WO2013125886A1 - 셀룰라아제를 생산하는 신균주 및 이를 이용한 당화방법 - Google Patents

셀룰라아제를 생산하는 신균주 및 이를 이용한 당화방법 Download PDF

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    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01004—Cellulase (3.2.1.4), i.e. endo-1,4-beta-glucanase
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to Pholiota adiposa SKU714, a method for producing cellulose from the strain, and a method for glycosylating cellulose using the produced cellulase.
  • Cellulose is the most abundant organic substance on earth, and it is a renewable resource that doesn't have to worry about exhaustion like oil or coal. However, most of the cellulose resources are being disposed of as agricultural and forest wastes, and these agricultural and forest wastes are considered to be the main sources of environmental pollution. The world's agricultural and forestry waste is produced at over 3 billion tonnes annually, with more than 800 million tonnes produced in Asia alone.
  • agricultural and forest waste resources consist mainly of cellulose and hemicellulose, if they can be saccharified and converted to monosaccharides containing glucose, it can be a great help in solving food, fuel and environmental problems. .
  • the cell wall of the plant is composed of polymers such as cellulose (cellulose, insoluble ⁇ -1,4-glucan fiber), hemicellulose (hemicellulose, non-cellulose polysaccharide), and lignin (lignin, polysaccharide of complex polyphenol structure).
  • cellulose cellulose, insoluble ⁇ -1,4-glucan fiber
  • hemicellulose hemicellulose, non-cellulose polysaccharide
  • lignin lignin, polysaccharide of complex polyphenol structure.
  • Cellulose is the most abundant component, followed by hexycellulose, which is the main component of xylan, and these two components make up more than 50% of the total plant biomass.
  • Cellulose is a homopolymer in which glucose units are linked by ⁇ -1,4 bonds.
  • endo- ⁇ -1,4-glucanase In order to decompose it into monosaccharides, endo- ⁇ -1,4-glucanase [EC 3.2.1.4], Three enzymes exist: exo- ⁇ -1,4-glucanase [EC 3.2.1.91] and beta-glucosidase (EC 3.2.1.21). need. Endo-glucanase randomly cleaves ⁇ -1,4 glucose bonds from the inside, and exo-glucanase cleaves into cellobiose, a glucose disaccharide at the non-reducing sugar end. Cellobiose is finally degraded into glucose by beta-glucosidase.
  • Trichoderma reese ZU-02 Trichoderma reesei ATCC 56764
  • Aspergillus and Trichoderma were used.
  • Trichoderma reese ZU-02 Trichoderma reesei ATCC 56764
  • the process of producing ethanol from biomass has many advantages such as regeneration of raw materials and environmental friendliness of fuels produced.
  • ethanol produced from lignocellulosic materials is more expensive than gasoline. It is remarkably high and becomes obstacle to practical use.
  • the production cost of glycosylated enzyme accounts for the largest portion, about 60% of the total cost.
  • the present invention has been made in view of the need to solve the problems of the prior art, the problem to be solved by the present invention is as follows.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing cellulase using the strain.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for saccharifying cellulose using the cellulase.
  • the present invention is characterized by the black scale mushroom SKU714 (Accession No. KCCM 11187P) strain producing cellulase.
  • the present invention is characterized by culturing black scale mushroom SKU714 (Accession No. KCCM 11187P) in the method for producing cellulase.
  • the present invention is a cellulase production method, corn steep 5 ⁇ 10 g / L, yeast extract 1 ⁇ 5 g / L, potassium dihydrogen phosphate 3 ⁇ 7 g / L, potassium hydrogen phosphate 3 ⁇ 7 g / L, It is characterized by using a medium containing 1 to 5 g / L magnesium sulfate heptahydrate, 0.01 to 0.03 g / L thiamine hydrochloride, and 10 to 30 g / L carbon source (final pH 4.5 to 5.5).
  • the present invention is characterized in that in the cellulase production method, the carbon source included in the medium is selected from the group consisting of cellulose, cellobiose, rice straw, and avice.
  • the present invention is a cellulase production method, the stirring speed is 100 to 200 rpm, the aeration amount is 0.8 to 1.2 vvm, and the culture temperature is characterized in that the culture at 25 to 30 °C conditions.
  • the present invention is characterized in using the cellulase produced from the strain in the method of glycosylation.
  • the present invention is characterized in that the saccharification method of cellulose is saccharified under conditions of 5 to 25% by weight of substrate, 1 to 45 FPU / g-substrate of cellulase, pH 4 to 7 and temperature of 50 to 80 ° C.
  • the present invention is characterized in that cellulose saccharification method, that is, rice straw, sheep willow or mixtures thereof as a substrate.
  • Black scale mushroom SKU714 a new strain isolated from the mushroom of the present invention, produces highly active cellulase.
  • Cellulase produced from the new strain of the present invention exhibits better glycation yield than conventional saccharification enzymes, so that low-calorie foods and food wastes are produced in bioenergy, textile, paper, detergent, feed and food industries. It can be used for various purposes such as fermentation.
  • Figure 2a shows that ⁇ -glucosidase activity (- ⁇ -), cellobiohydrolase activity (- ⁇ -), endoglucanase activity (- ⁇ -), and a unit amount of enzyme of the black scale mushroom SKU714 strain It is a graph showing the production rate (- ⁇ -) of the glucose produced by decomposing and comparing the culture time.
  • Figure 2b shows the xylanase activity (- ⁇ -), laccase activity (- ⁇ -), mannase activity (- ⁇ -), and lignin peroxidase activity (- ⁇ -) of the black scale mushroom SKU714 strain
  • the graph shows the comparison according to the incubation time.
  • Figure 3a is a graph showing the optimal active pH of ⁇ -glucosidase enzyme produced by the black scale mushroom SKU714 strain.
  • Figure 3b is a graph showing the optimal activity temperature of ⁇ -glucosidase enzyme produced by the black scale mushroom SKU714 strain.
  • the first strain (S1 to S6) was selected through the above search process.
  • the selected strains were then used as Trichoderma RZZU-02, which is used as a conventional cellulase production strain as a control group (C), and then the fibrin resolution was confirmed in solid agar medium to which carboxymethylcellulose was added as described above. Strains were selected.
  • the ITS-5.8S rDNA sequence was analyzed at the Korea Microorganism Conservation Center.
  • the ITS-5.8S rDNA sequence of the S4 strain is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the S4 strain was named as 'Poliota adiposa SKU714' and was deposited internationally in accordance with the Budapest Treaty under the deposit number KCCM 11187P on April 20, 2011 with the Korea Microorganism Conservation Center.
  • a 50 mL flask containing 50 mL of preculture medium (Potato starch 4 g / L, Dextrose 20 g / L) was inoculated with the black scale mushroom SKU714 strain and cultured for 5 days at 150 rpm and 25 ° C in a shake incubator. It was.
  • Production medium (corn immersion 8 g / L, yeast extract 2 g / L, potassium dihydrogen phosphate 5 g / L, potassium hydrogen phosphate 5 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 3 g / L, thiamine hydrochloride 0.02 g / L 50 mL of the above culture medium was inoculated into a 50 mL flask containing 20 g / L of carbon source and a final pH of 5), and the main culture was performed at a stirring speed of 150 rpm, a culture temperature of 25 ° C., and pH 5 for 7 days.
  • Nitrogen source (5 g / L) ⁇ -glucosidase activity (U / mL) Production rate of glucose (U / mL) produced by unit enzyme decomposing Yeast extract 18.6 0.72 peptone 11.8 0.45 Corn Dipping 18.5 0.70 Element 14.5 0.31 Ammonia Sulfate 6.0 0.24 Potassium Nitrate 11.1 0.36 Sodium nitrate 10.7 0.34 Trypton 14.6 0.69
  • the yeast extract, corn steep meal, tryptone as a nitrogen source showed a relatively good cellulase activity, when using the yeast extract as a nitrogen source showed the maximum cellulase activity.
  • FIGS. 2A and 2B show the results of measuring the activity of ⁇ -glucosidase, cellobiohydrolase, and endoglucanase, and the production rate of glucose produced by unit enzyme decomposing by cultivation time.
  • Figure 2b shows the results of measuring the change in activity of xylanase, laccase, mannase, and lignin peroxidase for each culture time in a graph.
  • lignocellulosic contained in plants cannot obtain high glycation yields only by hydrolysis of enzymes.
  • a pretreatment process of fragmenting lignin and hemicellulose prior to enzymatic hydrolysis is performed to increase the fibrin hydrolysis efficiency of the cellulase enzyme.
  • 10 g of rice straw was added to a flask containing 40 mL of a 2% by weight sodium hydroxide solution and reacted at 85 ° C. for 1 hour.
  • the rice straw obtained by filtration with a 0.45 uM filter was dried and used at 65 ° C.
  • pretreated rice straw was added to various concentrations of cellulase in 20 mL of 0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0) by concentration.
  • Cellulase-added buffer was reacted at 150 rpm at 15-55 ° C. for 72 hours, and then the reaction solution was boiled at 100 ° C. for 3 minutes, cooled at room temperature, and centrifuged at 4000 rpm for 15 minutes to remove denatured enzyme. .
  • Enzyme activity was measured using the supernatant as a reducing sugar measurement.
  • the glycosylation rate was determined by Equation 1 based on the weight of 1 g of rice straw, which was reduced after drying the finished rice straw at 105 ° C. for 24 hours.
  • the saccharification yield was excellent when the initial concentration of the willow substrate is 10-25 wt%, and the optimum saccharification yield was found at the 20 wt% sheep willow concentration.
  • saccharification experiments of sheeps were performed using cellulase produced by the black scale mushroom SKU714 strain. That is, saccharification experiment was performed at a substrate concentration of 10% by weight, enzyme concentration of 25 FPU / g-substrate, pH 6, and temperature of 65 ° C.
  • Table 7 shows a comparison of the glycosylation yield between the cellulase produced from the black scale mushroom SKU714 strain and the cellulase derived from Tricoderma Ressei of Novozyme (trade name Celluclast 1.5L).
  • the saccharification experiment of rice straw was performed using cellulase produced by the black scale mushroom SKU714 strain under optimized conditions. That is, the saccharification experiment was performed for 24 hours at a substrate concentration of 10% by weight, enzyme concentration 16 FPU / g-substrate, pH 6, temperature 65 °C.
  • Table 8 shows a comparison of glycation yields with cellulase produced from black scale mushroom SKU714 strain, cellulase produced from Tricoderma ressei-derived cellulase from Novozyme (trade name Celluclast 1.5L) and fungus strain (Pholiota nameko, KTCC26163). It was.
  • the strains of the Nacho mushroom and the Black scale mushroom are the same Pholiotasp strain, but the glycosylation efficiency of cellulose shows a remarkable difference.
  • the fungus strain had a limitation in being applied as a glycosylase enzyme for reasons of low protein productivity and low enzyme activity, but the black scale mushroom strain of the present invention produced various biomass degrading enzymes including cellulase, high protein productivity, and high enzyme. Its activity and thermal stability make it suitable for commercial use.

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Description

셀룰라아제를 생산하는 신균주 및 이를 이용한 당화방법
본 발명은 신균주 검은비늘버섯 (Pholiota adiposa) SKU714, 상기 균주로부터 셀룰로스를 생산하는 방법, 그리고 생산된 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로스를 당화하는 방법에 관한 것이다.
셀룰로스 (cellulose)는 지구상에 존재하는 가장 풍부한 유기물질로, 석유나 석탄처럼 고갈에 대하여 걱정할 필요가 없는 재생 가능한 자원이다. 그러나 대부분의 셀룰로스 자원은 농산 및 임산 폐기물로 버려지고 있고, 이러한 농산 및 임산 폐자원은 환경오염원의 주범으로 간주되고 있다. 전 세계의 농산 및 임산 폐자원은 매년 30억 톤 이상 생산되고 있으며, 아시아에서만 8억 톤 이상이 생산된다.
농산 및 임산 폐자원은 주로 셀룰로스와 헤미셀룰로스로 이루어져 있으므로, 이들을 당화 (saccharification)시켜 포도당을 포함한 단당류로 전환만할 수 있다면, 식량문제, 연료문제 그리고 환경문제의 해결에 큰 도움이 될 수 있을 것이다.
농산 및 임산 폐자원으로부터 단당류를 회수하기 위한 일반적인 방법으로서, 황산을 첨가하여 고온에서 가압 및 분해하는 방법이 알려져 있다. 이 경우 강산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 생산장비가 필요하며, 각종 부반응으로 인하여 다양한 분해산물이 생성되므로 단당류를 분리 회수하는 공정이 어렵고, 분해반응 후의 폐기물 처리 등의 비용으로 인해 생산단가가 높으며, 전 과정이 환경 비친화적이라는 문제점을 안고 있다. 상기한 바와 같이 일반적인 당화방법이 상업적으로 이용하기에는 한계가 있으므로, 이를 대체할 수 있는 보다 친환경적인 셀룰로스의 당화방법에 대한 연구가 있어 왔다. 이러한 연구의 일환으로서 다양한 당화효소가 개발되었고, 그 용도도 다양하여 산업적으로 여러 분야에서 상업화 되어 있으며 또한 새로운 응용연구도 활발하게 진행되고 있다. 당화효소로서 셀룰라아제 (Cellulase)는 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 등에서 많이 이용되고 있으며, 이외에도 식품 산업 분야에서는 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도에 적용되고 있다.
한편, 식물체의 세포벽은 셀룰로스 (cellulose, 불용성 β-1,4-글루칸 섬유), 헤미셀룰로스 (hemicellulose, 비셀룰로스계 다당류), 리그닌 (lignin, 복잡한 폴리페놀 구조의 다당류)과 같은 중합체로 구성되어 있다. 구성성분 중 셀룰로스가 가장 많이 존재하고, 그 다음으로 자일란 (xylan)이 주성분인 헤미셀룰로스가 많이 존재하며, 이들 두 성분이 전체 식물 바이오매스의 50% 이상을 차지한다. 셀룰로스는 포도당 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 동종 중합체로서 이를 단당류로 분해하기 위해서는 엔도-β-1,4-글루칸아제 (endo-β-1,4-glucanase) [EC 3.2.1.4], 엑소-β-1,4-글루칸아제 (exo-β-1,4-glucanase) [EC 3.2.1.91], 베타-글루코시다아제 (β-glucosidase) (EC 3.2.1.21) 등 세 종류의 효소가 필요하다. 엔도-글루칸아제는 안쪽에서 β-1,4 포도당 결합을 무작위적으로 절단하고, 엑소-글루칸아제는 비환원당 말단에서 포도당 이당체인 셀로바이오스 (cellobiose)로 절단해 나간다. 셀로바이오스 (cellobiose)는 베타-글루코시다아제에 의해서 포도당으로 최종 분해된다.
셀룰라아제 효소의 생산은 주로 곰팡이 (fungi)를 이용하였으며, 특히 산업적인 측면에서 아스퍼질러스 (Aspergillus)와 트리코더마 (Trichoderma)를 이용하였다. 셀룰라아제 생산 균주로서 트리코더마 리제이 ZU-02 (Trichoderma reesei ATCC 56764)가 대표적인 균주로 집중 연구되어 왔으나, 효소의 농도 및 활성이 산업화를 충족시킬 만큼 충분하지 못하다는 문제점이 있다. 예를 들어, 바이오매스로부터 에탄올을 생산하는 공정은 원료 물질의 재생, 생산 연료의 환경 친화성 등 많은 장점을 갖고 있지만, 리그노셀룰로스계 물질을 원료로 하여 생산된 에탄올은 휘발유에 비해 생산 단가가 현저히 높아 실용화에 장애가 되고 있다. 이러한 에탄올 생산 공정에 소요되는 비용 중에서, 당화효소의 생산비가 전체 비용의 약 60 %로 가장 큰 비중을 차지하고 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 셀룰로스의 효율적인 당화공정 개발이 절실히 필요하고, 그 중에서도 환경친화성이 높은 신규를 이용한 셀룰로스의 당화공정 개발이 보다 절실히 요구되고 있다.
본 발명은 종래 기술의 문제점을 해결하고자 하는 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 하기와 같다.
본 발명의 목적은 고활성 셀룰라아제를 생산하는 신균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 셀룰라아제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 셀룰라아제를 이용한 셀룰로스의 당화방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 검은비늘버섯 SKU714 (기탁번호 KCCM 11187P) 균주를 그 특징으로 한다.
본 발명은 셀룰라아제의 생산방법에 있어서, 검은비늘버섯 SKU714 (기탁번호 KCCM 11187P)를 배양하는 것을 그 특징으로 한다.
또한 본 발명은 셀룰라아제 생산방법에 있어서, 옥수수 침지분 5～10 g/L, 효모추출물 1～5 g/L, 인산이수소칼륨 3～7 g/L, 인산수소칼륨 3～7 g/L, 황산마그네슘 7수화물 1～5 g/L, 티아민염산염 0.01～0.03 g/L, 및 탄소원 10～30 g/L (최종 pH 4.5～5.5)를 포함하는 배지를 이용하는 것을 그 특징으로 한다.
또한 본 발명은 셀룰라아제 생산방법에 있어서, 배지에 포함되는 탄소원이 셀룰로스, 셀로비오스, 볏짚, 및 아비셀로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 그 특징으로 한다.
또한 본 발명은 셀룰라아제의 생산방법에 있어서, 교반속도는 100 내지 200 rpm, 통기량은 0.8～1.2 vvm, 및 배양온도는 25 내지 30 ℃ 조건에서 배양시키는 것을 그 특징으로 한다.
본 발명은 셀룰로스의 당화방법에 있어서, 상기 균주로부터 생산된 셀룰라아제를 이용하는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 셀룰로스의 당화방법에 있어서, 기질 농도 5～25 중량%, 셀룰라아제 농도 1～45 FPU/g-기질, pH 4～7 및 온도 50～80 ℃ 조건에서 당화시키는 것을 그 특징으로 한다.
또한 본 발명은 셀룰로스의 당화방법에 있어서, 셀룰로스 공급원 즉, 기질로는 볏짚, 양버들 또는 이의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 버섯에서 분리한 신균주인 검은비늘버섯 SKU714는 고활성 셀룰라아제를 생산한다.
본 발명의 신균주로부터 생산된 셀룰라아제는 종래 당화효소보다 우수한 당화수율을 나타내므로 바이오에너지의 생산, 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 및 식품 산업에 있어 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과이다.
도 2a는 검은비늘버섯 SKU714 균주의 β-글루코시다아제 활성(-●-), 셀로바이오하이드로라아제 활성(-○-), 엔도클루카나아제 활성(-▲-), 및 단위량의 효소가 여지를 분해하여 생성하는 포도당의 생성율(-Δ-)을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2b는 검은비늘버섯 SKU714 균주의 자일라나아제 활성(-●-), 라카아제 활성(-○-), 만나나아제 활성(-▲-), 및 리그닌 페록시다아제 활성(-Δ-)을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 검은비늘버섯 SKU714균주에 의해 생산된 β-글루코시다아제 효소의 최적 활성 pH를 도시한 그래프이다.
도 3b는 검은비늘버섯 SKU714균주에 의해 생산된 β-글루코시다아제 효소의 최적 활성 온도를 도시한 그래프이다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명하나, 본 발명이 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 셀룰라아제 생산 균주의 선별
셀룰라아제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 버섯균의 배양액 10 uL를 생리식염수 10 mL에 현탁하고, 현탁액 10 uL (1x104 cfu mL-1)를 취하여 2% 카르복시메칠셀룰로스가 첨가된 감자한천배지 (potato dextrose agar)에 도말한 후, 27 ℃에서 3일간 배양 하였다. 고체 한천배지에서 콜로니가 형성된 후 0.1%의 콩고레드 시약으로 염색하고, 1 M 염화나트륨으로 탈색하여 그 콜로니 주위에 섬유소 분해환이 생성된 균들을 선별하는 방법으로 다양한 버섯 포자로부터 셀룰라아제를 생산하는 버섯균을 다수 탐색하였다.
위의 탐색과정을 통해 1차 균주(S1부터 S6까지)를 선별하였다. 이렇게 선별된 균주는 대조군(C)으로 종래 셀룰라아제 생산균주로 이용되는 트리코더마 리제이 ZU-02를 이용하여 상기와 같이 카르복시메칠셀룰로스를 첨가한 고체 한천배지에서 섬유소 분해능을 확인한 후, 섬유소 분해능이 가장 뛰어난 S4 균주를 선별하였다.

실시예 2. 균주의 동정
상기 실시예 1에서 분리한 S4 균주의 동정을 위하여 한국미생물 보존센터에서 ITS-5.8S rDNA 서열을 분석하였다. S4 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.
상기 S4 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과 검은비늘버섯으로 동정되었다 (도 1).
상기 S4균주는 '검은비늘버섯 (Pholiota adiposa) SKU714'으로 명명하였고, 한국미생물보존센터에 2011년 4월 20일 기탁번호 KCCM 11187P호로 부다페스트조약에 의거하여 국제 기탁하였다.

실시예 3. 셀룰라아제 생산을 위한 배지의 최적화 실험

(1) 탄소원의 종류에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7L 발효조에서 탄소원의 종류에 따른 검은비늘버섯 SKU714 균주의 셀룰라아제 생산 활성을 확인하는 실험을 수행하였다. 이때, 탄소원으로는 셀룰로스, 글루코스, 락토오스, 말토오스, 셀로비오스, 카르복시메칠셀룰로스, 슈크로스, 자일란, 볏짚, 아비셀을 사용하였다.
전 배양 배지 (Potato starch 4 g/L, Dextrose 20 g/L) 50 mL가 들어있는 50 mL 플라스크에, 검은비늘버섯 SKU714 균주를 접종하고 진탕 배양기에서 150 rpm, 25 ℃로 5일간 종배양을 수행하였다. 생산배지(옥수수 침지분 8 g/L, 효모추출물 2 g/L, 인산이수소칼륨 5 g/L, 인산수소칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3 g/L, 티아민염산염 0.02 g/L 및 탄소원 20 g/L, 최종 pH 5)가 포함된 50 mL 플라스크에, 상기의 종배양액 50 mL를 접종하고 교반속도 150 rpm, 배양온도 25 ℃, pH 5에서 7일간 본 배양을 수행하였다.
각 탄소원에 대한 검은비늘버섯 SKU714 균주의 β-글루코시다제 활성 및 포도당의 생성율을 측정한 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
탄소원 (20 g/L) β-글루코시다제 활성 (U/mL) 단위량의 효소가 여지를 분해하여 생성하는 포도당의 생성율 (U/mL)
셀룰로스 16.4 0.63
글루코스 3.45 0.15
락토오스 4.10 0.14
말토오스 8.60 0.31
셀로비오스 10.6 0.43
카르복시메칠셀룰로스 3.52 0.13
슈크로스 3.42 0.12
자일란 5.30 0.26
볏짚 15.0 0.52
아비셀 14.9 0.61

상기 표 1에 의하면, 탄소원으로서 셀룰로스, 셀로비오스, 볏짚, 아비셀을 사용하였을 때 비교적 우수한 셀룰라아제의 활성을 나타내었으며, 셀룰로스를 탄소원으로 사용하였을 때 최대 셀룰라아제의 활성을 나타내었다.
(2) 질소원의 종류에 따른 셀룰라아제 활성 시험
7L 발효조에서 질소원의 종류에 따른 검은비늘버섯 SKU714 균주의 셀룰라아제 생산 활성을 확인하는 실험을 수행하였다. 이때, 질소원으로는 효모추출물, 펩톤, 옥수수 침지분, 요소, 황산암모니아, 질산칼륨, 질산나트륨, 트립톤을 사용하였다.
질소원의 농도 5 g/L일 때, 각 질소원의 종류에 따른 검은비늘버섯 SKU714 균주의 β-글루코시다제 활성 및 포도당의 생성율을 측정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
질소원 (5 g/L) β-글루코시다제 활성 (U/mL) 단위량의 효소가 여지를 분해하여 생성하는 포도당의 생성율 (U/mL)
효모추출물 18.6 0.72
펩톤 11.8 0.45
옥수수 침지분 18.5 0.70
요소 14.5 0.31
황산암모니아 6.0 0.24
질산칼륨 11.1 0.36
질산나트륨 10.7 0.34
트립톤 14.6 0.69

상기 표 2에 의하면, 질소원으로서 효모추출물, 옥수수 침지분, 트립톤을 사용하였을 때 비교적 우수한 셀룰라아제의 활성을 나타내었으며, 효모추출물을 질소원으로 사용하였을 때 최대 셀룰라아제의 활성을 나타내었다.

실시예 4: 고활성 효소 생산을 위한 최적 배양조건 실험
(1) 양버들을 기질로 사용했을 경우 셀룰라아제의 최적 배양조건 실험
7L 발효조에서 옥수수 침지분 8 g/L, 효모추출물 2 g/L, 인산이수소칼륨 5 g/L, 인산수소칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3 g/L, 티아민염산염 0.02 g/L 및 양버들 20 g/L을 포함하는 배지의 최적화 실험을 수행하였다. pH 3～7 범위 및 배양온도를 20～35 ℃ 범위로 변화시키면서 셀룰라아제 활성을 비교하였다. 그 결과 pH 5, 배양온도 25～30 ℃에서 최대 셀룰라아제 활성을 나타내었다.
또한, 상기한 양버들 기질이 포함된 배지에서 최적의 배양조건(pH 5, 25 ℃)에서 각 셀룰라아제에 대한 배양 시간별로 활성을 측정하여 도 2a 및 2b에 각각 나타내었다. 도 2a에는 β-글루코시다아제, 셀로바이오하이드로라아제, 및 엔도클루카나아제의 활성과, 단위량의 효소가 여지를 분해하여 생성하는 포도당의 생성율을 배양 시간별로 측정한 결과를 그래프로 나타내었다. 그리고, 도 2b에는 자일라나아제, 라카아제, 만나나아제, 및 리그닌 페록시다아제의 활성변화를 배양 시간별로 측정한 결과를 그래프로 나타내었다.

(2) 볏짚을 기질로 사용했을 경우 셀룰라아제의 생산 및 활성 최적화 실험
7L 발효조에서 옥수수 침지분 8 g/L, 효모추출물 2 g/L, 인산이수소칼륨 5 g/L, 인산수소칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 7수화물 3 g/L, 티아민염산염 0.02g/L, 및 볏짚 20 g/L을 포함하는 배지의 최적화 실험을 수행하였다. pH 3～7 범위 및 배양온도를 20～35 ℃ 범위로 변화시키면서 셀룰라아제 생산을 비교하였다. 그 결과 pH 5, 배양온도 25～30 ℃에서 최대 셀룰라아제 생산을 나타내었다.
또한 생산된 셀룰라아제 활성의 최적 조건을 다음과 같이 탐색하였다. pH 3～7.5 범위 및 온도를 40～85 ℃ 범위로 변화시키면서 β-1,4-글루코시다아제 활성을 비교하였고, 그 결과는 도 3a 및 3b에 나타내었다. 도 3a 및 3b의 결과에 의하면, pH 5, 온도 65 ℃에서 최대 셀룰라아제 활성을 나타내었다.

실시예 5. 균주의 당화수율 분석
일반적으로 식물체가 함유하고 있는 리그노셀룰로스는 효소의 가수분해만으로 높은 당화수율을 얻을 수 없다. 이에, 효소가수분해 이전에 리그닌과 헤미셀룰로스를 조각화하는 전처리 과정을 수행하여, 셀룰라아제 효소의 섬유소 가수분해 효율이 증가되도록 한다. 본 실험에서는 전처리를 위해 2 중량% 수산화나트륨 용액 40 mL가 담긴 플라스크에 볏짚 10 g을 넣고 85 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.45 uM 필터로 여과하여 얻은 볏짚을 65 ℃에서 건조시켜 사용하였다.
균주의 최적 당화 조건을 탐색하기 위하여, 효소의 농도, 기질의 농도, 반응온도, 반응 pH를 변화시키면서 실험을 진행하였다.
먼저, 전 처리된 볏짚을 농도별로 20 mL의 0.1 M 소디움 아세테이트 완충액 (pH 5.0)에 다양한 농도의 셀룰라아제와 함께 첨가하였다. 셀룰라아제가 첨가된 완충액은 15～55 ℃에서 150 rpm으로 72시간 동안 반응시킨 후 변성된 효소를 제거하기 위하여 반응액을 100 ℃ 에서 3분간 끓이고 실온에서 식힌 뒤 4000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전시켰다. 효소활성 측정은 환원당 측정법으로 그 상등액을 이용하였다.
당화율 기준은 반응이 끝난 볏짚을 105 ℃에서 24시간 건조한 후 줄어든 1 g의 볏짚 무게를 기준으로 하기 수학식 1에 의해 측정되었다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2013001406-appb-M000001

(1) 효소 농도에 따른 당화수율 실험
온도 65 ℃, pH 6의 조건에서, 효소 농도에 따른 검은비늘버섯 SKU714 균주의 당화실험을 수행한 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
효소 농도 (FPU/g-기질) 당화수율 (%)
1 9.7
5 23.9
17.5 83.0
30 81.2
42.5 80.6

상기 표 3에 의하면, 효소농도 15～45 FPU/g-기질일 때 최적의 당화수율을 나타내었다.
(2) 기질 농도에 따른 당화수율 실험
본 실험에서는 균주 검은비늘버섯 SKU714 균주가 생산한 당화효소에 의한 양버들의 당화에 미치는 기질 농도의 영향을 확인하였다. 양버들 기질의 초기 농도를 1～27 중량%로 변화시키면서 당화수율을 측정한 결가를 하기 표 4에 나타내었다.
기질농도 (중량%) 당화수율 (%)
1 43.0
2 63.5
11 81.2
20 83.1
27 51.0

상기 표 4의 결과에 의하면, 양버들 기질의 초기 농도가 10～25 중량%일 때 당화수율이 우수하였고, 20 중량% 양버들 농도에서 최적의 당화수율이 나타났다.
(3) 온도에 따른 당화수율 실험
본 실험에서는 균주 검은비늘버섯 SKU714 균주가 생산한 당화효소에 의한 양버들의 당화에 미치는 온도의 영향을 확인하였다. 반응 온도를 20, 35, 50, 65, 80 ℃로 각각 변화시키면서 당화수율을 측정한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
반응온도 ( ℃) 당화수율 (%)
20 33.2
35 45.0
50 75.8
65 82.1
80 71.2

상기 표 5의 결과에 의하면, 당화 온도 50～80 ℃에서 당화수율이 우수하였고, 65 ℃에서 최적의 당화수율이 나타났다.
(4) pH에 따른 당화수율 실험
본 실험에서는 균주 검은비늘버섯 SKU714 균주가 생산한 당화효소에 의한 양버들의 당화에 미치는 pH의 영향을 확인하였다. 반응 pH를 1, 3, 5, 7, 9로 각각 변화시키면서 당화수율을 측정한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
pH 당화수율 (%)
1 20.0
3 62.6
5 81.4
7 84.0
9 39.4

상기 표 6의 결과에 의하면, pH 4～7에서 당화수율이 우수하였고, pH 7에서 최적의 당화수율이 나타났다.
실시예 6: 최적 조건에서의 당화실험
(1) 검은비늘버섯 셀룰라아제를 이용한 양버들의 당화실험
최적화된 조건에서 검은비늘버섯 SKU714 균주가 생산한 셀룰라아제를 이용하여 양버들의 당화실험을 수행하였다. 즉, 기질 농도 10 중량%, 효소 농도 25 FPU/g-기질, pH 6, 온도 65 ℃에서 당화실험을 수행하였다. 하기 표 7에는 검은비늘버섯 SKU714 균주에서 생산된 셀룰라아제와 노보자임사의 트리코더마 레세이 유래 셀룰라아제 (상품명 Celluclast 1.5L)와의 당화수율을 비교하여 나타내었다.
균 주 당 생산량(mg/g-양버들) 당화수율(%)
검은비늘버섯 SKU714 672 84
Celluclast 1.5L 242 35

(2) 검은비늘버섯 셀룰라아제를 이용한 볏짚의 당화 실험
최적화된 조건에서 검은비늘버섯 SKU714 균주가 생산한 셀룰라아제를 이용하여 볏짚의 당화실험을 수행하였다. 즉, 기질 농도 10 중량%, 효소 농도 16 FPU/g-기질, pH 6, 온도 65 ℃에서 24시간 동안 당화실험을 수행하였다. 하기 표 8에는 검은비늘버섯 SKU714 균주에서 생산된 셀룰라아제, 노보자임사의 트리코더마 레세이 유래 셀룰라아제 (상품명 Celluclast 1.5L) 및 나도팽나무버섯 균주 (Pholiota nameko, KTCC26163)에서 생산된 셀룰라아제와의 당화수율을 비교하여 나타내었다.
셀룰라아제 당생산량(mg/g-볏짚) 당화수율(%)
검은비늘버섯 SKU714 690 88
트리코더마 레세이 582 76
나도팽나무버섯 420 56

나도팽나무버섯 균주와 검은비늘버섯 균주는 동일한 비늘버섯 속 (Pholiotasp.) 균주이나, 셀룰로스의 당화 효율은 현저한 차이를 나타내고 있다. 특히나 나도팽나무버섯 균주는 단백질 저생산성 및 효소 저활성의 이유로 당화효소로 적용하는데 한계가 있었으나, 본 발명의 검은비늘버섯 균주는 셀룰라제를 포함한 다양한 바이오매스 분해효소의 생산, 단백질 고생산성, 높은 효소 활성 및 열안정성으로 인해 상업적으로 이용하기에 적합하다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11187P
수탁일자 : 20110420
Figure PCTKR2013001406-appb-I000001
<110> SK CHEMICALS CO., LTD.

<120> Cellulase producing novel strain and saccharification method
using the same

<130> DP-2011-0069

<160> 1

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1
<211> 592
<212> DNA
<213> Pholiota adiposa

<400> 1
aaggatcatt attgaatgaa cttggtatga ttgttgctgg cccatctggg catgtgcacg 60

tctgccatct ttatctctcc acctgtgcac atattgtagg tctggaataa atttctgagg 120

caactcagta gtggggaatg ctgctgcaaa gcggctttgc ctgtaatttc agatctatgt 180

tttcatatac accataaaaa tgtaacagaa tgtaataatg ggtcttgtac ctataaacta 240

tatacaactt tcagcaacgg atctcttggc tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg 300

cgataagtaa tgtgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcaccttgcg 360

ctccttggta ttccgaggag catgcctgtt tgagtgtcat taaattctca atcttattag 420

cttttgttaa taaagacttg gatgtggggg ggaaattttt ttgaaggttt ctcgcgagcc 480

ttctccccta aaatgcatta gctggtcgct cgcgcgaact gtctattggt gtgataatta 540

tctacgccat tgactaactg ccatagtagc accgcttcta atcgtcttcg ga 592

Claims (8)

  1. 기탁번호 KCCM 11187P호로 기탁된, 셀룰라아제를 생산하는 검은비늘버섯 (Pholiota adiposa) SKU714.
  2. 청구항 1의 검은비늘버섯 (Pholiota adiposa) SKU714를 배양하여 셀룰라아제를 생산하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 배양은 옥수수 침지분 5～10 g/L, 효모추출물 1～5 g/L, 인산이수소칼륨 3～7 g/L, 인산수소칼륨 3～7 g/L, 황산마그네슘 7수화물 1～5 g/L, 티아민염산염 0.01～0.03 g/L 및 탄소원 10～30 g/L을 포함하고, pH 4.5～5.5인 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.

  4. 제 3항에 있어서,
    상기 탄소원은 셀룰로스, 셀로비오스, 볏짚, 및 아비셀로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.

  5. 제 2항 또는 제 3항에 있어서,
    배양은 교반속도 100 내지 200 rpm, 통기량 0.8～1.2 vvm 및 배양온도는 25 내지 30 ℃ 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.

  6. 청구항 1의 검은비늘버섯 (Pholiota adiposa) SKU714를 배양하여 생산된 셀룰라아제를 이용하여, 셀룰로스 기질을 당화하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스의 당화방법.

  7. 제 6항에 있어서,
    상기 셀룰로스 기질은 양버들, 볏짚 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 셀룰로스의 당화방법.



  8. 제 6항에 있어서,
    상기 당화는 기질 농도 5～25 중량%, 셀룰라아제 농도 1～45 FPU/g-기질, pH 4～7 및 온도 50～80 ℃ 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스의 당화방법.

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