WO2013121351A2 - Cytomegalovirus humain oncogenique - Google Patents

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Universite de Franche-Comte
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Definitions

  • cancer defines a large group of different diseases, all involving unregulated cell growth.
  • the cells of a tissue divide and grow uncontrollably, leading to the formation of malignant tumors, and possibly to the invasion of nearby or distant tissues or organs, through the lymphatic system or the blood circulation, and the formation of metastases.
  • Breast cancer (or malignant breast tumor) is a type of cancer that originates from breast tissue, most often from the inner lining of the milk ducts or lobules that supply the milk ducts. Although the overwhelming majority of breast cancers in humans affect women, some men may also be affected. Worldwide, breast cancer accounts for around 20% of cancers (excluding non-melanoma skin cancers) in women, and more than one in three cancers in women in France.
  • Breast cancer like most cancers, comprises a set of heterogeneous tumors with clinical characteristics, pathological evolutions, and very different therapeutic responses.
  • the intrinsic characteristics of tumors such as these histological, immunopathological, or molecular characters lead to classifying breast tumors into different groups with often different prognosis.
  • the extrinsic characteristics of tumors such as the microenvironment, may impact the prognosis of breast tumors (Bertos & Park, J Clin Invest, 2011, 121: 3789-3796).
  • the prognosis and survival rate may vary widely depending on the type of cancer, the stage, and the treatment strategy adopted.
  • the oncogeneity of some viruses imply direct routes of action, such as the insertion of viral oncogenic genes into the host cell or the increase of the activity of oncogenic genes (proto-oncogenes) existing in the genome of the cell host.
  • Other viruses manifest their oncogenicity by inducing chronic nonspecific inflammation, as is the case for liver cancer induced by hepatitis C virus.
  • the main viruses associated with human cancers are human papillomavirus, hepatitis B and hepatitis C viruses, Epstein-Barr virus, human T-lymphotropic virus (HTLV), herpes associated with Kaposi's sarcoma (KSHV) and Merkel cell polyomavirus.
  • HCMV human cytomegalovirus
  • the human cytomegalovirus (Human Cytomegalovirus or HCMV) is a ubiquitous herpes virus that affects a large part of the adult population and causes latent, asymptomatic infections in healthy individuals. The frequency of infection varies from 50 to 100% in the general adult population. On the other hand, it can cause severe and often fatal disease states in immunocompromised individuals.
  • HCMV HCMV
  • certain strains of HCMV in particular the DB and AD 169 strains, have their own oncogenic properties and are able to transform, after infection, primary cells.
  • healthy especially human primary mammary epithelial cells (or HuMECs, Human Mammary Epithelial Cells), in malignant cells.
  • HuMECs Human Mammary Epithelial Cells
  • the inventors have identified that the UL82 and UL97 genes, their expression products and in particular the expression level of these genes, are involved in the oncogenic character of oncogenic HCMV strains.
  • the inventors have identified that the level of expression of the UL82 and UL92 proteins, and / or that mutations, as detailed in the examples, at the C-terminal end of the UL82 protein, in the region extending from amino acid 421 to amino acid 540 are involved in the oncogene character of oncogenic HCMVs.
  • the inventors have determined that mutations in the C-terminus of the UL82 protein are present only in the sequences of the oncogenic HCMV strains DB and AD 169 and not at the non-oncogenic strains HCMV TB40E and TB40F.
  • the inventors have determined that the UL97 and UL82 proteins, also described as inactivating the anti-tumor Rb protein (retinoblasoma) by phosphorylating it and promoting its cellular degradation in the 26S proteasome, are expressed in greater quantities within permissive cells infected with oncogenic strains only by non-oncogenic strains.
  • the present invention relates to the use of an isolated nucleic acid sequence encoding a UL82 or UL97 protein of a human cytomegalovirus strain, HCMV, or an isolated amino acid sequence. consisting of a sequence of an UL82 or UL97 protein of an HCMV strain to determine an oncogenic property in an HCMV.
  • the present invention relates to the use of an isolated nucleic acid sequence encoding a UL82 or UL97 protein of a human cytomegalovirus strain, HCMV, or an isolated amino acid sequence. consisting of a sequence of a UL82 or UL97 protein of a strain of HCMV to determine a risk of carcinogenesis or to evaluate a prognosis of a cancer.
  • the present invention relates to the use of an isolated nucleic acid sequence coding for a UL82 protein of a strain of human cytomegalovirus, HCMV, or an isolated amino acid sequence consisting of a sequence of an UL82 protein of an HCMV strain for determining a risk of carcinogenesis or for assessing a prognosis of a cancer, said UL82 protein comprising in a region extending from amino acid 421 to amino acid 540 at least one amino acid substituted by substitution or insertion.
  • carcinogenesis or cancer is carcinogenesis or cancer of the breast or liver, and more preferably carcinogenesis or breast cancer.
  • the present invention relates to an isolated nucleic acid sequence coding for an amino acid sequence of an UL82 protein of a strain of human cytomegalovirus, HCMV, said amino acid sequence comprising in a region extending from amino acid 421 to amino acid 540 at least one point mutation.
  • an isolated nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence of an UL82 protein of an HCMV strain encodes an amino acid sequence selected from a sequence consisting of SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • the present invention relates to a nucleotide primer, in particular isolated, consisting of a sequence of consecutive nucleic acids derived from an isolated nucleic acid sequence of the invention, said primer being specifically suitable for sequencing or amplification of a nucleic acid sequence comprising at least one nucleic acid sequence isolated from the invention, said nucleotide primer being a sequence consisting of one of SEQ ID NO 9 to 20.
  • the present invention relates to a nucleotide primer, in particular isolated, consisting of a sequence of consecutive nucleic acids derived from an isolated nucleic acid sequence coding for an UL82 protein of an HCMV strain, said primer specifically suitable for sequencing or amplifying an isolated nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence of an UL82 protein of an HCMV strain, said amino acid sequence being a sequence consisting of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7.
  • the present invention relates to a nucleotide probe, in particular isolated, consisting of a sequence of consecutive nucleic acids derived from an isolated nucleic acid sequence of the invention, said probe being a hybridization probe to specifically detect a nucleic acid sequence comprising at least minus an isolated nucleic acid sequence of the invention, said nucleotide probe being a sequence consisting of any one of SEQ ID NO 9 to 20.
  • the present invention relates to a nucleotide probe, in particular isolated, consisting of a sequence of consecutive nucleic acids derived from an isolated nucleic acid sequence coding for an UL82 protein of a strain of HCMV, said probe being a hybridization probe for specifically detecting an isolated nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence of a UL82 protein of an HCMV strain, said amino acid sequence being a sequence consisting of SEQ ID N05, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • the present invention relates to an expression vector, in particular isolated, comprising at least one nucleic acid sequence of the invention, preferably an isolated nucleic acid sequence coding for a sequence of nucleic acids.
  • amino acid of an UL82 protein of an HCMV strain said amino acid sequence being a sequence consisting of SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • the present invention relates to a host cell, in particular isolated, transfected with an expression vector of the invention.
  • the present invention relates to an amino acid sequence isolated from an UL82 protein of a strain of human cytomegalovirus, HCMV, said amino acid sequence comprising in a region extending from the acid amines 421 to amino acid 540 at least one point mutation.
  • an amino acid sequence isolated from an UL82 protein of an HCMV strain of the invention may consist of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO. 7.
  • an amino acid sequence isolated from an UL82 protein of an HCMV strain of the invention may consist of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • the present invention relates to an antibody capable of binding specifically to an amino acid sequence of the invention.
  • the present invention relates to a biomarker for evaluating an oncogenic property of a strain of human cytomegalovirus, HCMV, or for determining a risk of carcinogenesis in an individual in need, or for determining a prognosis of a cancer in an individual suffering from said cancer, said biomarker consisting of a nucleic acid sequence coding for a UL82 or UL97 protein of a strain of HCMV or an amino acid sequence consisting of a sequence of an UL82 or UL97 protein of an HCMV strain.
  • the present invention relates to a biomarker for determining a risk of carcinogenesis in an individual in need thereof, or for determining a prognosis of a cancer in an individual suffering from said cancer, said biomarker consisting of a sequence of nucleic acids encoding an UL82 protein of a human cytomegalovirus strain, HCMV, or an isolated amino acid sequence consisting of a sequence of an UL82 protein of a strain of HCMV, said UL82 protein comprising in a region extending from amino acid 421 to amino acid 540 at least one amino acid substituted by substitution or insertion.
  • Ranganathan et al. Journal of Virology 201 1, vol.86, No. 2: 854-864 describes that the expression of certain HCMV loci is more frequently associated with glioblastoma multiforme (GBM) than in other brain disorders.
  • GBM glioblastoma multiforme
  • UL96, US1 1 and US28 prove to be able to discriminate effectively between a brain with GBM and a brain with another tumor or epilepsy.
  • UL82 and UL 97 are not validated as being able to distinguish statistically, effectively, between a brain with GBM and a brain with another tumor or epilepsy.
  • the present invention relates to a diagnostic kit containing at least one isolated nucleic acid sequence of the invention, or at least one isolated amino acid sequence of the invention, at least one nucleotide primer. of the invention, at least one nucleotide probe of the invention, and / or at least one antibody of the invention.
  • the present invention relates to a diagnostic kit containing at least one isolated nucleic acid sequence encoding an UL82 protein of a strain of HCMV, the nucleic acid sequence encoding an acid sequence. amino acid consisting of a sequence selected from SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7, or at least one isolated amino acid sequence consisting of a sequence selected from SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7, at least one nucleotide primer of invention, at least one nucleotide probe of the invention, and / or at least one antibody of the invention.
  • the present invention relates to a medicament comprising at least one isolated nucleic acid sequence of the invention, or at least one isolated amino acid sequence of the invention or at least one antibody of the invention. 'invention.
  • a drug of the invention is a vaccine.
  • a medicament of the invention is intended to prevent and / or treat carcinogenesis, or cancer, induced by infection with HCMV.
  • carcinogenesis or cancer induced by HCMV infection is carcinogenesis or cancer of the breast or liver, and more preferably carcinogenesis or breast cancer.
  • a drug of the invention may be intended to prevent and / or treat breast cancer or liver.
  • An individual concerned by the invention is a human individual, and more preferably is a woman.
  • the present invention relates to a method for determining a risk of carcinogenesis in an individual in need thereof, or for evaluating a prognosis of a cancer in an individual suffering from said cancer, comprising at least the steps of:
  • the present invention relates to a method for determining a risk of carcinogenesis in an individual in need thereof, or for determining a prognosis of a cancer in an individual suffering from said cancer, comprising at least the steps of:
  • step b) comparing the determination of step a) with a control determination, said UL82 protein comprising in a region extending from amino acid 421 to amino acid 540 at least one amino acid substituted by substitution or insertion.
  • carcinogenesis or cancer is carcinogenesis or cancer of the breast or liver, and more preferably carcinogenesis or breast cancer.
  • the present invention relates to a method for evaluating an oncogene character of a strain of human cytomegalovirus, HCMV, comprising at least the steps of:
  • step b) comparing the determination of step a) with a control determination.
  • the present invention relates to the use of a human HCMV-DB cytomegalovirus strain for determining an oncogene character of a distinct strain of HCMV.
  • the strain HCMV-DB is advantageously used as a positive control.
  • the present invention relates to a method for determining a risk of carcinogenesis, in particular mammary carcinogenesis, in an individual in need thereof, or for determining a prognosis of a cancer in an individual suffering from said cancer, comprising at least the steps of:
  • the present invention relates to a method for determining an oncogenic character of an HCMV strain comprising at least the steps of:
  • the present invention relates to a method for determining an oncogenic character of a strain of HCMV comprising at least the steps of:
  • step b- determine the gene expression of the cells infected in step a-, and c- comparing the gene expression determined in step b- with basal / myoepithelial breast cancer cells or the gene expression of HCMV permissive eukaryotic cells infected with an oncogenic HCMV strain.
  • the uses and methods of the invention can be carried out in vivo, ex vivo or in vitro, and preferably are carried out in vitro or ex vivo.
  • HCMV human cytomegalovirus strain
  • a nucleic acid sequence of the invention may consist of a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence selected from SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 , or SEQ ID NO 7, preferably selected from SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 or SEQ ID No. 7, and more preferably for an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • a nucleic acid sequence encoding a UL97 protein may consist of a nucleic acid sequence SEQ ID NO 2, a nucleic acid sequence having a sequence identity of at least 90, preferably at least 95% , and more preferably at least 99% with SEQ ID NO 2 and a biological activity similar to SEQ ID NO 2, or a fragment of SEQ ID NO 2 and comprising a similar biological activity.
  • nucleic acid sequence encoding a UL97 protein may consist of a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO 8.
  • a nucleic acid sequence of the invention can be used to establish, in vitro, ex vivo, in vivo, transfected mammalian cells, or transgenic non-human mammals useful for establishing new diagnostic, prognostic or diagnostic tools. treatment of pathological disorders likely to be caused, at least in part, by an oncogenic HCMV, and in particular by a strain HCMV DB or AD 169.
  • Obtaining isolated, isolated cells from transfected mammals or obtaining transgenic non-human mammals can be accomplished using any methods known in the art, and including the use of any appropriate expression vector containing a sequence. nucleic acids of the invention.
  • the invention relates to an expression vector, in particular isolated, comprising a nucleic acid sequence of the invention, and a host cell, in particular isolated, comprising a nucleic acid sequence of the invention or a expression vector of the invention.
  • a nucleic acid sequence of the invention may also be a sequence, primer or nucleotide probe, capable of hybridizing, under stringent conditions, to a nucleic acid sequence SEQ ID No.
  • nucleic acid sequence having a sequence identity of at least 90, preferably at least 95%, and more preferably at least 99% with SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2 and a biological activity analogous to SEQ ID NO 1 or SEQ ID NO 2, or a fragment of SEQ ID NO 1, comprising at least 360 consecutive nucleic acids derived from said nucleic acid sequence, and a similar biological activity, or a fragment of SEQ ID NO 2 and comprising a similar biological activity, the stringent conditions being a temperature of 20 to 25 ° C lower than Tm, 1xSSC (soluble solid content) and 0.1% of SDS (Sodium Dodecyl Sulfate).
  • SDS sodium Dodecyl Sulfate
  • Tm melting temperature
  • Stringent conditions refer to specific conditions in which specific nucleic acid sequence hybrids can be formed, but in which nonspecific hybrids do not form.
  • these are the conditions under which two nucleic acid sequences having a high degree of homology, for example, nucleic acid sequences having 85% or more, preferably 90% or more, preferably still 95% or more, and even more preferably 99% or more identity hybridize, but in which two nucleic acid sequences of lower identity do not hybridize.
  • hybridization occurs at 60 ° C, at salt concentrations corresponding to 1xSSC, and 0.1% SDS, preferably 0.1xSSC and 0.1% SDS, which are usual washing conditions in Southern hybridization.
  • Hybridization can be performed according to the methods described in Current Protocols in Molecular Biology (Ed. Frederick M. Ausubel et al., 1987), or any other method known to those skilled in the art.
  • primer refers to a single-stranded nucleic acid sequence capable of acting as a starting point for the synthesis of a primer extension product, and complementary to the nucleic acid sequence to be copied. .
  • the length and sequence of the primer depends on the complexity of the nucleic acid sequence to be copied and should be such as to specifically prime the synthesis of the extension products.
  • a primer can be at least about 10, preferably at least less than 15 nucleic acids.
  • the length and the specific sequence of the primer also depend on the conditions of implementation, such as temperature, ionic strength, etc. Such a primer is suitable for amplification or sequencing of the target sequence.
  • An amplification primer does not necessarily correspond exactly to the sequence to be copied to obtain the amplification sought.
  • An amplification method suitable for the invention may be a polymerase chain reaction (PCR), a ligase chain reaction (LCR), a nucleic acid sequence-based amplification (NASBA), an amplification based on a transcription system (TAS), strand displacement amplification (SDA), QP replicase amplification, or any other method suitable for amplifying nucleic acid sequences using primer extension.
  • PCR polymerase chain reaction
  • LCR ligase chain reaction
  • NASBA nucleic acid sequence-based amplification
  • TAS transcription system
  • SDA strand displacement amplification
  • QP replicase amplification or any other method suitable for amplifying nucleic acid sequences using primer extension.
  • the amplified products can be labeled either by using labeled primers or by incorporating labeled nucleic acids.
  • the markers may be radioisotopic ( 32 P, 35 S, etc.) or non-isotopic, such as biotin or digoxigenin, or may be
  • a nucleic acid probe according to the invention may comprise a portion of a nucleic acid sequence of the invention, and be able to act as a hybridization probe for the specific detection of a nucleic acid sequence. containing a nucleic acid sequence of the invention.
  • a probe of the invention may consist of 5 to 50 nucleic acids, preferably 10 to 25 nucleic acids.
  • a probe can be attached to a solid support, that is, any substrate on which a nucleic acid probe can be coupled, provided that it retains its hybridization characteristics, and provided that the background noise hybridization remains weak.
  • a solid support that is suitable for the invention, mention may be made of a microtiter plate, a membrane, for example nylon or nitrocellulose, or a microsphere.
  • a nucleic acid probe may be modified to facilitate attachment to the carrier or enhance the efficiency of hybridization. Such modifications may consist in a coupling with different reactive groups such as aliphatic groups, NH groups Z, SH groups, carboxylic groups, or coupling with biotin or haptens.
  • a primer or a nucleotide probe of the invention capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid sequence of the invention, in particular coding for an UL82 protein, may especially consist of a nucleic acid sequence selected from SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 or SEQ ID NO 14.
  • nucleotide probes capable of hybridizing under stringent conditions to a nucleic acid sequence of the invention and having a sequence analogy of at least 90%, or even at least 95% with the nucleic acid sequences SEQ ID NO 9 to SEQ ID NO 20.
  • the invention also relates to an isolated nucleic acid sequence capable of reducing and / or suppressing and / or preventing the presence or expression and / or the activity of a nucleic acid or acid sequence. amino acids of the invention. Such a sequence may be referred to as an antisense sequence.
  • An antisense sequence may, for example, be transcribed in a target cell into RNA complementary to viral mRNA and thus block their translation into protein, according to the technique described in EP 0 140 308.
  • an antisense sequence may be introduced as such in the target cells as RNA.
  • An antisense nucleic acid sequence may be a siRNA, a miRNA, a shRNA, a hybrid sequence or a synthetic or semi-synthetic sequence.
  • an antisense sequence may be an antisense nucleic acid or oligonucleotide (ODN) sequence, including a synthetic ODN having chemical modifications of the native nucleic acids.
  • ODN oligonucleotide
  • An antisense oligonucleotide can be synthesized chemically by any method known in the art.
  • a chemically modified oligonucleotide can be prepared from a native phosphodiester structure to increase intracellular stability and binding affinity.
  • An antisense sequence can be produced by expressing all or part of a nucleic acid sequence of the invention in a suitable vector, wherein the initiation of transcription is oriented such that an antisense strand is produced as a molecule.
  • RNA Ribonucleic acid
  • An antisense sequence may generally comprise at least 7, in particular at least 12, more particularly at least about 20 nucleic acids, and not more than 500, especially not more than about 50, more particularly not more than about 35 acids. Nucleic.
  • the length of an antisense sequence is governed by various parameters known to those skilled in the art, such as the effectiveness of the inhibition, the specificity, and especially the absence of cross-reactivity, etc.
  • An amino acid sequence of the invention consists of an amino acid sequence of an UL82 protein or an UL97 protein of an HCMV strain. Such sequences are known and are available for example in the UniProt database under the references F5HBC6 (UL82) or Q5IV10 (UL97).
  • an amino acid sequence of the invention may consist of an amino acid sequence encoded by a nucleic acid sequence as defined above.
  • An amino acid sequence of an UL82 protein may consist of an amino acid sequence SEQ ID NO 3, an amino acid sequence having a sequence identity of at least 90, preferably at least 95% , and more preferably at least 99% with SEQ ID NO 3 and a biological activity similar to SEQ ID NO 3, or a fragment of SEQ ID NO 3 comprising at least 160 consecutive amino acids from SEQ ID NO 3 and a similar biological activity.
  • a fragment suitable for the invention is derived from the C-terminus, and may consist of 160 contiguous amino acids consisting of the region extending from amino acid 421 to amino acid 540.
  • amino acid numbering of the UL82 protein indicated in the text is given with respect to SEQ ID NO 3.
  • An isolated amino acid sequence of the invention and particularly a sequence of an UL82 protein or a fragment thereof, may comprise in a region extending from amino acid 421 to amino acid 540 at least one point mutation.
  • a point mutation is a mutation affecting only one amino acid, and may consist of a deletion of an amino acid, an insertion of an amino acid or a substitution of an amino acid.
  • an amino acid sequence of the invention comprises at least one point mutation selected from a substitution or an insertion.
  • an amino acid sequence of the invention can comprise at least two point mutations, and preferably comprises at most two point mutations. .
  • These point mutations can be two substitutions or a substitution and an insertion.
  • Point mutations more particularly considered by the invention may consist of an insertion of a glutamine after position 424, a substitution of an alanine with a glycine at position 507, a substitution of an arginine with a proline at position 464, and / or substitution of proline with threonine at position 539.
  • a sequence of the invention comprises at most two point mutations, these may consist of an insertion of a glutamine after position 424 (with respect to SEQ ID No. 3) and a substitution of an alanine by a glycine at position 507 (or 508 taking into account the insertion, numbering for example with respect to SEQ ID NO 5).
  • a sequence of the invention when a sequence of the invention comprises at most two point mutations, these may consist of a substitution of an arginine by a proline at position 464 and a substitution of a proline by a threonine at position 539.
  • an amino acid sequence of the invention can consist of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, or SEQ ID NO 7, and more preferably selected from SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • an amino acid sequence of the invention may consist of an amino acid sequence selected from SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • amino acid sequence of a UL97 protein may consist of an amino acid sequence SEQ ID NO 8.
  • a sequence identity of two nucleic acid sequences or two amino acid sequences can be determined visually or can be determined by any method generally implemented in the field, such as that implementing the BLAST algorithm used in software available on the Pubmed website (www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • a biological activity analogous to an amino acid sequence of the invention refers to an oncogenic activity or an ability to induce the transformation of healthy primary cells into malignant cells.
  • the evaluation of the transformation of healthy primary cells into malignant cells may in particular be carried out as detailed in the examples below, in particular by means of the soft agar gel (soft agar) test.
  • a biological activity analogous to a nucleic acid sequence of the invention refers to the ability of such a sequence to be translated into an amino acid sequence of the invention. Such an ability can be evaluated by any method known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to an expression vector, in particular isolated, comprising at least one nucleic acid sequence of the invention.
  • an expression vector of the invention may comprise a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence consisting of a sequence selected from SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, or SEQ ID NO 7, preferably selected from SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7, and more preferably selected from SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • An expression vector that is suitable for the invention may be a plasmid, a cosmid, a virus, a bacteriophage, and any other vector usually used in the field of genetic engineering.
  • a vector suitable for the invention may in particular be chosen in a non-limiting manner from a T7 expression vector for expression in a mammalian cell, and a baculovirus-derived vector for expression in mammalian cells. insects.
  • suitable expression vectors mention may be made of the plasmid pcDNA 3.3 -TOPO TA or pcDNA3.1, and preferably pcDNA3.1.
  • a nucleic acid sequence of the invention is functionally linked to regulatory elements in an expression vector of the invention, so as to allow the transcription and synthesis of an mRNA, and then the translation thereof, into prokaryotic and / or eukaryotic cells.
  • an expression vector may comprise a cassette of transcription comprising a transcription initiation element, a target nucleic acid sequence, and a transcription termination element.
  • a nucleic acid sequence to be transcribed may be operably linked to a promoter such as the T7 promoter, a metallothionein I promoter, or a polyhedrin promoter.
  • the present invention also relates to a recombinant host cell, transient or stable, in particular isolated, containing a nucleic acid sequence of the invention or an expression vector of the invention.
  • a host cell is understood as an organism having incorporated a nucleic acid sequence of the invention, in particular in vitro and, where appropriate capable of ensuring the synthesis of an amino acid sequence encoded by the acid sequence.
  • nucleic preferably, such a cell may be a prokaryotic or eukaryotic cell, for example a mammalian cell, human or non-human, a bacterial cell, an insect cell or a yeast cell.
  • a host cell of the invention may comprise a nucleic acid sequence encoding an amino acid sequence consisting of a sequence selected from SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, or SEQ ID NO 7, preferably selected from SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7, and more preferably selected from SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7.
  • an expression vector as defined above can be used to introduce a nucleic acid sequence as defined above.
  • the methods for transfection of the host cells of the invention are those usually implemented in the field. By way of examples, mention may be made of lipofectamine-based transfection methods.
  • antibody is intended to mean polyclonal, monoclonal antibodies, purified IgG, IgM, IgA antibodies, or fragments thereof, such as Fv, Fv single-stranded (scFv), F (ab) 2 fragments, Fab and F (ab) ', and chimeric or humanized antibodies.
  • An antibody of the invention may be a monoclonal antibody or may refer to a polyclonal antibody preparation having different epitopic specificities.
  • the antibodies of the invention are human antibodies.
  • an antibody of the invention can be obtained by implementing an amino acid sequence of the invention as an immunogen.
  • An amino acid sequence of the invention used as an immunogen may comprise at least 8 consecutive amino acids derived from an amino acid sequence defined above.
  • an immunogenic sequence of the invention may be derived from a sequence SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7, and more preferably selected from SEQ ID NO 6 or SEQ ID NO 7, and include at least one point mutation as defined above.
  • An immunogen can be used as is or conjugated to a carrier molecule, such as a carrier protein.
  • a carrier protein such as a carrier protein.
  • carrier proteins mention may be made of bovine serum albumin (BSA), chicken albumin, keyhole limpet hemocyanin (KLH) and tetanus toxin.
  • the present invention also relates to the use of a nucleic acid or amino acid or antibody sequence of the invention in a drug or vaccine or diagnostic kit.
  • a cancer considered by the invention may be chosen from breast cancer, head and neck, liver, ovary, pancreas, prostate, kidney, skin, testis, lung cancer. , cervix, brain, medulloblastoma, glioblastoma, and preferably may be cancer of the breast, liver, prostate or brain, and more preferably is breast cancer.
  • cancer treatment is intended to refer to a treatment intended to stabilize, reduce, eliminate, prevent and / or cure cancer.
  • a vaccine of the invention may be intended to induce an immune response, in a human individual, and preferably a woman, to prevent and / or treat carcinogenesis or cancer induced by infection with an oncogenic HCMV strain. , and in particular a strain AD 169 or DB.
  • a vaccine of the invention comprises a nucleic acid or amino acid sequence of the invention capable of inducing an immune response against an oncogenic HCMV strain.
  • a vaccine can also be useful for the treatment of an individual, in which case it is called a therapeutic vaccine.
  • a drug or vaccine of the invention may be formulated with any pharmaceutically acceptable carrier or diluent, and may be prepared in any dosage form suitable for the mode of administration adopted, such as a solid, semi-solid, liquid or gas form. , and especially in the form of tablets, capsules, powders, granules, emulsions, suspensions, gels, microspheres, etc.
  • a drug or vaccine of the invention of the invention may be in an oral dosage form, such as a tablet, capsule, pill, powder, granules, elixir, tincture, solution, suspension , a syrup or an emulsion.
  • a drug or vaccine of the invention may also be in injectable dosage form.
  • the nucleic acid or amino acid sequences can then be formulated as is or formulated with different vehicles, such as liposomes or transfection or intracellular delivery polymers.
  • an acceptable pharmaceutical carrier there may be mentioned, for example, water, buffered water, a 0.4% saline solution, or 0.3% glycine, physiological saline, glycerol, ethanol hyaluronic acid, proteins, polysaccharides, polylactic acids, glycolic acids, amino acids, or inactive viral particles.
  • a drug or vaccine of the invention may be sterilized by well-known sterilization techniques, or may be sterile filtered.
  • the resulting aqueous solutions can be used as is, or be freeze-dried.
  • a lyophilized preparation can then be combined with a sterile solution prior to administration.
  • a drug or vaccine of the invention comprises nucleic acid or amino acid sequences necessarily in an effective amount.
  • An effective amount is an amount of nucleic acid or amino acid sequences that alone, or with additional cumulative doses, can result in the desired response.
  • An effective amount may depend on various factors, such as the route of administration, whether the administration is in single or multiple doses, and the parameters of each patient including age, physical condition, height, weight, sex, and the stage of the sickness. These factors are well known to those skilled in the art and can be treated with no more than routine experimentation.
  • a drug or vaccine of the invention may be administered by any suitable route, such as orally, orally, rectally, parenterally, intraperitoneally, intradermally, transdermally, intratracheally, etc.
  • a drug or vaccine of the invention may preferably be administered by injection, such as intraperitoneal, intradermal, subcutaneous or intramuscular intravascular, or mucosally, or a combination of both.
  • Any mucosal route can be used, such as the vaginal route, the rectal route, the respiratory tract, or the nasal route.
  • kits of the invention may comprise all the elements and reagents for carrying out the various methods for determining the nucleic acid and amino acid sequences of the invention detailed below.
  • kit may comprise at least one nucleic acid sequence of the invention, a nucleotide primer of the invention, a nucleotide probe of the invention, an amino acid sequence of the invention, and / or an antibody. of the invention.
  • nucleic acid and amino acid sequences of the invention are particularly suitable for use as a biomarker.
  • the term “determine” refers to a qualitative evaluation and / or a quantitative detection.
  • control determination refers to a determination of a parameter under negative or positive conditions.
  • a negative control of the invention can be obtained by using a non-oncogenic HCMV strain, such as TB40-E and TB40-F strains, or a heat-inactivated strain of HCMV, for example 100 ° C for 10 minutes. min.
  • a positive control of the invention it is possible to use an oncogenic HCMV strain, such as HCMV-DB and HCMV-AD169 strains.
  • a negative control or negative reference determination may be obtained by determining the presence or level of expression of a nucleic acid or amino acid sequence of the invention in a set of individuals presumed not to have cancer and / or presumed not to be infected with an oncogenic HCMV, or in healthy or presumed healthy tissue and / or presumed not to be infected with oncogenic HCMV.
  • control or reference determination is not necessarily carried out simultaneously with the determination in the individual to be tested, it may be a historical determination, made previously, and stored on a suitable support, for example on a server or a hard disk, in a computer database.
  • Determination of the presence or level of expression or activity of an amino acid or nucleic acid sequence of the invention may be performed in a biological sample.
  • a biological sample can be isolated and can be obtained from an individual presumed to be affected by cancer, including breast or liver cancer, or from an individual presumed to be affected by a human cytomegalovirus infection, especially oncogenic.
  • HCMV UL97 and UL82 (pp71) proteins A significant increase in the HCMV UL97 and UL82 (pp71) proteins is observed in permissive eukaryotic cells, for example HuMEC cells, infected with oncogenic HCMV-DB and HCMV-AD169 strains. On the contrary, this increase is not observed in permissive eukaryotic cells infected with non-oncogenic HCMV strains, for example TB40E and TB40F.
  • a strain of HCMV is characterized as being oncogenic as is the case for the strains DB and AD 169, and these strains can be called HCMV, high protein strains UL82 and / or UL97 high.
  • a strain of HCMV is characterized as being non-oncogenic, as is the case for the TB40-E and TB40-F strains, and these strains of HCMV, low protein strains UL82, can be called and / or UL97 weak.
  • Determination of the level of expression of UL97 and UL82 proteins in HCMV-infected permissive eukaryotic cells may allow the characterization of HCMV strains with high, low or no oncogenic potency and may serve as a diagnostic, prevention and follow-up tool. infected individuals, including individuals with breast cancer, but potentially also for other organs (ovaries, liver, brain ).
  • the determination of a presence or a level of expression or of an activity of at least one nucleic acid or amino acid sequence may be carried out by a method chosen from mass spectrometry such as LC -MS, GC-MS, chromatographic separations such as single or 2-D gel separations, binding assays such as immunoassays or hybridization, enzymatic assays such as ELISA or inhibition assays competitive.
  • a determination may in particular be carried out by a method chosen from Western blot, immuno-ELISA, fluorescence microscopy, flow cytometry, direct sequencing, gel electrophoresis, column chromatography, transfer of Northern or Southern, by PCR, RT-PCR or quantitative PCR.
  • the presence or level of expression or activity of at least one nucleic acid sequence can be determined by a method chosen from direct sequencing, gel electrophoresis and column chromatography. , Northern or Southern blot, PCR, RT-PCR or quantitative PCR.
  • a detectable label may be included in an amplification reaction.
  • a marker suitable for the invention may be chosen from fluorochromes, such as fluorescein isothiocyanate, rhodamine or Texas Red ® .
  • a marker may be a two-entity system having an affinity for each other. For example, an amplified nucleic acid sequence is conjugated to biotin having a high affinity for avidin that can be labeled with a directly detectable entity.
  • a marker may be conjugated to one or both primers.
  • a mixture of nucleotides used for amplification can be labeled to incorporate a marker in the amplification product.
  • a nucleic acid sequence may be detected by any method of hybridizing the desired sequence with a nucleic acid probe labeled with a radioisotope, fluorescent or enzymatic label.
  • a method for detecting hybrids formed between a nucleic acid probe and a desired nucleic acid sequence may be a dot-blot method, sandwich hybridization, or reverse hybridization.
  • a determination may use staining of cells or histological sections, performed according to conventional methods.
  • a determination of a presence or level of expression or activity of at least one amino acid sequence of the invention may include extracting a sequence from a cell or a tissue sample, then binding by a specific labeled probe, for example an antibody, and in particular an antibody of the invention, and the detection of the probe .
  • the label may be a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme, or an enzymatic substrate.
  • a determination of the presence or level of expression or activity of at least one amino acid sequence of the invention can be carried out by gel electrophoresis or column chromatography. .
  • a determination can be made by a Western-blot method comprising one or two-dimensional gel migration, then optionally transfer to a blotter, and revealing the amino acid sequence with an entity able to specifically bind to this one and to be detected.
  • a determination of a presence or level of expression or activity of at least one amino acid sequence of the invention may be performed by methods involving affinity binding between an entity, for example an antibody, preferably an antibody of the invention, and the sequence to be detected.
  • entity may be added to a biological sample and allowed to incubate for a period of time sufficient to allow binding between the entity and the amino acid sequence, for example, at least about 10 minutes.
  • entity may be labeled with a radioisotope, an enzyme, a fluorescent molecule, a chemiluminescent molecule, or any other label suitable for direct detection.
  • a second entity having an affinity for the first entity for example a secondary antibody
  • a secondary antibody can be used to amplify the signal.
  • reagents are well known in the art.
  • a primary antibody may be conjugated to biotin, and horseradish peroxidase-conjugated avidin may be added as a second-stage reagent.
  • the final detection may use a substrate that undergoes a color change in the presence of peroxidase.
  • a secondary antibody coupled to a fluorescent label or a radioisotope may also be used.
  • the absence or presence or quantification of the labeled primary or secondary entity can then be performed by any method known in the art, such as flow cytometry, fluorescence microscopy, radiography, scintillation counter. etc.
  • a sandwich method comprises binding a first antibody, particularly an antibody of the invention, specific for an amino acid sequence of the invention to an insoluble support. Then incubation of the carrier carrying the antibody with a presumed sample comprises an amino acid sequence of the invention, and a step incubation in the presence of a second antibody, in particular an antibody of the invention, specific for an amino acid sequence of the invention linked to the first antibody.
  • the incubation times must be sufficient to allow the desired bonds, and may vary, generally, from 0.1 to 3 hours. Wash steps may be provided between each incubation step with one of the aforementioned entities.
  • the second antibody may carry a marker for its detection, such as a radioactive isotope, such as iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 112 In), an enzymatic label, such as glucose oxidase, a fluorescent label, such as rhodamine, an affinity tag such as biotin, or chemiluminescent molecules.
  • a radioactive isotope such as iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 112 In)
  • an enzymatic label such as glucose oxidase
  • a fluorescent label such as rhodamine
  • an affinity tag such as biotin, or chemiluminescent molecules.
  • a method of the invention may be adapted for in vivo implementation.
  • a detectably labeled entity that is a specific amino acid sequence of the invention for example an antibody of the invention, is administered to an individual, for example by injection, and the labeled cells are located using imaging techniques, such as magnetic resonance imaging, computed tomography, etc.
  • the determination of a presence or a level of expression or an activity of at least one amino acid sequence can be carried out by detection of the amino acid sequence or of an antibody directed against this amino acid sequence.
  • a preferred method suitable for the invention may be an ELISA test, for example implementing an antibody bound to a solid support, for example a polystyrene microtiter plate or nitrocellulose paper.
  • An antibody used to detect an amino acid sequence of the invention may be an antibody of the invention labeled with a radioactive isotope, such as iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 112 In), an enzymatic label, such as glucose oxidase, a fluorescent label, such as rhodamine, or an affinity tag such as biotin.
  • a radioactive isotope such as iodine ( 125 I, 121 I), carbon ( 14 C), sulfur ( 35 S), tritium ( 3 H), indium ( 112 In)
  • an enzymatic label such as glucose oxidase
  • a fluorescent label such as rhodamine
  • affinity tag such as biotin.
  • a method for determining for determining a risk of carcinogenesis in an individual in need thereof, or for determining a prognosis of a cancer in an individual suffering from said cancer may be a method comprising at least the steps of:
  • step a- cultivating infected cells in step a- in a basal layer of soft agar, and c- determining the presence or absence of soft agar cell colonies.
  • step c- The presence of cell colonies determined in step c- is indicative of a risk of carcinogenesis.
  • Permissive eukaryotic cells suitable for the invention may be HMEC cells.
  • the cells can be infected with a multiplicity of infection (MOI) of 1 to 10.
  • MOI multiplicity of infection
  • soft agar assay As an example of a soft agar medium (soft agar assay), mention may be made of the commercial agent CytoSelect 96-well cell transformation assay kit by CELL BIOLABSINC.
  • the cells deposited in the agar cell layer may have a number of between 0.4 and 4 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the infected cells can be added to the basal layer of agar at day 1 after, or even at day 13, or at day 33.
  • the appearance of cell colonies in soft agar can be observed between 6 and 8 days after seeding. Observation can be done using a white light optical microscope at a magnification of 10X to 40X.
  • permissive eukaryotic cells in particular HuMEC, infected with non-oncogenic HCMV strains, such as strains HCMV-TB40E and HCMV-TB40F, or infected with strains of HCMV inactivated at 100 ° C. for 10 min, can be used as negative control.
  • non-oncogenic HCMV strains such as strains HCMV-TB40E and HCMV-TB40F
  • strains of HCMV inactivated at 100 ° C. for 10 min can be used as negative control.
  • cells infected with oncogenic HCMV strains such as the HCMV-DB and HCMV-AD169 strains, or oncogenic cell lines known to cause the formation of soft agar colonies, such as HeLa and MCF-7.
  • a method of the invention may further comprise a step of quantifying cell proliferation in soft agar.
  • the soft agar cell proliferation in the absence of adhesion corresponds to the cellular transformation.
  • Such a step can be performed by removing the culture medium that is on the surface of the soft agar containing the cell colonies, and then solubilizing the agar to recover the cell colonies. Those- They can be lysed and brought into contact with a reagent, for example coupled to a fluorochrome, making it possible to quantify cells.
  • One method of the invention makes it possible to demonstrate the transformation of primary mammary epithelial cells by certain so-called oncogenic HCMV strains.
  • strains of HCMV that do not transform permissive eukaryotic cells are considered non-oncogenic.
  • a biological sample for isolating these strains can be of any type, especially as defined above, and in particular be milk, urine and blood.
  • a method of the invention may constitute a tool for the diagnosis, prevention and monitoring of infected individuals, especially patients, and in particular those with breast cancer, but potentially also for cancer affecting other organs. , such as the ovaries, the liver, or the brain.
  • step b- determine the gene expression of the cells infected in step a-, and c- compare the gene expression determined in step b- with the gene expression of basal / myoepithelial breast cancer cells or the expression of HCMV-permissive eukaryotic cells infected with an oncogenic HCMV strain.
  • Permissive eukaryotic cells may be HuMEC cells.
  • the basal / myoepithelial cancerous breast cells may be, for example, MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-20, HCC-1937, or Hs578T cells.
  • An oncogenic HCMV strain can be HCMV-DB and HCMV-AD169.
  • the gene expression of the cells can be carried out by any method known to those skilled in the art, and in particular by "Breast Cancer MicroArray” (BCA).
  • BCA Breast Cancer MicroArray
  • non-oncogenic HCMV strains such as HCMV-TB40E and HCMV-TB40F, or inactivated HCMV strains can be used. at 100 ° C for 10 min.
  • HCMV-DB and HCMV-AD169 strains can be used as a positive control.
  • Gene expression of infected cells similar to basal / myoepithelial cancer cell gene expression or cells infected with an oncogenic HCMV strain may be indicative of the oncogeneity of the HCMV strain tested.
  • the strain of HCMV may be an HCMV strain isolated from an individual suffering from a cancer, and in particular from an individual suffering from breast cancer.
  • a strain of HCMV to be tested can be isolated from breast milk, urine, blood or any other body fluid.
  • Such a method can also be used for prognosis, diagnosis, determination of a risk of carcinogenesis, prevention or follow-up of individuals infected with a strain of HCMV, including individuals with breast cancer, but potentially also for other organs (ovaries, liver, brain ).
  • this approach classifies an individual in whom the strain of HCMV has been isolated as at risk or not breast cancer and can suspect the type of breast cancer involved, basal-like cancers being bad prognosis and requiring even more early detection and close monitoring.
  • Permissive cells may be HuMEC cells.
  • An oncogenic HCMV strain can be selected from HCMV-DB and HCMV-AD169.
  • permissive cells infected with a strain of non-oncogenic HCMV selected from HCMV-TB40E and HCMV-TB40F, or an inactivated strain of HCMV at 100 ° C. for 10 min.
  • Cancerous breast cells suitable for the method may be as defined above.
  • the determination of the expression of the BRCA1 protein in HCMV-infected permissive eukaryotic cells may allow the detection of HCMV strains with high, low or no oncogenic potency and can be used for prognosis, diagnosis, determination of risk of carcinogenesis, prevention or monitoring of individuals infected with a strain of HCMV, including individuals with breast cancer, but potentially also for other organs (ovaries, liver, brain ).
  • this approach can be used to classify the individual in whom the strain of HCMV was isolated as at risk or not breast cancer (and potentially ovarian) and may allow to suspect a type of breast cancer involved , basal-like cancers have a poor prognosis and require even more early detection and close monitoring.
  • ECP cytopathic effect
  • MOI HCMV infection
  • HMECs infected with HCMV-DB and HCMV-AD169 oncogenic strains have a triple negative profile (negative for estrogen receptors, for progesterone receptors and negative for HER2), which is one of the hallmarks of cancers. breast type "basal-like".
  • the entire UL97 gene of the 2124 bp strain HCMV DB is amplified by simple PCR.
  • Figure 12A, B & C Illustrations of the nucleic acid and amino acid sequences considered in the invention.
  • HuMEC cells primary mammary epithelial cells
  • MCF7 primary mammary epithelial cells
  • MDA-MB-231 MDA-MB-231 and HeLa were obtained by ATCC. The cells were cultured in HuMEC medium.
  • the HCMV-DB clinical isolate was isolated from a cervical sample of a pregnant 30-year-old woman (Khan et al., J Immunol 2009; 182: 7784-7794).
  • the strain of HCMV TB40-E has a tropism for endothelial cells as well as for macrophages.
  • the TB40-F strain is derived in the laboratory from the strain TB40E after numerous passages of this strain in fibroblast cell culture.
  • Virus titers were determined by plaque formation assay in MRC5 human fibroblasts as described by Arrode et al. (J Virol, 2002; 76: 142-150). Proliferation of cells
  • HuMEC, MCF7 and HeLa cells were left uninfected or infected with a CMV strain. Proliferation was measured using the MTT cell proliferation test kit (Cayman Chemical # cat 10009365) and the measurement of Ki67 Ag intracellular antigen by flow cytometry, as described by (Sharma et al., Hepatology, 2010; : 1713-1722).
  • Soft agar gel culture (soft agar)
  • HuMEC cells are infected with HCMV and at day 1 after infection the cells are seeded in a soft agar medium (CytoSelect 96-well cell transformation assay kit, CELL BIOLABSINC).
  • the preparation of a basal layer of agar is done according to the recommendations of the manufacturer.
  • the agar cell layer containing HMEC cells infected with HCMV, uninfected HuMEC cells, or HeLa and MCF-7 cell lines is made according to the manufacturer's recommendations.
  • the cells deposited in the agar cell layer have a number of between 0.4 and 4 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • HuMEC cells infected with HCMV (usually a MOI of 1 to 10 is used) are added to the basal agar layer at day 1 after infection, or, depending on the case, by seeding infected HuMEC cells for 13 days or 33 days. .
  • the appearance of colonies in soft agar is usually observed between 6 and 8 days after inoculation using a white light optical microscope at a magnification of 10X to 40X.
  • the quantification of soft agar cell proliferation in the absence of adhesion (which corresponds to the cellular transformation) is then performed by removing the culture medium which is on the surface of the soft agar containing the cell colonies, followed by solubilization of the agar which makes it possible to recover the cell colonies. These were then lysed and contacted with a fluorochrome coupled reagent to quantify cells that proliferated to soft agar with the aid of a fluorometer at a wavelength of 485/520 nm, such as indicated above. These results are represented as a histogram (OD).
  • the total DNA was extracted and purified using a QIAamp kit (Qiagen, Valencia, CA) according to the manufacturer's recommendations.
  • the breast biopsy cell lysates were mixed with 300 ⁇ l of proteinase K (0.2 mg / ml) in compound buffer 100 mM. NaCl, 10 mM Tris-Cl, 25 mM EDTA, and 0.5% SDS (H 8.0). After incubation at 55 ° C for 3 hours, the DNA was extracted twice in phenol / chloroform (vol / vol) and then precipitated in ethanol. The DNA was dissolved in 20 ⁇ l of TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA).
  • the first PCR was performed from a volume of 50 ⁇ containing 1.5 ⁇ l of each of the external primers (10 mM), 2 U of Taq DNA polymerase, and 200 ng of DNA extract to be tested.
  • the UL82 external primers used are as follows:
  • the entire UL82 gene was amplified by PCR using the following primers: sense primer: 5'-CGGGATCCATGTCTCAGGCATCGTCCTCG-3 '(SEQ ID NO
  • Antisense primer 5 '-CGGAATTCCTAGATGCGGGGTCGACTGC-3' (SEQ ID NO: 1
  • restriction sites BamH1 and ECoR1 present respectively, in order to amplify a 1680 bp fragment.
  • PCR was performed as follows. After initial denaturation at 94 ° C for 2 min, 35 amplification cycles were performed at 94 ° C for 30 sec, 60 ° C for 30 sec, 68 ° C for 1.5 min, in a 50 ⁇ mixture containing 2 ⁇ 1 (10 mM) of each of the primers and 1 U Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen USA).
  • the first PCR was carried out from a volume of 50 ⁇ l containing 2 ⁇ l of each of the external primers (10 mM), 1 U of Taq DNA polymerase, and 200 ng of DNA extract to be tested.
  • the UL97 external primers used are as follows:
  • Antisense primer 5'- GCGAATTCTTACTCGGGGAACAGTTGACG -3 '(SEQ ID NO: 1
  • the complete UL97 gene was amplified by PCR using the following primers: sense primer: 5'-CCAAGCTTATGTCCTCCGCACTTCGGTCT -3 '(SEQ ID NO 19)
  • Antisense primer 5'- GCGAATTCTTACTCGGGGAACAGTTGACG -3 '(SEQ ID NO: 1
  • PCR was performed as follows. After an initial denaturation at 94 ° C.
  • HuMEC cells are brought to confluence in T25 or T75 flasks in HuMEC culture medium. These confluent cells are then infected with the HCMV-DB strain (Khan KA et al., Journal of Immunology 2009, 182: 7784-7794) and the HCMV-AD169 strain (Murphy ED et al., PNAS 2003, 100: 14976-14981 ) at a "multiplicity of infection" (MOI) of 1 or 10 overnight, followed by intensive overnight washing with PBS and addition of fresh HuMEC medium. Viral replication is then monitored as a function of time by measurement in culture supernatants and cell lysates of the HCMV viral load using a quantitative PCR technique (qPCR) (Khan2009).
  • qPCR quantitative PCR technique
  • ECP cytopathic effect
  • HuMEC cells are brought to confluence in T25 or T75 flasks in HuMEC culture medium. These confluent cells are then infected with the HCMV-DB strain (Khan KA et al., Journal of Immunology 2009, 182: 7784-7794) at a "multiplicity of infection” (MOI) of 10 overnight, followed by extensive overnight washing with PBS and addition of fresh HuMEC medium.
  • MOI multiplicity of infection
  • ECP cytopathic effect
  • results obtained shown in FIG. 2 demonstrate an active replication of HCMV in HMEC primary breast cells with the appearance of a typical HCMV ECP consisting of enlarged and refractile cell foci, slowly extending foci in the culture medium. .
  • the soft agar test directly tests the induction of oncogenesis of HuMEC human primary breast cells after exposure to HCMV.
  • the formation of soft agar gel cell colonies is an anchorage-independent growth test, and is considered the most rigorous test for detecting malignant transformation of cells.
  • HuMEC cells are infected with HCMV and at day 1 after infection the cells are seeded in a soft agar medium (CytoSelect 96-well cell transformation assay kit, CELL BIOLABSINC).
  • a basal layer of agar is done according to the recommendations of the manufacturer.
  • the agar cell layer containing HCMV-infected HMEC cells, uninfected HMEC cells, or HeLa and MCF-7 cell cells is made according to the manufacturer's recommendations.
  • the cells deposited in the agar cell layer have a number of between 0.4 and 4 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • HMEC cells infected with HCMV (usually a MOI of 1 to 10 is used) are usually added to the basal agar layer on day 1 after infection.
  • the appearance of colonies in soft agar is usually observed between 6 and 8 days after inoculation using a white light optical microscope at a magnification of 10X to 40X.
  • the quantification of soft agar cell proliferation in the absence of adhesion (which corresponds to the cellular transformation) is then performed by removing the culture medium which is on the surface of the soft agar containing the cell colonies, followed by solubilization of the agar which makes it possible to recover the cell colonies. These will then be lysed and a fluorochrome-coupled reagent will quantify the cells that have proliferated to soft agar with the aid of a fluorometer at a wavelength of 485/520 nm. These results are represented as a histogram (OD).
  • FIG. 3 demonstrate the transformation of the primary mammary epithelial cells by certain so-called oncogenic HCMV strains. In contrast, strains of HCMV that do not transform HuMEC cells are considered non-oncogenic.
  • HuMEC cells were cultured in a soft agarose gel for 21 days.
  • appropriate controls uninfected HuMEC Figure 3A, HuMEC infected with heat-inactivated HCMV, Figure 3B Heat-in, as negative controls, MCF7 and HeLa as positive controls, Figure 3C were performed.
  • BCA Breast Cancer microArray
  • HuMECs infected with HCMV-DB and HCMV-AD169 oncogenic strains have a triple negative profile (negative for estrogen receptors, for progesterone receptors and negative for HER2), which is one of the hallmarks of cancers. breast type "basal-like”.
  • Figure 5 indicate that by infecting primary mammary epithelial cells with an HCMV strain isolated from a patient and when the lysate of these infected cells is tested by a microarray targeting genes modulated in breast cancer (BCA) , will be able to determine if this strain has a potential oncogenic risk or not.
  • the HCMV strain may be isolated from breast milk, urine, blood or any other body fluid.
  • HuMEC cells are infected with oncogenic HCMV strains, HCMV-DB and HCMV-AD169, or non-oncogenic HCMV strains HCMV-TB40E and HCMV-TB40F, and then the expression of BRCA1 is determined.
  • anti-tumor BRCA1 protein is decreased in HMEC cells infected with HCMV-DB and HCMV-AD169 oncogenic strains, but not significantly in HMEC cells infected with non-oncogenic strains HCMV-TB40E and HCMV -TB40F. It should be noted that a decrease in the expression of BRCAl and / or a BRCA1 mutation is observed almost constantly in "basal-like" type breast cancers, whether familial or sporadic.
  • HCMV proteins UL97 and UL82 makes it possible to discriminate between oncogenic and non-oncogenic HCMV strain.
  • HCMV UL97 and UL82 (pp71) proteins A significant increase in the HCMV UL97 and UL82 (pp71) proteins is observed in HuMEC cells infected with the HCMV-DB and HCMV-AD 169 oncogenic strains. On the contrary, this increase is not observed in the HuMEC cells infected with the strains. non-oncogenic HCMV TB40E and TB40F.
  • the UL97 and UL82 proteins have been described as inactivating the antitumor protein Rb (retinoblasoma) by phosphorylating it and promoting its cellular degradation in the 26S proteasome. Inactivation of the Rb protein is also observed with another oncogenic virus such as the oncogenic papillomavirus.
  • Sequences from the UL82 and UL97 genes have been identified making it possible to amplify all of these genes and / or an internal sequence of these genes.
  • the entire UL97 gene of the 2124 bp strain HCMV DB is amplified by simple PCR.
  • nested PCR detection of the 208 bp internal fragment of the UL82 gene in nucleic acid extracts from breast cancer biopsies from 5 patients was performed.
  • Nucleic acid extracts were obtained from tumor (T) or macroscopically healthy tissue adjacent to the tumor area (S) from breast biopsies of 5 breast cancer patients.
  • Nested PCR was performed to detect an amplified 208 bp fragment corresponding to UL82 gene as well as the beta-actin gene serving as internal control.
  • the HCMV UL82 gene was detected either only in the tumor zone extracts (patients 3 and 4), or both in the tumor zone and the adjacent macroscopically healthy zone (patients 2 and 5). ).
  • Figure 10 shows a table summarizing all the histological data
  • the mutations at the C-terminus of the UL82 protein, from amino acid 420 to amino acid 540 (in bold in the table), are present only in the sequences of oncogenic HCMV strains DB and AD 169 and not at the non-oncogenic strains HCMV TB40E and TB40F.

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Description

CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN ONCOGENIQUE
La présente invention a pour objet, notamment, des séquences d'acides nucléiques et des séquences d'acides aminés isolées et issues d'un cytomégalovirus humain, et leur utilisation comme biomarqueur, actif thérapeutique ou cible thérapeutique, à l'égard du cancer, et plus particulièrement du cancer du sein.
Le terme « cancer » définit un grand groupe de maladies différentes, toutes impliquant une croissance cellulaire non régulée. Dans le cancer, les cellules d'un tissu se divisent et se développent de manière incontrôlée, conduisant à la formation de tumeurs malignes, et éventuellement à l'invasion de tissus ou organes voisins ou éloignés, par le biais du système lymphatique ou de la circulation sanguine, et à la formation de métastases.
Le cancer du sein (ou tumeur maligne du sein) est un type de cancer provenant de tissus mammaires, le plus souvent de la paroi interne des canaux galactophores ou des lobules qui approvisionnent les conduits en lait. Bien que l'écrasante majorité des cancers du sein chez les humains affectent les femmes, certains hommes peuvent également en être affectés. Dans le monde, le cancer du sein constitue environ 20 % des cancers (hors cancers cutanés non- mélanomes) chez les femmes, et plus d'un cancer sur trois chez la femme en France.
Le cancer du sein, comme la plupart des cancers, comprend un ensemble de tumeurs hétérogènes avec des caractéristiques cliniques, des évolutions pathologiques, et des réponses thérapeutiques très différentes. Ainsi, les caractéristiques intrinsèques des tumeurs, tels que ces caractères histologiques, immunopathologiques, ou moléculaires conduisent à classer les tumeurs du sein en différents groupes au pronostic souvent différents. Egalement, les caractéristiques extrinsèques des tumeurs, tels que le microenvironnement, peuvent impacter le pronostique des tumeurs du sein (Bertos & Park, J Clin Invest, 2011, 121 :3789- 3796).
Le pronostic et le taux de survie peuvent varier dans de larges proportions selon le type de cancer, le stade, et la stratégie de traitement adoptée.
Ainsi, une meilleure compréhension des caractéristiques sous-jacentes à la carcinogénèse, à l'hétérogénéité des cancers, et notamment des cancers du sein, ainsi que des mécanismes et de leur étiologie, est essentielle pour améliorer les stratégies de traitement, développer de nouvelles thérapies, et améliorer le pronostic vital des patients.
De nombreux facteurs sont connus pour augmenter le risque de carcinogénèse, tel que l'usage du tabac, certaines radiations, le manque d'activité physique, une mauvaise alimentation, l'obésité, les polluants environnementaux, certaines infections, notamment par virus.
Les virus oncogéniques ou virus à propriété ou caractère oncogène sont des virus dotés de la propriété d'induire, chez certains individus, et ce parfois plusieurs années après l'infection initiale, différentes tumeurs. Certains virus deviennent oncogéniques quand ils persistent après l'infection sous forme épisomique se répliquant séparément de la cellule hôte, comme le virus d'Epstein-Barr ou le virus de l'herpès associé au sarcome de Kaposi. D'autres, comme le polyomavirus et les papillomavirus, ne sont cancérigènes que lorsqu'ils s'intègrent dans le génome de la cellule hôte, par exemple à la suite d'un accident biologique. Le caractère oncogène de certains virus impliquent des voies d'action directes, telle que l'insertion de gènes oncogéniques viraux dans la cellule hôte ou l'augmentation de l'activité de gènes oncogéniques (proto-oncogènes) existant dans le génome de la cellule hôte. D'autres virus manifeste leur oncogénicité par induction d'une inflammation chronique non spécifique, comme c'est le cas pour le cancer du foie induit par le virus de l'hépatite C.
Les principaux virus associés aux cancers chez l'homme sont le papillomavirus humain, les virus de l'hépatite B et de l'hépatite C, le virus d'Epstein-Barr, le virus humain T- lymphotrope (HTLV), le virus de l'herpès associé au sarcome de Kaposi (KSHV) et le polyomavirus à cellules de Merkel.
Bien que le lien entre infection par le cytomégalovirus humain (HCMV) et cancer soit étudié depuis longtemps, il n'est pas reconnu, à ce jour, de propriétés oncogènes propres au cytomégalovirus humain (Human Cytomégalovirus ou HCMV) (Michaelis et ah, Neoplasia, 2009, 11 : 1-9).
Le cytomégalovirus humain (Human Cytomégalovirus ou HCMV) est un virus de l'herpès, ubiquitaire, qui affecte une large partie de la population adulte et qui provoque des infections latentes, asymptomatiques, chez les individus en bonne santé. La fréquence d'infection varie de 50 à 100 % dans la population adulte générale. En revanche, il peut provoquer des états pathologiques sévères et souvent fatals, chez les individus immunodéprimés.
Des études histologiques et immunohistochimiques ont démontré la présence de cellules infectées par ce virus dans pratiquement tous les organes. Ce virus peut cibler, in vivo, une grande diversité de types cellulaires, tels que les macrophages, les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les fibroblastes, les cellules stromales, les cellules neuronales, les cellules musculaires lisses, et les hépatocytes. Les monocytes du sang et les macrophages tissulaires sont considérés comme servant de cible cellulaire dans les organes infectés et joueraient le rôle de disséminateur viral dans l'organisme ou de réservoir pour le HCMV latent.
De manière surprenante, les inventeurs ont identifiés, comme détaillé dans les exemples ci-après, que certaines souches de HCMV, notamment les souches DB et AD 169, sont dotées de propriétés oncogéniques propres et sont aptes à transformer, après infection, des cellules primaires saines, notamment des cellules humaines épithéliales mammaires primaires (ou HuMEC, Human Mammary Epithelial Cells), en cellules malignes. Egalement, les inventeurs ont identifiés que les gènes UL82 et UL97, leur produits d'expression et notamment le niveau d'expression de ces derniers, sont impliqués dans le caractère oncogénique des souches HCMV oncogènes.
Ainsi les inventeurs ont identifié que le niveau d'expression des protéines UL82 et UL92, et/ou que des mutations, comme détaillées dans les exemples, au niveau de l'extrémité C-terminale de la protéine UL82, dans la région s'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540, sont impliqués dans le caractère oncogène des HCMV oncogéniques. Les inventeurs ont déterminés que des mutations dans l'extrémité C-terminale de la protéine UL82 ne sont présentes que dans les séquences des souches HCMV oncogéniques DB et AD 169 et non au niveau des souches non-oncogéniques HCMV TB40E et TB40F. Enfin, les inventeurs ont déterminé que les protéines UL97 et UL82, décrites par ailleurs comme inactivant la protéine anti-tumorale Rb (rétinoblasome) en la phosphorylant et en favorisant sa dégradation cellulaire dans le protéasome 26S, sont exprimées en quantité plus importantes au sein de cellules permissives infectées par les souches oncogéniques que par les souches non- oncogéniques.
Ainsi, selon un premier objet, la présente invention concerne l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer une propriété oncogénique chez un HCMV.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer un risque de carcinogénèse ou pour évaluer un pronostic d'un cancer.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne l'utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV pour déterminer un risque de carcinogénèse ou pour évaluer un pronostic d'un cancer, ladite protéine UL82 comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion.
Selon un mode de réalisation préférée, la carcinogénèse ou le cancer est une carcinogénèse ou un cancer du sein ou du foie, et de préférence encore une carcinogénèse ou un cancer du sein.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminés 421 à l'acide aminé 540 au moins une mutation ponctuelle.
Selon un mode de réalisation préféré, une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche d'HCMV code pour une séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence consistant en SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une amorce nucléotidique, notamment isolée, consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention, ladite amorce convenant spécifiquement au séquençage ou à l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention, ladite amorce nucléotidique étant une séquence consistant en une des séquences SEQ ID NO 9 à 20.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une amorce nucléotidique, notamment isolée, consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite amorce convenant spécifiquement au séquençage ou à l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite séquence d'acides aminés étant une séquence consistant en SEQ ID N05, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une sonde nucléotidique, notamment isolée, consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention, ladite sonde étant une sonde d'hybridation pour détecter spécifiquement une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention, ladite sonde nucléotidique étant une séquence consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 9 à 20.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une sonde nucléotidique, notamment isolée, consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite sonde étant une sonde d'hybridation pour détecter spécifiquement une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite séquence d'acides aminés étant une séquence consistant en SEQ ID N05, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un vecteur d'expression, notamment isolé, comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention, de préférence d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite séquence d'acides aminés étant une séquence consistant en SEQ ID N05, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une cellule hôte, notamment isolée, transfectée avec un vecteur d'expression de l'invention.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une séquence d'acides aminés isolée d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminés 421 à l'acide aminé 540 au moins une mutation ponctuelle.
Selon un mode de réalisation préféré, une séquence d'acides aminés isolée d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Selon un mode de réalisation préféré, une séquence d'acides aminés isolée d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un anticorps apte à se lier spécifiquement à une séquence d'acides aminés de l'invention.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un biomarqueur pour évaluer une propriété oncogénique d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, ledit biomarqueur consistant en une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV ou en une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un biomarqueur pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, ledit biomarqueur consistant en une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite protéine UL82 comprenant dans une région s 'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion.
Ranganathan et al. (Journal of Virology 201 1 , vol.86, no 2 : 854-864) décrit que l'expression de certains loci du HCMV est plus fréquemment associée au glioblastome multiforme (GBM) que dans d'autres atteintes cérébrales. Parmi l'ensemble des loci testés, seuls UL96, US 1 1 et US28 s'avèrent pouvoir permettre de discriminer de manière effective entre un cerveau atteint de GBM et un cerveau atteint d'une autre tumeur ou d'épilepsie. UL82 et UL 97 ne sont pas validés comme permettant pas de distinguer statistiquement, de manière efficace, entre un cerveau atteint de GBM et un cerveau atteint d'une autre tumeur ou par une épilepsie.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un kit de diagnostic contenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention, ou au moins une séquence d'acides aminés isolée de l'invention, au moins une amorce nucléotidique de l'invention, au moins une sonde nucléotidique de l'invention, et/ou au moins un anticorps de l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré, la présente invention concerne un kit de diagnostic contenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de HCMV, la séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, ou au moins une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, au moins une amorce nucléotidique de l'invention, au moins une sonde nucléotidique de l'invention, et/ou au moins un anticorps de l'invention.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne un médicament comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention, ou au moins une séquence d'acides aminés isolée de l'invention ou au moins une un anticorps de l'invention.
Selon un mode de réalisation préféré, un médicament de l'invention est un vaccin. Selon encore un mode de réalisation préféré, un médicament de l'invention est destiné à prévenir et/ou traiter une carcinogénèse, ou cancer, induit(e) par une infection par HCMV.
Selon un mode de réalisation préféré, une carcinogénèse ou un cancer induit par une infection par HCMV est une carcinogénèse ou un cancer du sein ou du foie, et de préférence encore une carcinogénèse ou un cancer du sein. Ainsi un médicament de l'invention peut être destiné à prévenir et/ou traiter un cancer du sein ou du foie.
Un individu concerné par l'invention est un individu humain, et de préférence encore est une femme.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour évaluer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes de:
a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, obtenu à partir dudit individu, une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, et
b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes de:
a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, obtenu à partir dudit individu, une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV, et
b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle, ladite protéine UL82 comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion.
Selon un mode de réalisation préférée, la carcinogénèse ou le cancer est une carcinogénèse ou un cancer du sein ou du foie, et de préférence encore une carcinogénèse ou un cancer du sein. Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour évaluer un caractère oncogène d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, comprenant au moins les étapes de :
a) déterminer dans un échantillon biologique isolé une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, et
b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne l'utilisation d'une souche de cytomégalovirus humain HCMV-DB pour déterminer un caractère oncogène d'une souche distincte de HCMV. Dans une telle utilisation, la souche HCMV-DB est avantageusement mise en œuvre à titre de contrôle positif.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, notamment mammaire, chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV isolée dudit individu,
b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester,
b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou.
Selon un autre de ses objets, la présente invention concerne une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche de HCMV comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester,
b- déterminer l'expression génique des cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression génique déterminée à l'étape b- avec des cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou l'expression génique de cellules eucaryotes permissives au HCMV infectées par une souche de HCMV oncogénique.
Selon un mode de réalisation, les utilisations et méthodes de l'invention peuvent être réalisées in vivo, ex vivo, ou in vitro, et de préférence sont réalisées in vitro ou ex vivo.
Au sens de l'invention, on entend par « souche de cytomégalovirus humain (HCMV) oncogénique » une souche de virus apte à induire la transformation d'une cellule eucaryote primaire permissive à l'infection par un tel virus en cellule maligne. Une telle transformation se caractérise, notamment, par la prolifération des cellules en l'absence d'adhésion, et peut être déterminée, par exemple, par la technique de la culture en agar mou, détaillée ci-après.
Séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés
Une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut consister en une séquence codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV. De telles séquences sont connues et sont disponibles par exemple dans la base de données EMBL-Bank sous les référence AAR31634.1 (UL82) ou AY642441.1 (UL97).
Une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 peut consister en une séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 1, une séquence d'acides nucléiques présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 1 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 1, ou un fragment de SEQ ID NO 1, comprenant au moins 360 acides nucléiques consécutifs issus de ladite séquence d'acides nucléiques, et une activité biologique analogue. De préférence, un fragment convenant à l'invention code pour une séquence d'acides aminés issue de l'extrémité C-terminale la protéine, et consiste en 360 derniers acides nucléiques de SEQ ID NO 1.
Une séquence d'acides nucléiques isolée de l'invention peut avantageusement coder pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV comprenant dans une région s 'étendant de l'acide aminés 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion.
De préférence une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut consister en une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore pour une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
La séquence UNIPROT C8CFC1, de 559 acides aminés, figurant une protéine UL82 diffère des séquences de l'invention, et en particulier des séquences SEQ ID NO 3, 4 et 5, en ce que elle possède une proline en position 464 alors qu'il s'agit d'une arginine dans SEQ ID NO 3 ; elle possède une proline en position 539 alors qu'il s'agit d'une thréonine dans SEQ ID NO 4 ; et la SEQ ID NO 5 possède 560 acides aminés.
Une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL97 peut consister en une séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 2, une séquence d'acides nucléiques présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 2 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 2, ou un fragment de SEQ ID NO 2 et comprenant une activité biologique analogue.
De préférence une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL97 peut consister en une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en SEQ ID NO 8.
Une séquence d'acide nucléique de l'invention peut être utilisée pour établir, in vitro, ex vivo, in vivo, des cellules de mammifères transfectées, ou des mammifères non- humains transgéniques utiles pour établir de nouveaux outils de diagnostic, de pronostic ou de traitement de troubles pathologiques susceptibles d'être provoqués, au moins en partie, par un HCMV oncogénique, et notamment par une souche HCMV DB ou AD 169.
Une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut être sous-clonée dans tout vecteur d'expression approprié convenant à la manifestation de l'expression d'une séquence d'acides aminés de l'invention dans une cellule hôte appropriée, par exemple un plasmide de type pcDNA3.1.
L'obtention de cellules, notamment isolées, de mammifères transfectées ou l'obtention de mammifères non-humains transgéniques peut être effectuée en utilisant toutes méthodes connues dans l'art, et comprenant l'utilisation de tout vecteur d'expression approprié contenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention.
Aussi, l'invention concerne un vecteur d'expression, notamment isolé, comprenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention, ainsi qu'une cellule hôte, notamment isolée, comprenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention ou un vecteur d'expression de l'invention. Selon un mode de réalisation, une séquence d'acides nucléiques de l'invention peut également être une séquence, amorce ou sonde nucléotidique, apte à s'hybrider, dans des conditions stringentes, à une séquence d'acides nucléiques SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2, une séquence d'acides nucléiques présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 1 ou SEQ ID NO 2, ou un fragment de SEQ ID NO 1 , comprenant au moins 360 acides nucléiques consécutifs issus de ladite séquence d'acides nucléiques, et une activité biologique analogue, ou un fragment de SEQ ID NO 2 et comprenant une activité biologique analogue, les conditions stringentes étant une température inférieure de 20 à 25 °C à Tm, lxSSC (soluble solid content) et 0,1% de SDS (Sodium Dodecyl Sulfate).
Tm (melting température) désigne la température de fusion ou de dénaturation des séquences d'acides nucléiques comme l'ADN, à savoir la température pour laquelle 50 % des séquences sont désappariées ou dénaturées (Le. sous forme simple brin).
Les conditions stringentes désignent des conditions spécifiques dans lesquelles des hybrides spécifiques des séquences d'acides nucléiques peuvent se former, mais dans lesquelles des hybrides non-spécifiques ne se forment pas. À titre d'exemple, ce sont les conditions dans lesquelles deux séquences d'acides nucléiques ayant un haut degré d'homologie, par exemple, des séquences d'acides nucléiques ayant 85 % ou plus, de préférence 90 % ou plus, de préférence encore 95 % ou plus, et encore plus préférentiellement 99 % ou plus d'identité s'hybrident, mais dans lesquelles deux séquences d'acides nucléiques d'identité inférieure ne s'hybrident pas.
Comme exemple de conditions stringentes, on peut mentionner les conditions dans lesquelles une hybridation se produit à 60 °C, à des concentrations de sel correspondant à lxSSC, et SDS 0,1 %, de préférence 0,lxSSC et 0,1 % SDS, qui sont des conditions habituelles de lavage dans une hybridation Southern. Une hybridation peut être réalisée selon les méthodes décrites dans Current Protocols in Molecular Biology (Ed. Frederick M. Ausubel et al., 1987), ou toute autre méthode connues de l'homme de l'art.
Le terme « amorce » désigne une séquence d'acides nucléiques simple brin capables d'agir comme un point d'initiation de la synthèse d'un produit d'extension d'amorces, et complémentaire de la séquence d'acides nucléiques destinée être copiée. La longueur et la séquence de l'amorce dépendent de la complexité de la séquence d'acides nucléiques à copier et doivent être telles qu'elles permettent d'amorcer spécifiquement la synthèse des produits d'extension. De préférence, une amorce peut être d'au moins environ 10, de préférence d'au moins 15 acides nucléiques. La longueur et la séquence spécifique de l'amorce dépendent également des conditions de mise en œuvre, comme la température, la force ionique, etc. Une telle amorce convient à l'amplification ou au séquençage de la séquence cible. Une amorce d'amplification ne correspond pas nécessairement exactement à la séquence à copier pour obtenir l'amplification cherchée.
Une méthode d'amplification convenant à l'invention peut être une réaction en chaîne par polymérase (PCR), une réaction en chaîne par ligase (LCR), une amplification basée sur une séquence d'acides nucléiques (NASBA), une amplification basée sur un système de transcription (TAS), une amplification par déplacement de brin (SDA), une amplification par réplicase QP, ou toute autre méthode adaptée pour amplifier des séquences d'acides nucléiques utilisant l'extension d'amorce. Pendant l'amplification, les produits amplifiés peuvent être marqués soit en utilisant des amorces marquées avec un marqueur ou en incorporant des acides nucléiques marqués. Les marqueurs peuvent être radio-isotopiques (32P, 35S, etc) ou non-isotopiques, comme la biotine ou la digoxigénine, ou encore être fluorescents, comme le FITC, une cyanine fluorescente, ou le BODIPY.
Le terme « sonde » se réfère à une séquence d'acides nucléiques spécifique simple brin, et complémentaire de la séquence d'acides nucléiques cible à détecter.
Une sonde d'acides nucléiques selon l'invention peut comprendre une portion d'une séquence d'acides nucléiques de l'invention, et être apte à agir comme une sonde d'hybridation pour la détection spécifique d'une séquence d'acides nucléiques contenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention.
De préférence, une sonde de l'invention peut consister en 5 à 50 acides nucléiques, de préférence de 10 à 25 acides nucléiques. Une sonde peut être fixée à un support solide, c'est à dire, tout substrat sur lequel une sonde d'acides nucléiques peut être couplée, à condition qu'elle conserve ses caractéristiques d'hybridation, et à condition que le bruit de fond de l'hybridation reste faible. A titre d'exemple de support solide convenant à l'invention on peut citer une plaque de microtitration, une membrane, par exemple de nylon ou de nitrocellulose, ou une microsphère. Une sonde d'acides nucléiques peut être modifiée en vue de faciliter la fixation sur le support ou améliorer l'efficacité de l'hybridation. De telles modifications peuvent consister en un couplage avec différents groupes réactifs, tels que des groupes aliphatiques, des groupes NHZ, des groupes SH, des groupes carboxyliques, ou un couplage avec une biotine ou des haptènes.
Une amorce ou une sonde nucléotidique de l'invention apte à s'hybrider dans des conditions stringentes à une séquence d'acides nucléiques de l'invention, en particulier codant pour une protéine UL82, peut notamment consister en une séquence d'acides nucléiques choisie parmi SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13 ou SEQ ID NO 14.
Une amorce ou une sonde nucléotidique de l'invention apte à s'hybrider dans des conditions stringentes à une séquence d'acides nucléiques de l'invention, en particulier codant pour une protéine UL97, peut notamment consister en une séquence d'acides nucléiques choisie parmi SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19 ou SEQ ID NO 20.
Sont également considérées dans l'invention des sondes nuclétodiques apte à s'hybrider dans des conditions stringentes à une séquence d'acides nucléiques de l'invention et présentant une analogie de séquence d'au moins 90%, voire d'au moins 95% avec les séquences d'acides nucléiques SEQ ID NO 9 à SEQ ID NO 20.
En outre, l'invention concerne également une séquence d'acides nucléiques isolée apte à réduire et/ou supprimer et/ou prévenir la présence ou l'expression et/ou l'activité d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention. Une telle séquence peut être désignée séquence antisens.
Une séquence antisens peut, par exemple, être transcrite dans une cellule cible en ARN complémentaires d'ARNm virales et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans EP 0 140 308. Alternativement, une séquence antisens peut être introduite en tant que telles dans les cellules cibles sous forme d'ARN.
Une séquence d'acide nucléique antisens peut être un siRNA, un miRNA, un shRNA, une séquence hybride ou une séquence synthétique ou semi-synthétique.
Plus particulièrement, une séquence antisens peut être une séquence d'acides nucléiques ou oligonucléotide antisens (ODN), notamment un ODN synthétique comportant des modifications chimiques des acides nucléiques natifs. Un oligonucléotide antisens peut être synthétisé chimiquement par toute méthode connue dans le domaine. De préférence, un oligonucléotide modifié chimiquement peut être préparé à partir d'une structure phosphodiester native afin d'augmenter la stabilité intracellulaire et l'affinité de liaison.
Une séquence antisens peut être produite par expression de tout ou partie d'une séquence d'acides nucléiques de l'invention dans un vecteur approprié, où l'initiation de la transcription est orientée de telle sorte qu'un brin antisens est produit comme molécule d'ARN.
Une séquence antisens peut généralement comprendre au moins 7, en particulier au moins 12, plus particulièrement au moins environ 20 acides nucléiques, et pas plus de 500, en particulier pas plus d'environ 50, plus particulièrement pas plus d'environ 35 acides nucléiques. La longueur d'une séquence antisens est régi par différents paramètres connus de l'homme de métier, tel que l'efficacité de l'inhibition, la spécificité, et notamment l'absence de réactivité croisée, etc. Une séquence d'acides aminés de l'invention consiste en une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 ou d'une protéine UL97 d'une souche de HCMV. De telles séquences sont connues et sont disponibles par exemple dans la base de données UniProt sous les référence F5HBC6 (UL82) ou Q5IV10 (UL97).
En particulier, une séquence d'acides aminés de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés codée par une séquence d'acides nucléiques telle que définie précédemment.
Une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 peut consister en une séquence d'acides aminés SEQ ID NO 3, une séquence d'acides aminés présentant une identité de séquence d'au moins 90, de préférence d'au moins 95 %, et de préférence encore d'au moins 99 % avec SEQ ID NO 3 et une activité biologique analogue à SEQ ID NO 3, ou un fragment de SEQ ID NO 3 comprenant au moins 160 acides aminés consécutifs issus de SEQ ID NO 3 et une activité biologique analogue. De préférence, un fragment convenant à l'invention est issu de l'extrémité C-terminale, et peut consister en 160 acides aminés contigus consistant en la région s'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540.
Sauf indication contraire, la numérotation des acides aminés de la protéine UL82 indiquée dans le texte est donnée par rapport à SEQ ID NO 3.
Une séquence d'acides aminés isolée de l'invention, et en particulier une séquence d'une protéine UL82 ou un fragment de celle-ci, peut comprendre dans une région s'étendant de l'acide aminés 421 à l'acide aminé 540 au moins une mutation ponctuelle.
Une mutation ponctuelle est une mutation ne touchant qu'un acide aminé, et peut consister en une délétion d'un acide aminé, une insertion d'un acide aminé ou une substitution d'un acide aminé.
De préférence une séquence d'acides aminés de l'invention comprend au moins une mutation ponctuelle choisie parmi une substitution ou une insertion.
De préférence encore, une séquence d'acides aminés de l'invention, et en particulier une séquence d'une protéine UL82 ou un fragment de celle-ci, peut comprendre au moins deux mutations ponctuelles, et de préférence comprend au plus deux mutations ponctuelles. Ces mutations ponctuelles peuvent être deux substitutions ou une substitution et une insertion. Les mutations ponctuelles plus particulièrement considérées par l'invention peuvent consister en une insertion d'une glutamine après la position 424, une substitution d'une alanine par une glycine en position 507, une substitution d'une arginine par une proline en position 464, et/ou une substitution d'une proline par une thréonine en position 539.
De préférence, lorsqu'une séquence de l'invention comprend au plus deux mutations ponctuelles, celles-ci peuvent consister en une insertion d'une glutamine après la position 424 (par rapport à SEQ ID NO 3) et une substitution d'une alanine par une glycine en position 507 (ou 508 en prenant en compte l'insertion, numérotation par exemple par rapport à SEQ ID NO 5).
Selon un autre mode de réalisation préféré, lorsque d'une séquence de l'invention comprend au plus deux mutations ponctuelles, celles-ci peuvent consister en une substitution d'une arginine par une proline en position 464 et une substitution d'une proline par une thréonine en position 539.
De préférence une séquence d'acides aminés de l'invention, d'une protéine UL82 ou d'un fragment de celle-ci, peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
De préférence encore, une séquence d'acides aminés de l'invention peut consister en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Une séquence d'acides aminés d'une protéine UL97 peut consister en une séquence d'acides aminés SEQ ID NO 8.
Une séquence d'acides aminés de l'invention peut être produite par toute méthode connue dans le domaine, comme par exemple, en cultivant une cellule hôte de l'invention dans des conditions permettant la synthèse de la séquence d'acides aminés, et l'isolement de cette séquence à partir des cellules cultivées et/ou du milieu de culture. L'isolement et la purification d'une séquence d'acides aminés peuvent être effectués par tout moyen conventionnel, telle qu'une chromatographie préparative d'affinité ou une séparation immunologique. Une séquence d'acides aminés de l'invention comprend non seulement les séquences d'acides aminés produites par recombinaison mais également les séquences d'acides aminés isolées d'un échantillon biologique ou produites par synthèse. Les méthodes d'obtention de ces séquences sont connues dans le domaine, et ne nécessitent pas d'être détaillée dans la présente description. Une identité de séquence de deux séquences d'acides nucléiques ou de deux séquences d'acides aminés peut être déterminée visuellement ou peut être déterminée par toutes méthodes généralement mises en œuvre dans le domaine, telle que celle mettant en œuvre l'algorithme BLAST utilisé dans un logiciel disponible sur le site Pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gov).
Selon l'invention, une activité biologique analogue à une séquence d'acides aminés de l'invention se réfère à une activité oncogénique ou une capacité à induire la transformation de cellules primaires saines en cellules malignes. L'évaluation de la transformation de cellules primaires saines en cellules malignes peut notamment être effectuée comme détaillé dans les exemples ci-après, en particulier au moyen de l'essai en gel d'agar mou (soft agar).
Selon l'invention, une activité biologique analogue à une séquence d'acides nucléiques de l'invention se réfère à l'aptitude d'une telle séquence à être traduite en une séquence d'acides aminés de l'invention. Une telle aptitude peut être évaluée par toute méthode connue de l'homme de l'art dans le domaine.
Vecteur d'expression
La présente invention concerne également un vecteur d'expression, notamment isolé, comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention.
De préférence, un vecteur d'expression de l'invention peut comprendre une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Un vecteur d'expression convenant à l'invention peut être un plasmide, un cosmide, un virus, un bactériophage, et tout autre vecteur habituellement utilisé dans le domaine du génie génétique. Un vecteur approprié à l'invention peut notamment être choisi de manière non limitative parmi un au vecteur d'expression basé sur T7 pour l'expression dans une cellule de mammifères, et de un vecteur dérivé de baculovirus pour l'expression en cellules d'insectes. Comme autre exemple de vecteurs d'expression adaptés, on peut citer le plasmide pcDNA 3.3 -TOPO TA ou le pcDNA3.1, et de préférence le pcDNA3.1.
Une séquence d'acides nucléiques de l'invention est fonctionnellement liée à des éléments régulateurs dans un vecteur d'expression de l'invention, de sorte à permettre la transcription et la synthèse d'un ARNm, puis la traduction de ce dernier, dans des cellules procaryotes et/ou eucaryotes. Ainsi, un vecteur d'expression peut comprendre une cassette de transcription comprenant un élément d'initiation de la transcription, une séquence d'acide nucléique cible, et un élément de terminaison de la transcription. Une séquence d'acides nucléiques à transcrire peut être liée de manière opérationnelle à un promoteur tel que le promoteur T7, un promoteur métallothionéine I, ou un promoteur polyhédrine.
Cellules hôtes
La présente invention concerne également une cellule hôte recombinante, transitoire ou stable, notamment isolée, contenant une séquence d'acides nucléiques de l'invention ou un vecteur d'expression de l'invention.
Une cellule hôte s'entend comme un organisme ayant incorporé une séquence d'acides nucléiques de l'invention, notamment in vitro et, le cas échéant apte à assurer la synthèse d'une séquence d'acides aminés codée par la séquence d'acides nucléiques. De préférence, une telle cellule peut être une cellule procaryote ou eucaryote, par exemple une cellule de mammifère, humain ou non-humain, une cellule bactérienne, une cellule d'insecte ou une cellule de levure. De préférence, une cellule hôte de l'invention peut comprendre une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Selon un mode de réalisation, un vecteur d'expression tel que défini précédemment peut être utilisé pour introduire une séquence d'acides nucléiques telle que définie précédemment.
Les méthodes de transfection des cellules hôtes de l'invention sont celles habituellement mises en œuvre dans le domaine. A titre d'exemples, on peut citer les méthodes de transfection à base de lipofectamine.
Anticorps
La présente invention concerne également un anticorps qui se lie spécifiquement à une séquence d'acides aminés de l'invention. Un anticorps de l'invention peut reconnaître spécifiquement un épitope présent chez des souches de HCMV oncogéniques, telle que les souches DB ou AD 169, mais non présent sur chez des souches de HCMV non-oncogéniques, telles que les souches TB40E ou TB40F. De préférence, un anticorps de l'invention peut se lier spécifiquement à une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, de préférence choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Le terme « anticorps » vise à désigner des anticorps polyclonaux, monoclonaux, des anticorps purifiés IgG, IgM, IgA, ou des fragments de de ceux-ci, tels que les fragments Fv, Fv monocaténaire (scFv), F(ab)2, Fab et F(ab)', et des anticorps chimériques ou humanisés. Un anticorps de l'invention peut être un anticorps monoclonal ou peut désigner une préparation d'anticorps polyclonaux présentant différentes spécificités épitopiques. Dans un mode de réalisation préféré, les anticorps de l'invention sont des anticorps humains.
Un anticorps de l'invention peut être préparé par mise en œuvre d'un antigène contenant ou consistant en une séquence d'acides aminés de l'invention au moyen de toute méthode connue de l'homme de l'art, et notamment comme décrit par Harlow et Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, du Cold Spring Harbor, NY, 1988.
Notamment, un anticorps de l'invention peut être obtenu par mise en œuvre d'une séquence d'acides aminés de l'invention à titre d'immunogène. Une séquence d'acides aminés de l'invention utilisée à titre d'immunogène peut comprendre au moins 8 acides aminés consécutifs issus d'une séquence d'acides aminés définie précédemment.
De préférence, une séquence immunogène de l'invention peut être issue d'une séquence SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et comprendre au moins une mutation ponctuelle telle que définie ci-dessus.
Un immunogène peut être utilisé en l'état ou conjugué à une molécule porteuse, telle qu'une protéine porteuse. A titre d'exemple de protéines porteuses on peut citer la sérum albumine bovine (BSA), l'albumine de poule, l'hémocyanine de patelle (KLH), la toxine tétanique.
Médicament, vaccin et kit
La présente invention concerne également la mise en œuvre d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés ou d'anticorps de l'invention dans un médicament ou un vaccin ou un kit de diagnostic.
De préférence, une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés ou un anticorps plus particulièrement considérés peuvent être une séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, ou un anticorps se liant spécifiquement à une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, et de préférence encore choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
Un médicament ou un vaccin de l'invention convient tout particulièrement pour prévenir et/ou traiter une carcinogénèse ou un cancer, de préférence un cancer induit par une infection à HCMV oncogénique, et notamment une souche AD 169 ou DB.
Un cancer considéré par l'invention peut être choisi parmi un cancer du sein, de la tête et du cou, du foie, de l'ovaire, du pancréas, de la prostate, du rein, de la peau, du testicule, du poumon, du col de l'utérus, du cerveau, un médulloblastome, un glioblastome, et de préférence peut être un cancer du sein, du foie, de la prostate ou du cerveau, et de préférence encore est un cancer du sein.
Au sens de l'invention, par « traitement du cancer », on entend se référer à un traitement destiné à stabiliser, réduire, éliminer, prévenir et/ou guérir un cancer.
Au sens de l'invention, le terme « prévenir » se réfère à la réduction d'un risque de survenue d'un événement.
L'évaluation de la stabilisation, réduction, guérison ou progression d'un cancer relève des connaissances générales de l'homme de l'art.
En particulier, un vaccin de l'invention peut être destiné à induire une réponse immunitaire, chez un individu humain, et de préférence une femme, pour prévenir et/ou traiter une carcinogénèse ou un cancer induit par une infection par une souche de HCMV oncogénique, et notamment une souche AD 169 ou DB. Un vaccin de l'invention comprend une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention apte à induire une réponse immunitaire contre une souche de HCMV oncogénique.
Un vaccin peut aussi être utile pour le traitement d'un individu, auquel cas il est appelé un vaccin thérapeutique.
Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent être formulés avec tout véhicules ou diluants pharmaceutiquement acceptables, et peuvent être préparés sous toute forme galénique convenant au mode d'administration adopté, telle qu'une forme solide, semi- solide, liquide ou gaz, et notamment sous forme de comprimés, gélules, poudres, granulés, d'émulsions, suspensions , gels, de microsphères, etc. Un médicament ou un vaccin de l'invention de l'invention peuvent être sous une forme galénique orale, telle qu'un comprimé, une capsule, une pilule, une poudre, des granulés, un élixir, une teinture, une solution, une suspension, un sirop ou une émulsion.
Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent également être sous une forme galénique injectable. Les séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés peuvent être alors formulées en l'état ou formulés avec différents véhicules, comme des liposomes ou des polymères de transfection ou de délivrance intracellulaire.
A titre de véhicule pharmaceutique acceptable, on peut citer, par exemple, l'eau, l'eau tamponnée, une solution saline à 0,4 %, ou 0,3 % de glycine, du sérum physiologique, du glycérol, de l'éthanol l'acide hyaluronique, des protéines, des polysaccharides, des acides polylactiques, les acides glycoliques, des acides aminés, ou des particules virales inactives.
Un vaccin de l'invention peut en particulier comprendre un adjuvant pour stimuler la réponse immunitaire. Un adjuvant convenant à l'invention peut être, par exemple, le squalène, l'hydroxyde aluminim (alun), la N-acétyl-muramyl-L-thréonyl-D-isoglutamine (thr- MDP), la N-acétyl-normuramyl-Lalanyl -D-isoglutamine (ni-MDP), la 5 L-oxy-éthylamine (MTP-PE) et RIBI, qui contiennent des composants extraits de bactéries, le monophosphoryle lipide A, le tréhalose dimycolate, et des éléments de la paroi cellulaire de bactéries(MPL, TDM et SP) dans une émulsion à 2 % de squalène/Tween 80 émulsion, l'adjuvant complet de Freund (CFA) ou l'adjuvant incomplet de Freund (IF A).
Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent également comprendre des substances auxiliaires, tels que des agents mouillants ou émulsifiants, des substances tampon, des agents ajustant la tonicité ou le pH, des conservateurs, des agents antioxydants, etc.
Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent être stérilisés par des techniques de stérilisation bien connues, ou peuvent être filtrés de manière stérile. Les solutions aqueuses résultantes peuvent être utilisées en l'état, ou être lyophilisées. Une préparation lyophilisée peut ensuite être combinée avec une solution stérile avant administration.
Un médicament ou un vaccin de l'invention comprennent des séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés nécessairement en une quantité efficace.
Une quantité efficace est une quantité de séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés qui seule, ou avec des doses supplémentaires cumulatives, peut entraîner la réponse souhaitée. Une quantité efficace peut dépendre de divers facteurs, tels que la voie d'administration, si l'administration est en doses uniques ou multiples, et les paramètres de chaque patient dont l'âge, la condition physique, la taille, le poids, le sexe, et le stade de la maladie. Ces facteurs sont bien connus de l'homme de l'art et peuvent être traitées avec pas plus de l'expérimentation de routine.
Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent être administrés par toute voie adéquate, telle que la voie orale, buccale, rectale, parentérale, intrapéritonéale, intradermique, transdermique, intra-trachéale, etc.
Un médicament ou un vaccin de l'invention peuvent de préférence être administrés par injection, telle qu'une voie intrapéritonéale, intradermique, sous cutanée ou intramusculaire intravasculaire, ou par voie muqueuse, ou une combinaison des deux. Toute voie muqueuse peut être utilisée, tels que la voie vaginale, la voie rectale, la voie respiratoire, ou la voie nasale.
Un kit de l'invention peut comprendre l'ensemble des éléments et réactifs pour effectuer les différentes méthodes de détermination des séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés de l'invention détaillées ci-après.
Un tel kit peut comprendre au moins une séquence d'acides nucléiques de l'invention, une amorce nucléotidique de l'invention, une sonde nucléotidique de l'invention, une séquence d'acides aminés de l'invention, et/ou un anticorps de l'invention.
Utilisations et méthodes
Les séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés de l'invention conviennent tout particulièrement à une mise en œuvre comme biomarqueur.
Au sens de l'invention, le terme « biomarqueur » se réfère à une entité présente dans une cellule, un tissu ou un virus, qui peut être déterminée directement ou indirectement, par exemple par visualisation directe ou après isolement et marquage avec une sonde fluorescente ou radioactive, ou encore par une méthode de dosage, et qui est révélateur d'un processus physiologique, biochimique, morphologique ou phénotypique de la cellule, du tissu, ou du virus. Un biomarqueur peut être utilisé pour qualifier un état physiologique, biochimique morphologique ou phénotypique d'un tissu biologique ou d'un organisme, tel qu'un virus ou un mammifère, notamment un être humain. Un biomarqueur de l'invention est notamment isolé.
Les séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés de l'invention conviennent tout particulièrement à une mise en œuvre comme biomarqueur pour déterminer ou qualifier le caractère oncogénique ou non-oncogénique d'une souche de cytomégalovirus humain, ou pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer. Un cancer considéré par l'invention peut être choisi parmi un cancer du sein, de la tête et du cou, du foie, de l'ovaire, du pancréas, de la prostate, du rein, de la peau du testicule, du poumon, du col de l'utérus, du cerveau, un médulloblastome, un glioblastome et de préférence peut être un cancer du sein, du foie, de la prostate ou du cerveau. De préférence encore, un cancer considéré dans l'invention est un cancer du sein ou du foie, et de préférence encore est un cancer du sein.
Les méthodes de l'invention comprennent au moins les étapes de:
a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention, et
b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
Au sens de l'invention, le terme « déterminer » se réfère à une évaluation qualitative et/ou une détection quantitative.
Au sens de l'invention, les termes « détermination contrôle » ou « détermination de référence » se réfèrent à une détermination d'un paramètre dans des conditions négatives ou positives. Par exemple un contrôle négatif de l'invention peut être obtenu en utilisant une souche de HCMV non-oncogène, comme des souches TB40-E et TB40-F, ou une souche de HCMV inactivée par la chaleur, par exemple 100 °C pendant 10 min. Comme contrôle positif de l'invention on peut utilisant une souche de HCMV oncogène, comme les souches HCMV-DB et HCMV-AD169.
Par exemple, en ce qui concerne la présence ou le niveau d'expression ou d'activité d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention, la détermination contrôle négative ou de référence négative peut être une valeur ou une plage de valeurs correspondant au degré de détection ou à un niveau d'expression ou d'activité déterminé dans un échantillon biologique présumé ne pas contenir de séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention ou dans un échantillon biologique présumé issu de ou comprenant des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche de HCMV non- oncogène. Une détermination contrôle positive ou de référence positive peut être une valeur ou une plage de valeurs correspondant au degré de détection ou à un niveau d'expression ou d'activité déterminé dans un échantillon biologique présumé contenir des séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention ou dans un échantillon biologique issu de ou comprenant des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche de HCMV non- oncogène Typiquement, pour une méthode de pronostic ou pour déterminer un risque de carcinogénèse, une détermination contrôle négative ou de référence négative peut être obtenue en déterminant la présence ou le niveau d'expression d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention dans un ensemble d'individus présumés ne pas avoir un cancer et/ou présumés ne pas être infectés par un HCMV oncogène, ou dans un tissu sain ou présumé sain et/ou présumé ne pas être infecté par un HCMV oncogène.
Selon le degré de déviation entre la valeur déterminée pour un individu à tester et la valeur de détermination contrôle négative ou de référence négative, un pronostic quant au caractère plus ou moins agressif du cancer affectant l'individu testé peut être établi, et, éventuellement, conduire à l'adoption d'une stratégie thérapeutique spécifique, ou un risque de carcinogénèse peut être établi.
La détermination contrôle ou de référence n'est pas nécessairement effectuée simultanément avec la détermination chez l'individu à tester, elle peut être une détermination historique, effectuée antérieurement, et stockée sur un support adéquat, par exemple sur un serveur ou un disque dur, dans une base de données informatisée.
La détermination de la présence ou du niveau d'expression ou de l'activité d'une séquence d'acides aminés ou d'acides nucléiques de l'invention peut être réalisée dans un échantillon biologique.
Un échantillon biologique peut être isolé et peut être obtenu à partir d'un individu présumé être affecté par un cancer, et notamment un cancer du sein ou du foie, ou à partir d'un individu présumé être affecté par une infection à cytomégalovirus humain, notamment oncogénique.
Tel qu'utilisé ici, l'expression « échantillon biologique » vise à désigner tout prélèvement isolé, obtenu chez un individu, tel qu'un prélèvement d'un fluide corporel ou d'un tissu (par exemple, le sérum, le plasma, le sang, le liquide céphalorachidien, l'urine, le lait, un tissu mammaire), ou obtenu à partir de cellules en culture, et susceptible de contenir une séquence d'acides aminés ou d'acides nucléiques de l'invention. Un échantillon biologique peut être une biopsie réalisée à partir d'un tissu, de préférence comprenant une tumeur maligne.
La détermination, dans un échantillon biologique isolé, d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés de l'invention, peut être effectuée par toute méthode de biologie cellulaire, de biochimie analytique ou de biologie moléculaire connue dans le domaine comme étant utile pour évaluer ou quantifier la présence ou l'absence, ou un niveau d'expression ou d'activité d'un constituant cellulaire comme une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés. La détermination peut être effectuée directement dans un échantillon biologique ou après extraction d'une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés d'intérêt à partir de l'échantillon.
Une augmentation importante des protéines du HCMV UL97 et UL82 (pp71) est observée dans des cellules eucaryotes permissives, par exemple des cellules HuMEC, infectées par des souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169. Au contraire cette augmentation n'est pas observée dans des cellules eucaryotes permissives infectées par des souches de HCMV non-oncogènes, par exemple TB40E et TB40F.
Au-delà d'un certain seuil d'expression des deux protéines codées par les gènes UL97 et UL82, une souche de HCMV est caractérisé comme étant oncogénique comme cela est le cas pour les souches DB et AD 169, et on peut appeler ces souches HCMV, souches à protéines UL82 élevée et/ou UL97 élevée. Au contraire sous ce seuil d'expression une souche de HCMV est caractérisée comme étant non-oncogénique, comme cela est le cas pour les souches TB40-E et TB40-F, et on peut appeler ces souches de HCMV, souches à protéines UL82 faible et/ou UL97 faible. La détermination du niveau d'expression des protéines UL97 et UL82 dans des cellules eucaryotes permissives infectées par un HCMV peut permettre la caractérisation de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi d'individus infectés, notamment des individus présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...).
Par exemple, un niveau d'expression des protéines codées par les gènes UL97 et UL82, d'une souche de HCMV oncogénique peut être d'environ au moins 1,5 fois, notamment 2 fois, voire 3 fois, voire 5 fois, ou encore 10 fois, voire encore 20 fois ou plus, supérieure au niveau d'expression des protéines codées par les gènes UL97 et UL82, d'une souche de HCMV non-oncogénique.
La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés peut être effectuée par une méthode choisie parmi la spectrométrie de masse tels que la LC-MS, GC-MS, des séparations chromatographiques telles que les séparations sur gel un ou 2-D, des essais par liaison comme les immuno-essais ou l'hybridation, des essais enzymatique tels que l'ELISA ou des tests d'inhibition compétitive. Une détermination peut notamment être effectuée par une méthode choisie parmi le Western-blot, l'immuno-ELISA, la microscopie à fluorescence, la cytométrie de flux, le séquençage direct, l'électrophorèse sur gel, la chromatographie sur colonne, le transfert de Northern ou de Southern, par PCR, RT-PCR ou PCR quantitative. La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques peut être effectuée par une méthode choisie parmi le séquençage direct, l'électrophorèse sur gel, chromatographie sur colonne, le transfert de Northern ou de Southern, la PCR, la RT-PCR ou la PCR quantitative.
Pour être détectée, une séquence d'acides nucléiques peut être amplifiée par des techniques classiques, telles que la réaction en chaîne polymérase (PCR), la PCR nichée (nested PCR) ou de la transcriptase inverse PCR (RT-PCR) pour fournir une quantité suffisante pour l'analyse, puis soumise à une électrophorèse sur gel, et ensuite colorée avec un colorant spécifique pour acide nucléique.
Alternativement, un marqueur détectable peut être inclus dans une réaction d'amplification. Un marqueur convenant à l'invention peut être choisi parmi des fluorochromes, tels que l'isothiocyanate de fluorescéine, la rhodamine ou Texas Red®. Un marqueur peut être un système à deux entités présentant une affinité l'une pour l'autre. Par exemple, une séquence d'acides nucléiques amplifiée est conjuguée à la biotine présentant une haute affinité envers l'avidine qui peut être marquée par une entité détectable directement. Un marqueur peut être conjugué à une ou aux deux amorces.
Alternativement encore, un mélange de nucléotides utilisés pour l'amplification peut être marqué de manière à incorporer un marqueur dans le produit d'amplification.
Selon un autre mode de réalisation, une séquence d'acides nucléiques peut être détectée par toute méthode d'hybridation de la séquence cherchée avec une sonde d'acides nucléiques marquée avec un marqueur radio-isotopique, fluorescent ou enzymatique. Une méthode de détection d'hybrides formés entre une sonde d'acides nucléiques et une séquence d'acides nucléiques cherchée peut être une méthode dot-blot, une hybridation sandwich ou une hybridation inverse.
La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés peut être effectuée par une méthode choisie parmi le Western blot, l'immuno-ELISA, la microscopie à fluorescence, ou la cytométrie de flux. La détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés peut être basée sur les caractéristiques fonctionnelles ou antigéniques de la séquence.
Une détermination peut utiliser la coloration de cellules ou coupes histologiques, réalisées selon les méthodes conventionnelles.
Alternativement, une détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés de l'invention peut inclure l'extraction d'une séquence à partir d'une cellule ou d'un échantillon de tissu, puis la liaison par une sonde marquée spécifique, par exemple un anticorps, et notamment un anticorps de l'invention, et la détection de la sonde. Le marqueur peut être un radio-isotope, un composé fluorescent, une enzyme, ou un substrat enzymatique.
Selon un mode de réalisation, une détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés de l'invention peut être effectuée par électrophorèse sur gel ou chromatographie sur colonne.
Une détermination peut être effectuée par une méthode de type Western-blot comprenant une migration sur gel à une ou deux dimensions, puis éventuellement un transfert sur un buvard, et révélation de la séquence d'acides aminés avec une entité apte à se lier spécifiquement à celle-ci et à être détectée.
Une détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés de l'invention peut être effectuée par des méthodes impliquant une liaison par affinité entre une entité, par exemple un anticorps, de préférence un anticorps de l'invention, et la séquence à détecter. L'entité peut être ajoutée à un échantillon biologique et laissée incuber pendant une période de temps suffisante pour permettre une liaison entre l'entité et la séquence d'acides aminés, par exemple au moins environ 10 minutes. L'entité peut être étiquetée avec un radio-isotope, une enzyme, une molécule fluorescente, une molécule chimioluminescente, ou tout autre marqueur convenant à une détection directe.
Alternativement, une seconde entité présentant une affinité pour la première entité, par exemple un anticorps secondaire, peut être utilisée pour amplifier le signal. Ces réactifs sont bien connus dans le domaine. Par exemple, un anticorps primaire peut être conjugué à la biotine, et une avidine conjuguée à une peroxydase de raifort peut être ajoutée comme réactif de deuxième étape. La détection finale peut utiliser un substrat qui subit un changement de couleur en présence de la peroxydase. Un anticorps secondaire couplé à un marqueur fluorescent ou un radio-isotope peut également être utilisé. L'absence ou la présence ou la quantification de l'entité, primaire ou secondaire, marquée peut être ensuite effectuée par toute méthode connue dans le domaine, telle que la cytométrie en flux, la microscopie à fluorescence, la radiographie, le compteur à scintillation, etc.
Egalement, une méthode de type sandwich classique, telle que l'ELISA, peut être utilisée. Une méthode de type sandwich comprend la liaison d'un premier anticorps, notamment un anticorps de l'invention, spécifique d'une séquence d'acides aminés de l'invention à un support insoluble. Puis l'incubation du support portant l'anticorps avec un échantillon présumé comprendre une séquence d'acides aminés de l'invention, et une étape d'incubation en présence d'un second anticorps, notamment un anticorps de l'invention, spécifique d'une séquence d'acides aminés de l'invention liée au premier anticorps. Les temps d'incubation doivent être suffisants pour permettre les liaisons recherchées, et peuvent varier, généralement, de 0,1 à 3 heures. Des étapes de lavages peuvent être prévues entre chaque étape d'incubation avec l'une des entités précitées. Le second anticorps peut porter un marqueur permettant sa détection, comme un isotope radioactif, tel que l'iode (125I, 121I), le carbone (14C), le soufre (35S), le tritium (3H), l'indium (112In), un marqueur enzymatique, tel que la glucose oxydase, un marqueur fluorescent, comme la rhodamine, un marqueur d'affinité comme la biotine, ou des molécules chimioluminescentes.
Dans certains modes de réalisation, une méthode de l'invention peut être adaptée pour une mise en œuvre in vivo. Dans ces réalisations, une entité marqué de façon détectable et qui est un spécifique d'une séquence d'acides aminés de l'invention, par exemple un anticorps de l'invention, est administrée à un individu, par exemple par injection, et les cellules marquées sont situées en utilisant des techniques d'imagerie, telle que l'imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie, etc.
De manière préférée, la détermination d'une présence ou d'un niveau d'expression ou d'une activité d'au moins une séquence d'acides aminés peut être effectuée par détection de la séquence d'acides aminés ou d'un anticorps dirigé contre cette séquence d'acides aminés.
Une méthode préférée convenant à l'invention peut être un test ELISA mettant, par exemple, en œuvre un anticorps lié à un support solide, par exemple, une plaque de microtitrage en polystyrène ou du papier de nitrocellulose.
Un anticorps utilisé pour détecter séquence d'acides aminés de l'invention peut être anticorps de l'invention marqué par un isotope radioactif, comme l'iode (125I, 121I), le carbone (14C), le soufre (35S), le tritium (3H), l'indium (112In), un marqueur enzymatique, tel que la glucose oxydase, un marqueur fluorescent, comme la rhodamine, ou un marqueur d'affinité comme la biotine.
Une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV peut également être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester,
b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou. Une méthode pour déterminer pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer peut être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV isolée dudit individu,
b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, et c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou.
La présence de colonies cellulaires déterminées à l'étape c- est indicative d'un risque de carcinogénèse.
Des cellules eucaryotes permissives convenant à l'invention peuvent être des cellules HMEC. Les cellules peuvent être infectées avec une MOI (multiplicité d'infection - multiplicity of infection) de 1 à 10.
A titre d'exemple de milieu d'agar mou (soft agar assay) on peut citer celui commercialier sous la référence CytoSelect 96-well cell transformation assay kit par CELL BIOLABSINC.
Les cellules déposées dans la couche cellulaire d'agar peuvent avoir un nombre compris entre 0,4 et 4 X 105 cellules/ml. Les cellules infectées peuvent être ajoutées dans la couche basale d'agar au jour 1 après, voire au jour 13, ou encore au jour 33.
L'apparition de colonies cellulaires en agar mou peut être observée entre 6 et 8 jours après ensemencement. L'observation peut se faire en utilisant un microscope optique à lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X.
Comme contrôle négatif, peuvent être utilisées des cellules eucaryotes permissives, notamment HuMEC, infectées avec des souches HCMV non oncogènes, telles que les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, ou infectées par des souches de HCMV inactivées à 100 °C pendant 10 min. Comme contrôle positif, on peut utiliser des cellules infectées par des souches HCMV oncogéniques, telles que les souches HCMV-DB et HCMV- AD169, ou des lignées cellulaires oncogéniques connues comme entraînant la formation de colonies en agar mou, telles que les lignées HeLa et MCF-7.
Avantageusement, une méthode de l'invention peut en outre comprendre une étape de quantification de la prolifération cellulaire en agar mou. La prolifération cellulaire en agar mou en absence d'adhérence correspond à la transformation cellulaire. Une telle étape peut être effectuée en enlevant le milieu de culture qui se trouve à la surface de l'agar mou contenant les colonies cellulaires, puis solubilisation de l'agar pour récupérer les colonies cellulaires. Celles- ci peuvent être lysées et mises en contact avec un réactif, par exemple couplé à un fluorochrome, permettant de quantifier des cellules.
Une méthode l'invention permet de mettre en évidence la transformation des cellules épithéliales mammaires primaires par certaines souches de HCMV dites oncogéniques. Au contraire, des souches de HCMV ne transformant pas les cellules eucaryotes permissives sont considérées comme non-oncogéniques.
Une méthode de l'invention permet de cribler les souches de HCMV isolées d'un individu afin de déterminer si ces souches présentent un risque, par exemple élevé, faible ou nul, de carcinogénèse. Cette carcinogénèse peut être mammaire, mais peut également concerner d'autres organes, tels que les ovaires, le foie, ou le cerveau.
Un échantillon biologique permettant d'isoler ces souches peuvent être de tout type, notamment comme défini précédemment, et en particulièrement être du lait, des urines et du sang.
Avantageusement, une méthode de l'invention peut constituer un outil de diagnostique, de prévention et de suivi d'individus infectés, notamment de patientes, et en particulier celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour un cancer affectant d'autres organes, telles que les ovaires, le foie, ou le cerveau.
Une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV peut également être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester,
b- déterminer l'expression génique des cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression génique déterminée à l'étape b- avec l'expression génique de cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou l'expression génique de cellules eucaryotes permissives au HCMV infectées par une souche de HCMV oncogénique.
Des cellules eucaryotes permissives peuvent être des cellules HuMEC. Les cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial peuvent être, par exemple, des cellules MDA-MB-231, MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-20, HCC- 1937, ou Hs578T.
Une souche de HCMV oncogénique peut être HCMV-DB et HCMV-AD169.
L'expression génique des cellules peut être effectuée par toute méthode connue de l'homme de l'art, et en particulier par « Breast Cancer microArray » (BCA).
Comme contrôle négatif, peuvent être utilisés des souches HCMV non oncogènes, telles que les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, ou des souches de HCMV inactivées à 100 °C pendant 10 min. Comme contrôle positif, on peut utiliser des souches HCMV-DB et HCMV-AD169.
Une expression génique des cellules infectées similaire à l'expression génique de cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou de cellules infectées par une souche de HCMV oncogénique peut être indicatif du caractère oncogène de la souche de HCMV testée.
Selon un mode de réalisation la souche de HCMV peut être une souche HCMV isolée d'un individu souffrant d'un cancer, et en particulier d'un individu affecté d'un cancer du sein. Une souche de HCMV à tester peut être isolée du lait maternel, des urines, du sang ou de tout autre liquide biologique.
Une telle méthode peut également servir pour le pronostic, le diagnostic, la détermination d'un risque de carcinogénèse, la prévention ou le suivi d'individus infectés par une souche de HCMV, notamment d'individus présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche permet de classer un individu chez qui la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein et permet de suspecter le type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché.
Une méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche HCMV peut également être une méthode comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester et apte à exprimer BRCA1, et
b- déterminer l'expression de BRCA1 dans les cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression de BRCA1 déterminée à l'étape b- à une expression de BRCA1 déterminée dans des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche de HCMV oncogénique ou des cellules mammaires cancéreuses.
Des cellules permissives peuvent être des cellules HuMEC. Une souche de HCMV oncogénique peut être choisie parmi HCMV-DB et HCMV-AD169. A titre de contrôle négatif on peut utiliser des cellules permissives infectées par une souche de HCMV non-oncogénique choisie parmi HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, ou une souche de HCMV inactivées à 100 °C pendant 10 min.
Des cellules mammaires cancéreuses convenant à la méthode peuvent être telles que définies précédemment. La détermination de l'expression de la protéine BRCA1 dans des cellules eucaryotes permissives infectées par une souche HCMV peut permettre la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et peut servir pour le pronostic, le diagnostic, la détermination d'un risque de carcinogénèse, la prévention ou le suivi d'individus infectés par une souche de HCMV, notamment des individus présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche peut permettre de classer l'individu chez qui la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein (et potentiellement de l'ovaire) et peut permettre de suspecter un type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : Réplication des souches HCMV-DB et HCMV-AD169 dans les cellules HuMEC. Des cellules HuMEC sont infectées avec les souches HCMV-DB (Khan KA et al, Journal of Immunology 2009, 182 : 7784-7794) ou la souche HCMV-AD169 (Murphy ED et al, PNAS 2003, 100 : 14976-14981) à une « multiplicité d'infection » (multiplicity of infection = M.O.I.) de 1 ou 10 pendant une nuit, suivi d'un lavage intensif le lendemain avec du PBS et d'addition de milieu frais HuMEC et la réplication virale est suivie en fonction du temps par la mesure dans les surnageants de culture ou les lysats cellulaire de la charge virale HCMV en utilisant une technique de qPCR (Khan et al , 2009).
Figure 2 : Observation d'un effet cytopathogène (ECP) typique d'une infection par le HCMV (MOI = 10) au jour 29 après infection des cellules HuMEC par la souche HCMV-DB. Microscopie en lumière blanche X 10.
Figure 3 : Formation de colonies en « agar mou » ensemencé au jour 1 après infection avec des cellules HuMEC infectées avec les souches HCMV-DB et HCMV-AD169, mais non avec des cellules HMEC infectées avec les souches HCMV-TB40E et HCMV- TB40F (MOI = 1). La transformation est détectée par la formation de colonies de taille variable dans le milieu d'agar mou en absence d'adhérence. Les contrôles négatifs sont représentés par des cellules HMEC non-infectées ou infectées avec du virus HCMV inactivé à 100 °C pendant 10 min (« heat-inactivated » ou hi virus). Les contrôles positifs sont représentés par deux lignées cellulaires oncogéniques connues comme entraînant la formation de colonies en agar mou, les lignées HeLa et MCF-7.
Figure 4 : Transformation en « soft agar » des cellules HuMEC infectées avec HCMV-DB et HCMV-AD169, mais non-transformation des cellules HMEC infectées par les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB40F. Des cellules HMEC non-infectées et infectées sont ensemencées au jour 1 après infection. La transformation est quantifiée par la mesure de la prolifération des cellules en « soft agar » en utilisant un test MTT et une mesure de la densité optique à 570 nm. Les cellules transformées MCF-7 servent de contrôle positif.
Figure 5 : Etude de l'expression génique par « Breast Cancer microArray »
(BCA) des cellules HuMEC non-infectées et infectées par les différentes souches de HCMV (à différentes MOI) et comparaison avec des cellules mammaires cancéreuses de type basai (MDA-MB-231) ou de type luminal (MCF-7). L'expression génique des cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169, mais pas celle des souches non-oncogéniques HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, est proche de celle des cellules épithéliales mammaires cancéreuses de type « basal-like » représentées par des cellules telles que les cellules MDA-MB-231 (mais également les cellules MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-20, HCC- 1937, Hs578T, cette liste étant non- exhaustive) et non de celle des cellules épithéliales mammaires de type « luminal » représentées par les cellules MCF-7 (mais également les cellules BT-474, MDA-MB-453, T47D, ZR-75-1, cette liste étant non- exhaustive). Il est à noter que les HMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169 ont un profil triple négatif (négatif pour les récepteurs aux oestrogènes, pour les récepteurs à la progestérone et négatif pour HER2) qui est une des caractéristique des cancers du sein de type « basal-like ».
Figure 6 : L'expression de la protéine anti-tumorale BRCA1 est diminuée dans les cellules HuMEC infectées avec les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169, mais pas de manière significative dans les cellules HMEC infectées avec les souches non-oncogènes HCMV-TB40E et HCMV-TB40F. Il est à noter qu'une diminution de l'expression de BRCA1 et/ou une mutation de BRCA1 est observée de manière quasi- constante dans les cancers du sein de type « basal-like » qu'ils soient de type familial ou sporadique.
Figure 7 : Une augmentation importante des protéines du HCMV UL97 et UL82 (pp71) est observée dans les cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169. Au contraire cette augmentation n'est pas observée dans les cellules HMEC infectées par les souches de HCMV non-oncogènes TB40E et TB40F.
Les protéines UL97 et UL82 ont été décrite comme inactivant la protéine antitumorale Rb (rétinoblasome) en la phosphorylant et en favorisant sa dégradation cellulaire dans le protéasome 26S. L'inactivation de la protéine Rb est également observée avec un autre virus oncogène tel le papillomavirus oncogène. Le niveau d'expression des protéines codées par ces deux gènes est plus élevé pour les souches oncogéniques que pour les souches non- oncogéniques, comme ceci est montré dans cette figure.
Figure 8 : Détection par PCR des gènes complets et de fragments internes amplifiés des gènes UL82 et UL97. Le panel du haut montre l'amplification par PCR simple du gène complet UL82 de ?pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD 169 et DB (MOI = 10). Utilisant une PCR nichée un fragment interne spécifique de UL82 de 208 pb est amplifié à partir des mêmes surnageants. Le panel en bas à gauche montre l'amplification par PCR simple d'un fragment interne spécifique du gène UL97 de 312 pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD 169, DB, TB40E, TB40F (MOI = 10) ou non-infectées (Ctl -). Le gène entier UL97 de la souche HCMV DB de 2124 pb est amplifié par PCR simple.
Figure 9 : Détection par PCR nichée du fragment interne de 208 pb du gène UL82 dans des extraits d'acides nucléiques de biopsies de cancer du sein provenant de 5 patientes (cf aussi Figure 10). Des extraits d'acides nucléiques ont été obtenus à partir du tissu tumoral (T) ou macroscopiquement sain adjacent à la zone tumorale (S) provenant de biopsies mammaires de 5 patientes ayant un cancer du sein. Une PCR nichée a été réalisée afin de détecter un fragment amplifié de 208 pb correspondant au gène UL82 ainsi que le gène beta-actine servant de contrôle interne. Dans 4 cas sur 5 le gène UL82 du HCMV a été mis en évidence soit uniquement dans les extraits de la zone tumorale (patientes 3 et 4), soit à la fois dans la zone tumorale et la zone macroscopiquement saine adjacente (patients 2 et 5).
Figure 10 : Tableau récapitulant l'ensemble des données histologiques (type et grade), cellulaires (récepteurs aux oestrogènes, à la progestérone et à HER2) et de PCR nichée pour le gène UL82 de 5 patientes ayant un cancer du sein (cf figure 9).
Figure 11 : Tableau récapitulant les différences en amino-acides de la protéine UL82 (pp71) entre les souches oncogènes (HCMV DB, AD169), non-oncogènes (TB40E et TB40F) ainsi qu'une souche HCMV isolée du lait maternel (MS) par rapport à la souche prototypique de référence HCMV Merlin. Il s'agit de substitutions d'acides aminés par rapport à la souche Merlin sauf pour la souche HCMV-DB pour laquelle on observe une insertion de glutamine (Glu) en position 424.
Figure 12A, B & C : illustrations des séquences d'acides nucléiques et d'acides aminés considérés dans l'invention.
Les différents aspects de l'invention sont illustrés par les exemples ci-après, qui ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de celle-ci. EXEMPLES
MATERIELS & METHODES
Cultures cellulaires
Les cellules HuMEC (cellules épithéliales mammaires primaires), MCF7, MDA- MB-231 et HeLa ont été obtenues par l'ATCC. Les cellules ont été cultivées dans du milieu HuMEC.
Infection des cellules HuMEC par HCMV
Un stock acellulaire de virus a été préparé par la propagation de deux souches de CMV (la souche de laboratoire AD 169 et un isolât clinique HCMV-DB) dans des fibroblastes humains MRC5 comme décrit par Coaquette et al. (Clin Infect Dis, 2004;39: 155-161) et Khan et al. (J Immunol, 2009;182:7784-7794). AD 169 est une souche de HCMV de laboratoire, ayant subi de multiple passages, initialement isolée à partir des adénoïdes d'un enfant (Murphy et al, Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100: 14976-14981). L'isolât clinique HCMV-DB a été isolé à partir d'un échantillon de prélèvement cervical d'une femme de 30 ans, enceinte (Khan et al, J Immunol 2009; 182:7784-7794). La souche de HCMV TB40-E a un tropisme pour les cellules endothéliales ainsi que pour les macrophages. La souche TB40-F est dérivée en laboratoire de la souche TB40E après de nombreux passages de cette dernière en culture de cellules fibroblastiques.
Les fibroblastes humains MRC5 ont été cultivées dans du MEM avec 10 % de Sérum de Veau Fœtal (SVF), de la pénicilline (100 Ul/ml) et de la streptomycine (100 μg/ml). Les cellules en monocouche à confluence ont été infectées avec un isolât viral, et les virus ont été recueillis lorsque les effets cytopathiques ont touchés plus de 90 % des cellules. Les surnageants ont été récupérés et clarifiés par centrifugation, puis stockés à moins 80 °C jusqu'à utilisation.
Les cellules HuMEC, MCF7 et HeLa ont été infectées à différentes multiplicité d'infection (MOI : Multiplicity of Infection) pendant 2 heures à 37 ° C, puis soigneusement rincées, et recouvertes par du milieu frais.
Les titres de virus ont été déterminés par essai de formation de plaques dans des fibroblastes humains MRC5 comme décrit par Arrode et al. (J Virol, 2002;76: 142-150). Prolifération des cellules
Pour les tests de prolifération cellulaire, les cellules HuMEC, MCF7 et HeLa ont été laissées non infectées ou sont infectées par une souche de CMV. La prolifération a été mesurée en utilisant le kit de test de prolifération cellulaire MTT (Cayman Chemical # cat 10009365) et la mesure de l'antigène intracellulaire Ki67 Ag par cytométrie en flux, comme décrit par (Sharma et al, Hepatology, 2010;52: 1713-1722).
Culture en gel d'agar mou (soft agar)
Des cellules HuMEC sont infectées par le HCMV et au jour 1 après l'infection les cellules sont ensemencées dans un milieu d'agar mou (soft agar assay) (CytoSelect 96-well cell transformation assay kit, CELL BIOLABSINC).
La préparation d'une couche basale d'agar se fait selon les recommandations du fabriquant. De la même manière, la couche cellulaire d'agar contenant les cellules HMEC infectées par le HCMV, les cellules HuMEC non-infectées ou les cellules de lignée HeLa et MCF-7 est réalisée selon les recommandations du fabriquant. Les cellules déposées dans la couche cellulaire d'agar ont un nombre compris entre 0,4 et 4 X 105 cellules/ml. Les cellules HuMEC infectées par le HCMV (habituellement une MOI de 1 à 10 est utilisée) sont ajoutées dans la couche basale d'agar au jour 1 après infection, ou selon les cas en ensemençant des cellules HuMEC infectées depuis 13 jours ou depuis 33 jours. L'apparition des colonies en agar mou est habituellement observée entre 6 et 8 jours après ensemencement en utilisant un microscope optique à lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X.
La quantification de la prolifération cellulaire en agar mou en absence d'adhérence (ce qui correspond à la transformation cellulaire) est ensuite effectuée en enlevant le milieu de culture qui se trouve à la surface de l'agar mou contenant les colonies cellulaires, suivi d'une solubilisation de l'agar qui permet de récupérer les colonies cellulaires. Celles-ci ont été ensuite lysées et mises en contact avec un réactif couplé à un fluorochrome permettant de quantifier les cellules qui ont proliférées en agar mou avec l'aide d'un fluoromètre à une longueur d'onde de 485/520 nm, comme indiqué ci-dessus. Ces résultats sont représentés sous forme d'histogramme (OD).
Amplification du gène UL82 par PCR nichée
L'ADN total a été extrait et purifié en utilisant un kit QIAamp (Qiagen, Valencia, CA) en suivant les recommandations du fabriquant. Les lysats cellulaires de biopsie du sein ont été mélangés avec 300 μΐ de protéinase K (0.2 mg/ml) dans un tampon composé delOO mM NaCl, 10 mM Tris-Cl, 25 mM EDTA, et 0.5 % SDS ( H 8.0). Après une incubation à 55 °C pendant 3 heures, l'ADN a été extrait deux fois dans un mélange phénol/chloroforme (vol/vol) et ensuite précipité dans de l'éthanol. L'ADN a été dissous dans 20 μΐ de tampon TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA). Pour l'extraction de l'ADN des surnageants de culture de cellules (HuMECs ou MRC5) infectées avec différentes souches de HCMV, 200 μΐ de surnageant a été récupéré et l'ADN a été extrait en utilisant le kit "QIAamp DNA mini column" selon les instructions du fabriquant.
La première PCR a été réalisée à partir d'un volume de 50 μΐ contenant 1,5 μΐ de chacune des amorces externes (10 mM), 2 U de Taq DNA polymérase, et 200ng d'extrait d'ADN à tester. Les amorces externes UL82 utilisées sont les suivantes:
* Amorces externes UL82
5'-TAGATGCGGGGTCGACTGCGT-3' (SEQ ID NO 9)
5'-TCAGGCATCGTCCTCGCCCGG-3' (SEQ ID NO 10)
Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant 5 min, 35 cycles d'amplification de l'ADN ont été réalisés (94 °C pendant 1 min, 60 °C pendant 1 min, 72 °C pendant 1 ,5 min), suivis d'une extension terminale à 72 °C pendant 5 min.
Ensuite, 10 μΐ du produit amplifié lors de la première PCR a été soumis à une deuxième PCR pendant 35 cycles dans 50 μΐ de mélange, contenant 1 μΐ (10 mM) de chacune des amorces internes UL82 et 1 U de Taq polymérase. Pendant cette deuxième PCR, la durée d'extension a été de 45 sec. Les amorces internes UL82 utilisées ont été les suivantes:
* Amorces internes UL82
5' - CGAAAGCATTCTGGATCTGC-3 ' (SEQ ID NO 11)
5' - TTTCTGCATCACGACTCACC-3 ' (SEQ ID NO 12)
Après cette seconde amplification, 35 μΐ du produit de PCR a été soumis à électrophorèse dans un gel de 1,5 % d'agarose, marqué au bromure d'éthidium et visualiser sous lumière UV. Un résultat a été considéré positif lorsque l'échantillon testé et un contrôle positif montrent un fragment amplifié de 208 pb. Les fragments amplifiés de 208 pb ont été séquencés et n'ont pas montré de différence entre les souches HCMV DB, AD169, TB40E, TB40F et la souche prototypique HCMV Merlin lorsque la banque de données de séquences NCBI a été utilisée. Amplification du gène complet UL82 par PCR
Le gène entier UL82 a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes: Amorce sens : 5'-CGGGATCCATGTCTCAGGCATCGTCCTCG-3' (SEQ ID NO
13)
Amorce antisens: 5 ' -CGGAATTCCTAGATGCGGGGTCGACTGC-3 ' (SEQ ID
NO 14)
avec des sites de restriction BamHl et ECoRl présents respectivement, afin d'amplifier un fragment de 1680 pb.
La PCR a été réalisée comme suit. Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant 2 min, 35 cycles d'amplification ont été réalisés à 94 °C pendant 30 sec, 60 °C pendant 30 sec, 68 °C pendant 1,5 min, dans un mélange de 50 μΐ, contenant 2μ1 (10 mM) de chacune des amorces et 1 U de Platinum Taq DNA polymérase (Invitrogen USA).
Amplification du gène UL97 par PCR nichée
La première PCR a été réalisée à partir d'un volume de 50 μΐ contenant 2 μΐ de chacune des amorces externes (10 mM), 1 U de Taq DNA polymérase, et 200 ng d'extrait d'ADN à tester. Les amorces externes UL97 utilisées sont les suivantes:
* Amorces externes UL97
Amorce sens : 5'- CCAAGCTTATGTCCTCCGCACTTCGGTCT -3' (SEQ ID NO 15)
Amorce antisens: 5'- GCGAATTCTTACTCGGGGAACAGTTGACG -3' (SEQ
ID NO 16)
Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant 2 min, 35 cycles d'amplification de l'ADN ont été réalisés (94 °C pendant 30 sec, 60 °C pendant 45 sec, 68 °C pendant 2 min), suivis d'une extension terminale à 68 °C pendant 5 min.
Ensuite, 10 μΐ du produit amplifié lors de la première PCR ont été soumis à une deuxième PCR pendant 35 cycles dans 50 μΐ de mélange, contenant 1 μΐ (10 mM) de chacune des amorces internes UL97 et 1 U de Taq polymérase. Pendant cette deuxième PCR, la durée d'extension a été de 1 min. Les amorces internes UL97 utilisées sont les suivantes:
* Amorces internes UL97
5' - TCTACGTGCCCAAAGAGGACGATT -3' (SEQ ID NO 17),
5' - TGTGGAAACGTCGATGTACCGTGA -3' (SEQ ID NO 18) Après cette seconde amplification, 35 μΐ du produit de PCR a été soumis à électrophorèse dans un gel de 1,5 % d'agarose, marqué au bromure d'éthidium et visualisé sous lumière UV. Un résultat a été considéré positif lorsque l'échantillon testé et un contrôle positif montrent un fragment amplifié de 312 pb.
Amplification du gène complet UL97 par PCR
Le gène complet UL97 a été amplifié par PCR en utilisant les amorces suivantes: Amorce sens : 5'- CCAAGCTTATGTCCTCCGCACTTCGGTCT -3' (SEQ ID NO 19)
Amorce antisens: 5'- GCGAATTCTTACTCGGGGAACAGTTGACG -3' (SEQ
ID NO 20)
Avec des sites de restriction Hind III et EcoRl présents respectivement, afin d'amplifier un fragment de 2124 pb.
La PCR a été réalisée comme suit. Après une dénaturation initiale à 94 °C pendant
2 min, 35 cycles d'amplification ont été réalisés à 94 °C pendant 30 sec, 60 °C pendant 45 sec, 68 °C pendant 2 min, dans un mélange de 50 μΐ, contenant 2 μΐ (10 mM) de chacune des amorces et 1 U de Platinum Taq DNA polymérase (Invitrogen USA). Exemple 1
Cinétique de croissance du HCMV dans les cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC
Des cellules HuMEC sont amenées à confluence dans des flacons T25 ou T75 dans du milieu de culture HuMEC. Ces cellules confluentes sont ensuite infectées avec la souche HCMV-DB (Khan KA et al. Journal of Immunology 2009, 182 : 7784-7794) et la souche HCMV-AD169 (Murphy ED et al., PNAS 2003, 100 : 14976-14981) à une « multiplicité d'infection » (multiplicity of infection = M.O.I.) de 1 ou 10 pendant une nuit, suivi d'un lavage intensif le lendemain avec du PBS et d'addition de milieu frais HuMEC. La réplication virale est ensuite suivie en fonction du temps par la mesure dans les surnageants de cultures et les lysats cellulaires de la charge virale HCMV en utilisant une technique de PCR quantitative (qPCR) (Khan2009).
Les résultats obtenus présentés en Figure 1 montrent que les cellules épithéliales mammaires humaines sont permissives au HCMV et permettent la réplication du HCMV pendant plusieurs jours in vitro. Les résultats obtenus montrent également que de nouvelles particules virales HCMV sont produites dans le milieu extracellulaire suite à l'infection des HMEC. Enfin, l'ADN du HCMV est détecté directement dans les lysats de cellules HMEC indiquant que le HCMV pénètre bien dans ces cellules et les infecte de manière productive. Cette mise en évidence de l'infection des cellules HMEC par le HCMV permet avantageusement d'utiliser ces cellules infectées par le HCMV comme contrôle positif pour la détection de cellules mammaires épithéliales humaines infectées par le HCMV ou contenant des protéines et/ou des acides nucléiques du HCMV provenant de patientes présentant une pathologie mammaire potentiellement liée au HCMV. Exemple 2
Mise en évidence d'un effet cytopathogène (ECP) typique d'une infection par le HCMV dans les cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC.
Des cellules HuMEC sont amenées à confluence dans des flacons T25 ou T75 dans du milieu de culture HuMEC. Ces cellules confluentes sont ensuite infectées avec la souche HCMV-DB (Khan KA et al. Journal of Immunology 2009, 182 : 7784-7794) à une « multiplicité d'infection » (multiplicity of infection = M.O.I.) de 10 pendant une nuit, suivi d'un lavage intensif le lendemain avec du PBS et d'addition de milieu frais HuMEC. L'observation d'un effet cytopathogène (ECP) typique d'une infection par le HCMV (MOI = 10) après infection des cellules HuMEC par la souche HCMV-DB, mais également avec d'autres souches de HCMV, au bout de quelques jours à quelques semaines est réalisée par une observation au microscope optique en lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X.
Les résultats obtenus présentés en Figure 2 mettent en évidence une réplication active du HCMV dans les cellules mammaires primaires HMEC avec apparition d'un ECP typique du HCMV constitué de foyers de cellules augmentées de volumes et réfringentes, foyers à extension lente dans le milieu de culture.
Exemple 3
Transformation et prolifération en absence d'adhérence des cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC infectées par le HCMV.
Le test en agar mou permet de tester directement l'induction de l'oncogenèse des cellules mammaires primaires humaines HuMEC après une exposition de HCMV. La formation de colonies cellulaires en en gel d'agar mou est un test de croissance indépendant de l'ancrage, et est considéré comme le test le plus rigoureux pour détecter la transformation maligne des cellules. Des cellules HuMEC sont infectées par le HCMV et au jour 1 après l'infection les cellules sont ensemencées dans un milieu d'agar mou (soft agar assay) (CytoSelect 96-well cell transformation assay kit, CELL BIOLABSINC).
La préparation d'une couche basale d'agar se fait selon les recommandations du fabriquant. De la même manière, la couche cellulaire d'agar contenant les cellules HMEC infectées par le HCMV, les cellules HMEC non-infectées ou les cellules de lignée HeLa et MCF-7 est réalisée selon les recommandations du fabriquant. Les cellules déposées dans la couche cellulaire d'agar ont un nombre compris entre 0,4 et 4 X 105 cellules/ml. Les cellules HMEC infectées par le HCMV (habituellement une MOI de 1 à 10 est utilisée) sont ajoutées habituellement dans la couche basale d'agar au jour 1 après infection. L'apparition des colonies en agar mou est habituellement observée entre 6 et 8 jours après ensemencement en utilisant un microscope optique à lumière blanche à un grossissement de 10X à 40X. La formation de colonies en « agar mou » est observée avec des cellules HMEC infectées avec les souches HCMV-DB et HCMV-AD169, mais non avec des cellules HMEC infectées avec les souches HCMV-TB40E et HCMV-TB40F (MOI = 1). La transformation est détectée par la formation de colonies de taille variable dans le milieu d'agar mou en absence d'adhérence. Les contrôles négatifs sont représentés par des cellules HMEC non-infectées ou infectées avec du virus HCMV inactivé à 100 °C pendant 10 min (« heat-inactivated » ou hi virus). Les contrôles positifs sont représentés par deux lignées cellulaires oncogéniques connues comme entraînant la formation de colonies en agar mou, les lignées HeLa et MCF-7. La quantification de la prolifération cellulaire en agar mou en absence d'adhérence (ce qui correspond à la transformation cellulaire) est ensuite effectuée en enlevant le milieu de culture qui se trouve à la surface de l'agar mou contenant les colonies cellulaires, suivi d'une solubilisation de l'agar qui permet de récupérer les colonies cellulaires. Celles-ci vont ensuite être lysées et un réactif couplé à un fluorochrome permet de quantification des cellules qui ont proliférées en agar mou avec l'aide d'un fluoromètre à une longueur d'onde de 485/520 nm. Ces résultats sont représentés sous forme d'histogramme (OD).
Les résultats obtenus présentés en Figure 3 mettent en évidence la transformation des cellules épithéliales mammaires primaires par certaines souches de HCMV dites oncogéniques. Au contraire, des souches de HCMV ne transformant pas les cellules HuMEC sont considérées comme non-oncogéniques.
Au jour 1 post- infection des cellules HuMEC avec une souche d'HCMV (AD 169, DB, TB40-F, ou TB40-E), les cellules ont été cultivées dans un gel d'agarose mou pendant 21 jours. En parallèle, des contrôles appropriés (HuMEC non infectées Figure 3A, HuMEC infectées par HCMV inactivées par la chaleur, Figure 3B Heat-in, comme contrôles négatifs ; MCF7 et HeLa comme contrôles positifs, Figure 3C) ont été effectués.
Au jour 7 (au jour 8 post-infection) a été observée la formation de colonies en gel d'agar mou ensemencé avec des HuMEC infectés par les souches DB souches et AD169 (Figure 3B). En revanche aucune colonies n'a été observée en gel d'agar mou ensemencé avec des HuMEC infectés par les souches TB40-E et TB40-F (Figure 3D).
Ces résultats indiquent que la transformation cellulaire in vitro associée à la perte de l'inhibition de contact et de l'indépendance d'ancrage se produit dans des cellules mammaires primaires humaines infectées par HCMV DB ou HCMV AD 169.
Cette mise en évidence de souches oncogéniques ainsi que non-oncogéniques de HCMV sur des cellules HMEC permet de cribler les souches de HCMV isolées de patientes afin de déterminer si ces souches présentent un risque élevé, faible ou nul de carcinogénèse essentiellement mammaire, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Les liquides biologiques permettant d'isoler ces souches seront de tout type et plus particulièrement le lait, les urines et le sang.
Ces résultats indiquent que l'utilisation de la technique d'agar mou pour la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...).
Exemple 4
Etude de l'expression génique par « Breast Cancer microArray » (BCA) des cellules HuMEC infectées par les différentes souches de HCMV indique que le HCMV induit essentiellement une transformation des cellules épithéliales mammaires primaires HuMEC en un type « basal-like ».
L'étude de l'expression génique par « Breast Cancer microArray » (BCA) des cellules HuMEC non-infectées et infectées par les différentes souches de HCMV (à différentes MOI) a été réalisée et la comparaison est effectuée avec des cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial (MDA-MB-231) ou de type luminal (MCF-7). L'expression génique des cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV- AD169, mais pas celle des cellules infectées par des souches non-oncogéniques HCMV- TB40E et HCMV-TB40F, est proche de celle des cellules épithéliales mammaires cancéreuses de type « basal-like » représentées par des cellules telles que les cellules MDA-MB-231 (mais également les cellules MDA-MB-468, MDA-MB-231, BT-20, HCC- 1937, Hs578T, cette liste étant non-exhaustive), et non de celle des cellules épithéliales mammaires de type « luminal » représentées par les cellules MCF-7 (mais également les cellules BT-474, MDA-MB-453, T47D, ZR-75-1, cette liste étant non-exhaustive). Il est à noter que les HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169 ont un profil triple négatif (négatif pour les récepteurs aux oestrogènes, pour les récepteurs à la progestérone et négatif pour HER2) qui est une des caractéristique des cancers du sein de type « basal-like ».
Ces résultats (Figure 5) indiquent qu'en infectant des cellules épithéliales mammaires primaires par une souche HCMV isolée d'une patiente et lorsque le lysat de ces cellules infectées est testé par un microarray ciblant les gènes modulés dans le cancer du sein (BCA), ont pourra déterminer si cette souche a potentiellement un risque oncogénique ou non. La souche HCMV pourra être isolée du lait maternel, des urines, du sang ou de tout autre liquide biologique.
D'autre part, ces résultats indiquent que l'utilisation de la technique du microarray pour la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche permet de classer la patiente chez laquelle la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein et permet de suspecter le type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché.
Exemple 5
Etude de l'expression de la protéine BRCA1 dans les cellules HuMEC infectées par différentes souches de HCMV.
Des cellules HuMEC sont infectées par des souches de HCMV oncogéniques, HCMV-DB et HCMV-AD169, ou des souches de HCMV non-oncogéniques HCMV-TB40E et HCMV-TB40F, puis l'expression de BRCA1 est déterminée.
L'expression de cette protéine est très diminuée dans les cellules HuMEC infectées par des souches de HCMV oncogéniques, au contraire des cellules infectées par des souches de HCMV non-oncogéniques. Cette diminution de l'expression de la protéine BRCA1 traduit également le fait que les souches oncogéniques de HCMV induisent essentiellement une transformation des cellules épithéliales mammaires primaires HMEC en un type « basal- like ».
L'expression de la protéine anti-tumorale BRCAl est diminuée dans les cellules HMEC infectées avec les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV-AD169, mais pas de manière significative dans les cellules HMEC infectées avec les souches non-oncogènes HCMV-TB40E et HCMV-TB40F. Il est à noter qu'une diminution de l'expression de BRCAl et/ou une mutation de BRCAl est observée de manière quasi- constante dans les cancers du sein de type « basal-like » qu'ils soient de type familial ou sporadique.
Ces résultats (Figure 6) indiquent que la mesure de l'expression de la protéine BRCAl dans les cellules HuMEC infectées par une souche HCMV peut permettre la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et pourra servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...). Par ailleurs, cette approche permettra de classer la patiente chez laquelle la souche de HCMV a été isolée comme à risque ou non de cancer du sein (et potentiellement de l'ovaire) et permettra de suspecter le type de cancer du sein impliqué, les cancers de type basal-like étant de mauvais pronostic et nécessitant d'autant plus un dépistage précoce et un suivi rapproché. Exemple 6
L 'expression des protéines du HCMV UL97 et UL82 permet de discriminer entre souche HCMV oncogénique et non-oncogéniques.
Une augmentation importante des protéines du HCMV UL97 et UL82 (pp71) est observée dans les cellules HuMEC infectées par les souches oncogènes HCMV-DB et HCMV- AD 169. Au contraire cette augmentation n'est pas observée dans les cellules HuMEC infectées par les souches de HCMV non-oncogènes TB40E et TB40F.
Les protéines UL97 et UL82 ont été décrites comme inactivant la protéine antitumorale Rb (rétinoblasome) en la phosphorylant et en favorisant sa dégradation cellulaire dans le protéasome 26S. L'inactivation de la protéine Rb est également observée avec un autre virus oncogène tel le papillomavirus oncogène.
Ces résultats (Figure 7) indiquent que au-delà d'un certain seuil d'expression des deux protéines codées par les gènes UL97 et UL82, le HCMV serait oncogénique comme cela est le cas pour les souches DB et AD 169, et on peut appeler ces souches HCMV, souches à protéines UL82 élevée et/ou UL97 élevée. Au contraire sous ce seuil d'expression le HCMV ne serait pas oncogénique comme cela est le cas pour les souches TB40-E et TB40-F, et on pourrait appeler ces souches de HCMV, souches à protéines UL82 faible et/ou UL97 faible. Ces résultats indiquent également que le niveau d'expression des protéines UL97 et UL82 dans les cellules HMEC infectées par le HCMV peut permettre la détection de souches HCMV à pouvoir oncogénique élevé, faible ou nul et peut servir d'outil diagnostique, de prévention et de suivi des patientes infectées, notamment celles présentant un cancer du sein, mais potentiellement également pour d'autres organes (ovaires, foie, cerveau...).
Exemple 8
Détection par PCR des gènes complets et de fragments internes amplifiés des gènes UL82 et UL97 du HCMV.
Des séquences issues des gènes UL82 et UL97 ont été identifiées permettant d'amplifier la totalité de ces gènes et/ou une séquence interne de ces gènes. Comme le montre la Figure 8, le panel du haut montre l'amplification par PCR simple du gène complet UL82 de 1680 pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD 169 et DB (MOI = 10). Utilisant une PCR nichée un fragment interne spécifique de UL82 de 208 pb est amplifié à partir des mêmes surnageants. Le panel en bas à gauche montre l'amplification par PCR simple d'un fragment interne spécifique du gène UL97 de 312 pb dans les surnageants de cultures de cellules HMEC infectées par les souches de HCMV AD 169, DB, TB40E, TB40F (MOI = 10) ou non-infectées (Ctl -). Le gène entier UL97 de la souche HCMV DB de 2124 pb est amplifié par PCR simple.
Ces résultats indiquent que des séquences d'acides nucléiques permettant d'amplifier les gènes UL97 et UL82 de souches oncogéniques et non-oncogéniques ont été identifiées. Par ailleurs, ces résultats indiquent qu'à partir des ces séquences des outils diagnostiques, de prévention, thérapeutique et vaccinal peuvent être mis en œuvre.
Exemple 9
Détection par PCR du gène UL82 du HCMV dans des biopsies de cancer du sein.
Comme l'indique la Figure 9, la détection par PCR nichée du fragment interne de 208 pb du gène UL82 dans des extraits d'acides nucléiques de biopsies de cancer du sein provenant de 5 patientes (cf aussi Figure 10) a été réalisée. Des extraits d'acides nucléiques ont été obtenus à partir du tissu tumoral (T) ou macroscopiquement sain adjacent à la zone tumorale (S) provenant de biopsies mammaires de 5 patientes ayant un cancer du sein. Une PCR nichée a été réalisée afin de détecter un fragment amplifié de 208 pb correspondant au gène UL82 ainsi que le gène beta-actine servant de contrôle interne. Dans 4 cas sur 5 le gène UL82 du HCMV a été mis en évidence soit uniquement dans les extraits de la zone tumorale (patientes 3 et 4), soit à la fois dans la zone tumorale et la zone macroscopiquement saine adjacente (patients 2 et 5).
La Figure 10 montre un tableau récapitulant l'ensemble des données histologiques
(type et grade), cellulaires (récepteurs aux oestrogènes, à la progestérone et à HER2) et de PCR nichée pour le gène UL82 de 5 patientes ayant un cancer du sein (les résultats des PCR des ces 5 patientes sont représentés dans la Figure 9).
Ces résultats indiquent que la mise en évidence du HCMV par détection de séquences du gène UL82 dans des biopsies de cancer du sein peut être utilisé à titre diagnostic (même de nombreuses années après l'infection de la patiente), de pronostic et potentiellement à des fins thérapeutique en fonction de la présence du HCMV uniquement dans la zone tumorale ou à la fois dans cette dernière ainsi que dans le tissu macroscopiquement sain adjacent.
Exemple 11
Identification des séquences d'acides aminés responsables de l'activité oncogène du HCMV
La Figure 11 montre un tableau récapitulant les différences en amino-acides de la protéine UL82 (pp71) entre les souches oncogènes (HCMV DB, AD169), non-oncogènes (TB40E et TB40F) ainsi qu'une souche HCMV isolée du lait maternel (MS) par rapport à la souche prototypique de référence HCMV Merlin. Il s'agit de substitutions d'acides aminés par rapport à la souche Merlin sauf pour la souche HCMV-DB pour laquelle on observe une insertion de glutamine (Glu) en position 424. Les mutations au niveau de l'extrémité C- terminale de la protéine UL82, de l'acide-aminé 420 à l'acide aminé 540 (en gras dans le tableau), sont présentes uniquement dans les séquences des souches HCMV oncogéniques DB et AD 169 et non au niveau des souches non-oncogéniques HCMV TB40E et TB40F.
Ces résultats identifient des séquences de nucléotides du gène UL82 et d'acides aminés de la protéine UL82 impliqué dans l'activité oncogénique du HCMV. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer une propriété oncogénique chez un HCMV.
2. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV pour déterminer un risque de carcinogénèse ou pour évaluer un pronostic d'un cancer.
3. Utilisation d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV pour déterminer un risque de carcinogénèse ou pour évaluer un pronostic d'un cancer, ladite protéine UL82 comprenant dans une région s 'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion.
4. Utilisation selon la revendication 2 ou 3, dans laquelle la carcinogénèse ou le cancer est une carcinogénèse ou un cancer du sein ou du foie, de préférence du sein.
5. Séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une séquence d'acides aminés d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés étant une séquence consistant en SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
6. Amorce nucléotidique consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou
UL97 d'une souche de HCMV, ladite amorce convenant spécifiquement au séquençage ou à l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, ladite amorce nucléotidique étant une séquence consistant en une des séquences SEQ ID NO 9 à 20.
7. Amorce nucléotidique consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite amorce convenant spécifiquement au séquençage ou à l'amplification d'une séquence d'acides nucléiques telle que définie en revendication 5.
8. Sonde nucléotidique consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, ladite sonde étant une sonde d'hybridation pour détecter spécifiquement une séquence d'acides nucléiques comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, ladite sonde nucléotidique étant une séquence consistant en l'une quelconque des séquences SEQ ID NO 9 à 20.
9. Sonde nucléotidique consistant en une séquence d'acides nucléiques consécutifs issus d'une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite sonde étant une sonde d'hybridation pour détecter spécifiquement une séquence d'acides nucléiques telle que définie en revendication 5.
10. Vecteur d'expression comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques selon la revendication 5.
11. Cellule hôte isolée transfectée avec un vecteur d'expression selon la revendication 10.
12. Séquence d'acides aminés isolée d'une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ladite séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'acides aminés choisie parmi SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7.
13. Anticorps apte à se lier spécifiquement à une séquence d'acides aminés selon la revendication 12.
14. Biomarqueur pour évaluer une propriété oncogénique d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, ledit biomarqueur consistant en une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV ou en une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV.
15. Biomarqueur pour déterminer un risque de carcinogénèse chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, ledit biomarqueur consistant en une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV, ladite protéine UL82 comprenant dans une région s 'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion.
16. Kit de diagnostic contenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 d'une souche de HCMV, la séquence d'acides nucléiques codant pour une séquence d'acides aminés consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, ou au moins une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence choisie parmi SEQ ID NO 6 ou SEQ ID NO 7, au moins une amorce nucléotidique selon la revendication 6 ou 7, au moins une sonde nucléotidique selon la revendication 8 ou 9, et/ou au moins un anticorps selon la revendication 13.
17. Médicament comprenant au moins une séquence d'acides nucléiques isolée codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV ou au moins une séquence d'acides aminés isolée consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, ou au moins un anticorps selon la revendication 13.
18. Médicament selon la revendication précédente, ledit médicament étant un vaccin.
19. Médicament selon la revendication 17 ou 18, pour prévenir et/ou traiter une carcinogénèse induite par une infection par HCMV.
20. Méthode pour évaluer un caractère oncogène d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, comprenant au moins les étapes de:
a) déterminer dans un échantillon biologique isolé une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'au moins une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 de ladite souche de HCMV, et
b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
21. Méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes de:
a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, obtenu à partir dudit individu, une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 ou UL97 d'une souche de HCMV, et
b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle.
22. Méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes de : a) déterminer, dans un échantillon biologique isolé, obtenu à partir dudit individu, une présence ou un niveau d'expression ou une activité d'une séquence d'acides nucléiques codant pour une protéine UL82 d'une souche de cytomégalovirus humain, HCMV, ou d'une séquence d'acides aminés consistant en une séquence d'une protéine UL82 d'une souche de HCMV, et
b) comparer la détermination de l'étape a) à une détermination contrôle, ladite protéine UL82 comprenant dans une région s'étendant de l'acide aminé 421 à l'acide aminé 540 au moins un acide aminé muté par substitution ou insertion.
23. Méthode selon la revendication 21 ou 22, dans laquelle la carcinogénèse ou le cancer est une carcinogénèse ou un cancer du sein ou du foie, de préférence du sein.
24. Utilisation d'une souche de cytomégalovirus humain HCMV-DB pour déterminer un caractère oncogène d'une souche distincte de HCMV.
25. Méthode pour déterminer un risque de carcinogénèse, notamment mammaire, chez un individu en ayant besoin, ou pour déterminer un pronostic d'un cancer chez un individu atteint dudit cancer, comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV isolée dudit individu,
b- cultiver les cellules infectées à l'étape a- dans une couche basale d'agar mou, c- déterminer la présence ou l'absence de colonies cellulaires en agar mou.
26. Méthode selon la revendication précédente, dans laquelle la présence de colonies cellulaires déterminées à l'étape c- est indicative d'un risque de carcinogénèse.
27. Méthode pour déterminer un caractère oncogénique d'une souche de HCMV comprenant au moins les étapes consistant à :
a- infecter des cellules eucaryotes permissives au HCMV au moyen d'une souche de HCMV à tester,
b- déterminer l'expression génique des cellules infectées à l'étape a-, et c- comparer l'expression génique déterminée à l'étape b- avec des cellules mammaires cancéreuses de type basal/myoépithélial ou l'expression génique de cellules eucaryotes permissives au HCMV infectées par une souche de HCMV oncogénique.
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