WO2013165076A1 - 산화환원반응용 시약 조성물 - Google Patents

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oxidase
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김문환
임은혜
이명호
이웅기
차근식
남학현
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Definitions

  • the present invention relates to a stabilizer composition for improving the stability of the redox reaction reagent : and to a redox reagent composition having improved stability including the same, wherein the redox reagent composition is used for an electrochemical biosensor. Can be used as a reagent.
  • the electrochemical biosensor for measuring blood glucose is prepared by drying a reagent prepared by mixing an enzyme, an electron transporter, and various stabilizers and dispersants with a working electrode.
  • the most important properties of the electrochemical biosensor are the type of enzyme used and the electron transporter. It is a characteristic.
  • the glucose-reductase oxide used in most commercially available electrochemical sensors FAD-GOx (flavin adenine dinucleotide- glucose oxidase) is at rest and oxidation only glucosyl O 'scan column key banung selectivity is excellent, but the blood Because of the reaction with oxygen dissolved in the sensor, the sensor made using the FAD-GOx enzyme can vary greatly depending on the type of sample blood (venous, arterial, or capillary).
  • sensors made using the PQQ-GDH enzyme show little or no effects of oxygen in the blood, while in addition to glucose specificity, mannose, maltose or Several monosaccharides or disaccharides, such as lactose, are also selective, especially in patients with renal peritoneal dialysis, which may result in maltreatment caused by maltose. Became known.
  • NAD-GDH nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase
  • the reaction resistance is higher than that of PQQ-GDH.
  • coenzymes such as NAD + or NADP + have to be added separately to the reagent composition and have low storage stability.
  • Electrochemical sensors using FAD-GDH are not affected by the amount of oxygen dissolved in the blood, have high stability, and maltose, which is a disadvantage of the sensor using PQQ-GDH enzyme. There is no specificity for, so it has been used a lot recently.
  • FAD-GDH has a limited number of electron mediators that can be used together depending on the type of bacteria or fungi that produce the enzyme.
  • the most commonly used electron transporter is potassium ferricyanide [K 3 Fe (CN) 6 ], which is low in cost and good in response to both sensors using FAD-GOx, PQQ-GDH or FAD-GDH. useful.
  • the sensor using this electron carrier produces measurement errors due to interfering substances such as uric acid and gentisic acid in the blood, and is easily changed due to temperature and humidity. Special care should be taken, and it is difficult to accurately detect low concentrations of glucose due to the change of background current after long time storage.
  • Nuclear sandstone minruthenium chloride [Ru (NH 3 ) 6 Cl 3 ] has higher redox stability than ferric amide. Biosensors using this electron carrier are easy to manufacture and store, and stable due to the small change in background current even after long-term storage. It has this high advantage, but it is difficult to produce a commercially useful sensor because it does not match with the FAD-GDH.
  • the present invention provides a biosensor reagent composition that meets these requirements.
  • the present inventors completed the present invention by confirming that a hydrophilic inclusion compound may be added to the redox reagent used in the electrochemical biosensor to stabilize the redox enzyme and the electron transporter.
  • one embodiment of the present invention provides a reagent stabilizer composition for redox reaction comprising a hydrophilic containing compound as an active ingredient.
  • Another example provides a redox reagent composition comprising an oxidoreductase, an electron transfer mediator, and a hydrophilic containing compound, and having enhanced stability.
  • Another example provides a method for preparing a stability enhancing redox reagent comprising mixing a redox enzyme, an electron transfer mediator, and a hydrophilic containing compound.
  • Another example provides an electrochemical biosensor comprising a reagent composition for the electrochemical biosensor with enhanced stability.
  • the present inventors have found that the reaction rate between the enzyme and the electron transporter is increased when thionine or 1-Methoxy PMS (1 -Methoxy-5 -methy lphenazinium methylsulfate) and nucleated ammamine ruthenium chloride are used as the electron transport mediator of FAD-GDH. It has been found that the glucose detection performance is significantly improved, and they have applied for a patented biosensor reagent composition (Korean Patent Application No. 201 2 -0009 6 68).
  • the present inventors have described thionine as a second electron transfer medium in order to enhance the activity of the first electron transfer medium, the metal-containing complex (eg, nucleus ammamine ruthenium chloride) and the low-responsive redox enzyme. And compounds having similar structures to this compound (see FIG. 1).
  • hydroxypropyl-a-cyclodextrin HP-a-CD
  • hydrophilic inclusion compound such as hydroxypropyl-
  • ⁇ - ⁇ -CD is very soluble in water, so that it melts up to almost 50% (w / v) per unit volume, which forms a complex with a substance that is not soluble in water. It forms a stable complex of forms.
  • hydrophilic inclusion compounds in the electrochemical biosensors including FAD-GDH enzymes and nucleated ammonia ruthenium and thionine transfer media, do not react with oxygen and are deteriorated by high temperature and humidity, It is confirmed that the detection sensitivity is hardly affected by the interfering substance, and it can be used as a reagent for redox reaction excellent in long-term storage, and more specifically, it can be provided a reagent for an electrochemical biosensor and a biosensor including the same. The present invention was completed.
  • the redox reaction reagent provided in the present invention is not affected by oxygen, has little change in performance due to temperature and humidity, and changes in performance even after long-term storage.
  • embodiments of the present invention exemplify biosensors for measuring glucose as applicable examples, cholesters, lactates, creatinine, hydrogen peroxide, alcohols, amino acids can be prepared by varying the types of enzymes included in the reagent composition of the present invention. It can be applied to biosensors for the quantification of various substances such as glutamate.
  • the reagent stabilizer composition for a biosensor according to the present invention and the reagent composition comprising the same do not react with oxygen, have a small degree of deterioration due to high temperature and humidity, and are hardly affected by an interfering substance, and thus, metabolites in blood, in particular, Useful in the manufacture of electrochemical biosensors for glucose detection.
  • FIG. 1 is an exploded perspective view of a planar biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is an exploded perspective view of a face-type biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is a graph measuring the change in the current appears when a sample of different glucose concentration is applied using the planar biosensor according to Example 2.
  • Figure 4 is a graph measuring the change in current appears when a sample of different glucose concentration is applied by using the face-type biosensor according to Example 1.
  • Figure 5 is a graph showing the change in phase according to the maturation period when the aged biosensor according to Example 3 and Comparative Example 2 at 50 o C and a sample with different glucose concentration is applied.
  • 6 is a structure of thionine used in one embodiment of the present invention.
  • one example of the present invention is a redox reaction reagent stabilizer composition
  • a hydrophilic containing compound as an active ingredient
  • the redox reaction reagent can be used as a reagent for an electrochemical biosensor
  • another example of the present invention provides a reagent stabilizer composition for an electrochemical biosensor comprising a hydrophilic containing compound as an active ingredient.
  • oxidoreductases include oxidoreductases, electron transfer mediators, and hydrophilic containing compounds. It includes, and provides a reagent composition for redox reaction enhanced stability.
  • the redox reaction reagent composition can be applied to an electrochemical biosensor
  • another example of the present invention includes an oxidoreductase, an electron transfer mediator, and a compound containing an electrochemical having enhanced stability. It provides a reagent composition for a biosensor.
  • Another example provides a method of preparing a reagent for enhanced redox reaction, comprising the step of mixing a redox enzyme, an electron transfer mediator, and a hydrophilic containing compound.
  • the redox reagent composition may be applied to an electrochemical biosensor
  • another example of the present invention is a stability including mixing a redox enzyme, an electron transfer medium, and a hydrophilic containing compound.
  • Provided are methods for preparing reagents for enhanced electrochemical biosensors.
  • Another example provides an electrochemical biosensor comprising a reagent composition for an electrochemical biosensor having enhanced stability.
  • an 'inclusion compound' is also called an inclusion compound or an inclusion compound, and under appropriate conditions, one of the two molecules forms a cage-like inclusion lattice and the other molecule is filled in between. It means a compound having a form.
  • Hydrophilic containing compounds used in the present invention is cyclodextrin
  • (cyclodextrin) -based compound and derivatives thereof may be at least one selected from the group consisting of (cyclodextrin) -based compound and derivatives thereof, and more specifically, may be a cyclodextrin-based compound.
  • Hydrophilic containing compounds, such as cyclodextrin-based compounds as described above plays a role in reducing the change in glucose detection performance even if the sensor is stored for a long time.
  • the cyclodextrin-based compounds include six alpha-cyclodextrins ( ⁇ -cyclodextrin), seven beta-cyclodextrins ( ⁇ -cyclodextrin), eight gamma-cyclodextrins ( ⁇ -cyclodextrin), etc. It may be selected from the group consisting of, specifically, the cyclodextrin may be beta-cyclodextrin.
  • the derivative of the cyclotextine-based compound may be one in which the cyclotextine-based compound includes one or more substituents selected from the group consisting of a hydroxypropyl group and a methyl group.
  • hydroxypropyl-a-cyclodextrin hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, hydroxypropyl-gamma- Cyclodextrin (hydroxypropyl-"-cyclodextrin), methyl-beta-cyclodextrin, etc. are mentioned.
  • hydroxypropyl-beta-cyclodextrin is illustrated as a representative example, alpha- And derivatives with similar properties of gamma-cyclodextrin may also show similar properties (see FIG. 4).
  • hydrophilic containing compounds i.e., cyclotextrin-based compounds and derivatives of cyclodextrin-based compounds, in particular hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, are very soluble in water, and therefore, for redox reagent compositions, especially for electrochemical biosensors.
  • redox reagent compositions especially for electrochemical biosensors.
  • it forms a complex with an insoluble substance in the reagent to form a stable complex that is soluble in water, thereby increasing the solubility and stabilizing the reagent.
  • the present invention provides a use for stabilizing a redox reaction reagent for a hydrophilic containing compound, such as an electrochemical biosensor, and, as an embodiment thereof, for a redox reaction compound containing the hydrophilic containing compound as an active ingredient.
  • a reagent stabilizer composition or a reagent stabilizer composition for a biosensor is provided.
  • the stabilized redox reaction reagent or reagent for an electrochemical biosensor is a conventional redox reaction reagent or reagent for an electrochemical biosensor, including a redox enzyme and an electron transfer medium.
  • a reagent composition for enhanced redox reaction comprising an oxidoreductase, an electron transfer mediator, and a hydrophilic containing compound.
  • the redox reagent composition is applicable as a reagent composition for an electrochemical biosensor, so in another example, the stability including a redox enzyme, an electron transfer mediator, and a hydrophilic containing compound is improved.
  • Reagent compositions for enhanced electrochemical biosensors are provided.
  • a method for preparing a stability enhancing redox reaction reagent comprising the step of mixing a oxidoreductase, an electron transfer mediator, and a hydrophilic containing compound.
  • the redox reaction reagent composition may be applied to an electrochemical biosensor, and in another example, an electrochemical biotechnology having enhanced stability including the step of mixing a redox enzyme, an electron transfer medium, and a hydrophilic-containing compound.
  • a method for preparing a reagent for a sensor comprising the step of mixing a oxidoreductase, an electron transfer mediator, and a hydrophilic containing compound.
  • the step of mixing the oxidoreductase, the electron transfer medium and the hydrophilic containing compound is a step of mixing the oxidoreductase and the electron transfer medium and adding a hydrophilic containing compound to the obtained mixture This can be done by including a step.
  • Another example provides an electrochemical biosensor comprising a reagent composition for an electrochemical biosensor having enhanced stability.
  • Another example provides an electrochemical biosensor comprising a reagent composition for an electrochemical biosensor having enhanced stability.
  • the hydrophilic containing compound serves as a reagent stabilizer to stabilize the reagent as described above.
  • reagents having enhanced stability including a oxidoreductase, an electron transfer medium, and a hydrophilic containing compound as a reagent stabilizer, may be referred to as a reagent composition for redox reaction or reagent composition for electrochemical biosensor.
  • a reagent composition for redox reaction or reagent composition for electrochemical biosensor may be referred to as a reagent composition for redox reaction or reagent composition for electrochemical biosensor.
  • Conventional reagents including conventional oxidoreductases and electron transfer mediators to be stabilized by a hydrophilic containing compound are described as being divided into 'reagent for redox reaction or reagent for electrochemical biosensor'.
  • reagent composition for redox reaction or a reagent composition for an electrochemical biosensor is collectively referred to as "reagent composition" unless otherwise specified.
  • the hydrophilic containing compound is as described above.
  • the oxidoreductase refers to an enzyme that catalyzes a redox reaction of a living body, and in the present invention, an enzyme that is reduced by reacting with a target substance to be measured, such as a biosensor, is measured with a metabolite to be measured.
  • the reduced enzyme reacts with the electron transfer medium, and the metabolites are quantified by measuring signals such as current change generated at this time.
  • the redox enzymes usable in the present invention are various dehydrogenases and oxidations.
  • It may be one or more selected from the group consisting of enzymes (oxidases), esterases (esterases) and the like, and enzymes based on the target substance among the enzymes belonging to the enzyme group according to redox or detection target substances You can select and use.
  • the oxidoreductase is glucose dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, glucose oxidase, cholesterol oxidase, cholesterol esterase 1 selected from the group consisting of lactate oxidase, ascorbic acid oxidase, alcohol oxidase, alcohol dehydrogenase, bilirubin oxidase, and the like. It may be more than one species.
  • the oxidoreductase may include a cofactor (cofactor) that serves to store the hydrogen taken by the oxidoreductase from the target material (eg metabolites) to be measured, for example, flavin adenine dinew It may be one or more selected from the group consisting of flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), pyrroloquinoline quinone (PQQ), and the like.
  • a cofactor that serves to store the hydrogen taken by the oxidoreductase from the target material (eg metabolites) to be measured, for example, flavin adenine dinew It may be one or more selected from the group consisting of flavin adenine dinucleotide (FAD), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), pyrroloquinoline quinone (PQQ), and the like.
  • glucose dehydrogenase may be used as the oxidoreductase, and the glucose dehydrogenase is a flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase including FAD as a cofactor.
  • Nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase including enzyme (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), and / or FAD-GDH as cofactor.
  • the oxidoreductases available may include FAD-GDH (eg, EC 1.1.99.10, etc.), NAD-GDH (eg, EC 1.1.1.47, etc.), PQQ-GDH (eg, EC1.1.5.2).
  • FAD-GDH eg, EC 1.1.99.10, etc.
  • NAD-GDH eg, EC 1.1.1.47, etc.
  • PQQ-GDH eg, EC1.1.5.2.
  • glutamate dehydrogenase e.g., EC 1.4.1.2, etc.
  • glucose oxidase e.g., EC 1.1.3.4, etc.
  • cholesterase oxidase e.g., EC 1.1.3.6, etc.
  • cholesterol esterases e.g., , EC 3.1.1.13, etc.
  • lactate oxidase e.g, EC 1.1.3.2, etc.
  • ascorbic oxidase eg, EC 1.10.3.3
  • alcohol oxidase eg, EC 1.1.3.13, etc.
  • alcohol Dehydrogenase eg, EC 1.1.1.1, etc.
  • bilirubin oxidase eg, EC 1.3.3.5, etc.
  • the electron transfer mediator is reduced by reacting with a reduced enzyme and redox reaction, reacting with a metabolite, and the electron transfer mediator thus formed plays a role of generating a current at the electrode surface to which the oxidation potential is applied. .
  • the electron transfer medium may be a combination of the system 1 electron transfer medium and the second electron transfer medium.
  • the first electron transport mediator may be a metal containing complex
  • the second electron transport mediator may be thionine, 1-methoxy PMS (1 -Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate), 3-amino-7- (2,3,4,5,6-pentahydroxy nucleic acid amido) -5-phenothiazinium (3-amino-7- (2, 3,4,5,6-pentahydroxy hexanamido) -5-phenothiazinium), 1-methoxy-5-methylphenazinium (1 -Methoxy-5-methylphenazinium), Azure C, Azur A ), Methylene blue (Methylene Blue), toluidine blue (Toluidine Blue), and derivatives thereof may be one or more selected from the group consisting of (see FIGS. 6 and 7).
  • the metal-containing complex may be a complex containing one or more selected from the group consisting of Ru, Fe, Os, R, Mo, and Ir.
  • the metal-containing complex is a ruthenium complex, such as nucleus ammamine ruthenium chloride [Ru (NH 3 ) 6 Cl 3 ], ruthenium tri fendidi
  • the molar ratio of thionine or 1-methoxy PMS with the metal-containing complex is from 1: 1 to 20 (thionine or Moles of 1-methoxy PMS: moles of metal-containing complexes), more specifically 1: 1 to 10.
  • the reagent composition comprising a metal-containing complex (eg, ruthenium complex) and thionine or thionine derivative as the electron transfer medium may be 20 to 700 parts by weight of the metal-containing complex, such as 60 to 700, based on 100 parts by weight of the redox enzyme. It may contain parts by weight or 30 to 340 parts by weight.
  • the content of the metal-containing complex may be appropriately adjusted according to the activity of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase contained in the reagent composition is high, the reagent composition may exert the desired effect even if the content of the metal-containing complex is low.
  • the content of the metal-containing complex can be controlled to be relatively low.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 60 to 700 parts by weight of a metal-containing complex, such as 30 to 340 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and the activity of the oxidoreductase If is higher than this, the content of the metal-containing complex can be adjusted lower than this.
  • a reagent composition comprising a metal-containing complex (eg, a ruthenium complex) and a thionine or a thionine derivative as the electron transfer medium may contain 2 to 25 parts by weight of thionine or a derivative thereof based on 100 parts by weight of a redox enzyme, For example, 6 to 25 parts by weight or 6 to 20 parts by weight.
  • a metal-containing complex eg, a ruthenium complex
  • a thionine or a thionine derivative as the electron transfer medium may contain 2 to 25 parts by weight of thionine or a derivative thereof based on 100 parts by weight of a redox enzyme, For example, 6 to 25 parts by weight or 6 to 20 parts by weight.
  • the content of the thionine or its derivatives can be appropriately adjusted according to the activity of the oxidoreductase, the activity of the oxidoreductase contained in the reagent composition If the high content of the metal-containing complex is low, the reagent composition can exhibit the desired effect, in general, the higher the activity of the oxidoreductase, the lower the content of thionine or its derivatives can be controlled relatively.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 6 to 25 parts by weight or 6 to 20 parts by weight of thionine or a derivative thereof based on 100 parts by weight of the oxidoreductase.
  • the content of thionine or a derivative thereof can be adjusted lower than this. If the content of thionine or derivatives thereof is less than the above range, there is a problem that the response of the sensor is insensitive to a high blood sugar level, and if it exceeds the above range, the reagent may not be dissolved quickly by blood.
  • Reagent composition according to the present invention is 50 to 600 parts by weight, such as 80 to 500 parts by weight, 100 to 450 parts by weight, 200 to 600 parts by weight, 300 to 300 to 100 parts by weight of the hydrophilic containing compound as the reagent stabilizer 500 parts by weight, or 350 to 450 parts by weight.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg 200 to 600 parts by weight of a hydrophilic containing compound, specifically 300 to 500 parts by weight, and more specifically 350 to 450 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase If the activity of the oxidoreductase is higher than this, it is possible to control the content of the containing compound lower than this.
  • the hydrophilicity as the reagent stabilizer is included.
  • the content of the compound is preferably in the above range.
  • the reagent composition according to the present invention is a dispersant when dissolving a reagent, at least one additive selected from the group consisting of surfactants, water-soluble polymers, quaternary ammonium salts, fatty acids, thickeners, adhesives for the preparation of reagents, stabilizers for long-term storage It may further include for the role of.
  • the surfactant may play a role of dispensing the reagent evenly on the electrode when dispensing the reagent to dispense the reagent to a uniform thickness.
  • Triton X-100 as the surfactant sodium dodecyl sulfate (sodium dodecyl sulfate, perfluorooctane sulfonate, sodium stearate, and the like.
  • the surfactant in order to properly perform the role that the reagent is evenly distributed on the electrode when the reagent is dispensed, so that the reagent is dispensed with a uniform thickness, the surfactant It may be contained in an amount of 3 to 25 parts by weight, such as 10 to 25 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase.
  • the surfactant may contain 10 to 25 parts by weight of the surfactant based on 100 parts by weight of the oxidoreductase.
  • the surfactant The content of can be adjusted lower than this.
  • the water-soluble polymer may serve to help stabilize and disperse the enzyme as a polymer support of the reagent composition.
  • the water-soluble polymers include polyvinylpyrrolidone (PVP), polyvinyl alcohol (PVA), polyfluorosulfonate, hydroxyethyl cellulose; HEC), hydroxypropyl cellulose (HPC), carboxy methyl cellulose (CMC), cellulose acetate, polyamide, etc. 1 More than one species can be used.
  • the reagent composition according to the present invention comprises 10 to 70 parts by weight of the water-soluble polymer based on 100 parts by weight of the oxidoreductase in order to exert the role of helping to stabilize and disperse the oxidoreductase.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 30 to 70 parts by weight of a water-soluble polymer based on 100 parts by weight of an oxidoreductase. Can be adjusted lower than this.
  • the water-soluble polymer may have a weight average molecular weight of about 2,500 to 3,000,000, for example, about 5,000 to 1,000,000 in order to effectively carry out a ' help of stabilizing and dispersing the support and enzyme.
  • the quaternary ammonium salts are determined according to the amount of hematocrit. It may be to reduce the measurement error.
  • the quaternary ammonium salts include ecyltrimethylammonium, myristyltrimethylammonium, cetyltrimethylammonium, octadecyltrimethylammonium, tetrahexylammonium, and the like. One or more selected from the group consisting of can be used.
  • the reagent composition according to the present invention is 20 to 130 parts by weight of the quaternary ammonium salt, based on 100 parts by weight of oxidoreductase, such as 70 to 70, in order to effectively reduce the measurement error according to the red blood cell volume ratio.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 70 to 130 parts by weight of the quaternary ammonium salt based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the quaternary ammonium salt The content of can be adjusted lower than this.
  • the fatty acid reduces the measurement error according to the amount of hematocrit, like the quaternary ammonium salt described above, and also reduces the linear dynamic range of the biosensor in the high concentration region. It plays a role of expanding.
  • the fatty acid may be one or more selected from the group consisting of fatty acid having a C 4 ⁇ C 20 carbon chain and its fatty acid salt, preferably having an alkyl carbon chain consisting of C 6 ⁇ C 12 Fatty acid or its fat acid salt can be used.
  • the fatty acid may be caproic acid, heptanoic acid, caprylic acid, octanoic acid, nonanoic acid, capric acid, undecano Acids (undecanoic acid, lauric acid, tridecanoic acid, myritic acid, myristic acid, pentadecanoic acid, palmitic acid, heptadecanoic acid ( Heptadecanoic acid, stearic acid (stearic acid), nonadecanoic acid (nonadecanoic acid), arachidonic acid (arachidonic acid), one or more selected from the group consisting of the fatty acid can be used.
  • the reagent composition according to the present invention based on 100 parts by weight of the oxidoreductase based on the fatty acid in order to properly obtain the effect of reducing the measurement error according to the red blood cell volume ratio and to expand the linear dynamic region of the biosensor in a high concentration region.
  • 10 to 70 parts by weight such as 30 to 70 parts by weight It may contain in quantity.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 30 to 70 parts by weight of fatty acid based on 100 parts by weight of oxidoreductase. Can be adjusted low.
  • the thickener serves to firmly attach the reagent to the electrode.
  • the thickener one or more selected from the group consisting of natrosol and diethylaminoethyl-dextran hydrochloride may be used.
  • the reagent composition according to the present invention may contain the thickener in an amount of 10 to 90 parts by weight, such as 30 to 90 parts by weight, based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, so that the reagent is firmly attached to the electrode.
  • an oxidoreductase having an activity of 700 U / mg it may contain 30 to 90 parts by weight of a thickener based on 100 parts by weight of the oxidoreductase, and if the activity of the oxidoreductase is higher than this, the amount of the thickener is increased. Can be adjusted lower than this.
  • the present invention provides an electrochemical biosensor comprising the reagent composition.
  • a working electrode and an auxiliary electrode are provided on one plane, and a planar electrochemical biosensor is provided, wherein the reagent composition according to the present invention is included on the working electrode. See FIG. 1).
  • a working electrode and an auxiliary electrode are provided to face each other on different planes, and a face-to-face electrochemical biochemical method comprising a reagent composition according to the present invention on the working electrode.
  • a sensor is provided (see FIG. 2).
  • the form in which the reagent composition according to the present invention is included is not particularly limited, and specifically, may be included as a ' coated form on the working electrode surface, but is not limited thereto.
  • planar and face type electrochemical biosensor according to the present invention is, for example, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2004-0105429, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2006-0089464, Republic of Korea Patent Registration No. 0854389, Republic of Korea Patent Publication No. 10 - 2008-0080841, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2008-0084030, Republic of Korea Patent Publication No. 10-2008-0088028 It can be prepared by a method known in the art.
  • the planar electrochemical biosensor shown in FIG. 1 is provided with a working electrode and an auxiliary electrode on one plane, and from above, an upper plate 11 having an air vent 10 for allowing blood to permeate into the sensor;
  • An adhesive is coated on both sides to serve to bond the upper plate and the lower plate, the insertion plate (9) for the blood to penetrate toward the electrode by capillary action;
  • a reagent composition (8) according to the invention which is incorporated (e.g. coated) in the following working and auxiliary electrodes;
  • An insulating plate (7) provided with a passage portion for defining the area of the working electrode and the auxiliary electrode;
  • a working electrode 2 and an auxiliary electrode 3 printed on the lower plate;
  • a lower plate 1 on which the working electrode and the auxiliary electrode are formed.
  • the face type electrochemical biosensor shown in FIG. 2 is provided such that the working electrode and the auxiliary electrode face each other on different planes, and from above, the venting part 10 is provided to allow blood to permeate into the sensor.
  • An adhesive is coated on both sides to serve to bond the upper plate and the lower plate, and an insertion plate 9 for allowing blood to penetrate into the electrode by capillary action;
  • a reagent composition (8) according to the invention which is included (eg coated) in the working electrode;
  • An insulating plate (7) having a passage portion for defining the area of the working electrode and the auxiliary electrode;
  • the reagent composition according to the present invention has a small change in the detection performance of a metabolite to be detected, such as glucose, even after long-term storage of the sensor, and thus, particularly for the preparation of an electrochemical biosensor for measuring blood glucose. useful.
  • a metabolite to be detected such as glucose
  • the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are merely to illustrate the invention, but the content of the present invention is not limited by the following examples.
  • Redox enzyme with respect to 100 parts by weight of flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase (FAD-GDH, EC 1.1.99.10);
  • Example 2 Preparation of a planar biosensor comprising the reagent composition of Example 1 As an example of the planar biosensor, a planar biosensor having an average value of 0.5?
  • (1) is a bottom plastic made of polyester in which working electrodes (area: 1.05 mm 2 ) and auxiliary electrodes are formed;
  • (2) and (3) are electrodes made by screen printing carbon graphite, (2) is working electrode, (3) is auxiliary electrode,
  • (8) is the reagent composition prepared in Example 1 to be coated on the working electrode
  • (9) is a 0.10 mm thick insertion plate that allows blood to penetrate into the electrode by capillary action, the adhesive is coated on both sides of the top plate Serves to bond the bottom plate with
  • Numeral 11 denotes a biosensor made of a top plate plastic made of polyester.
  • Example 3 Preparation of a Large-Scale Biosensor Comprising the Reagent Composition of Example 1
  • a face-to-face biosensor having an average value of 0.5 ⁇ sample introduction portion was prepared as shown in FIG. 2.
  • (1) is a bottom plate plastic made of a screen-printed polyester of the working electrode (area: 1.95 mm 2 ), the lead and the flow sensing electrode of the auxiliary electrode;
  • (2), (3), (4) and (6) are electrodes made by screen printing carbon graphite, (2) is working electrode, (3) is auxiliary electrode, and (4) is lead of auxiliary electrode ego,
  • (6) is a flow sensing electrode for measuring the rate at which blood enters
  • (5) is a circuit connection ground made of silver and silver chloride (Ag / AgCl) to connect (3) and (4),
  • (8) is the reagent composition prepared in Example 1 coated on a working electrode
  • (9) is a 0.07 mm thick insertion plate that allows blood to penetrate into the electrode by capillary action, and has an adhesive coating on both sides thereof to bond the upper plate and the lower plate,
  • Comparative Example 2 Preparation of a Large-Scale Biosensor Comprising the Reagent Composition of Comparative Example 1
  • a biosensor was prepared by coating the reagent composition prepared in Comparative Example 1 on the working electrode.
  • glucose standard solution refers to blood prepared by fitting blood extracted from veins to hematocrit 42% and using glucose analyzer (manufacturer: YSI, model name: 2300 Stat Plus) to have various glucose levels.
  • the standard solution with the glucose concentrations of 11,22,50,67,101,202,301,396 and 509 mg / dL simultaneously covers the working electrode and the auxiliary electrode, applying 0 mV to the working electrode, waiting for 3 seconds, and then operating. After applying 200 mV to the electrode, the current was measured after 1 second. All measurements were made 10 times for each concentration, the average value is shown in FIG. As shown in FIG. 3, it was found that the planar biosensor manufactured in Example 2 showed good linearity in which a current gradually increased according to glucose concentration. At this time, the slope of the measured electrode per unit area of the working electrode is 2 () .5 nA / (mg / dL) / mm 2 .
  • the large-area biosensor manufactured in Example 3 was used to measure current against glucose standard solution as in Experimental Example 1. However, the concentration of each glucose standard solution was 11, 21, 50, 72, 104, 204, 303, 397 and 500 mg / dL.
  • the biosensor comprising hydroxypropyl-beta-cyclodextrin as a reagent stabilizer in the reagent composition has the best linearity with a slope of 26.9 nA / (mg / dL) / mm 2 per unit area of the working electrode. It also showed good linearity even when other reagent stabilizers were included.
  • Example 3 is an experiment to find out how stable it is when the sensor is stored for a long time. That is, produced in Example 3 and Comparative Example 2 After aging the biosensor at 50 ° C for 4, 11, 17, 24, 29, 36, and 43 days, the current measurement was performed on glucose standard solution as in Experiment 2, and the result is shown in FIG. It was. At this time, if aged for 43 days at 50 ° C corresponds to 17 months stored at room temperature.
  • the change in slope is up to 3.6% during the aging period for at least 43 days, but the hydroxypropyl-beta- In the absence of cyclotextine, the slope gradually decreased with aging, and after 43 days of aging, the creeping decreased by 21% compared to before aging, thus adding hydroxypropyl-beta-cyclodextrin to the reagent composition. It can be seen that it can be stored without long-term performance change.
  • the redox reaction reagent composition comprising hydroxypropyl-beta-cyclodextrin according to the present invention is very stable for long-term storage and is useful for the preparation of a biosensor for glucose detection in blood.
  • the reagent compositions and ratios presented in the examples of the present invention are merely examples of the invention, and can be freely changed in order to adjust the degree of response according to the intended use and the required performance, which will be obvious to those skilled in the art. Therefore, the core of the present invention is not limited to the present embodiment.

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Abstract

본 발명은 산화환원반응용 시약의 안정성 향상을 위한 안정제 조성물, 및 이를 포함하는 안정성이 증진된 산화환원반응용 시약 조성물에 관한 것으로, 상기 산화환원반응용 시약 조성물은 전기화학적 바이오센서용 시약으로 사용될 수 있다.

Description

【명세서】
【발명 의 명 칭】
산화환원반응용 시 약 조성물
【기술분야】
본 발명은 산화환원반웅용 시 약의 안정성 향상을 위한 안정제 조성물 : 및 이를 포함하는 안정성 이 증진된 산화환원반웅용 시 약 조성물에 관한 것으로, 상기 산화환원반응용 시 약 조성물은 전기화학적 바이오센서용 시 약으로 사용될 수 있다.
【배경기술】
당뇨 관리에 있어 혈당의 주기 적 인 측정은 대단히 중요하며， 이에 정 확성과 정밀성을 갖춘 다양한 종류의 전기화학적 바이오센서가 널리 쓰이고 있다. 혈당을 측정하는 전기화학적 바이오센서는 작동 전극에 효소, 전자전달체 및 다양한 안정제와 분산제를 섞어서 조제한 시 약을 건조시 켜 제조하는데, 그 특성을 가장 크게 좌우하는 것은 사용하는 효소의 종류와 전자전달체의 특성 이다.
예를 들어 , 대부분의 상용화된 전기화학적 센서에 사용되는 글루코오스 산화환원효소인 FAD-GOx (flavin adenine dinucleotide-glucose oxidase)는 열에 안정하고 글루코오'스만을 산화시 키는 반웅선택성은 탁월하지만, 혈액에 녹아 있는 산소와 반웅하기 때문에 FAD-GOx 효소를 사용하여 만든 센서는 시료 혈액의 종류 (정 맥혈, 동맥혈, 또는 모세혈)에 따라서 측정 값이 크게 다를 수 있다.
한편, PQQ-GDH 효소 (pyrrole quinoline quinone-glucose dehydrogenase)를 이용하여 만든 센서는 혈중 산소의 영 향을 거의 받지 않는 특성을 보이는 반면， 글루코오스에 대한 특이성 외에도 만노스 (mannose), 말토스 (maltose) 또는 락토스 (lactose) 등과 같은 여 러 종의 단당류 또는 이당류도에도 선택성을 보이며 , 특히， 신장복막투석을 하는 환자의 경우에는 말토스에 의 한 영향으로 인하여 잘못된 치료를 하게 되는 경우가 발생할 수 있다는 사실이 알려졌다. 또 다른 GDH 효소인 NAD-GDH (nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)를 이용하는 센서는 만노스, 말토스 및 락토스와 같은 이당류와 반응하지 않기 때문에 반웅선택성은 PQQ-GDH보다 좋지만, NAD+ 또는 NADP+와 같은 조효소를 별도로 시 약 조성 에 첨가해야 하고 보관 안정성 이 낮은 문제가 있다.
FAD-GDH (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)를 이.용하는 전기화학적 센서는 혈중에 녹아 있는 산소의 양에 영향을 받지 않고, 안정성 이 높으며， PQQ-GDH 효소를 사용하는 센서의 단점 인 말토스에 대한 특이성도 없어서 최근 많이 사용되고 있다. 반면 FAD-GDH는 그 효소를 생산하는 세균이나 진균 (fimgi) 종류에 따라 같이 사용할 수 있는 전자전달체 (mediator)의 종류가 제한적 이다.
가장 보편적으로 사용되는 전자전달체로는 포타슘페리시아나이드 [K3Fe(CN)6]가 있는데, 가격 이 저 렴하고 반웅성 이 좋아서 FAD-GOx, PQQ- GDH 또는 FAD-GDH를 이용한 센서 모두에 유용하다. 그러나， 이 전자전달체를 이용한 센서는 혈액에 존재하는 요산 (uric acid)이나 겐티식산 (gentisic acid)과 같은 방해 물질에 의 한 측정오차를 발생하고， 온도와 습도에 의하여 변질되기 쉽기 때문에 제조와 보관에 각별히 주의해야 하고 장시간 보관 후 바탕전류의 변화로 낮은 농도의 글루코오스를 정 확하게 검출하는데 어 려움이 있다.
핵사암민루테늄클로라이드 [Ru(NH3)6Cl3]는 페리시 아나이드에 비하여 산화환원 안정성 이 높아 이 전자전달체를 사용한 바이오센서는 제조와 보관이 용이하고 장시간 보관에도 바탕전류의 변화가 작아 안정성 이 높은 장점을 갖지만, FAD-GDH와 사용하기 에는 반웅성 이 서로 맞지 않아 상업 적으로 유용한 센서로 제작하기가 어 렵다는 단점 이 았다.
최근 효소나 전자전달체를 사용하지 않는 나노 동공 전극 표면을 갖는 특수 형 태의 바이오센서들을 사용하여 글루코즈를 검출하려는 시도들이 있다. 예를 들어 US8083926은 사이클로덱스트린으로 형성 한 나노동공 구조의 전극을 사용하여 낮은 농도의 글루코즈 측정에 유용한 센서를 제시하였다. 그러나 이 센서는 아주 낮은 농도에서 높은 농도까지 모두 측정하기에는 적합하지 않으며， 대량생산에도 적합하지 않은 단점을 가지고 있다.
따라서 산소에 의하여 영 향 받지 않고, 온도와 습도에 의 한 성능변화가 적으며 , 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가 적으며 , 넓은 농도 범위의 측정 이 가능하며 , 대량생산에 적합한 산화환원반웅용 시 약, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시 약을 제조하기 위 한 기술의 개발이 요구되고 있다. 본 발명은 이와 같은 요건을 만족하는 바이오센서 시 약 조성물을 제시 한다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
이 에 본 발명자들은 전기화학적 바이오센서에 사용가능한 산화환원반응용 시 약에 친수성 포함화합물 (inclusion compound)을 첨가하여 산화환원효소와 전자전달체를 안정화시 킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서， 본 발명 의 일례는 친수성 포함화합물을 유효성분으로 포함하는 산화환원반응용 시 약 안정 제 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 산화환원효소, 전자전달매개체, 및 친수성 포함화합물을 포함하고, 안정성 이 증진된 산화환원반웅용 시 약 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 산화환원효소， 전자전달매개체, 및 친수성 포함 화합물을 흔합하는 단계를 포함하는 안정성 이 증진된 산화환원반웅용 시 약의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 예는 상기 안정성 이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시 약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
【기술적 해결방법】
본 발명자들은 FAD-GDH의 전자전달매개체로 티오닌 (thionine) 또는 1-Methoxy PMS ( 1 -Methoxy- 5 -methy lphenazinium methylsulfate)과 핵사암민루테늄클로라이드를 함께 사용할 경우 효소와 전자전달체간의 반응속도가 빨라져 글루코오스 검출성능이 현저히 향상된다는 것을 발견하여 이들은 포함하는 바이오센서용 시 약 조성물에 관한 특허출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 2012-0009668호).
본 발명자들은 상기와 같이 제 1의 전자전달매개체인 금속함유 착물 (예컨대, 핵사암민루테늄클로라이드)과 반웅성 이 낮은 산화환원효소의 활성을 높이기 위하여 제 2의 전자전달매개체로 티오닌 (도 6 참조) 및 이 화합물과 유사한 구조를 가진 화합물들 (도 1 참조)을 같이 사용할 때 나타나는 불안정성을 해결하여 시약 조성물의 안정성을 증진시키기 위한 연구를 거듭한 결과， 상기 시약 조성물에 시약 안정제로서 하이드톡시프로필 알파 사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-a-cyclodextrin, HP-a-CD), 하이드톡시프로필 베타 사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-|3-cyclodextrin, ΗΡ-β-CD), 또는 하이드톡시프로필 감마 사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-Y-cyclodextrin, ΗΡ-γ- CD)과 같은 친수성 포함화합물 (inclusion compound)을 첨가하는 경우 센서를 장기간 보관한 후에도 산화환원반웅 효율 및 글투코오스 검출 성능에 변화가 거의 없다는 것을 확인하였다. 친수성 포함화합물은 티오닌과의 포함복합체 형성을 유도하여 티오닌의 제한된 용해성을 높여주고 효소와의 직접적인 반웅을 제한하여 시약 조성물의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어 ΗΡ-β-CD는 단위 부피당 거의 50 % (w/v)까지 녹을 정도로 물에 매우 잘 녹는 성질을 갖는데, 이러한 성질에 의하여 물에 잘 녹지 않는 물질과 복합체를 형성하여 물에 녹아있는 형태의 안정된 복합체를 형성하게 된다. 본 발명자들은 친수성 포함화합물이， FAD-GDH 효소와 핵사암민루테늄 및 티오닌 전달매개체를 포함하는 전기화학적 바이오센서에서， 산소와 반응하지 않고, 높은 온도와 습도에 의하여 변질되는 정도가 작으며, 검출 감도가 방해물질에 의하여 거의 영향 받지 않으며 , 장기간 보관성도 탁월한 산화환원반응용 시약으로 사용 가능함을 확인하고, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약 및 이를 포함하는 바이오센서를 제공할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 제공되는 산화환원반웅용 시약, 보다 구체적으로 전기화학적 바이오센서용 시약은 산소에 의하여 영향 받지 않고, 온도와 습도에 의한 성능변화가 적으며, 장기간 보관한 후에도 성능의 변화가
^S. 범위 (예컨대， 5 내지 1000 mg/dL)의 측정이 가능하며, 대량생산에 적합하다는 이점을 갖는다. ᅮ ~_、
본 발명의 구체예에서는 적용 가능한 예로서 글루코오스를 측정하기위한 바이오센서를 예시하고 있지만, 본 발명의 시약조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 콜레스테를, 락테이트， 크레아티닌, 과산화수소, 알코올， 아미노산, 글루타메이트와 같은 다양한 물질의 정량을 위한 바이오센서에 적용할 수 있다. 【유리한 효과】
본 발명에 따른 바이오센서용 시약 안정제 조성물 및 이를 포함하는 시약 조성물은 산소와 반웅하지 않고, 높은 온도와 습도에 의하여 변질되는 정도가 작으며 방해물질에 의하여 거의 영향 받지 않으므로, 혈액 내 대사물질, 특히 글루코오스 검출올 위한 전기화학적 바이오센서의 제조에 유용하다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 평면형 바이오센서의 분해사시도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 대면형 바이오센서의 분해사시도이다.
도 3은 실시예 2에 따른 평면형 바이오센서를 이용하여 글루코오스 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 4는 실시예 1에 따른 대면형 바이오센서를 이용하여 글루코오스 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 나타나는 전류의 변화를 측정한 그래프이다.
도 5는 실시예 3과 비교예 2에 따른 대면형 바이오센서를 50oC에서 숙성하고 글루코오스 농도를 달리한 시료를 적용하였을 경우, 숙성 기간에 따른 기을기의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 티오닌의 구조이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 사용된 티오닌 유도체들의 구조이다. 【발명의 실시를 위한 형태】
상기한 바와 같이， 본 발명의 일례는 친수성 포함화합물을 유효성분으로 포함하는 산화환원반웅용 시약 안정제 조성
한 구체예에서， 상기 산화환원반웅용 시약은 전기화학적 바이오센서용 시약으로 사용 가능하므로, 본 발명의 또 다른 예는 친수성 포함화합물을 유효성분으로 포함하는 전기화학적 바이오센서용 시약 안정제 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 산화환원효소, 전자전달매개체， 및 친수성 포함화합물을 포함하고， 안정성이 증진된 산화환원반웅용 시약 조성물을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 산화환원반웅용 시약 조성물은 전기화학적 바이오센서에 적용될 수 있으므로, 본 발명의 또 다른 예는 산화환원효소， 전자전달매개체, 및 포함화합물을 포함하고, 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물을 제공한다.
또 다른 예는 산화환원효소, 전자전달매개체 및 친수성 포함 화합물을 흔합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 산화환원반응용 시약의 제조 방법을 제공한다.
한 구체예에서, 상기 산화환원반응용 시약 조성물은 전기화학적 바이오센서에 적용될 수 있으므로, 본 발명의 또 다른 예는 산화환원효소, 전자전달매개체, 및 친수성 포함 화합물을 흔합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약의 제조 방법을 제공한다. 또 다른 예는 상기 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 명세서에 사용된 바로서, '포함화합물 (inclusion compound)'은 포접화합물 또는 내포화합물이라고도 하며， 적당한 조건하에서 2 가지 분자 중 한쪽 분자가 바구니형의 내포 격자를 만들고 그 사이에 다른 분자가 채워지는 형태를 갖는 화합물을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 친수성 포함화합물은 사이클로덱스트린
(cyclodextrin) 계열 화합물 및 이의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며， 보다 구체적으로 사이클로덱스트린 (cyclodextrin) 계열 화합물일 수 있다. 상기와 같은 사이클로덱스트린 계열 화합물과 같은 친수성 포함화합물은 센서를 장기간 보관하여도 글루코오스 검출성능에 변화가 적도록 하는 역할을 한다. '
상기 사이클로덱스트린 계열 화합물은 구조적으로 환상에 결합한 글루코오스의 수가 6개인 알파 -사이클로덱스트린 (α-cyclodextrin), 7개인 베타- 사이클로덱스트린 (β-cyclodextrin), 8개인 감마 -사이클로덱스트린 (γ- cyclodextrin) 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며， 구체적으로 사이클로덱스트린은 베타-사이클로덱스트린일 수 있다. 상기 사이클로텍스트린 계열 화합물의 유도체는 사이클로텍스트린 계열 화합물이 하이드록시프로필기, 메틸기 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 치환기를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 대표적인 사이클로텍스트린 계열 화합물의 유도체로서 하이드록시프로필-알파- 사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-a-cyclodextrin), 하이드록시프로필-베타- 사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-(3-cyclodextrin), 하이드록시프로필-감마- 사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-"-cyclodextrin), 메틸-베타-사이클로덱스트린 (methyl- -cyclodextrin) 등을 들 수 있다. 본 발명의 구체예에서는 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린를 대표예로서 예시하였으나, 알파- 및 감마-사이클로덱스트린의 유사한 특성을 갖는 유도체 역시 유사한 성질을 보일 수 있음을 확인하였다 (도 4 참조).
상기한 친수성 포함화합물， 즉 사이클로텍스트린 계열 화합물， 사이클로덱스트린 계열 화합물의 유도체, 특히 하이드록시프로필-베타- 사이클로덱스트린은 물에 매우 잘 녹기 때문에, 산화환원반응용 시약 조성물, 특히 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물에 포함되는 경우, 시약 내 불용성 물질과 복합체를 형성하여 물에 녹는 안정한 복합체를 형성함으로써， 용해성을 높이고 시약을 안정화하는 역할을 한다.
따라서， 본 발명은 친수성 포함화합물의 산화환원반웅용 시약, 예컨대 전기화학적 바이오센서용 시약을 안정화시키기 위한 용도를 제공하며, 그 일 구현예로서 상기 친수성 포함화합물을 유효성분으로 포함하는 산화환원반웅용 시약 안정제 조성물, 또는 바이오센서용 시약 안정제 조성물을 제공한다.
상기 안정화되는 산화환원반웅용 시약 또는 전기화학적 바이오센서용 시약은 산화환원효소 및 전자전달 매개체를 포함하는 통상의 산화환원반응용 시약 또는 전기화학적 바이오센서용 시약이다.
다른 측면에서, 산화환원효소, 전자전달 매개체， 및 친수성 포함화합물을 포함하는 안정성이 .증진된 산화환원반웅용 시약 조성물이 제공된다. 구체예에서, 상기 산화환원반응용 시약 조성물은 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물로서 적용가능하므로, 또 다른 예에서 산화환원효소, 전자전달 매개체, 및 친수성 포함화합물을 포함하는 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물이 제공된다.
또 다른 측면에서 산화환원효소， 전자전달매개체 및 친수성 포함 화합물을 흔합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 산화환원반웅용 시약의 제조 방법이 제공된다. 구체예에서 , 상기 산화환원반웅용 시약 조성물은 전기화학적 바이오센서에 적용될 수 있으므로， 또 다른 예에서 산화환원효소, 전자전달매개체 및 친수성 포함 화합물을 흔합하는 단계를 포함하는 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약의 제조 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 상기 제조 방법에 있어서, 상기 산화환원효소, 전자전달매개체 및 친수성 포함 화합물을 흔합하는 단계는 산화환원효소 및 전자전달매개체를 흔합하는 단계 및 상기 얻어진 흔합물에 친수성 포함 화합물올 첨가하는 단계를 포함하여 수행할 수 있다.
또 다른 예는 상기 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
또 다른 예는 상기 안정성이 증진된 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물을 포함하는 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
이 때, 친수성 포함화합물은 앞서 설명한 바와 같이 시약을 안정화시키는 시약안정제로서의 역할을 한다.
본 명세서에서 특별한 언급이 없는 한, 산화환원효소, 전자전달 매개체, 및 시약안정제로서 친수성 포함화합물을 포함하는 안정성이 증진된 시약은 '산화환원반응용 시약 조성물 또는 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물 '로 기재하고, 친수성 포함화합물에 의한 안정화 대상이 되는 통상의 산화환원효소 및 전자전달 매개체를 포함하는 기존의 시약은 '산화환원반응용 시약 또는 전기화학적 바이오센서용 시약'으로 구분하여 기재한다. 또한， 산화환원반응용 시약 조성물 또는 전기화학적 바이오센서용 시약 조성물을 총칭하는 경우 특별한 언급이 없는 한 '시약 조성물 '이라 칭한다.
상기 친수성 포함화합물은 상기한 바와 같다.
산화환원효소는 생체의 산화환원반응을 촉매하는 효소를 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 측정하고자 하는 대상물질, 예컨대 바이오센서의 경우에는 측정하고자하는 대사물질과 반응하여 환원되는 효소를 의미한다. 이 와 같이 환원된 효소는 전자전달매개체와 반응하며, 이 때 발생한 전류변화 등의 신호를 측정하여 대사물질을 정 량하게 된다ᅳ 본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 에스테르화효소 (esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것 일 수 있으며 , 산화환원 또는 검출 대상 물질에 따라서 , 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기 질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코오스탈수소효소 (glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소 (glutamate dehydrogenase), 글루코오스산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테를산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테롤에스테르화효소 (cholesterol esterase), 락테 이트산화효소 (lactate oxidase), 아스코빅산산화효소 (ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소 (alcohol oxidase), 알코올탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 빌리루빈산화효소 (bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편， 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질 (예컨대, 대사물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자 (cofactor)를 함께 포함할 수 있는데， 예컨대， 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피를로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 혈중 글루코오스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코오스 탈수소효소 (glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며 , 상기 글루코오스 탈수소효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및 /또는 보조인자로서 FAD- GDH를 포함하는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)일 수 있다.
구체 예에서 , 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH (예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH (예컨대， EC 1.1.1.47 등), PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산탈수소효소 (예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코오스산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테를산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤에스테르화효소 (예컨대， EC 3.1.1.13 등)， 락테 이트산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.2 등)， 아스코빅산산화효소 (예컨대, EC 1.10.3.3 둥), 알코올산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.13 등)， 알코올탈수소효소 (예컨대, EC 1.1.1.1 등)， 빌리루빈산화효소 (예컨대， EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 전자전달매개체는 대사물질과 반응하여 환원된 효소와 산화환원반웅하여 환원되 게 되며， 이 렇게 형성된 환원상태의 전자전달매개체는 산화전위가 인가된 전극표면에서 전류를 발생시 키는 역할을 수행한다.
상기 전자전달매개체는 계 1 전자전달매개체 및 제 2 전자전달매개체의 흔합물일 수 있다.
상기 제 1 전자전달매개체 및 제 2 전자전달매개체의 흔합물에서 , 상기 제 1 전자전달매개체는 금속함유 착물일 수 있고, 제 2 전자전달매개체는 티오닌 (thionine), 1-메톡시 PMS ( 1 -Methoxy- 5 -methylphenazinium methylsulfate), 3-아미노 -7-(2,3,4，5,6-펜타하이드록시 핵산아미도) -5-페노티 아지늄 (3-amino-7- (2,3,4,5,6-pentahydroxy hexanamido)-5-phenothiazinium), 1-메톡시 -5-메틸페나지늄 ( 1 -Methoxy-5-methylphenazinium), 아주르 C (Azure C), 아주르 A (Azure A), 메틸렌블루 (Methylene Blue), 를루이 딘블루 (Toluidine Blue), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다 (도 6 및 도 7 참조). 상기 금속함유 착물은 Ru, Fe, Os, R , Mo, 및 Ir로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 착물일 수 있다.
구체 예에서 상기 금속함유 착물은 루테늄 착물, 예컨대 핵사암민루테늄클로라이드 [Ru(NH3)6Cl3], 루테늄트리 펜디은
{[Ru(phendione)3] , phendione = 1 , 10-phenanthroline-5,6-dione} , 루테늄티피 와이 비피와이 {[Ru(tpy)(bpy)H20]2+, tpy= 2':6',2"-terpyridine, bpy = 2,2'-bipyridine} 등으로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상의 루테늄 착물일 수 있다.
전자전달매개체로서 금속함유 착물과 티오닌 또는 이 의 유도체의 흔합물, 및 /또는 금속함유 착물과 1-메록시 PMS 또는 이의 유도체와 흔합물을 사용하는 경우, 티오닌 또는 1-메록시 PMS와 금속함유 착물의 몰비가 1:1 내지 20 (티오닌 또는 1-메특시 PMS의 몰:금속함유 착물 몰)， 보다 구체적으로 1:1 내지 10일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면 상기 전자전달매개체로서 루테늄 착물과 티오닌 또는 티오닌 유도체를 함께 사용함으로써 글루코오스 검출 성능을 현저히 증가시키고 글루코오스 검출에 있어서의 여러 방해물질에 영향이 거의 없도록 할 수 있다.
이때, 상기 전자전달매개체로서 금속함유 착물 (예컨대, 루테늄 착물)과 티오닌 또는 티오닌 유도체를 포함하는 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 금속함유 착물 20 내지 700 중량부， 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부를 함유할 수 있다. 상기 금속함유 착물의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로, 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 금속함유 착물의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우에는 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 금속함유 착물 60 내지 700 중량부, 예컨대 30 내지 340 증량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 금속함유 착물의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다. 금속함유 착물의 함량이 상기 범위보다 낮은 경우 높은 혈당농도에서 센서의 반웅이 둔감해지는 문제가 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 혈액에 의하여 시약이 빨리 녹지 않는 문제가 있을 수 있다. ᅳ 또한， 상기 전자전달매개체로서 금속함유 착물 (예컨대, 루테늄 착물)과 티오닌 또는 티오닌 유도체를 포함하는 시약 조성물은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 티오닌 또는 이의 유도체를 2 내지 25 중량부, 예컨대 6 내지 25 중량부 또는 6 내지 20 중량부를 함유할 수 있다. 상기 티오닌 또는 이의 유도체의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있으며, 시약 조성물 내에 함유된 산화환원효소의 활성도가 높으면 금속함유 착물의 함량이 낮아도 시약 조성물이 목적하는 효과를 발휘할 수 있으므로， 일반적으로 산화환원효소의 활성도가 높을수록 티오닌 또는 이의 유도체의 함량은 상대적으로 낮게 조절할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우에는 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 티오닌 또는 이의 유도체 6 내지 25 중량부 또는 6 내지 20 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 티오닌 또는 이의 유도체의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다. 티오닌 또는 이의 유도체의 함량이 상기 범위 미만인 경우 높은 혈당농도에서 센서의 반응이 둔감해지는 문제가 있고， 상기 범위를 초과하는 경우 혈액에 의하여 시약이 빨리 녹지 않는 문제가 있을 수 있다.
본 발명에 따른 시약 조성물은 상기 시약 안정제로서의 친수성 포함화합물을 산화환원효소 100 중량부에 대하여 50 내지 600 증량부, 예컨대 80 내지 500 중량부， 100 내지 450 중량부, 200 내지 600 중량부， 300 내지 500 중량부, 또는 350 내지 450 중량부의 양으로 포함할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우에는 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 친수성 포함화합물 200 내지 600 중량부, 구체적으로 300 내지 500 중량부， 보다 구체적으로 350 내지 450 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 포함화합물의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다. 상기 시약 안정제로서의 친수성 포함화합물의 함량이 상기 범위보다 적은 경우 티오닌 또는 티오닌 유도체가 완전히 녹지 않는 문제가 있고, 상기 범위를 초과하는 경우 센서의 민감도가 낮아지는 문제가 있으므로, 시약 안정제로서의 친수성 포함화합물의 함량은 상기 범위로 하는 것이 좋다.
한편, 본 발명에 따른 시약 조성물은 계면활성제， 수용성 고분자， 4차 암모늄염, 지방산， 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제 , 시약 제조시의 점착제 , 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 시약을 분주할 때 사약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네 이트 (perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시 약 조성물은， 시 약을 분주할 때 시 약이 전극위 에서 골고루 퍼져서 시 약이 균일한 두께로 분주되 게 하는 역 할을 적 절하게 수행하도록 하기 위하여， 상기 계면활성 제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성 제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며 , 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면， 계면활성 제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 시 약 조성물의 고분자 지지 체로서 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것 일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리 비 닐피를리돈 (polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비 닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네 이트 (perfluoro sulfonate), 하이드록시 에 틸 셀를로오즈 (hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀를로오즈 (hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시 메틸 셀를로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC), 셀를로오즈 아세테이트 (cellulose acetate), 폴리아미드 (polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명 에 따른 시 약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 층분하고 적 절하게 발휘 하도록 하기 위하여 , 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며 , 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면， 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 지지 체 및 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을' 돕는 역 학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 내지 3,000,000 정도, 예컨대 , 5,000 내지 1,000,000 정도일 수 있다.
상기 4차 암모늄염은 적 혈구용적률 (hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시 키 는 역할을 하는 것 일 수 있다. 상기 4차 암모늄염으로는 에실트리 메틸 암모늄 (ecyltrimethylammonium), 마이 리스틸트리 메틸암모늄 (myristyltrimethylammonium), 세틸트리 메틸 암모늄 (cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리 메틸 암모늄 (octadecyltrimethylammonium), 테트라핵실 암모늄 (tetrahexylammonium) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시 약 조성물은 적 혈구용적률에 따른 측정오차를 효율적으로 감소시 키 기 위하여 , 상기 4차 암모늄염을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 20 내지 130 중량부, 예컨대 70 내지 . 130 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 4차 암모늄염 70 내지 130 중량부를 함유할 수 있으며 , 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 4차 암모늄염의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 지 방산은 상술한 4차 암모늄염과 같이 적 혈구용적률 (hematocrit)의 양에 따른 측정오차를 감소시 키는 역할을 하며 , 또한 고농도 영 역에서 바이오센서 의 선형 동적 영 역 (linear dynamic range)을 확대시키는 역 할을 한다. 상기 지 방산으로는 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지 방산 및 그의 지 방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고， 바람직하게는 C6~C12로 이루어진 알킬탄소사슬을 갖는 지 방산 또는 그의 지 방산염을 사용할 수 있다. 상기 지방산으로는 카프로산 (caproic acid), 헵타노산 (heptanic acid), 카프릴산 (caprylic acid), 옥타논산 (octanoic acid), 노나노산 (nonanoic acid), 카프르산 (capric acid), 운데카노산 (undecanoic acid), 라우르산 (lauric acid), 트리 데카노산 (tridecanoic acid), 미리스티산 (myristic acid), 펜타데카노산 (pentadecanoic acid), 팔미트산 (palmitic acid), 헵타데카노산 (heptadecanoic acid), 스테아르산 (stearic acid), 노나데카노산 (nonadecanoic acid), 아라키드산 (arachidonic acid), 상기 지 방산의 염 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시 약 조성물은, 적 혈구용적률에 따른 측정오차 감소 및 고농도 영 역에서 바이오센서 의 선형 동적 영 역 확대 효과를 적 절하게 얻기 위 하여 , 상기 지 방산을 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 지방산 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 지방산의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약이 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 시약 조성물이 포함된 전기화학적 바이오센서를 제공한다.
일 구현예에서, 전기화학적 바이오센서에 있어서 작동전극 및 보조전극이 한 평면상에 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다 (도 1 참조).
또 다론 구현예에서, 전기화학적 바이오센서에 있어서， 작동전극 및 보조전극이 서로 다른 평면상에서 대면하도록 구비되고, 상기 작동전극 위에 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 것을 특징으로 하는 대면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다 (도 2 참조).
상기 바이오센서에 있어서 본 발명에 따른 시약 조성물이 포함된 형태는 특별한 제한이 없으며, 구체적으로 작동전극 표면에' 코팅된 형태로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서는， 예컨대 대한민국 특허공개 제 10-2004-0105429호, 대한민국 특허공개 계 10- 2006-0089464호， 대한민국 특허등록 계 0854389호, 대한민국 특허공개 제 10- 2008-0080841호， 대.한민국 특허공개 제 10-2008-0084030호, 대한민국 특허공개 제 10-2008-0088028호 등에 공지된 방법을 통해 제조할 수 있다.
이하, 상기 평면형 및 대면형 전기화학적 바이오센서의 구조를 도 1 및 도 2를 참조하여 예시한다.
먼저, 도 1에 나타낸 평면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 한 평면상에 구비되는 것으로, 위에서부터, 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부 (10)를 구비한 상판 (11); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하며, 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판 (9); 하기 작동전극과 보조전극에 포함 (예컨대, 코팅)되는 본 발명에 따른 시약 조성물 (8); 하기 작동전극과 보조전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판 (7); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극 (2)과 보조전극 (3); 및 상기 작동전극 및 보조전극이 형성되는 하판 (1)이 순차적으로 적층된 구조를 갖는다.
도 2에 나타낸 대면형 전기화학적 바이오센서는 작동전극과 보조전극이 서로 다른 평면상에 대면하도록 구비되는 것으로， 위에서부터, 혈액이 센서 안으로 스며들도록 하기 위한 통기부 (10)를 구비하며, 하기 보조전극이 프린트되는 상판 (11); 상기 상판에 프린트되는 보조전극 (3); 양면에 접착제가 코팅되어 있어 상기 상판과 하기 하판을 접착하는 역할을 하고, 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 하기 위한 끼움판 (9); 하기 작동전극에 포함 (예컨대, 코팅)되는 본 발명에 따른 시약 조성물 (8); 하기 작동전극과 상기 보조전극의 면적을 규정하기 위한 통로부가 구비된 절연판 (7); 상기 보조전극과 하기 보조전극의 리드를 연결하는 회로연결접지 (5); 하기 하판 상에 프린트되는 작동전극 (2), 보조전극의 리드 (4) 및 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 유동감지전극 (6); 및 상기 작동전극, 보조전극의 리드 및 유동감지전극이 형성되는 하판 (1)이 순차적으로 적층되는 구조를 갖는다.
상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 시약조성물은 센서를 장기간 보관한 후에도 글루코오스 등의 검출 대상 대사산물에 대한 검출 성능에 변화가 적어서 특히 혈당 측정을 위한 전기화학적 바이오센서의 제조에 유용하다. 이하, 본 발명을 하기의 실시 예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단， 하기의 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다. 실시예
<실시예 1> 시약 안정제를 포함하는 시약조성물의 제조
산화환원효소로 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD-GDH, EC 1.1.99.10) 100 중량부에 대하여;
금속함유 착물로 핵사암민루테늄클로라이드 (Ru(NH3)6Cl3) 80 중량부 (50 mM);
티오닌 (thionine) 36 중량부 (20 mM);
하이드록시프로필 -베타 -사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-(3-cyclodextrin)
406 중량부 (50 mM);
지방산으로 소듐옥타노에이트 (sodium octanoate) 52 중량부;
4차 암모늄염으로 브롬화미리스틸트리메틸암모늄
(myristyltrimethylammonium bromide) 104.3 중량부;
점증제로 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-
Dextran hydrochloride) 52 중량부 및 나트로졸 (Natrosol) 11.7 중량부;
수용성 고분자로 80% 수화된 폴리비닐알코을 (Polyvinyl alcohol; 중량평균분자량: 9,000 ~ 10,000) 52 중량부; 및
계면활성제 (상품명： Triton X- 100) 17.4 중량부;
를 소듐포스페이트 완층액 (pH6.4,0.1M 농도의 1249ml) 및 탈이온수
(1614.6 ml)에 녹이고, 용액 내에 남아있는 미립자들은 걸러서 제거하여, 산화환원반웅용 시약 조성물을 제조하였다.
<실시예 2> 실시예 1의 시약 조성물을 포함하는 평면형 바이오센서의 제조 평면형 바이오센서의 일예로서 도 1에 나타낸 것과 같이 평균값 0.5 ≠ 시료도입부를 가진 평면형 바이오센서를 제조하였다.
도 1에서,
(1)은 작동전극 (면적: 1.05 mm2) 및 보조전극이 형성되는 폴리에스터로 만든 하판 플라스틱이고,
(2)와 (3)은 탄소그라파이트를 스크린 프린트하여 만든 전극으로, (2)는 작동전극이고 (3)은 보조전극이며,
(7)은 절연체로써 작동전극과 보조전극의 면적을 규정하고,
(8)은 작동전극에 코팅되는 실시예 1에서 제조한 시약 조성물이고, (9)는 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록 한 0.10 mm 두께의 끼움판으로， 그 양면에 접착제가 코팅되어 있어서 상판과 하판을 접착시키는 역할을 하고,
(10)은 혈액이 센서안으로 스며들도록 하기 위한 공기배출구이며,
(11)은 폴리에스터로 만든 상판 플라스틱으로 하여 바이오센서를 제작하였다.
<실시예 3> 실시예 1의 시약 조성물을 포함하는 대면형 바이오센서의 제조
대면형 바이오센서의 일예로서 도 2에 나타낸 것과 같이 평균값 0.5 μΐ 시료도입부를 가진 대면형 바이오센서를 제조하였다.
도 2에서,
(1)은 작동전극 (면적: 1.95 mm2), 보조전극의 리드 및 유동감지전극이 스크린 프린트된 폴리에스터로 만든 하판 플라스틱이고,
(2) , (3), (4) 및 (6)은 탄소그라파이트를 스크린프린트하여 만든 전극으로, (2)는 작동전극이고， (3)은 보조전극이며 ,(4)는 보조전극의 리드이고,
(6)은 혈액이 들어오는 속도를 측정하기 위한 유동감지전극이고,
(5)는 (3)과 (4)를 연결하도록 은과 염화은 (Ag/AgCl)으로 만든 회로연결접지이고，
(7)은 절연체로써 작동전극의 면적을 규정하고,
(8)은 작동전극에 코팅되는 실시예 1에서 제조한 시약 조성물이고, (9)는 혈액이 모세작용으로 전극쪽으로 스며들도록한 0.07 mm 두께의 끼움판으로, 그 양면에 접착제가 코팅되어 있어서 상판과 하판을 접착시키는 역할을 하고,
(10)은 공기배출구이며,
(11)은 보조전극이 스크린 프린트된 폴리에스터로 만든 상판 플라스틱으로 하여 바이오센서를 제작하였다.
<비교예 1> 시약 안정제를 포함하지 않는 시약 조성물의 제조 실시예 1과 동일하게 실시하여 시약조성물을 제조하되 시약 안정제인 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린을 첨가하지 않고 시약 조성물을 제조하였다.
<비교예 2> 비교예 1의 시약 조성물을 포함하는 대면형 바이오센서의 제조
실시예 1-2와 동일하게 실시하여 대면형 바이오센서를 제조하되, 비교예 1에서 제조한 시약 조성물을 작동전극에 코팅하여 바이오센서를 제작하였다.
<실험예 1> 평면형 바이오센서의 글루코오스 표준용액에 대한 전류측정
실시예 2에서 제작한 평면형 바이오센서를 이용하여 글루코오스 표준용액에 대한 전류측정을 수행하였다. 여기서， 상기 글루코오스 표준용액은 정맥에서 추출한 혈액을 헤마토크릿 (hematocrit) 42%에 맞추고 글루코오스 분석기 (제조사: YSI, 모델명: 2300 Stat Plus)를 사용하여 여러 가지의 글루코오스 놓도를 가지도록 제조한 혈액을 말한다.
구체적으로, 각각의 글루코오스 농도가 11,22,50,67, 101,202,301,396 및 509 mg/dL인 표준용액이 작동전극과 보조전극을 동시에 덮는 순간 작동전극에 0 mV를 걸어주고, 3초간 대기한 후 작동전극에 200 mV를 걸어준 뒤 1초 후에 전류를 측정하였다. 모든 측정은 각 농도당 10회씩 측정하였고， 그 평균값을 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 제조한 평면형 바이오센서는 글루코오스 농도에 따라서 측정되는 전류가 점진적으로 증가하는 좋은 직선성을 보이는 것을 알 수 있었다. 이때, 측정되는 전류의 작동전극의 단위면적당 기울기는 2().5 nA/(mg/dL)/mm2이다.
<실험예 2> 대면형 바이오센서의 글루코오스 표준용액에 대한 전류측정
실시예 3에서 제작한 대면형 바이오센서를 이용하여 실험예 1에서와 같이 글루코오스 표준용액에 대한 전류측정을 수행하였다. 단， 각각의 글루코오스 표준용액의 농도는 11,21,50,72,104,204,303,397 및 500 mg/dL로 하였다.
본 실험은 시약 안정화제로 하이드록시프로필-베타- 사이클로텍스트린대신에 하이드록시프로필-알파-사이클로덱스트린, 하이드록시프로필-감마-사이클로덱스트린, 또는 베타-사이클로덱스트린을 포함하는 시약 조성물을 실시예 1의 방법에 따라서 각각 제조하고, 각각 제조된 시약 조성물을 이용하여 실시예 3의 방법에 따라서 바이오센서를 제작하여 상기와 동일한 실험을 수행하였다.
모든 측정은 각 농도당 10회씩 측정하였고， 그 평균값을 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 시약 조성물 중에서 시약 안정제로 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린을 포함하는 바이오센서는 작동전극의 단위면적당 기울기가 26.9 nA/(mg/dL)/mm2로 가장 좋은 직선성을 보였으며, 다른 시약 안정제를 포함하는 경우에도 양호한 직선성을 보이는 것으로 나타났다.
<실험예 3> 대면형 바이오센서를 50oC에서 숙성하였을 때의 글루코오스표준용액에 대한 전류측정
센서를 상용화하기 위해서는 센서의 유효기간 내에 센서의 성능변화가 적어야한다. 실험예 3은 센서를 장기간 보관할 때 얼마나 안정한지를 알아보는 실험이다. 즉, 실시예 3과 비교예 2에서 제작한 대면형 바이오센서를 50 °C에서 4, 11, 17, 24, 29, 36, 및 43일간 숙성한 후 실험예 2에서와 같이 글루코오스 표준용액에 대한 전류측정을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이 때, 50 °C에서 43일 간 숙성시킨 경우는 실온에서 17개월 보관한 것에 해당한다.
도 5에 보여지는 바와 같이, 시약 안정제로 하이드록시프로필-베타- 사이클로덱스트린 (HP(3CD)올 포함한 경우 적어도 43일 동안의 숙성기간에 기울기의 변화는 최대 3.6%이나, 하이드록시프로필-베타-사이클로텍스트린을 포함하지 않은 경우 숙성기간에 따라 기울기가 점점 감소하여 43일간 숙성한 후 기을기는 숙성전과 비교하여 21% 감소한 것으로 나타났다. 따라서 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린을 시약 조성물에 첨가하면 센서를 장기간 성능 변화 없이 보관할 수 있도록 할 수 있다는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 하이드록시프로필-베타-사이클로덱스트린을 포함하는 산화환원반웅용 시약 조성물은 장기 보관에 매우 안정하여 혈액 내 글루코오스 검출을 위한 바이오센서의 제조에 유용하다. 본 발명의 실시예에 제시한 시약 조성물 및 비율은 발명의 한 예일 뿐이며, 사용하고자 하는 용도 및 요구하는 성능에 따라 감응의 정도를 조절하기 위하여 자유롭게 바꿀 수 있고, 이는 본 실시 기술을 다루는 당업자에게는 당연한 일이므로 본 발명의 핵심은 제시한 실시예에 한정되지 않는다.

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
산화환원효소， 전자전달 매개체， 및 친수성 포함화합물을 포함하는 산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 2】
게 1항에 있어서 , 상기 친수성 포함화합물은 사이클로덱스트린 (cyclodextrin) 계열 화합물 및 사이클로덱스트린 계열 화합물의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 3]
제 2항에 있어서 , 상기 친수성 포함화합물은 알파 -사이클로덱스트린
(α-cyclodextrin), 베타 -사이클로텍스트린 (β-cyclodextrin), 감마- 사이클로덱스트린 (γ-cyclodextrin), 하이드록시프로필 -알파 -사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-a-cyclodextrin), 하이드록시프로필-베타 -사이클로덱스트린
(hydroxypropyl-p-cyclodextrin), 하이드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-y-cyclodextrin), 및 메틸 -베타 -사이클로덱스트린 (methyl-β- cyclodextrin)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 4]
거 U항에 있어서 , 상기 산화환원효소는
탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소
(esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는
탈수소효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피를로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것 인,
산화환원반웅용 시 약 조성물.
【청구항 5】
제 4항에 있어서 , 상기 탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소는 글루코오스탈수소효소 (glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소 (glutamate dehydrogenase), 글루코오스산화효소 (glucose oxidase), 콜레스테를산화효소 (cholesterol oxidase), 콜레스테를에스테르화효소 (cholesterol esterase), 락테 이트산화효소 (lactate oxidase), 아스코빅산산화효소 (ascorbic acid oxidase), 알코을산화효소 (alcohol oxidase), 알코을탈수소효소 (alcohol dehydrogenase), 및 빌리루빈산화효소 (bilirubin oxidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것 인， 산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 6]
제 4항에 있어서， 상기 산화환원효소는 플라빈아데닌디뉴클레오티드- 글루코오스탈수소효소 (flavin adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase, FAD- GDH), 및 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide-glucose dehydrogenase)로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상의 것 인, 산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 7]
제 1항에 있어서 , 상기 전자전달매개체는 제 1 전자전달매개체 및 제 2 전자전달매개체의 흔합물로 이루어지고，
상기 제 1 전자전달매개체는 Ru, Fe, Os, Rh, Mo, 및 Ir로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 금속함유 착물이고,
상기 제 2 전자전달매개체의 흔합물은 티오닌 (thionine), 1-메록시 PMS(l-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate), 3-아미 노 -7-(2,3,4，5，6- 펜타하이드록시 핵산아미도) -5-페노티 아지늄 (3-amin으 7-(2,3,4,5,6-pentahydroxy hexanamido)-5-phenothiazinium), 1-메톡시 -5-메틸페나지늄 (l-Methoxy-5- methylphenazinium), 아주르 C (Azure C), 아주르 A (Azure A), 메틸렌블루 (Methylene Blue), 를루이딘블루 (Toluidine Blue), 및 이들의 유도체로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상인,
산화환원반웅용 시 약 조성물.
【청구항 8】
제 1항에 있어서, 계면활성 제, 수용성 고분자 , 4차 암모늄염， 지방산， 및 점증제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함하는, 산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 9】
제 8항에 있어서 ,
상기 계면활성 제는 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼 들루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 및 소듐스테아레이트 (sodium stearate)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것 이고;
상기 수용성 고분자는 폴리 비 닐피롤리돈 (polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올 (polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네 이트 (perfluoro sulfonate), 하이드록시에 틸 샐를로오즈 (hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀를로오즈 (hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀를로오즈 (carboxy methyl cellulose; CMC), 셀를로오즈 아세테이트 (cellulose acetate), 및 폴리 아미드 (polyamide)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것 이고;
상기 4차 암모늄염은 에실트리 메틸 암모늄 (ecyltrimethylammonium), 마이 리스틸트리 메틸암모늄 (myristyltrimethylammonium), 세틸트리 메틸 암모늄 (cetyltrimethylammonium), 옥타데실트리 메틸 암모늄
(octadecyltrimethylammonium), 및 테트라핵실 암모늄 (tetrahexylammonium)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것 이고;
상기 지 방산은 C4~C20의 탄소사슬을 갖는 지 방산 및 그의 지 방산염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것 이고;
상기 점증제는 나트로졸 및 디 에 틸아미노에 틸-덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-Dextran hydrochloride)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것인,
산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 10】
제 1항 내지 제 9항 증 어느 한 항에 있어서 , 상기 산화환원반응용 시 약 조성물은 전기화학적 바이오센서에 사용하기 위 한 전기화학적 바이오센서용 시 약 조성물인， 산화환원반응용 시 약 조성물.
【청구항 11】
작동전극과 보조전극이 한 기판에 구성 되고, 상기 작동전극은 제 10항의 산화환원반응용 시 약 조성물을 포함하는 것올 특징으로 하는, 평면형 전기화학적 바이오센서 .
【청구항 12】
작동전극과 보조전극이 별도의 기판에 구성되고,
상기 작동전극은 제 10항의 산화환원반응용 시 약 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 대면형 전기화학적 바이오센서 .
【청구항 13]
산화환원효소, 전자전달 매개체， 및 친수성 포함화합물을 흔합하는 단계를 포함하는 산화환원반응용 시 약 조성물의 제조 방법 .
【청구항 14】
제 13항에 있어서 , 상기 친수성 포함화합물은 사이클로덱스트린 (cyclodextrin) 계열 화합물 및 사이클로덱스트린 계열 화합물의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법 .
【청구항 15】
제 14항에 있어서 , 상기 친수성 포함화합물은 알파 -사이클로덱스트린
(α-cyclodextrin), 베타 -사이클로텍스트린 (β-cyclodextrin), 감마- 사이클로덱스트린 (γ-cyclodextrin), 하이드톡시프로필 -알파 -사이클로덱스트린 (hydroxypropyl- -cyclodextrin), 하이드톡시프로필-베타 -사이클로덱스트린
(hydroxypropyl- -cyclodextrin), 하이드록시프로필-감마-사이클로덱스트린 (hydroxypropyl-y-cyclodextrin), 및 메틸 -베타 -사이클로덱스트린 (methyl-β- cyclodextrin)으로 이루어 진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법 .
【청구항 16】
제 13항에 있어서， 상기 산화환원효소는
탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는
탈수소효소， 산화효소， 및 에스테르화효소 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피를로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것 인, 방법 .
【청구항 17]
제 13항에 있어서 , 상기 전자전달매개체는 계 1 전자전달매개체 및 제 2 전자전달매개체의 흔합물로 이루어지고,
상기 제 1 전자전달매개체는 Ru, Fe, Os, Rh, Mo, 및 Ir로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 금속함유 착물이고,
상기 제 2 전자전달매개체의 흔합물은 티오닌 (3,7-Diaminophenothiazin- 5-ium chloride), 1-메톡시 PMS ( 1 -Methoxy-5 -methylphenazinium methylsulfate), 3- 아미노 -7-(2,3，4，5,6-펜타하이드록시 핵산아미도) -5-페노티 아지늄 (3-amino-7- (2,3,4,5,6-pentahydroxy hexanamido)-5-phenothiazinium), 1-메톡시 -5-메틸페나지늄 ( 1 -Methoxy-5-methylphenazinium), 아주르 C (Azure C), 아주르 A (Azure A), 메틸렌블루 (Methylene Blue), 를루이딘블루 (Toluidine Blue), 및 이들의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
방법 .
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