WO2013085338A2 - 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • compositions for the prevention and treatment of metabolic diseases containing water lily extract, fractions thereof or polyphenol-based compounds isolated therefrom as active ingredients
  • the present invention provides obesity, type 2 diabetes mellitus, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis, and non-alcoholic activity containing water extract extract, fractions thereof, or polyphenol-based compounds isolated therefrom as active ingredients.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases such as fatty liver. .
  • the triglyceride biosynthesis is a multistage reaction, the first of which is catalyzed by glycerol-3-phosphate acyl transferase (GPAT) and the glycerol 3-phosphate of glycerol 3-phosphate.
  • the fatty acid (fatty acyl-CoA) a form of acyl-coenzyme A, is transferred to the STT 1 position to catalyze the ester reaction of producing lysophosphatidic acid OysophosphaticHc acid (LPA) and glycerol-3 It is known as the rate-1 imiting step that regulates the rate of the glycerol-3-phosphate pathway (Be 11 et al, Annu Rev Biochem 49: 459-487, 1980).
  • the final step is the biosynthesis of triglycerides by diacylglycerol acyl transferase (DGAT).
  • DGAT diacylglycerol acyl transferase
  • GPAT has four types of isoenzymes in mammalian tissues and is distinguished by their sensitivity to N-ethylmaleimide (NEM) and their location.
  • NEM N-ethylmaleimide
  • MtGPATl and mtGPAT2 present in the membrane (MOM) are resistant to NEM and have a characteristic of favoring saturated fatty acyl-CoO as a substrate (Gonzanlez-Baro et al. Biochim. Biophys. acta, 1771: 830-).
  • mtGPAT accounts for about 10% of total GPAT activity in most tissues of the human body, but up to 50% of total GPAT activity in liver tissues and high activity in adipose tissues. (Bell et al, Annu Rev Biochem 49: 459-487, 1980; Lewin et al. Arch. Biochem. Biophys. 396: 119-127, 2001), suggesting that mtGPAT is an important component of fatty liver formation, obesity and insulin resistance treatment. It can be a useful target.
  • mtGPAT is known to be affected by diet and exercise. Studies have shown that when high calorie diets can be used to consume excess calories, the mRNA expression of mtGPAT is increased and the activity of mtGPAT is increased as a result. In the mice group, mtGPAT activity was steadily increased compared with mice without exercise at all, resulting in a significant increase in triglyceride synthesis (KuMp et al. 2006).
  • mice CPT-1 and ⁇ —oxidation were activated, and mtGPAT-deficient (mtGPAT—) mice had 373 ⁇ 4 less triglyceride in the liver and 15% less blood than the control group.
  • VLDL very low density lipoprotein
  • mtGPAT ⁇ /- was observed in mice to increase insulin sensitivity after weight and fat loss (Hammond et al, Mol Cell Biol 22). : 8024-8214, 2002; Hammond et al, J Biol Chem 280: 25629x25636, 2005).
  • GPAT inhibition may be a function of inhibiting intracellular accumulation of triglycerides, and the development of low molecular weight inhibitors that regulate the fat accumulation and energy metabolic role of GPAT has been associated with obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, It may be a strategy to develop therapeutic agents for metabolic diseases such as hepatic steatosis and non-alcoholic fatty liver.
  • mtGPAT inhibitor compounds include cyclopentenyl acetic acid ⁇ 010 6] ⁇ 1 ⁇ 1 acetic acid derivatives (Eydysh et al. Bioorg. Med. Chem. 2010, 18: 6470-6479), 2- (nonylsulfonamido) and benzoic acid (benzoic acid) derivatives (Eydysh et al. J. Med. Chem. 2009, 52: 3317-3327) are known, but exhibited weak inhibitory activity as enzyme inhibitors with IC 50 values between 25 ⁇ and 350 ⁇ . The enzyme source used was interpreted as a mitochondrial fraction of 3 ⁇ 4, which is still in its infancy.
  • Patent No. 1 in which the genetic inhibition of mtGPAT and lipid metabolism-related enzymes in collaboration with FASgen and Princeton University of the United States, is effective in the inhibition and treatment of various viral infections is known (TO 2011/019498).
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing water lily root 0V73 ⁇ 4oA3es tetragona) extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases, comprising a fraction obtained by fractionating the water lily root extract using an organic solvent.
  • another object of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases comprising a polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases comprising a polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a health food composition for preventing and improving metabolic diseases containing water lily root extract, fractions thereof or polyphenol-based compounds isolated therefrom as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing water lily root (vVj / ⁇ ea tetragona) extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases, including a fraction obtained by fractionating the water lily root extract using an organic solvent.
  • the present invention is a polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases including a fraction obtained by fractionating the water lily root extract using an organic solvent.
  • the present invention also provides a method for treating metabolic disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of a water lily root extract to an individual suffering from metabolic disease.
  • the present invention provides a method of preventing metabolic diseases comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a water lily root extract.
  • the present invention also provides a method of treating metabolic disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of an organic solvent fraction of water lily root extract to an individual suffering from metabolic disease.
  • the present invention provides a method for preventing metabolic diseases comprising the step of throwing a pharmaceutically effective amount of an organic solvent fraction of water lily root extract to an individual.
  • the present invention comprises administering a pharmaceutically effective amount of the polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual suffering from metabolic disease. It provides a method of treating metabolic diseases.
  • the present invention provides a method for treating a metabolic disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the polyphenolic compound of Formula 1, Formula 2 or Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a pharmaceutically effective amount of the polyphenolic compound of Formula 1, Formula 2 or Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the polyphenolic compound of Formula 1, Formula 2 or Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a composition for preventing and improving metabolic diseases containing water lily extract as an active ingredient. ⁇
  • the present invention provides a composition for preventing and improving metabolic diseases, including a fraction obtained by fractionating the water lily root extract using an organic solvent.
  • the present invention provides a composition for preventing and improving metabolic diseases, including the polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. do.
  • the present invention also provides a composition containing a water lily root extract for use in the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • the present invention also provides a composition containing an organic solvent fraction of water lily root extract for use in the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • the present invention also provides a polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • the present invention also provides the use of water lily root extract for use in the preparation of pharmaceutical compositions for the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • the present invention also provides the use of an organic solvent fraction of a water lily root extract for use in the preparation of a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • the present invention provides a use of the polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the preparation of a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases. do.
  • the present invention provides the use of water lily root extract for use in the manufacture of a composition for the prevention and improvement of health foods for metabolic diseases.
  • the present invention provides the use of the organic solvent fraction of the water lily root extract for use in the preparation of the composition for the health food for preventing and improving metabolic diseases.
  • the present invention provides a use of the polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the preparation of a health food composition for the prevention and improvement of metabolic diseases to provide.
  • Water lily root extract, extracts thereof or polyphenolic compounds isolated from the fractions according to the present invention effectively inhibit the activity of mtGPATl causing metabolic disease, inhibit the biosynthesis of intracellular triglycerides and insulin-dependent in skeletal muscle cells As it was confirmed that it showed the activity to increase glucose intake, Including the polyphenolic compounds of the present invention, water extracts or their fractions containing them are useful for the prevention and treatment of metabolic diseases such as obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis and nonalcoholic fatty liver. Can be used.
  • 1 and 2 is a diagram showing the inhibitory activity of hGPATl of the water extract methanol extract, butanol fraction and the compound isolated from the fraction.
  • 1 is a diagram showing the inhibitory activity of hGPATl of the water extract methanol extract and solvent fractions.
  • Figure 2 is a diagram showing the hGPATl inhibitory activity of the formula (1), (2), (3) or (4).
  • FIG. 3 is a diagram showing the effect of inhibiting triglyceride biosynthesis in HepG2 cells (human-derived hepatocytes) of the methanol extract and the solvent fraction of the water lily root.
  • 4 and 5 are views showing the glucose intake activity of the water lily root extract and fractions and the separated compounds.
  • L6 cells which are the murine skeletal muscle cells of the extract and fraction of the water lily root.
  • L6 cells which are skeletal muscle cells of the mouse of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing water lily root GVJ 3es tetragona) extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition comprising a water lily root extract for use in the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • ⁇ Nymphaea tetragonaY means all organs of natural, hybrid, or cultivar, including all roots, branches, branches, leaves, and flowers. .
  • the extract may be extracted with water, a solvent of C 4 alcohol or a mixture thereof, and specifically, the alcohol may be ethanol or methanol, but is not limited thereto.
  • the water lily root extract may be prepared by a manufacturing method comprising the following steps, but is not limited thereto:
  • step 3 drying the filtered extract of step 2) under reduced pressure.
  • the water lily root of step 1) can be used without limitation, such as being grown or commercially available.
  • the water lily root may be to use the water lily underground, but is not limited thereto.
  • Extraction method of the water lily root extract may be used in the art, such as filtration, hot water extraction, immersion extraction, reflux kinkak extraction and ultrasonic extraction, may be one to five times by the hot water extraction method, More specifically, the extraction may be repeated three times, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent may be added 0.1 to 10 times to the dried water lily root, it is preferable to add 0.3 to 5 times.
  • the extraction temperature may be 20 to 40, but is not limited thereto.
  • the extraction time may be 12 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) may be to use a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying may be, but not limited to, drying under reduced pressure, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying.
  • the metabolic disease consists of obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis and non-alcoholic fatty liver. It may be selected from the group, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases, including a fraction obtained by fractionating the water lily root extract using an organic solvent.
  • the present invention also provides a composition comprising an organic solvent fraction of water lily root extract for use in the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • the organic solvent may be selected from the group consisting of nucleic acid, chloroform and butanol, but is not limited thereto.
  • the fraction may be a nucleic acid fraction, chloroform fraction, butanol fraction or water fraction obtained by systematic fractionation of water lily root extract in the order of hexane, chloroform, butanol and water, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid is n-nucleic acid.
  • the metabolic disease may be selected from the group consisting of obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis, and nonalcoholic fatty liver, but not limited thereto.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing a polyphenol-based compound of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing a polyphenol-based compound of Formula 2 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases-containing a cliphenol-based compound of Formula 3 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing a polyphenol-based compound of Formula 4 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention is for use in the prevention and treatment of metabolic diseases It provides a polyphenolic compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or 0 pharmaceutically acceptable salts.
  • Compounds of Formula 1, Formula 2, Formula 3 and Formula 4 may be isolated from the water lily root extract, respectively, but are not limited thereto, and those derived from other substances or synthesized may be used.
  • the metabolic disease may be selected from the group consisting of obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis, and nonalcoholic fatty liver, but is not limited thereto.
  • the present inventors pulverized the water lily root to prepare a water lily root extract and fractions were extracted by dipping in methanol. The extract was filtered, concentrated under reduced pressure to obtain methane. The extract was extracted with methane, chloroform, butanol, and water, and the fractions were extracted to obtain active fractions. — Inhibition of 3-phosphate acyltransferase (huraan glycerol-3-phosphate acyl transferase (hGPATl)) showed that butane was better inhibited in fractions.
  • 3-phosphate acyltransferase huraan glycerol-3-phosphate acyl transferase (hGPATl)
  • the present inventors separated the butanes into eight fractions using reverse phase column chromatography while increasing the polarity sequentially with a methanol / water mixed solvent.
  • Fractions 1 to 8 the fractions with the strongest inhibitory activity were collected and the active fractions were separated by eluting with methane using Sephatex LH-20 (Sephadex LH20).
  • fractions with strong inhibitory activity were collected, and high-performance liquid chromatography (YMC J'sphere ODS H-80 column, 250 20 ⁇ ) was carried out by pouring methanol / water mixed solvent at 5 ml / min as elution solvent.
  • Four compounds (Formula 1, Formula 2, Formula 3, and Formula 4) were obtained.
  • the present inventors have determined the properties, molecular weights, molecular formulas, mass spectrometry, ' 3 ⁇ 4-NMR spectra, and 13 C-NMR spectra of the compounds as disclosed in Hideyuki Kurihara et a. ⁇ . Biosci. Biotech. Biochem. , 57 (9): 1570-1571, 1993; Wen-Hua Zhao et al. J. Chroma togr. B., 850, 523-527, 2007; RW Owen et al. Food and Chemical Toxicology. , 41, 1727-1738, 2003], geranin,
  • the present inventors cloned human hGPATl cDNA (NCBI accesstion No. NM ⁇ 020020) into pFastBacl vector and transfected recombinant bacmid DNA into Sf9 cells in order to isolate the mass expression of hGPATl (human GPAT1) and hGPATl enzyme source.
  • hGPATl human GPAT1
  • hGPATl enzyme source human GPATl
  • a baculovirus containing human hGPATl 0 ⁇ ' was assembled and amplified. Cells were recovered and homogenized using an ultrasonic cell crusher. Only supernatant was taken and centrifuged. The obtained precipitate was suspended in a complete sucrose solution and used as an enzyme source of mitochondrial hGPATKmitochondrial hGPATl).
  • the precipitate obtained by centrifugation of the supernatant from which the precipitate was removed was suspended in sucrose buffer and used as a microsomal h
  • the radiation dose of [ 14 C] lysophosphatidic acid ([ 14 C] Lysophosphat lic acid) was measured.
  • the activity of mitochondrial hGPATl was measured in an ice bath with 2 mM N 2ethylmaleimide for 15 minutes in the mitochondrial hGPATl enzyme source before the experiment.
  • microsomal hGPATl activity was measured by pretreatment of N-ethylmaleimide (2 mM) with microsomal hGPATl enzyme source to determine the ratio of total hGPATl activity and enzymatic activity of microsomal hGPATl.
  • the enzyme activity was measured by correcting the activity result of the microsomal hGPATl enzyme source.
  • Substrates used for enzyme reaction were [ 14 C] glycerides -3 ⁇ phosphate (1.8 ⁇ ) and palmitoleyl-CoA (100 ⁇ ). The reaction was stopped by water and water. The reaction product was separated into a water layer and a butanol layer by centrifugation.
  • a supernatant (layered butane) containing [ 14 C] lysophosphatidic acid was taken.
  • the supernatant was shaken with the same amount of water and separated again into a water layer and a butanol layer by centrifugation.
  • the supernatant was taken up to 600 ⁇ to obtain the amount of radioactivity (Disintegrations per minute (DPM)) using a liquid scintillation counter (LSC).
  • DPM Disintegrations per minute
  • LSC liquid scintillation counter
  • the water lily root extract, fractions thereof, or acyclic polyphenol-based compounds isolated therefrom showed excellent hGPATl inhibitory activity and showed hGPATl inhibitory activity in a concentration-dependent manner (see Table 1, Table 2, Figs. 1 and 2). ).
  • HepG2 cells which are human-derived hepatocytes, were used to measure the triglyceride biosynthesis inhibitory activity in cells against two substrates.
  • Table 3 the water lily extract and the fractions were treated at a concentration of 50 /, respectively.
  • the water extracts of Butyl root extract or butane were treated with fractions of the water extracts and butane including insulin, and then Krebs-Ringer buffer (Krebs-Ringer Buffer, KRB).
  • KRB Krebs-Ringer Buffer
  • Cells cultured in KRB were labeled with 2-deoxy-D-glucose and labeled 2-deoxy-2-glucose, 2-deoxy-D- [ 14 C] glucose, 0.2 uCi. / ml) and reacted for 10 minutes.
  • the glucose intake was determined by measuring with a scintillation counter.
  • the treatment of water extract or butane significantly increased glucose uptake compared to the control group (DMS0) and was dependent on insulin.
  • the following experiment was performed using a mouse.
  • the experimental animals were specific pathogen free (SPF) animals, and 7-week-old male ICR mice were divided into a control group and a test group, and the control group received only 0.5% carboxymethyl cellulose (CMC) solution.
  • the test group was orally administered to the water lily root extract of the present invention prepared in Example 1 at a dose of 1,000 mg / kg, 500 mg / kg for 2 weeks to observe the toxicity. As a result, no animals died in all groups, and no animals with unusual behavior or toxic symptoms were found.
  • body weight gain was observed in all groups, and abnormal lesions and abnormal findings in all organs in the thoracic cavity and abdominal cavity observed at autopsy Not found.
  • the water lily root extract, fractions thereof, and polyphenolic compounds isolated from the fractions effectively inhibit the activity of mtGPATl causing metabolic disease, inhibit the biosynthesis of intracellular triglycerides and insulin in skeletal muscle cells. Since it was confirmed that the dependent glucose uptake activity, the polyphenol-based compounds of the present invention, water extract root or fractions thereof are obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis and non-alcoholic fatty liver, etc. It can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases.
  • It contains 0.1 to 99.9% by weight of the water lily root extract of the present invention or a fraction thereof based on the total weight of the composition of the present invention as an active ingredient, and may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • compositions of the present invention may be in various oral or parenteral formulations.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents and surfactants are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, powders, granules, capsulants, and the like, which may contain at least one excipient such as starch, carbohydrate, sucrose or lactose ( lactose) and gelatin.
  • the "lubricant such as magnesium stearate, in addition to simple excipients, thoracic, and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquid solutions, emulsions, and syrups.
  • ком ⁇ онентs such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • non-aqueous and suspending solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and it is preferable to select the external or intraperitoneal, rectal, intravenous, intramuscular, subcutaneous intrauterine dural or cerebrovascular injection method for parenteral administration. Use for external skin.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health status, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease of the patient, the daily dosage of the extract 0.01 to 1000 mg / kg based on the amount, preferably 30 to 500 mg / kg, more preferably 50 to 300 rag / kg, may be administered 1 to 6 times a day.
  • composition of the present invention can be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormone therapy, chemotherapy and biological reaction modifiers.
  • the present invention also provides a method for preventing metabolic disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of the composition according to the present invention.
  • the present invention also provides a method of treating a metabolic disease comprising administering a pharmaceutically effective amount of the composition according to the present invention to a subject having metabolic disease.
  • the metabolic disease may be any one selected from the group consisting of obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis, and nonalcoholic fatty liver, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutically effective amount is 0.0001 to 100 mg / kg, 0.001 to
  • Dosage may vary depending on the weight, age, sex, health status, diet, duration of administration, rate of elimination, and severity of the particular patient.
  • composition can be administered orally or parenterally during clinical administration and intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, It can be administered by intrauterine epidural injection, cerebrovascular injection, or intrathoracic injection, and can be used in the form of general pharmaceutical preparations.
  • the subject is a vertebrate, specifically a mammal, more specifically an experimental animal such as a rat, rabbit, guinea pig, hamster, dog, or cat, and more specifically, may be an ape-like animal such as a chimpanzee or a gorilla. have.
  • administration means introducing a certain substance into a patient in any suitable way and the route of administration of the substance can be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device that allows the active substance to migrate to the target cell.
  • administration means that the composition of the present invention is introduced by “systemic delivery” or “topical delivery” to pancreatic cancer cells.
  • “Whole body delivery” refers to delivery that causes widespread biodistribution of a compound in an organism. Some administration techniques result in systemic delivery of certain compounds, and others may not.
  • Systemic delivery means that a useful, preferably therapeutically effective amount of a compound is exposed to most of the body. Generally, in order to obtain a broad biodistribution, fast non-specific cell binding or by a fast passage of organs (liver, lung, etc.) to ensure that the compound is not rapidly degraded or eliminated before reaching the disease site far from the site of administration. Life expectancy in the blood is required.
  • topical delivery refers to the delivery of a compound directly to a target site in an organism.
  • the compound can be delivered locally by injection directly into a disease site, such as a tumor or other target site, such as a target organ, such as the pancreas.
  • the present invention provides a composition for preventing and improving metabolic diseases containing water lily extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing and improving metabolic diseases, including a fraction obtained by fractionating a water lily root extract using an organic solvent.
  • the present invention also provides a composition for preventing and improving metabolic diseases, which contains a polyphenolic compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of water lily root extract for use in the manufacture of a composition for the prevention and improvement of health foods for metabolic diseases.
  • the present invention provides the use of the organic solvent fraction of the water lily root extract for use in the preparation of the composition for the health food for preventing and improving metabolic diseases.
  • the present invention provides a use of the polyphenol-based compound of Formula 1, Formula 2, Formula 3 or Formula 4, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in the preparation of a health food composition for preventing and improving metabolic diseases to provide.
  • the polyphenol-based compound is represented by Chemical Formula 1, Chemical Formula 2, Chemical Formula 3 and Chemical Formula
  • It may be selected from the group consisting of four, but is not limited thereto.
  • the metabolic disease may be selected from the group consisting of obesity, type 2 diabetes mellitus, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis and nonalcoholic fatty liver, but is not limited thereto.
  • the water lily root extract, its fractions and polyphenol compounds isolated from the fractions have been found to effectively inhibit the activity of mtGPATl causing metabolic diseases, including the polyphenolic compounds of the present invention, water lily root extract or Fractions thereof may be used as an active ingredient in the composition for the prevention and improvement of metabolic diseases such as obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, insulin resistance, hepatic steatosis and non-alcoholic fatty liver.
  • the functional food of the present invention may contain various ' flavours, natural carbohydrates, and the like as additional ingredients.
  • Natural carbohydrates mentioned above include glucose, fructose and Disaccharides such as monosaccharides, maltose, sucrose, and polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, xyli, sorby, erythr, and the like.
  • sweetening agent natural sweetening agents such as tautin and stevia extract, synthetic sweetening agents such as saccharin and aspartame can be used.
  • the ratio of natural carbohydrate and water may be selected from 0.01 to 0.04 parts by weight, specifically about 0.02 to 0.03 parts by weight, per 100 parts by weight of the health food of the present invention.
  • the functional food of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols.
  • the carbonizing agent used in the carbonated beverage may contain a flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination. The proportion of such additives is not critical but is usually selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the health food of the present invention.
  • Example 2 Separation of Compound from Water Lily Root Extract The butanes fraction (about 25 g) . A total of 8 fractions were separated by reverse phase column chromatography with increasing polarity sequentially with a 20%, 30%, 40%, 50% methanol / water mixture (fractions 1 to 8). .
  • LH20 was used to elute the methane to separate the active fractions. Among them, fractions with strong inhibitory activity were collected, and high-performance liquid chromatography (YMC J 1 sphere ODS H-80 column, 250X20 mm) was performed by flowing 90% methanol / water mixed solvent at 5 mi / min as the elution solvent. Four pure compounds (Formula 1, Formula 2, Formula 3, and Formula 4) were obtained.
  • the compound was determined by measuring the properties, molecular weight, molecular formula, mass spectrometry, -NMR spectrum and 13 ONMR spectrum of the material, published by Hideyuki Rurihara et al. Biosci. Biotech. Biochew. , 57 (9): 1570-1571, 1993; Wen-Hua Zhao et al. J. Chromatogr. B., 850, 523-527, 2007; RW Owen et al. Food and Chemical Toxicology.
  • Mitochondrial protein isolated from sf9 cells overexpressing Human GPATK hGPATl was used as the enzyme source.
  • hGPATl cDNA NCBI accesstion No. ⁇ _020918
  • pFastBacl vector Invitrogen
  • the resulting recombinant bacmid DNA was transformed into Sf9 cells to assemble and amplify baculovirus containing human hGPATl cDNA.
  • Sf9 cells (1 ⁇ 10 6 cells / ral) were infected with 10 M () I virus and cells were harvested by centrifugation after 48 hours, homogenize buffer (250 mM sucrose, 10 niM Tris (H).
  • hGPATl enzyme The activity of hGPATl enzyme was measured by the amount of radiation of [14C] lysophosphatidic acid ([l] Lysophosphaticlic acid), a reaction product produced by the mitochondrial hGPATl enzyme source. Mitochondrial hGPATl activity was compared to other isoenzymes, and 2 mM N—ethylmaleimide was added to the hGPATl enzyme source before the experiment, according to previous studies, in which hGPATl was maintained by treatment with ethylmaleimide (NEM). Pre-treatment in an ice bath for minutes. Deactivated isozyme activity other than hGPATl.
  • NAM ethylmaleimide
  • Substrates used for enzyme reaction were [ 14 C] glycerol -3-phosphate (1.8 ⁇ ) and palmitoyl-CoAKlOO ⁇ and these substrates were the reaction solution (75 mM Tris (pH 7.5), 4 After reaction for 20 minutes at 26 ° C. with mM MgCl 2 , 8 mM NaF, 2 mg / i BSA), reaction was stopped by saturated butanol and water. The reaction was centrifuged to separate the water layer and the butane, and the supernatant containing the reaction product [ 14 C] lysophosphatidic acid (layer of butane) was taken up to 800 ⁇ .
  • the supernatant was shaken with the same amount of water, and the water layer and butane were separated into layers by centrifugation, and the supernatant was taken up to 600 ⁇ to obtain a liquid scintillation counter (LSC). ) was measured.
  • the final concentration of the water lily root extract and fractions prepared in Examples 1 and 2 was treated at a concentration of 30,100 g /, the final concentration of the compounds of Formula 1, Formula 2 and Formula 3 prepared in Example 2 100, 30 , 10 , 3 , 1, hGPATl enzyme by treatment at concentration of 0.3 / g / m £ Activity was measured.
  • the inhibition rate of hGPATl enzyme activity by the sample was calculated by the following equation.
  • Inhibitory activity (%) 1-[(T-B (C-B)] X 100
  • HepG2 cells which are human-derived hepatocytes, were used for two substrates. Triglyceride biosynthesis inhibitory activity in cells was measured. HepG2 cells were cultured at ATCC, with minimum essential medium (MEM; 2 mM L ⁇ glutamine; 1.5 g / L sodium bicarbonate, 0.1 mM essential amino acid nonessential amino acids). And 10% fetal bovine serum (FBS) and antibiotics (100 U / ml. Penicillin and 100 g / ml streptomycin) in earle ⁇ BSS medium formulated to contain 1 mM sodium pyruvate.
  • MEM minimum essential medium
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics 100 U / ml. Penicillin and 100 g / ml streptomycin
  • [ 14 C] acetate [ 14 C] acetate) (Amersham) was added and reacted for 6 hours. Also used in other substrate [14 C] In the case of the glyceryl ([14 C] glycerol), the reaction was carried out for 18 hours. The sample was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMS0), and the control group in the neutron room production reaction was reacted only with dimethyl sulfoxide without adding the sample, and the production rate of triglycerides was 100. .
  • DMS0 dimethyl sulfoxide
  • [ 14 C] acetate a substrate that is not absorbed by the cells and remains in the medium to determine the amount of triglycerides produced in the finished cells
  • L6 myoblasts were cultured in DMEM (4 mM L-glutamine, 1.5 g / L sodium bicarbonate, 4.5 g / L glucose) medium containing 10% FBS.
  • DMEM 4 mM L-glutamine, 1.5 g / L sodium bicarbonate, 4.5 g / L glucose
  • FBS 0.2% FBS DMEM
  • the following experiment was performed using a mouse.
  • the experimental animals were SPF-specific animals and were introduced to 7-week-old male ICR mice (Korea Biolink, Chungbuk Negative), followed by a 1-week acclimatization period. At the age of five, five animals were assigned to each group and used in the experiment.
  • the control group was administered only 0.5% carboxymethyl cellulose (CMC) solution, the test group was prepared in Example 1. After the oral administration of the water lily root extract of the present invention at a dose of 1,000 mg / kg, 500 rag / kg, respectively, the toxicity was observed for 2 weeks.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • the powder through According to the manufacturing method was filled in hard capsule to prepare a capsule.
  • 0.1 g of the compound of Formula 2 of ⁇ Example 2> sterile distilled water dose pH adjuster dose for injection according to the conventional method for preparing an injection was prepared in the above component content (2 iii ⁇ ) per ampule.
  • Vitamin A Acetate 70 Mg
  • Vitamin B6 0.5 rag
  • Vitamin C 10 mg
  • composition ratio of the vitamin and mineral mixtures is a relatively suitable composition for a healthy food in a preferred embodiment, but may be modified arbitrarily, and the mixture of the above ingredients in accordance with the usual health food manufacturing method
  • the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.
  • Plum concentrate Taurine 1 g purified water was added to mix the above ingredients according to the general method of preparing a healthy beverage in 900 ml ' , then stirred and heated at 85 for about 1 hour, the resulting solution was filtered and obtained in a sterile 21 container and sealed. After sterilization and refrigerated it was used to prepare a healthy beverage composition.
  • composition ratio is a relatively suitable composition for a preferred beverage and beverage in a preferred embodiment
  • the compounding ratio may be arbitrarily modified according to the demand hierarchy, demand country, usage, regional and ethnic preferences.

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Abstract

본 발명은 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 수련뿌리 추출물, 이의 분획물은 대사성 질환을 유발하는 글리세롤-3-포스페이트(glycerol-3-phosphate, GPAT)의 활성을 효과적으로 억제하고, 세포 내의 중성지방의 생합성 저해 활성, 골격근 세포에서의 인슐린 의존적 포도당 섭취(glucose uptake) 증대 활성을 나타내므로, 수련뿌리 추출물 및 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver) 등의 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
수련뿌리 추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물
【기술분야】
본 발명은 수련뿌리 추출물, 이의 분획물, 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증, 인슬린저항성, 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver) 등의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. .
【배경기술】
중성지방의 생합성은 다단계 반웅으로 그 첫 단계는 글리세롤ᅳ 3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (glycerol-3-phosphate acyl transferase, GPAT)에 의해 촉매되며， 글리세를ᅳ 3—포스페이트 (glycero卜 3-phosphate)의 STT 1 위치에 아실-코엔자임 에이 (acyl -coenzyme A)의 형태인 지방산 (fatty acyl—CoA)를 전이하여 리소포스파티딘산 OysophosphaticHc acid, LPA)를 생성하는 에스터 (ester) 반응을 촉매하며 글리세롤 -3-포스페이트 경로 (glycerol-3-phosphate pathway)의 속도를 조절하는 율속단계 (rate-1 imit ing step)로 알려져 있다 (Be 11 et al， Annu Rev Biochem 49:459-487， 1980). 마지막 단계는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 (cliacylglycerol acyl transferase; 이하 "DGAT")에 의해 중성지방의 생합성이 이루어진디-.
현재까지 GPAT는 포유동물 조직에 4 종류의 동족체 (isoenzyme)가 존재하며， N—에틸말레이미드 (N-ethylmaleimide, NEM)에 대한 감수성과 존재하는 위치에 따라 구분된다. 즉， 소포체 (endoplasmic reticulum, ER)에 존재하는 GPAT3와 GPAT4는 NEM을 포함하는 설프히드릴기 시약 (sulfhydryl reagent)에 대해 높은 감수성을 나타내고， 미토콘드리아 외막 (mitochondrial outer membrane, MOM)에 존재하는 mtGPATl과 mtGPAT2는 NEM에 대해 저항성을 나타내며 기질로서 포화지방산 (saturated fatty acyl-CoO를 선호하는 특징을 가진다 (Gonzanlez-Baro et al . Biochim. Biophys. acta, 1771： 830-838 , 2007) . mtGPAT은 인체 대부분의 조직에 있어서 전체 GPAT 활성의 약 10% 정도를 차지하고 있지만， 간 조직에서는 전체 GPAT 활성에 대하여 최대 50%까지의 활성을 차지하며， 지방조직에서도 활성이 높은 것으로 알려져 있다 (Bell et al， Annu Rev Biochem 49 :459-487, 1980； Lewin et al. Arch. Biochem. Biophys. 396： 119-127, 2001). 이는 mtGPAT가 지방간의 형성과 비만， 인슐린저항성 치료의 유용한 표적이 될 수 있음을 시사하고 있다.
GPAT의 4가지 이소폼 (isoform)가운데， mtGPAT만이 식이와 운동에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 연구에 따르면 고탄수화물식이를 섭취 통해 과도한 칼로리의 이용이 가능할 때， mtGPAT의 mRNA 발현이 증가되고 그 결과 mtGPAT의 활성이 증가된다는 보고가 있으며， 이와 유사하게 꾸준하게 운동을 시킨 후 10 시간 가량 움직임 없이 방치한 마이스 (mice) 군에서는 운동을 전혀 하지 않은 군의 마이스에 비해 mtGPAT의 활성이 꾸준히 증가하고 그 결과 혈중 중성지방의 합성이 유의적으로 증가한다는 결과가 보고되었다 (KuMp et al. 2006) .
랫 (Rat)에서 mtGPAT의 간에서의 선택적인 과발현은 대조군과 비교하여 간에서의 지질 생합성이 증가하는 반면 지방산의 산화는 크게 감소하였으며， 지방간과 이상지질혈증 (dyslipidemia), 인슬린 저항성이 높아졌는데， 특히 간에서의 인술린 저항성이 크게 증가하였다 (Linden et al . FASEB J, 20:434-443, 2006； Linden et al . J. Lipid Res. 45:1279-1288, 2004) . 이는 간에서의 지질 대사가 인술린 저항성의 발달에 주요하게 관여되고 있음을 의미하고 있다. 특히, 비만환자에서 지방간 (fatty liver)의 발병률이 현저히 높기 때문에 mtGPAT은 비알콜성 지방간 질환 (non-alcoholic fatty liver disease)과 관련된 이상지질혈증， 인슐린저항성 치료제 개발의 매력적인 분자 타겟이 될 수 있음을 시사하고 있다 (Linden et al. , FASEB J, 20:434—443， 2006) .
이와 관련된 연구로서， mtGPAT-결핍 (mtGPAT——)된 마우스에 비만유도를 위해 고지방， 고당분 식이를 섭취시키면 중성지방의 합성과는 동떨어져
CPT-1과 β—산화 (βᅳ oxidation)가 활성화되며， 또한, mtGPAT-결핍 (mtGPAT— )된 마우스는 대조군에 비해 중성지방의 함량이 간에서 37¾ 감소, 혈중에서는 15% 감소하였으며，초저비중지질단백 (very low density lipoprotein, VLDL)의 분비는 30% 감소되었으며， 결과적으로 마우스에서 mtGPATᅳ /-는 체중과 지방량의 감소 이후 인슐린 감수성이 증가함이 관찰되었다 (Hammond et al, Mol Cell Biol 22:8024-8214, 2002； Hammond et al , J Biol Chem 280： 25629ᅳ 25636, 2005) . 따라서， GPAT 저해는 중성지방의 세포 내 축적을 저해하는 작용점이 될 수 있으며, GPAT의 지방 축적과 에너지 대사 역할을 조절하는 저분자 저해제의 개발은 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증， 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 치료제를 개발하는 전략이 될 수 있다.
기존에 mtGPAT 저해제 화합물로서는 싸이클로펜테닐 아세틱산^010 6]^1 ^1 acetic acid)유도체 (Eydysh et al . Bioorg. Med. Chem . 2010, 18: 6470-6479), 2-(nonylsulfonamido) 및 벤조산 (benzoic acid) 유도체 (Eydysh et al. J. Med. Chem. 2009, 52 :3317-3327)가 알려져 있으나， IC50 값이 25 μΜ에서 350 μΜ사이로 효소 저해제로서의 미약한 저해활성을 보였다. 이때 사용한 효소원이 ¾의 미토콘드리아 분획으로 아직 초보적인 단계에 있는 결과로 해석된다. 특허로는 미국의 FASgen과 프린스턴대학과 공동으로 mtGPAT 및 지질대사 관련 효소들의 유전적 억제가 다양한 바이러스 감염의 억제 및 치료에 효과적임을 연구한 특허 1편이 알려져 있다 (TO 2011/019498).
한편 , ^ Nyi haea tetragona)^ 수련과에 속하는 식물로서 한국， 일본 중국, 인도, 시베리아 동부 등에 분포되어 있고 여러 해살이 수중식물로 굵고 짧은 땅속줄기에서 많은 잎자루가 자라서 물 위에서 꽃이 핀다. 수련의 꽃은 한방에서 더위를 풀고 숙취를 풀어주며 소아의 급만성 경풍을 치료하는데 사용된다. 민간에서는 꽃을 지혈， 강장, 불면증 등의 약으로 사용된다.
수련뿌리 성분으로 폴리페놀계열인 제라닌 (geraniin)과
1,2,3,4， 6-펜타ᅳ 0-갈로이ᅳ베타ᅳ으포도당 ( 1 ,2,3,4, 6-pent a~0-ga 11 oyl-bet a-D-g 1 ucose, PGG)이 알려져 있으며 방사선에 의해 유도된 세포사 (apoptosis)를 억제하는 것으로 알려져 있다 (Kanget al . Cell Biol. Toxicol. 2011, 27： 83-94； Biol. Pharm. Bull. 2010， 33:1122-1127). 본 발명자들은 천연물로부터 ratGPATl을 억제하는 활성물질을 탐색하는 과정에서 수련뿌리 추출물， 이의 분획물 및 이로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들이 mtGPATl의 효소활성을 효과적으로 억제하였고， 세포 내의 중성지방의 생합성을 저해하는 것을 확인함으로써， 골격근 세포에서의 포도당 섭취를 증대시켜 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증， 인슐린저항성， 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료 효과가 있음을 확인함으로써， 본 발명을 완성하였다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 수련뿌리 0V7¾oA3es tetragona) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한， 본 발명의 다른 목적은 하기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
<화학식 1>
Figure imgf000007_0001
<화학식 3>
Figure imgf000008_0001
<화학식 4>
Figure imgf000008_0002
아을러, 본 발명의 다른 목적은 수련뿌리 추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 과제를 해결하기 위하여， 본 발명은 수련뿌리 (vVj /^ ea tetragona) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수련뿌리 추출물을 대사성 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수련뿌리 추출물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수련뿌리 추출물의 유기용매 분획물을 대사성 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 수련뿌리 추출물의 유기용매 분획물을 개체에게 투껴하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 대사성 질환에 걸린 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1， 화학식 2ᅳ 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다. ^
또한， 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물을 함유하는 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 유기용매 분획물을 함유하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료에 사용하기 위한 상기 화학식 1,화학식 2，화학식 3또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물，또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
또한, 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 유기용매 분획물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물의 제조에 사용하기 위한 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 제조에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 제조에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 유기용매 분획물의 용도를 제공한다. 아울러, 본 발명은 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 제조에 사용하기 위한 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명에 따른 수련뿌리 추출물， 이의 분확물 또는 상기 분획물로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들은 대사성 질환을 유발하는 mtGPATl의 활성을 효과적으로 억제하고， 세포내 중성지방의 생합성 저해 및 골격근 세포에서의 인술린 의존적 포도당 섭취 증대 활성을 나타내는 것을 확인하였으므로, 본 발명의 폴리페놀계 화합물들을 비롯하여， 이들을 함유하는 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물은 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증， 인슐린저항성， 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1 및 2는 수련뿌리 메탄올 추출물, 부탄올 분획물 및 분획물에서 분리된 화합물의 hGPATl의 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 1은 수련뿌리 메탄올 추출물과 용매 분획물의 hGPATl의 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 2는 화학식 1， 화학식 2, 화학식 3 또는 화학식 4의 hGPATl 저해 활성을 나타낸 도이다.
도 3은 수련뿌리의 메탄올 추출물과 용매 분획물의 HepG2 세포 (인간 유래 간세포) 내에서의 중성지방 생합성 저해효과를 나타낸 도이다.
도 4 및 도 5는 수련뿌리 메탄올 추출물과 분획물 및 분리된 화합물의 포도당 섭취 활성을 나타낸 도이다.
도 4는 수련뿌리의 메탄을 추출물과 분획물의 쥐의 골격근세포인 L6 세포에서의 포도당 섭취 활성을 나타낸 도이다.
도 5는 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 쥐의 골격근세포인 L6세포에서의 포도당 섭취 활성을 나타낸 도이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 수련뿌리 GVJ 3es tetragona) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명에서 사용된 용어， "^^ Nymphaea tetragonaY 은 천연， 잡종 또는 변종 수련의 모든 기관， 예를 들어， 뿌리， 가지， 즐기， 잎， 꽃을 모두 포함하여 의미하나， 구체적으로는 수련의 지하부이다.
상기 추출물은 물， 내지 C4의 알코올 또는 이들의 흔합물인 용매로 추출되는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 알코을은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 수련뿌리 추출물은 :하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것 일 수 있으나 이에 한정하지 않는다:
1) 수련뿌리에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서， 단계 1)의 수련뿌리는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다. 상기 수련뿌리는 수련 지하부를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 수련뿌리 추출물의 추출 방법으로는 여과법， 열수 추출， 침지 추출， 환류넁각 추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며， 열수 추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고， 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 수련뿌리에 0.1 내지 10배 첨가할 수 있으며， 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 40인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 48시간인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서， 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한， 건조는 감압건조， 진공건조， 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 대사성 질환은 비만, 제 2형 당뇨, 이상지질혈증， 인슐린저항성, 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한， 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 유기용매 분획물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 유기용매는 핵산, 클로로포름 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
상기 분획물은 수련뿌리 추출물을 헥산， 클로로포름， 부탄올 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 핵산 분획물， 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다. 상기 핵산은 n-핵산인 것이 바람직하다.
상기 대사성 질환은 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증, 인슐린저항성， 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다. 또한， 본 발명은 하기 화학식 1의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure imgf000014_0001
또한， 본 발명은 하기 화학식 2의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 2>
Figure imgf000014_0002
또한, 본 발명은 하기 화학식 3의 클리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 .질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 3>
Figure imgf000015_0001
또한， 본 발명은 하기 화학식 4의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
<화학식 4>
Figure imgf000015_0002
. 또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 치료에 사용하기 위한
Figure imgf000015_0003
화학식 1，화학식 2,화학식 3또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물，또는 0 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다. 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 및 화학식 4의 화합물은 각각 수련뿌리 추출물로부터 분리한 것일 수 있으나 이에 한정하지 않으며， 다른 물질로부터 유래한 것 또는 합성한 것 모두사용가능하다.
상기 대사성 질환은 비만， 제 2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슬린저항성, 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명자들은 수련뿌리 추출물 및 분획물을 제조하기 위해 수련뿌리를 분쇄하여 메탄올에 침지하여 추출하였다. 추출액을 여과하고， 감압 농축하여 메탄을 추출물을 얻었으며， 활성물질을 분리하기 위해 상기 수련뿌리 메탄을 추출물을 핵산, 클로로포름, 부탄올, 물로 용매 분획하여 각각의 분획물들을 얻었으몌 상기 분획들의 인간 글리세를— 3-포스페이트 아실트랜스퍼라제 (huraan glycerol-3-phosphate acyl transferase, hGPATl) 저해 활성을 측정한 결과 부탄을 분획물에서 보다 우수한 저해활성을 확인하였다.
본 발명자들은 수련뿌리 추출물로부터 화합물을 분리하기 위하여， 상기 부탄을 분획물을 메탄올 /물 흔합용매로 순차적으로 극성을 증가시키면서 역상 컬럼 크로마토그래피 (reverse phase column chromatography)를 이용하여 총 8 개의 분획으로 분리하였다 (분획물 1〜분획물 8). 이들 중 저해활성이 가장 강한 분획물을 모아 세파텍스 LH-20(Sephadex LH20)을 사용하여 메탄을로 용출시켜 활성분획을 분리하였다. 이 중 저해활성이 강한 분획물을 모아 용출용매로 메탄올 /물 흔합용매를 5 ml/분으로 홀려주면서 고속액체크로마토그래피 (YMC J 'sphere ODS H-80 column, 250 20讓)를 실시하여 최종적으로 순수한 화합물 4종 (화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 및 화학식 4)을 얻었다.
본 발명자들은 상기 4종의 화합물들의 구조를 규명하기 위해, 상기 화합물의 성상， 분자량， 분자식, 질량분석,' ¾-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과 발표된 문헌 [Hideyuki Kurihara et a\ . Biosci. Biotech. Biochem. , 57(9)： 1570-1571, 1993； Wen-Hua Zhao et al. J. Chroma togr. B. , 850, 523-527, 2007； R. W. Owen et al . Food and Chemical Toxicology. , 41, 1727-1738, 2003]의 데이터와 일치하였으며， 제라닌 (geranin),
1,2,3,4, 6ᅳ펜타-^갈로이ᅳ베타ᅳ으글루코스 (1 ,2,3,4， 6-pent a-i>gal 1 oy 1ᅳ bet aᅳ으 glucose) ,
1， 2， 3 , 6ᅳ테트라 -0-갈로이—베타 -으글루코스 (1， 2， 3， 6-t etra-0-ga 11 oyl-beta-D-g 1 ucose), 메틸갈레이트 (methyl gallate)로 동정하였다. 수련뿌리로부터 분리된 화합물의 이화학적 특성과 화학 구조는 하기와 같다.
<화학식 1>
제라닌 (geranin)
Figure imgf000017_0001
<화학식 2>
1,2,3,4, 6-펜타— 갈로이 -베타-으글루코오스 ( 1,2,3,4, 6-pent a-^g lloyl -beta— D一 glucose)
Figure imgf000018_0001
<화학식 3>
1,2ᅳ 3，6ᅳ테트라ᅳ으갈로이-베타ᅳ으글루코오스 (1,2,3,6— tetra-으 galloyl-b eta—D— glucose)
Figure imgf000018_0002
<화학식 4>
메틸갈레이트 (methyl gal late)
Figure imgf000019_0001
본 발명자들은 인체유래 hGPATl (human GPAT1)의 대량 발현 및 hGPATl 효소원을 분리하고자， Human hGPATl cDNA(NCBI accesstion No. NMᅳ 020918)를 pFastBacl 백터에 클로닝하고 이 후 얻어진 재조합 bacmid DNA를 Sf9 세포에 형질전환하여 human hGPATl 0^를' 포함하는 배클로바이러스 (baculovirus)를 조립 ·증폭하였다. 세포를 회수하였으며， 초음파세포파쇄기를 이용하여 균질화하였다. 상등액만을 취하고， 원심분리하였다. 얻어진 침전물을 수크로오스 완층액에 현탁하여 미토콘드리아 hGPATKmitochondrial hGPATl)의 효소원으로 사용하였다. 또한， 침전물을 제거한 상둥액을 원심분리하여 얻은 침전물을 수크로오스 완층액 (sucrose buffer)에 현탁하여 마이크로솜 hGPATl 효소원으로 사용하였다.
인체유래 hGPATl의 활성 저해 효과를 측정하기 위해， 마이크로솜 hGPATl 효소의 활성은 Nᅳ에틸말레이미드 (Nᅳ ethylmaleimide, NEM)에 의해 그 활성이 소실되며， 미토콘드리아 hGPATl 활성만을 측정할 때에는 실험 전에 N-에틸말레이미드를 전처리함으로써 마이크로솜 hGPATl 활성을 소실시킨 후 실험을 진행하였다. 미토콘드라아 hGPATl 효소의 활성은 생성된 반웅물인
[14C]리소포스파티딕산 ([14C]Lysophosphat lic acid)의 방사선 양으로 측정하였다. 미토콘드리아 hGPATl의 활성은 실험 전 미토콘드리아 hGPATl 효소원에 2 mM Nᅳ에틸말레이미드를 15분 동안 얼음 욕조 (ice bath)에서 전처리하여 마이크로솜 hGPATl의 활성을 실활시킨 후 측정하였으며， 마이크로솜 hGPATl의 활성은 N-에틸말레이미드 (2 mM)를 마이크로솜 hGPATl 효소원에 전처리하여 전체 hGPATl 활성과 마이크로솜 hGPATl의 효소 활성 비율을 측정하여 마이크로솜 hGPATl 효소원의 활성 결과를 보정하여 효소 활성을 측정하였다.
효소 반웅에 사용된 기질은 [14C]글리세를 -3ᅳ포스페이트 (1.8 μΜ)와 팔미토일-코에이 (palniitoyl-CoA)(100 μΜ)이며， 이들 기질은 반웅액에서 반웅 후， 수포화 부탄올과 물에 의해 반웅이 정지되었다. 반웅물은 원심분리를 통하여 물 층과 부탄올 층으로 분리되었고, 반웅 생성물인
[14C]리소포스파티딕산 (lysophosphatidic acid)이 포함된 상층액 (부탄을 층)을 취하였다. 상층액은 동량의 물과 진탕하여 원심분리를 통해 물 층과 부탄올 층으로 다시 분리하였고 상층액 600 峰 취하여 액체섬광계측기 (liquid scintillation counter, LSC)로 방사능의 양 (Disintegrat ions per minute, DPM)을 측정하였다. 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 수련뿌리 추출물, 분획물 및 화학식 1， 화학식 2와 화학식 3의 화합물을 각각 처리하여 hGPATl 효소 활성을 측정하였다. 그 결과， 수련뿌리 추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 비환식 폴리페놀계 화합물은 hGPATl 저해 활성이 우수하며, 농도의존적으로 hGPATl 저해 활성을 나타내었다 (표 1， 표 2， 도 1 및 도 2 참조).
본 발명의 화합물에 의한 세포 내에서의 중성지방 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해， 인간 유래 간세포인 HepG2 세포를 이용하여 2종의 기질에 대한 세포 내에서의 중성지방 생합성 저해 활성을 측정하였다. 그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이 수련 추출물 및 분획물을 각각 50 / 의 농도로 처리하고
[14C]글리세롤을 기질로 사용했을 때 각 분획물은 세포내의 중성지방 생성을 저해하였다 (표 3 참조).
L6세포 (rat skeletal myoblast cell line)에서의 포도당섭취 증가 효과 측정하기 위하여, 분화된 L6 세포에 인슬린을 비롯한 수련뿌리 추출물 또는 분획물 및 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3， 화학식 4를 각각 처리한 후 크렙스ᅳ링거 완충액 (Krebs-Ringer Buffer, K B)에서 배양하였다. RB에서 배양된 세포에 2ᅳ데옥시 -2ᅳ글루코오스 (2-deoxy— D-gkicose)와 표지된 2-데옥시 -2-글루코오스 (2-deoxy-으 [14C]glucose, 0.2 Ci/ml)를 처리한 후 10분 동안 반웅시켰다. 반응이 끝난 후 방사성 측정기 (scintillation counter)로 측정하여 포도당 섭취 정도를 판단했다. 그 결과， 수½뿌리 추출물 또는 부탄올 분획물을 처리하였을 때 대조군 (DMS0)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰다. 또한 화학식 1， 화학식 2, 화학식 3， 화학식 4를 처리하였을 때 대조군 (DMS0)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰디-.
수련뿌리 추출물 또는 부탄을 분획물의 L6 세포 (rat skeletal myoblast cell line)에서의 포도당 섭취 증가 효과 측정하기 위하여, 분화된 L6 세포에 인슐린을 비롯한 수련뿌리 추출물과 부탄을 분획물을 처리한 후 크렙스 -링거 완충액 (Krebs-Ringer Buffer, KRB)에서 배양하였다. KRB에서 배양된 세포에 2ᅳ데옥시— 2-글루콘오스 (2-deoxy-D-glucose)와 표지된 2-데옥시 -2-글루코오스 (2-deoxy-D-[14C]glucose, 0.2 uCi/ml)를 처리한 후 10분 동안 반응시켰다. 반웅이 끝난 후 방사성 측정기 (scintillation counter)로 측정하여 포도당 섭취 정도를 판단했다. 그 결과， 수련뿌리 추출물 또는 부탄을 분획물을 처리하였을때 대조군 (DMS0)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰으며 인술린에 의존적인 것으로 나타났다.
본 발명의 수련뿌리 추출물의 경구 급성 독성을 알아보기 위하여 마우스를 사용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험동물은 무특이병원체 (specific pathogen free, SPF) 동물로서 7 주령의 수컷 ICR 마우스를 대조군 및 시험군으로 구분하여， 대조군에는 0.5% 카르복시메틸 셀를로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC) 용액만을 투여하였고, 시험군에는 상기 실시예 1에서 제조한 본 발명의 수련뿌리 추출물을 각각 1,000 mg/kg, 500 mg/kg의 용량으로 경구 투여한 후 2 주간 독성 여부를 관찰하였다. 그 결과， 모든 군에서 사망한 동물은 없었으며， 특이한 행동이나 독성증상의 소견을 보이는 동물은 발견되지 않았다. 또한, 모든 군에서 체중이 증가하였으며 부검 시 관찰한 흉강 및 복강 내 모든 장기에서 특이한 병변이나 이상 소견은 발견되지 않았다.
따라서， 본 발명에 따른 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들은 대사성 질환을 유발하는 mtGPATl의 활성을 효과적으로 억제하고， 세포내 중성지방의 생합성 저해 및 골격근 세포에서의 인술린 의존적 포도당 섭취 증대 활성을 나타내는 것을 확인하였으므로， 본 발명의 폴리페놀계 화합물들을 비롯하여, 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물은 비만, 제 2형 당뇨, 이상지질혈증， 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 0.1 내지 99.9 중량 %를 유효성분으로 함유하고， 약제학적으로 허용 가능한 담체， 부형제 또는 회석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제， 증량제, 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제ᅳ 환제， 산제, 과립제， 캡술제 등이 포함되며， 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분, 탄산칼슴, 수크로오스 (sucrose) 또는 락토오스 ( lactose)， 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한， 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슴， 탈크 등과 같은 '윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제， 내용액제，유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은.주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골， 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며， 비경구 투여시 피부외용 또는 복강내， 직장， 정맥, 근육， 피하 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며， 가장 바람직하게는 피부외용으로 사용한다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령， 성별, 건강상태， 식이， 투여시간， 투여방법， 배설율 및 질환의 증증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 수련뿌리 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000 mg/kg이고, 바람직하게는 30내지 500 mg/kg이고， 더욱 바람직하게는 50내지 300 rag/kg이며， 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술， 방사선 치료， 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 본 발명에 따른 조성물을 대사성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법을 제공한다.
상기 대사성 질환은 비만, 제 2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 0.001 내지
10 mg/kg이며 , 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중， 연령, 성별， 건강상태, 식이, 투여기간， 투여방법 제거율， 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사， 직장내주사, 피하주사, 정맥주사， 근육내주사， 자궁내 경막주사， 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
상기 개체는 척추동물이고， 구체적으로는 포유동물이고， 더 구체적으로는 쥐， 토끼, 기니아피그， 햄스터， 개， 고양이와 같은 실험동물이며， 보다 구체적으로는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물일 수 있다.
본 발명에서， "투여 "는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여， 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여， 피내 투여， 경'구 투예 국소,투여， 비내 투여， 폐내 투여， 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에서， "투여 "는 본 발명의 조성물을 췌장암 세포로 "전신 전달" 또는 "국소 전달"하여 도입되는 것을 뜻한다. "전신 전달"은 유기체 내에 화합물의 광역 생체분포를 유발하는 전달을 지칭한다ᅳ 일부 투여 기술은 특정한 화합물의 전신 전달을 유발하고, 다른 것들에는 그렇지 않을 수 있다. 전신 전달은 유용한, 바람직하게는 치료적으로 유효한 양의 화합물이 신체의 대부분에 노출되는 것을 의미한다. 일반적으로， 광역 생분포를 얻기 위해, 화합물이 투여 부위와 멀리 떨어진 질환 부위에 도달하기 전에 빠르게 분해되거나 제거되지 않도록 (예를 들면， 최초 통과 기관 (간, 폐 등)에 의해 또는 빠른 비특이적 세포 결합에 의해) 하는 혈액내 수명이 요구된다. 본 명세서에 사용된 "국소 전달"은 유기체 내에서 표적 부위에 화합물을 직접 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들면， 화합물은 질환 부위， 예를 들면 종양 또는 다른 표적 부위, 예를 들면 표적 기관, 예를 들면 췌장에 직접 주사함으로써 국소 전달될 수 있다.
또한 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다. 主한， 본 발명은 수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 제조에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명은 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 제조에 사용하기 위한 수련뿌리 추출물의 유기용매 분획물의 용도를 제공한다. 아울러, 본 발명은 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 제조에 사용하기 위한 상기 화학식 1, 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 제공한다.
상기 폴리페놀계 화합물은 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3및 화학식
4로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나， 이에 한정하지 않는다.
상기 대사성 질환은 비만, 제 2형 당뇨, 이상지질혈증， 인슬린저항성， 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서는 수련뿌리 추출물， 이의 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 폴리페놀계 화합물들은 대사성 질환을 유발하는 mtGPATl의 활성을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였으므로， 본 발명의 폴리페놀계 화합물들을 비롯하여， 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물은 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증， 인슬린저항성，간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지' 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당， 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드， 및 덱스트린， 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드， 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나,사카린 , 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수 ·물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01~0.04 중량부， 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제， 비타민， 전해질， 풍미제， 착색제， 펙트산 및 그의 염 , 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제， 안정화제， 방부제, 글리세린, 알콜， 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 - 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 이하 실시예 및 제조예를 통해 본 발명의 내용을 보다상세히 설명한디-. 단， 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>수련뿌리 추출물 및 분획물의 제조
건조된 수련뿌리 5 kg을 분쇄하여 메탄을 25 에 침지하여 2회 추출하였다. 추출액을 여과하고, 감압 농축하여 메탄을 추출물 약 199 g을 얻었다. 활성물질을 분리하기' 위해 상기 수련뿌리 메탄을 추출물 199 g을 증류수 1000 ^에 현탁시킨 후 핵산， 클로로포름， 부탄올， 물로 용매 분획하여 각각의 분획물들을 얻었다. 상기 분획들의 hGPATl 효소 저해 활성 측정한 결과부탄을 분획물에서 보다우수한 저해활성을 보였다.
<실시예 2>수련뿌리 추출물로부터 화합물의 분리 상기 부탄을 분획 (약 25 g)을 . 20%, 30%, 40%, 50%메탄올 /물 흔합용매로 순차적으로 극성을 증가시키면서 역상 컬럼 크로마토그래피 (reverse phase column chromatography)를 이용하여 총 8 개의 분획으로 분리하였다 (분획물 1 ~ 분획물 8).
이들 중 저해활성이 가장 강한 분획물을 모아 세파텍스 LH-20(Sephadex
LH20)을: 사용하여 메탄을로 용출시켜 활성분획을 분리하였다. 이 중 저해활성이 강한 분획물을 모아 용출용매로 90% 메탄올 /물 흔합용매를 5 mi/분으로 흘려주면서 고속액체크로마토그래피 (YMC J 1 sphere ODS H-80 column, 250X20 mm)를 실시하여 최종적으로 순수한 화합물 4종 (화학식 1, 화학식 2， 화학식 3 및 화학식 4)을 얻었다.
<실시예 3> 화합물의 구조 규명
상기 화합물은 물질의 성상， 분자량， 분자식， 질량분석， -NMR스펙트럼 및 13ONMR 스펙트럼을 측정한 결과 발표된 문헌 [Hideyuki Rurihara et al. Biosci. Biotech. Biochew. , 57(9)： 1570-1571 , 1993； Wen-Hua Zhao et al. J. Chromatogr. B. , 850， 523-527, 2007; R. W. Owen et al . Food and Chemical Toxicology. , 41, 1727-1738, 2003]의 데이터와 일치하 ¾으며 , 제라닌 (geranin) (화학식 1), 1,2,3,4，6ᅳ펜타-^갈로이ᅳ베타-으글루코스(1，2，3，4，6 6 £1ᅳ^ 3110 卜 3ᅳ으 glucose) (화학식 2)， 1，2，3，6ᅳ테트라-으갈로이 -베타 -D-글루코스
(l,2,3,6-tetra-()-galloyl-beta-D-ghicose) (화학식 3) 및 메틸갈레이트 (methyl gallate) (화학식 4)로 동정하였다. 수련뿌리로부터 분리된 화합물의 이화학적 특성과 화학 구조는 하기와 같다.
【화학식 1】 ΊΖΊ6Ι 'TS'89T 'ΖΤ'89ΐ 'Π'99ΐ '99'591 '9S'99T 'Τ8 9Ι ΌΖ'^91 ' 9'½Ι 'S 'SH '6S'SH 'S2'9H 'CT'SH '96'm '06 'T9'm 'S 'SW '89"6εΐ Ί9Ί£1 'Zf9 l '8S"82I '99 "921 H[ '09Ί ΐ '92O2T ' 5-6ΙΤ 'Z 'Sn 'T2'STI '9S'Sn '98 "ΟΤΤ '99'OXI '2S"0II '22" OTI ' O'SOT '88'ZOT 'T2-96 '8S'26 'ΖΖ"Τ6 Ό Ό6 '0 '£L 'ZO'SZ '09"2 'I9"0Z 'S6'69 '98'99 '06"S9 '6Z'S9 '99'S9 '¾"S9 '9S"29 ' 6"IS '6Γ9^： ( ( ) 9 '00¾3 'ζΗ1¾00Τ)Η -3εΐ (9
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Figure imgf000028_0001
SZ90TO/ZlOIM¾/13d 92 8££S80/eiOZ OAV 【화학식 2】
Figure imgf000029_0001
1) 성상 ： 연한 갈색 고체 (pale brown solid)
2) 분자량 ： 940
3) 분자식 ： C41H32O36
4) ESI-질량분석 ： m/z = [M+Na] + , 963
5) ¾-MR( 400MHz, CD30D, δ (ppm)) ： 7.10 (2H, s, 1-Gall-Hᅳ 2, 6), 7.04 (2H, s, 2-Gall -H-2, 6)， 6.97 (2H, s, 3-Gal 1 -H-2, 6)， 6.94 (2H, s, 4-GaUᅳ H-2, 6)， 6.89 (2H, s, 6— Gall-H— 2, 6), 6.22 (1H, d, J=9.5 Hz, glu-H-1).
6) 13C-NMR(100MHz, CD30D, δ (ppm)) ： 167.9 (2-Gal l-C-7) , 167.3 (l-Gall-C-7), 167.0 (3-G l l-C-7) , 166.9 (4-Gal l-C-7) , 166.2 (6-G l l-C-7) , 146.5 (l-Gall-C-3,5), 146.4 (2-Gal l-C-3,5) , 146.4 (3-Gal 1— 03 ,5) , 146.3 (4-Gall-C-3,5), 146.3 (6-Gal l-C-3,5) , 140.8 (l-Gall-C-4), 140.4 (2-Gal l-C-4) , 140.3 (3-Gal l-C-4), 140.1 (4-Gal l-C-4) , 140.0 (6-Gal l-C-4) , 121.1 (1-Gal 1-C-l), 120.4 (2-Gal 1-C-l) , 120.3 (3-Gal 1-C-l) , 120.2 (4-Gal 1-C-l) , 119.7 (6-Gall-C-l), 110.6 (1-Gal l-C-2,6) , 110.4 (2-Gal l-C-2,6, 3-Gal l-C-2,6) , 110.3 (4-Gall-C-2,6, 6— Gal l—C— 2，6) , 93.8 (glu-C-1), 74.4 (ghi— C— 3)， 74.1 (glu-C-5), 72.2 (glu-C-2), 69.8 (ghi— C— 4)， 63.1 (glu-C-6).
【화학식 3】
Figure imgf000030_0001
1) 성상 ： 연한 갈색 고체 (pale brown solid)
2) 분자량 ： 788
3) 분자식 ： C34H2S022
4) ESIᅳ질량분석 ： m/z = [M+Na] + , 811
5) ¾-NMR( 400MHz, CD30D, δ (ppm)) ： 7.11 (2H, s, 6-Gall-H-2, 6)， 7.01
(2H, s, 3-Gall-H-2, 6), 6.98 (2H, s, 1-Gall -H-2, 6)， 6.90 (2H, s, 2-Gall-H-2, 6), 6.00 (1H, d' J=9.5 Hz, glu-H-1).
6) 13C-NMR(100MHz, CD30D, δ (ppm)) ： 168.1 (6-Gal l-C-7) , 167.7 (3-Gall-C-7), 167.5 (2— Gal l-C-7) , 167.1 (l-Gall-C-7), 146.5 (1-Gal l-C-3,5) , 146.4 (3— Gal l-C-3,5), 146.3 (6-Gal l-C-3,5) , 146.2 (2-Gal l-C-3,5) , 121.2 (6-Gall-C-l), 120.8 (3-Gal 1-C-l) , 120.5 (2-Gall'C-l), 120.4 (1-Gal 1-C-l) , 110.4 (l-Gall-C-2,6, 2-Gal l-C-2,6) , 110.3 (3~Gal l-C-2,6, β-Gal l-C-2,6) , 91.5 (glu-C-1), 73.8 (glu-C-3), 73.4 (glu-C-5), 70.6 (glu-C— 2)， 68.7 (glu-C-4) 64.4 (glu-C-6).
【화학식 4】
Figure imgf000031_0001
1) 성상 ： 흰색 가루 (white powder)
2) 분자량 ： 184
3) 분자식 ： C8H805
4) 1H-NMR( 400MHz, CD30D, δ (ppm)) ： 7.41 (IH, s, H-2), 7.75 (IH, s, H-6) , 3.87 (3H, s , methoxy methyl ) , 3.83 (IH, s , ester methyl )
5) IX— NMR(100MHz, CD30D, δ (ppm)) ： 121.5 (01)， 110.6 (02), 149.9 (C-3), 146.1 (C-4) , 141.2 (05), 118.7 (06), 168.2 (07)， 56.8 (methoxy methyl ) , 49.5 (ester methyl ) . <실시예 4> 인체유래 hGPATl (human GPAT1)의 대량 발현 및 효소원 분리
Human GPATK hGPATl)을 과발현시킨 sf9 세포로부터 분리한 미토콘드리아 단백질 (mitochondrial protein)을 효소원으로 사용하였다. hGPATl cDNA(NCBI accesstion No. 丽_020918)를 pFastBacl 백터 (Invitrogen)에 클로닝하고 이 후 얻어진 재조합 bacmid DNA를 Sf9 세포에 형질전환하여 human hGPATl cDNA를 포함하는 배클로바이러스 (baculovirus)를 조립 .증폭하였다. Sf9 세포 (1X106 세포 /ral)에 10 M()I의 바이러스를 감염시키고 48 시간 후 원심분리를 통해 세포를 회수하였으며， 균질화 완충액 (homogenize buffer )(250 mM 수크로오스 (sucrose), 10 niM Tris ( H 7.4)， 1 mM EDTA)을 넣고 초음파세포파쇄기를 이용하여 균질화하였다. 원심분리 (600 g, 15분)하여 상등액만을 취하고, 이를 다시 8， 000 g에서 15분 동안 원심분리 하여 얻어진 침전물인 미토콘드리아 단백질 분획을 수크로오스 완충액 (sucrose buffer: 250 mM sucrose, 10 mM Tris (pH 7.4), 1 mM EDTA, 1 mM DTT)에 현탁하여 브래드포드 방법 (Bradford Method)으로 단백질의. 농도를 결정하였으며， 이를 ᅳ 80°C에 보관한 후 실험에 사용하였다.
<실시예 5> 인체유래 hGPATl의 활성 저해 효과 측정
hGPATl 효소의 활성은 미토콘드리아 hGPATl 효소원에 의해 생성된 반웅물인 [14C]리소포스파티딕산 ([l ]Lysophosphaticlic acid)의 방사선 양으로 측정하였다. 미토콘드리아 hGPATl의 활성은 다른 동질효소에 비해 hGPATl은 에틸말레이미드 (N-ethylmaleimide, NEM)의 처리에 의해 활성을 유지한다는 이전 연구 결과에 따라 실험 전 hGPATl 효소원에 2 mM N—에틸말레이미드를 15분 .동안 얼음 욕조 (ice bath)에서 전처리하여 hGPATl 외의 동질효소의 활성을 실활시킨 후 측정하였다.
효소 반웅에 사용된 기질은 [14C]글리세를 -3-포스페이트 (1.8 μΜ)와 팔미토일ᅳ코에이 (palmitoyl-CoAKlOO μΜ)이며 , 이들 기질은 반응액 (75 mM Tris (pH 7.5), 4 mM MgCl2, 8 mM NaF, 2 mg/ i BSA)과 함께 26°C에서 20분 동안 반응 후, 수포화 부탄올과 물에 의해 반웅이 정지되었다. 반응물은 원심분리를 통하여 물 층과 부탄을 충으로 분리되었고, 반웅 생성물인 [14C]리소포스파티딕산 (lysophosphatidic acid)이 포함된 상층액 (부탄을 층) 800 ^를 취하였다. 상층액은 동량의 물과 진탕하여 원심분리를 통해 물 층과 부탄을 층으로 다시 분리하였고 상층액 600 ^를 취하여 액체섬광계측기 (liquid scintillation. counter, LSC)로 방사능의 양 (Disintegrations per minute, DPM)을 측정하였다. 상기 실시예 1 및 2에서 제조한 수련뿌리 추출물 및 분획물의 최종농도를 30,100 g/ 의 농도로 처리하고， 상기 실시예 2에서 제조한 화학식 1， 화학식 2와 화학식 3의 화합물의 최종농도 100， 30， 10， 3， 1, 0.3/g/m£의 농도로 처리하여 hGPATl효소 활성을 측정하였다. 시료에 의한 hGPATl 효소 활성의 저해율은 하기 수학식 1로 계산하였다.
【수학식 1】 저해활성 (%)= 1 - [(T-B (C-B)] X 100
τ： 효소 반응액에 시료를 넣은 시험 구의 DPM 값，
C ： 효소 반웅액에 시료를 넣지 않은 대조 구의 DPM 값,
B ： 효소원을 넣지 않고 시료를 넣은 대조 구의 DPM 값.
. 그 결과, 표 1， 표 2, 도 1및 도 2에 나타난 바와 같이 , 수련뿌리 추출물 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 비환식 폴리페놀계 화합물은 hGPATl 저해 활성이 우수하며， 농도의존적으로 hGPATl 저해 활성을 나타내었다. 또한, 화학식 1, 화학식 2와 화학식 3의 화합물의 hGPATl에 대한 50% 저해 활성을 나타내는 농도인 IC50값은 각각 16.9 ug/ml, 70.3 /g/ 과 59.8 ^g/ml 이었다.
【표 1】
Figure imgf000033_0001
【표 2]
Figure imgf000034_0001
<실시예 6> HepG2 세포 내에서의 중성지방 생합성저해 효과측정
^ ¾명의 화합물에 의한 세포 내에서의 중성지방 합성에 미치는 영향을 알아보기 위해, 인간 유래 간세포인 HepG2 세포를 이용하여 2종의 기질에 대한 세포 내에서의 중성지방 생합성 저해 활성을 측정하였다. HepG2 세포는 ATCC에서 분양 받았으며， 최소필수배지 (Minimum essential medium, MEM; 2 mM Lᅳ글루타민; 및 1.5 g/L 탄산수소 나트륨 (sodium bicarbonate), 0.1 mM 불필수 아口 1노산 (nonessential amino acids) 및 1 mM 피루브산 나트륨 (sodium pyruvate)을 함유하도록 조제된 earle^ BSS) 배지에 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)과 \ 항생제 (100 U/ml . penicillin 및 100 g/ml streptomycin)를 첨가하여 37°C , 5%C02배양기에서 배양하였다. 세포 내에서의 hGPATl ' 효소 활성은 배양된 HepG2 세포에서 생성된 중성지방의 양으로 ■ 측정하였으며 효소활성 저해 물질로 화학식 1과 화학식 2ᅳ 화학식 3의 화합물을 각각 첨가한 후 중성지방의 생성의 감소율에 따라 효소 저해제의 효과를 결정하였다. ᅵ 24웰 (well) 배양접시에 웰 당 IX 106세포 /ml의 세포수로 분주하여 24 시간 동안 배양한 후 FBS가 존재하지 않는 DMEM(Dulbecco^ modified Eaglets medium) 배지로 교환하고 기질로서 0.2 niCi의
[14C]아세테이트 ([14C]acetate)(Amersham사)를 첨가시키고 6시간 동안 반응시켰다. 또 다른 기질로 사용된 [14C]글리세를 ([14C]glycerol)의 경우 18시간 동안 반응시켰다. 시료는 디메틸설폭시화물 (dimethyl sulfoxide, DMS0)에 녹여 사용하였으며, 중성자방 생성반웅에서의 대조구는 시료를 넣지 않고 디메틸설폭시화물만으로 반웅을 시켰으며， 이로써 생성된 중성지방의 생성율을 100으로 하였다.
반웅이 끝난 세포 내에서 중성지방의 생성양을 측정하기 위해 세포로 흡수되지 않고 배지 중에 남아있는 기질인 [14C]아세테이트 또는
[14C]글리세를을 제거하고 인산완충식염수 (phosphate-buff er-sa line, PBS)로 1회 제거한 후 추출용매 (핵산 (hexane) ： 아이소프로판을 (isopropanol) = 3:2, v:v) 0.5 ml을 첨가하여 중성지방을 포함한 전체 지방을 추출하였다. 0.5 ml 추출 용매로 30분씩 2회 추출 후 얻어진 추출액 1 ml은 질소가스를 통해 농축하였으며， 추출용매를 제거한 후 전체 지방을 ;유기용매 (클로로포름:메탄을 = 2:1)에 녹여 박층 크로마토그래피 (TLC: silica gel 60F254, thickness: 0.5讓， Merck)에 점적하여 전개용매 (핵산：디에틸에테르:아세틱에시드 = 80:20:1， v:v:v)상에서 전개하였다. TLC 상에서 중성지방 (Rf값: 0.4)을 분리한 후 TLC 판을 방사능 에너지를 감광할 수 있는 필름에 3시간 동안 감광한 후 이미지 분석 (FLA-7000, Fuji, Japan)을 통해 중성지방의 [14C]방사능 양을 측정하였다. 추출 후 남아 있는 세포는 0.1 N 수산화나트륨 0.3 nil에 녹여 반웅에 이용된 세포의 단백질 농도 측정에 이용하였다. 중성지방의 방사능 양을 측정하여 단백질 농도로 나눈 값을 실험값으로 하여 각 시험군 사이의 실험 오차를 보정하여 본 발명의 수련ᅵ 추출물 및 분획물에 의한 중성지방의 생성율을 산출하였다.
그 결과， 표 3에 나타난 바와 같이 수련 추출물 및 분획물을 각각 50 /g/ 의 농도로 처리하고 [14C]글리세롤을 기질로 사용했을 때 세포내의 중성지방 생성을 메탄올 추출물은 15.9%, 핵산 분획물은 16 ， 클로로포름 분획물은 27.3%， 부탄을 분획물은 27.4%， 물분획물은 35.6%저해하였다.
【표 3]
Figure imgf000036_0001
<실시예 7〉 수련뿌리 추출물 또는 부탄올 분획물의 L6 세포 (rat skeletal myoblast cell line)에서의 포도당 섭취 증가 효과 측정
L6 근아세포 (myoblasts)주는 FBS 10%를 포함하는 DMEM(4 mM L-글루타민， 1.5 g/L 탄산수소 나트륨， 4.5 g/L 포도당) 배지에 배양하였다. 24웰 플레이트에서 배양된 세포주는 80%가 배지 전면에 증식한상태 상태에서 PBS로 세포를 두 번 세척한 후 0.2% FBS DMEM (4 mM L-글루타민， 1.5 g/L 탄산수소 나트륨， 1 g/L 포도당) 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 이 조건하에서 근아세포 (myoblastes) 상태의 세포는 근관세포 (myotubes)로 분화하게 된다. 분화된 L6 세포에 인슐린을 비롯한 수련뿌리 추출물과 분획물 30 //g/m.e와 화학식 1， 화학식 2， 화학식 ' 3 및 화학식 4를 각각 30 uM의 농도로 각각 일정시간 (1시간， 3시간, 6시챤) 처리한 후 크렙스—링거 완층액 (Krebs-Ringer Buffer, K B)에서 30분간 배양했다. RB에서 배양된 세포에 0.1 mM의 2-데옥시 -2ᅳ글투코오스 (2-deoxyᅳ으 glucose)와 표지된
2_데옥시ᅳ 2ᅳ글루코오스 (2ᅳ deoxy_D_[14C]gIucose, 0.2 uCi/iTil)를 처리한 후 10분 동안 반웅시켰다. 반웅이 끝난 세포에서 KRB 완충액를 제거하고 KRB 완충액으로 3번 세척한 후 1 M수산화나트륨 (NaOH)으로 세포를 용해시켰다. 1M 수산화나트륨에 용해된 세포는 방사성 측정기 (scint illation counter)로 측정하여 포도당 섭취 정도를 판단했다.
그 결과, 수련뿌리 추출물 및 부탄을 분획물을 30 /ᅳ 의 농도로 6시간 처리하였을 때 대조군 (DMS0)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰다. 또한 화학식 1， 화학식 2, 화학식 3및 화학식 4를 30 uM의 농도로 6시간 처리하였을 때 대조군 (DMS0)에 비해 포도당 섭취를 크게 증가시켰다.
<실시예 8> 수련뿌리 추출물의 급성 독성실험
본 발명의 수련뿌리 추출물의 경구 급성 독성을 알아보기 위하여 마우스를 사용하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 실험동물은 무특이병원체 (specific pathogen free, SPF) 동물로서 7 주령의 수컷 ICR 마우스 (대한바이오링크， 충북 음성)를 도입하여 1 주일간 순화기간을 거쳐 8 주령이 되었을 때 각 군당 5마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 대조군에는 0.5% 카르복시메틸 셀를로오스 (carboxymethyl cellulose, CMC) 용액만을 투여하였고， 시험군에는 상기 실시예 1에서 제조한. 본 발명의 수련뿌리 추출물을 각각 1,000 mg/kg, 500 rag/kg의 용량으로 경구 투여한 후 2주간 독성 여부를 관찰하였다.
그 결과， 모든 군에서 사망한 동물은 없었으며， 특이한 행동이나 독성증상의 소견을 보이는 동물은 발견되지 않았다. 또한， 모든 군에서 체중이 증가하였으며 부검 시 관찰한 흉강 및 복강 내 모든 장기에서 특이한 병변이나 이상 소견은 발견되지 않았다.. 따라서， 수련뿌리 추출물은 마우스에 대하여 각각 1ᅳ 000 mg/kg, 500 mg/kg 농도의 단회 경구투여에 따른 독성을 나타내지 않는 것을 알 수 있었다.
<제조예 1>산제의 제조
<실시예 1>의 수련뿌리 추출물 0.1 g 유당 1.5 g 탈크 0.5 g 상기의 성분들을 흔합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<제조예 2> 정제의 제조
<실시예 1>의 수련뿌리 분획물 0.1 g 락토오스 7.9 g 결정성 셀롤로오스 1.5 g 마그네슘 스테아레이트 0.5 g 상기의 '성분들을 흔합한 후 직타법 (direct tablet ing method)
제조하였다.
<제조예 3> 캡슐제의 제조
<실시예 2>의 화학식 1의 화합물 0.1 g 옥수수전분
카르복시 셀롤로오스
상기의 성분들을 흔합하여 분말을 제조한 후， 상기 분말을 통
Figure imgf000039_0001
제조방법에 따라 경질 캡술에 충전하여 캡술제를 제조하였다.
<제조예 4>주사제의 제조
<실시예 2>의 화학식 2의 화합물 0.1 g 주사용 멸균 증류수 적량 pH조절제 적량 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 (2 iii^) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.
<제조예 5> 액제의 제조
<실시예 2>의 화학식 3의 화합물 0.1 g 이성화당 10 g 만니를 5' g 정제수 적량 통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고， 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 로 조절한 후 갈색병에 층진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
<제조예 6>건강식품의 제조
<실시예 2>의 화학식 4의 화합물 100 mg
비타민 흔합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 Mg
비타민 E 1.0 rag
비타민 0.13 mg 비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 rag
비타민 B12 0.2 i
비타민 C , 10 mg
비오틴 10 μ
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 rag
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 흔합물 o
황산제 1철 1.75 rag
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제 1인산칼륨 15 rag
제 2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 rag
염화마그네슘 24.8 rag
상기의 비타민 및 미네랄흔합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였지만， 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음, 과립을 제조하고， 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<제조예 6> 건강 음료의 제조
<실시예 1>의 수련뿌리 추출물
구연산
을리고당
매실농축액 타우린 1 g 정제수를 가하여 전체 900 ml ' 통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후， 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 21 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호 .음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였지만 수요계층이나， 수요국가, 사용용도 둥 지역적, 민족적 기호 도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】 . , ■
수련뿌리 GVj^¾ ea tetragona) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 추출물은 물， 내지 C4의 알코을 또는 이들의 흔합물인 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 3】
제 2항에 있어서， 상기 알코올은 에탄을 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
수련뿌리 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5]
제 4항에 있어세 상기 유기용매는 핵산， 클로로포름 및 부탄을로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구 6】
제 4항에 있어서, 상기 분획물은 수련뿌리 추출물을 핵산， 클로로포름, 부탄을 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 핵산 분획물， 클로로포름 분획물， 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 7】
하기 화학식 1의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한
Figure imgf000043_0001
유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
<화학식 1〉
Figure imgf000043_0002
【청구항 8】
하기 화학식 2의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
<화학식 2>
Figure imgf000043_0003
【청구항 9]
하기 화학식 3의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:'
Figure imgf000044_0001
【청구항 10]
하기 화학식 4의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
<화학식 4>
Figure imgf000044_0002
【청구항 11】
제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어세 상기 화학식 1, 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물은 수련뿌리 추출물로부터 분리한 것을. 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 12】
제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서,상기 대사성 질환은 비만， 게 2형 당뇨， 이상지질혈증， 인술린저항성, 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 13】
수련뿌리 추출물， 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
【청구항 14】
제 13항에 있어서， 상기 폴리페놀계 화합물은 하기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 및 화학식 4로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물:
<화학식 1>
Figure imgf000045_0001
<화학식 2>
Figure imgf000046_0001
【청구항 15]
제 13항 또는 제 14항에 있어서， 상기 대사성 질환은 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증, 인슐린저항성 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
【청구항 16】
약학적으로 유효한 양의 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 방법 .
【청구항 17】
약학적으로 유효한 양의 수련뿌리 추출물 또는 이의 분획물을 대사성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법 .
【청구항 18】
약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1 , 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리 페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허 용가능한 염을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 예방 방법 .
【청구항 19】
약학적으로 유효한 양의 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 대사성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법 .
【청구항 20】
대사성 질환 예방， 개선 또는 치료에 사용하기 위 한 수련뿌리 추출물 또는 이의 유기용매 분획물을 포함하는 조성물 .
【청구항 21】
대사성 질환 예방 , 개선 또는 치료에 사용하기 위 한 상기 화학식 1， 화학식 2， 화학식 3 또는 화학식 4의 폴리페놀계 화합물， 또는 이 의 약학적으로 허용가능한 염， 또는 이들을 포함하는 조성물 .
PCT/KR2012/010625 2011-12-07 2012-12-07 수련뿌리 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Ceased WO2013085338A2 (ko)

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