WO2013102619A2 - Verfahren zur reduktion eines secodion-derivats mit einer alkoholdehydrogenase - Google Patents

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WO2013102619A2 PCT/EP2013/000004 EP2013000004W WO2013102619A2 WO 2013102619 A2 WO2013102619 A2 WO 2013102619A2 EP 2013000004 W EP2013000004 W EP 2013000004W WO 2013102619 A2 WO2013102619 A2 WO 2013102619A2
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Thomas Greiner-Stoeffele
Andreas Vogel
Ramona Schmiedel
Sabrina KÖPKE
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C Lecta GmbH
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C12P7/38—Cyclopentanone- or cyclopentadione-containing products

Definitions

  • the invention relates to a method for reducing a Secodion derivative of general formula 1 with an enzyme from the class of alcohol dehydrogenases (ADHs).
  • ADHs alcohol dehydrogenases
  • the Secodion derivatives of the general formula 1 are also referred to as secosteroids or 8,14-seco-gonatetraene-14,17-diones.
  • the Secodione are key substances in the synthesis of enantiomerically pure steroids from the estrogen and progestogen class. Examples are levonorgestrel, estradiol, 3-keto-desogestrel and deso estrel.
  • 3-keto-desogestrel The key step in preparing the enantiomerically pure steroids from the secodiones of general formula 1 is the selective reduction of only one ketone group to the corresponding alcohol in a stereoselective manner.
  • stereoselective simple reduction of a secodione of general formula 1 to a seconol theoretically 4 different spatial configurations are possible, depending on whether the hydroxyl group is formed at the position 14 or 17 e and whether the - or ß configuration arises.
  • the alcohol dehydrogenase-catalyzed reduction of secodiones of the general formula 1 can form, in addition to the singly reduced seconols of the general formulas 2-5, also doubly reduced secodiols of the general formula 6 which are undesirable for further conversion.
  • DE 2120676 describes the fermentative reduction of selected Seco steroids using the specific microorganisms Pichia farinosa NRRL Y-1 18 or Pichia farinosa CBS 185.
  • US 3,481,974 relates to a microbiological process for the stereospecific selective reduction of one of the carbonyl groups of a 13-alkyl-3-alkoxy-8,14-secogona
  • Suitable microorganisms are members of the genera Humicola, Rhodotorula and Schizosaccharomyces.
  • WO 2008/068030 a method is described in which the transformation is carried out with recombinant enzymes from the class of alcohol dehydrogenases. A precise indication of the product purity or the stereoisomeric excess is not made in WO 2008/068030.
  • the advantage of recombinant enzymes over wild-type cells is that the reaction conditions are not linked to cell survival. For example, higher substrate concentrations can be used.
  • the use of free enzymes eliminates the need for diffusion or transport of the substrate into the cell.
  • Another advantage is the easier production of the biocatalyst in constant quality.
  • a high proportion of by-products in particular double-reduced secodiol and secondary products derived therefrom, is produced. The formation of these by-products lowers the yield of singly reduced Seconol and makes the work-up of the reaction mixture more difficult. The process is therefore less economical overall.
  • the substrate and the reaction product are hardly soluble in water.
  • the substrate must be made available in the aqueous system.
  • This is solved in WO2008068030 by the use of high concentrations (40-67%) of secondary alcohols such as isopropanol or 4-methyl-2-pentanol.
  • these have the disadvantage that many enzymes are irreversibly inactivated at these concentrations or the alcohol is not accepted by the ADH enzyme.
  • the invention has for its object to improve the known from the prior art enzymatic method for the reduction of Secodion derivatives.
  • ADHs have been identified which have a particularly high stereoselectivity with respect to the 17-.beta.-seconol of general formula 2 and provide this in high product purity under different reaction conditions.
  • the product purity is analyzed by means of HPLC with a reversed phase C18 column (Gemini 5 ⁇ , 150 ⁇ 4.6 mm, Phenomenex). It is eluted isocratically with a mixture of water and 65% acetonitrile. The detection is carried out by means of a UV lamp at 265 nm. The product assignment takes place as far as available via reference compounds and is confirmed by means of HPLC-MS. Three product peaks can be identified: Seconol (all stereoisomers) at 4.32 min; Secodiol at 3.34 min; and peak 3 at 4.64 min. For peak 3, the same molar mass as for overreduced secodiol can be measured. Peak 3 can thus be explained by a subsequent reaction of Secodiol. The product purity of simply reduced Seconol is calculated as follows:
  • the proportion of the desired 17-.beta.-Seconol 2 in the product is determined by evaluating an HPLC chromatogram on a chiral HPLC phase.
  • the peaks of the 4 simply reduced stereoisomers can be clearly separated with this analysis and elute in the following order 17a, 14ß, 17ß and 14a-seconol.
  • the stereoisomeric excess is calculated from the respective peak areas according to the following formula:
  • the converted portion of Secodions to the desired Seconol is analyzed by HPLC with a reversed phase C18 column (Gemini 5 ⁇ , 150 x 4.6 mm, Phenomenex). It is eluted isocratically with a mixture of water and 65% acetonitrile. The detection is carried out by means of a UV lamp at 265 nm. The product assignment takes place as far as available via reference compounds and is confirmed by means of HPLC-MS. Four peaks can be identified: Secodion at 6.09 min, Seconol (all stereoisomers) at 4.32 min; Secodiol at 3.34 min; Peak 3 at 4.64 min.
  • Sales Secodion [%] peak area Seconol / (peak area Seconol + peak area Secodion + peak area Secodiol + peak area Peak 3) * 100 4 // fo / 7o / -De /? Y- rog'eA7ase
  • Alcohol dehydrogenases belong to the enzyme family of oxidoreductases. Alcohol dehydrogenases are characterized by the fact that they catalyze both the oxidation of alcohols to the corresponding carbonyl compounds and the corresponding reverse reaction. surfactant
  • Surfactants are amphiphilic molecules that can hold in aqueous systems difficultly soluble substances in homogeneous emulsion or suspension.
  • NADP nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • NADPH reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
  • NAD refers to nicotinamide adenine dinucleotide and the term “NADH” to reduced nicotinamide adenine dinucleotide.
  • the invention relates to a process for the enzymatic reduction of a secodione derivative of general formula 1
  • R is -H or a - (CVC 4 ) alkyl group
  • R a , R b and R c each independently represent - (C 1 -C 6 ) alkyl or phenyl;
  • R d and R e are independently -H, unsubstituted or monosubstituted phenyl
  • R ' is - (C 1 -C 4) alkyl, phenyl or - (CH 2) i -2 SiR a R b R c group;
  • X is O or S
  • Aryl is unsubstituted or substituted by -O-mono- or polysubstituted phenyl; and wherein the 17-.beta.-Seconol derivative of general formula 2 is preferably obtained with a product purity of> 90% and a stereoisomeric content of> 90%.
  • the 17-.beta.-Seconol derivative of general formula 2 is obtained with a stereoisomeric excess of> 95%, more preferably> 98%, and most preferably> 99%.
  • the 17-.beta.-Seconol derivative of general formula 2 is obtained with a product purity of> 90%, preferably -.95%, more preferably about 98%, and most preferably> 99%.
  • R in the general formulas 1 and 2 is in each case methyl or ethyl.
  • R 'in the general formulas 1 and 2 is in each case methyl.
  • R and R 'in the general formulas 1 and 2 are each methyl, i. the compound of general formula 1 is methyl secodione (methyl 3-methoxy-8,14-seco-gona-1,3,5 (10), 9 (11) -tetraene-14,17-dione).
  • R in the general formulas 1 and 2 is in each case ethyl and R 'is each methyl, i. the compound of general formula 1 is ethyl-sec-dione (ethyl-3-methoxy-8,14-seco-gona-1,3,5 (10), 9 (11) -tetraene-14,17-dione).
  • the alcohol dehydrogenase comprises an amino acid sequence having at least 60% or at least 65%, preferably at least 70% or at least 75%, more preferably at least 80% or at least 85%, even more preferably at least 90% or at least 92%, most preferably at least 93% or at least 94%, most preferably at least 95%, at least 96%, at least 97% or at least 98%, and in particular at least 99%, homology to at least one of the amino acid sequences selected from the group consisting of (Seq ID No: 2) , (Seq ID No: 4), (Seq ID No: 6), (Seq ID No: 8) and (Seq ID No: 10).
  • amino acid sequences are described, for example, by the DNA sequences (SEQ ID NO: 1), (SEQ ID NO: 3), (SEQ ID NO: 5), (SEQ ID NO: 7) or (SEQ ID NO:
  • the homology of a sequence is preferably calculated as identity using BLASTP 2.2.20+ (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schulffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman ( 1997)), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; Stephen F. Altschul, John C. Wootton, E. Michael Gertz, Richa Agarwala, Aleksander Morgulis, Alejandro A. Schffer, and Yi-Kuo Yu (2005) ".
  • the alcohol dehydrogenase has at least one of the amino acid sequences selected from the group consisting of Seq ID No 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 8 and SEQ ID NO 10 a homology of at least 60% or at least 65%, preferably at least 70% or at least 75%, more preferably at least 80% or at least 85%, even more preferably at least 90% or at least 92%, most preferably at least 93% or at least 94%, most preferably at least 95% , at least 96%, at least 97% or at least 98%, and in particular at least 99%.
  • the alcohol dehydrogenase has in its protein sequence one or more of the following sequence motifs:
  • the alcohol dehydrogenase has in its protein sequence one or more of the following sequence motifs:
  • the alcohol dehydrogenase has in its protein sequence one or more of the following sequence motifs:
  • the alcohol dehydrogenase has in its protein sequence one or more of the following sequence motifs:
  • the alcohol dehydrogenase has in its protein sequence one or more of the following sequence motifs:
  • One unit of alcohol dehydrogenase is defined as the reaction of 1 ⁇ 4-chloro-3-oxo-butyric acid ethyl ester (COBE) within 1 min at 30 ° C in 50 mM Tris / HCl buffer at pH 7.0; 10mM COBE, 2mM MgCl 2, 0.25mM NADH, 0.25mM NADPH.
  • COBE 4-chloro-3-oxo-butyric acid ethyl ester
  • the alcohol dehydrogenase after incubation for 48 h at 30 ° C in 50 mM Tris / HCl buffer at pH 7.0; 2mM MgCl 2 ; 0.1% DMSO; 0.01% Triton X-100; 3 g / L ethylsecodione; 1 mM NADH still a residual activity of> 50%, more preferably> 60%, particularly preferably 70%, very particularly preferably> 80% and particularly preferably 85%.
  • the alcohol dehydrogenase used is produced recombinantly with the aid of a microorganism.
  • suitable hosts for the recombinant production of the alcohol dehydrogenase are Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae or Aspergillus sp.
  • the alcohol dehydrogenase used is used in a yield of> 25,000 U / L culture, more preferably> 50,000 U / L culture, more preferably> 100,000 U / L culture, most preferably> 200,000 U / L culture and most preferably> 300,000 U / L culture produced.
  • the alcohol dehydrogenase used is used at a concentration of ⁇ 10,000 U / L reaction, more preferably ⁇ 5,000 U / L reaction, more preferably -5,000 U / L reaction, most preferably 2,000 U / L reaction, and particularly preferably ⁇ 1 .500 U / L reaction used.
  • the process according to the invention is preferably carried out in an aqueous organic two-phase system.
  • the process according to the invention is preferably carried out at a pH of from 5 to 10, more preferably from 6 to 8.
  • the reaction mixture comprises a buffer, more preferably a potassium phosphate, tris / HCl, glycine or triethanolamine buffer, in particular a tris / HCl buffer.
  • the buffer further contains magnesium ions and / or zinc ions.
  • the secodione derivative of the general formula 1 is in a concentration of> 1 g / L, more preferably> 9 g / L, more preferably> 25 g / L, very preferably> 35 g / L and particularly preferably about 40 g / L used.
  • the Secodion derivative of general formula 1 is used in a concentration of> 40 g / L and the alcohol dehydrogenase in a concentration of ⁇ 1500 U / L reaction and a conversion of> 97% achieved.
  • the secodione derivative of general formula 1 is reduced in the presence of a substoichiometric amount of an NADH or NADPH cofactor.
  • the NADH or NADPH cofactor is continuously regenerated by means of another enzymatic reaction.
  • the NADH or NADPH can be used as such or in its oxidized form, i. as NAD or NADP, and generated in situ using the further enzymatic reaction.
  • the NADH or NADPH cofactor is regenerated by oxidation of at least one alcohol, preferably a monofunctional, secondary (C 3 -C 8 ) -alcohol, in the presence of the dehydrogenase.
  • the NADH or NADPH cofactor is regenerated by oxidation of glucose to gluconolactone in the presence of a glucose dehydrogenase (GDH); i.e. the enzymatic reduction of the secodione derivative of general formula 1 is further carried out in the presence of a glucose dehydrogenase.
  • GDH glucose dehydrogenase
  • GDH activity is defined as the conversion of 1 ⁇ glucose within 1 min at 30 ° C in 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.4, 200 mM glucose, 1 mM NAD.
  • the GDH is at a concentration of
  • the cofactor regeneration is carried out by oxidation of formate in the presence of formate dehydrogenase, by oxidation of phosphite by phosphite dehydrogenase or by oxidation of glucose-6-phosphate by glucose-6-phosphate dehydrogenase.
  • the enzymatic reduction is carried out in the presence of at least one surfactant, more preferably in the presence of a nonionic surfactant.
  • Suitable nonionic surfactants are, for example
  • polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (trade name, among others Tween ® 20), polyoxyethylene (4) sorbitan monolaurate (trade name, among others Tween ® 21), polyoxyethylene (20) - sorbitan monopalmitate (trade name, among others (Tween ® 40), polyoxyethylene 20) sorbitan monostearate (trade name, among others Tween ® 60), polyoxyethylene (20) sorbitan tristearate (trade name, among others Tween ® 65), polyoxyethylene (20) sorbitan monooleate (trade name, among others Tween ® 80), polyoxyethylene (5) sorbitan monooleate (trade name, among others Tween ® 81) and polyoxyethylene (20) sorbitan trioleate (trade name, among others Tween ® 85); preferably fatty acid monoesters of the polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (trade name, among others
  • alkylene is an optionally unsaturated (C 6 -C 30 ) alkylene group, more preferably (C 8 -C 2 4) alkylene group, and most preferably (C 1 -C 6 ) alkylene group;
  • Polyoxyethylene fatty acid glycerides preferably with molecular weights between 200 and 4000 g / mol, such as macrogol glycerol caprylocaprate, macrogol glycerol laurate, macrogol glycerol cocoate, macrogol glycerol oleate, macrogol-20-glycerol monostearate, macrogol-6-glycerol caprylocaprate, macrogol glycerol oleate; Macrogolglycerol stearate, Macrogolglycerolhydroxystearat and Macrogolglycerolrizinoleat
  • Polyoxyethylene fatty acid esters derived from (C 8 -C 18 ) fatty acids for example macrogoleate, macrogol stearate, macrogol-15-hydroxystearate; preferably according to the general formula 8
  • Polyalkylene glycol ethers (fatty alcohol ethoxylates) of the general formula 9
  • R 3 is -O- (CH 2 -C (CH 3 ) H -O-) 0 H (10) where o is a number between 2 and 25 and R 3 is the alkyl or alkenyl radical of a (C 8 -C 18 ) Fatty acid, ie, (C 7 -C 17 ) alkyl or (C 7 -C 17 ) alkenyl; and
  • R 4 is (C 6 -C 15 ) -alkyl, preferably (C 7 -C 12 ) -alkyl, and more preferably (C 8 -C 9 ) -alkyl, and is preferably in the para-position relative to the polyoxyethylene radical; and p is a number between 3 and 25, more preferably between 6 and 20, and especially between 8 and 12; such as the 4- (tert-octyl) phenyl polyethoxylate Triton X-100 (Octoxinol 9); and
  • Polyoxyethylene esters of alpha tocopheryl succinate e.g. D-alpha tocopheryl PEG 1000 succinate (TPGS).
  • TPGS D-alpha tocopheryl PEG 1000 succinate
  • nonionic surfactants are selected from the group consisting of the polyalkylene glycol ethers; Alkyl glycosides, in particular polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters; Octylphenol ethoxylates and nonylphenol ethoxylates.
  • alkylphenol ethoxylates of the general formula II in which R 4 is (C 8 -C 9 ) -alkyl and is in the para position relative to the polyoxyethylene radical; and p is a number between 8 and 12.
  • Particularly preferred is Triton X-100.
  • the surfactant preferably has an HLB value (hydrophilic-lipophilic balance) of at least 8, particularly preferably at least 10, and in particular at least 12.
  • the surfactant has an HLB value in the range of 12 ⁇ 4, preferably 12 ⁇ 3.5, more preferably 12 ⁇ 3, even more preferably 12 ⁇ 2.5, most preferably 12 ⁇ 2, most preferably 12 ⁇ 1, 5, and in particular 12 ⁇ 1.
  • the surfactant has an HLB value in the range of 14 ⁇ 4, preferably 14 ⁇ 3.5, more preferably 14 ⁇ 3, even more preferably 14 ⁇ 2.5, most preferably 14 ⁇ 2, most preferably 14 ⁇ 1, 5, and especially 14 ⁇ 1.
  • the content of the surfactant in the reaction mixture is at least 0.0001% by volume, more preferably at least 0.0005% by volume, most preferably at least 0.001% by volume, and especially at least 0.005% by volume.
  • the content of the surfactant in the reaction mixture is at most 25% by volume, more preferably at most 20% by volume, most preferably at most 15% by volume, more preferably at most 10% by volume, most preferably at most 7.5% by volume, and most preferably at most 5% by volume.
  • the content of the surfactant in the reaction mixture is 0.0001 to 1% by volume, and more preferably 0.001 to 0.5% by volume.
  • the content of the surfactant in the reaction mixture is from 0.01 to 10% by volume, more preferably from 0.1 to 5% by volume, and especially from 0.1 to 1% by volume.
  • the content of the surfactant in the reaction mixture is 0.1 to 10% by volume, more preferably 1 to 10% by volume, and in particular 2.5 to 7.5% by volume.
  • the enzymatic reduction is carried out in the presence of at least one alcohol, preferably a monofunctional (C 2 -C 8 ) -alcohol, in particular a monofunctional, secondary (C 3 -C 8 ) -alcohol and / or dimethylsulfoxide as cosolvent ,
  • a monofunctional (C 2 -C 8 ) -alcohol in particular a monofunctional, secondary (C 3 -C 8 ) -alcohol and / or dimethylsulfoxide
  • this preferably also serves for the regeneration of the NADH or NADPH co-factor.
  • the content of the cosolvent in the reaction mixture is at most 90% by volume, more preferably at most 60% by volume, also preferably at most 30% by volume, further preferably at most 25% by volume, most preferably at most 20% by volume. , And in particular at most 15 vol .-%.
  • the enzymatic reduction is carried out in the presence of at least one alcohol.
  • Preferred alcohols are monofunctional (C 2 -C 8 ) -alcohols, more preferably monofunctional, secondary (C 3 -C 8 ) -alcohols are preferably selected from the group consisting of isopropanol (2-propanol), 2-butanol, 2-pentanol , 3-pentanol, 3-methyl-2-butanol, 2-hexanol, 3-hexanol, 3-methyl-2-pentanol, 4-methyl-2-pentanol, 2-methyl-3-pentanol, 3,3-dimethyl 2-butanol, 2-heptanol, 2-octanol and cyclohexanol.
  • Very particular preference is isopropanol.
  • the content of the alcohol in the reaction mixture is at most 30% by volume, more preferably at most 25% by volume, most preferably at most 20% by volume, and most preferably at most 15% by volume.
  • the content of the alcohol in the reaction mixture is at least 1% by volume, more preferably at least 2.5% by volume, most preferably at least 5% by volume, and most preferably at least 7.5% by volume.
  • the enzymatic reduction is carried out in the presence of dimethyl sulfoxide.
  • the content of dimethyl sulfoxide in the reaction mixture is preferably at most 20% by volume, more preferably at most 15% by volume, most preferably at most 10% by volume, most preferably at most 7.5% by volume and in particular at most 5% by volume. -%.
  • the inventive method Compared to that carried out with whole-cell catalysis with wild-type organisms of the genus Saccharomyces, from H. Heidepriem et al. Justus Liebigs Annalen der Chemie (1968), 712, 155-67 and H. Gibian et al. Tetrahedron Letters (1966) known methods, the inventive method has the advantage that a much smaller proportion of doubly reduced by-products is formed. Furthermore, the use of recombinant enzymes over wild type cells generally has the advantage that the reaction conditions are not linked to cell survival, higher substrate concentrations can be used, no cell boundaries need to be overcome, and higher product production rates are achieved.
  • the method according to the invention also has the advantage over the methods known from the prior art, both compared with those with whole cell catalysis and with those with recombinant enzymes, that the reduced product can be obtained with high stereoselectivity and purity and thus the process can be made more effective.
  • a further advantage of the method according to the invention is that the sparingly soluble substrate and the reduced product, in particular when using a combination of a cosolvent and a surfactant, can be homogeneously suspended in the aqueous reaction solution. Consequently, the concentrations of secondary alcohols used, such as isopropanol, 4-methyl-2-pentanol or 2-heptanol, can be greatly reduced or even completely dispensed with the use of a monofunctional secondary alcohol and the Acceptance of the reaction system can be increased by the ADH enzyme. Under such mild conditions, substrate concentrations of up to 40 g / l can be achieved in the aqueous system.
  • Another aspect of the invention relates to a process for the enzymatic reduction of a secodione derivative of general formula 1
  • R is -H or a - (C 1 -C 4 ) alkyl group
  • R is phenyl, unsubstituted, substituted one or more times by halogen - (CrCe ⁇ alkyl or -O-allyl;
  • R a , R b and R ° each independently represent - (CC 6 ) alkyl or phenyl;
  • R d and R e are independently -H, unsubstituted or monosubstituted phenyl;
  • R f is - (CC 4 ) alkyl, phenyl or -iCH 2 ) i-2SiR a R b R c ;
  • X is O or S
  • Aryl is unsubstituted or substituted by -OMe mono- or polysubstituted phenyl.
  • the 17-.beta.-Seconol derivative of general formula 2 is obtained with a product purity of> 90% and a stereoisomeric content of> 90% in this process.
  • Another aspect of the invention relates to a use of an alcohol dehydrogenase for the enzymatic reduction of a secodione derivative of general formula 1
  • each represents -H or a - (CC 4 ) alkyl group; is selected from -H, - (C 1 -C 6 ) -alkyl, - (C 1 -C 4) -alkenyl, -C ( O) R ",
  • R e is -CR d R e -aryl, -tetrahydropyranyl and - (CH 2 ) i- 2 -XR f ; wherein R 'is -phenyl; unsubstituted, one or more halogen-substituted - (C-
  • R a, R b and R c are each independently of one another - are (dC ß J-alkyl or phenyl;
  • R d and R e are independently -H, unsubstituted or monosubstituted phenyl
  • R is - (CC 4 ) alkyl, phenyl or - (CH 2 ) 1-2 SiR a R b R c ;
  • X is O or S
  • Aryl is unsubstituted or substituted by -O-mono- or polysubstituted phenyl; and more preferably R is methyl or ethyl and R 'is methyl.
  • a further aspect of the invention thus relates to a process for the preparation of an estrogen or a progestin comprising the process for the enzymatic reduction of a secodione derivative of general formula 1 with an alcohol dehydrogenase to a 17-.beta.-seconol derivative of general formula 2.
  • the enzyme variants were prepared by conventional methods and examined for their properties. The method of preparation was based on transformation of Escherichia coli strains with a DNA plasmid containing the information and regulation for the production of the enzyme. The coding sequence of the enzyme or of the enzyme variant was placed under the control of an inducible promoter. This was by addition of an inducer (usually isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)). The transformed E.
  • IPTG isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside
  • coli strain was then cultured in a conventional nutrient medium (eg LB (lysogeny broth) with 10 g / L NaCl, Lennox broth with 5 g / L NaCl, minimal medium M9) and, after induced with IPTG, and enzyme production was maximum, harvested by separation of the biomass by, for example, centrifugation. From the biomass, the enzyme could then be obtained after appropriate cell lysis. Centrifugation, precipitation, ultrafiltration and / or chromatographic methods were used.
  • a conventional nutrient medium eg LB (lysogeny broth) with 10 g / L NaCl, Lennox broth with 5 g / L NaCl, minimal medium M9
  • enzyme production was maximum, harvested by separation of the biomass by, for example, centrifugation. From the biomass, the enzyme could then be obtained after appropriate cell lysis. Centrifugation, precipitation, ultrafiltration and / or chromatographic methods were used.
  • Example 2 Whole cell transformation with wild-type organisms.
  • yeast strains Saccharomyces uvarum (DSMZ: 70412) and Saccharomyces carlsbergensis (DSMZ: 6580) were selected (see H. Gibian et al., Tetrahedron Letters (1966), 21 2321-30).
  • the yeast strains were cultured in a nutrient medium (2% glucose, 2% sucrose, 0.8% yeast extract, pH 6.5) at 26 ⁇ 2 ° C. After reaching an optical density (600 nm) of 8-12, the pH was adjusted to pH 6.5 and 3 g / L Ethylsecodion added. The cultures were then shaken for an additional 60 hours at 26 ⁇ 2 ° C.
  • the reaction was carried out under the following reaction conditions: 50 mM Tris / HCl buffer at pH 7.0; 2mM MgCl 2 ; 1% DMSO; 0.01% Triton-X-100; 3 g / l ethylsecodione; 1 mM NADH or NADPH; 200 mM glucose; GDH-03 and the corresponding ADH enzyme.
  • the reaction was incubated overnight at 30 ° C.
  • the enzymes were all prepared in E. coli according to Example 1 and used in the reaction.
  • the analysis was carried out first with achiral HPLC for the determination of product formation and the Product purity. The interesting candidates were further analyzed by chiral HPLC to determine the stereoisomeric excess.
  • the composition of the reaction mixture was: 50 mM Tris / HCl buffer at pH 7.0 or pH 9.0 for CmADH9; 2mM MgCl 2 ; 10% isopropanol; 3 g / l ethylsecodione; 1 mM NAD or NADP and the corresponding ADH enzyme.
  • the enzymes were prepared as described in Example 1.
  • the glucose / GDH system was used for cofactor regeneration.
  • cosolvent DMSO was used as cosolvent DMSO.
  • the composition of the reaction mixture was: 50 mM Tris / HCl buffer at pH 7.0 or pH 9.0 for CmADH9; 2mM MgCl 2 ; 1% DMSO; 0.01% Triton X-100; 3 g / l ethylsecodione; 1 mM NAD or NADP, 200 mM glucose, GDH-03 and the corresponding ADH enzyme.
  • the enzymes were described as in Example 1 produced.
  • the enzymes used in WO2008 / 068030 were investigated for comparison (see Example 4).
  • ethyl codedione in a total volume of 15 ml were reacted under the following conditions (40 g / l): 100 mM triethanolamine / HCl buffer pH 7.0; 2mM MgCl 2 ; 5% DMSO; 5% Triton-X-100; 1 mM NAD, 200 mM glucose, GDH-03 and ADH according to Seq ID NO 2.
  • the pH was kept constant at 7.0 by automatic titration of 5 M NaOH solution in a pH-stat instrument.
  • the method can also be performed using 0.25 mM NAD and titration with 1 M NaOH.
  • the reaction was stirred at 30 ° C for 30h to 39h.
  • the product was extracted with MTBE and analyzed for conversion, product purity and stereoisomeric excess. 97.4% of the ethylsecodione was converted to 17-.beta.-ethylseconol.
  • the product purity was> 99.9% and the stereoisomeric excess> 99.9%.
  • the reaction was carried out in an analogous manner with the substrate Methylsecodion.
  • the conditions were: 100 mM Tris / HCl buffer at pH 7.0; 2mM MgCl 2 ; 5% DMSO; 0.1% Triton-X-100; 3 g / L methyl secodione; 1 mM NAD, 200 mM glucose, GDH-03 and ADH Seq ID 2.
  • the conversion was 92.2% and the product purity 95%.
  • Example 8 Reaction of methyl codedione with ADH Seq ID 4
  • the reaction of methyl codedione with ADH Seq ID 4 was performed under the following conditions: 100 mM Tris / HCl buffer at pH 7.0; 2mM MgCl 2 ; 10% isopropanol; 0.1% Triton-X-100; 3 g / L methyl secodione; 1 mM NADP and ADH Seq ID 4. The conversion was 87.5% and the product purity 99%.

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Description

Verfahren zur Reduktion eines Secodion-Derivats
mit einer Alkohol-Dehydrogenase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1 mit einem Enzym aus der Klasse der Alkohol-Dehydrogenasen (ADHs).
Figure imgf000002_0001
(1 )
Die Secodion-Derivate der allgemeinen Formel 1 werden auch als Secosteroide oder 8,14- Seco-gonatetraen-14,17-dione bezeichnet Mit R = Ethyl und R' = Methyl bezeichnet man die Substanz als Ethylsecodion (Ethyl-3-methoxy-8,14-seco-gona-1 ,3, 5(10), 9(11 )-tetraen-14,17- dion) und mit R = Methyl und R' = Methyl als Methylsecodion (Methyl-3-methoxy-8,14-seco- gona-1 ,3,5(10),9(11 )-tetraen-14, 17-dion).
Die Secodione sind Schlüsselsubstanzen in der Synthese von enantiomerenreinen Steroiden aus der Klasse der Estrogene und Gestagene. Beispiele sind Levonorgestrel, Estradiol, 3-Keto-desogestrel und Deso estrel.
Figure imgf000002_0002
Levonorgestrel Estradiol
Figure imgf000002_0003
3-Keto-desogestrel Der Schlüsselschritt zur Herstellung der enantiomerenreinen Steroide aus den Secodionen der allgemeinen Formel 1 ist die selektive Reduktion nur einer Ketongruppe in den entsprechenden Alkohol in stereoselektiver Weise. Bei der stereoselektiven einfachen Reduktion eines Secodions der allgemeinen Formel 1 zu einem Seconol sind theoretisch 4 unterschiedliche räumliche Konfigurationen möglich, je nachdem ob die Hydroxylgruppe an der Position 14 oder 17 ebildet wird und ob die - oder ß-Konfiguration entsteht.
Figure imgf000003_0001
14-ß-Seconol 4 14-a-Seconol 5
Die Alkohol-Dehydrogenase-katalysierte Reduktion von Secodionen der allgemeinen Formel 1 kann neben den einfach reduzierten Seconolen der allgemeinen Formeln 2-5 auch doppelt reduzierte Secodiole der allgemeinen Formel 6 bilden, die für die weitere Umwandlung unerwünscht sind.
Figure imgf000003_0002
Secodiol 6
Von wirtschaftlich besonderem Interesse ist das 17-ß-Seconol der allgemeinen Formel 2, aus welchem durch weitere chemische Umwandlungen die oben genannten Steroide hergestellt werden können. Die Synthese von optisch aktivem Seconol wird im industriellen Maßstab durch mikrobielle Ganzzelltransformation mit Wildtyp-Organismen der Gattung Saccharomyces oder Pichia durchgeführt (H. Heidepriem et al. Justus Liebigs Annalen der Chemie (1968), 712, 155-67;
H. Gibian et al. Tetrahedron Letters (1966), 7, 2321-30; V. Bihari et al. Current Science (1984), 53, 124-6).
In DE 2120676 wird die fermentative Reduktion von ausgewählten Seco-Steroiden unter Verwendung der spezifischen Mikroorganismen Pichia farinosa NRRL Y-1 18 oder Pichia farinosa CBS 185 beschrieben.
US 3,549,499 beschreibt die Synthese von optisch aktiven Seco-Steroiden durch mikrobiologische Reduktion. Diese Verbindungen können zur Herstellung von physiologisch aktiven Steroiden verwendet werden.
US 3,481 ,974 betrifft einen mikrobiologischen Prozess zur stereospezifisch selektiven Reduktion einer der Carbonyl-Gruppen eines 13-Alkyl-3-alkoxy-8,14-secogona-
I , 3,5(10),9(1 1 )-tetraen-14,17-dions zur Herstellung des 17ß-Hydroxy-lsomers. Geeignete Mikroorganismen sind Mitglieder der Gattungen Humicola, Rhodotorula und Schizosaccharomyces.
In WO 2008/068030 wird ein Verfahren beschrieben, in dem die Transformation mit rekombinanten Enzymen aus der Klasse der Alkohol-Dehydrogenasen durchgeführt wird. Eine genaue Angabe über die Produktreinheit oder den Stereoisomerenüberschuss wird in WO 2008/068030 nicht gemacht.
Der Vorteil von rekombinanten Enzymen gegenüber Wildtyp-Zellen ist, dass die Reaktionsbedingungen nicht an ein Überleben der Zellen geknüpft sind. So können z.B. höhere Substratkonzentrationen benutzt werden. Zudem entfällt bei der Verwendung von freien Enzymen die Notwendigkeit der Diffusion, bzw. des Transports des Substrats in die Zelle. Ein weiterer Vorteil ist die einfachere Produktion des Biokatalysators in gleichbleibender Qualität. Bei der Verwendung von Mikroorganismen sowie mit den Enzymen aus WO2008068030 entsteht jedoch ein hoher Anteil an Nebenprodukten, insbesondere von doppelt reduziertem Secodiol und daraus abgeleiteten Folgeprodukten. Durch die Bildung dieser Nebenprodukte wird die Ausbeute an einfach reduziertem Seconol gesenkt und die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches wird erschwert. Der Prozess wird also insgesamt weniger wirtschaftlich. Ferner sind das Substrat und das Reaktionsprodukt in Wasser nur schwer löslich. Für eine effektive enzymatische Katalyse muss das Substrat im wässrigen System verfügbar gemacht werden. Dies wird in WO2008068030 durch die Verwendung von hohen Konzentrationen (40 - 67%) sekundärer Alkohole wie Isopropanol oder 4-Methyl-2-pentanol gelöst. Diese haben jedoch den Nachteil, dass viele Enzyme bei diesen Konzentrationen irreversibel inaktiviert werden oder der Alkohol nicht von dem ADH-Enzym akzeptiert wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die aus dem Stand der Technik bekannten enzymatischen Verfahren zur Reduktion von Secodion-Derivaten zu verbessern.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Patentansprüche gelöst.
Es wurde überraschend ein Verfahren gefunden, mit dem das 17-ß-Seconol der allgemeinen Formel 2 mit hoher Stereoselektivität und in hoher Reinheit erhalten werden kann.
Es wurden überraschend ADHs identifiziert, die eine besonders hohe Stereoselektivität bzgl. des 17-ß-Seconols der allgemeinen Formel 2 besitzen und dieses in hoher Produktreinheit bei verschiedenen Reaktionsbedingungen liefern.
Es wurde ferner überraschend gefunden, dass durch die Verwendung milder Tenside wie beispielsweise Triton-X-100 in Kombination mit geringen Konzentrationen an Cosolventien wie Isopropanol oder Dimethylsulfoxid (DMSO) ein Reaktionssystem erhalten wird, in dem das Substrat homogen verteilt und effektiv enzymatisch umgesetzt werden kann. Überraschenderweise bleibt unter diesen Reaktionsbedingungen die Aktivität vieler Enzyme erhalten.
Definitionen
Produktreinheit
Die Produktreinheit wird mittels HPLC mit einer reversed phase C18 Säule (Gemini 5 μ, 150 x 4.6 mm, Phenomenex) analysiert. Es wird isokratisch eluiert mit einem Gemisch aus Wasser und 65% Acetonitril. Die Detektion erfolgt mittels einer UV-Lampe bei 265 nm. Die Produktzuordnung erfolgt soweit verfügbar über Referenzverbindungen und wird mittels HPLC-MS bestätigt. Es können 3 Produktpeaks identifiziert werden: Seconol (alle Stereoisomere) bei 4,32 min; Secodiol bei 3,34 min; und Peak 3 bei 4,64 min. Für Peak 3 kann die gleiche molare Masse wie für überreduziertes Secodiol gemessen werden. Peak 3 kann somit durch eine Folgereaktion von Secodiol erklärt werden. Die Produktreinheit von einfach reduziertem Seconol wird demnach wie folgt berechnet:
Produktreinheit Seconol =
Peakfläche Seconol/(Summe der Peakflächen der 3 Produktpeaks) * 100 % Stereoisomerenüberschuss
Der Anteil des gewünschten 17-ß-Seconol 2 im Produkt wird durch Auswertung eines HPLC Chromatograms an einer chiralen HPLC-Phase ermittelt. Es wird eine Chiralpak AY-H (Chiral Technologies Europe) benutzt mit dem Eluenten n-Heptan/lsopropanol/Diethylamin = 90:10:0,1. Die Peaks der 4 einfach reduzierten Steroisomeren können mit dieser Analytik klar getrennt werden und eluieren in folgender Reihenfolge 17a-, 14ß-, 17ß- und 14a- Seconol. Der Stereoisomerenüberschuss wird aus den jeweiligen Peakflächen nach folgender Formel berechnet:
Stereoisomerenüberschuss = (17β - (17α + 14ß + 14α))/(17β + 17a + 14ß + 14a) * 100 % Umsatz
Der umgesetzte Anteil des Secodions zum gewünschten Seconol wird mittels HPLC analysiert mit einer reversed phase C18 Säule (Gemini 5 μ, 150 x 4.6 mm, Phenomenex). Es wird isokratisch eluiert mit einem Gemisch aus Wasser und 65% Acetonitril. Die Detektion erfolgt mittels einer UV-Lampe bei 265 nm. Die Produktzuordnung erfolgt soweit verfügbar über Referenzverbindungen und wird mittels HPLC-MS bestätigt. Es können 4 Peaks identifiziert werden: Secodion bei 6,09 min, Seconol (alle Stereoisomere) bei 4,32 min; Secodiol bei 3,34 min; Peak 3 bei 4,64 min. . Für Peak 3 kann die gleiche molare Masse wie für überreduziertes Secodiol gemessen werden. Peak 3 kann somit durch eine Folgereaktion von Secodiol erklärt werden. Der Umsatz von Secodion zum einfach reduzierten Seconol wird demnach wie folgt berechnet:
Umsatz Secodion [%] = Peakfläche Seconol / (Peakfläche Seconol + Peakfläche Secodion + Peakfläche Secodiol + Peakfläche Peak 3) * 100 4//fo/7o/-De/?y- rog'eA7ase
Alkohol-Dehydrogenasen gehören zur Enzymfamilie der Oxidoreduktasen. Alkohol- Dehydrogenasen zeichnen sich dadurch aus, dass sie sowohl die Oxidation von Alkoholen zu den entsprechenden Carbonylverbindungen als auch die korrespondierende Rückreaktion katalysieren. Tensid
Tenside sind amphiphile Moleküle, die in wässrigen Systemen schwer lösliche Substanzen in homogener Emulsion bzw. Suspension halten können.
Unter dem Begriff "NADP" wird Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat und unter dem Begriff "NADPH" reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat verstanden. Der Begriff "NAD" steht für Nicotinamid-adenin-dinucleotid und der Begriff "NADH" für reduziertes Nicotinamid-adenin-dinucleotid.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1
Figure imgf000007_0001
(1 ) mit einer Alkohol-Dehydrogen at der allgemeinen Formel 2
Figure imgf000007_0002
(2) wobei jeweils
R für -H oder eine -(CVC4)-Alkylgruppe steht;
R' ausgewählt ist aus -H, -(C C6)-Alkyl, -(C1-C4)-Alkenyl, -C(=0)R",
-CRdRe-Aryl, -Tetrahydropyranyl und -(CH2)i-2-X-Rf; worin
R" für -Phenyl; unsubstituiertes, ein oder mehrfach durch Halogen substituiertes -(C C6)-Alkyl oder für -O-Allyl steht; Ra, Rb und Rc jeweils unabhängig voneinander für -(CrC6)-Alkyl oder Phenyl stehen;
Rd und Re jeweils unabhängig voneinander für -H, für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach substituiertes -Phenyl stehen;
R' für -(C1-C4)-Alkyl, Phenyl oder -(CH2)i-2SiRaRbRc steht;
X für O oder S steht;
Aryl für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach oder mehrfach substituiertes Phenyl steht; und wobei das 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2 bevorzugt mit einer Produktreinheit von > 90% und einem Stereoisomeren-Anteil von > 90% erhalten wird.
Vorzugsweise wird das 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2 mit einem Stereoisomerenüberschuss von >95%, besonders bevorzugt >98%, und am bevorzugtesten >99% erhalten.
Vorzugsweise wird das 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2 mit einer Produktreinheit von >90%, vorzugsweise -.95%, besonders bevorzugt ä98%, und am bevorzugtesten >99% erhalten.
Vorzugsweise steht R in den allgemeinen Formeln 1 und 2 jeweils für Methyl oder Ethyl.
Vorzugsweise steht R' in den allgemeinen Formeln 1 und 2 jeweils für Methyl.
In einer bevorzugten Ausführungsform stehen R und R' in den allgemeinen Formeln 1 und 2 jeweils für Methyl, d.h. die Verbindung der allgemeinen Formel 1 ist Methylsecodion (Methyl- 3-methoxy-8,14-seco-gona-1 ,3,5(10), 9(1 1 )-tetraen-14,17-dion).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform steht R in den allgemeinen Formeln 1 und 2 jeweils für Ethyl und R' jeweils für Methyl, d.h. die Verbindung der allgemeinen Formel 1 ist Ethylsecodion (Ethyl-3-methoxy-8,14-seco-gona-1 ,3,5(10),9(1 1 )-tetraen-14,17-dion).
Erfindungsgemäß wird das Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1 mit einer Alkohol- Dehydrogenase reduziert. Vorzugsweise umfasst die Alkohol-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% oder mindestens 65%, bevorzugt mindestens 70% oder mindestens 75%, besonders bevorzugt mindestens 80% oder mindestens 85%, noch bevorzugter mindestens 90% oder mindestens 92%, ganz besonders bevorzugt mindestens 93% oder mindestens 94%, am bevorzugtesten mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97% oder mindestens 98%, und insbesondere mindestens 99%, Homologie zu wenigstens einer der Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (Seq ID No: 2), (Seq ID No: 4), (Seq ID No: 6), (Seq ID No: 8) und (Seq ID No: 10). Diese Aminosäuresequenzen werden zum Beispiel durch die DNA-Sequenzen (Seq ID No: 1 ), (Seq ID No: 3), (Seq ID No: 5), (Seq ID No: 7) bzw. (Seq ID No: 9) codiert.
Im Sinne der Erfindung wird die Homologie einer Sequenz bevorzugt berechnet als Identität mittels BLASTP 2.2.20+ (Stephen F. Altschul, Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997)), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Stephen F. Altschul, John C. Wootton, E. Michael Gertz, Richa Agarwala, Aleksandr Morgulis, Alejandro A. Schäffer, and Yi-Kuo Yu (2005) ".
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase zu wenigstens einer der Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq ID No 2, Seq ID No 4, Seq ID No 6, Seq ID No 8 und Seq ID No 10 eine Homologie von mindestens 60% oder mindestens 65%, bevorzugt mindestens 70% oder mindestens 75%, besonders bevorzugt mindestens 80% oder mindestens 85%, noch bevorzugter mindestens 90% oder mindestens 92%, ganz besonders bevorzugt mindestens 93% oder mindestens 94%, am bevorzugtesten mindestens 95%, mindestens 96%, mindestens 97% oder mindestens 98%, und insbesondere mindestens 99%, auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase in ihrer Proteinsequenz eines oder mehrere der folgenden Sequenzmotive auf:
TGSsSGIGL, wobei s = A, C, D, G, N, P, S, T oder V,
und/oder
SGIGL,
und/oder
NAG12, wobei 1 = I, L oder Y und 2 = L, G, M, oder A,
und/oder
GR11N, wobei 1 = I, L oder V,
und/oder KHG11G, wobei 1 = I, L oder V,
und/oder
CPGaV, wobei a = F, H, W oder Y.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase in ihrer Proteinsequenz eines oder mehrere der folgenden Sequenzmotive auf:
LVNNAG,
und/oder
PGsFRT, wobei s = A, C, D, G, N, P, S, T oder V.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase in ihrer Proteinsequenz eines oder mehrere der folgenden Sequenzmotive auf:
GAsGFIA, wobei s = A, C, D, G, N, P, S, T oder V,
und/oder
SKpFAE, wobei p = C, D, E, H, K, N, Q, R, S oder T,
und/oder
VFGPQ
und/oder
DVRDV.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase in ihrer Proteinsequenz eines oder mehrere der folgenden Sequenzmotive auf:
TGASSG1G, wobei 1 = I, L oder V,
und/oder
NNAG1M, wobei 1 = I, L oder V.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase in ihrer Proteinsequenz eines oder mehrere der folgenden Sequenzmotive auf:
L1NNAG1 , wobei 1 = I, L oder V, oder FVSNAG
und/oder
YsAsK, wobei s = A, C, D, G, N, P, S, T oder V.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase in ihrer Proteinsequenz eines oder mehrere der folgenden Sequenzmotive auf: L1 NNAG, wobei 1 = I, L oder V, oder FVSNAG.
Eine Unit Alkohol-Dehydrogenase wird definiert als Umsetzung von 1 μηιοΙ 4-Chloro-3-oxo- Buttersäure-Ethylester (COBE) innerhalb von 1 min bei 30 °C in 50 mM Tris/HCL Puffer bei pH 7,0; 10 mM COBE, 2 mM MgCI2, 0,25 mM NADH, 0,25 mM NADPH.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Alkohol-Dehydrogenase nach Inkubation über 48 h bei 30 °C in 50 mM Tris/HCL Puffer bei pH 7,0; 2 mM MgCI2; 0, 1 % DMSO; 0,01 % Triton-X-100; 3 g/L Ethylsecodion; 1 mM NADH noch eine Restaktivität von > 50 %, bevorzugter > 60 %, besonders bevorzugt 70 %, ganz besonders bevorzugt > 80 % und insbesondere bevorzugt £ 85 % auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die verwendete Alkoholdehydrogenase rekombinant mit Hilfe eines Mikroorganismus hergestellt. Beispiele für geeignete Wirte zur rekombinanten Herstellung der Alkohol-Dehydrogenase sind Escherichia coli, Pseudomonas sp., Bacillus sp., Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae oder Aspergillus sp.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die verwendete Alkoholdehydrogenase mit einer Ausbeute von > 25000 U / L Kultur, bevorzugter > 50000 U / L Kultur, besonders bevorzugt > 100000 U / L Kultur, ganz besonders bevorzugt > 200000 U / L Kultur und insbesondere bevorzugt > 300000 U / L Kultur hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die verwendete Alkoholdehydrogenase mit einer Konzentration von < 10.000 U / L Reaktion, bevorzugter < 5.000 U / L Reaktion, besonders bevorzugt -5 3.000 U / L Reaktion, ganz besonders bevorzugt ^ 2.000 U / L Reaktion und insbesondere bevorzugt < 1 .500 U / L Reaktion eingesetzt.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren in einem wässrigen organischen Zweiphasensystem durchgeführt.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren bei einem pH- Wert von 5 bis 10, besonders bevorzugt 6 bis 8 durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Reaktionsmischung einen Puffer, besonders bevorzugt einen Kaliumphosphat-, Tris/HCI-, Glycin- oder Triethanolamin-Puffer, insbesondere einen Tris/HCI-Puffer. Vorzugsweise enthält der Puffer ferner Magnesium- Ionen und/oder Zinkionen.
Vorzugsweise wird das Secodion-Derivat der allgemeinen Formel 1 in einer Konzentration von > 1 g/L, bevorzugter > 9 g/L, besonders bevorzugt > 25 g/L, ganz besonders bevorzugt > 35 g/L und insbesondere bevorzugt ä 40 g/L eingesetzt.
Vorzugsweise wird bei der Umsetzung des Secodion-Derivates zum gewünschten Seconol ein Umsatz von > 70 %, bevorzugter > 80 %, besonders bevorzugt ä 90 %, ganz besonders bevorzugt 2: 95 % und insbesondere bevorzugt 2. 97 % erreicht.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Secodion-Derivat der allgemeinen Formel 1 in einer Konzentration von > 40 g/L und die Alkoholdehydrogenase in einer Konzentration von < 1500 U / L Reaktion eingesetzt und ein Umsatz von > 97 % erreicht.
Vorzugsweise wird das Secodion-Derivat der allgemeinen Formel 1 in Gegenwart einer substöchiometrischen Menge eines NADH oder NADPH Co-Faktors reduziert.
Vorzugsweise wird der NADH oder NADPH Co-Faktor mit Hilfe einer weiteren enzymatischen Reaktion kontinuierlich regeneriert.
Das NADH bzw. NADPH kann als solches oder in seiner oxidierten Form, d.h. als NAD bzw. NADP, eingesetzt und mit Hilfe der weiteren enzymatischen Reaktion in situ generiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird der NADH oder NADPH Co-Faktor durch Oxidation wenigstens eines Alkohols, vorzugsweise eines monofunktionellen, sekundären (C3-C8)-Alkohols, in Gegenwart der Dehydrogenase regeneriert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird der NADH oder NADPH Co-Faktor durch Oxidation von Glucose zu Gluconolacton in Gegenwart einer Glucose-Dehydrogenase (GDH) regeneriert; d.h. die enzymatische Reduktion des Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1 wird ferner in Gegenwart einer Glucose-Dehydrogenase durchgeführt.
Eine Unit GDH-Aktivität wird definiert als die Umsetzung von 1 μιηοΙ Glucose innerhalb von 1 min bei 30 °C in 50 mM Kaliumphosphatpuffer pH 7,4, 200 mM Glucose, 1 mM NAD. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die GDH mit einer Konzentration von
< 5.000 U / L Reaktion, bevorzugter < 2.000 U / L Reaktion, besonders bevorzugt
< 1.000 U / L Reaktion, ganz besonders bevorzugt < 500 U / L Reaktion und insbesondere bevorzugt < 200 U / L Reaktion eingesetzt.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen wird die Cofaktor-Regenerierung durch Oxidation von Formiat in Gegenwart von Formiat-Dehydrogenase, durch Oxidation von Phosphit durch Phosphit-Dehydrogenase oder durch Oxidation von Glucose-6-Phosphat durch Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase durchgeführt.
Vorzugsweise wird die enzymatische Reduktion in Gegenwart wenigstens eines Tensids, besonders bevorzugt in Gegenwart eines nicht-ionischen Tensids durchgeführt.
Geeignete nicht-ionische Tenside sind beispielsweise
- Alkylglycoside, insbesondere Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureester (Polysorbate), wie z.B. Polyoxyethylen(20)sorbitanmonolaurat (Handelsname u.a. Tween® 20), Polyoxy- ethylen(4)sorbitanmonolaurat (Handelsname u.a. Tween® 21 ), Polyoxyethylen(20)- sorbitanmonopalmitat (Handelsname u.a. Tween® 40), Polyoxyethylen(20)sorbitan monostearat (Handelsname u.a. Tween® 60), Polyoxyethylen(20)sorbitantristearat (Handelsname u.a. Tween® 65), Polyoxyethylen(20)sorbitanmonooleat (Handelsname u.a. Tween® 80), Polyoxyethylen(5)sorbitan monooleat (Handelsname u.a. Tween® 81 ), und Polyoxyethylen(20)sorbitantrioleat (Handelsname u.a. Tween® 85); vorzugsweise Fettsäuremonoester des Polyoxyethylensorbitans gemäß der allgemeinen Formel 7
Figure imgf000013_0001
(7), worin (w+x+y+z) eine Zahl im Bereich von 15 bis 60, vorzugsweise 17 bis 40, und insbesondere von 19 bis 21 ist; und Alkylen eine gegebenenfalls ungesättigte (C6-C30)-Alkylengruppe, besonders bevorzugt (C8-C24)-Alkylengruppe, und am bevorzugtesten (Ci0-Ci6)-Alkylengruppe ist; - Polyoxyethylen-Fettsäureglyceride, vorzugsweise mit Molekulargewichten zwischen 200 und 4000 g/mol, wie z.B. Macrogolglycerolcaprylocaprat, Macrogolglycerollaurat, Macrogolglycerolococoat, Macrogolglycerollinoleat, Macrogol-20-glycerolmonostearat, Macrogol-6-glycerolcaprylocaprat, Macrogolglycerololeat; Macrogolglycerolstearat, Macrogolglycerolhydroxystearat und Macrogolglycerolrizinoleat;
- Polyoxyethyien-Fettsäureester, die sich von (C8-C18)-Fettsäuren ableiten, z.B. Macrogol- oleat, Macrogolstearat, Macrogol-15-hydroxystearat; vorzugsweise gemäß der allgemeinen Formel 8
R1-C(=0)-0-(CH2-CH2-0-)mH (8) wobei m eine Zahl zwischen 10 und 50 und R1 für den Alkyl- oder Alkenylrest (C8-C18)-Fettsäure, d.h. für (C7-C17)-Alkyl oder (C7-C17)-Alkenyl steht;
Polyalkylenglycolether (Fettalkoholethoxylate) der allgemeinen Formel 9
R2-0-(CH2-CH2-0-)nH (9) wobei n eine Zahl zwischen 2 und 25 bedeutet und R2 für den Alkyl- oder Alkenylrest einer (C8-C 8)-Fettsäure, d.h. für (C7-C 7)-Alkyl oder (C7-C17)-Alkenyl, steht; wie beispielsweise Polyoxyethylen(4)laurylether (Handelsname u.a. Brij® 30), Polyoxyethylen(23)laurylether (Handelsname u.a. Brij® 35), Polyoxyethylen(2)- cetylether (Handelsname u.a. Brij® 52), Polyoxyethylen(10)cetylether (Handelsname u.a. Brij® 56) und Polyoxyethylen(20)cetylether (Handelsname u.a. Brij® 38);
- Fettalkoholpropoxylate der allgemeinen Formel 10;
R3-0-(CH2-C(CH3)H-0-)0H (10) wobei o eine Zahl zwischen 2 und 25 bedeutet und R3 für den Alkyl- oder Alkenylrest einer (C8-C18)-Fettsäure, d.h. für (C7-C17)-Alkyl oder (C7-C17)-Alkenyl, steht; und
- Alkylphenolethoxylate der allgemeinen Formel 11 ;
Figure imgf000014_0001
(11 ) wobei R4 für (C6-C15)-Alkyl, vorzugsweise (C7-C12)-Alkyl, und besonders bevorzugt (C8-C9)-Alkyl steht, und sich vorzugsweise in para-Position relativ zum Polyoxyethylen-Rest befindet; und p eine Zahl zwischen 3 und 25, besonders bevorzugt zwischen 6 und 20, und insbesondere zwischen 8 und 12 bedeutet; wie beispielsweise das 4-(tert-Octyl)-phenyl-polyethoxylat Triton X-100 (Octoxinol 9); und
- Polyoxyethylenester des alpha-Tocopherylsuccinats, wie z.B. D-alpha-Tocopheryl-PEG- 1000-succinat (TPGS).
Besonders bevorzugte nicht-ionische Tenside sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den Polyalkylenglycolethern; Alkylglycosiden, insbesondere Polyoxyethylen-Sorbitan- fettsäureestern; Octylphenolethoxylaten und Nonylphenolethoxylaten.
Ganz besonders bevorzugt sind Alkylphenolethoxylate der allgemeinen Formel 11, worin R4 für (C8-C9)-Alkyl steht und sich in para-Position relativ zum Polyoxyethylen-Rest befindet; und p eine Zahl zwischen 8 und 12 bedeutet. Insbesondere bevorzugt ist Triton X-100.
Vorzugsweise weist das Tensid einen HLB-Wert (hydrophilic-lipophilic balance) von mindestens 8, besonders bevorzugt mindestens 10, und insbesondere mindestens 12 auf.
Beispiele für diese Art von Tensiden sind die vorstehend beschriebenen Tenside Triton X- 100, "Tween® 20", "Tween® 40", "Tween® 60", "Tween® 80", "Brij® 30", "Brij® 35", "Brij® 56" und "Brij® 58".
In einer bevorzugten Ausführungsform hat das Tensid einen HLB-Wert im Bereich von 12±4, vorzugsweise 12±3,5, besonders bevorzugt 12±3, noch bevorzugter 12±2,5, ganz besonders bevorzugt 12±2, am bevorzugtesten 12±1 ,5, und insbesondere 12±1.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform hat das Tensid einen HLB-Wert im Bereich von 14±4, vorzugsweise 14±3,5, besonders bevorzugt 14±3, noch bevorzugter 14±2,5, ganz besonders bevorzugt 14±2, am bevorzugtesten 14±1 ,5, und insbesondere 14±1.
Vorzugsweise beträgt der Gehalt des Tensids in der Reaktionsmischung mindestens 0,0001 Vol.-%, besonders bevorzugt mindestens 0,0005 Vol.-%, ganz besonders bevorzugt mindestens 0,001 Vol.-%, und insbesondere mindestens 0,005 Vol.-%.
Vorzugsweise beträgt der Gehalt des Tensids in der Reaktionsmischung höchstens 25 Vol.-%, besonders bevorzugt höchstens 20 Vol.-%, ganz besonders bevorzugt höchstens 15 Vol.-%, noch bevorzugter höchstens 10 Vol.-%, am bevorzugtesten höchstens 7,5 Vol.-%, und insbesondere höchstens 5 Vol.-%.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt des Tensids in der Reaktionsmischung 0,0001 bis 1 Vol.-%, und insbesondere bevorzugt 0,001 bis 0,5 Vol.-%.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt des Tensids in der Reaktionsmischung 0,01 bis 10 Vol.-%, besonders bevorzugt 0,1 bis 5 Vol.-%, und insbesondere 0,1 bis 1 Vol.-%.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Gehalt des Tensids in der Reaktionsmischung 0,1 bis 10 Vol.-%, besonders bevorzugt 1 bis 10 Vol.-%, und insbesondere 2,5 bis 7,5 Vol.-%.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die enzymatische Reduktion in Gegenwart wenigstens eines Alkohols, vorzugsweise eines monofunktionellen (C2-C8)-Alkohols, insbesondere eines monofunktionellen, sekundären (C3-C8)-Alkohols und/oder Dimethyl- sulfoxid als Cosolvens durchgeführt. Soweit ein Alkohol als Cosolvens vorhanden ist, dient dieser vorzugsweise auch zur Regenerierung des NADH oder NADPH Co-Faktors.
Vorzugsweise beträgt der Gehalt des Cosolvens in der Reaktionsmischung höchstens 90 Vol-%, besonders bevorzugt höchstens 60 Vol.-%, ebenfalls bevorzugt höchstens 30 Vol.-%, weiterhin bevorzugt höchstens 25 Vol.-%, am bevorzugtesten höchstens 20 Vol.-%, und insbesondere höchstens 15 Vol.-%.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die enzymatische Reduktion in Gegenwart wenigstens eines Alkohols durchgeführt.
Bevorzugte Alkohole sind monofunktionelle (C2-C8)-Alkohole, besonders bevorzugt sind monofunktionelle, sekundäre (C3-C8)-Alkohole vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Isopropanol (2-Propanol), 2-Butanol, 2-Pentanol, 3-Pentanol, 3-Methyl-2- butanol, 2-Hexanol, 3-Hexanol, 3-Methyl-2-pentanol, 4-Methyl-2-pentanol, 2-Methyl-3- pentanol, 3,3-Dimethyl-2-butanol, 2-Heptanol, 2-Octanol und Cyclohexanol. Ganz besonders bevorzugt ist Isopropanol. Vorzugsweise beträgt der Gehalt des Alkohols in der Reaktionsmischung höchstens 30 Vol-%, besonders bevorzugt höchstens 25 Vol.-%, am bevorzugtesten höchstens 20 Vol.-%, und insbesondere höchstens 15 Vol.-%.
Vorzugsweise beträgt der Gehalt des Alkohols in der Reaktionsmischung mindestens 1 Vol-%, besonders bevorzugt mindestens 2,5 Vol.-%, am bevorzugtesten mindestens 5 Vol-%, und insbesondere mindestens 7,5 Vol.-%.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird die enzymatische Reduktion in Gegenwart von Dimethylsulfoxid durchgeführt.
Vorzugsweise beträgt der Gehalt des Dimethylsulfoxids in der Reaktionsmischung höchstens 20 Vol-%, besonders bevorzugt höchstens 15 Vol.-%, ganz besonders bevorzugt höchstens 10 Vol.-%, am bevorzugtesten höchstens 7,5 Vol.-% und insbesondere höchstens 5 Vol.-%.
Verglichen mit dem mit Ganzzellkatalyse mit Wildtyp-Organismen der Gattung Saccharomyces durchgeführten, aus H. Heidepriem et al. Justus Liebigs Annalen der Chemie (1968), 712, 155-67 und H. Gibian et al. Tetrahedron Letters (1966) bekannten Verfahren, hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass ein weitaus geringerer Anteil an doppelt reduzierten Nebenprodukten entsteht. Ferner hat die Verwendung von rekombinanten Enzymen gegenüber Wildtyp-Zellen generell den Vorteil, dass die Reaktionsbedingungen nicht an ein Überleben der Zellen geknüpft sind, höhere Substratkonzentrationen benutzt werden können, keine Zellgrenzen überwunden werden müssen und höhere Produkt-Bildungsraten erzielt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat ferner gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, sowohl gegenüber denen mit Ganzzellkatalyse als auch gegenüber denen mit rekombinanten Enzymen, den Vorteil, dass das reduzierte Produkt mit hoher Stereoselektivität und Reinheit erhalten und somit der Prozess effektiver gestaltet werden kann.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, dass das schwerlösliche Substrat und das reduzierte Produkt, insbesondere bei Einsatz einer Kombination eines Cosolvens und eines Tensids homogen in der wässrigen Reaktionslösung suspendiert werden können. Folglich können die eingesetzte Konzentrationen an sekundären Alkoholen, wie z.B. Isopropanol, 4-Methyl-2-pentanol oder 2-Heptanol, stark reduziert oder sogar ganz auf den Einsatz eines monofunktionellen, sekundären Alkohols verzichtet werden und die Akzeptanz des Reaktionssystems durch das ADH-Enzym erhöht werden. Unter solchen milden Bedingungen können im wässrigen System Substratkonzentrationen von bis zu 40 g/l erzielt werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1
Figure imgf000018_0001
mit einer Alkohol-Dehydrogenase zu einem 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2
Figure imgf000018_0002
(2) wobei jeweils
R für -H oder eine -(CrC4)-Alkylgruppe steht;
R' ausgewählt ist aus -H, -(CrC6)-Alkyl, -(C1-C4)-Alkenyl, -C(=0)R", -SiRaRbRc, -CRdRe-Aryl, -Tetrahydropyranyl und -(CH2)i-2-X-Rf; worin
R" für -Phenyl; unsubstituiertes, ein oder mehrfach durch Halogen substituiertes -(CrCe^Alkyl oder für -O-Allyl steht;
Ra, Rb und R° jeweils unabhängig voneinander für -(C C6)-Alkyl oder Phenyi stehen;
Rd und Re jeweils unabhängig voneinander für -H, für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach substituiertes -Phenyl stehen; Rf für -(C C4)-Alkyl, Phenyl oder -iCH2)i-2SiRaRbRc steht;
X für O oder S steht; und
Aryl für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach oder mehrfach substituiertes Phenyl steht.
Vorzugsweise wird auch bei diesem Verfahren das 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2 mit einer Produktreinheit von > 90% und einem Stereoisomeren-Anteil von > 90% erhalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Verwendung einer Alkohol-Dehydrogenase zur enzymatischen Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1
Figure imgf000019_0001
zu einem 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2
Figure imgf000019_0002
(2 ) jeweils für -H oder eine -(C C4)-Alkylgruppe steht; ausgewählt ist aus -H, -(CrC6)-Alkyl, -(d-C )-Alkenyl, -C(=0)R",
-CRdRe-Aryl, -Tetrahydropyranyl und -(CH2)i-2-X-Rf; worin R' für -Phenyl; unsubstituiertes, ein oder mehrfach durch Halogen substituiertes -(C-|-C6)-Alkyl oder für -O-Allyl steht;
Ra, Rb und Rc jeweils unabhängig voneinander für -(d-CßJ-Alkyl oder Phenyl stehen;
Rd und Re jeweils unabhängig voneinander für -H, für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach substituiertes -Phenyl stehen;
R für -(C C4)-Alkyl, Phenyl oder -(CH2)1-2SiRaRbRc steht;
X für O oder S steht; und
Aryl für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach oder mehrfach substituiertes Phenyl steht; und besonders bevorzugt R für Methyl oder Ethyl und R' für Methyl steht.
Es wurde weiterhin überraschend gefunden, dass die Synthese von Estrogenen bzw. Gestagenen möglich ist durch ein Verfahren umfassend das Verfahren zur enzymatischen Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1 mit einer Alkohol- Dehydrogenase zu einem 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Herstellung eines Estrogens oder eines Gestagens umfassend das Verfahren zur enzymatischen Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1 mit einer Alkohol-Dehydrogenase zu einem 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur näheren Erläuterung der Erfindung, sind jedoch nicht einschränkend auszulegen.
Beispiele
Beispiel 1 - Herstellung von Enzymen
Die Enzymvarianten wurden mit Hilfe herkömmlicher Verfahren hergestellt und im Hinblick auf ihre Eigenschaften untersucht. Das Herstellverfahren beruhte auf Transformation von Escherichia coli Stämmen mit einem DNA Plasmid, welches die Information und Regulation für die Produktion des Enzyms beinhaltete. Die kodierende Sequenz des Enzyms oder der Enzymvariante wurde dabei unter die Kontrolle eines induzierbaren Promoters gestellt. Dadurch ließ sich durch Zugabe eines Induktors (i.d.R. Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG)) steuern. Der transformierte E. coli Stamm wurde dann in einem herkömmlichen Nährmedium (z.B. LB (lysogeny broth) mit 10 g/L NaCI; Lennox-Broth mit 5 g/L NaCI, Minimalmedium M9) kultiviert und, nachdem mit IPTG induziert wurde und die Enzymproduktion maximal war, durch Abtrennung der Biomasse durch z.B. Zentrifugation geerntet. Aus der Biomasse konnte dann das Enzym nach entsprechender Zelllyse gewonnen werden. Dabei wurden Zentrifugations-, Fällungs-, Ultrafiltrations- und/oder Chromatographieverfahren eingesetzt.
Beispiel 2 - Ganzzelltransformation mit Wildtyp-Orqanismen.
Es wurden zwei mikrobielle Referenzsysteme hinsichtlich der Umsetzung und Produktreinheit getestet. Hierfür wurden die Stämme Saccharomyces uvarum (DSMZ: 70412) und Saccharomyces carlsbergensis (DSMZ: 6580) ausgewählt (vgl. dazu H. Gibian et al. Tetrahedron Letters (1966), 21 2321 -30). Die Hefestämme wurden in einem Nährmedium (2 % Glucose, 2 % Saccharose, 0.8 % Hefe-Extrakt, pH 6.5) bei 26 ± 2 °C kultiviert. Nach Erreichen einer optischen Dichte (600 nm) von 8-12 wurde der pH-Wert auf pH 6.5 eingestellt und 3 g/L Ethylsecodion zugegeben. Anschließend wurden die Kulturen für weitere 60 h bei 26 ± 2 °C geschüttelt.
Nach Extraktion der Kulturen mit tert-Butylmethylether (MTBE) wurde eine achirale HPLC - Analytik zur Bestimmung der Produktreinheit durchgeführt.
Tabelle 1 :
Stamm Produktreinheit
[%]
Saccharomyces uvarum 91 ,1
Saccharomyces
carlsbergensis 62,1
Es zeigte sich, dass mit diesem Verfahren überreduzierte Nebenprodukte auftreten. Beispiel 3 - Screening der ADH-Kollektion
Für das erste Screening wurde die Reaktion unter folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt: 50 mM Tris/HCL Puffer bei pH 7,0; 2 mM MgCI2; 1 % DMSO; 0,01 % Triton-X- 100; 3 g/l Ethylsecodion; 1 mM NADH bzw. NADPH; 200 mM Glucose; GDH-03 und das entsprechende ADH-Enzym. Die Reaktion wurde über Nacht bei 30°C inkubiert. Die Enzyme wurden alle in E. coli gemäß Beispiel 1 hergestellt und in der Reaktion eingesetzt. Die Analyse erfolgte zuerst mit achiraler HPLC zur Bestimmung der Produktbildung und der Produktreinheit. Die interessanten Kandidaten wurden ferner zur Bestimmung des Stereoisomerenüberschusses mit chiraler HPLC analysiert.
Beispiel 4 - Umsetzung von Ethylsecodion mit Isopropanol Cofaktorreqenerierung
In diesem Ansatz wurde Isopropanol zur Cofaktorregenerierung eingesetzt. Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war: 50 mM Tris/HCL Puffer bei pH 7,0 bzw pH 9,0 für CmADH9; 2 mM MgCI2; 10% Isopropanol; 3 g/l Ethylsecodion; 1 mM NAD bzw NADP und das entsprechende ADH-Enzym. Die Enzyme wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Es wurden neben erfindungsgemäßen Enzymen zum Vergleich die in WO2008/068030 benutzten Enzyme mit den dort offenbarten Nukleotid-Sequenzen Seq ID No 6 (CaADH), Seq ID No 7 (RxADH), Seq ID No 8 (CmADH8), Seq ID No 9 (CmADH9) sowie Seq ID No 10 (CmADHIO) bzw. Protein-Sequenzen Seq ID No 1 (CaADH), Seq ID No 2 (RxADH), Seq ID No 3 (CmADH8), Seq ID No 4 (CmADH9) sowie Seq ID No 5 (CmADHIO) untersucht. Die RxADH konnte nicht löslich und somit nur inaktiv hergestellt werden. Es wurde dementsprechend keine Umsetzung von Secodion festgestellt. Es wurde die Umsetzung von Ethylsecodion untersucht.
Tabelle 2:
Enzym Produktreinheit Stereoisomeren-
[%] überschuss [%]
CaADH 98,6 85,4
RxADH - -
CmADH8 66 6,1
CmADH9 87,1 >99,9
CmADHIO 78,8 2,2
Seq ID 4 >99,8 >99,9
Es zeigte sich, dass die Umsetzung mit dem erfindungsgemäßen Enzym gemäß Seq ID 4 sowohl eine hohe Produktreinheit als auch einen hohen Stereoisomerenüberschuss liefert. Die untersuchten Enzyme aus WO2008/068030 hingegen zeichnen sich dadurch aus, dass sie in Bezug auf Produktreinheit und Stereoisomerenüberschuss deutlich unterlegen sind.
Beispiel 5 - Umsetzung von Ethylsecodion mit Glucose/GDH zur Cofaktorregenerierung
In diesem Ansatz wurde das Glucose/GDH System zur Cofaktorregenerierung benutzt. Als Cosolvenz wurde DMSO eingesetzt. Die Zusammensetzung der Reaktionsmischung war: 50 mM Tris/HCL Puffer bei pH 7,0 bzw pH 9,0 für CmADH9; 2 mM MgCI2; 1 % DMSO; 0,01 % Triton-X-100; 3 g/l Ethylsecodion; 1 mM NAD bzw NADP, 200 mM Glucose, GDH-03 und das entsprechende ADH-Enzym. Die Enzyme wurden wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt. Es wurden neben erfindungsgemäßen Enzymen zum Vergleich die in WO2008/068030 benutzten Enzyme untersucht (siehe Beispiel 4).
Tabelle 3:
Enzym Produktreinheit Stereoisomeren-
[%] überschuss [%]
CaADH 89,3 >99,9
RxADH
CmADH8 43,3 >99,8
CmADH9 82,3 >99,9
CmADHIO 20 29,7 (Hauptisomer 14b)
Seq ID 2 >99,4 >98,7
Seq ID 4 >99,9 95,0
Es zeigte sich, dass nur in den Umsetzungen mit Enzym gemäß Seq ID 2 oder Seq ID 4 sowohl eine hohe Produktreinheit als auch ein hoher Stereoisomerenüberschuss erreicht werden konnte. Die untersuchten Enzyme aus WO2008/068030 hingegen zeichnen sich auch in diesem Reaktionssystem dadurch aus, dass sie in Bezug auf Produktreinheit und Stereoisomerenüberschuss deutlich unterlegen sind.
Beispiel 6 - Präparative Umsetzung mit Seq ID 2
In einem präparativen Ansatz wurden 600 mg Ethylsecodion in einem Gesamtvolumen von 15 ml unter folgendem Bedingungen umgesetzt (40g/l): 100 mM Triethanolamin/HCL Puffer pH 7,0; 2 mM MgCI2; 5 % DMSO; 5 % Triton-X-100; 1 mM NAD, 200 mM Glucose, GDH-03 und ADH gemäß Seq ID NO 2. Während der Reaktion wurde der pH-Wert durch automatische Titration von 5 M NaOH-Lösung in einem pH-Stat-Gerät konstant auf 7,0 gehalten. Alternativ dazu kann das Verfahren auch unter Einsatz von 0,25 mM NAD und Titration mittels 1 M NaOH durchgeführt werden. Die Reaktion wurde 30h bis 39 h bei 30°C gerührt. Das Produkt wurde mit MTBE extrahiert und auf Umsatz, Produktreinheit und Stereoisomerenüberschuss analysiert. Es wurden 97,4% des Ethylsecodions zu 17-ß- Ethylseconol umgesetzt. Die Produktreinheit betrug >99,9% und der Stereoisomerenüberschuss >99,9%.
Beispiel 7 - Umsetzung von Methylsecodion mit ADH Seq ID 2
Die Reaktion wurde in analoger weise mit dem Substrat Methylsecodion durchgeführt. Die Bedingungen waren: 100 mM Tris/HCL Puffer bei pH 7,0; 2 mM MgCI2; 5 % DMSO; 0,1 % Triton-X-100; 3 g/l Methylsecodion; 1 mM NAD, 200 mM Glucose, GDH-03 und ADH Seq ID 2. Der Umsatz betrug 92,2% und die Produktreinheit 95%. Beispiel 8 - Umsetzung von Methylsecodion mit ADH Seq ID 4
Die Reaktion von Methylsecodion mit ADH Seq ID 4 wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: 100 mM Tris/HCL Puffer bei pH 7,0; 2 mM MgCI2; 10% Isopropanol; 0,1 % Triton-X-100; 3 g/l Methylsecodion; 1 mM NADP und ADH Seq ID 4. Der Umsatz betrug 87,5% und die Produktreinheit 99%.

Claims

Patentansprüche:
Ein Verfahren zur enzymatischen Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1
Figure imgf000025_0001
(1 ) mit einer Alkohol-Dehydrogenase zu einem 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2
Figure imgf000025_0002
(2) wobei jeweils
R für -H oder eine -(C C4)-Alkylgruppe steht; und
R' ausgewählt ist aus -H, -(C C6)-Alkyl, -(C1-C4)-Alkenyl, -C(=0)R",
-SiRaRbRc, -CRdRe-Aryl, -Tetrahydropyranyl und -(CH2)i-2-X-Rf; worin
R" für -Phenyl; unsubstituiertes, ein oder mehrfach durch Halogen substituiertes -(C C6)-Alkyl oder für -O-Allyl steht;
Ra, Rb und Rc jeweils unabhängig voneinander für -(C C6)-Alkyl oder Phenyl stehen;
Rd und Re jeweils unabhängig voneinander für -H, für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach substituiertes -Phenyl steht;
Rf für -(d-C^-Alkyl, Phenyl oder -(CH^^SiR^R0 steht; X für O oder S steht; und
Aryl für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach oder mehrfach substituiertes Phenyl steht.
2. Das Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das 17-ß-Seconol- Derivat der allgemeinen Formel 2 mit einem Stereoisomeren-Anteil von > 90% und einer Produktreinheit von > 90% erhalten wird.
3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass R für Methyl oder Ethyl steht.
4. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass R' für Methyl steht.
5. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkohol-Dehydrogenase eine Aminosäuresequenz mit mindestens 60% Homologie zu wenigstens einer der Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (Seq ID No: 2), (Seq ID No: 4), (Seq ID No: 6), (Seq ID No: 8) und (Seq ID No: 10) umfasst.
6. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Secodion-Derivat der allgemeinen Formel 1 in Gegenwart einer substöchio- metrischen Menge eines NADH oder NADPH Co-Faktors reduziert wird.
7. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Secodion-Derivat der allgemeinen Formel 1 in Gegenwart einer Glucose- Dehydrogenase reduziert wird.
8. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Reduktion in Gegenwart wenigstens eines Tensids durchgeführt wird.
9. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Reduktion in Gegenwart wenigstens eines nicht-ionischen Tensids, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyalkylen- glycolethern, Polyoxyethylen-Sorbitanfettsäureestern, Octylphenolethoxylaten und Nonylphenolethoxylaten durchgeführt wird.
10. Das Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt des Tensids in der Reaktionsmischung mindestens 0,001 Vol.-%, beträgt.
1 1. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die enzymatische Reduktion in Gegenwart eines sekundären (C3-C8)-Alkohols und/oder von Dimethylsulfoxid als Cosoivens durchgeführt wird.
12. Das Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Gehalt des Cosoivens in der Reaktionsmischung höchstens 20 Vol.-% beträgt.
Verwendung einer Alkohol-Dehydrogenase definiert wie in einem der Ansprüche 5 6 zur enzymatischen Reduktion eines Secodion-Derivats der allgemeinen Formel 1
Figure imgf000027_0001
(1 ) nem 17-ß-Seconol-Derivat der allgemeinen Formel 2
Figure imgf000027_0002
(2) wobei jeweils
R für -H oder eine -(d-C4)-Alkylgruppe steht; und
R' ausgewählt ist aus -H, -(d-Q -Alkyl, -(C C4)-Alkenyl, -C(=0)R",
-SiRaRbRc, -CRdRe-Aryl, -Tetrahydropyranyl und -(CHz^-X-R'; worin R" für -Phenyl; unsubstituiertes, ein oder mehrfach durch Halogen substituiertes -(Ci-C6)-Alkyl oder für -O-Allyl steht;
Ra, Rb und Rc jeweils unabhängig voneinander für -(C C6)-Alkyl oder Phenyl stehen;
Rd und Re jeweils unabhängig voneinander für -H, für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach substituiertes -Phenyl steht;
Rf für -(d-C4)-Alkyl, Phenyl oder -(CH2)i-2SiRaRbRc steht;
X für O oder S steht; und
Aryl für unsubstituiertes oder durch -OMe einfach oder mehrfach substituiertes Phenyl steht.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Estrogens oder eines Gestagens umfassend das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
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