WO2013077425A1 - 網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 - Google Patents

網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法 Download PDF

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WO2013077425A1
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retinal
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cell
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徳重 中野
覚 安藤
芳樹 笹井
元次 永樂
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Sumitomo Chemical Co Ltd
RIKEN
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Sumitomo Chemical Co Ltd
RIKEN
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    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing retinal tissue and retinal related cells such as retinal layer-specific nerve cells and retinal pigment epithelial cells.
  • the retina is an important sensory tissue that receives light, converts it into an electrical signal, and transmits information to the visual center of the brain via axons after information processing.
  • the retina is largely composed of two epithelial tissues inside and outside.
  • the inner side is a neural retina that receives light and performs information processing, and includes a plurality of types of cells such as photoreceptor cells.
  • On the outside is the retinal pigment epithelium, a single-layer cell sheet that supports photoreceptor survival and function.
  • retinal layer-specific nerve cells visual cells, horizontal cells, amacrine cells, ganglion cells, etc.
  • Patent Document 1 a report of producing retinal layer-specific nerve cells (visual cells, horizontal cells, amacrine cells, ganglion cells, etc.) constituting the neural retina from pluripotent stem cells.
  • a uniform pluripotent stem cell aggregate is formed in a serum-free medium, and this is cultured in suspension in the presence of a basement membrane preparation.
  • Non-patent Document 1 and Patent Document 2 Describes that a retinal progenitor tissue, an eyecup-like structure, and a multi-layer neural retinal tissue can be produced in a test tube.
  • Non-patent Document 2 a report of producing retinal pigment epithelial cells using pluripotent stem cells is also known (Non-patent Document 2), there is no report that retinal pigment epithelial cells were produced with high efficiency.
  • a method for producing retinal tissue comprising the following steps (1) to (3): (1) First step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitory substance (2) Coagulation formed in the first step Second step of culturing the aggregate in a serum-free medium containing a basement membrane preparation (3) Third step of culturing the aggregate cultured in the second step in a serum medium [2] [1]
  • the retinal tissue obtained by the method described above is suspended in a serum-free medium or serum medium containing a sonic hedgehog (hereinafter sometimes referred to as “Shh”) signal pathway agonist and a Wnt signal pathway agonist
  • Shh sonic hedgehog
  • the retinal tissue obtained by the method described in [1] above is treated with a serum-free medium or serum medium containing a Wnt signal pathway agonist (provided that the serum-free medium and serum medium are sonic hedgehog (hereinafter referred to as “Sonic Hedgehog”).
  • a method for producing retinal pigment epithelial cells comprising a step of suspension culture in (sometimes referred to as “Shh”) containing no signal pathway agent).
  • the serum-free medium or serum medium containing the Wnt signal pathway agonist further comprises an Activin signal pathway agonist.
  • the pluripotent stem cell is a primate pluripotent stem cell.
  • the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • the basement membrane preparation is at least one extracellular matrix molecule selected from the group consisting of laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan and entactin. The method according to any one.
  • [8] The method described in any one of [1] to [7], wherein the first to third steps are performed in the presence of a knockout serum substitute (hereinafter sometimes referred to as “KSR”).
  • KSR knockout serum substitute
  • a method for producing a retinal layer-specific nerve cell comprising contacting a retinal progenitor cell contained in a retinal tissue derived from a primate pluripotent stem cell with a Notch signal pathway inhibitor.
  • the Notch signal pathway inhibitor is a gamma secretase activity inhibitor.
  • the Notch signaling pathway inhibitor is N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (hereinafter sometimes referred to as “DAPT”).
  • DAPT N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester
  • retinal progenitor cells contained in the retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells are retinal progenitor cells contained in the retinal tissue produced by the following steps.
  • the method in any one of.
  • First step of forming primate pluripotent stem cell aggregates by suspension culture of primate pluripotent stem cells in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitor (2) In the first step Second step of culturing the formed aggregate in a serum-free medium containing a basement membrane preparation (3) Third step of culturing the aggregate cultured in the second step in a serum medium and ( 4) The aggregate cultured in the third step is in a serum-free medium or serum medium containing a sonic hedgehog (hereinafter sometimes referred to as “Shh”) signal pathway agonist and a Wnt signal pathway agonist.
  • Shh sonic hedgehog
  • Step of culturing the eye-cup-like structure formed in the fourth step [16] [1] to [15]
  • Retinal tissue or eye cup produced by any of the methods
  • a reagent for evaluating toxicity and medicinal effects comprising a structure-like structure, retinal pigment epithelial cells or retinal layer-specific neurons.
  • a test substance is brought into contact with the retinal tissue, eyecup-like structure, retinal pigment epithelial cell or retinal layer-specific nerve cell produced by the method according to any one of [1] to [15],
  • a method for evaluating toxicity / drug efficacy of the substance comprising assaying an influence of the substance on the tissue, the structure or the cell.
  • a retinal tissue comprising a retinal tissue, an eyecup-like structure, a retinal pigment epithelial cell, or a retinal layer-specific nerve cell produced by the method according to any one of [1] to [15].
  • Therapeutic agent for diseases based on various disorders [19] An effective amount of retinal tissue, eyecup-like structure, retinal pigment epithelial cells or retinal layer-specific nerve cells produced by the method according to any one of [1] to [15] is transplanted.
  • a method for treating a disease based on a disorder of retinal tissue, comprising transplanting to a subject in need thereof.
  • retinal tissue, eyecup-like structures, retinal layer-specific neurons or retinal pigment epithelial cells can be produced with high efficiency. Therefore, the present invention is intended to efficiently provide retinal tissue, eyecup-like structures, retinal layer-specific neurons or retinal pigment epithelial cells for the purpose of evaluating toxicity and drug efficacy of chemical substances, etc., and transplantation treatment. Very useful.
  • Figure 1 shows a bright-field image of human pluripotent stem cell-derived aggregates on the 25th day from the start of suspension culture, which was prepared by adding only Matrigel (hereinafter sometimes referred to as Matrigel) without adding a Wnt signaling pathway inhibitor.
  • A and fluorescence image
  • B bright field image
  • C bright field image
  • F fluorescence image
  • Fig. 2 shows the suspension culture of human pluripotent stem cells added with a Wnt signaling pathway inhibitor, followed by suspension culture in the presence of Matrigel, and suspension culture in the absence of fetal calf serum.
  • FIG. 6 is a diagram showing a fluorescence image (F).
  • Figure 3 shows the suspension of human pluripotent stem cells added with a Wnt signaling pathway inhibitor, suspended in the presence of Matrigel, and then suspended in the absence of fetal calf serum.
  • FIG. 4 shows the retinal tissue (A, B, C) on the 60th day from the start of floating culture and the retinal tissue (D, E, F, G, H) on the 126th day from the start of floating culture.
  • I is a figure which shows the immuno-staining result of I).
  • FIG. 5 shows the 14th day (A), 15th day (B), 16th day (C), and 17th day after the start of suspension culture of aggregates that were cultured in suspension by the method for producing the eyecup-like structure of the present invention. It is a figure which shows the image which overlap
  • FIG. 6 shows a bright-field image (A), a fluorescent image (B), and a two-photon microscope of an aggregate obtained by microscopic observation from 24 to 26 days after the start of suspension culture by the method for producing the eyecup-like structure of the present invention. It is a figure which shows the 3D reconstruction image (D) obtained from the observation image (C) and the two-photon microscope observation image.
  • D 3D reconstruction image
  • FIG. 7 shows the result of immunostaining of a frozen section of an eyecup-like structure produced by suspension culture using the eyecup-like structure production method of the present invention using anti-Mitf antibody and anti-Chx10 antibody.
  • FIG. 8 shows the fluorescence microscope (A) and DAPT when the retinal tissue derived from Crx :: GFP knock-in human ES cells on the 29th day after suspension culture was suspended until the 41st day of suspension culture under the condition that 10 ⁇ M DAPT was not added.
  • FIG. 9 shows the culturing of cultivated suspension of retinal tissue derived from Crx :: GFP knock-in human ES cells.
  • the retinal tissue was frozen and thawed on the 38th day.
  • the retinal tissue was cultured on the 49th day after the start of suspension culture under the condition that 10 ⁇ M DAPT was not added.
  • Fluorescence microscope (B) when suspension culture is performed up to the 49th day of suspension culture with the addition of the fluorescence microscope (A) and DAPT until suspension culture until 49 days of suspension culture without the addition of 10 ⁇ M DAPT A photograph (C) of the frozen section that was immunostained with anti-Recoverin antibody and a picture of immunostained with anti-Brn3 antibody (E), and suspension culture up to day 49 of suspension culture under the condition that DAPT was added.
  • FIG. 10 shows that aggregates are formed by suspension culture in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitor, and the formed aggregates are suspended and cultured in the presence of a basement membrane preparation in a serum-free medium. It is a figure which shows the bright field of the aggregate manufactured by culture
  • FIG. 11 shows that aggregates are formed by suspension culture in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitor, and the formed aggregates are suspended and cultured in the presence of a basement membrane preparation in a serum-free medium. Shows a bright field of an aggregate produced by culturing the aggregate in a medium containing serum and culturing the cultured aggregate in a medium containing a Wnt signal pathway agonist and an ActivinA signal pathway agonist It is.
  • the “transformant” in the present invention means all or part of a living organism such as a cell produced by transformation.
  • the transformant include prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like.
  • a transformant may be referred to as a transformed cell, a transformed tissue, a transformed host, or the like depending on the subject.
  • the cell used in the present invention may be a transformant.
  • prokaryotic cells used in the genetic manipulation technique in the present invention include, for example, prokaryotic cells belonging to the genus Eschericia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc., for example, Eschericia XL1- Blue, Eschericia XL2-Blue, Eschericia DH1, etc. can be mentioned.
  • prokaryotic cells belonging to the genus Eschericia, Serratia, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, Microbacterium, Pseudomonas, etc.
  • Eschericia XL1- Blue Eschericia XL2-Blue
  • Eschericia DH1 Eschericia DH1
  • Such cells are specifically described in, for example, “Molecular Cloning (3rd edition)” by Sambrook, J and Russell, DW, Appendix 3 (Volume 3), Vectors and Bacterial strains. A
  • the “vector” in the present invention means a vector capable of transferring a target polynucleotide sequence to a target cell.
  • examples of such vectors include autonomous replication in host cells such as prokaryotic cells, yeast, animal cells, plant cells, insect cells, individual animals and individual plants, or integration into chromosomes. Examples thereof include those containing a promoter at a position suitable for polynucleotide transcription.
  • a vector suitable for cloning may be referred to as a “cloning vector”.
  • Such cloning vectors usually contain multiple cloning sites containing multiple restriction enzyme sites.
  • the “vector” in the present invention includes “expression vector”, “reporter vector”, and “recombinant vector”.
  • the “expression vector” means a nucleic acid sequence in which various regulatory elements are operably linked in a host cell in addition to a structural gene and a promoter that regulates its expression. Examples of the “regulatory element” include those containing a terminator, a selection marker such as a drug resistance gene, and an enhancer. It is well known to those skilled in the art that the type of expression vector of an organism (eg, animal) and the type of regulatory element used can vary depending on the host cell.
  • the “recombinant vector” in the present invention includes, for example, (a) a lambda FIX vector (phage vector) for screening a genomic library, and (b) a lambda ZAP vector (phage for screening cDNA).
  • a lambda FIX vector phage vector
  • a lambda ZAP vector phage for screening cDNA
  • pBluescript II SK +/-, ppGEM, pCR2.1 vector plasmid vector
  • plasmid vector can be used for cloning of genomic DNA.
  • Examples of the “expression vector” include pSV2 / neo vector, pcDNA vector, pUC18 vector, pUC19 vector, pRc / RSV vector, pLenti6 / V5-Dest vector, pAd / CMV / V5-DEST vector, pDON-AI-2 / neo vector, pMEI-5 / neo vector, etc. (plasmid vector).
  • Examples of the “reporter vector” include pGL2 vector, pGL3 vector, pGL4.10 vector, pGL4.11 vector, pGL4.12 vector, pGL4.70 vector, pGL4.71 vector, pGL4.72 vector, pSLG vector, pSLO. Examples include vectors, pSLR vectors, pEGFP vectors, pAcGFP vectors, pDsRed vectors, and the like. Such vectors may be appropriately used with reference to the aforementioned Molecular Cloning magazine
  • Examples of the technique for introducing a nucleic acid molecule in the present invention into a cell include transformation, transduction, transfection, and the like. Specific examples of such introduction techniques include AusubelAuF. A. et al. (1988), Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J. et al. (1987) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. And its third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, and the methods described in the separate experimental medicine "Methods for Gene Transfer & Expression Analysis” Yodosha, 1997, etc. Can do. Examples of the technique for confirming that the gene has been introduced into the cell include Northern blot analysis, Western blot analysis, and other well-known conventional techniques.
  • the “stem cell” in the present invention is a cell that maintains the same differentiation ability even after cell division, and can be regenerated when the tissue is damaged.
  • the stem cells can be embryonic stem cells (ES cells) or tissue stem cells (also referred to as tissue stem cells, tissue-specific stem cells or somatic stem cells), or induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced pluripotent stem cell). Is not limited to them. It is known that the above stem cell-derived tissue cells can differentiate normal cells close to a living body, as can be seen from the fact that tissue regeneration is possible.
  • Stem cells can be obtained from a predetermined institution or commercially available products can be purchased.
  • human embryonic stem cells KhES-1, KhES-2, and KhES-3 are available from the Institute of Regenerative Medicine, Kyoto University.
  • EB5 cells which are mouse embryonic stem cells, are available from RIKEN, and the D3 strain is available from ATCC.
  • Stem cells can be maintained and cultured by a method known per se.
  • stem cells can be maintained by culturing with feeder-free cells supplemented with fetal calf serum (FCS), Knockout Serum Replacement (KSR), or LIF.
  • FCS fetal calf serum
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • LIF LIF
  • the “pluripotent stem cell” in the present invention can be cultured in vitro and all cells constituting the living body excluding the placenta (tissues derived from the three germ layers (ectoderm, mesoderm, endoderm)) Stem cells having the ability to differentiate into (pluripotency), including embryonic stem cells (ES cells).
  • a “pluripotent stem cell” is obtained from a fertilized egg, a cloned embryo, a germ stem cell, or a stem cell in tissue. Also included are cells that are artificially provided with differentiating pluripotency similar to embryonic stem cells by introducing several types of genes into somatic cells (also called artificial pluripotent stem cells).
  • Pluripotent stem cells can be prepared by a method known per se. For example, Cell 131 (5) pp. 861-872, Cell 126 (4) pp. And the method described in 663-676.
  • the “embryonic stem cell (ES cell)” in the present invention is a stem cell having self-renewal ability and pluripotency (ie, pluripotency “pluripotency”), and a pluripotent stem cell derived from an early embryo Say. Embryonic stem cells were first established in 1981, and have been applied since 1989 to the production of knockout mice. In 1998, human embryonic stem cells were established and are being used in regenerative medicine.
  • the “artificial pluripotent stem cell” in the present invention is a cell in which differentiated cells such as fibroblasts are directly initialized by expression of several types of genes such as Oct3 / 4, Sox2, Klf4, Myc, etc. to induce pluripotency.
  • differentiated cells such as fibroblasts
  • mouse cells Yamanaka et al.
  • Yamanaka K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126 (4), p663-676 Established in human fibroblasts in 2007, it has pluripotency similar to embryonic stem cells (Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S.
  • Genetically modified pluripotent stem cells can be produced by using, for example, homologous recombination technology.
  • the chromosomal gene that is modified when the modified pluripotent stem cell is prepared include a histocompatibility antigen gene, a disease-related gene based on a neuronal cell disorder, and the like.
  • the modification of target genes on chromosomes is described in Manipulating the MousebEmbryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Pirc. Gene targeting, production of mutant mice using ES cells, methods described in Yodosha (1995) and the like can be used.
  • a genomic gene of a target gene to be modified for example, a histocompatibility antigen gene or a disease-related gene
  • homologous recombination of the target gene using the isolated genomic gene Create a target vector.
  • genomic gene of the target gene can be isolated by using a genomic DNA library screening system (manufactured by Genome® Systems), Universal® Genome Walker Kits (manufactured by CLONTECH), or the like.
  • target vectors for homologous recombination of target genes are described in Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Presat At Oxford Universality Press (1993); Biomanual Series 8 Gene Targeting, A mutant mouse using ES cells can be prepared according to the method described in Yodosha (1995).
  • the target vector can be either a replacement type or an insertion type, and as a selection method, methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, and poly A selection can be used.
  • Examples of a method for selecting a target homologous recombinant from the selected cell lines include Southern hybridization method and PCR method for genomic DNA.
  • tissue in the present invention refers to a structure of a cell population having a structure in which a plurality of types of cells having different forms and properties are three-dimensionally arranged in a certain pattern.
  • the “retinal tissue” in the present invention means at least a plurality of types of cells such as photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal node cells, progenitor cells or retinal progenitor cells constituting each retinal layer in a living retina. , Meaning retinal tissue arranged in layers and three-dimensionally. Which retinal layer each cell constitutes can be confirmed by a known method, for example, expression of a cell marker.
  • Rax progenitor cell of retinal
  • PAX6 progenitor cell
  • nestin expressed in progenitor cell of hypothalamic neuron but not expressed in retinal progenitor cell
  • Sox1 expressed in hypothalamic neuroepithelium
  • Crx progenitor cell of photoreceptor
  • the markers of the retinal layer-specific neurons include Chx10 (bipolar cells), L7 (bipolar cells), Tuj1 (node cells), Brn3 (node cells), Calretinin (amacrine cells), Calbindin (horizontal cells), Examples include, but are not limited to, Rhodopsin (photocell), Recoverin (photocell), RPE65 (pigment epithelial cell), Mitf (pigment epithelial cell) Nrl (rod cell), Rxr-gamma (cone cell).
  • the “eye cup-like structure” refers to a structure having a shape similar to that of the eye cup in the embryogenesis process.
  • the retinal primordium develops from the side of the diencephalon and is formed so as to jump out of the diencephalon in a bag shape.
  • This bag-like epithelial structure is called an eye follicle.
  • the outermost part of the eye follicle gradually invades the inside of the eye follicle to form the eye cup, which is a cup-shaped tissue consisting of two layers of inner and outer layers.
  • the eyecup then grows larger and forms a retina with retinal tissue.
  • a person skilled in the art can confirm whether the structure is a cup-like structure by observation with a microscope, a magnifying glass, or the like.
  • the eyecup-like structure produced in the present invention not only has a morphologically-like eyecup-like protrusion, but also has a high level of Rax, a retinal progenitor cell marker, from cells constituting the eyecup-like structure. Frequent expression is observed.
  • cells constituting retinal tissues such as a retinal pigment epithelial cell layer expressing Mitf are observed in the outer layer of the eyecup-like structure and a retinal progenitor cell expressing Chx10 is observed in the inner layer.
  • Such an eyecup-like structure is very similar to the structure of the eyecup tissue in biological development.
  • the “retinal layer” in the present invention means each layer constituting the retina. Specifically, the retinal pigment epithelium layer, photoreceptor layer, outer boundary membrane, outer granular layer, outer reticulated layer, inner granular layer, inner granular layer, Mention may be made of the reticular layer, the ganglion cell layer, the nerve fiber layer and the inner limiting membrane.
  • the “retinal layer-specific nerve cell” means a cell constituting the retinal layer and specific to the retinal layer.
  • the “retinal progenitor cell” in the present invention refers to a progenitor cell that can differentiate into any mature retinal cell of a photoreceptor cell, a horizontal cell, a bipolar cell, an amacrine cell, and a retinal node cell.
  • photoreceptor precursor cells, horizontal cell precursor cells, bipolar cell precursor cells, amacrine cell precursor cells, and retinal node precursor cells are differentiated into photoreceptor cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, and retinal node cells, respectively. Refers to progenitor cells that have been determined.
  • retinal pigment epithelial cell means an epithelial cell existing outside the neural retinal tissue in the living retina. If it is those skilled in the art, whether it is a retinal pigment epithelial cell, for example, expression of a cell marker (RPE65 (pigment epithelial cell), Mitf (pigment epithelial cell) etc.), presence of melanin granule, characteristic cell of polygon It can be easily confirmed by the form.
  • a cell marker RPE65 (pigment epithelial cell), Mitf (pigment epithelial cell) etc.
  • the medium used in the present invention can be prepared using a medium used for culturing animal cells as a basal medium.
  • a basal medium for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium-199 medium, Eagle-MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, Ham medium, RPMI-1640 medium , Fischer's medium, and mixed media thereof are not particularly limited as long as they can be used for animal cell culture.
  • serum-free medium means a medium that does not contain unconditioned or unpurified serum.
  • a medium mixed with purified blood-derived components or animal tissue-derived components (for example, growth factors) corresponds to a serum-free medium unless it contains unadjusted or unpurified serum.
  • the medium is not particularly limited as long as it is as described above. However, from the viewpoint of avoiding complicated preparation, a serum-free medium (GMEM or DMEM, 0.1 mM 2-mercaptoethanol) to which a suitable amount (for example, 1-20%) of commercially available KSR is added as such a serum-free medium. 0.1 mM non-essential amino acid Mix, 1 mM sodium pyruvate).
  • the serum-free medium may contain a serum substitute.
  • the serum substitute may appropriately contain, for example, albumin, transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace element, 2-mercaptoethanol or 3'thiolglycerol, or an equivalent thereof.
  • Such serum replacement can be prepared, for example, by the method described in WO98 / 30679.
  • a serum substitute can utilize. Examples of such commercially available serum substitutes include Chemically-defined Lipid concentrated (Gibco) and Glutamax (Gibco).
  • the serum-free medium used in suspension culture contains fatty acids or lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, etc. Can be contained.
  • serum medium means a medium containing unadjusted or unpurified serum.
  • the medium is not particularly limited as long as it is as described above.
  • fatty acids or lipids, amino acids (for example, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like can be contained.
  • floating culture refers to culturing under conditions that do not allow cells or cell clusters to adhere to culture equipment or the like.
  • the incubator used for the suspension culture is not particularly limited as long as it can perform “suspension culture”, and can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • Examples of such incubators include flasks, tissue culture flasks, dishes, petri dishes, tissue culture dishes, multi dishes, micro plates, micro well plates, micro pores, multi plates, multi well plates, chamber slides, Petri dishes, tubes, trays, culture bags, and roller bottles.
  • These incubators are preferably non-cell-adhesive from the viewpoint of suspension culture.
  • the non-cell-adhesive incubator those in which the surface of the incubator has not been artificially treated (for example, coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion to cells can be used.
  • primary refers to mammals belonging to the order of primates, and examples of primates include wild monkeys such as lemurs, loris and camellia, and monkeys such as monkeys, apes and humans.
  • the first aspect of the present invention is a method for producing retinal tissue, comprising the following steps (1) to (3).
  • First step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitory substance (2) Coagulation formed in the first step A second step of suspension culture of the aggregate in a serum-free medium containing a basement membrane preparation; and (3) a third step of suspension culture of the aggregate cultured in the second step in a serum medium.
  • the Wnt signal pathway inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by Wnt.
  • Wnt signaling pathway inhibitors include Dkk1, Cerberus protein, Wnt receptor inhibitor, soluble Wnt receptor, Wnt antibody, casein kinase inhibitor, dominant negative Wnt protein, CKI-7 (N- (2- Aminoethyl) -5-chloro-isoquinoline-8-sulfonamide), D4476 (4- ⁇ 4- (2,3-dihydrobenzo [1,4] dioxin-6-yl) -5-pyridin-2-yl- 1H-imidazol-2-yl ⁇ benzamide), IWR-1-endo (IWR1e), IWP-2 and the like.
  • the concentration of the Wnt signal pathway inhibitor used in the present invention may be any concentration that forms aggregates of pluripotent stem cells.
  • a normal Wnt signal pathway inhibitor such as IWR1e
  • it is added at a concentration of about 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably around 3 ⁇ M.
  • the Wnt signal pathway inhibitor may be added to the serum-free medium before the start of suspension culture, or may be added to the serum-free medium within a few days (for example, within 5 days) after the start of suspension culture.
  • the Wnt signal pathway inhibitor is added to the serum-free medium within 5 days after the start of suspension culture, more preferably within 3 days, and most preferably simultaneously with the start of suspension culture.
  • the suspension culture is performed until 18 days, more preferably 12 days after the start of suspension culture, with the addition of a Wnt signal pathway inhibitor.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the first step can be set as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the “aggregate” in the present invention refers to a mass formed by aggregation of cells dispersed in the medium.
  • cells dispersed at the start of suspension culture are formed.
  • aggregates that have already been formed at the start of suspension culture are formed.
  • aggregate formation means qualitatively uniform cells by rapidly aggregating a certain number of dispersed stem cells when cells are aggregated to form cell aggregates and suspended in culture. The formation of an aggregate of
  • Experimental operations for forming aggregates include, for example, a method of confining cells in a small space using a plate with a small well (96-well plate) or a micropore, or a short centrifugation using a small centrifuge tube. Examples thereof include a method for aggregating cells.
  • the concentration of pluripotent stem cells in the first step can be appropriately set by those skilled in the art so as to form aggregates of pluripotent stem cells more uniformly and efficiently.
  • the concentration of pluripotent stem cells at the time of aggregate formation is not particularly limited as long as it is a concentration capable of forming a uniform aggregate of stem cells.
  • a solution prepared so as to be about 2 ⁇ 10 4 cells, most preferably about 9 ⁇ 10 3 cells, is added, and the plate is allowed to stand to form aggregates.
  • the suspension culture time required to form the aggregate can be determined as appropriate depending on the pluripotent stem cell used as long as the cells can be rapidly aggregated, but can be formed to form a uniform aggregate. It is desirable to be as short as possible. For example, in the case of human ES cells, it is desirable to form aggregates preferably within 24 hours, more preferably within 12 hours. A person skilled in the art can appropriately adjust the time until the formation of the aggregates by adjusting a tool for aggregating cells, centrifugation conditions, and the like.
  • the formation of aggregates of pluripotent stem cells is due to the size and number of the aggregates, the macroscopic morphology, the microscopic morphology and its homogeneity by tissue staining analysis, the expression and the homogeneity of differentiation and undifferentiation markers Those skilled in the art can judge based on the expression control and differentiation of differentiation markers, the reproducibility between aggregates of differentiation efficiency, and the like.
  • Basis membrane preparation controls epithelial cell-like cell morphology, differentiation, proliferation, motility, functional expression, etc. when desired cells with basement membrane-forming ability are seeded and cultured on it It includes a basement membrane component that has a function.
  • the “basement membrane component” refers to a thin membrane-like extracellular matrix molecule that exists between an epithelial cell layer and a stromal cell layer in an animal tissue.
  • Basement membrane preparation is prepared by removing cells with basement membrane-forming ability that adhere to the support through the basement membrane using a solution or alkaline solution that has lipid-dissolving ability of the cells. can do.
  • basement membrane preparations include products that are commercially available as basement membrane components (eg, Matrigel (hereinafter sometimes referred to as Matrigel)), and extracellular matrix molecules known as basement membrane components (eg, laminin, type IV collagen, Heparan sulfate proteoglycan, entactin and the like).
  • basement membrane components eg, Matrigel (hereinafter sometimes referred to as Matrigel)
  • extracellular matrix molecules eg, laminin, type IV collagen, Heparan sulfate proteoglycan, entactin and the like.
  • Matrigel is a basement membrane preparation derived from Engelbreth Holm (Swarn (EHS) mouse sarcoma.
  • the main components of Matrigel are type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan and entactin, but in addition to these, TGF- ⁇ , fibroblast growth factor (FGF), tissue plasminogen activator, and EHS tumor are naturally produced Growth factors are included.
  • Matrigel's “growth factor factor reduced product” has a lower concentration of growth factor than normal Matrigel, with standard concentrations of EGF ⁇ 0.5 ng / ml, NGF ⁇ 0.2 ng / ml, PDGF ⁇ 5 pg / Ml, IGF-1 is 5 ng / ml, and TGF- ⁇ is 1.7 ng / ml. In the method of the present invention, it is preferable to use "growthfactory reduced product”.
  • the concentration of the basement membrane preparation added to the serum-free medium in the suspension culture in the second step is not particularly limited as long as the epithelial structure of nerve tissue (for example, retinal tissue) is stably maintained.
  • the basement membrane preparation may already be added to the medium at the start of stem cell culture, but is preferably added to the serum-free medium within 5 days after the start of suspension culture, more preferably within 2 days after the start of suspension culture. .
  • the serum-free medium used in the second step can be the same as the serum-free medium used in the first step, or can be replaced with a new serum-free medium.
  • a “basement membrane preparation” may be added to the medium.
  • the serum-free medium used for suspension culture in the first step and the second step is not particularly limited as long as it is as described above.
  • a serum-free medium GMEM or DMEM, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential
  • KSR Knockout Serum Replacement
  • the dose of KSR to the serum-free medium is not particularly limited. For example, in the case of human ES cells, it is usually 1 to 20%, preferably 2 to 20%.
  • Culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration in the second step can be set as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the serum medium used in the third step may be a serum medium directly added to the serum-free medium used in the second step, or a new serum medium.
  • Serum added to the medium in the third step is, for example, bovine serum, calf serum, fetal calf serum, horse serum, foal serum, horse fetal serum, rabbit serum. Sera from mammals such as baby rabbit serum, rabbit fetal serum, and human serum can be used.
  • Serum is added after 7 days from the start of suspension culture, more preferably after 9 days, and most preferably after 12 days.
  • the serum concentration is about 1 to 30%, preferably about 3 to 20%, more preferably around 10%.
  • the serum medium used in the third step is not particularly limited as long as it is as described above, but the serum-free medium (GMEM or DMEM, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid Mix, 1 mM pyruvin). It is preferable to use a solution obtained by adding serum to (sodium acid). Moreover, you may use what added a suitable quantity of commercially available KSR (Knockout Serum Replacement) as this serum culture medium.
  • GMEM or DMEM 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid Mix, 1 mM pyruvin. It is preferable to use a solution obtained by adding serum to (sodium acid). Moreover, you may use what added a suitable quantity of commercially available KSR (Knockout Serum Replacement) as this serum culture medium.
  • the production efficiency of retinal tissue can be increased by adding an Shh signal pathway agent in addition to serum.
  • the substance acting on the Shh signal pathway is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Shh.
  • substances acting on the Shh signal pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purmorphamine, SAG and the like.
  • the concentration of the Shh signal pathway agonist used in this step is about 0.1 nM to 10 ⁇ M, preferably about 10 nM to 1 ⁇ M, more preferably around 100 nM in the case of a normal Shh signal pathway agonist such as SAG. Added.
  • the retinal tissue thus produced exists so as to cover the surface of the aggregate. Confirmation that the retinal tissue was produced by the production method of the present invention can be confirmed by the immunostaining method described in (4) below. It is also possible to physically cut out the retinal tissue present on the surface of the aggregate from the aggregate using tweezers or the like. In this case, since a nerve tissue other than the retinal tissue may be formed on the surface of each aggregate, a part of the nerve tissue cut out from the aggregate is cut out and used to immunostain according to (4) By confirming by a method or the like, it is possible to confirm that the tissue is a retinal tissue.
  • a retinal tissue can be produced through the first to third steps described above. Furthermore, it can be confirmed that the retinal tissue is produced by the first to third steps by the following method.
  • Aggregates cultured in the third step are suspended in serum medium.
  • the incubator used in the suspension culture include those described above.
  • Other culture conditions such as culture temperature, CO 2 concentration, and O 2 concentration in suspension culture can be set as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • the O 2 concentration is, for example, 20 to 70%, preferably 20 to 60%, more preferably 30 to 50%.
  • the culture time in this step is not particularly limited, but is usually 48 hours or longer, preferably 7 days or longer.
  • Confirmation of retinal tissue can be done by fixing the aggregate with a fixative such as paraformaldehyde solution after completion of suspension culture, preparing a frozen section, and confirming that the layer structure is formed by immunostaining.
  • a fixative such as paraformaldehyde solution
  • retinal progenitor cells visual cells, horizontal cells, bipolar cells, amacrine cells, retinal node cells
  • retinal tissue uses antibodies against the above markers expressed in these cells, It can be confirmed that a layer structure is formed by immunostaining.
  • the second aspect of the present invention includes a step of subjecting the retinal tissue obtained by the above-mentioned ⁇ Method for producing retinal tissue> to suspension culture in a serum-free medium or serum medium containing a Shh signal pathway agonist and a Wnt signal pathway agonist. It is a manufacturing method of the eyecup-like structure characterized by including.
  • As the retinal tissue obtained by the above ⁇ Retinal tissue production method> an aggregate containing the retinal tissue cultured in the third step of ⁇ Retinal tissue production method> can be used.
  • a method for producing an eyecup-like structure including the following steps (1) to (4) can be mentioned: (1) First step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitory substance (2) Coagulation formed in the first step Second step of suspension culture of aggregate in serum-free medium containing basement membrane preparation (3) Third step of suspension culture of aggregate cultured in second step in serum medium and (4) Third Fourth step of suspension culture of the aggregate cultured in the step in a serum-free medium or serum medium containing a Shh signal pathway agonist and a Wnt signal pathway agonist.
  • the substance acting on the Shh signal pathway is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Shh.
  • substances acting on the Shh signal pathway include proteins belonging to the Hedgehog family (for example, Shh), Shh receptors, Shh receptor agonists, Purmorphamine, SAG and the like.
  • the concentration of the Shh signal pathway agonist used in the second present invention is about 0.1 nM to 10 ⁇ M, preferably about 10 nM to 1 ⁇ M, more preferably around 100 nM in the case of a normal Shh signal pathway agonist such as SAG. Add at a concentration of
  • Wnt signal pathway agonists examples include proteins belonging to the Wnt family, Wnt receptors, Wnt receptor agonists, GSK3 ⁇ inhibitors (for example, 6-Bromoindirubin-3′-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) and the like. It is done.
  • the concentration of the Wnt signal pathway agonist used in the second present invention is about 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to 30 ⁇ M, more preferably 3 ⁇ M. Add before and after concentration.
  • Shh signal pathway agonist and Wnt signal pathway agonist within 12 to 25 days after the start of suspension culture. Preferably, it is added within 15 days and 18 days. At this time, it is preferable to use a medium that does not contain a Wnt signal pathway inhibitor added in the aggregate formation step.
  • a cup-like structure is formed in a protrusion shape from the aggregate.
  • a person skilled in the art can confirm whether the structure is a cup-like structure by observation with a microscope, a magnifying glass, or the like.
  • the eyecup-like structure manufactured in this way is formed from a two-layer structure of an outer layer and an inner layer. Since retinal pigment epithelial cells are present in the outer layer and retinal progenitor cells are present in the inner layer, for example, by preparing a frozen section of this eyecup-like structure and performing immunostaining, retinal progenitor cells, retinal pigment epithelial cells and Can be confirmed.
  • the eyecup-like structure produced by the method of the present invention is formed into a protrusion from the aggregate, the eyecup-like structure is cut out physically and morphologically from the aggregate. Can be dispersed (for example, trypsin / EDTA treatment) and sorted using FACS to obtain high-purity retinal progenitor cells.
  • the method for cutting out the eyecup-like structure is not particularly limited, and can be easily cut out from the aggregate of stem cells using fine tweezers or the like.
  • a third aspect of the present invention is a method for producing a retinal layer-specific nerve cell, which comprises contacting a retinal progenitor cell contained in a retinal tissue derived from a primate pluripotent stem cell with a Notch signal pathway inhibitor.
  • retinal layer-specific neurons can be produced from retinal progenitor cells.
  • retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells The “retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells” used in the method for producing retinal layer-specific neurons will be described.
  • Examples of the retinal tissue derived from primate pluripotent stem cells include, for example, the retinal tissue obtained by the above ⁇ Method for producing retinal tissue>, or the eyecup-like structure obtained by the above ⁇ Method for producing eyecup-like structure>.
  • Retinal tissue produced from the body can be used.
  • the retinal tissue can be produced by further suspension culture of the eyecup-like structure formed in the fourth step of the above ⁇ Method for producing eyecup-like structure>.
  • the eyecup-like structure is formed into a protrusion shape from the aggregate, so that a high-purity retinal tissue is obtained by physically and morphologically cutting the protrusion from the aggregate and separating and culturing. be able to.
  • the method for cutting out the eyecup-like structure is not particularly limited, and can be easily cut out from the aggregate of stem cells using fine tweezers or the like.
  • the retinal tissue and eyecup-like structure produced as described above contain retinal progenitor cells.
  • the retinal progenitor cells By contacting the retinal progenitor cells with a Notch signaling pathway inhibitor, the retinal progenitor cells can be retinal layer-specific nerves. Cells can be produced.
  • Notch signaling pathway inhibitor used in the method for producing a retinal layer-specific nerve cell will be described.
  • the Notch signal pathway inhibitor is not particularly limited as long as it can inhibit signal transduction mediated by Notch.
  • Examples of the Notch signal pathway inhibitor include Notch antibody, Notch receptor antagonist, ADAM inhibitor, gamma secretase inhibitor and the like.
  • Examples of the gamma secretase inhibitor include N- [N- (3,5-difluorophenacetyl) -L-alanyl] -S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT).
  • the concentration of the gamma secretase inhibitor is not particularly limited as long as it is a concentration that can promote differentiation from retinal progenitor cells to photoreceptor progenitor cells or photoreceptor cells.
  • a concentration can be, for example, about 0.1 to 1000 ⁇ M, preferably about 1 to 100 ⁇ M, more preferably about 10 ⁇ M for a common gamma secretase inhibitor.
  • the gamma secretase inhibitor is added to the medium within 15 to 200 days after the start of suspension culture of primate pluripotent stem cells among retinal tissues produced from primate pluripotent stem cells.
  • the gamma secretase inhibitor is added to the medium at a time within 20 days after differentiation induction and within 150 days, more preferably within 25 days after differentiation induction within 100 days.
  • the period of adhesion culture in the presence of a gamma secretase inhibitor may be of a length that allows more efficient production of photoreceptor precursor cells or photoreceptor cells.
  • the length of such a period can be, for example, about 3 days or more, preferably about 5 to 100 days, more preferably about 7 to 30 days.
  • retinal layer-specific nerve cells As a method for confirming retinal layer-specific nerve cells produced as described above, the case where the retinal layer-specific nerve cells are photoreceptor cells, photoreceptor precursors, and ganglion cells will be described as an example.
  • the produced retinal layer-specific neurons are photoreceptor precursor cells can be confirmed by a known method, for example, expression of photoreceptor precursor cell markers.
  • the photoreceptor cell progenitor cell marker include Crx.
  • Photocells include rod photoreceptors and cone photoreceptors. Whether or not the produced cell is a photoreceptor can be confirmed by a method known per se, for example, expression of a photoreceptor marker. Examples of photoreceptor markers include rhodopsin (rod photoreceptor cells), red / green opsin (cone photoreceptor cells), blue opsin (cone photoreceptor cells), and recoverins (rod photoreceptor cells, cone photoreceptor cells). Can be mentioned.
  • the produced retinal layer-specific nerve cell is a ganglion cell can be confirmed by a known method, for example, expression of a ganglion cell marker.
  • a ganglion cell marker include Brn3.
  • photoreceptor precursor cells or photoreceptor cells can be isolated from the retinal tissue. This isolation can be carried out by a method known per se (cell sorter or the like) using an antibody against photoreceptor precursor cells or photoreceptor surface markers.
  • ganglion cells can be isolated from retinal tissue after completion of culture. This isolation can be performed by a method known per se (cell sorter or the like) using an antibody against the surface marker of ganglion cells.
  • a gene encoding a marker for photoreceptor progenitor cells for example, Crx
  • a marker for photoreceptor cells for example, recoverin
  • a marker gene for a marker for ganglion cells for example, a fluorescent protein such as GFP
  • a retinal tissue obtained by the above-described ⁇ Method for producing retinal tissue> is obtained from a serum-free medium or serum medium containing a Wnt signal pathway agonist (however, a sonic hedgehog signal pathway agent is not included).
  • a method for producing retinal pigment epithelial cells comprising a step of suspension culture in the medium.
  • an aggregate containing the retinal tissue cultured in the third step of ⁇ Retinal tissue production method> can be used as the retinal tissue obtained by the above ⁇ Retinal tissue production method>.
  • a method for producing retinal pigment epithelial cells characterized by comprising the following steps (1) to (4): (1) First step of forming pluripotent stem cell aggregates by suspension culture in a serum-free medium containing a Wnt signal pathway inhibitory substance (2) Coagulation formed in the first step Second step of suspension culture of aggregate in serum-free medium containing basement membrane preparation (3) Third step of suspension culture of aggregate cultured in second step in serum medium, and (4) First Aggregates cultured in three steps are subjected to suspension culture in a serum-free medium or serum medium containing a Wnt signal pathway agent, wherein the serum-free medium and serum medium do not contain a sonic hedgehog signal pathway agent The fourth step to do.
  • the Wnt signaling pathway agonist for example, a protein belonging to the Wnt family, a Wnt receptor, a Wnt receptor agonist, a GSK3 ⁇ inhibitor (eg, 6-Bromoindirubin-3′-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) Etc.
  • a GSK3 ⁇ inhibitor eg, 6-Bromoindirubin-3′-oxime (BIO), CHIR99021, Kenpaullone
  • the concentration of the Wnt signal pathway agonist used in the fourth present invention is about 0.1 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably about 1 ⁇ M to 30 ⁇ M, more preferably 3 ⁇ M. Add before and after concentration.
  • the Wnt signal pathway agonist is added on or after the 12th day after the start of production, most preferably on the 15th day.
  • a medium not containing the Wnt signal pathway inhibitor added in the first step and the Shh signal pathway agonist added in the third step is used.
  • a retinal tissue or an aggregate containing a retinal tissue obtained by the above ⁇ Method for producing retinal tissue> is used as a serum-free medium or serum medium containing a Wnt signal pathway agonist and an Activin signal pathway agonist It is preferable to culture in.
  • Activin signal pathway acting substance is not particularly limited as long as it can enhance signal transduction mediated by Activin.
  • the Activin signal pathway agonist include proteins belonging to the Activin family (for example, Activin A, Activin B, Activin CActivin AB, etc.), Activin receptor, Activin receptor agonist and the like.
  • the concentration of the Activin signal pathway agonist used in this step is 1 ng / ml to 10 ug / ml in the case of a normal Activin signal pathway agonist such as RecombinantReHuman / Mouse / Rat Activin A (R & D systems # 338-AC).
  • ml preferably about 10 ng / ml to 1 ug / ml, more preferably around 100 ng / ml.
  • retinal pigment epithelial cells thus produced are present on the surface of the aggregate, they can be easily confirmed by microscopic observation or the like. It is also possible to obtain high-purity retinal pigment epithelial cells by using, for example, dispersion treatment (for example, trypsin / EDTA treatment) using an aggregate in which retinal pigment epithelial cells are present, and sorting using FACS. It is also possible to physically cut out retinal pigment epithelial cells from the aggregates using tweezers or the like and culture them. The dispersed or excised retinal pigment epithelial cells can be cultured under adhesive conditions.
  • a cell adhesive culture vessel for example, a culture vessel coated with an extracellular matrix or the like (eg, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • culture conditions such as culture temperature, CO 2 concentration, and O 2 concentration in adhesion culture can be easily determined by those skilled in the art.
  • the culture may be performed in the presence of serum, a known growth factor, an additive for promoting growth, or a chemical substance.
  • known growth factors include EGF and FGF.
  • additives that promote growth include N2 supplement (Invitrogen) and B27 supplement (Invitrogen).
  • the retinal tissue, eyecup-like structure, retinal layer-specific nerve cell or retinal pigment epithelial cell produced by the first to fourth inventions is used for screening for a therapeutic agent for a disease based on a disorder of retinal tissue or retinal related cells. It can be used as a cell therapy transplant material, a disease research material, or a drug discovery material for a therapeutic agent in a cell damage state caused by other causes. It can also be used for toxicity studies such as phototoxicity, toxicity tests, etc. in the evaluation of toxicity and drug efficacy of chemical substances.
  • diseases based on disorders of retinal tissue or retinal-related cells include organic mercury poisoning, chloroquine retinopathy, retinitis pigmentosa, age-related macular degeneration, glaucoma, diabetic retinopathy, retinopathy of newborn, and the like. .
  • ⁇ Use as a biomaterial for transplantation of retinal tissue, eyecup-like structure, retinal layer-specific nerve cells or retinal pigment epithelial cells The retinal tissue, eyecup-like structure, retinal layer-specific nerve cell or retinal pigment epithelial cell produced according to the first to fourth aspects of the present invention, in the cell damage state, the cell or the damaged tissue itself. It can be used as a biomaterial for transplantation used for replenishment (for example, used for transplantation surgery). Examples of the transplantation method include, but are not limited to, the methods described in Examples below.
  • RAX knock-in human ES cells A human ES cell line in which GFP was knocked in at the RAX locus, which is one of the marker genes of retinal progenitor cells, was prepared.
  • Zinc Finger Nuclease (ZFN) that specifically cleaves the RAX gene on the genomic DNA of a human ES cell line (KhES-1: human ES cell line established by Kyoto University) was purchased from SigmaAldrich.
  • Neomycin treated with mitomycin C by co-introducing ZFN-encoding mRNA, GFP, and a knock-in vector loaded with a neomycin resistance gene, which is a drug selection gene, by electroporation using single humanized ES cells Seeded onto resistant mouse fibroblasts.
  • G418 was added to the medium to select the drug.
  • the obtained colonies of resistant clones were picked up and cultured, and knock-in cells were selected by PCR or Southern blotting to establish a RAX :: GFP knock-in human ES cell line.
  • RAX GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and were used for experiments. Using. The medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells were monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and 9 ⁇ 10 ⁇ 3 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon spheroid plate, Sumitomo Bakelite)
  • the suspension culture was carried out in 100 ⁇ l of serum-free medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium As the serum-free medium at that time, a serum-free medium in which 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 20 ⁇ M Y27632 was added to G-MEM medium was used.
  • RAX GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and were used for experiments. Using. The medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used. Suspension culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 9 ⁇ 10 3 cells per well were obtained.
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, Nodal signal pathway inhibitor (10 ⁇ M SB431542) is used as the serum-free medium. It was. In addition, from the second day of suspension culture, 1/100 amount of Matrigel per volume was added and suspension culture was performed. Thereafter, the suspension culture was continued, and on the 18th day from the beginning of suspension culture, the ratio of GFP-expressing cells was confirmed using a fluorescence microscope and FACS. As a result, some GFP-expressing cells were observed (FIGS. 1C and D).
  • RAX GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and were used for experiments. Using. The medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used. Suspension culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 9 ⁇ 10 3 cells per well were obtained.
  • a serum-free medium As the serum-free medium, a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was. In addition, from the second day of suspension culture, 1/100 amount of Matrigel per volume was added and suspension culture was performed. Thereafter, suspension culture was continued, and on the 18th day from the start of suspension culture, observation of the fluorescence microscope and confirmation of the ratio of GFP-expressing cells using FACS were performed. As a result, GFP-expressing cells were clearly increased as compared with Comparative Examples 1 and 2 (FIGS. 1E and F).
  • Example 1 Production of retinal tissue using human ES cells (Wnt signal pathway inhibitor and Matrigel, serum addition conditions)
  • RAX GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and were used for experiments. Using. The medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used. Suspension culture was performed in 100 ⁇ l of serum-free medium at 37 ° C. and 5% CO 2 so that 9 ⁇ 10 3 cells were obtained per well.
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was. In addition, from the second day of suspension culture, 1/100 amount of Matrigel per volume was added and suspension culture was performed. Furthermore, 1/10 amount of fetal calf serum per volume was added on the 12th day from the start of suspension culture. Thereafter, the suspension culture was continued, and on the 18th day from the beginning of suspension culture, the ratio of GFP-expressing cells was confirmed using a fluorescence microscope and FACS.
  • Example 2 Production of retinal tissue using human ES cells (Wnt signal pathway inhibitor and Matrigel, serum and Shh signal agent addition conditions)
  • RAX GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and were used for experiments. Using. The medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used. Suspension culture was performed in 100 ⁇ l of serum-free medium at 37 ° C. and 5% CO 2 so that 9 ⁇ 10 3 cells were obtained per well.
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was.
  • a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was.
  • 1/100 amount of Matrigel per volume was added and suspension culture was performed.
  • 1/10 amount of fetal calf serum and Shh signal pathway agonist (100 nM SAG) per volume were added and suspension culture was performed.
  • the ratio of GFP-expressing cells was examined using FACS.
  • Example 3 Confirmation of formation of retinal tissue (Method)
  • the aggregates having GFP-expressing cells produced in Examples 2 and 3 were confirmed for retinal tissue formation. From the 18th day of suspension culture, suspension culture was performed under 40% O 2 using DMEM / F12 medium supplemented with N2 supplement, 10% (v / v) fetal bovine serum, and 0.5 ⁇ M retinoic acid. It was. Thereafter, the aggregate was fixed with a 4% paraformaldehyde solution, a frozen section was prepared, and the tissue structure was confirmed by immunostaining.
  • Example 4 Transplantation of retinal tissue produced from human ES cells into the eye After scleral incision of the eyeball, an injection needle is inserted into the vitreous from the scleral incision to reduce intraocular pressure. An intraocular perfusate is injected from the scleral incision into the subretinal space using a cell transplant needle to artificially form a shallow retinal detachment state. A retinal tissue is transplanted into the formed space using a cell transplant needle or a cell sheet transplant device.
  • Example 5 Production of highly efficient eyecup-like structure using human ES cells (Method) Eyecup-like structures were produced using RAX :: GFP knock-in human ES cells. RAX :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were cultured according to the methods described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and were used for experiments. Using.
  • the medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • KSR Kinnockout Serum Replacement
  • 0.1 mM 2-mercaptoethanol 1 mM pyruvic acid
  • 5-10 ng / ml bFGF a non-cell-adhesive 96-well culture plate.
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 9 ⁇ 10 3 cells per well were formed, and an aggregate was rapidly formed, followed by suspension culture at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was. Further, from the second day of suspension culture, 1/100 amount of Matrigel per volume was added and cultured.
  • a frozen section of this eyecup-like structure was prepared and immunostained, and a layer of retinal pigment epithelial cells expressing Mitf was present on the outside, and Chx10-positive neuroretinal progenitor cells were present on the inside ( FIG. 7).
  • Example 6 Transplantation of eyecup-like structure produced from human ES cells into the eye After scleral incision of the eyeball, an injection needle is inserted into the vitreous from the scleral incision to reduce intraocular pressure. An intraocular perfusate is injected from the scleral incision into the subretinal space using a cell transplant needle to artificially form a shallow retinal detachment state. An eye cup-like structure cultured using a cell transplant needle or a cell sheet transplant device is transplanted into the formed space.
  • Example 7 Notch signal agent treatment of human ES cell-derived retinal tissue Crx :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were treated with "Ueno, M. et al. PNAS 2006""Watanabe, K. et al. It was cultured according to the method described in “Nat Biotech 2007” and used for the experiment.
  • the medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells were monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and 9 ⁇ 10 ⁇ 3 cells per well of a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon spheroid plate, Sumitomo Bakelite)
  • the suspension culture was carried out in 100 ⁇ l of serum-free medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was.
  • the prepared frozen sections were immunostained for Recoverin, which is one of the marker genes for photoreceptor cells, and Brn3, which is one of the ganglion cell marker genes, and the results with and without DAPT added were compared.
  • Recoverin which is one of the marker genes for photoreceptor cells
  • Brn3 which is one of the ganglion cell marker genes
  • Example 8 Treatment of a human ES cell-derived retinal tissue after freeze-thawing with a Notch signal agent RAX :: GFP knock-in human ES cells (derived from KhES-1) were expressed as “Ueno, M. et al. PNAS 2006” “Watanabe, K et al. Nat Biotech 2007 "was cultured according to the method described in the above and used for the experiment.
  • the medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used. Suspension culture was performed at 37 ° C. and 5% CO 2 in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 9 ⁇ 10 3 cells per well were obtained.
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was. In addition, a serum-free medium supplemented with 1/100 volume of Matrigel per volume from the second day of suspension culture was used. Further, from the second day of culture, 1/100 volume of Matrigel per volume was added, and suspension culture was performed.
  • the prepared frozen sections were immunostained for Recoverin, which is one of the photoreceptor marker genes, and Brn3, which is one of the ganglion cell marker genes, and the results with and without the addition of DAPT were compared.
  • Recoverin which is one of the photoreceptor marker genes
  • Brn3 which is one of the ganglion cell marker genes
  • Example 9 Transplantation of retinal layer-specific nerve cells produced from human ES cells into the eye After scleral incision of the eyeball, an injection needle is inserted into the vitreous body from the scleral incision to reduce intraocular pressure. An intraocular perfusate is injected from the scleral incision into the subretinal space using a cell transplant needle to artificially form a shallow retinal detachment state. Retinal layer-specific neurons are transplanted into the formed space using a cell transplant needle or a cell transplant device.
  • Example 10 Production of highly efficient retinal pigment epithelial cells using human ES cells (Method)
  • Human ES cells (KhES-1) were cultured according to the method described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and used for experiments.
  • the medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used.
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of a serum-free medium so that 9 ⁇ 10 3 cells per well were formed, and an aggregate was rapidly formed, followed by culturing at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was. In addition, from the second day of suspension culture, 1/100 amount of Matrigel per volume was added and suspension culture was performed. On the 12th day from the start of suspension culture, the aggregate was transferred to a serum-free medium containing no Wnt signal pathway inhibitor, and 1/10 amount of fetal bovine serum per volume was added and cultured.
  • Example 11 Production of retinal pigment epithelial cells using human ES cells (Method)
  • Human ES cells (KhES-1) were cultured in suspension according to the method described in “Ueno, M. et al. PNAS 2006” and “Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007” and used for experiments.
  • the medium used was a DMEM / F12 medium (Invitrogen) supplemented with 20% KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvic acid, 5-10 ng / ml bFGF.
  • ES cells are monodispersed using 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), and a non-cell-adhesive 96-well culture plate (Sumilon Spheroid Plate, Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) is used.
  • the suspension was suspended in 100 ⁇ l of serum-free medium so that 9 ⁇ 10 3 cells per well were formed, and an aggregate was rapidly formed, followed by suspension culture at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • serum-free medium a serum-free medium supplemented with 20% KSR, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM pyruvate, 20 ⁇ M Y27632, a Wnt signal pathway inhibitor (3 ⁇ M IWR1e) is used as the serum-free medium. It was. Further, from the second day of culture, 1/100 volume of Matrigel per volume was added, and suspension culture was performed. On the 12th day after the start of suspension culture, the aggregate was transferred to a serum-free medium containing no Wnt signal pathway inhibitor, and cultured with 1/10 volume of fetal bovine serum added per volume.
  • suspension culture was carried out in a medium containing a Wnt signaling pathway agonist (3 ⁇ M CHIR99021) and an Activin signaling pathway agonist (Recombinant Human / Mouse / Rat Activin A (R & D systems # 338-AC) 100 ng / ml).
  • a Wnt signaling pathway agonist 3 ⁇ M CHIR99021
  • an Activin signaling pathway agonist Recombinant Human / Mouse / Rat Activin A (R & D systems # 338-AC) 100 ng / ml.
  • Example 12 Transplantation of retinal pigment epithelial cells produced from human ES cells into the eye After the scleral incision of the eyeball, an injection needle is inserted into the vitreous from the scleral incision to reduce the intraocular pressure. An intraocular perfusate is injected from the scleral incision into the subretinal space using a cell transplant needle to artificially form a shallow retinal detachment state. Retinal pigment epithelial cells are transplanted into the formed space using a cell transplant needle or a cell sheet transplant device.
  • the production method of the present invention is a method for efficiently producing a cell group (photocell, optic nerve, etc.) constituting a retinal tissue for the purpose of toxicity and drug efficacy evaluation of a chemical substance, cell therapy, etc., and a retinal tissue having a tissue structure It is very useful from the viewpoint of efficiently producing retinal tissue, which is a "tissue material" for use in testing and treatment, for the purpose of evaluating toxicity and drug efficacy using glycine and applying it to transplantation materials for retinal tissue transplantation treatment. is there.

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Abstract

　本発明は、［１］下記（１）～（３）の工程を含むことを特徴とする網膜組織の製造方法： （１）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、 （２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、及び （３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程； ［２］上記第三工程で培養された網膜組織を含む凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする眼杯様構造体の製造方法； ［３］上記第三工程で培養された網膜組織を含む凝集体を、Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地（但し、前記無血清培地及び血清培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物を含まない）中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする網膜色素上皮細胞の製造方法；及び ［４］霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法； を提供する。

Description

網膜組織及び網膜関連細胞の製造方法
　本発明は、網膜組織、並びに網膜層特異的神経細胞及び網膜色素上皮細胞等の網膜関連細胞の製造方法等に関するものである。
　脳や網膜などの中枢神経系組織は、再生能力が低く、障害を受けた組織が自然回復することはほとんどない。そのため、多能性幹細胞から分化させた細胞を移植して治療する再生医療は、難病克服の切り札として期待されている。また、多能性幹細胞から分化させて得られたヒト由来の細胞は、ヒトに対する化学物質の影響を精緻に評価できると考えられ、化合物の毒性評価や創薬への利用に向けた研究開発も進められている。
　網膜は光を受容し、電気シグナルに変換して、さらに情報処理後に、脳の視覚中枢へ軸索を介して情報を伝える重要な感覚組織である。網膜は大きく内外2つの上皮組織が重なってできている。内側は光を受容し、情報処理を行なう神経網膜であり、視細胞などの複数種類の細胞を含む。外側は、視細胞の生存と機能をサポートする1層の細胞シートである網膜色素上皮である。
　これまでに、神経網膜を構成する網膜層特異的神経細胞（視細胞、水平細胞、アマクリン細胞、神経節細胞など）を多能性幹細胞から製造する報告が知られている（特許文献１）。また、多能性幹細胞から立体的な網膜組織を製造する方法として、無血清培地中で均一な多能性幹細胞の凝集体を形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養することで、網膜前駆組織、眼杯様構造体及び多層の神経網膜組織を試験管内で製造できることが記載されている（非特許文献１及び特許文献２）。
　一方、多能性幹細胞を用いて網膜色素上皮細胞を製造する報告も知られているが（非特許文献２）、高効率に網膜色素上皮細胞を製造したとの報告はない。
国際公開第2008/087917号 国際公開第2011/055855号
Mototsugu Eiraku, Nozomu Takata, Hiroki Ishibashi, Masako Kawada, Eriko Sakakura, Satoru Okuda, Kiyotoshi Sekiguchi, Taiji Adachi & Yoshiki Sasai (2011) Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature Volume: 472, Pages: 51-56 Maria Idelson, Ruslana Alper, Alexey Obolensky, Etti Ben-Shushan, Itzhak Hemo, Nurit Yachimovich-Cohen, Hanita Khaner, Yoav Smith, Ofer Wiser, Michal Gropp, Malkiel A. Cohen, Sharona Even-Ram, Yael Berman-Zaken, Limor Matzrafi, Gideon Rechavi, Eyal Banin, and Benjamin Reubinoff (2009)　 Directed Differentiation of HumanEmbryonic Stem Cells into Functional Retinal Pigment Epithelium Cells. Cell Stem Cell 5, 396-408
　網膜組織、眼杯様構造体及び網膜層特異的神経細胞や、網膜色素上皮細胞を、さらに効率よく製造する方法が切望されていた。
　本発明者らは、このような状況を鑑み鋭意検討した結果、本発明に至った。
　即ち、本発明は以下の通りである。
［１］　下記（１）～（３）の工程を含むことを特徴とする網膜組織の製造方法。
（１）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程
［２］　前記［１］記載の方法により得られた網膜組織を、ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Shh」という場合がある）シグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、眼杯様構造体の製造方法。
［３］　前記［１］記載の方法により得られた網膜組織を、Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地（但し、前記無血清培地及び血清培地は、ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」という場合がある）シグナル経路作用物を含まない）中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、網膜色素上皮細胞の製造方法。
［４］　前記Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地が、Activinシグナル経路作用物質をさらに含む、前記［３］記載の方法。
［５］　前記多能性幹細胞が、霊長類多能性幹細胞であることを特徴とする前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［６］　前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であることを特徴とする前記［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
［７］　前記基底膜標品が、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびエンタクチンからなる群から選ばれる少なくとも１つの細胞外マトリックス分子であることを特徴とする前記［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］　前記第一工程乃至第三工程が、ノックアウト血清代替物（以下、「ＫＳＲ」という場合がある）存在下で行われることを特徴とする前記［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］　霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法。
［１０］　前記Notchシグナル経路阻害物質が、ガンマセクレターゼ活性阻害物質であることを特徴とする前記［９］記載の方法。
［１１］　前記Notchシグナル経路阻害物質が、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシン　ｔ－ブチルエステル（以下、「ＤＡＰＴ」という場合がある）であることを特徴とする前記［９］又は［１０］記載の方法。
［１２］　前記霊長類が、ヒトであることを特徴とする前記［９］～［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］　網膜層特異的神経細胞が視細胞であることを特徴とする前記［９］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］　網膜層特異的神経細胞が神経節細胞であることを特徴とする前記［９］～［１２］のいずれかに記載の方法。
［１５］　霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞が、以下の工程で製造された網膜組織に含まれる網膜前駆細胞であることを特徴とする前記［９］～［１４］のいずれかに記載の方法。
（１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程および
（４）第三工程で培養された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグ（以下、「Ｓｈｈ」という場合がある）シグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養することにより、眼杯様構造体を形成させる第四工程
（５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程
［１６］　前記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞を含有してなる、毒性・薬効評価用試薬。
［１７］　前記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞に被検物質を接触させ、該物質が該組織、該構造体又は該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
［１８］　前記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞を含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤。
［１９］　前記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法により製造される、有効量の網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
［２０］　網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための前記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞。
　本発明によれば、高効率に網膜組織、眼杯様構造体、網膜層特異的神経細胞又は網膜色素上皮細胞を製造することが可能である。従って、本発明は、化学物質等の毒性・薬効評価や移植治療などを目的として、網膜組織、眼杯様構造体、網膜層特異的神経細胞又は網膜色素上皮細胞を効率よく提供するという観点から非常に有用である。
図１はWntシグナル経路阻害物質を添加せず、Matrigel（以下、マトリゲルという場合もある）のみを添加して製造されたヒト多能性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始25日目の明視野像（A）と蛍光像（B）、Nodalシグナル経路阻害物質及びマトリゲルを添加して製造されたヒト多能性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始25日目の明視野像（C）と蛍光像（D）、Wntシグナル経路阻害物質及びマトリゲルを添加して製造されたヒト多能性幹細胞由来凝集体の浮遊培養開始25日目の明視野像（E）と蛍光像（F）を示す図である。 図２はWntシグナル経路阻害物質を添加してヒト多能性幹細胞を浮遊培養した後、マトリゲル存在下で浮遊培養し、さらに牛胎児血清非存在下で浮遊培養した凝集体の浮遊培養開始18日目の明視野像（A）と蛍光像（B）、Wntシグナル経路阻害物質を添加してヒト多能性幹細胞を浮遊培養した後、マトリゲル存在下で浮遊培養し、さらに牛胎児血清存在下で浮遊培養した凝集体の浮遊培養開始18日目の明視野像（C）と蛍光像（D）、Wntシグナル経路阻害物質を添加してヒト多能性幹細胞を浮遊培養した後、マトリゲル存在下で浮遊培養し、さらに牛胎児血清及びソニック・ヘッジホッグ（以下、「Shh」という場合がある）シグナル経路作用物質存在下で浮遊培養した凝集体の浮遊培養開始18日目の明視野像（E）と蛍光像（F）を示す図である。 図３はWntシグナル経路阻害物質を添加してヒト多能性幹細胞を浮遊培養した後、マトリゲル存在下で浮遊培養し、さらに牛胎児血清非存在下で浮遊培養した浮遊培養開始18日目の凝集体を構成するGFP発現細胞のFACSヒストグラム（A）、Wntシグナル経路阻害物質を添加してヒト多能性幹細胞を浮遊培養した後、マトリゲル存在下で浮遊培養し、さらに牛胎児血清存在下で浮遊培養した浮遊培養開始18日目の凝集体を構成するGFP発現細胞のFACSヒストグラム（B）、Wntシグナル経路阻害物質を添加してヒト多能性幹細胞を浮遊培養した後、マトリゲル存在下で浮遊培養し、さらに牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質存在下で浮遊培養した浮遊培養開始18日目の凝集体を構成するGFPは発現細胞のFACSヒストグラム（C）及び、網膜前駆細胞であるGFP強陽性細胞の割合のグラフ（D）である。 図４は本発明の網膜組織の製造方法により製造した浮遊培養開始60日目の網膜組織（A,B,C）及び浮遊培養開始126日目の網膜組織（D,E,F,G,H,I）の免疫染色結果を示す図である。 図５は本発明の眼杯様構造体の製造方法により浮遊培養を行った凝集体の浮遊培養開始後14日目（A）、15日目（B）、16日目（C）、17日目（D）の同一部分の明視野及び蛍光像を重ね合わせた像を示す図である。 図６は本発明の眼杯様構造体の製造方法により浮遊培養開始後24～26日まで浮遊培養した凝集体の顕微鏡観察による明視野像（A）、蛍光像（B）と、2光子顕微鏡観察像（C）および2光子顕微鏡観察像から得られた３D再構成イメージ（D）を示す図である。 図７は本発明の眼杯様構造体の製造方法により浮遊培養を行って製造された眼杯様構造体の凍結切片を坑Mitf抗体及び坑Chx10抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す図である。 図８は、Crx::GFPノックインヒトES細胞由来の浮遊培養開始29日目網膜組織を10μM DAPTを添加しない条件で浮遊培養開始41日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（A）とDAPTを添加した条件で浮遊培養開始41日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（B）、10μM DAPTを添加しない条件で浮遊培養開始43日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（C）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（E）、DAPTを添加した条件で分化誘導43日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（D）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（F）を示す図である。 図９は、Crx::GFPノックインヒトES細胞由来の浮遊培養開始33日目網膜組織を凍結融解した後の浮遊培養開始38日目網膜組織を10μM DAPTを添加しない条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（A）とDAPTを添加した条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の蛍光顕微鏡（B）、10μM DAPTを添加しない条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（C）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（E）、DAPTを添加した条件で浮遊培養開始49日目まで浮遊培養した場合の凍結切片を坑Recoverin抗体で免疫染色した写真（D）と坑Brn3抗体で免疫染色した写真（F）を示す図である。 図１０はWntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより凝集体を形成させ、形成させた凝集体を無血清培地中で基底膜標品の存在下で浮遊培養し、培養された凝集体を血清を含む培地中で培養し、培養された凝集体をWntシグナル経路作用物質を含む培地中で培養して製造された凝集体の明視野を示す図である。 図１１はWntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより凝集体を形成させ、形成させた凝集体を無血清培地中で基底膜標品の存在下で浮遊培養し、培養された凝集体を血清を含む培地中で培養し、培養された凝集体をWntシグナル経路作用物質及びActivinAシグナル経路作用物質を含む培地中で培養して製造された凝集体の明視野を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
　本発明における「形質転換体」とは、形質転換により作製された細胞等の生命体の全部又は一部を意味する。形質転換体としては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞等を挙げることができる。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主等とも呼ばれることがある。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。
　本発明における遺伝子操作技術で使用される原核生物細胞としては、例えば、Eschericia属、Serratia属、Bacillus属、Brevibacterium属、Corynebacterium属、Microbacterium属、Pseudomonas属等に属する原核生物細胞、例えば、Eschericia XL1-Blue、Eschericia XL2-Blue、Eschericia DH1等を挙げることができる。このような細胞は、例えば、「Molecular Cloning（3rd edition）」 by Sambrook，J and Russell, D.W., Appendix 3（Volume３），Vectors and Bacterial strains. A3.2（Cold Spring Harbor USA 2001）に具体的に記載されている。
　本発明における「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターを意味する。このようなベクターとしては、例えば、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体及び植物個体等の宿主細胞において自立複製が可能であり、又は、染色体中への組込みが可能である、ポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているもの等を挙げることができる。
　このようなベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」と記すこともある。このようなクローニングベクターは、通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。現在、遺伝子のクローニングに使用可能なベクターは、当該技術分野において多数存在しており、販売元により、微妙な違い（例えば、マルチクローニングサイトの制限酵素の種類や配列）から名前を代えて販売されている。例えば、「Molecular Cloning（3rd edition）」 by Sambrook, J and Russell, D.W., Appendix 3 (Volume 3)， Vectors and Bacterial strains. A3.2 (Cold Spring Harbor USA, 2001)） に代表的なものが記載（発売元も記載）されており、このようなものを当業者は適宜目的に応じて使用することができる。
　本発明における「ベクター」は、「発現ベクター」、「レポーターベクター」、「組換えベクター」も含む。尚、「発現ベクター」とは、構造遺伝子及びその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主細胞の中で作動し得る状態で連結されている核酸配列を意味する。「調節エレメント」としては、例えば、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカー、及び、エンハンサーを含むもの等を挙げることができる。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプ及び使用される調節エレメントの種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。
　本発明における「組換えベクター」としては、例えば、（ａ）ゲノムライブラリーのスクリーニングのためには、ラムダFIXベクター（ファージベクター）、（ｂ）cDNAのスクリーニングのためには、ラムダZAPベクター（ファージベクター）、（ｃ）ゲノムＤＮＡのクローニングするためには、例えば、pBluescript II SK＋/－, pGEM，pCR2.1ベクター（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「発現ベクター」としては、例えば、pSV2/neoベクター、pcDNAベクター、pUC18ベクター、pUC19ベクター、pRc/RSVベクター、pLenti6/V5-Destベクター、pAd/CMV/V5-DESTベクター、pDON-AI-2/neoベクター、pMEI-5/neoベクター等（プラスミドベクター）等を挙げることができる。また「レポーターベクター」としては、例えば、pGL2ベクター、pGL3ベクター、pGL4.10ベクター、pGL4.11ベクター、pGL4.12ベクター、pGL4.70ベクター、pGL4.71ベクター、pGL4.72ベクター、pSLGベクター、pSLOベクター、pSLRベクター、pEGFPベクター、pAcGFPベクター、pDsRedベクター等を挙げることができる。このようなベクターは、前述のMolecular Cloning誌を参考にして適宜利用すればよい。
　本発明における核酸分子を細胞内に導入する技術としては、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクション等を挙げることができる。このような導入技術としては、具体的には例えば、Ausubel F. A.ら編（１９８８）、Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York, NY; Sambrook J.ら（１９８７）Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.及びその第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７等に記載される方法等を挙げることができる。遺伝子が細胞内に導入されたことを確認する技術としては、例えば、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析又は他の周知慣用技術等を挙げることができる。
　本発明における「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織を再生することができる。ここで幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）又は組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞ともいう）、又は人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）であり得るがそれらに限定されない。上記の幹細胞由来の組織細胞は組織再生が可能なことから分かるように生体に近い正常な細胞を分化できることが知られている。
　幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ－１、ＫｈＥＳ－２及びＫｈＥＳ－３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。マウス胚性幹細胞であるＥＢ５細胞は、独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株は、ＡＴＣＣより入手可能である。
　幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による培養により維持できる。
　本発明における「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいい、胚性幹細胞（ES細胞）もこれに含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞から得られる。また、体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た分化多能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞ともいう）も含む。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作成することが可能である。作成方法としては、例えばＣｅｌｌ　１３１（５）ｐｐ．８６１－８７２や、Ｃｅｌｌ　１２６（４）ｐｐ．６６３－６７６に記載の方法などが挙げられる。
　本発明における「胚性幹細胞（ES細胞）」とは、自己複製能を有し、多分化能（すなわち多能性「pluripotency」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。
　本発明における「人工多能性幹細胞」とは、繊維芽細胞等分化した細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc等数種類の遺伝子の発現により直接初期化して多分化能を誘導した細胞であり、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Takahashi K, Yamanaka S.Cell. 2006, 126(4), p663-676）。2007年、ヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell.2007, 131(5),p861-872. 、Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA.,Science. 2007, 318(5858), p1917-1920. 、Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), p101-106）。
　遺伝子改変した多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変多能性幹細胞の作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法を用い、行うことができる。
　具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した幹細胞を作製することができる。
　標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ　Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。
　標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる。 
　選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
　本発明における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
　本発明における「網膜組織」とは生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、これらの前駆細胞または網膜前駆細胞などの細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現により確認できる。
　網膜細胞マーカーとしては、Ｒaｘ（網膜の前駆細胞）、ＰＡＸ６（前駆細胞），ｎｅｓｔｉｎ（視床下部ニューロンの前駆細胞では発現されるが網膜前駆細胞では発現されない）、Ｓｏｘ１（視床下部神経上皮で発現され、網膜では発現されない）、Ｃｒｘ（視細胞の前駆細胞）、などが挙げられるが、これらに限定されない。また特に、上記網膜層特異的ニューロンのマーカーとしては、Ｃｈｘ１０（双極細胞）、Ｌ７（双極細胞）、 Ｔｕｊ１（節細胞）、Ｂｒｎ３ （節細胞）、Ｃａｌｒｅｔｉｎｉｎ（アマクリン細胞）、Ｃａｌｂｉｎｄｉｎ（水平細胞）、Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ（視細胞）、Recoverin（視細胞）、ＲＰＥ６５（色素上皮細胞）、Ｍｉｔｆ （色素上皮細胞）Nrl（杆体細胞）、Rxr-gamma（錐体細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明における「眼杯様構造体」とは、胚の発生過程における眼杯に類似した形状を示す構造体をさす。胚の発生過程において網膜の原基は、間脳の側面から発生し、間脳から外側へ袋状に飛び出すように形成される。この袋状の上皮構造を眼胞という。さらに眼胞の一番外側の部分（将来の神経網膜）は、次第に眼胞の内側へ陥入し、内外2層の上皮からなる杯状の組織である眼杯を形成する。眼杯は、その後さらに大きく成長し、網膜組織を有する網膜を形成する。眼杯様構造体であるかは、当業者であれば顕微鏡、拡大鏡等による観察で確認が可能である。
　本発明において製造される眼杯様構造体には、単に形態的に眼杯様の突起が認められるばかりでなく、眼杯様構造体を構成する細胞からは網膜前駆細胞マーカーであるＲaｘの高頻度な発現が認められる。また眼杯様構造体の外層にはMitfを発現する網膜色素上皮細胞の層、内層にはChx10を発現する網膜前駆細胞など網膜組織を構成する細胞も認められる。このような眼杯様構造体は、生体発生における眼杯組織の構造と酷似している。
　本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。
　本発明における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。
　本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
　一方、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
　本発明における「網膜色素上皮細胞」とは生体網膜において神経網膜組織の外側に存在する上皮細胞を意味する。網膜色素上皮細胞であるかは、当業者であれば、例えば細胞マーカー（RPE65（色素上皮細胞）、Mitf（色素上皮細胞）など）の発現や、メラニン顆粒の存在、多角形の特徴的な細胞形態などにより容易に確認できる。
　本発明において用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ １９９培地、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
　本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に該当するものとする。
　培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避するという観点からは、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、１－２０％）添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はDＭＥＭ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）を使用できる。
　また、無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものであり得る。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９記載の方法により調製できる。また、本発明の方法をより簡便に実施するために、血清代替物は市販のものを利用できる。かかる市販の血清代替物としては、例えば、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ｄｅｆｉｎｅｄ Ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ（Ｇｉｂｃｏ社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
　また、浮遊培養で用いる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。
　本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。また、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有できる。
　本発明における「浮遊培養」とは、細胞または細胞塊を培養器材等に接着させない条件で培養することをいう。 
　浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。そしてこれらの培養器は、浮遊培養する観点から、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。
　本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
＜網膜組織の製造方法＞
　第１の本発明は、下記（１）～（３）の工程を含むことを特徴とする網膜組織の製造方法である。
（１）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程、及び
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程
（１）第一工程
　多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程について説明する。
　Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されない。Ｗｎｔシグナル経路阻害物質としては、例えば、Ｄｋｋ１、Cerberus蛋白、Ｗｎｔ受容体阻害剤、可溶型Ｗｎｔ受容体、Ｗｎｔ抗体、カゼインキナーゼ阻害剤、ドミナントネガティブＷｎｔ蛋白、ＣＫＩ－７（Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロ－イソキノリン－８－スルホンアミド）、Ｄ４４７６（４－{４－（２，３－ジヒドロベンゾ［１，４］ジオキシン－６－イル）－５－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミイダゾール－２－イル}ベンズアミド）、IWR-1-endo（IWR1e）、IWP-2などが挙げられる。
　本発明に用いられるＷｎｔシグナル経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体が形成する濃度であればよい。例えばIWR1e等の通常のＷｎｔシグナル経路阻害物質の場合は、約0.1μM ～100μM、好ましくは約1μM～10μM、より好ましくは3μM前後の濃度で添加する。
　Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始前に無血清培地に添加されていてもよく、また、浮遊培養開始後数日以内（例えば、５日以内）に無血清培地に添加してもよい。好ましくは、Ｗｎｔシグナル経路阻害物質は、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは３日以内、最も好ましくは浮遊培養開始と同時に無血清培地に添加する。また、Wntシグナル経路阻害物質を添加した状態で、浮遊培養開始後1８日目まで、より好ましくは１２日目まで浮遊培養する。
　第一工程における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％前後である。
　本発明における「凝集体」とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成した塊をいうが、本発明における「凝集体」には、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成した凝集体と浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体とが含まれるものとする。
　「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させて浮遊培養させる際に、「一定数の分散した幹細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
　凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法などが挙げられる。
　第一工程における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができる。凝集体形成時の多能性幹細胞の濃度は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０の３乗～約５×１０の４乗細胞、好ましくは約３×１０の３乗～約３×１０の４乗細胞、より好ましくは約５×１０の３乗～約２×１０の４乗細胞、最も好ましくは９×１０の３乗細胞前後となるように調製した液を添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
　凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を迅速に凝集させることができる限り、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。例えば、ヒトES細胞の場合には、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内に凝集体を形成させることが望ましい。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。
　多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき、当業者であれば判断することが可能である。
（２）第二工程
　第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程について説明する。
　「基底膜標品」としては、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有するような基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて除去することで作成することができる。好ましい基底膜標品としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（以下、マトリゲルという場合もある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
　Ｍａｔｒｉｇｅｌは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｎ（ＥＨＳ）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Ｍａｔｒｉｇｅｌの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてＴＧＦ－β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子、ＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Ｍａｔｒｉｇｅｌの「ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ製品」は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ－１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ－βが１．７ｎｇ／ｍｌである。本発明の方法では、「ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｄｕｃｅｄ製品」の使用が好ましい。
　第二工程における浮遊培養で無血清培地に添加される基底膜標品の濃度としては、神経組織（例えば網膜組織）の上皮構造が安定に維持される限り特に限定されないが、例えばＭａｒｔｉｇｅｌを用いる場合には、好ましくは培養液の１／２０～１／２００の容量、より好ましくは１／１００前後の容積を挙げることができる。基底膜標品は幹細胞の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後５日以内、より好ましくは浮遊培養開始後２日以内に無血清培地に添加される。
　第二工程で用いられる無血清培地は、第一工程で用いた無血清培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。
　第一工程で用いた無血清培地をそのまま本工程に用いる場合、「基底膜標品」を培地中に添加すればよい。
　第一工程及び第二工程における浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避観点から、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加した無血清培地（ＧＭＥＭ又はDＭＥＭ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの投与量としては特に限定されず、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常１～２０％であり、好ましくは２～２０％である。
　第二工程における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃前後である。またＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％前後である。
（３）第三工程
　第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程について説明する。
　第三工程で用いられる血清培地は、第二工程で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。
　第三工程で培地に添加される血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎児血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清。仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。
　血清の添加は、浮遊培養開始後７日目以降、より好ましくは9日目以降、最も好ましくは12日目に行う。血清濃度については、約1～30％、好ましくは約3～20%、より好ましくは10%前後で添加する。
　第三工程で用いられる血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されないが、前記無血清培地（ＧＭＥＭ又はDＭＥＭ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸Ｍｉｘ、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウム）に血清を添加したものを用いることが好ましい。
　また、かかる血清培地として、市販のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を適量添加したものを用いてもよい。
　第三工程において、血清に加えてShhシグナル経路作用物質を添加することで網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。
　Shhシグナル経路作用物質としては、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAGなどが挙げられる。
　本工程に用いられるShhシグナル経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のＳｈｈシグナル経路作用物質の場合は、約0.1nM ～10μM、好ましくは約10nM～1μM、より好ましくは100nM前後の濃度で添加する。
　このようにして製造された網膜組織は、凝集体の表面を覆うように存在する。本発明製造方法により、網膜組織が製造されたことの確認は、以下の（４）記載の免疫染色法等により確認することができる。
　また、凝集体の表面に存在する網膜組織を、ピンセット等を用いて、凝集体から物理的に切り出すことも可能である。この場合、各凝集体の表面には、網膜組織以外の神経組織が形成される場合もあるため、凝集体から切り出した神経組織の一部を切り取り、これを用いて（４）記載の免疫染色法等により確認することで、その組織が網膜組織であることを確認することが出来る。
（４）網膜組織の確認方法
　以上の第一工程乃至第三工程を経ることにより、網膜組織を製造することができる。さらに、以下の方法により、第一工程乃至第三工程により網膜組織が製造されたことを確認することができる。
　第三工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する。浮遊培養で用いられる培養器としては、上述のものが挙げられる。浮遊培養における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０～４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約５％である。一方Ｏ２濃度については、例えば２０～７０％、好ましくは２０～６０％、より好ましくは３０～５０％である。
　本工程の培養時間は特に限定されないが、通常４８時間以上であり、好ましくは７日以上である。
　網膜組織の確認は、浮遊培養終了後、凝集体をパラホルムアルデヒド溶液等の固定液を用いて固定し、凍結切片を作製後、層構造が形成されていることを免疫染色法などにより確認すればよい。網膜組織は、各層を構成する網膜前駆細胞（視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞）がそれぞれ異なるため、これらの細胞に発現している上述のマーカーに対する抗体を用いて、免疫染色法により、層構造が形成されていることを確認することができる。
＜眼杯様構造体の製造方法＞
　第２の本発明は、上記＜網膜組織の製造方法＞により得られた網膜組織を、Shhシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする眼杯様構造体の製造方法である。上記＜網膜組織の製造方法＞により得られた網膜組織としては、上記＜網膜組織の製造方法＞の第三工程で培養された網膜組織を含む凝集体を用いることができる。第２の本発明の実施態様としては、下記（１）～（４）の工程を含むことを特徴とする眼杯様構造体の製造方法を挙げることができる：
（１）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程および
（４）第三工程で培養された凝集体を、Shhシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する第四工程。
　ここで、Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Ｓｈｈシグナル経路作用物質としては、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Purmorphamine、SAGなどが挙げられる。
　第２の本発明に用いられるShhシグナル経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のＳｈｈシグナル経路作用物質の場合は、約0.1nM ～10μM、好ましくは約10nM～1μM、より好ましくは100nM前後の濃度で添加する。
　Wntシグナル経路作用物質としては、例えば、Wntファミリーに属するタンパク質、Wnt受容体、Wnt受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤（例えば、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）、CHIR99021、Kenpaullone）などが挙げられる。
　第２の本発明に用いられるWntシグナル経路作用物質の濃度は、例えばCHIR99021等の通常のWntシグナル経路作用物質の場合には、約0.1μM ～100μM、好ましくは約1μM～30μM、より好ましくは3μM前後の濃度で添加する。
　Shhシグナル経路作用物質及びWntシグナル経路作用物質は、浮遊培養開始後12日目以降25日目以内に添加する。好ましくは、15日目以降18日目以内に添加する。この際、凝集体形成工程で添加されたWntシグナル経路阻害物質を含まない培地を使用することが好ましい。
　浮遊培養開始から１８日目以降に、凝集体中から、眼杯様構造体が突起状に形成される。眼杯様構造体であるかは、当業者であれば顕微鏡、拡大鏡等による観察で確認が可能である。
　このようにして製造された眼杯様構造体は、外層と内層の2層構造から形成される。網膜色素上皮細胞は外層に存在し、網膜前駆細胞は内層に存在するため、例えばこの眼杯様構造体の凍結切片を作製し、免疫染色を行うことにより、網膜前駆細胞と網膜色素上皮細胞との確認が可能である。
　さらに、本発明の方法により製造された眼杯様構造体は、凝集体中から突起状に形成されるので、当該突起を凝集体から物理的、形態的に切り出し、切り出した眼杯様構造体を分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、FACSを用いて選別することで高純度な網膜前駆細胞を得ることも可能である。眼杯様構造体の切り出し方法としては特に限定されず、幹細胞の凝集体から微細ピンセットなどを用いて容易に切り出すことが可能である。
＜網膜層特異的神経細胞の製造方法＞
　第３の本発明は、霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法である。本発明の方法によると、網膜前駆細胞から網膜層特異的神経細胞を製造することができる。
（霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織の製造方法）
　本網膜層特異的神経細胞の製造方法で用いる「霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織」について説明する。
　霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織としては、例えば、上記＜網膜組織の製造方法＞により得られた網膜組織、又は上記＜眼杯様構造体の製造方法＞により得られた眼杯様構造体から製造される網膜組織を用いることができる。
　後者の場合、上記＜眼杯様構造体の製造方法＞の第四工程で形成された眼杯様構造体をさらに浮遊培養することにより、網膜組織を製造することができる。
　眼杯様構造体は、上述の通り、凝集体中から突起状に形成されるので、当該突起を凝集体から物理的、形態的に切り出し、分離・培養することによって高純度の網膜組織を得ることができる。眼杯様構造体の切り出し方法としては特に限定されず、幹細胞の凝集体から微細ピンセットなどを用いて容易に切り出すことが可能である。
　上述のように製造した網膜組織及び眼杯様構造体には網膜前駆細胞が含まれており、前記網膜前駆細胞にNotchシグナル経路阻害物質を接触させることにより、網膜前駆細胞から網膜層特異的神経細胞を製造することができる。
＜Notchシグナル経路阻害物質＞
　次に、本網膜層特異的神経細胞の製造方法で用いるNotchシグナル経路阻害物質について説明する。
　Notchシグナル経路阻害物質は、Notchにより媒介されるシグナル伝達を阻害し得るものである限り特に限定されない。Notchシグナル経路阻害物質としては、例えば、Notch抗体、Notch受容体アンタゴニスト、ADAM阻害剤、ガンマセクレターゼ阻害剤などをあげることができる。
　ガンマセクレターゼ阻害剤としては、例えば、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシン　ｔ－ブチルエステル（ＤＡＰＴ）を挙げることが出来る。
　ガンマセクレターゼ阻害剤の濃度は、網膜前駆細胞から視細胞前駆細胞又は視細胞への分化を促進し得る濃度である限り特に限定されない。かかる濃度は、例えば一般的なガンマセクレターゼ阻害剤の場合、約０．１～１０００μＭ、好ましくは約１～１００μＭ、より好ましくは約１０μＭであり得る。
　ガンマセクレターゼ阻害剤は、霊長類多能性幹細胞から製造される網膜組織のうち、霊長類多能性幹細胞の浮遊培養開始後１５日目以降２００日目以内に培地中に添加される。好ましくは、ガンマセクレターゼ阻害剤は、分化誘導２０日目以降１５０日目以内、より好ましくは分化誘導２５日以降１００日以内の時期に培地に添加される。
　ガンマセクレターゼ阻害剤の存在下での接着培養の期間は、視細胞前駆細胞又は視細胞をより効率的に産生できる長さであり得る。かかる期間の長さは、例えば約３日間以上、好ましくは約５～１００日間、より好ましくは約７～３０日間であり得る。
（網膜層特異的神経細胞の確認方法）
　上述のように製造された網膜層特異的神経細胞を確認する方法として、網膜層特異的神経細胞が視細胞、視細胞前駆体、神経節細胞である場合を例として、説明する。
　製造された網膜層特異的神経細胞が、視細胞前駆細胞であるか否かは、公知の方法、例えば、視細胞前駆細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞前駆細胞マーカーとしては、例えば、Ｃｒｘが挙げられる。
　視細胞には桿体視細胞及び錐体視細胞が含まれる。製造された細胞が視細胞であるか否かは、自体公知の方法、例えば、視細胞マーカーの発現により確認できる。視細胞マーカーとしては、例えば、ロドプシン（桿体視細胞）、赤／緑オプシン（錐体視細胞）、青オプシン（錐体視細胞）、リカバリン（桿体視細胞、錐体視細胞）等が挙げられる。
　また、製造された網膜層特異的神経細胞が、神経節細胞であるか否かは、公知の方法、例えば、神経節細胞マーカーの発現により確認できる。神経節細胞マーカーとしては、例えば、Ｂｒｎ３が挙げられる。
　接着培養の終了後、網膜組織から視細胞前駆細胞又は視細胞が単離され得る。この単離は視細胞前駆細胞又は視細胞の表面マーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。また、培養の終了後、網膜組織から神経節細胞が単離され得る。この単離は神経節細胞の表面マーカーに対する抗体等を用いて、自体公知の方法（セルソーター等）により行うことができる。あるいは、多能性幹細胞として、視細胞前駆細胞のマーカー（例えばCrx）をコードする遺伝子や視細胞のマーカー（例えばリカバリン）、神経節細胞のマーカー（Brn3）に標識遺伝子（例えばＧＦＰ等の蛍光タンパク質）がインフレームにノックインされた細胞を用い、その標識遺伝子の発現を指標に、自体公知の方法（セルソーター等）によりそれぞれの細胞を単離することが出来る。
＜網膜色素上皮細胞の製造方法＞
　第４の本発明は、上記＜網膜組織の製造方法＞により得られた網膜組織を、Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地（但し、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物を含まない）中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする網膜色素上皮細胞の製造方法である。上記＜網膜組織の製造方法＞により得られた網膜組織としては、上記＜網膜組織の製造方法＞の第三工程で培養された網膜組織を含む凝集体を用いることができる。第４の本発明の実施態様としては、下記（１）～（４）の工程を含むことを特徴とする網膜色素上皮細胞の製造方法を挙げることができる：
（１）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程、及び
（４）第三工程で培養された凝集体を、Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地、但し、前記無血清培地及び血清培地はソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物を含まない、中で浮遊培養する第四工程。
　ここで、Wntシグナル経路作用物質としては、例えば、Wntファミリーに属するタンパク質、Wnt受容体、Wnt受容体アゴニスト、GSK３β阻害剤（例えば、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）、CHIR99021、Kenpaullone）などが挙げられる。
　第４の本発明に用いられるWntシグナル経路作用物質の濃度は、例えばCHIR99021等の通常のWntシグナル経路作用物質の場合には、約0.1μM ～100μM、好ましくは約1μM～30μM、より好ましくは3μM前後の濃度で添加する。
　Wntシグナル経路作用物質は、例えばヒトES細胞を用いる場合、製造開始後12日目以降、最も好ましくは1５日目に添加する。この際、第一工程で添加したWntシグナル経路阻害物質及び第三工程で添加したShhシグナル経路作用物質を含まない培地を使用する。
　第４の本発明において、上記＜網膜組織の製造方法＞により得られた網膜組織又は網膜組織を含む凝集体を、Wntシグナル経路作用物質とActivinシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で培養することが好ましい。
　Activinシグナル経路作用物質としては、Activinにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されない。Activinシグナル経路作用物質としては、例えば、Activinファミリーに属する蛋白（例えば、Activin A,Activin B,Activin CActivin ABなど）、Activin受容体、Activin受容体アゴニストなどが挙げられる。
　本工程に用いられるActivinシグナル経路作用物質の濃度は、例えばRecombinant Human/Mouse/Rat Activin A (R&D systems社　＃338-AC)等の通常のActivinシグナル経路作用物質の場合、1ng/ml ～10ug/ml、好ましくは約10ng/ml～1ug/ml、より好ましくは100ng/ml前後の濃度で添加する。
　このようにして製造された網膜色素上皮細胞は凝集体の表面に存在するため、顕微鏡観察等で容易に確認が可能である。網膜色素上皮細胞が存在する凝集体を用いて、例えば分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、FACSを用いて選別することで高純度な網膜色素上皮細胞を得ることも可能である。また、ピンセット等を用いて、凝集体から物理的に網膜色素上皮細胞を切り出し、培養することも可能である。分散または切り出した網膜色素上皮細胞は接着条件下で培養することができる。接着培養する場合、細胞接着性の培養器、例えば細胞外マトリクス等（例えば、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。また、接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の培養条件は、当業者であれば容易に決定できる。また、この際、血清、既知の増殖因子や増殖を促進する添加剤や化学物質存在下で培養してもよい。既知の増殖因子としては、例えばEGF、FGFなどをあげることができる。増殖を促進する添加剤としてN2 supplement（Invitrogen社）やB27 supplement（Invitrogen社）などをあげることができる。
＜網膜組織の毒性・薬効評価用試薬としての使用＞
　第１ないし第４の本発明により製造された網膜組織、眼杯様構造体、網膜層特異的神経細胞又は網膜色素上皮細胞は、網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬に対しての細胞治療用移植用材料や疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。また化学物質等の毒性・薬効評価においても、光毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。
　網膜組織又は網膜関連細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。
＜網膜組織、眼杯様構造体、網膜層特異的神経細胞又は網膜色素上皮細胞の移植用生体材料としての使用＞
　第１ないし第４の本発明により製造された網膜組織、眼杯様構造体、網膜層特異的神経細胞又は網膜色素上皮細胞は、細胞損傷状態において、当該細胞や、障害を受けた組織自体を補充する（例えば、移植手術に用いる）ためなどに用いる移植用生体材料として用いることができる。移植方法としては、例えば、後述の実施例に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
　以下の比較例および実施例により本発明製造方法をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
（RAXノックインヒトES細胞の樹立）
　網膜前駆細胞のマーカー遺伝子の1つであるRAX遺伝子座にGFPをノックインしたヒトES細胞株の作製を実施した。
　ヒトES細胞株（KhES-1：京都大学が樹立したヒトES細胞株）のゲノムDNA上RAX遺伝子を特異的に切断するZinc Finger Nuclease（ZFN）をSigmaAldrich社から購入した。単一細胞化したヒトES細胞を用いて、エレクトロポレーション法により、ZFNをコードするmRNAとGFP及び薬剤選択遺伝子であるネオマイシン耐性遺伝子が搭載されたノックインベクターを共導入し、マイトマイシンＣ処理したネオマイシン耐性マウス線維芽細胞上へ播種した。播種翌日から培地中にG418を添加し、薬剤選択を行った。得られた耐性クローンのコロニーをピックアップして培養を続け、PCR法やサザンブロット法により、ノックイン細胞を選別し、RAX::GFPノックインヒトES細胞株を樹立した。
比較例１：ヒトES細胞を用いた網膜組織の製造（Matrigel添加条件）
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。その後浮遊培養を継続しながら、定期的に蛍光顕微鏡観察を実施した。
　その結果、浮遊培養開始25日目まで蛍光顕微鏡観察を実施したところ、網膜前駆細胞が誘導されたことを示すGFP発現細胞が多少認められた（図１A,B）。
比較例２：ヒトES細胞を用いた網膜組織の製造（Nodalシグナル経路阻害剤及びMatrigel添加条件）
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Nodalシグナル経路阻害物質（10μM SB431542）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。その後浮遊培養を継続し、浮遊培養開始18日目に蛍光顕微鏡観察及びFACSを用いたGFP発現細胞の割合確認を実施した。
　その結果、GFP発現細胞が多少認められた（図１C,D）。
比較例３：ヒトES細胞を用いた網膜組織の製造（Wntシグナル経路阻害剤及びMatrigel添加条件）
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。その後浮遊培養を継続し、浮遊培養開始18日目に蛍光顕微鏡観察及びFACSを用いたGFP発現細胞の割合確認を実施した。
　その結果、比較例１及び２に比べ、明らかにGFP発現細胞が増加した（図１E,F）。
実施例１：ヒトES細胞を用いた網膜組織の製造（Wntシグナル経路阻害剤及びMatrigel、血清添加条件）
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。さらに、浮遊培養開始12日目に容積あたり1/10量の牛胎児血清を添加した。その後浮遊培養を継続し、浮遊培養開始18日目に蛍光顕微鏡観察及びFACSを用いたGFP発現細胞の割合確認を実施した。同時に血清を添加しない比較例３の条件でも実験を実施した。
　比較例３の条件ではGFP発現細胞の割合は3.2%（図2A,B、図3A）であったのに対し、血清を添加した条件では多数のGFP発現細胞が出現した（図２C,D）。FACSを用いた解析からGFP陽性細胞の割合は30%強であった（図3B）。
実施例２：ヒトES細胞を用いた網膜組織の製造（Wntシグナル経路阻害剤及びMatrigel、血清及びShhシグナル作用物質添加条件）
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養開始12日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を添加し浮遊培養した。浮遊培養開始18日目にFACSを用いてGFP発現細胞の割合を調べた。
　血清と同時にShhシグナル経路作用物質を添加することで非常に多くのGFP発現細胞が出現した（図２E,F）。FACSを用いた解析からGFP発現細胞の割合は70%以上に達していた。
　比較例３に比べ、血清を添加する実施例１の条件ではGFP発現細胞の割合が約10倍に、さらに血清とShhシグナル経路作用物質を同時に添加する実施例２の条件ではGFP発現細胞の割合が24倍程度上昇することがわかった（図３D）。
実施例３：網膜組織の形成確認
　（方法）
　実施例２及び３で製造したGFP発現細胞をもつ凝集体について、網膜組織形成の確認を実施した。浮遊培養開始18日目からDMEM/F12培地にN2 supplement、10%（v/v）牛胎児血清、0.5μM レチノイン酸を添加した血清培地を用いて、40% O2条件下で浮遊培養を行った。その後、凝集塊を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、凍結切片を作製後、免疫染色法により組織構造の確認を行った。
　その結果、浮遊培養開始60日目において、最下層にはBrn3及びTuJ1陽性の神経節細胞、最外層及び中間層にCrx及びRecoverin陽性の視細胞前駆細胞、最外層のBrn3陽性細胞と最下層のBrn3陽性細胞の間にChx10陽性の双極細胞等のインターニューロン前駆細胞が整然と層をなして配列していることが明らかとなった（図４A,B,C）。さらに、126日目まで浮遊培養を継続すると、Crx及びRecoverin陽性の視細胞前駆細胞は最外層へ集積し、杆体細胞で特異的に発現するNrlを発現する細胞や錐体細胞で特異的に発現するRxr-gammaを発現する細胞が観察された。また、中間層において水平細胞やアマクリン細胞の前駆細胞マーカーであるPtf1aを発現する細胞が観察された（図４D,E,F,G,H,I）。この結果から、ヒトES細胞から、高効率に網膜組織が製造可能であることが示された。
実施例４：ヒトES細胞から製造した網膜組織の眼への移植
　眼球の強膜切開後、強膜切開創から硝子体中に注射針を挿入し、眼圧を低下させる。強膜切開創から網膜下腔に細胞移植針を用いて眼内灌流液を注入し、人工的に浅い網膜剥離の状態を形成する。形成した空間に細胞移植針または細胞シート移植デバイスを用いて網膜組織を移植する。
実施例５：ヒトES細胞を用いた高効率な眼杯様構造体の製造
　（方法）
　RAX::GFPノックインヒトES細胞を用いて、眼杯様構造体を製造した。
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による凝集体の形成には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して培養した。浮遊培養開始12日目にWntシグナル経路阻害物質を含まない無血清培地へ浮遊凝集体を移し、容積あたり１／１０量の牛胎児血清を添加して培養した。さらに15日目からWntシグナル経路作用物質（3μM CHIR99021）及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を含む血清培地で浮遊培養した。
　（結果）
　上記方法で製造したところ、浮遊培養開始14日目ごろに凝集体の一部においてRAXを発現することを示すGFP陽性の細胞集団が出現し（図５A）、その後凝集体の外側へ隆起し（図５B、C）さらに浮遊培養を継続すると明瞭な突起を形成した（図５D）。さらに、浮遊培養を続けたところGFP陽性細胞（網膜前駆細胞）で構成される凝集体上に、明瞭な眼杯様構造体が形成された（図６）。この眼杯様構造体は凝集体を顕微鏡観察するだけで明らかに認識が可能であった（図６A）。凝集体上に形成された眼杯様構造体について、２光子顕微鏡を用いて詳細に観察を行ったところ、外部と内部の2層構造を有することが示された（図６C、D）。この眼杯様構造体について凍結切片を作製し、免疫染色を行ったところ、外側にMitfを発現する網膜色素上皮細胞の層が、その内側にChx10陽性の神経網膜前駆細胞が存在していた（図７）。
実施例６：ヒトES細胞から製造した眼杯様構造体の眼への移植
　眼球の強膜切開後、強膜切開創から硝子体中に注射針を挿入し、眼圧を低下させる。強膜切開創から網膜下腔に細胞移植針を用いて眼内灌流液を注入し、人工的に浅い網膜剥離の状態を形成する。形成した空間に細胞移植針または細胞シート移植デバイスを用いて培養した眼杯様構造体を移植する。
実施例７：ヒトES細胞由来網膜組織のNotchシグナル作用物質処理
　Crx::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養12日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を添加し浮遊培養することで、網膜組織を製造した。浮遊培養開始29日目の網膜組織にNotchシグナル作用物質（10μM DAPT（ガンマセクレターゼ活性阻害剤））を添加し、浮遊培養開始41日目（添加後12日目）に蛍光顕微鏡観察、浮遊培養開始43日目（添加後14日目）に4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を製造した。製造した凍結切片は視細胞のマーカー遺伝子の１つであるRecoverin、神経節細胞マーカー遺伝子の１つであるBrn3について免疫染色を行い、DAPT添加の有無の結果を比較した。
　その結果、DAPTを添加しない場合（図８A）と比較し、DAPTを添加した場合、GFP発現細胞が著しく増加していた（図８B）。また、凍結切片の免疫染色の結果から、DAPTを添加するとRecoverin陽性細胞が3～5倍増加していることが明らかとなった（図８C、D）。
　これらの結果は、視細胞が著しく増加したことを示している。また、Brn3の免疫染色結果から神経節細胞もDAPT添加により増加したことが分かった（図８E、F）。
実施例８：凍結融解後のヒトES細胞由来網膜組織のNotchシグナル作用物質処理
　RAX::GFPノックインヒトＥＳ細胞（KhES-1由来）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加した無血清培地を用いた。また、培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養開始12日目に容積あたり１／１０量の牛胎児血清及びShhシグナル経路作用物質（100nM SAG）を添加し浮遊培養することで、網膜組織を製造した。製造した浮遊培養開始33日目の網膜組織を凍結融解後、浮遊培養開始38日目の網膜組織にNotchシグナル作用阻害物質（10μM DAPT）を添加し、浮遊培養開始49日目（添加後11日目）に蛍光顕微鏡観察を実施した後、4%パラホルムアルデヒド固定し凍結切片を製造した。製造した凍結切片は視細胞マーカー遺伝子の１つであるRecoverin、神経節細胞マーカー遺伝子の１つであるBrn3について免疫染色を行い、DAPT添加の有無の結果を比較した。
　その結果、DAPTを添加しない場合（図９A）と比較し、DAPTを添加した場合、GFP発現細胞が著しく製造されていた（図９B）。また、凍結切片の免疫染色の結果から、DAPTを添加するとRecoverin陽性細胞が5倍程度製造されていることが明らかとなった（図９C、D）。これらの結果は、視細胞が著しく製造されたことを示している。また、Brn3の免疫染色結果から神経節細胞もDAPT添加により製造されたことが分かった（図９E、F）。
実施例９：ヒトES細胞から製造した網膜層特異的神経細胞の眼への移植
　眼球の強膜切開後、強膜切開創から硝子体中に注射針を挿入し、眼圧を低下させる。強膜切開創から網膜下腔に細胞移植針を用いて眼内灌流液を注入し、人工的に浅い網膜剥離の状態を形成する。形成した空間に細胞移植針または細胞移植デバイスを用いて網膜層特異的神経細胞を移植する。
実施例１０：ヒトES細胞を用いた高効率な網膜色素上皮細胞製造
　（方法）
　ヒトＥＳ細胞（KhES-1）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の形成には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、浮遊培養開始2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養開始12日目にWntシグナル経路阻害物質を含まない無血清培地へ凝集体を移し、容積あたり１／１０量の牛胎児血清を添加して培養した。15日目からWntシグナル経路作用物質（3μM CHIR99021）含む培地で浮遊培養した。
　（結果）
　上記方法で製造したところ、ほぼ全ての凝集体の表面において網膜色素上皮細胞の集団が出現した（図１０）。
実施例１１：ヒトES細胞を用いた網膜色素上皮細胞の製造
　（方法）
　ヒトＥＳ細胞（KhES-1）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007」に記載の方法に倣って浮遊培養し、実験に用いた。培地にはDMEM/F12 培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に20%ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、5～10ng/ml bFGFを添加したものを用いた。浮遊培養による網膜組織の製造には、０．２５％ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＥＳ細胞を単一分散し、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン スフェロイド プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり９×１０＾３細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％ＣＯ２で浮遊培養した。その際の無血清培地には、Ｇ－ＭＥＭ培地に２０％ＫＳＲ、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、１ｍＭ ピルビン酸、20μM Ｙ27632、Wntシグナル経路阻害物質（3μM IWR1e）を添加した無血清培地を用いた。また、培養2日目から容積あたり１／１００量のマトリゲルを添加して浮遊培養した。浮遊培養開始後12日目にWntシグナル経路阻害物質を含まない無血清培地へ凝集体を移し、容積あたり１／１０量の牛胎児血清を添加して培養した。15日目からWntシグナル経路作用物質（3μM CHIR99021）とActivinシグナル経路作用物質（Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A (R&D systems社　＃338-AC) 100ng/ml）とを含む培地で浮遊培養した。
　（結果）
　上記方法で製造したところ、ほぼ全ての凝集体の表面において黒色を呈する網膜色素上皮細胞が出現した。さらに、凝集体表面のほぼ全面が網膜色素上皮細胞で覆われており（図１１）、驚くべき高効率で網膜色素上皮細胞が製造された。
実施例１２：ヒトES細胞から製造した網膜色素上皮細胞の眼への移植
　眼球の強膜切開後、強膜切開創から硝子体中に注射針を挿入し、眼圧を低下させる。強膜切開創から網膜下腔に細胞移植針を用いて眼内灌流液を注入し、人工的に浅い網膜剥離の状態を形成する。形成した空間に細胞移植針または細胞シート移植デバイスを用いて網膜色素上皮細胞を移植する。
　本発明によれば、高効率に網膜組織、眼杯様構造体、網膜層特異的神経細胞及び網膜色素上皮細胞を製造することが可能である。本発明製造方法は、化学物質等の毒性・薬効評価や細胞治療などを目的として、網膜組織を構成する細胞群（視細胞、視神経など）を効率よく製造することや、組織構造を有する網膜組織を用いた毒性・薬効評価や網膜組織移植治療用移植材料への応用を目的として、試験や治療に使用するための「組織材料」となる網膜組織を効率よく製造するという観点から非常に有用である。
　本出願は、日本国に出願された特願2011-258209、特願2011-258210、特願2011-258211、特願2011-258212、特願2012-043080、特願2012-043081、特願2012-043082及び特願2012-043083を基礎としており、それらの内容は全て本明細書に包含される。

Claims (20)

  1. 　下記（１）～（３）の工程を含むことを特徴とする網膜組織の製造方法。
    （１）多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
    （２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
    （３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程
  2. 　請求項１記載の方法により得られた網膜組織を、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、眼杯様構造体の製造方法。
  3. 　請求項１記載の方法により得られた網膜組織を、Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地（但し、前記無血清培地及び血清培地は、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物を含まない）中で浮遊培養する工程を含むことを特徴とする、網膜色素上皮細胞の製造方法。
  4. 　前記Wntシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地が、Activinシグナル経路作用物質をさらに含む、請求項３記載の方法。
  5. 　前記多能性幹細胞が、霊長類多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　前記基底膜標品が、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンおよびエンタクチンからなる群から選ばれる少なくとも１つの細胞外マトリックス分子であることを特徴とする請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　前記第一工程乃至第三工程が、ノックアウト血清代替物存在下で行われることを特徴とする請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞に、Notchシグナル経路阻害物質を接触させることを特徴とする網膜層特異的神経細胞の製造方法。
  10. 　前記Notchシグナル経路阻害物質が、ガンマセクレターゼ活性阻害物質であることを特徴とする請求項９記載の方法。
  11. 　前記Notchシグナル経路阻害物質が、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェンアセチル）－Ｌ－アラニル］－Ｓ－フェニルグリシン　ｔ－ブチルエステルであることを特徴とする請求項９又は１０記載の方法。
  12. 　前記霊長類が、ヒトであることを特徴とする請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　網膜層特異的神経細胞が視細胞であることを特徴とする請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 　網膜層特異的神経細胞が神経節細胞であることを特徴とする請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 　霊長類多能性幹細胞由来の網膜組織に含まれる網膜前駆細胞が、以下の工程で製造された網膜組織に含まれる網膜前駆細胞であることを特徴とする請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。
    （１）霊長類多能性幹細胞を、Wntシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより霊長類多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程
    （２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養する第二工程
    （３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程および
    （４）第三工程で培養された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質とWntシグナル経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養することにより、眼杯様構造体を形成させる第四工程
    （５）第四工程で形成された眼杯様構造体を、浮遊培養する工程
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞を含有してなる、毒性・薬効評価用試薬。
  17. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞に被検物質を接触させ、該物質が該組織、該構造体又は該細胞に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
  18. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞を含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤。
  19. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により製造される有効量の網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
  20. 　網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法により製造される網膜組織、眼杯様構造体、網膜色素上皮細胞又は網膜層特異的神経細胞。
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