含む、自然界に存在しないヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、2′-デオキシウリジン、α－デオキシリボヌクレオシド、β-L-デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシドが挙げられる。さらに、前記糖修飾を有するヌクレオシドには、置換五単糖（2′-O-メチルリボース、2′-デオキシ-2′-フルオロリボース、3′-O-メチルリボース、1′，2′-デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖、置換六単糖及びアルファ－アノマーの糖修飾を有するヌクレオシドが含まれる。また、本発明の非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）であってもよい。「塩基類似体」には、例えば、2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、5位置換-2-オキソ（1H）-ピリジン-3-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-チアゾリル）プリン-9-イル基、2-アミノ-6-（2-オキサゾリル）プリン-9-イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。
　本明細書において、「非天然型核酸」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された核酸類似体をいう。例えば、ペプチド核酸（PNA：Peptide Nucleic Acid）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（PHONA）、架橋化核酸（BNA/LNA：Bridged Nucleic Acid/Locked Nucleic Acid）、モルホリノ核酸等が挙げられる。メチルホスホネート型DNA/RNA、ホスホロチオエート型DNA/RNA、ホスホルアミデート型DNA/RNA、2′-O-メチル型DNA/RNA等の化学修飾核酸や核酸類似体を含むこともできる。なお、本明細書においては、以下、便宜的に、上記非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸は、総括して「修飾核酸」と呼ぶ。
　本明細書において、「核酸アプタマー」とは、核酸で構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的物質と強固、かつ特異的に結合し、標的物質の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つリガンド分子をいう。核酸アプタマーは、一般に、RNAのみで構成されるRNAアプタマーとDNAのみで構成されるDNAアプタマーが知られているが、本明細書における核酸アプタマーを構成する核酸は、特に限定はしない。例えば、DNAアプタマー、RNAアプタマー、DNAとRNAの組み合わせで構成されるアプタマー、修飾核酸をそれらの一部に含むアプタマー、修飾核酸のみで構成されるアプタマーなどを含む。好ましくは、DNAアプタマーである。
　本明細書において「標的物質」とは、核酸分子、特に核酸アプタマーの結合対象となり得る物質をいう。標的物質の種類は、核酸分子が結合し得る生体物質であれば、特に制限はしない。例えば、ペプチド（オリゴペプチド、又はポリペプチド）、核酸、脂質、糖（糖鎖を含む）、又は低分子化合物が挙げられる。好ましくはペプチド、より好ましくはポリペプチド、すなわちタンパク質である。標的物質は、目的に応じて適宜選択することができる。通常は、生体物質が有する特有の生物学的機能を阻害若しくは抑制又は亢進させることを目的として選択される。特有の生物学的機能には、例えば、触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能、広くは細胞情報伝達を担うタンパク質-タンパク質間相互作用などの生体物質間相互作用が挙げられる。使用する標的物質は、天然由来の物質、化学合成物質、遺伝子組換え物質等いずれを用いてもよい。不純物が混在しない精製された単一物質を使用することが好ましい。また、標的物質がポリペプチドの場合、タグ配列を融合した融合ポリペプチドであってもよい。タグ配列としては、例えば、ヘキサヒスチジン（His）、FLAG、HA、myc又はGFPが挙げられる。
２．核酸アプタマーの製造方法
２－１．概要
　本発明の第１の実施形態は、核酸アプタマーの製造方法である。本発明によれば、一本鎖核酸の非特異的吸着によるバックグラウンドを低減し、標的物質に対して特異性の高い核酸アプタマー、特にDNAアプタマーを効率的に、かつ簡便に製造することができる。
２－２．構成
　本発明の工程フローを図１に示す。この図が示すように、本発明の製造方法は、複合体形成工程（１０１）、固定化工程（１０２）、回収工程（１０３）、増幅工程（１０４）及び一本鎖核酸調製工程（１０５）を必須の工程として含む。また、本発明の製造方法は、必要に応じて反復工程（１０６）及び／又は選択工程（１０７）を任意の工程として含むことができる。このうち、選択工程（１０７）は、増幅工程（１０４）と一本鎖核酸調製工程（１０５）間、及び／又は反復工程（１０６）後に行うことができる。以下、それぞれの工程について、具体的に説明をする。
（１）複合体形成工程
　「複合体形成工程」（１０１）とは、一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合し、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる工程である。
　本発明において、「一本鎖核酸ライブラリー」とは、核酸アプタマーの候補分子を包含する同一の及び／又は異なる複数の一本鎖核酸で構成されるプールをいう。ただし、一本鎖核酸の全部又は一部の塩基が互いに対合することによって形成される二本鎖核酸がその一部に含まれていてもよい。一本鎖核酸ライブラリーは、前述のように核酸アプタマー候補を包含するライブラリーであることから、ライブラリーを構成する各一本鎖核酸は、原則としてセルフフォールディングによる高次構造を形成している。
　当該ライブラリーを構成する一本鎖核酸の一次構造は、図２で示すように5′末端側及び3′末端側にプライマーが結合するプライマー結合領域（２０１、２０３）を有し、その間に位置する中央領域（２０２）を含む。プライマー領域の塩基長は、それぞれ15～40塩基である。また、中央領域の塩基長は、20～80塩基である。したがって、一本鎖核酸ライブラリーを構成する一本鎖核酸の塩基長は、50～160塩基の範囲内である。
　5′末端側及び3′末端側のプライマー結合領域（２０１、２０３）は、それぞれフォワードプライマー（２０４）に対応する塩基配列とリバースプライマー（２０５）に相補的な塩基配列を有する。それぞれのプライマーの塩基配列は、プライマーが分子内で二次構造を形成しない配列及び／又はフォワードプライマーとリバースプライマーどうしが連続する二本鎖領域を形成しない配列であること、Tm値が50～80℃、55～75℃、又は60～70℃の範囲内にあること、両プライマーのTm値が大きく異ならないこと、及び各プライマーのGC含量が40～60 ％、又は45～55 ％であることが好ましい。
　一本鎖核酸ライブラリーを構成する各一本鎖核酸の中央領域（２０２）の塩基配列は、ランダムな又は特定の塩基配列からなる。本発明の製造方法において初回に使用する場合、中央領域は、原則としてランダムであることが望ましい。前記特定の塩基配列とは、所定の選択圧を受けた一本鎖核酸における塩基配列をいう。ここで、「所定の選択圧を受けた一本鎖核酸」とは、例えば、本発明の製造方法が後述する反復工程（１０６）を含む場合に、2回目（2ラウンド目）以降に使用する一本鎖核酸ライブラリーの構成一本鎖核酸が該当する。
　一本鎖核酸ライブラリーの調製は、当該分野で公知の方法に従って適宜調製すればよい。例えば、本発明の方法が標的物質に結合し得る未知の核酸アプタマーを製造することを目的とする場合、初回に使用する一本鎖核酸ライブラリーは、多数の異なる一本鎖核酸の集団で構成されていることが好ましい。したがって、この場合には、例えば、核酸合成機を利用して一本鎖核酸ライブラリーを化学合成によって調製すればよい。例えば、一本鎖DNAライブラリーを調製するのであれば、DNAシンセサイザーを用いて、設計した塩基配列を合成プログラムに入力することで、目的のライブラリーを得ることができる。塩基配列を各メーカーに合成委託して、所望の一本鎖核酸ライブラリーを作製してもよい。また、本発明の製造方法が後述する反復工程（１０６）を含む場合であって、2ラウンド目以降に使用する一本鎖核酸ライブラリーについては、その反復工程（１０６）直前のラウンドで得られた一本鎖核酸に基づいて調製すればよい。
　なお、本発明の製造方法において、初回に使用する一本鎖核酸ライブラリーは、後述の一本鎖核酸調製工程（１０５）に記載する、一本鎖核酸の分子内高次構造形成処理を予め行っておくことが好ましい。また、後述の固定化工程（１０２）で使用する固相担体に非特異的に結合をする一本鎖核酸を低減するために、一本鎖核酸ライブラリーは、予め固相担体（二種以上の固相担体を用いるときには、それぞれの固相担体について）に非特異的に結合する一本鎖核酸の除去処理を行っておくことが好ましい。この処理は、一本鎖核酸ライブラリーを含む溶液中に固相化工程で使用する固相担体を適量加えて混合した後、その固相担体を回収、除去した後の溶液を一本鎖ライブラリーとして使用すれば足りる。
　本発明において、「複合体」とは、一本鎖核酸ライブラリーを構成する一本鎖核酸、具体的には、一本鎖核酸によって形成される核酸アプタマーの候補分子と標的物質とが結合して形成される核酸－標的物質複合体をいう。
　本工程で使用する溶液は、核酸と標的物質とが複合体を形成できる溶液であれば、その種類、性質は特に制限しない。好ましくは水又は水溶液である。水溶液の場合、pHは、5.0～9.0、好ましくは6.0～8.0、より好ましくは6.5～7.6の範囲であればよい。また、塩濃度は、最終濃度で20～500 mM、好ましくは50～300 mM、より好ましくは90～180 mMの範囲であればよい。好ましい水溶液は、バッファである。例えば、上記pH範囲が適応範囲であるpH緩衝液（例えば、リン酸バッファ、クエン酸－リン酸バッファ、トリス－塩酸バッファ又はHEPESバッファ）に、適当な塩（例えば、NaCl、CH3COOK）を最終塩濃度が上記範囲となるように添加したものである。具体的には、例えば、PBSバッファ（1.1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4、pH 7.4）が挙げられる。上記pHバッファの組成は、例えば、Sambrook, J. et. al.,(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Third Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の公知組成に基づいて、必要に応じて微調整すればよい。
　上記溶液は、必要に応じて、さらに還元剤や界面活性剤を含んでいてもよい。
　還元剤には、例えば、DTT（ジチオトレイトール）や2-メルカプトエタノールが挙げられる。溶液中の還元剤の最終濃度は、0.5～10 mM、好ましくは1～5 mMの範囲であればよい。
　また、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Nonidet P40（NO-40）、Triton X-100、Triton X-114、Brij-35、Brij-58、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、n-オクチル-β-グルコシド、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10が挙げられる。溶液中の界面活性剤の最終濃度は、容量/容量（V/V）で0.005 ％～0.1 ％、好ましくは0.01 ％～0.08 ％の範囲であればよい。
　さらに、本工程で使用する溶液は、競合物質を含んでいてもよい。本明細書において、「競合物質」とは、前記一本鎖核酸との間で標的物質との結合を競合し合う物質をいう。競合物質の種類は、一本鎖核酸と標的物質をめぐって競合し得る物質であれば、特に制限はしない。例えば、核酸、ペプチド、脂質、糖、又は低分子化合物が挙げられる。目的の核酸アプタマーである一本鎖核酸と同様の性質を有する物質、例えば、標的物質上の結合部位が同じであるような物質が好ましい。そのような物質としては、目的の一本鎖核酸に類似の塩基配列を有する核酸（一本鎖核酸及び／又は二本鎖核酸）が該当する。具体的には、例えば、標的物質が転写調節因子である場合、その転写調節因子が本来結合するゲノム配列上の塩基配列等が相当する。競合物質が前記核酸である場合、競合物質が標的物質と複合体を形成した場合であっても、一本鎖核酸のようなプライマー結合領域（２０１、２０３）を持たないようにデザインして調製しておくことによって、後述する増幅工程（１０４）で増幅されず、除去することができる。競合物質が溶液に含まれることで、より強固に標的物質に結合する核酸アプタマーを製造することが可能となる。
　複合体を形成させるためには、一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを、9:1～1:9、好ましくは5:5（容量：容量）で混合し、4～40℃、好ましくは15～37℃の範囲内で、5分～30分以上、例えば、10分～1時間程度、好ましくは20分～40分程度インキュベートすればよい。
　形成された複合体は、次の固定化工程（１０２）前に洗浄してもよい。溶液中で標的物質と複合体を形成しなかった遊離状態の一本鎖核酸を洗浄によって除去又は低減することで、遊離一本鎖核酸の非特異的結合によるバックグラウンドをより低減することができるからである。複合体の洗浄は、標的物質の種類、複合体の分子サイズや特性に基づいて、当該分野で公知の方法を用いて行えばよい。例えば、標的物質がタンパク質の場合、分子サイズにより核酸のみが通過する限外濾過膜を用いて複合体を遊離の一本鎖核酸から分離することができる。洗浄用バッファの組成は、上記複合体形成に用いたバッファと同様の組成でよい。また、複合体形成に用いたバッファと同様に、洗浄用バッファにも還元剤や界面活性剤を含んでいてもよい。還元剤や界面活性剤の濃度や組成は、複合体形成に用いたバッファと同様でよい。もっとも、この段階で、遊離一本鎖核酸を除去せずとも、又は完全に除去できなくとも、続く、固定化工程（１０２）や回収工程（１０３）においても洗浄操作により、残存する遊離一本鎖核酸を除去することができる。したがって、洗浄は、必要に応じて行えばよい。
（２）固定化工程
　「固定化工程」（１０２）とは、前工程後の溶液と固相担体を混合して、複合体を固相担体に固定化する工程である。
　本発明において「固相担体」とは、固体状態の担体であって、例えば、磁気ビーズ、高分子多糖支持体（例えば、セファロース、セファデックス、アガロース）、シリカ、ガラス、金属(例えば、金、白金、銀)、プラスチック、セラミックス、樹脂（天然又は合成樹脂）、又はそれらの組み合わせを含む。その材質は限定しないが、前工程後の溶液中に含まれる複合体を形成していない遊離状態の一本鎖核酸等による当該固相担体への非特異的な結合を回避又は低減するために、固相担体表面は、親水性であることが好ましい。この場合、固相担体自体が親水性であってもよいし、固相担体が疎水性でその表面を親水性コーティング処理したものであってもよい。担体の形状は、特に限定はしない。例えば、球体形状、略球体形状、平板形状、略平板形状、繊維形状などが挙げられる。ビーズのような略球体形状の粒子は、結合表面積が大きく、操作性も高いことから、本工程における固相担体の形状として、特に好ましい。
　本工程において、「固定化」とは、複合体を固相担体と連結させることをいう。複合体の固相担体への固定化は、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して行われる。
　本明細書において、「結合子」とは、標的物質と固相担体の連結を介在する分子をいう。結合子は、結果的に標的物質及び固相担体間の連結を介在することができれば、単一分子のみならず、二以上の連結する異なる分子も包含し得る。結合子の具体例としては、例えば、低分子化合物、アミノ酸若しくはペプチド、核酸若しくはその構成物（ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。ここでいう低分子化合物は、分子量約数百～数千の天然物又は化学合成物である。例えば、ビタミン類（ビオチンを含む）、テルペノイド（例えば、カロチノイド、ヘム、クロロフィル）、又はポリフェノール（例えば、フラボノイド、カテキン、タンニン）が該当する。ペプチドは、抗体（ヒト化抗体又は多価抗体のような組換え抗体を含む）又は酵素を包含するタンパク質又はその機能性断片を含む。核酸は、DNA、RNA、LNA（Locked Nucleic Acid：LNAは登録商標）若しくはPNA（Peptide Nucleic Acid）のような核酸類似物、又はそれらの断片を含む。本発明における好ましい結合子としては、例えば、ビオチン及びアビジン又はストレプトアビジンからなる結合子、前記ビオチンにさらにレクチンが結合したレクチン－ビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンからなる結合子、一以上の抗体のみからなる結合子、又は抗体及びプロテインA、G又はLからなる結合子が挙げられる。
　結合子は、標的物質、固相担体又はその両方に吸着されている。ここでいう「吸着」とは、結合子を標的物質又は固相担体に化学的吸着、物理的吸着及び／又は親和力によって固定化することをいう。ここでいう化学的吸着は、共有結合、イオン結合、水素結合のような化学結合を含み、また物理的吸着は、クーロン力、ファンデルワールス力、疎水性相互作用を含む。
　結合子が標的物質又は固相担体の一方にのみ吸着されている場合、その結合子は、結合子が吸着されていない相手側の物質を特異的に認識し、結合することができる。例えば、固相担体に結合子が吸着されている場合、その結合子は標的物質を特異的に認識し、結合する。より具体的には、例えば、抗体又は抗体と結合したプロテインAが結合子として固相担体に吸着されている場合、その抗体は、標的物質を特異的に認識し、結合する。それ故、標的物質と固相担体を溶液中で混合することによって、標的物質と固相担体とが結合子を介して連結される。複合体形成工程（１０１）後の標的物質は、その一部又は全部が核酸アプタマーの候補である一本鎖核酸と複合体を形成している。したがって、この工程により、複合体を固相担体に固定化することができる。
　結合子が標的物質及び固相担体のそれぞれに吸着されている場合、それらの結合子（便宜的に、以降、標的物質に吸着された結合子を「第１結合子」、固相担体に吸着された結合子を「第２結合子」という）は、互いに特異的に結合することができる。例えば、標的物質に第１結合子であるビオチンが、固相担体に第２結合子であるアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンが、それぞれ吸着されている場合、標的物質と固相担体を溶液中で混合することによって、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンが互いに特異的に結合する。その結果、標的物質と固相担体がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンの結合を介して連結される。また、標的物質に第１結合子である抗標的物質マウスモノクローナルIgG抗体が、固相担体に第２結合子であるウサギ抗マウスIgG抗体又はプロテインAが、それぞれ吸着されている場合、標的物質と固相担体を溶液中で混合することによって、抗標的物質マウスモノクローナルIgG抗体とウサギ抗マウスIgG抗体又はプロテインAが互いに特異的に結合する。その結果、標的物質と固相担体が抗体－抗体又は抗体－プロテインAの結合を介して連結される。結果的に、複合体を固相担体に固定化することができる。
　なお、本工程において結合子を介した固相担体へ複合体の固定化に直接寄与するのは複合体中の標的物質である。したがって、本工程では、複合体のみならず、複合体を形成していない遊離状態の標的物質も同時に固相担体に固定化され得る。しかし、一本鎖核酸を担持していない遊離状態の標的物質が固相担体に固定化されたとしても、一本鎖核酸の非特異的吸着の低減を目的の一つとする本発明への影響はないか又は非常に軽微であり、本発明の達成において、特段の阻害要因とはならない。
　標的物質や固相担体への結合子の吸着方法は、標的物質、固相担体及び／又は結合子の種類によって異なる。したがって、それぞれの種類や目的に応じて当該分野で公知の方法によって適宜吸着させればよい。ただし、標的物質に結合子を吸着させる場合には、前記複合体中の一本鎖核酸と標的物質との結合を阻害しない又は解離させない結合子及び／又は吸着方法であることが望ましい。また、標的物質及び固相担体のいずれに結合子を吸着させる場合であっても、本工程及び次の回収工程（１０３）における操作で容易に解離しない方法で吸着させることが好ましい。
　吸着方法の例として、標的物質や固相担体が官能基を有する場合には、例えば、その官能基と共有結合が可能な活性官能基（例えば、アルデヒド基、カルボキシル基、スルホ基、アミノ基、チオール基、シアノ基、ニトロ基）を有する結合子か、又はそのような活性官能基を導入した結合子を用いて、両官能基間の求核的付加反応、求核置換反応若しくは求電子置換反応のような化学反応による共有結合を介して、標的物質や固相担体に結合子を吸着させることができる。そのような共有結合が可能な官能基の組み合わせは、例えば、アミノ基とアルデヒド基、アミノ基とエステル基、チオール基とマレイミド基、アジド基とアセチレン基、アジド基とアミノ基、ヒドラジン基とケトン基、ヒドラジン基とアルデヒド基がある。これらの官能基どうしを化学反応により共有結合させる方法は、当該分野では周知の技術である。例えば、標的がタンパク質の場合、ビオチンを結合子としてタンパク質を吸着させる場合には、ビオチンにN－ヒドロキシスクシンイミドエステル（NHS）などを用いて活性エステル基を導入した後、タンパク質のアミノ基と当該エステル基との間でアミド結合を形成させることによって、タンパク質をビオチン吸着させることができる。標的物質にビオチンを吸着させる場合には、各種ビオチン化試薬がメーカーから市販されており、それらを利用してもよい。
　また、標的物質が抗原であり、かつ第１結合子がその抗原のエピトープを特異的に認識し、結合する抗体である場合、適当な溶液中で両者を接触させることによって、アフィニティー結合により第１結合子を標的物質に吸着させることができる。例えば、標的物質がポリペプチドであって、そのポリペプチドを特異的に認識できる抗体が存在する場合には、その抗体を第１結合子として該ポリペプチドに吸着させることができる。また、標的物質のポリペプチドを特異的に認識できる抗体が存在しない場合であっても、そのポリペプチドとタグ配列との融合ポリペプチドの合成が可能であれば、そのタグ配列を特異的に認識できる抗体を第１結合子として該ポリペプチドに吸着させることができる。
　結合子の吸着時期は、限定はしないが、標的物質に結合子を吸着させる場合には、複合体形成工程（１０１）後、本工程前であることが好ましい。複合体形成工程（１０１）前に標的物質に結合子を吸着させた場合、結合子の吸着によって標的物質と一本鎖核酸との結合が抑制又は阻害される可能性があるからである。したがって、標的物質に結合子を吸着させる場合は、複合体形成工程（１０１）後、本工程前の適当な時期、例えば、複合体形成工程（１０１）後に得られる複合体を含む溶液に対して、上記いずれかの吸着方法により標的物質に結合子を吸着させればよい。また、固相担体に結合子を吸着させる場合には、少なくとも本工程において複合体を含む溶液と固相担体を混合する前に吸着させておくことが好ましい。結合子が吸着した固相担体を用いることで標的物質の固相担体への固定化をより確実にすることができるからである。したがって、固相担体に結合子を吸着させる場合は、少なくとも本工程において複合体を含む溶液と固相担体を混合する前に、上記いずれかの吸着方法により固相担体に結合子を吸着させればよい。具体的には、例えば、標的物質であるタンパク質に第１結合子としてビオチンを、また固相担体である磁気ビーズに第２結合子としてストレプトアビジンを、それぞれ吸着させる場合、タンパク質へのビオチン吸着は、複合体形成工程（１０１）後得られる複合体を含む溶液に対して、例えば、市販のビオチン化試薬を用いて添付にプロトコルに従い吸着させればよい。その後、未吸着のビオチンは、例えば、限外濾過等の当該分野で公知の方法により洗浄、除去しておくことが好ましい。また、磁気ビーズへのストレプトアビジンの吸着は、複合体形成工程（１０１）とは独立に、予め磁気ビーズに公知の方法を用いてストレプトアビジンを吸着させておけばよい。例えば、磁気ビーズがTosyl基やエポキシ基を有する場合には、ストレプトアビジンと混合するだけで、そのままストレプトアビジンの1級アミノ基と共有結合により吸着させることができる。また、磁気ビーズがカルボキシル基を有する場合には、カルボジイミドによる活性化によってストレプトアビジンの1級アミノ基と共有結合により吸着させることができる。これらは当該分野で周知の方法である。また、予めストレプトアビジンが吸着された市販の磁気ビーズを購入して利用してもよい。
　標的物質の固相担体への固定化に供する結合子は、複数種であってもよい。例えば、標的物質に異なる複数の第１結合子を吸着させる場合である。具体的には、例えば、ビオチンと抗標的物質抗体を独立した第１結合子として一の標的物質に吸着させる場合が挙げられる。この場合、標的物質上における各第１結合子の認識部位及び／又は吸着部位が互いに重複及び／又は競合しないものを選択することが好ましい。それぞれの第１結合子に対応する第２結合子を吸着させた異なる固相担体を用いて、固定化工程（１０２）及び後述する回収工程（１０３）を実行することで、固相担体への非特異的吸着により混入する一本鎖核酸のバックグラウンドをより低減することができる。具体的には、前述のビオチンと抗標的物質抗体を第１結合子として吸着させた標的物質を用いる場合、ストレプトアビジンを第２結合子として吸着させた固相担体である磁気ビーズを用いて、固定化工程（１０２）及び回収工程（１０３）を行った後、プロテインGを第２結合子として吸着させた固相担体であるセファロースビーズを用いて、再び固定化工程（１０２）及び回収工程（１０３）を行う場合が挙げられる。
　なお、本工程では、複合体と共に一本鎖核酸と複合体を形成していない遊離状態の標的物質も固相担体に固定化される。しかし、後述する増幅工程（１０４）において、複合体から標的物質を除去して一本鎖核酸を回収する際に、このような複合体を形成していない標的物質も同時に除去されることから問題とはならない。
（３）回収工程
　「回収工程」（１０３）とは、前記固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する工程である。
　固定化工程（１０２）後の固相担体には、前述のように複合体が結合子を介して固定化されている。本工程では、固相担体の特性に基づいてこの複合体－固相担体を溶液から分離し、回収することを特徴とする。固相担体の特性とは、固相担体に特有の性質をいう。例えば、磁力、比重、蛍光、発光、親和力等が含まれる。
　具体的には、例えば、固相担体が磁気ビーズであれば、固定化工程（１０２）後の溶液中の複合体－固相担体を、磁石（磁気マグネット）を用いて回収した後、バッファを用いて洗浄し、標的物質や固相担体に非特異的に吸着した一本鎖核酸を洗浄、除去することで、回収することができる。また、固相担体が高分子多糖支持体、シリカ、金属（磁気ビーズを含む）又はガラスであれば、遠心によって複合体－固相担体を沈殿させ、上清を除去した後、バッファを用いて洗浄することで、同様に複合体－固相担体を回収することができる。さらに固相担体が蛍光物質を担持した高分子多糖支持体等であれば、FACSのような蛍光検出器によって、回収することができる。それぞれの具体的な選択方法は、当該分野で公知の技術を用いて固相担体の有する特性に基づいて適宜定めればよく、特に限定はしない。
　本工程で洗浄に用いるバッファには、複合体形成工程（１０１）で使用したバッファと同様の組成のバッファを使用することができる。さらに、バッファは、必要に応じて還元剤や界面活性剤を含んでいてもよい。使用する還元剤には、例えば、DTT（ジチオトレイトール）や2-メルカプトエタノールが挙げられる。溶液中の還元剤の最終濃度は、0.5～10 mM、1～5 mMの範囲であればよい。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤が好ましい。例えば、Nonidet P40（NO-40）、Triton X-100、Triton X-114、Brij-35、Brij-58、Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80、n-オクチル-β-グルコシド、MEGA-8、MEGA-9、MEGA-10が好ましい。溶液中の界面活性剤の最終濃度は、容量/容量（V/V）で0.005 ％～0.1 ％、0.01 ％～0.08 ％の範囲であればよい。
　洗浄は、上記バッファを用いて1～数回行えばよい。2～3回行うことが好ましい。洗浄温度や洗浄時間は、特に限定はしないが、15～50℃、又は20～40℃で、10分～1時間行えばよい。
（４）増幅工程
　「増幅工程」（１０４）とは、複合体中の一本鎖核酸を回収後、核酸増幅法によって増幅させる工程である。
　本工程では、まず、必要に応じて回収工程（１０３）で回収された複合体－固相担体から複合体の溶出を行う。溶出方法は、結合子の種類によって異なる。例えば、結合子が抗体である場合には複合体－固相担体を酸処理等によって解離させた後、必要に応じてアルカリを加え、中和処理を行うことによって、複合体－固相担体から複合体を溶出することができる。また、結合子がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである場合、7 M以上の尿素及び／又は2 M以上のβ-メルカプトエタノールを含む溶液中で加熱処理することによって、ビオチンとアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンの結合を解離させ、複合体を溶出することができる。さらに、標的物質が糖鎖修飾された物質で、結合子がレクチンである場合、グルコース等の糖を添加することによって複合体を溶出することができる。これらの方法は、当該分野で公知の方法に従い、適宜行えばよい。
　複合体一本鎖核酸を回収する方法は、複合体を形成する標的物質の種類によって異なる。したがって、その標的物質と核酸からなる複合体から核酸を回収する当該分野で公知の方法に基づいて行えばよい。例えば、標的物質がタンパク質のようなペプチドの場合、アルカリ法やフェノール／クロロホルム法のようなタンパク質変性法によってタンパク質を凝固、除去することによって、目的の一本鎖核酸を回収することができる。また、標的物質が脂質又は低分子化合物の場合、例えば、溶出バッファを加えた後、加熱処理をして核酸の二本鎖構造を破壊する、又は溶出バッファにキレート剤を添加した状態、若しくは溶出バッファのpHを結合バッファと変えた状態で加熱処理をして核酸の二本鎖構造を破壊することによって、標的物質と核酸との結合を解離させた後、アルコール沈殿法等によって解離した一本鎖核酸を回収することができる。また、標的物質を固相担体に結合子で固定化する際に、結合子中に光照射や還元剤などで切断可能なリンカーを加えておくことで、標的物質を結合した核酸とともに固相担体から切り出し、上述の操作によってアルコール沈殿法等により核酸分子を回収することもできる。また、前述のように、固定化工程（１０２）で複合体と共に固相担体に固定化された、複合体を形成していない標的物質も、本工程で除去することができる。
　続いて、回収後の一本鎖核酸を、当該分野で公知の核酸増幅法によって増幅させる。「核酸増幅法」とは、プライマーとポリメラーゼ等の酵素を用いて鋳型となる核酸の特定領域を増幅する方法をいう。本工程で用いる核酸増幅法は、当該分野で公知のいずれの方法を使用すればよい。例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)法、ICAN（等温遺伝子増幅）法等が挙げられる。好ましくはPCR法である。
　前記反応で用いられるポリメラーゼは、使用する核酸増幅方法によって適宜定められるが、通常は、DNAポリメラーゼ、特に熱耐性DNAポリメラーゼを使用する。このような耐熱性核酸ポリメラーゼは、TaKaRa社、New England Biolab社、Roche社、ライフテクノロジー社、Roche社、Promega社等の各メーカーから様々な種類のものが市販されており、それらを利用することもできる。一般に、核酸増幅法で使用されるポリメラーゼには、フィデリティー（fidelity）の高いものが好まれるが、本工程で使用するポリメラーゼは、必ずしもフィデリティーが高い必要はなく、Taqポリメラーゼのように、しばしばエラーが導入され得るポリメラーゼであってもよい。
　核酸増幅法の反応条件は、増幅させる塩基配列の長さ、鋳型用核酸、すなわち回収した一本鎖核酸の量、プライマーのTm値、使用するポリメラーゼの至適反応温度及び至適pH等を勘案して決定すればよい。例えば、PCR法であれば、前記一本鎖核酸ライブラリーの各一本鎖核酸を構成する5′末端側プライマー結合領域（２０１）に対応する配列をフォワードプライマー（２０４）に、3′末端側プライマー結合領域（２０３）に相補的な配列をリバースプライマー（２０５）に用いる。このとき、リバースプライマーを標識子で標識しておくことによって、その標識子に基づいて、増幅反応後の反応溶液から増幅産物である二本鎖核酸を選択的に分離、精製したり、その後、その二本鎖核酸のうち目的の一本鎖核酸に相補する他方の一本鎖核酸をその標識子に基づいて分離、除去することができるので便利である。市販のポリメラーゼを用いる場合には、添付のバッファに、塩（MgCl2等）及びdNTP(N=A、G、C又はT)を適当な濃度で加えて反応液を調製すればよい。PCRを変性、アニーリング及び伸長の3ステップで行う場合、各ステップの温度と反応時間は、例えば、熱変性ステップを90℃～98℃で30秒～1分間、アニーリングステップを50℃～60℃で30秒～1分間、伸長ステップを70℃～75℃で40秒～2分間程度行えばよい。また、サイクル数は、通常、10サイクル～40サイクルでよい。好ましくは15サイクルから20サイクルである。
　本工程の終了後、一本鎖調製工程までの間に、得られた増幅核酸を必要に応じて精製してもよい。精製によって未反応のデオキシヌクレオチド及びプライマー、又はポリメラーゼ等を除去することができる。精製方法は、当該分野で公知のいずれの方法であってもよい。例えば、エタノール沈殿法やスピン式ゲル濾過カラムを用いた精製方法が挙げられる。後者は、迅速、かつ簡便に核酸を精製することができるので好ましい。このようなカラムは、バイオ関連事業の各社から市販されており、それらを利用することもできる。
（５）一本鎖核酸調製工程
　「一本鎖核酸調製工程」（１０５）とは、増幅工程（１０４）で得られた二本鎖核酸を一本鎖化する工程である。
　増幅工程（１０４）後の核酸は、通常、標的物質と特異的に結合する一本鎖核酸からなる核酸アプタマーではなく、それに相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と塩基対合した二本鎖核酸の状態で存在している。そこで、本工程では、その二本鎖核酸を一本鎖に調製した後、目的の一本鎖核酸において分子内高次構造を形成させて、核酸アプタマーの調製を行う。
　二本鎖核酸の一本鎖化は、一般に熱変性によって行われる。熱変性は、60～90℃の範囲で行えばよい。このとき変性時に使用する溶液中に1～7 Mの尿素が含まれていてもよい。その後、変性ゲルを用いて電気泳動を行い、目的のサイズのバンドをゲルから溶出して精製する等の当該分野で公知の方法によって二本鎖の一本鎖化とその精製を行うことができる。
　なお、本工程において調製される一本鎖核酸には、目的の核酸アプタマーを形成し得るものと、目的とする一本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する対となるものが混在する。本工程では、一本鎖化した核酸に分子内高次構造を形成させる前に、そのような相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸を除去し、目的の核酸アプタマーを形成する一本鎖核酸のみを分離してもよい。このような目的の塩基配列を有する一方の一本鎖核酸のみを分離するには、例えば、前述のように、リバースプライマーを標識子で標識しておくことによって、達成できる。この方法を用いれば、標識子に基づいて、増幅反応後の反応溶液から増幅産物である二本鎖核酸を選択的に分離、精製することも可能となる。具体的には、例えば、ビオチンで標識したリバースプライマーを用いる場合が挙げられる。PCRを行った後、エタノール沈殿法等によって反応液中の増幅された二本鎖核酸を回収した後、その懸濁液にストレプトアビジンを添加して、ビオチン－ストレプトアビジン複合体を形成させ、これによって二本鎖核酸を分離、精製する。その後、精製された二本鎖核酸を変性させて、一本鎖化し、変性ゲル電気泳動でその両鎖の移動度の違いによってフラクション化して、目的の一本鎖核酸のみをゲルより分離、精製することができる。
　調製した一本鎖核酸に分子内高次構造を形成させるためには、例えば、一本鎖核酸に加熱・冷却処理を行えばよい。具体例を挙げると、一本鎖核酸を複合体形成工程（１０１）で使用したバッファ（例えば、PBSバッファ）に溶解し80～98℃、好ましくは85～95℃で30秒～5分、好ましくは30秒～3分熱変性させた後、室温等に放置して徐冷するか又は段階冷却することによって分子内高次構造を形成させればよい。段階冷却は、例えば、熱変性後、一旦50～70℃で1分～20分程度冷却させた後、さらに温度を15～35℃に下げて冷却すればよい。
　本工程によって、標的物質に特異的に結合する核酸アプタマーを製造することができる。得られた核酸アプタマーは、当該分野で公知の通常の核酸クローニング技術を用いて、その塩基配列を同定することができる。例えば、得られた核酸アプタマーを直鎖状に変性させ、適当なクローニングベクター内に挿入後、サイクルシークエンス反応等によって、塩基配列を決定することができる。これらは、公知の方法であり、例えば、Life Technologies社のBig Dye Terminator Cycle Sequencing Kit等の市販のキットを用いて、シーケンサーを用いて実施することができる。
（６）反復工程
　「反復工程」（１０６）とは、複合体形成工程（１０１）から一本鎖核酸調製工程（１０５）まで（本明細書では、以降、これらの一連の工程を「ラウンド」と称する）を複数回繰り返す工程である。
　本工程は、前述のように、任意工程である。しかし、一本鎖核酸調製工程（１０５）後に、標的物質との特異性がより高い核酸アプタマーを絞り込むためには、本工程を2ラウンド以上繰り返すことが好ましい。具体的には、例えば、2～15ラウンド、2～8ラウンド、又は2～5ラウンドである。
　各ラウンドにおいて、複合体形成工程（１０１）で使用する一本鎖核酸ライブラリーは、初回のラウンドを除き、原則として直前のラウンドの一本鎖核酸調製工程（１０５）で得られる一本鎖核酸のプールを新たな一本鎖核酸ライブラリーとして用いる。初回のラウンドは、前述のように多数の異なる一本鎖核酸の集団で構成されていることが好ましいことから、原則として、化学合成によって調製した一本鎖核酸ライブラリーを用いることが望ましい。各ラウンドで使用する一本鎖核酸ライブラリーには、必要に応じて、各ラウンドにおけるそれぞれの工程、すなわち複合体形成工程（１０１）から一本鎖核酸調製工程（１０５）の諸条件は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。ラウンドの条件が異なる場合として、例えば、各ラウンドで使用する溶液やバッファの組成を変更することが挙げられる。具体的には、ラウンド前半のバッファは、洗浄条件をマイルドにして、核酸アプタマー候補をより多く獲得し、ラウンド後半のバッファには、3 M程度の尿素を混和して、洗浄条件を厳しくすることで標的物質により強固に結合する一本鎖核酸のみを分離することができる。さらに、複合体形成工程（１０１）における標的物質と一本鎖核酸ライブラリーの濃度を各ラウンドで変更することもできる。例えば、ラウンドを重ねる毎に標的物質と一本鎖核酸ライブラリーの濃度を低くして、複合体形成条件をより厳しくすることによって、標的物質により強固に結合する一本鎖核酸のみを分離することができる。
（７）選択工程
　「選択工程」（１０７）とは、反復工程（１０６）後に得られる一本鎖核酸から、所定の構造を有する一本鎖核酸分子を選択する工程である。本工程は、任意の工程であり、後述するように、標的物質とより強固に結合する核酸アプタマーを製造することを目的とする場合に選択的に行うことができる。
　ここでいう所定の構造とは、一本鎖核酸分子が核酸アプタマーとして二次構造を形成した場合、その予想される二次構造が二本鎖領域を一以上含み、かつその少なくとも一つの二本鎖領域内に非ワトソン・クリック型（non-Watson-Crick型）塩基対が含まれる構造をいう。
　本発明者らは、本発明の製造方法により得られる核酸アプタマーにおいて、標的物質との結合領域と予測される二本鎖領域内に非ワトソン・クリック型塩基対を有するものが、その標的物質と極めて強固に結合することを見出した。本工程は、その知見に基づくものである。
　本工程は、反復工程（１０６）後、すなわちラウンドの最終工程である一本鎖核酸調製工程（１０５）後に得られたそれぞれの一本鎖核酸について、前述の一本鎖核酸調製工程（１０５）に記載した方法を用いて塩基配列を決定し、M-fold（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold/）等のソフトウェアを用いて決定した塩基配列から二次構造を予測する。その中から、二次構造内に、連続する5～20塩基、7～18塩基、8～17塩基、又は10～15塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域、すなわちステム領域を一以上含み、かつその二本鎖領域の少なくとも一つにおいて1～5塩基対、1～7塩基対、1～8塩基対、又は1～10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる一本鎖核酸配列を選択する。
　本明細書において、「非ワトソン・クリック型塩基対」とは、グアニン（g）、アデニン（a）、シトシン（c）、チミン（t）及びウラシル（u）の各塩基において、グアニンとシトシン（g-c）、アデニンとチミン（a-t）又はウラシル（a-u）以外の塩基対をいう。また、通常の二本鎖DNAで形成される塩基対とは異なる水素結合様式の塩基対も含まれる（NagaswamyU., et al., Nucl. Acid Res. 2000, 28: 375-376）。好ましくは、グアニンとアデニン（g-a）若しくはチミン（g-t）、又はグアニンとグアニン(g-g)、アデニンとアデニン(a-a)等からなる塩基対である。
　本工程は、最終ラウンド終了後の他、各ラウンド後、次のラウンド開始前までの間に行うこともできる。後者の場合、本工程で得られた所定の構造を有する一本鎖核酸を次のラウンドの一本鎖核酸ライブラリーとして使用して、一ラウンド内の各工程の諸条件を厳しくすることで、より一層強固に標的物質に結合する核酸アプタマーを製造することができる。
２－３．効果
　本発明の製造方法によれば、従来法の核酸アプタマー、特にDNAアプタマーの製造方法と比較して、特異性が高く、かつ100～1000倍以上強い結合能を有する核酸アプタマーを効率的に製造することができる。
３．核酸分子
　本発明の第２の実施形態は、標的物質に結合する核酸分子である。
３－１．構成
　本発明の核酸分子は、その分子内に、二本鎖領域を一以上含み、かつ前記二本鎖領域の少なくとも一つが非ワトソン・クリック型塩基対を含むことを特徴とする。
　本発明の核酸分子は、前述の「１．定義」の項で説明したように、原則としてDNA、RNA、又はそれらの組み合わせのような天然型核酸が該当する。また、本発明の核酸は、その一部又は全部が非天然型ヌクレオチド又は非天然型核酸を含んでいてもよい。好ましい本発明の核酸形態は、DNAである。
　「二本鎖領域」とは、核酸分子を構成するヌクレオチド鎖間において塩基対が連続して形成された領域をいう。連続する塩基対の長さは、5～20塩基、7～18塩基、8～17塩基、又は10～15塩基である。本発明の核酸分子は、二本鎖領域を二以上含む場合、各二本鎖領域は、同一又は異なる塩基対から構成される。異なる塩基対から構成される場合、各二本鎖領域の長さは、同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、それぞれの二本鎖領域は、互いに塩基対を形成しない領域（例えば、ミスマッチ部位、ギャップ、バルジ構造、又はインターナルループ構造を含む）によって分断されていてもよいし、連続していてもよい。
　「非ワトソン・クリック型塩基対」とは、前述のように、グアニン、アデニン、シトシン、チミン及びウラシルの各塩基において、グアニンとシトシン、アデニンとチミン又はウラシル以外の塩基対をいう。好ましくは、グアニンとアデニン若しくはチミン、又はグアニンとグアニン(g-g)、アデニンとアデニン(a-a)等からなる塩基対である。
　非ワトソン・クリック型塩基対は、本発明の核酸分子内に存在する前記二本鎖領域の少なくとも一つに含まれていればよい。一つの二本鎖核酸領域内に含まれる非ワトソン・クリック型塩基対は、1～5塩基対、1～7塩基対、1～8塩基対、又は1～10塩基対である。一つの二本鎖核酸領域内における非ワトソン・クリック型塩基対の位置は、特に限定はしない。
　本発明の核酸分子において非ワトソン・クリック型塩基対を含む二本鎖領域は、標的物質との結合に直接関与する領域である。したがって、その塩基配列は、標的物質によって異なる。標的物質に結合することが既に知られている二本鎖領域の塩基配列に基づき、その一部に非ワトソン・クリック型塩基対を導入した塩基配列であればよい。例えば、特定の標的物質に結合する本発明の核酸分子は、その標的物質に結合する公知のデコイDNA、RNAアプタマー、又はDNAアプタマーにおいて標的物質結合部位と予想される二本鎖領域の塩基配列に基づき、その両鎖に非ワトソン・クリック型塩基対を導入したものであればよい。
　本発明の核酸分子は、標的物質に結合する。「標的物質」とは、前述の「１．定義」の項で説明したように、核酸分子の結合対象となり得る生体物質をいう。標的物質の種類は、特に制限はしないが、ペプチド、核酸、脂質、糖、又は低分子化合物が挙げられる。好ましくはペプチド、より好ましくはポリペプチド、すなわちタンパク質である。特に、特定の塩基配列を有する核酸と結合する転写調節因子、シグナル伝達因子、タンパク質リガンド（サイトカイン、ケモカインを含む）、又は受容体タンパク質は、本発明の核酸分子の標的物質として好ましい。
　転写調節因子の具体例としては、例えば、NF-κB、SP1、E2F、AP-1、STAT-1等が挙げられる。
　シグナル伝達因子の具体例としては、例えば、Raf、Cytohesin 1、Phospholipase A２、HER3等が挙げられる。
　タンパク質リガンドの具体例としては、例えば、VEGF、EGF、NGF、HGF、KGF、bFGF、PDGF、IL-2、-3、-6、-8、-10、-20、IFN-α、-β、-γ、TGF-β、BMP、Activin、TNF-α、Wnt、RANKLが挙げられる。
　本発明の核酸分子は、上記標的物質に結合することによって、標的物質が有する特有の生物学的機能を阻害若しくは抑制又は亢進することができる。通常は、機能阻害又は抑制作用を有する。
　本発明の核酸分子は、二本鎖核酸及び／又は一本鎖核酸からなる。以下、二本鎖核酸及び一本鎖核酸断片のそれぞれについて、具体的に説明をする。
＜二本鎖核酸＞
　二本鎖核酸からなる場合、各ヌクレオチド鎖の長さは、限定はしないが、例えば、5～50-mer、7～40-mer、又は10～35-merの範囲が好ましい。塩基対合する各鎖の長さは、同じである必要はない。例えば、一方のヌクレオチド鎖が他方のヌクレオチド鎖に対して7-mer以上長い場合が挙げられる。この場合、長い側のヌクレオチド鎖は、他方のヌクレオチド鎖と対応しない一本鎖領域内で分子内アニールによってヘアピン構造を形成してもよい。このヘアピン構造内に形成されたステム領域も本発明の二本鎖領域に包含される。
　また、二本鎖核酸を構成する各ヌクレオチド鎖は、二本鎖領域の5′側及び／又は3′側に互いに塩基対合を形成しない一本鎖領域を含むことができる。二本鎖核酸は、これらの一本鎖領域がリンカー核酸のようにループ構造を形成して二本鎖核酸の双方のヌクレオチド鎖を連結したダンベル型の閉環状核酸も包含する。このようなダンベル型核酸は、直鎖状の二本鎖核酸に比べてヌクレアーゼ等の核酸分解酵素に対する分解耐性能を有しており、本発明の核酸分子として好ましい。
　また、二本鎖核酸を構成する各ヌクレオチド鎖の一方又は両方は、5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、国際出願番号PCT/JP2011/059619に記載のヘアピン型DNAを含むこともできる。このヘアピン型DNAは、具体的には、第１核酸領域、第2核酸領域及び第3核酸領域の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5′末端側から3′末端側に向かって順番に連結された構造を有する。
　「第1核酸領域」とは、2～5-merの任意ヌクレオチドからなる核酸領域である。本核酸領域の塩基は、グアニン、アデニン、シトシン又はチミンのいずれであってもよいが、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、gc含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がg及び／又はcで構成されていることがもっとも好ましい。
　「第2核酸領域」とは、5′‐gna‐3′又は5′‐gnna‐3′の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各nは、独立に、天然型塩基（g、a、t、若しくはc）、塩基類似体又は修飾塩基のいずれかからなる。
　「第3核酸領域」とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム構造を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ構造をそれぞれ構成し、全体として、例えば、配列番号３７又は３８の塩基配列を有する7～14-merのヌクレオチドからなるヘアピン型DNAが形成される。
　このようなヘアピン型DNAを、二本鎖核酸の一方又は両方の3′末端にホスホジエステル結合によって連結することによって、二本鎖核酸の核酸分解酵素に対する分解耐性を向上させて生体内での安定性を高めることが可能となる。
＜一本鎖核酸＞
　本発明の核酸分子を構成する一本鎖核酸は、分子内アニールによって二次構造を形成し、分子内に一以上のステム構造及び一以上のループ構造を有する。前記二本鎖領域は、このステム構造内に含まれる。さらに、ステム構造は、一以上のミスマッチ部位及び／又は一以上のバルジ構造を含んでいてもよい。
　一本鎖核酸のヌクレオチド鎖の長さは、分子内に少なくとも一つの二本鎖領域を含み得る長さを有していれば、特に限定はしない。例えば、15～100-mer、20～90-mer、又は30～80-merの範囲が好ましい。
　また、一本鎖核酸もその5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、前述のヘアピン型DNAを含むことができる。
　本発明の核酸分子が一本鎖核酸の場合、好適な形態として核酸アプタマーが挙げられる。DNAアプタマーは、核酸の安定性の面から特に好ましい。
＜二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNA＞
　本発明の核酸分子が二本鎖RNA又は一本鎖RNA（例えば、RNAアプタマー）からなる場合、それらをコードするDNAも利用することができる。そのようなDNAの塩基配列は、例えば、二本鎖RNA又は一本鎖RNAを構成する塩基配列中のウラシル（U）をチミン（T）に置換した塩基配列となる。
　二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNAは、例えば、RNAアプタマーをコードするDNAであれば、そのRNAアプタマーを鋳型として、そのアプタマーの3′末端塩基配列に全部又は一部が相補するプラマーを用いて、逆転写反応を行うことによって調製することができる。逆転写反応は、当該分野で公知の技術を使用すればよい。例えば、上述のMolecular Cloningに記載の方法に準じて行うことができる。また、本発明のDNAは、二本鎖RNA及び一本鎖RNAの塩基配列情報に基づいて、当技術分野で公知の化学合成法によって製造することもできる。
　さらに、前記二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNAは、それを発現可能な状態で発現ベクターに挿入されていてもよい。「発現可能な状態」とは、発現ベクター内のプロモーターの下流に二本鎖RNA又は一本鎖RNAをコードするDNAを該当するRNAが発現可能なように連結することをいう。本発明の発現ベクターには、宿主内で自律的に増殖し得るプラスミド又はウイルスを使用することができる。そのようなプラスミドとしては、例えば、宿主が大腸菌（Escherichia coli）の場合、pET、pGEX6p、pMAL、pREST等が、宿主が枯草菌（Bacillus subtilis）の場合、pUB110、pTP5等が、宿主が酵母の場合、YEp13、YEp24、YCp50等が、宿主が植物の場合、pBI系、pRI系又はpGW系のバイナリーベクター等が挙げられる。また、ウイルスとしては、宿主が大腸菌の場合、λファージ（λgt11、λZAP等）が、宿主が哺乳動物の場合、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等が、宿主が昆虫の場合、バキュロウイルス等が、宿主が植物の場合、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）、インゲンマメゴールデンモザイクウイルス（BGMV）、タバコモザイクウイルス（TMV）等が挙げられる。
３－２．NF-κBを標的物質とする核酸分子の具体例
　以下にNF-κBを標的物質とする本発明の核酸分子を具体例を挙げて説明する。
　NF-κBは、免疫反応において主要な役割を担う転写因子の一つであり、炎症反応、細胞増殖、及びアポトーシス等に関与することから、創薬ターゲットとして注目され、その機能を阻害し得る核酸分子の開発が世界各国で行われている。例えば、NF-κBが結合する共通配列を有する二本鎖DNA断片を含むデコイDNA（WO/1996/035430；Miyake T., et al., Mol. Ther., 2001, 19: 181-187；Kim K.H., et al., Exp. Mol. Pathol., 2008, 86: 114-120；Isomura I., A. Morita, Microbiol. Immunol., 2006, 50: 559-563；Mann M.J., Invest., 2000, 106: 1071-1075）やRNAアプタマー（Lebruska L.L. and Maher III L.J., Biochemistry, 1999, 38:3168-3174；N.J. Reiter, L.J. Maher III, S.E. Butcher, Nucleic Acids Res., 2008, 36:1227-1236；Chan R., et al., Nucleic Acids Res., 2006, 34, e36；S.E. Wurster, L.J. Maher III, RNA, 2008, 14:1037-1047）が挙げられる。
　しかし、これらの核酸分子は、NF-κBに対する結合能（解離定数、Kd）が、どちらも数nM程度であった。これに対して、本発明の核酸分子は、NF-κBに対する結合能がpMオーダーであり、既知の核酸分子よりも100倍以上高い結合能を有する。
　NF-κBのp50を標的物質とする本発明の核酸分子は、コンセンサス配列として図３（ａ）に示す配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含むことを特徴とする。塩基配列中、「W-W」で記載した塩基対は、「a-t」又は「t-a」を示す。また、二本鎖領域の各塩基間における「｜」は、ワトソン・クリック型塩基対を、「○」又は「●」は、それぞれ「a-g」若しくは「g-a」、又は「g-t」若しくは「t-g」からなる非ワトソン・クリック型塩基対を示す。この図で示すように、NF-κBのp50を標的物質とする本発明の核酸分子は、連続する11塩基が互いに塩基対合するコンセンサス配列において、4塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなることを特徴とする。このようなコンセンサス配列に含まれる具体的な塩基配列としては、例えば、図３（ｂ）に示す配列番号３及び４で示される塩基配列、図３（ｃ）に示す配列番号５及び６で示される塩基配列、そして図３（ｄ）に示す配列番号７及び８で示される塩基配列が挙げられる。
　前述のように、NF-κBのp50を標的物質とする本発明の核酸分子は、上記コンセンサス配列からなる二本鎖領域を一以上含んでいれば、二本鎖核酸及び／又は一本鎖核酸のいずれの形態であってもよい。例えば、二本鎖核酸の場合、上記コンセンサス配列の5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、上記ヘアピン型DNAを含んでいてもよい。また、一本鎖核酸の場合、DNAアプタマーが好適な例として挙げられる。例えば、前記図３（ｂ）に示す配列番号３及び４で示される塩基配列からなる二本鎖領域を分子内に有する、図４の配列番号９～１１で示される中央領域を含むDNAアプタマー、具体的には、例えば、クローン5R01、5R09及び5R43、図３（ｃ）に示す配列番号５及び６で示される塩基配列からなる二本鎖領域を分子内に有する、図４の配列番号１２～１８で示される中央領域を含むDNAアプタマー、具体的には、例えば、クローン5R14、5R13、5R34、5R10、5R26、5R27及び5R11、及び図３（ｄ）に示す配列番号７及び８で示される塩基配列からなる二本鎖領域を分子内に有する、図４の配列番号１９～２１で示される中央領域を含むDNAアプタマー、具体的には、例えば、クローン5R05、5R28及び5R19が挙げられる。
３－３．効果
　これらのDNAアプタマーは、下記実施例で示すように、従来知られていたNF-κB p50を標的物質とするRNAアプタマーやDNAアプタマーよりも100～1000倍以上強い結合能を有する。このように、本発明の核酸分子によれば、核酸分子内に含まれる少なくとも一つの二本鎖領域が非ワトソン・クリック型塩基対を有することで、従来の核酸アプタマーの標的物質に対する結合能を飛躍的に向上させることができる。
４．標的物質機能阻害剤
　本発明の第３の実施形態は、標的物質の機能阻害剤である。
４－１．構成
　本発明の標的物質機能阻害剤は、前記実施形態２の核酸分子を有効成分とする。
　本明細書において「標的物質機能阻害」とは、標的物質が有する、触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能のような生物学的機能を、有効成分である核酸分子の結合によって阻害又は抑制することをいう。
　本発明の標的物質機能阻害剤における前記核酸分子の含有量は、製薬上有効な量であればよい。
　本明細書において「製薬上有効な量」とは、標的物質機能阻害剤の有効成分である第２実施形態の核酸分子がその薬効である標的物質機能阻害を発揮する上で必要な用量で、かつ投与する生体等に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量を言う。その具体的な量は、標的物質の種類、核酸分子の有する抑制活性、使用する剤形、また、生体への投与を目的とする場合には、被検体であるその生体の情報及び投与経路によって異なる。生体への投与の具体例として、ヒトに投与する場合には、製薬上有効な量の範囲及び好適な投与経路は、一般に細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータに基づいて策定される。最終的な投与量は、個々の被験者に応じて医師の判断により決定され、調整される。その際に、勘案される被験者の情報には、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、体重、性別、食生活、薬剤感受性及び治療に対する耐性等が含まれる。
　標的物質機能阻害剤の一投与単位あたりにおける本発明の核酸分子の含有量は、例えば、他の医薬の併用を必要としないヒト成人男子（体重60 kg）に対して、前述のNF-κB p50を標的物質とする本発明の核酸分子を注射液によって投与する場合、注射液一投与単位あたり約0．01 ％(w/v)～約20 ％(w/v)、好ましくは約0.1 ％(w/v)～約10 ％(w/v)で含んでいればよい。本発明の医薬組成物の薬理効果を得る上で、本発明の核酸の大量投与が必要な場合、被検体に対する負担軽減のために数回に分割して投与することもできる。
５．医薬組成物
　本発明の第４の実施形態は、医薬組成物である。
５－１．構成
　本発明の医薬組成物は、前記実施形態３に記載の標的物質機能抑制剤を少なくとも一つ含有する。また、本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する医薬組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、前記標的物質機能抑制剤の効果を維持するために、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、潤滑沢剤又は界面活性剤が挙げられる。
　「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、或いはそれらの組み合わせが挙げられる。
　「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
　「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
　「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
　「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
　このような担体は、必要に応じて適宜使用すればよい。本発明の薬物組成物は、上記の添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、安定剤、吸収促進剤（例えば、第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等）、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、抗酸化剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤等を含むこともできる。
　「界面活性剤」としては、例えば、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール／エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが該当する。
　本実施形態の医薬組成物は、上記担体を一以上包含することが可能である。
　さらに、本発明の医薬組成物は、本発明の核酸が有する薬理効果を失わない範囲において、他の薬剤を含有することもできる。例えば、抗生物質を所定量含有していてもよい。
　本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。通常は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。
　例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。
　非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は、組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、医薬組成物も、それぞれの投与方法に適した剤形にすることができる。全身又は組織内投与に適した剤形としては、例えば、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、例えば、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、例えば、坐剤等を挙げることができる。
　薬物を植物に投与する場合には、薬剤組成物の剤形は、液体、固体（半固体を含む）又はその組み合わせが挙げられる。溶液剤、油性分散液剤、エマルション剤、懸濁製剤、粉剤、散剤、ペースト剤、ゲル剤、ペレット剤、錠剤及び粒剤とすることができる。
　なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
５－２．製造方法
　本発明の医薬組成物を製造するには、原則として当該分野で公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
　例えば、注射剤の場合には、第２の実施形態の核酸分子を製薬上許容可能な溶媒に溶解し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加え、当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
　「薬学的に許容可能な溶媒」としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、殺菌されていることが望ましく、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
５－３．投与方法
　本実施形態の医薬組成物は、目的とする疾患等の治療又は予防のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
　本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所的投与のいずれであってもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明の核酸分子を十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明の核酸分子を全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
　本発明の医薬組成物は、有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
　注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。有効成分である核酸分子が標的物質に結合してその機能を抑制することができれば、いずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経肺、経皮、皮下、皮内、腹腔内、鼻腔内、腸内又は舌下等が挙げられる。好ましくは、静脈内注射又は動脈内注射等の血管内への注射である。前述のように血流を介して本発明の医薬組成物を全身に行き渡らせることが可能であり、また侵襲性も比較的低いからである。
６．標的物質検出方法
　本発明の第５の実施形態は、前記第２実施形態に記載の核酸分子を用いた標的物質の検出方法である。
６－１．構成
　第２実施形態に記載の核酸分子は、その核酸分子の標的物質と極めて強固に、かつ特異的に結合し得るため、核酸分子のその性質を利用して試料中に存在する標的物質を検出することができる。
　第２実施形態に記載の核酸分子と標的物質間の結合を利用した方法であれば、検出方法自体は公知の検出方法を用いればよい。例えば、SPR法、水晶振動子マイクロバランス法、比濁法、比色法又は蛍光法を利用することができる。
　SPR（表面プラズモン共鳴）は、金属薄膜にレーザー光を照射すると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰する現象をいう。SPR法は、この現象を利用した測定方法で、センサ部である金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。本発明においては、例えば、予め第２実施形態の核酸分子を金属薄膜表面上に固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させ、当該核酸分子と標的物質との結合によって生じる試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することにより試料中の標的物質を検出することができる。SPR法には、置換法、間接競合法等が知られるがいずれを用いてもよい。
　QCM（水晶振動子マイクロバランス：Quartz Crystal Microbalance）法は、水晶振動子に取り付けた電極表面に物質が吸着すると、その質量に応じて水晶振動子の共振周波数が減少する現象を利用した方法である。この方法を用いたQCMセンサは、水共振周波数の変化量によって極微量な吸着物を定量的に捕らえることができる。本発明においては、電極表面に、前記SPR法と同様に予め核酸分子を固定化しておき、試料を電極表面に接触させることによって、核酸分子と標的物質との結合により生じる水共振周波数の変化量から試料中の標的物質を定量的に検出することができる。本技術は、当該分野において周知である。例えば、Christopher J., et al.(2005) Self-Assembled Monolayers of a Form of Nanotechnology, Chemical Review,105:1103-1169を参照すればよい。
　比濁法は、溶液に光を照射し、溶液中に浮遊する物質によって散乱する散乱光の減衰又はその溶液を通過した透過光を、比色計等を用いて光学的に計測することにより溶液中の物質量を測定する方法である。本発明においては、試料中に第２実施形態の核酸分子を添加する前後の吸光度を計測することによって、試料中の標的物質を定量的に検出することができる。
　また、標的物質に対する抗体と併用することにより標的物質を検出することもできる。例えば、ELISA法のサンドイッチ法を応用した方法を用いてもよい。この方法では、まず、固相担体に第２実施形態の核酸分子を固定しておき、次に試料を加えて、試料中に存在する標的物質と前記核酸分子とを結合させる。続いて、試料を洗い流した後、抗標的物質抗体を加えて標的物質に結合させる。洗浄後、適当な標識をした二次抗体を用いて抗標的物質抗体を検出することにより、試料中の標的物質を検出することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
　このような検出方法の具体的な例として、標的物質がNF-κB p50のときに、核酸分子が第２実施形態に記載したコンセンサス配列として図３（ａ）に示す配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む核酸分子が挙げられる。例えば、図３（ｂ）に示す配列番号３及び４で示される塩基配列、図３（ｃ）に示す配列番号５及び６で示される塩基配列、そして図３（ｄ）に示す配列番号７及び８で示される塩基配列を有する核酸分子であり、より具体的には、例えば、前記コンセンサス配列の5′側及び／又は3′側、好ましくは3′側に、第２実施形態に記載したヘアピン型DNAを含む核酸分子、あるいは前記図４の配列番号９～２１で示される中央領域を含むDNAアプタマー、より具体的には、例えば、クローン5R01、5R09、5R43、5R14、5R13、5R34、5R10、5R26、5R27、5R11、5R05、5R28及び5R19が挙げられる。試料中のヌクレアーゼ濃度が高く、核酸分子を利用できない場合には、測定前に試料をヌクレアーゼインヒビターで処理する等した後に用いればよい。
６－２．効果
　本発明の検出方法によれば、第２実施形態の核酸分子の標的物質への強固かつ特異的な結合を利用して、試料中の微量な標的物質を高感度に検出することが可能となる。
７．NF-κB p50検出キット
　本発明の第６の実施形態は、第２実施形態のNF-κB p50結合性核酸分子を一以上含むNF-κB p50を検出するためのキットである。本キットは、前記態様であるNF-κB p50結合性核酸を使用して試料中のNF-κB p50を検出することができる。
　本キットは、第２実施形態記載のNF-κB p50結合性アプタマーの他、必要に応じて標識二次抗体、標識の検出に必要な基質、陽性対照や陰性対照、又は試料の希釈や洗浄に用いる緩衝液等を含むことができる。さらに、そのキットの使用説明書を包含することもできる。
＜実施例１：核酸アプタマーの高効率製造法の開発＞
Ｉ．固相担体の条件検討
　本発明の核酸アプタマーの製造方法において、使用する固相担体への一本鎖核酸の非特異的吸着を低減させるために、固相担体の最適条件を検討した。
（方法）
　固相担体には、メーカー市販のストレプトアビジンでコートされた2種類の磁気ビーズを用いた。磁気ビーズA(NewEnglandBiolabs社、Hydrophilic Streptavidin Magentic Beads）は、ビーズ表面が親水性であり、磁気ビーズB(NewEnglandBiolabs社、Streptavidin Magnetic Beads）は、ビーズ表面が疎水性である。
　これらの磁気ビーズを用いて、磁気ビーズへの一本鎖DNAの非特異的吸着について検証した。具体的には、配列番号２２に示す43塩基からなるランダム領域（Nで示す）を含む一本鎖DNAで構成された一本鎖核酸ライブラリー（全長79-mer）8 pmoLを含む溶液に50 μgの磁気ビーズA、又はBをそれぞれ混合した後、50 mLサイズのファルコンチューブを用いて、0.05 % Nonidet P-40及び2.5 mM DTTを含む40 mLのPBSバッファで磁気ビーズを洗浄し、溶液中の一本鎖DNAを除去した後、磁気ビーズに非特異的に吸着したDNA量をリアルタイムPCRにより検出した。リアルタイムPCRには、配列番号２３で示すリバースプライマーと配列番号２４で示すフォワードプライマーを用いた。なお、ライブラリーを構成する一本鎖DNAに相補的なリバースプライマーは、5′末端のチミン（t）をビオチン化修飾している。それ故、PCR増幅された産物をストレプトアビジンと混合した後、変性ゲル電気泳動を行うことにより、未反応のリバースプライマー及び5′末端がビオチン化された配列２２に示す一本鎖DNAの相補配列は、ストレプトアビジンと結合して移動度が遅くなることから、ゲルシフト法により目的の一本鎖DNAの増幅産物を選択的に調製できる。
　PCRの反応条件は、SYBR Green I（Lonza 社）とROX Dye（Life Techonologies社）の存在下で、95℃を30秒、50℃を30秒、そして65℃を2分の3ステップで、PCRを30サイクル行い、Mx3005P（Agilent Technologies社）によって、その増幅過程を検出した。
（結果）
　結果を図５に示す。この図が示すように、疎水性表面を有する磁気ビーズBは、親水性表面を有する磁気ビーズAよりもより多くの増幅産物が得られた。この結果は、親水性表面を有する固相担体の方が疎水性表面を有する固相担体よりも一本鎖核酸の非特異的吸着が少なく、本発明の製造方法における固相担体に適していることが示された。
　なお、前記磁気ビーズの洗浄に用いたバッファ中に、上記Nonidet P-40等の非極性界面活性剤を添加すると、無添加のときと比較して固相担体である磁気ビーズの収集性が向上することが明らかとなった（データ示さず）。
ＩＩ．NF-κB p50を標的物質とするDNAアプタマーの製造
　次に、本発明の核酸アプタマー製造方法を用いて、標的物質を転写因子であるNF-κB p50とし、それに強結合するDNAアプタマーの作製を行った。
（方法）
　化学合成した配列番号２５で示す、43塩基からなるランダムな塩基配列の中央領域（Nで示す）を含む一本鎖DNAからなる一本鎖核酸ライブラリー（全長95-mer）を用いて、複合体形成工程（１０１）から一本鎖核酸調製工程（１０５）を1ラウンドとして、後述の反復工程（１０６）を行った。
　以下、本発明の製造方法における各工程について、具体的に説明する。
（１）複合体形成工程（１０１）
　前記一本鎖核酸ライブラリーは、PBS緩衝液（1.1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4、pH 7.4）に溶解した。一本鎖DNA分子内で高次構造を形成させるため、90℃で3分間加熱後、60℃で3分間冷却し、さらにその後25℃に置く加熱・冷却処理を行った。その後、この溶液と等量の0.1 % Nonidet P-40及び5 mM DTTを含むPBS緩衝液と混合した。
　次に、固相担体である磁気ビーズの前処理を行った。磁気ビーズには、前記「Ｉ．固相担体の条件検討」の結果から、磁気ビーズA(Hydrophilic Streptavidin Beads、New England Biolabs)を用いた。磁気ビーズに非特異的に吸着する一本鎖DNAを前記一本鎖核酸ライブラリーから除くため、その一本鎖核酸ライブラリー溶液を0.2 mgのストレプトアビジン磁気ビーズ(Hydrophilic Streptavidin Beads、New England Biolabs)と共に室温で30分間インキュベーションし、マグネットスタンドと遠心操作により磁気ビーズを取り除き、上清液を回収した。
　そして、標的タンパク質である組換えヒトNF-κB p50 (rhNF-κB、Promega社)と表１に記載の割合で混合し、25℃で30分間インキュベーションすることで一本鎖DNAとNF-κB p50の複合体を形成させた。複合体形成のための一本鎖核酸ライブラリーやNF-κB p50の濃度比、本工程に使用した反応液容量等は、ラウンド毎に調整した。詳細については後述の反復工程（１０６）に記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）固定化工程（１０２）
　本実施例では、結合子としてビオチン及びストレプトアビジンを用いた。ビオチンは、標的物質に吸着する第１結合子であり、ストレプトアビジンは、前記磁気ビーズに吸着された第２結合子に相当する。
　前記使用したNF-κB p50は、ビオチン化されていないことから、ここでは、まず、複合体形成後の溶液に、0.09容量の10 mM ビオチン化試薬（EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin、Thermo Scientific社）を添加し、25℃で15分間インキュベーションした。これにより、溶液中の複合体に含まれるNF-κB p50と複合体未形成の遊離NF-κB p50とがビオチン化された。
　バックグラウンドの増大を防ぐため、未反応のビオチン化試薬をマイクロコン50（Merck社）による限外濾過による洗浄操作で取り除いた。
　洗浄後のビオチン化複合体を含む溶液をストレプトアビジン磁気ビーズ(Hydrophilic Streptavidin Beads、New England Biolabs)（p50 monomer換算で 1 pmolあたり6.8～8μg）と混合して室温で10分間インキュベーションし、ビオチン－ストレプトアビジンの結合子によって、複合体を磁気ビーズに固定化した。その後、タンパク質や磁気ビーズに非特異的に吸着した一本鎖DNAを洗浄するため、磁気ビーズを40 mLの0.05 % Nonidet P-40及び2.5 mM DTTを含むPBSバッファ(以降、本明細書では「バッファA」とする)に懸濁し、37℃で撹拌しながら30分間インキュベーションを行った。この洗浄操作をもう一度繰り返した。
（３）回収工程（１０３）
　固定化工程（１０２）後の磁気ビーズに400 μLの溶出液（100 mMクエン酸ナトリウム pH 5.0、7 M 尿素、3 mM EDTA）を加えて、90℃で5分間加熱して、溶出液を回収した。その後、この回収した溶出液にフェノール・クロロホルム処理を行い、イソプロピルアルコールによる沈殿操作により、NF-κB p50に結合していた一本鎖DNAを回収した。
（４）増幅工程（１０４）
　PCRには、配列番号２６で示すリバースプライマーと配列番号２７で示すフォワードプライマーを用いた。リバースプライマーは、5′末端のチミン（t）をビオチン化修飾している。PCRは、最終濃度0.025 U/μLのExTaq DNA ポリメラーゼ（タカラバイオ社）と添付バッファを用いて行った。反応組成は、最終濃度が2 mM MgCl2、0.2 mM dNTP (N=A,G,C,T)となるように調製し、サイクル条件は、94℃を30秒、50℃を30秒、そして72℃を1分の3ステップで、DNA増幅量に応じて、15サイクル又は20サイクルで行った。
（５）一本鎖核酸調製工程（１０５）
　増幅工程（１０４）後の増幅産物を含むPCR溶液からエタノール沈殿により二本鎖DNAを回収した後、ストレプトアビジンを利用したゲルシフト法により一本鎖DNAを調製した。具体的には、回収された二本鎖DNA（PCR溶液0.4 mL）を、10 μLのSA緩衝液（10 mM Tris-HCl pH 7.6、50 mM NaCl、1 mM EDTA）に懸濁し、75℃で3分間加熱後、10 μLのストレプトアビジン溶液（5 mg/mL、SA緩衝液に溶解）を加えて、25℃で30分間インキュベーションした。増幅工程（１０４）で使用されたリバースプライマーの5′末端の塩基は、ビオチン化されていることから、この操作によって、ビオチン化二本鎖DNAとアビジンの複合体が形成される。この複合体を含む溶液に、同容量の変性ゲル用ローディングバッファ（10 M尿素、1×TBE溶液）を加えて、75℃で3分間加熱して、一本鎖化した後、7 M 尿素を含む6 % ポリアルアミド変性ゲルで電気泳動し、増幅された目的の一本鎖DNAをゲルから回収することによって、不要なビオチン化された一本鎖DNAを除去した。得られた一本鎖DNAをPBS緩衝液（1.1 mM KH2PO4、155 mM NaCl、3 mM Na2HPO4、pH 7.4）に溶解し、90℃で3分間加熱後、60℃で3分間冷却し、さらにその後25℃に置く加熱・冷却処理を行って一本鎖DNA分子内で高次構造を形成させた。その後、この溶液と等量の0.1 % Nonidet P-40及び5 mM DTTを含むPBS緩衝液と混合し、新たな一本鎖核酸ライブラリーとして次のラウンドに使用した。
（６）反復工程（１０６）
　本実施例では、本工程を5ラウンド行った。各ラウンドにおける一本鎖核酸ライブラリー及び標的物質であるNF-κB p50の濃度等の条件については、前記表１に示す通りである。
　最初のラウンドでは、前述のように化学合成とゲル精製により調製した一本鎖DNAからなる一本鎖核酸ライブラリーを直接用いた。このラウンドでの一本鎖DNAの分子種総数は、333 pmolを用いた。これは、一本鎖DNA約2×1013分子に相当する。ラウンドを繰り返す過程で、一本鎖DNA-NF-κB p50の複合体形成条件を厳しくするために、徐々に一本鎖核酸ライブラリーとNF-κB p50の濃度を低くしていった。また、3ラウンド以降は、一本鎖核酸ライブラリーとNF-κB p50を混合して複合体を形成させる際に、配列番号２８で示す競合DNA分子としてNF-κB mini46（46-mer）を過剰量加えた。各ラウンドの終了時には、40mLのバッファAを用いて、37℃にて30分間で洗浄を2回行った。ただし、5ラウンド目のみ、さらに、バッファAに3 M尿素を加えたバッファ1 mLを用いて、室温で15分間転倒混和することによって洗浄した。これによって、洗浄条件を厳しくし、NF-κB p50に強く結合する一本鎖DNA断片を選別するようにした。
（７）NF-κB p50結合性DNAアプタマーの同定
　5ラウンド終了後に得られた各一本鎖DNAにおける中央領域の塩基配列を決定し、得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの一次構造、及びその塩基配列から推定される二次構造を同定した。
　まず、5ラウンド終了後に回収した各一本鎖の一部を鋳型として、ビオチン化されていない配列番号２６と配列番号２７で示されるプライマーを用いて、50 μLの反応スケールで、前記増幅工程（１０４）と同様の反応組成、サイクル条件で15サイクルPCRを行った。その後、増幅産物の一部（2 μL）をTOPO TA クローニングキット(Life Technologies社)を用いてクローニングした。得られた大腸菌のクローンから、プラスミドを回収し、42クローンについてシークエンシングを行い、前記中央領域の塩基配列を決定した。
（結果）
　得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの塩基配列、クローン名、クローン数及び配列番号を図４に示す。この図で示すように、中央領域の塩基配列は、大きく３つの配列群、すなわち、配列番号９～１１で示す塩基配列を有する配列群、配列番号１２～１８で示す塩基配列を有する配列群、そして配列番号１９～２１で示す塩基配列を有する配列群に分類された。それぞれの配列には、配列番号２９で示すNF-κBの結合する天然型のコンセンサスDNA配列と類似した配列が存在していた。それらのコンセンサスに類似する配列は、図５で示すように、ヘアピン構造のステム部分に位置することがわかった。興味深いことに、このステム部分の配列には、天然型のDNA配列と異なり、非ワトソン・クリック型のG-AとG-Tの塩基対が含まれていることが明らかとなった。
＜実施例２：NF-κBに結合するDNAアプタマーの結合能＞
　実施例１で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマークローンのうち、各配列群においてクローン数の多かった5R01、5R14、5R05（図４参照）を用いて、NF-κB p50への結合能について解析した。
（方法）
　各クローンの一本鎖DNA（全長95-mer）は、実施例１で得られたクローンのプラスミドを鋳型として、ビオチン化された配列２６及び配列２７のプライマーを用いてPCR増幅した後、実施例１で示した一本鎖核酸調製工程と同様の手順で、ストレプトアビジンを利用したゲルシフト法により調製した。
　各NF-κB p50結合性DNAアプタマークローンのNF-κB p50への結合能は、BIACORE3000（GEヘルスケア社）を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）法により測定した。SPR法では、ランニングバッファにバッファAを用い、設定温度25℃で測定を行った。具体的には、ストレプトアビジンコートされたセンサーチップ（SAチップ）に、各クローンの3′末端領域に相補的な塩基配列を有し、5′末端の塩基がビオチン化された配列番号30で示すDNAプローブ(21-mer)を固定化した後、流速5 μL/minで、PBSにより50 nMに希釈した各一本鎖DNAクローン（95-mer）の溶液を60 μL（12分間相当）インジェクションし、プローブとのハイブリダイゼーションによってSAチップに固定化した。
　固定化されたクローンDNAとNF-κB p50との結合・解離の検出は、2.5 nM又は5 nMのNF-κB p50溶液(バッファAにより希釈、dimerで換算)をKinetic Injectionモードによってインジェクションすることでモニターした。測定条件は、流速20 μL/min、タンパク質インジェクションは、6分間、インジェクション終了後のタンパク質解離の測定は6分間とした。チップの再生（結合タンパク質の解離）は、2 MのNaCl溶液を5 μL（15秒相当）インジェクションすることで行った。なお、ハイブリダイゼーションにより固定化されたDNAは、流速25 μL/minで0.05 M NaOH溶液を5 μL（12秒相当）インジェクションにより除去することができ、異なるDNA配列での結合解析にも同じチップを使用できた。
（結果）
　図７に結果を示す。この図は、上記３つのクローンとNF-κB p50との相互作用を検出したセンサグラムである。この図が示すように、いずれのクローンもNF-κB p50に非常に強く結合すること、そして、NF-κB p50インジェクション終了後のセンサグラムのパターンから、結合したクローンのNF-κB p50からの解離が極めて遅いことが明らかとなった。BIACORE3000付属の解析ソフトを用いて、反応モデル1:1 binding with mass transferでのフィッティングにより解離定数 Kdを算出した結果、Kd＝2.1～3.5 pMで、解離速度定数も10-5（1/s）のオーダーであった。
＜実施例３：NF-κB p50に結合するDNAアプタマー変異体の結合能＞
　実施例２で検証したNF-κB p50結合性DNAアプタマークローン5R01、5R14、5R05を切り詰めた変異体におけるNF-κB p50への結合能について解析した。
（方法）
　各NF-κB p50結合性DNAアプタマークローンから5′末端側のプライマー配列領域を含む配列を取り除いた一本鎖DNA変異体（68-mer、配列番号３１、３２、３３）の結合能について、実施例２と同様にSPR法により解析した。各種DNA断片の配列を図８に示す。これら結合解析に使用した一本鎖DNA変異体は、化学合成とゲル精製により調製した。なお、図中、Cont-68（配列番号３４）は、既知のNF-κB p50結合コンセンサス配列を含む二本鎖DNAをアデニンのテトラループ（AAAA）で連結した一本鎖DNAに相当する。また、SPR解析において、各種一本鎖DNAのプローブへのハイブリダイゼーションによるSAチップへの固定化は、流速20 μL/minで、PBSにより250nMに希釈した各種DNA断片（68-mer）溶液を20 μL（1分間相当）インジェクションすることで行った。
（結果）
　図９に結果を示す。この図は、上記３つのクローン及び対照用のCont-68とNF-κB p50との相互作用を検出したSPRのセンサグラムである。
　実施例２で検証したNF-κB p50結合性DNAアプタマーのそれぞれの5′末端側プライマー結合領域を含む配列を取り除いた一本鎖DNA変異体の結合能は、Kd＝5.7～8.7 pMであった（図８及び９）。一方、対照である天然型のDNA配列をステムに持つヘアピン型DNA Cont-68の結合能は、従来から知られている値に近く、Kd=3.5 nMであった（図８及び９）。この結果から、本発明の製造方法で得られた非ワトソン・クリック型塩基対を含む二本鎖領域を包含するDNAアプタマーは、従来のデコイDNAに用いられるDNA断片よりも、その結合能が数百～約1000倍も高いことが明らかとなった。
＜実施例４：NF-κB p50結合性DNAアプタマー5R01-68変異体のNF-κB p50への結合能＞
　実施例１で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの各クローンの共通構造は、前述のように、通常の二本鎖DNAとは異なる非ワトソン・クリック型塩基対を含む（図４）。そこで、NF-κB p50結合性DNAアプタマー5R01の変異体であって、実施例３で調製した5R01-68の二本鎖領域中に存在する5箇所の非ワトソン・クリック型塩基対、すなわち、2箇所のG-T塩基対及び3箇所のG-A塩基対を、全てワトソン・クリック型塩基対であるG-C塩基対に変えた配列番号３５で示される変異体5R01mut-68について、NF-κB p50への結合能をSPR法により測定した。
（方法）
　変異体5R01mut-68は、配列番号３５で示される塩基配列に基づき、化学合成により調製した。実施例２と同様の方法によりNF-κB p50に対する結合能を検証した。同時に、非ワトソン・クリック型塩基対を含む5R01-68とCont-68を対照用として用い、同様に結合能を測定した。
（結果）
　図１０に結果を示す。この図は、変異体5R01mut-68（A）、対照用の5R01-68（B）及びCont-68（C）のそれぞれについて、NF-κB p50との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラムである。変異体5R01mut-68は、Cont-68よりも結合能が20倍以上強かったが、5R01-68と比較すると解離速度定数が10倍大きくなっており、非ワトソン・クリック型塩基対を有する5R01-68よりもNF-κB p50から解離しやすくなっていることがわかった。この結果から、本発明の製造方法で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーの各クローンにおける共通構造中の非ワトソン・クリック型塩基対は、NF-κB p50との結合に寄与していることが明らかとなった。
＜実施例５：NF-κB p50結合性DNAアプタマーのNF-κB p50に対する結合特異性＞
　実施例１で得られたNF-κB p50結合性DNAアプタマーのNF-κB p50結合選択性を調べた。
（方法）
　実施例３で調製した非ワトソン・クリック型塩基対を有する5R01-68及び、実施例４で調製した非ワトソン・クリック型塩基対を含まない5R01mut-68を固定化したセンサーチップを用いて、NF-κB p50以外の転写因子であるAP-1タンパク質(プロメガ社)、及びTaq DNAポリメラーゼ (Roche社、1U= 0.05 pmol換算)への結合をSPR法によって検証した。
　対照用アプタマーとして、公知の抗Taq DNAアプタマーを組み込んだ59-mer のDNA断片Taq-59（配列番号３６)を化学合成により調製し、5R01-68及び5R01mut-68と同様に、各種タンパク質への結合をSPR法によって検証した。
（結果）
　図１１に結果を示す。この図は、5R01-68（A）、5R01mut-68（B）、対照用のTaq-59のそれぞれについて、NF-κB p50（●）、Taq DNAポリメラーゼ（○）、及びAP-1（△）との相互作用を検出したときのSPRのセンサグラムである。この図から、5R01-68及び5R01mut-68のAP-1やTaq DNAポリメラーゼへの結合能は非常に弱く、本発明の製造方法で得られたDNAアプタマーが標的物質であるNF-κB p50に特異的に結合できることが明らかとなった。
　なお、上記各実施例において検証したDNAアプタマー等のSPR法の結果から算出したNF-κB p50への解離定数（Kd値）を表２にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (25)

  1. 　核酸アプタマーの製造方法であって、
    　一本鎖核酸ライブラリーと標的物質とを溶液中で混合して、一本鎖核酸と標的物質の複合体を形成させる複合体形成工程、
    　複合体形成工程後の溶液と固相担体を混合し、標的物質及び／又は固相担体に吸着させた結合子を介して、複合体を固相担体に固定化する固定化工程、
    　固相担体に固定化された複合体を溶液から回収する回収工程、
    　複合体中の一本鎖核酸を回収後、該一本鎖核酸を核酸増幅法によって増幅させる増幅工程、及び
    　増幅工程で得られた二本鎖核酸を一本鎖化した後、分子内立体構造を形成させる一本鎖核酸調製工程を含む前記製造方法。
  2. 　一本鎖核酸調製工程で得られる一本鎖核酸を新たな一本鎖核酸ライブラリーに用いて、複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを複数回繰り返す反復工程をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　反復工程において複合体形成工程から一本鎖核酸調製工程までを2～15回繰り返す、請求項２に記載の製造方法。
  4. 　反復工程後に得られる一本鎖核酸の中から、連続する5～20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を二次構造中に一以上含み、かつ前記二本鎖領域内の1～10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる一本鎖核酸分子を選択する選択工程をさらに含む、請求項２又は３に記載の製造方法。
  5. 　複合体形成工程において、前記溶液が前記一本鎖核酸との間で標的物質との結合を競合し合う競合物質を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記核酸がDNAである、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記標的物質がペプチドである、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　前記結合子がビオチン及びアビジン、ストレプトアビジン又はニュートラアビジンである、請求項１～７のいずれか一項に記載の製造方法。
  9. 　前記固相担体が親水性である、請求項１～８のいずれか一項に記載の製造方法。
  10. 　複合体形成工程及び／又は回収工程で使用する溶液又はバッファが界面活性剤を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の製造方法。
  11. 　標的物質に結合する核酸分子であって、
    　連続する5～20塩基が互いに塩基対合する二本鎖領域を一以上含み、かつ
    　前記二本鎖領域内の1～10塩基対が非ワトソン・クリック型塩基対からなる前記核酸分子。
  12. 　前記核酸分子が一本鎖核酸又は二本鎖核酸からなる、請求項１１に記載の核酸分子。
  13. 　前記核酸分子がDNAである、請求項１２に記載の核酸分子。
  14. 　前記標的物質がペプチドである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸分子。
  15. 　前記ペプチドが転写調節因子、シグナル伝達因子、タンパク質リガンド、又は受容体タンパク質である、請求項１４に記載の核酸分子。
  16. 　前記転写調節因子がNF-κBである、請求項１５に記載の核酸分子。
  17. 　前記NF-κBがp50であって、配列番号１及び２で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
  18. 　配列番号３及び４、配列番号５及び６、又は配列番号７及び８で示される塩基配列からなる二本鎖領域を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
  19. 　配列番号９～２１で示される塩基配列を含む、請求項１８に記載の核酸分子。
  20. 　請求項１１～１９のいずれか一項に記載の核酸分子を有効成分とする標的物質の機能阻害剤。
  21. 　請求項２０に記載の標的物質機能阻害剤を含む医薬組成物。
  22. 　請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて試料中に存在するその核酸分子が結合する標的物質を検出する方法。
  23. 　請求項１６～１９のいずれか一項に記載の核酸分子を用いて試料中のNF-κB p50を検出する方法。
  24. 　表面プラズモン共鳴測定法、水晶振動子マイクロバランス測定法、比濁法、比色法又は蛍光法を用いて検出する、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 　請求項１６～１９のいずれか一項に記載の核酸分子を一以上含むNF-κB p50検出用キット。
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