WO2013118743A1 - アスコルビン酸の影響抑制方法 - Google Patents

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    • C12Q2523/10—Characterised by chemical treatment
    • C12Q2523/113—Denaturating agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for suppressing the influence of ascorbic acid in measurement of glycated hemoglobin, and a reagent for measuring glycated hemoglobin.
  • Glycated hemoglobin is a saccharified product in which glucose is bound to hemoglobin.
  • Hemoglobin has a tetramer structure consisting of ⁇ and ⁇ chains, but the glycated N-terminus of ⁇ chain is called hemoglobin A1c, and increases as the blood glucose level increases. Measured in clinical tests.
  • an immunoassay method using an antibody such as a chromatography method such as HPLC, electrophoresis, latex immunoagglutination, an enzyme that acts on glycated protein, and a glycated peptide and / or glycated amino acid.
  • An enzyme measurement method using an enzyme is known.
  • glycated hemoglobin As an enzyme measurement method for glycated hemoglobin, first, hemoglobin in a hemoglobin-containing sample is denatured with a denaturing agent, a proteolytic enzyme is allowed to act on the denatured hemoglobin, and then a glycated peptide oxidase is allowed to act on the produced glycated peptide. It is known to react the oxidized hydrogen peroxide with an oxidative coloring type chromogen in the presence of a peroxidase active substance such as peroxidase, lead to the dye, and measure the glycated hemoglobin from the absorbance of the dye produced (absorbance method). It has been.
  • An object of the present invention is to provide a method for suppressing the influence of ascorbic acid in measuring glycated hemoglobin in a glycated hemoglobin-containing sample, and a reagent for measuring glycated hemoglobin.
  • the present inventors diligently investigated this problem. After allowing a proteolytic enzyme to act on a glycated hemoglobin-containing sample, the produced glycated peptide was reacted with a glycated peptide oxidase, and the produced hydrogen peroxide was measured.
  • the reaction between the glycated peptide and the glycated peptide oxidase is performed in the presence of a halogen oxide and a specific 5-membered ring heterocyclic compound containing a nitrogen atom and a sulfur atom.
  • the present invention relates to the following [1] to [7].
  • a method for measuring glycated hemoglobin in a sample by allowing a proteolytic enzyme to act on a glycated hemoglobin-containing sample, reacting the produced glycated peptide with a glycated peptide oxidase, and measuring the produced hydrogen peroxide.
  • the reaction between the glycated peptide and the glycated peptide oxidase is carried out by reacting the halogen oxide with the general formula (I)
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl
  • R 2 represents substituted or unsubstituted alkyl, and --- represents a single bond or a double bond
  • a substance selected from the group consisting of substances A method for suppressing the influence of ascorbic acid in measuring glycated hemoglobin in a sample.
  • the halogen oxide is a halogen oxide selected from the group consisting of iodic acid or a salt thereof and bromic acid or a salt thereof.
  • the glycated hemoglobin is hemoglobin A1c.
  • R 1 represents substituted or unsubstituted alkyl
  • R 2 represents substituted or unsubstituted alkyl, ---- represents a single bond or a double bond
  • a hydrogen peroxide measuring reagent A reagent for measuring glycated hemoglobin in a sample.
  • the halogen oxide is a halogen oxide selected from the group consisting of iodic acid or a salt thereof and bromic acid or a salt thereof.
  • the present invention provides a method for suppressing the influence of ascorbic acid in the measurement of glycated hemoglobin and a reagent for measuring glycated hemoglobin.
  • the method for suppressing the influence of ascorbic acid in the measurement of glycated hemoglobin in a glycated hemoglobin-containing sample works by applying a proteolytic enzyme to the glycated hemoglobin-containing sample.
  • the reaction between the glycated peptide and glycated peptide oxidase is performed.
  • a substance selected from the group consisting of [hereinafter referred to as compound (II)] In the presence of.
  • the halogen oxide and a substance selected from the group consisting of compound (I) and compound (II) may coexist in the reaction between the glycated hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme.
  • the glycated hemoglobin-containing sample in the measurement method of the present invention is not particularly limited as long as it contains glycated hemoglobin and hemoglobin and enables the method for suppressing the influence of ascorbic acid of the present invention.
  • whole blood, blood cells, blood cells examples include samples in which plasma is mixed, samples obtained by hemolyzing these samples, and the like.
  • the hemolysis treatment is not particularly limited as long as it is a treatment that hemolyzes whole blood, blood cells, and a sample in which blood cells are mixed with plasma, and examples thereof include physical methods, chemical methods, and biological methods.
  • Examples of the physical method include a method using a hypotonic solution such as distilled water and a method using ultrasonic waves.
  • the chemical method include a method using an organic solvent such as methanol, ethanol, and acetone, and a method using a polyoxyethylene surfactant.
  • biological methods include a method using an antibody or complement.
  • the glycated hemoglobin in the present invention is produced by binding sugar such as glucose to hemoglobin, and examples thereof include hemoglobin A1a, hemoglobin A1b, hemoglobin A1c, and hemoglobin A1c is preferable.
  • the halogen oxide in the present invention is not particularly limited as long as it is a halogen oxide that enables the method for suppressing the influence of ascorbic acid of the present invention.
  • iodine acid or a salt thereof, bromic acid or a salt thereof, periodate examples thereof include acid or a salt thereof, and iodic acid or a salt thereof, bromic acid or a salt thereof is preferable.
  • the salt include lithium salt, sodium salt, potassium salt, ammonium salt, calcium salt, magnesium salt and the like.
  • halogen oxides include iodic acid, sodium iodate, potassium iodate, bromic acid, sodium bromate, potassium bromate, periodic acid, sodium periodate, potassium periodate, etc. Can be mentioned.
  • the concentration of the halogen oxide in the reaction solution is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention, but usually 0.005 to 20 mmol / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • R 1 in the compound (I) in the present invention represents substituted or unsubstituted alkyl.
  • alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (Cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl , Isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like.
  • Examples of the substituent in the substituted alkyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • products of the compound (I) include, for example, 2-octyl-4-isothiazolin-3-one (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., Chemiclear), 2-methyl-4-isothiazolin-3-one (Sigma-Aldrich) Etc.).
  • R 2 in the compound (II) in the present invention represents substituted or unsubstituted alkyl.
  • alkyl in the substituted or unsubstituted alkyl include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (Cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl , Isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like.
  • Examples of the substituent in the substituted alkyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • Examples of the halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • Specific examples (products) of compound (II) include, for example, 2-methylthiazoline (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2-methylthiazole (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2-ethylthiazole (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2-propyl Examples include thiazole (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) 2-isobutylthiazole (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and the like.
  • the concentration of compound (I) and compound (II) in the reaction solution is not particularly limited as long as it is a concentration that enables the method for measuring glycated hemoglobin of the present invention. However, it is usually 0.005 to 20 mmol / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • the reaction for producing a glycated peptide by allowing a proteolytic enzyme to act on a glycated hemoglobin-containing sample can be performed under any conditions as long as the glycated peptide can be produced.
  • the reaction that is, the reaction between the glycated hemoglobin and the proteolytic enzyme in the glycated hemoglobin-containing sample is preferably performed in an aqueous medium. Examples of the aqueous medium include an aqueous medium described later.
  • the reaction can also be performed in the presence of a denaturing agent for glycated hemoglobin in the glycated hemoglobin-containing sample.
  • the denaturing agent allows glycated hemoglobin to react with a proteolytic enzyme
  • the reaction between the glycated hemoglobin and the proteolytic enzyme is preferably performed in the presence of the denaturing agent.
  • the denaturing agent is not particularly limited as long as it is a denaturing agent capable of allowing glycated hemoglobin to react with a proteolytic enzyme.
  • a cationic surfactant, an anionic surfactant, an amphoteric surfactant, Nonionic surfactants and the like can be mentioned.
  • cationic surfactant examples include quaternary ammonium salts and pyridinium salts.
  • quaternary ammonium salt having at least one linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms is preferable.
  • linear alkyl having 8 to 20 carbon atoms include octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl Etc.
  • quaternary ammonium salts include, for example, decyltrimethylammonium chloride, decyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride, dodecyltrimethylammonium bromide, tetradecyltrimethylammonium bromide (hereinafter referred to as C14TMA), hexadecyl Examples include trimethylammonium chloride, hexadecyltrimethylammonium bromide, didecyldimethylammonium chloride, didecyldimethylammonium bromide, didodecyldimethylammonium chloride, didodecyldimethylammonium bromide (all manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.).
  • Examples of pyridinium salts include N-alkylpyridinium salts and N-alkenylpyridinium salts.
  • Examples of the alkyl include straight chain alkyl having 1 to 20 carbon atoms and branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms examples include methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (Cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include isopropyl, isobutyl, isopentyl, isohexyl, isoheptyl, isooctyl, isononyl, isodecyl, isoundecyl, isododecyl, isotridecyl, isotetradecyl, isopentadecyl, isohexadecyl, isoheptadecyl, isooctadecyl , Isononadecyl, isoicosyl, octyldodecyl and the like.
  • alkenyl examples include alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include vinyl, propenyl, allyl, butenyl, pentenyl, hexenyl, heptenyl, octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, oleyl, nonadecenyl, Etc.
  • substituted alkyl can be used as alkyl
  • substituted alkenyl can also be used as alkenyl.
  • substituent in the substituted alkyl and the substituted alkenyl include a phenyl group, a hydroxyl group, a sulfo group, a cyano group, and a halogen atom.
  • halogen atom include a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • N-alkylpyridinium salts and N-alkenylpyridinium salts having substituents at the 2-6 positions on the pyridine ring can also be used.
  • substituent at the 2-6 position on the pyridine ring include linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms, branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms, and alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms include the aforementioned linear alkyl having 1 to 20 carbon atoms.
  • Examples of the branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms include the aforementioned branched alkyl having 3 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 2 to 20 carbon atoms include the above-mentioned linear alkenyl having 2 to 20 carbon atoms.
  • pyridinium salts include, for example, 1-dodecylpyridinium chloride (hereinafter referred to as C12py; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 1-cetylpyridinium chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 1-cetyl-4-methylpyridinium. Examples thereof include chloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) and N-octadecyl-4-stilbazole bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.).
  • anionic surfactant examples include sulfate ester salt, carboxylate salt, sulfonate salt, phosphate ester salt, sulfosuccinate salt, N-methyl taurine salt, N-alkanoyl-N-methyl taurine salt and the like.
  • amphoteric surfactants include tertiary amine oxides and alkylcarboxybetaines.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkylamine, polyoxyethylene alkenylamine, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkenyl ether, polyoxyethylene alkylphenyl ether, ethylenediaminetetrapolyoxyethylene, polyglycerin fatty acid.
  • examples include esters, and polyoxyethylene alkylamines and polyoxyethylene alkyl ethers are preferred.
  • alkyl in the polyoxyethylene alkylamine examples include alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms examples include octyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristyl), pentadecyl, hexadecyl (cetyl), heptadecyl, octadecyl (stearyl), nonadecyl, icosyl and the like. Can be mentioned.
  • alkenyl in polyoxyethylene alkenylamine examples include alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include octenyl, nonenyl, decenyl, undecenyl, dodecenyl, tetradecenyl, pentadecenyl, hexadecenyl, heptadecenyl, octadecenyl, oleyl, nonadecenyl, icocenyl and the like.
  • alkyl in the polyoxyethylene alkyl ether examples include alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkyl having 8 to 20 carbon atoms examples include the aforementioned alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl in the polyoxyethylene alkenyl ether examples include alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkenyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkenyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • alkyl in the polyoxyethylene alkylphenyl ether examples include alkyl having 8 to 20 carbon atoms. Examples of the alkyl having 8 to 20 carbon atoms include the aforementioned alkyl having 8 to 20 carbon atoms.
  • the reaction temperature in the reaction between the glycated hemoglobin in the glycated hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme is usually 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., the reaction time is usually 1 minute to 3 hours, 2.5 Minute to 1 hour is preferred.
  • the concentration of the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as the reaction between the glycated hemoglobin in the hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme proceeds, and is usually 50 to 25,000 kU / L, preferably 250 to 10,000. kU / L.
  • the proteolytic enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on glycated hemoglobin in a hemoglobin-containing sample and generates a glycated peptide from glycated hemoglobin.
  • serine protease chymotrypsin, subtilisin, etc.
  • cysteine protease papain, caspase
  • Etc. aspartic protease
  • pepsin, cathepsin D, etc. metalloprotease (thermolysin, etc.)
  • N-terminal threonine protease glutamic acid protease and the like.
  • commercially available proteolytic enzymes can also be used.
  • protease P “Amano” 3G examples include protease P “Amano” 3G, protease K “Amano” (above, Amano Enzyme), actinase AS, actinase E (above).
  • protease P “Amano” 3G examples include protease P “Amano” 3G, protease K “Amano” (above, Amano Enzyme), actinase AS, actinase E (above).
  • Kaken Pharma Co., Ltd. examples include thermolysin (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.), Sumiteam MP (manufactured by Shin Nippon Chemical Industry Co., Ltd.), etc.
  • the concentration of the denaturing agent in the reaction that causes the proteolytic enzyme to act is not particularly limited as long as the reaction between the glycated hemoglobin in the glycated hemoglobin-containing sample and the proteolytic enzyme proceeds, and is usually 0.0001 to 10%. Yes, 0.0005 to 5% is preferable.
  • a glycated peptide is produced by a reaction between glycated hemoglobin in a glycated hemoglobin-containing sample and a proteolytic enzyme.
  • the produced glycated peptide reacts with glycated peptide oxidase to produce hydrogen peroxide.
  • the reaction between the glycated peptide and the glycated peptide oxidase is preferably performed in an aqueous medium. Examples of the aqueous medium include an aqueous medium described later.
  • the reaction temperature in the reaction between the glycated peptide and the glycated peptide oxidase is usually 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C., and the reaction time is usually 1 minute to 3 hours, preferably 2.5 minutes to 1 hour. .
  • the concentration of glycated peptide oxidase is not particularly limited as long as the reaction between fructosyl hemoglobin and glycated peptide oxidase proceeds, and is usually 0.1 to 30 kU / L, preferably 0.2 to 15 kU / L. It is.
  • the glycated peptide oxidase is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on a glycated peptide to generate hydrogen peroxide.
  • glycated peptide oxidation derived from filamentous fungi, yeast, actinomycetes, bacteria, or archaea. An enzyme etc. are mentioned.
  • commercially available glycated peptide oxidase can also be used. Examples of commercially available products include FPOX-CE (manufactured by Kikkoman), FPOX-EE (manufactured by Kikkoman), FPOX-CET (manufactured by Kikkoman), and the like. Is mentioned.
  • Examples of the method for measuring the generated hydrogen peroxide include a method using an electrode, a method using a hydrogen peroxide measuring reagent, and the like, and a method using a hydrogen peroxide measuring reagent is preferable.
  • the reagent for measuring hydrogen peroxide is a reagent for converting hydrogen peroxide into a detectable substance.
  • Examples of the detectable substance include a dye, light (luminescence), fluorescence, and the like, and a dye is preferable.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and an oxidative coloring type chromogen.
  • examples of the oxidative coloring type chromogen include an oxidative coupling type chromogen and a leuco chromogen, and a leuco chromogen is preferred.
  • leuco chromogen examples include phenothiazine chromogen, triphenylmethane chromogen, diphenylamine chromogen, o-phenylenediamine, hydroxypropionic acid, diaminobenzidine, tetramethylbenzidine and the like, and phenothiazine.
  • a chromogen is preferred.
  • the phenothiazine chromogen examples include 10-N-carboxymethylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine (CCAP), 10-N-methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino).
  • -10H-phenothiazine MCDP
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • 10-N- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine sodium salt DA-67
  • triphenylmethane chromogen examples include N, N, N ′, N ′, N ′′, N ′′ -hexa (3-sulfopropyl) -4,4 ′, 4 ′′ -triaminotriphenyl And methane (TPM-PS).
  • diphenylamine chromogen examples include N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sodium salt (DA-64), 4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis And [3-bis (4-chlorophenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine (BCMA).
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and a chemiluminescent substance.
  • examples of the chemiluminescent substance include luminol, isoluminol, lucigenin, and acridinium ester.
  • examples of the reagent for measuring hydrogen peroxide include a reagent containing a peroxidase active substance such as peroxidase and a fluorescent substance.
  • examples of the fluorescent substance include 4-hydroxyphenylacetic acid, 3- (4-hydroxyphenyl) propionic acid, and coumarin.
  • the method for measuring glycated hemoglobin in a glycated hemoglobin-containing sample also includes a method of calculating the ratio of the glycated hemoglobin amount to the total hemoglobin amount in the glycated hemoglobin-containing sample.
  • the total hemoglobin amount can be determined by a known method, for example, the cyanmethemoglobin method, the oxyhemoglobin method, the SLS-hemoglobin method, or the like.
  • the total amount of hemoglobin is not only the glycated hemoglobin-containing sample itself, but also a sample obtained by adding a halogen oxide and a substance selected from the group consisting of compound (I) and compound (II) to a glycated hemoglobin-containing sample, A sample obtained by adding a halogen oxide, a substance selected from the group consisting of compound (I) and compound (II), and a proteolytic enzyme to a glycated hemoglobin-containing sample, the cyan methemoglobin method, oxyhemoglobin It can also be determined by applying the SLS-hemoglobin method.
  • the glycated hemoglobin-measuring reagent in a glycated hemoglobin-containing sample of the present invention comprises a proteolytic enzyme, glycated peptide oxidase, halogen oxide, compound (I) and compound (II).
  • the reagent for measuring glycated hemoglobin of the present invention is used in the method for suppressing the influence of ascorbic acid of the present invention.
  • proteolytic enzyme examples include the aforementioned proteolytic enzyme and saccharification, respectively.
  • Peptide oxidase, halogen oxide, compound (I), compound (II), hydrogen peroxide measuring reagent and the like can be mentioned.
  • the concentration of the proteolytic enzyme in the measurement reagent of the present invention is usually 50 to 25,000 kU / L, preferably 250 to 10,000 kU / L.
  • the concentration of the glycated peptide oxidase in the measurement reagent of the present invention is usually 0.1 to 30 kU / L, preferably 0.2 to 15 kU / L.
  • the concentration of the halogen oxide in the measurement reagent of the present invention is usually 0.005 to 20 mmol / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • the concentration of compound (I) in the measurement reagent of the present invention is usually 0.005 to 20 mmol / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • the concentration of compound (II) in the measurement reagent of the present invention is usually 0.005 to 20 mmol / L, preferably 0.01 to 10 mmol / L.
  • the measurement reagent of the present invention may contain an aqueous medium, a denaturing agent, a stabilizing agent, a preservative, a salt, an interfering substance influence inhibitor, a solubilizing agent, an organic solvent, and the like, if necessary.
  • the aqueous medium include deionized water, distilled water, and a buffer solution, and a buffer solution is preferable.
  • the pH of the aqueous medium is, for example, pH 4-10.
  • a buffer solution is used as the aqueous medium, it is desirable to use a buffering agent corresponding to the set pH.
  • the buffer used in the buffer include tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, phosphate buffer, borate buffer, Good's buffer, and the like.
  • Good buffering agents include, for example, 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES), bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) Piperazine-N, N′-bis (2-ethanesulfonic acid) (PIPES), N- (2-acetamido) -2-aminoethanesulfonic acid (ACES), 3-morpholino-2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) ), N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid (BES), 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS), N- [tris (hydroxymethyl) methyl] -2-aminoethanesulfone Acid (TES), 2- [4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPE
  • the concentration of the buffer is usually 0.001 to 2.0 mol / L, preferably 0.005 to 1.0 mol / L.
  • the concentration of the denaturing agent in the measurement reagent of the present invention is usually 0.0001 to 10%, preferably 0.0005 to 5%.
  • Examples of the stabilizer include ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), sucrose, calcium chloride, calcium acetate, calcium nitrate, potassium ferrocyanide, bovine serum albumin (BSA), and the like.
  • Examples of the preservative include sodium azide and antibiotics.
  • Examples of the salts include sodium chloride, sodium nitrate, sodium sulfate, sodium carbonate, potassium chloride, potassium nitrate, potassium sulfate, potassium carbonate and the like.
  • Examples of the inhibitor of the influence of interfering substances include pyruvic acid for suppressing the influence of peroxide.
  • Examples of the solubilizer include nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene alkylphenyl ether.
  • organic solvent examples include dimethylformamide (DMF), dimethyl sulfoxide (DMSO), dioxane, acetone, methanol, ethanol and the like for assisting dissolution of the leuco chromogen in an aqueous medium.
  • the glycated hemoglobin measurement reagent of the present invention may take the form of a kit.
  • the glycated hemoglobin measurement kit include a two-reagent kit, a three-reagent kit, and the like.
  • the glycated hemoglobin measurement kit is a two-reagent kit, a substance selected from the group consisting of proteolytic enzyme, glycated peptide oxidase, halogen oxide, compound (I) and compound (II), and hydrogen peroxide measurement
  • the arrangement of each component of the reagent can be appropriately selected by those skilled in the art from the viewpoint of the storage stability of the kit, but a kit containing a proteolytic enzyme and a glycated peptide oxidase in separate reagents is preferred.
  • Bis-Tris (manufactured by Dojindo Laboratories), MOPS (manufactured by Dojindo Laboratories), calcium chloride dihydrate (manufactured by Kanto Chemical), sodium pyruvate (manufactured by Kanto Chemical), DMSO (Nacalai Tesque) DA-67 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Triton X-405 (nonionic surfactant: Sigma Aldrich), 1-dodecylpyridinium chloride (C12py) (modifier: manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) , Tetradecyltrimethylammonium bromide (C14TMA) (modifier: manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), potassium iodate (halogen oxide; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), potassium bromate (halogen oxide; manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 2-octyl -4-isothiazolin-3-one [
  • HbA1c measurement kits (kits 1 to 3; kits a to e) shown in Table 1 comprising the following first reagent and second reagent were prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C12py 1.2g / L Potassium iodate Compound (I) or Compound (II) Calcium chloride dihydrate 16mmol / L Sodium pyruvate 2g / L Actinase E 340 kU / L DMSO 0.2mL / L DA-67 12.6 ⁇ mol / L
  • Second reagent MOPS (pH 7.0) 50 mmol / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 80 kU / L FPOX-CET 2.5 kU / L
  • HbA1c measurement kits (kits 4 to 6; kits f to j) shown in Table 2 consisting of the following first reagent and second reagent were prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C14TMA 0.6g / L Potassium iodate Compound (I) or Compound (II) Calcium chloride dihydrate 16mmol / L Sodium pyruvate 2g / L Actinase E 340 kU / L DMSO 0.2mL / L DA-67 12.6 ⁇ mol / L
  • Second reagent MOPS (pH 7.0) 50 mmol / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 80 kU / L FPOX-CET 2.5 kU / L
  • HbA1c measurement kits (kits 7 to 8; kits k and g to j) shown in Table 3 comprising the following first reagent and second reagent were prepared.
  • First reagent Bis-Tris (pH 6.8) 10 mmol / L C14TMA 0.6g / L Potassium bromate Compound (I) or Compound (II) Calcium chloride dihydrate 16mmol / L Sodium pyruvate 2g / L Actinase E 340 kU / L DMSO 0.2mL / L DA-67 12.6 ⁇ mol / L
  • Second reagent MOPS (pH 7.0) 50 mmol / L Triton X-405 7.1g / L Peroxidase 80 kU / L FPOX-CET 2.5 kU / L
  • Example 1 Using the kit 1 of Example 1 as the HbA1c measurement kit and the whole blood derived from 16 subjects suspected of having diabetes as a sample, the total hemoglobin concentration (the amount) of HbA1c concentration (amount) in each sample by the following procedure. The ratio [HbA1c (%)] to the amount) was determined.
  • Nescoat hemokit-N cyanmethemoglobin method
  • Alfresa Pharma cyanmethemoglobin method
  • JDS Japan Diabetes Society
  • each blood cell HbA1c (%) in the fraction was determined by an immunoassay using a determiner L HbA1c (manufactured by Kyowa Medex) according to the method described in the package insert of the determiner L HbA1c.
  • kits 1 of example 1 instead of kit 1 of example 1, kits 2 to 3, kit a to e of example 1, kits 4 to 6 of example 2, kits f to j, kits 7 to 8 of example 3, Using each kit of the kit k, the correlation coefficient between the measurement using the determiner L HbA1c (manufactured by Kyowa Medex) was determined. The results are shown in Table 4.
  • the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) in each sample was determined by the following procedure. Were determined.
  • Nescoat hemokit-N cyanmethemoglobin method
  • a kit for measuring total hemoglobin of the blood cell fraction obtained by centrifuging human blood (Alfresa Pharma) And the hemoglobin concentration was diluted with purified water and hemolyzed to prepare a hemoglobin solution having a hemoglobin concentration of 6.4 mg / mL.
  • Ascorbic acid is added to the prepared hemoglobin solution, and ascorbic acid concentrations of 0.5 mg / dL, 1 mg / dL, 2 mg / dL, and 5 mg / dL are prepared, and the effects of ascorbic acid are confirmed.
  • a sample was prepared.
  • the prepared hemoglobin solution itself was used as a sample for confirming the effect of ascorbic acid having an ascorbic acid concentration of 0 mg / mL.
  • Ascorbic acid concentration is 0.5 mg / dL, 1 mg / dL, 2 mg / dL when HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) in the sample for confirming the effect of ascorbic acid with ascorbic acid concentration of 0 mg / dL is 100
  • the relative value of the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) in each sample of the sample for confirming the influence of ascorbic acid was determined.
  • kits 2 to 3 and the kits a to e of Example 1 were used in the same procedure, and the relative value of the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) in each sample was measured. It was determined. The determined relative values are shown in Table 5. The closer the relative value is to 100, the less likely it is to be affected by ascorbic acid.
  • kits 1 to 3 containing potassium iodate and compound (I) or compound (II) at least potassium iodate and compound (I) or compound (II) It can be seen that the relative value of the HbA1c concentration is close to 100 and less susceptible to ascorbic acid than kits that do not contain one (kits a to e).
  • Example 6 In the same manner as in Example 5 except that the kits 4 to 6 and kits f to j of Example 2 were used instead of the kit 1 of Example 1, each sample of the sample for confirming the effect of ascorbic acid was used. The relative value of HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) was determined. Table 6 shows the relative values of the determined HbA1c concentration ( ⁇ mol / L).
  • kits 4 to 6 containing potassium iodate and compound (I) or compound (II) any of potassium iodate and compound (I) or compound (II) It can be seen that the relative value of the HbA1c concentration is close to 100 and less susceptible to ascorbic acid as compared to the kit not containing either or both (kits f to j).
  • Example 7 Each sample for confirming the effect of ascorbic acid was obtained in the same manner as in Example 5 except that the kits 7 to 8 and kits k and g to j of Example 3 were used instead of the kit 1 of Example 1.
  • the relative value of the HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) in the sample was determined.
  • the relative values of the determined HbA1c concentration ( ⁇ mol / L) are shown in Table 7.
  • kits 7 to 8 containing potassium bromate and compound (I) or compound (II) any one of potassium bromate and compound (I) or compound (II) It can be seen that the relative value of the HbA1c concentration is close to 100 and less susceptible to ascorbic acid compared to a kit not containing either or both (kits k, g to j).
  • the present invention provides a method for suppressing the influence of ascorbic acid in the measurement of glycated hemoglobin in a glycated hemoglobin-containing sample and a reagent for measuring glycated hemoglobin in a glycated hemoglobin-containing sample.
  • the method for suppressing the influence of ascorbic acid and the reagent for measuring glycated hemoglobin of the present invention are useful for diagnosis of diabetes and the like.

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Description

アスコルビン酸の影響抑制方法
　本発明は、糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法、及び、糖化ヘモグロビンの測定用試薬に関する。
　糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコースが結合した糖化物である。ヘモグロビンはα鎖、β鎖からなる四量体の構造を取っているが、β鎖のＮ末端が糖化したものはヘモグロビンＡ１ｃと呼ばれ、血糖値が高い程、増加することから、糖尿病マーカーとして、臨床検査において測定されている。
　糖化ヘモグロビンの測定方法としては、ＨＰＬＣ法等のクロマトグラフィ法、電気泳動法、ラテックス免疫凝集法など抗体を利用する免疫測定法、糖化タンパク質に作用する酵素と、糖化ペプチド及び／又は糖化アミノ酸に作用する酵素とを用いる酵素測定法等が知られている。
　糖化ヘモグロビンの酵素測定法としては、先ず、ヘモグロビン含有試料中のヘモグロビンを変性剤により変性させ、変性したヘモグロビンにタンパク質分解酵素を作用させ、次いで生成した糖化ペプチドに糖化ペプチド酸化酵素を作用させ、生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質の存在下に、酸化発色型色原体と反応させて色素に導き、生成した色素の吸光度から糖化ヘモグロビンを測定する方法（吸光度法）等が知られている。
　しかしながら、この吸光度法による糖化ヘモグロビンの測定においては、試料中に存在するアスコルビン酸の影響が問題となる。従来、過酸化水素測定系を用いた試料中の測定対象物の測定において、アスコルビン酸の影響が問題となっており、アスコルビン酸の影響抑制という課題に対して、例えばアスコルビン酸酸化酵素を用いる方法（特許文献１参照）、鉄、コバルト、セレン、銅、水銀、ニッケル等の有機錯体を用いる方法（特許文献２～４参照）、ヨウ素酸塩を用いる方法（特許文献５参照報）、ヨウ素酸塩と共に、ヨウ素酸塩の補助剤として、リン酸化合物、ほう酸化合物、クエン酸化合物、リンゴ酸化合物、酒石酸化合物、及びシュウ酸化合物から選ばれた少なくとも１種の化合物を用いる方法（特許文献６）等が知られているが、糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制効果は十分なものではなかった。
特公昭５６－３９１９８号公報 特公平１－４１２２３号公報 特公昭６３－６７１３９号公報 特公昭６３－３９８７１号公報 特開昭５６－１５１３５８号公報 特開平８－２７１５０４号公報
　本発明の目的は、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法、及び、糖化ヘモグロビン測定用試薬を提供することにある。
　本発明者らは本課題について鋭意検討したところ、糖化ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させた後、生成した糖化ペプチドを糖化ペプチド酸化酵素と反応させ、生成した過酸化水素を測定することにより、試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法において、糖化ペプチドと糖化ペプチド酸化酵素との反応を、ハロゲン酸化物と、窒素原子及び硫黄原子を含む特定の５員環複素環化合物との存在下に行うことにより、試料中のアスコルビン酸の影響を抑制できる、という知見を見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の［１］～［７］に関する。
［１］　糖化ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させた後、生成した糖化ペプチドを糖化ペプチド酸化酵素と反応させ、生成した過酸化水素を測定することにより、試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法において、糖化ペプチドと糖化ペプチド酸化酵素との反応を、ハロゲン酸化物と、一般式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒ２は置換若しくは非置換のアルキルを表し、－－－は単結合又は二重結合を表す）で示される物質からなる群より選ばれる物質との存在下に行うことを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法。
［２］　ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、及び、臭素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、［１］記載の方法。
［３］　糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃである［１］又は［２］記載の方法。
［４］　タンパク質分解酵素、糖化ペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、一般式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（式中、Ｒ２は置換若しくは非置換のアルキルを表し、－－－は単結合又は二重結合を表す）で示される物質からなる群より選ばれる物質、及び、過酸化水素測定用試薬を含む、試料中の糖化ヘモグロビン測定用試薬。
［５］　ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、及び、臭素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、［４］記載の試薬。
［６］　糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃである［４］又は［５］記載の試薬。
［７］　試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響を抑制するための［４］～［６］のいずれかに記載の試薬。
　本発明により、糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法、及び、糖化ヘモグロビン測定用試薬が提供される。
（１）試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法
　本発明の、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法は、糖化ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させた後、生成した糖化ペプチドを糖化ペプチド酸化酵素と反応させ、生成した過酸化水素を測定することにより、試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法において、糖化ペプチドと糖化ペプチド酸化酵素との反応を、ハロゲン酸化物と、一般式（Ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（式中、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される物質［以下、化合物（Ｉ）と記す］、及び、一般式（ＩＩ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（式中、Ｒ２は置換若しくは非置換のアルキルを表し、－－－は単結合又は二重結合を表す）で示される物質［以下、化合物（ＩＩ）と記す］からなる群より選ばれる物質との存在下に行うことを特徴とする方法である。ハロゲン酸化物と、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる物質は、糖化ヘモグロビン含有試料とタンパク質分解酵素との反応において共存させてもよい。
　本発明の測定方法における糖化ヘモグロビン含有試料は、糖化ヘモグロビン及びヘモグロビンを含有し、本発明のアスコルビン酸の影響抑制方法を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血球、血球に血漿が混在した試料、これらの試料を溶血処理した試料等が挙げられる。溶血処理としては、全血、血球、血球に血漿が混在した試料を溶血させる処理であれば特に制限はなく、例えば物理的方法、化学的方法、生物学的方法等が挙げられる。物理的方法としては、例えば蒸留水等の低張液を用いる方法、超音波を用いる方法等が挙げられる。化学的方法としては、例えばメタノール、エタノール、アセトン等の有機溶媒を用いる方法、ポリオキシエチレン系界面活性剤を用いる方法等が挙げられる。生物学的方法としては、例えば抗体や補体を用いる方法等が挙げられる。
　本発明における糖化ヘモグロビンは、ヘモグロビンにグルコース等の糖が結合して生成したものであり、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｃ等が挙げられ、ヘモグロビンＡ１ｃが好ましい。
　本発明におけるハロゲン酸化物としては、本発明のアスコルビン酸の影響抑制方法を可能とするハロゲン酸化物であれば特に制限はないが、例えば、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩、過ヨウ素酸若しくはその塩等が挙げられ、ヨウ素酸若しくはその塩、臭素酸若しくはその塩が好ましい。塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等が挙げられる。
　ハロゲン酸化物の具体例（製品）としては、例えばヨウ素酸、ヨウ素酸ナトリウム、ヨウ素酸カリウム、臭素酸、臭素酸ナトリウム、臭素酸カリウム、過ヨウ素酸、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム等が挙げられる。
　本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法において、ハロゲン酸化物の反応液中の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば、特に制限はないが、通常0.005～20 mmol/Lであり、0.01～10 mmol/Lが好ましい。
　本発明における化合物（Ｉ）におけるＲ１は置換若しくは非置換のアルキルを表す。置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　化合物（Ｉ）の具体例（製品）としては、例えば２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン（東京化成社製、ケミクレア社製）、２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン（シグマアルドリッチ社製）等が挙げられる。
　本発明における化合物（ＩＩ）におけるＲ２は置換若しくは非置換のアルキルを表す。置換若しくは非置換のアルキルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。置換アルキルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　化合物（ＩＩ）の具体例（製品）としては、例えば２－メチルチアゾリン（東京化成社製）、２－メチルチアゾール（東京化成社製）、２－エチルチアゾール（東京化成社製）、２－プロピルチアゾール（東京化成社製）２－イソブチルチアゾール（東京化成社製）等が挙げられる。
　本発明のアスコルビン酸の影響抑制方法において、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）の反応液中の濃度としては、本発明の糖化ヘモグロビンの測定方法を可能とする濃度であれば、特に制限はないが、通常0.005～20 mmol/Lであり、好ましくは0.01～10 mmol/Lである。
　糖化ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させて糖化ペプチドを生成させる反応は、糖化ペプチドを生成し得る条件であれば、いかなる条件下でも行うことができる。当該反応、すなわち、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンとタンパク質分解酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。また、当該反応は、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの変性剤の存在下に行うこともできる。当該変性剤により、糖化ヘモグロビンはタンパク質分解酵素との反応が可能な状態となることから、糖化ヘモグロビンとタンパク質分解酵素との反応は、変性剤の存在下に行うことが好ましい。変性剤としては、糖化ヘモグロビンをタンパク質分解酵素との反応が可能な状態にし得る変性剤であれば特に制限はなく、例えば陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
　陽イオン性界面活性剤としては、例えば第四級アンモニウム塩、ピリジニウム塩等が挙げられる。
　第四級アンモニウム塩としては、炭素数８～２０の直鎖アルキルを少なくとも１つ有する第四級アンモニウム塩が好ましい。炭素数８～２０の直鎖アルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
　第四級アンモニウム塩の具体例（製品）としては、例えばデシルトリメチルアンモニウム　クロライド、デシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド、ドデシルトリメチルアンモニウム　クロライド、ドデシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド、テトラデシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド（以下、Ｃ１４ＴＭＡと記す）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム　クロライド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム　ブロマイド、ジデシルジメチルアンモニウム　クロライド、ジデシルジメチルアンモニウム　ブロマイド、ジドデシルジメチルアンモニウム　クロライド、ジドデシルジメチルアンモニウム　ブロマイド（いずれも、東京化成社製）等が挙げられる。
　ピリジニウム塩としては、Ｎ－アルキルピリジニウム塩、Ｎ－アルケニルピリジニウム塩等が挙げられる。アルキルとしては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えばイソプロピル、イソブチル、イソペンチル、イソヘキシル、イソヘプチル、イソオクチル、イソノニル、イソデシル、イソウンデシル、イソドデシル、イソトリデシル、イソテトラデシル、イソペンタデシル、イソヘキサデシル、イソヘプタデシル、イソオクタデシル、イソノナデシル、イソイコシル、オクチルドデシル等が挙げられる。
　アルケニルとしては、例えば炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えばビニル、プロペニル、アリル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
　また、アルキルとして、置換アルキルを用いることもでき、アルケニルとして、置換アルケニルを用いることもできる。置換アルキル及び置換アルケニルにおける置換基としては、例えばフェニル基、水酸基、スルホ基、シアノ基、ハロゲン原子等が挙げられる。ハロゲン原子としては、例えば塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子等が挙げられる。
　さらに、ピリジン環上の２～６位に置換基を有するＮ－アルキルピリジニウム塩、Ｎ－アルケニルピリジニウム塩も用いることもできる。ピリジン環上の２～６位の置換基としては、例えば炭素数１～２０の直鎖アルキル、炭素数３～２０の分岐アルキル、炭素数２～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数１～２０の直鎖アルキルとしては、例えば前述の炭素数１～２０の直鎖アルキル等が挙げられる。炭素数３～２０の分岐アルキルとしては、例えば前述の炭素数３～２０の分岐アルキル等が挙げられる。炭素数２～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数２～２０の直鎖アルケニル等が挙げられる。
　ピリジニウム塩の具体例（製品）としては、例えば１－ドデシルピリジニウムクロライド（以下、Ｃ１２ｐｙと記す；東京化成社製）、１－セチルピリジニウムクロライド（東京化成社製）、１－セチル－４－メチルピリジニウムクロライド（東京化成社製）、Ｎ－オクタデシル－４－スチルバゾールブロミド（東京化成社製）等が挙げられる。
　陰イオン性界面活性剤としては、例えば硫酸エステル塩、カルボン酸塩、スルホン酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸塩、Ｎ－メチルタウリン塩、Ｎ－アルカノイル－Ｎ－メチルタウリン塩等が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、例えば第三級アミンオキサイド、アルキルカルボキシベタイン等が挙げられる。
　非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルケニルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、エチレンジアミンテトラポリオキシエチレン、ポリグリセリン脂肪酸エステル等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンアルキルエーテルが好ましい。
　ポリオキシエチレンアルキルアミンにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えばオクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル（ラウリル）、トリデシル、テトラデシル（ミリスチル）、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、ヘプタデシル、オクタデシル（ステアリル）、ノナデシル、イコシル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルケニルアミンにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えばオクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、テトラデセニル、ペンタデセニル、ヘキサデセニル、ヘプタデセニル、オクタデセニル、オレイル、ノナデセニル、イコセニル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルケニルエーテルにおけるアルケニルとしては、例えば炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルケニルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルケニル等が挙げられる。
　ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルにおけるアルキルとしては、例えば炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。炭素数８～２０のアルキルとしては、例えば前述の炭素数８～２０のアルキル等が挙げられる。
　糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応における反応温度は、通常10～50℃であり、20～40℃が好ましく、反応時間は、通常1分間～3時間であり、2.5分間～1時間が好ましい。タンパク質分解酵素の濃度としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常50～25,000 kU/Lであり、好ましくは250～10,000 kU/Lである。
　タンパク質分解酵素としては、ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンに作用し、糖化ヘモグロビンから糖化ペプチドを生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えばセリンプロテアーゼ（キモトリプシン、スブチリシン等）、システインプロテアーゼ（パパイン、カスパーゼ等）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ等）、メタロプロテアーゼ（サーモリシン等）、Ｎ－末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が挙げられる。本発明においては、市販のタンパク質分解酵素も使用することができ、市販品としては例えばプロテアーゼＰ「アマノ」３Ｇ、プロテアーゼＫ「アマノ」（以上、天野エンザイム社製）、アクチナーゼＡＳ、アクチナーゼＥ（以上、科研ファルマ社製）、サーモリシン（大和化成社製）、スミチームMP(新日本化学工業社製)等が挙げられる。
　上記タンパク質分解酵素を作用させる反応における変性剤の濃度としては、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常0.0001～10%であり、0.0005～5%が好ましい。
　糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンと、タンパク質分解酵素との反応により、糖化ペプチドが生成する。生成した糖化ペプチドは、糖化ペプチド酸化酵素と反応し、過酸化水素が生成する。糖化ペプチドと糖化ペプチド酸化酵素との反応は、水性媒体中で行われることが好ましい。水性媒体としては後述の水性媒体等が挙げられる。
　糖化ペプチドと糖化ペプチド酸化酵素との反応における反応温度は、通常10～50℃であり、20～40℃が好ましく、反応時間は、通常1分間～3時間であり、2.5分間～1時間が好ましい。糖化ペプチド酸化酵素の濃度としては、フルクトシルヘモグロビンと糖化ペプチド酸化酵素との反応が進行する濃度であれば特に制限はなく、通常0.1～30 kU/Lであり、好ましくは0.2～15 kU/Lである。
　糖化ペプチド酸化酵素としては、糖化ペプチドに作用して過酸化水素を生成させる酵素であれば特に制限はなく、例えば糸状菌由来、酵母由来、放線菌由来、バクテリア由来、古細菌由来の糖化ペプチド酸化酵素等が挙げられる。本発明においては、市販の糖化ペプチド酸化酵素も使用することができ、市販品としては例えばFPOX-CE（キッコーマン社製）、FPOX-EE（キッコーマン社製）、FPOX-CET（キッコーマン社製）等が挙げられる。
　生成した過酸化水素の測定方法としては、例えば電極を用いる方法、過酸化水素測定用試薬を用いる方法等が挙げられ、過酸化水素測定用試薬を用いる方法が好ましい。過酸化水素測定用試薬は、過酸化水素を検出可能な物質に変換するための試薬である。検出可能な物質としては、例えば色素、光（発光）、蛍光等が挙げられ、色素が好ましい。
　検出可能な物質が色素の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と酸化発色型色原体を含む試薬等が挙げられる。酸化発色型色原体としては、酸化カップリング型色原体、ロイコ型色原体等が挙げられ、ロイコ型色原体が好ましい。ロイコ型色原体としては、例えばフェノチアジン系色原体、トリフェニルメタン系色原体、ジフェニルアミン系色原体、ｏ－フェニレンジアミン、ヒドロキシプロピオン酸、ジアミノベンジジン、テトラメチルベンジジン等が挙げられ、フェノチアジン系色原体が好ましい。フェノチアジン系色原体としては、例えば１０－Ｎ－カルボキシメチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン(CCAP)、１０－Ｎ－メチルカルバモイル－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン(MCDP)、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)等が挙げられる。フェノチアジン系色原体の中でも、１０－Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－１０Ｈ－フェノチアジン ナトリウム塩(DA-67)が特に好ましい。トリフェニルメタン系色原体としては、例えばＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’－ヘキサ（３－スルホプロピル）－４，４’，４’’－トリアミノトリフェニルメタン(TPM-PS)等が挙げられる。ジフェニルアミン系色原体としては、例えばＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン ナトリウム塩(DA-64)、４，４’－ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミン、ビス〔３－ビス（４－クロロフェニル）メチル－４－ジメチルアミノフェニル〕アミン(BCMA)等が挙げられる。
　検出可能な物質が光（発光）の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と化学発光物質を含む試薬等が挙げられる。化学発光物質としては、例えばルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエステル等が挙げられる。
　検出可能な物質が蛍光の場合、過酸化水素測定用試薬は、ペルオキシダーゼ等の過酸化活性物質と蛍光物質を含む試薬等が挙げられる。蛍光物質としては、例えば４－ヒドロキシフェニル酢酸、３－（４－ヒドロキシフェニル）プロピオン酸、クマリン等が挙げられる。
　本発明における、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定方法は、糖化ヘモグロビン含有試料中の総ヘモグロビン量に対する糖化ヘモグロビン量の割合として算出する方法も包含する。
　総ヘモグロビン量は、公知の方法、例えばシアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法等によって決定することができる。総ヘモグロビン量は、糖化ヘモグロビン含有試料そのもののみならず、糖化ヘモグロビン含有試料に、ハロゲン酸化物と、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる物質とを添加して得られる試料、糖化ヘモグロビン含有試料に、ハロゲン酸化物、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる物質、及び、タンパク質分解酵素を添加して得られる試料に対して、シアンメトヘモグロビン法、オキシヘモグロビン法、ＳＬＳ－ヘモグロビン法を適用することによっても決定することができる。
（２）糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬
　本発明の、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定試薬は、タンパク質分解酵素、糖化ペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる物質、及び、過酸化水素測定用試薬を含む試薬である。本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬は、本発明のアスコルビン酸の影響抑制方法に使用される。
　本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素、糖化ペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、及び、過酸化水素測定試薬としては、例えば、それぞれ、前述のタンパク質分解酵素、糖化ペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、及び、過酸化水素測定試薬等が挙げられる。
　本発明の測定試薬におけるタンパク質分解酵素の濃度は、通常50～25,000 kU/Lであり、好ましくは250～10,000 kU/Lである。本発明の測定試薬における糖化ペプチド酸化酵素の濃度は、通常0.1～30 kU/Lであり、好ましくは0.2～15 kU/Lである。
　本発明の測定試薬におけるハロゲン酸化物の濃度は、通常0.005～20 mmol/Lであり、好ましくは0.01～10 mmol/Lである。
　本発明の測定試薬における化合物（Ｉ）の濃度は、通常0.005～20 mmol/Lであり、0.01～10 mmol/Lが好ましい。
　本発明の測定試薬における化合物（ＩＩ）の濃度は、通常0.005～20 mmol/Lであり、0.01～10 mmol/Lが好ましい。
　本発明の測定試薬には、必要に応じて、水性媒体、変性剤、安定化剤、防腐剤、塩類、妨害物質の影響抑制剤、可溶化剤、有機溶媒等が含有されてもよい。
　水性媒体としては、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。
　水性媒体のpHは、例えばpH4～10である。水性媒体として緩衝液を用いる場合には、設定するpHに応じた緩衝剤を用いることが望ましい。緩衝液に用いる緩衝剤としては、例えばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、リン酸緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、グッドの緩衝剤等が挙げられる。
　グッドの緩衝剤としては、例えば２－モルホリノエタンスルホン酸(MES)、ビス（２－ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン(Bis-Tris)、Ｎ－（２－アセトアミド）イミノ二酢酸(ADA)、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）(PIPES)、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸(ACES)、３－モルホリノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸(BES)、３－モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－アミノエタンスルホン酸(TES)、２－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕エタンスルホン酸(HEPES)、３－〔Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）アミノ〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕－２－ヒドロキシ－３－アミノプロパンスルホン酸(TAPSO)、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）(POPSO)、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸(HEPPSO)、３－〔４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジニル〕プロパンスルホン酸[(H)EPPS]、Ｎ－〔トリス（ヒドロキシメチル）メチル〕グリシン(Tricine)、Ｎ，Ｎ－ビス（２－ヒドロキシエチル）グリシン(Bicine)、Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）メチル－３－アミノプロパンスルホン酸(TAPS)、Ｎ－シクロヘキシル－２－アミノエタンスルホン酸(CHES)、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)、Ｎ－シクロヘキシル－３－アミノプロパンスルホン酸(CAPS)等が挙げられる。
　緩衝液の濃度は、通常0.001～2.0 mol/Lであり、0.005～1.0 mol/Lが好ましい。
　変性剤としては、例えば前述の変性剤等が挙げられる。本発明の測定試薬における変性剤の濃度は、通常0.0001～10%であり、0.0005～5%が好ましい。
　安定化剤としては、例えばエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、シュークロース、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、硝酸カルシウム、フェロシアン化カリウム、牛血清アルブミン(BSA)等が挙げられる。防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質等があげられる。塩類としては、例えば塩化ナトリウム、硝酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、塩化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、炭酸カリウム等が挙げられる。妨害物質の影響抑制剤としては、例えば過酸化物の影響を抑制するためのピルビン酸等が挙げられる。可溶化剤としては、例えばポリオキシエチレンアルキルエーテルやポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル等の非イオン性界面活性剤等が挙げられる。有機溶媒としては、例えばロイコ型色原体の水性媒体への溶解補助のためのジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルスルホキサイド(DMSO)、ジオキサン、アセトン、メタノール、エタノール等が挙げられる。
　本発明の糖化ヘモグロビン測定試薬は、キットの形態を取ってもよい。糖化ヘモグロビン測定キットとしては、例えば２試薬系キット、３試薬系キット等が挙げられる。糖化ヘモグロビン測定キットが２試薬系キットである場合、タンパク質分解酵素、糖化ペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＩ）からなる群より選ばれる物質、及び、過酸化水素測定用試薬の各要素の配置は、キットの保存安定性の観点から、当業者が適宜、選択することができるが、タンパク質分解酵素及び糖化ペプチド酸化酵素が別々の試薬に含まれるキットが好ましい。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。尚、本実施例においては、下記メーカーの試薬及び酵素を使用した。
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（同仁化学研究所社製）、ＭＯＰＳ（同仁化学研究所社製）、塩化カルシウム２水和物（関東化学社製）、ピルビン酸ナトリウム（関東化学社製）、ＤＭＳＯ（ナカライテスク社製）、ＤＡ－６７（和光純薬工業社製）、トリトンＸ－４０５（非イオン性界面活性剤；シグマアルドリッチ社製）、１－ドデシルピリジニウムクロライド（Ｃ１２ｐｙ）（変性剤；東京化成社製）、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（Ｃ１４ＴＭＡ）（変性剤；東京化成社製）、ヨウ素酸カリウム（ハロゲン酸化物；東京化成社製）、臭素酸カリウム（ハロゲン酸化物；東京化成社製）、２－オクチル－４－イソチアゾリン－３－オン［化合物（Ｉ）；ケミクレア社製］、プロクリン９５０｛２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン［化合物（Ｉ）］の9.5%水溶液；シグマアルドリッチ社製｝、２－メチルチアゾリン［化合物（ＩＩ）；東京化成社製］、アクチナーゼＥ（タンパク質分解酵素；科研製薬社製）、ＦＰＯＸ－ＣＥＴ（糖化ペプチド酸化酵素；キッコーマン社製）、ペルオキシダーゼ（東洋紡績社製）。
　以下の第１試薬及び第２試薬からなる、第１表に示すＨｂＡ１ｃ測定キット（キット１～３；キットａ～ｅ）を調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１２ｐｙ　　　　　　　　　　　　　　１．２ｇ／Ｌ
　ヨウ素酸カリウム
　化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　１６ｍｍｏｌ／Ｌ
　ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　２ｇ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＭＳＯ　　　　　　　　　　　　　　　０．２ｍＬ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　１２．６μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　８０ｋＵ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　２．５ｋＵ／Ｌ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　以下の第１試薬及び第２試薬からなる、第２表に示すＨｂＡ１ｃ測定キット（キット４～６；キットｆ～ｊ）を調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１４ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　０．６ｇ／Ｌ
　ヨウ素酸カリウム
　化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　１６ｍｍｏｌ／Ｌ
　ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　２ｇ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＭＳＯ　　　　　　　　　　　　　　　０．２ｍＬ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　１２．６μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　８０ｋＵ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　２．５ｋＵ／Ｌ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　以下の第１試薬及び第２試薬からなる、第３表に示すＨｂＡ１ｃ測定キット（キット７～８；キットｋ、ｇ～ｊ）を調製した。
第１試薬
　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ（ｐＨ６．８）　　　　１０ｍｍｏｌ／Ｌ
　Ｃ１４ＴＭＡ　　　　　　　　　　　　　０．６ｇ／Ｌ
　臭素酸カリウム
　化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）
　塩化カルシウム２水和物　　　　　　　　１６ｍｍｏｌ／Ｌ
　ピルビン酸ナトリウム　　　　　　　　　２ｇ／Ｌ
　アクチナーゼＥ　　　　　　　　　　　　３４０ｋＵ／Ｌ
　ＤＭＳＯ　　　　　　　　　　　　　　　０．２ｍＬ／Ｌ
　ＤＡ－６７　　　　　　　　　　　　　　１２．６μｍｏｌ／Ｌ
第２試薬
　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）　　　　　　　　５０ｍｍｏｌ／Ｌ
　トリトンＸ－４０５　　　　　　　　　　７．１ｇ／Ｌ
　ペルオキシダーゼ　　　　　　　　　　　８０ｋＵ／Ｌ
　ＦＰＯＸ－ＣＥＴ　　　　　　　　　　　２．５ｋＵ／Ｌ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　ＨｂＡ１ｃ測定キットとして、実施例１のキット１を、試料として、糖尿病が疑われる１６名の被験者由来の全血を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度（量）の総ヘモグロビン濃度（量）に対する割合［ＨｂＡ１ｃ（％）］を決定した。
（１）総ヘモグロビン濃度決定のための検量線の作成
　測定キットとして、総ヘモグロビン測定用キットであるネスコートヘモキット－Ｎ（シアンメトヘモグロビン法）（アルフレッサファーマ社製）を用いて、検体として、ネスコートヘモキット－Ｎに付属の標準液（ヘモグロビン濃度：15.3 g/dL）を用いて、ヘモグロビン濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成した。
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
　ラテックス免疫凝集法と、血球画分の総ヘモグロビン値とから、ＨｂＡ１ｃ濃度が2.97 μmol/L、7.80 μmol/Lと値付けされた２つの血球画分について、実施例１のキット１を用いて測定し、各血球画分に対する吸光度を測定した。当該血球画分の代わりに生理食塩水を用いて、生理食塩水に対するＨｂＡ１ｃ濃度を測定した。当該血球画分に対するそれぞれの吸光度から、生理食塩水に対する吸光度を差し引いて算出した値を、当該血球画分に対するブランク補正吸光度とした。当該血球画分に対するブランク補正吸光度と、生理食塩水に対するブランク補正吸光度(0 Abs)とから、ＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（３）各血球画分におけるヘモグロビン濃度の決定
　各試料に対して、25℃、3,000 rpmで5分間遠心分離を行い、血球画分を得た。各血球画分について、ネスコートヘモキット－Ｎを用いて測定し、得られた測定値と（１）の検量線とから、各血球画分中のヘモグロビン濃度(μmol/L)を決定した。
（４）各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度の決定
　各血球画分について、実施例１のキット１を用いて測定し、得られた測定値と（２）の検量線とから、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)を決定した。
（５）ＨｂＡ１ｃ（％）（＝ＨｂＡ１ｃ濃度のヘモグロビン濃度に対する割合）の決定
　上記（３）で決定した各血球画分におけるヘモグロビン濃度(μmol/L)と、上記（４）で決定した各血球画分におけるＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)とから、以下の式により、日本糖尿病学会(Japan Diabetes Society；JDS）値のＨｂＡ１ｃ（％）を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000014
（６）同一血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）の免疫測定法での決定
　上記（５）でのＨｂＡ１ｃ（％）の決定に使用した血球画分と同一の血球画分を用いて、各血球画分中のＨｂＡ１ｃ（％）を、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いる免疫測定法により、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃの添付文書に記載の方法に従って決定した。
（７）本発明の測定キットを用いる測定方法と免疫測定法との相関
　本発明の測定キットを用いる測定方法により、上記（５）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）と、免疫測定法を用いて、上記（６）で決定したＨｂＡ１ｃ（％）とから、本発明の測定方法と免疫測定法との間の相関関係を検証し、相関係数を決定した。
　同様に、実施例１のキット１の代わりに、実施例１のキット２～３、キットａ～ｅ、実施例２のキット４～６、キットｆ～ｊ、実施例３のキット７～８、キットｋの各キットを用いて、デタミナーＬ　ＨｂＡ１ｃ（協和メデックス社製）を用いた測定との間の相関係数を決定した。その結果を第４表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　第４表に示す通り、実施例１～３の各キットを用いるＨｂＡ１ｃの測定方法と、免疫測定法との間に良好な相関関係が認められた。従って、実施例１～３の各キットを用いることにより、試料中のＨｂＡ１ｃを正確に測定できることを確認した。
　ＨｂＡ１ｃ測定キットとして、実施例１のキット１を、試料として、以下に方法により調製されたアスコルビン酸の影響確認用試料を用いて、以下の手順により、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)を決定した。
（１）アスコルビン酸の影響確認用試料の調製
　ヒト血液を遠心分離して得られた血球画分について、総ヘモグロビン測定用キットであるネスコートヘモキット－Ｎ（シアンメトヘモグロビン法）（アルフレッサファーマ社製）を用いてヘモグロビン濃度を決定した後、当該血球画分を精製水で希釈すると共に、溶血させて、ヘモグロビン濃度6.4 mg/mLのヘモグロビン溶液を調製した。
　調製した当該ヘモグロビン溶液にアスコルビン酸を添加し、アスコルビン酸濃度が0.5 mg/dL, 1 mg/dL, 2 mg/dL、及び、5 mg/dLの各ヘモグロビン溶液を調製し、アスコルビン酸の影響確認用試料とした。また、調製した当該ヘモグロビン溶液そのものを、アスコルビン酸濃度が0 mg/mLであるアスコルビン酸の影響確認用試料とした。
（２）ＨｂＡ１ｃ濃度決定のための検量線の作成
　実施例４の（２）の方法により、ＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)と吸光度との間の関係を示す検量線を作成した。
（３）アスコルビン酸の影響確認用試料中のＨｂＡ１ｃ濃度の決定
　上記（１）で調製したアスコルビン酸の影響確認用試料の各試料について、実施例１のキット１を用いて測定し、得られた測定値と（２）の検量線とから、各試料中のＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)を決定した。アスコルビン酸濃度が0 mg/dLであるアスコルビン酸の影響確認用試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)を100としたときの、アスコルビン酸濃度が0.5 mg/dL、1 mg/dL、2 mg/dLであるアスコルビン酸の影響確認用試料の各試料中のＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)の相対値を決定した。
　実施例１のキット１の代わりに、実際例１のキット２～３、キットａ～ｅの各キットを用いて同様の手順により測定を行い、各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)の相対値を決定した。決定された相対値を第５表に示す。相対値が100に近い程、アスコルビン酸の影響を受け難いことを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　第５表より明らかなように、ヨウ素酸カリウムと、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）とを含むキット１～３においては、ヨウ素酸カリウム、及び、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）の少なくとも１つを含まないキット（キットａ～ｅ）に比較して、ＨｂＡ１ｃ濃度の相対値が100に近く、アスコルビン酸の影響を受け難いことが分かる。
　実施例１のキット１の代わりに、実施例２のキット４～６、キットｆ～ｊの各キットを用いる以外は実施例５と同様の方法により、アスコルビン酸の影響確認用試料の各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)の相対値を決定した。決定されたＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)の相対値を第６表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　第６表より明らかなように、ヨウ素酸カリウムと、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）とを含むキット４～６においては、ヨウ素酸カリウム、及び、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）のいずれか又は両方を含まないキット（キットｆ～ｊ）に比較して、ＨｂＡ１ｃ濃度の相対値が100に近く、アスコルビン酸の影響を受け難いことが分かる。
　実施例１のキット１の代わりに、実施例３のキット７～８、キットｋ、ｇ～ｊの各キットを用いる以外は実施例５と同様の方法により、アスコルビン酸の影響確認用試料の各試料におけるＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)の相対値を決定した。決定されたＨｂＡ１ｃ濃度(μmol/L)の相対値を第７表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　第７表より明らかなように、臭素酸カリウムと、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）とを含むキット７～８においては、臭素酸カリウム、及び、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）のいずれか又は両方を含まないキット（キットｋ、ｇ～ｊ）に比較して、ＨｂＡ１ｃ濃度の相対値が100に近く、アスコルビン酸の影響を受け難いことが分かる。
　従って、ハロゲン酸化物と、化合物（Ｉ）又は化合物（ＩＩ）とを含むキットを用いたＨｂＡ１ｃの測定においては、アスコルビン酸の影響が顕著に抑制されていることが分かる。
　本発明により、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法、糖化ヘモグロビン含有試料中の糖化ヘモグロビン測定用試薬が提供される。本発明のアスコルビン酸の影響抑制方法、及び、糖化ヘモグロビン測定用試薬は、糖尿病の診断等に有用である。
 

Claims (7)

  1. 　糖化ヘモグロビン含有試料にタンパク質分解酵素を作用させた後、生成した糖化ペプチドを糖化ペプチド酸化酵素と反応させ、生成した過酸化水素を測定することにより、試料中の糖化ヘモグロビンを測定する方法において、糖化ペプチドと糖化ペプチド酸化酵素との反応を、ハロゲン酸化物と、一般式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （式中、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、Ｒ２は置換若しくは非置換のアルキルを表し、－－－は単結合又は二重結合を表す）で示される物質からなる群より選ばれる物質との存在下に行うことを特徴とする、試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響抑制方法。
  2. 　ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、及び、臭素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、請求項１記載の方法。
  3. 　糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃである請求項１又は２記載の方法。
  4. 　タンパク質分解酵素、糖化ペプチド酸化酵素、ハロゲン酸化物、一般式（Ｉ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （式中、Ｒ１は置換若しくは非置換のアルキルを表す）で表される物質、及び、一般式（ＩＩ）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （式中、Ｒ２は置換若しくは非置換のアルキルを表し、－－－は単結合又は二重結合を表す）で示される物質からなる群より選ばれる物質、及び、過酸化水素測定用試薬を含む、試料中の糖化ヘモグロビン測定用試薬。
  5. 　ハロゲン酸化物が、ヨウ素酸若しくはその塩、及び、臭素酸若しくはその塩からなる群より選ばれるハロゲン酸化物である、請求項４記載の試薬。
  6. 　糖化ヘモグロビンが、ヘモグロビンＡ１ｃである請求項４又は５記載の試薬。
  7. 　試料中の糖化ヘモグロビンの測定におけるアスコルビン酸の影響を抑制するための請求項４～６のいずれかに記載の試薬。
     
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