WO2013171024A1 - Verfahren und vorrichtung zum untersuchen einer probe in bezug auf die lebensdauer eines angeregten zustands - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zum untersuchen einer probe in bezug auf die lebensdauer eines angeregten zustands Download PDF

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detection time
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detection
light
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Jürgen Schneider
Bernd Widzgowski
Jochen Sieber
Wernher FOUQUET
Lars Friedrich
Arnold Giske
Lioba Kuschel
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    • G01N2201/06113—Coherent sources; lasers

Definitions

  • the invention relates to a method for examining a sample with respect to the lifetime of an excited state, in particular a fluorescence lifetime, and / or with respect to a property of a sample correlated with a lifetime of an excited state, in particular a fluorescence lifetime, wherein a sample area with a sequence of excitation light pulses is illuminated, and an apparatus for carrying out such a method.
  • the invention also relates to a device, microscope, in particular a scanning microscope, in particular a confocal scanning microscope, for examining a sample with respect to the lifetime of an excited state, in particular a fluorescence lifetime, and / or with respect to one having a lifetime of an excited state, in particular one Fluorescence lifetime, correlated property of a sample, with a light source, which generates a sequence of excitation light pulses for illuminating a sample area of a sample.
  • a device in particular a scanning microscope, in particular a confocal scanning microscope, for examining a sample with respect to the lifetime of an excited state, in particular a fluorescence lifetime, and / or with respect to one having a lifetime of an excited state, in particular one Fluorescence lifetime, correlated property of a sample, with a light source, which generates a sequence of excitation light pulses for illuminating a sample area of a sample.
  • fluorescent dyes can be used to acquire information about a sample area under study, such as the composition or its environment, using Fluorecence Lifetime Imaging Microscopy (FLI M). For example, in cell biology Measurement of the lifetime of the fluorescent dyes can be concluded indirectly on the calcium concentration in a sample area.
  • FLI M Fluorecence Lifetime Imaging Microscopy
  • FLI M is a technique by which the different fluorescence decay times (e.g., caused by use
  • the fluorescence decay times are measured pixel by pixel, wherein, for example, pixels with different
  • Fluorescence cooldowns are assigned different colors. There are a number of methods for measuring the lifetime of the excited states of fluorescent dyes. Some of these
  • Excitation light generated, and with at least one detector that receives from the sample emanating detection light known.
  • the microscope is characterized in that the light source includes a semiconductor laser emitting pulsed excitation light, wherein a
  • Adjustment device is provided for adjusting the pulse repetition rate on the specific life characteristics of the sample.
  • the electronics required for data evaluation is offered commercially - often in the form of PC plug-in cards.
  • such a timing card is very complex and expensive.
  • Fluorescence lifetime to be able to draw correlated property of a sample.
  • This object is achieved by a method which is characterized in that the amount of light and / or the number of photons of the detection light emanating from the sample area, in particular fluorescent light, is measured in time between the excitation light pulses in each case within a detection time window.
  • a device which is characterized in that a detector measures the amount of light and / or the number of photons of the detection light emanating from the sample area, in particular fluorescence light, between the excitation light pulses in each case within a detection time window.
  • At least two of the detection time windows are of different lengths of time and / or in that at least two detection time windows arranged temporally between different excitation light pulses are of different lengths of time.
  • a detection time window start of a detection time window is defined by a first time interval to the preceding excitation light pulse and that a detection time window end is defined by a second time interval to the previous excitation light pulse.
  • the second time intervals of the detection time window for the previous excitation light pulse are the same and that during illumination with the sequence of excitation light pulses, the first time interval is changed, in particular increased, to produce unequal detection time windows.
  • each measured quantity of light or each photon number is assigned to at least one variable characterizing the associated detection time window and / or each measured amount of light or each photon number is respectively assigned to the detection time window beginning of the respectively associated detection time window, in particular if the second distances of the detection time window to each previous excitation light pulse are the same.
  • an amount of n-tuples is formed for the further evaluation by the assignment. In this way, the integral is scanned successively over the decay curve. By forming the time derivative, it is then possible to deduce the course of the decay curve.
  • each detection time window is completely described by a single variable, namely by the detection time window beginning. This makes it possible to assign the respectively measured amount of light or the respectively measured number of photons only to a single size, so that the temporal behavior of the sample in the illuminated area can be recorded and further evaluated in response to the excitation light pulses by the formation of 2-tuples ,
  • the amount of the n-tuple formed by the assignment, in particular tuple of 2 can be determined, for example, by numerical methods relating to the lifetime of an excited state, in particular a fluorescence lifetime, and / or with respect to one having a lifetime of an excited state, in particular one Fluorescence lifetime, correlated property of a sample can be evaluated.
  • the numerical time derivatives are formed from the set of mutually associated tuples. It is also possible to first deduce from the determined tuples the course of a curve defined by the tuples and then to deduce this in time. It can also be provided that a Abklinglebenszeit and / or a fluorescence half-life are determined from the set of mutually associated tuples. This can be done, for example, by determining from the data obtained, in particular from the n-tuples, the time intervals within which the number of detected photons has decreased to 1 / e or by half.
  • the excitation light pulses in particular with regard to pulse duration and pulse energy, are equal and / or that the time intervals of the excitation light pulses are the same.
  • devices for regulating the pulse duration and / or for regulating the light output can be provided which ensure these boundary conditions.
  • fluctuations in the properties of the excitation light pulses are measured and taken into account in the evaluation for correcting the data obtained.
  • the excitation light pulses are generated with a white-light laser, in particular a white-light laser, which has a photonic band-gap fiber or a photonic-cristal fiber.
  • a white-light laser in particular a white-light laser, which has a photonic band-gap fiber or a photonic-cristal fiber.
  • This has the advantage that light of the appropriate excitation light wavelength can be made available largely for each fluorescent dye. It is of course also possible to apply the sample simultaneously to light of several wavelengths, for example if the sample contains several different fluorescent dyes.
  • a particularly precise detection of the respective amount of light or photon number is possible when the detection light is detected with a hybrid detector.
  • the detection light is detected by a detector having a photocathode, which is followed by an electron accelerator and / or an electron multiplier and then an avalanche diode.
  • Especially such detectors have properties that allow a particularly precise embodiment of the method according to the invention; namely a large dynamic range, a high sensitivity and a low signal-to-noise ratio.
  • the method is carried out with a scanning microscope, in particular a confocal scanning microscope, which may have, for example, a scanning device for directing the excitation light and / or the detection light. In this way it is possible to generate FLI M images of the illuminated sample area and display it to the user on a display.
  • the device according to the invention it is possible, in particular, to provide a preferably electronic control device which keeps the second distances of the detection time window identical to the previous excitation light pulse and, during the illumination with the sequence of excitation light pulses, alters, in particular increases, the first distance, as the respective detection time window beginning.
  • control device or an evaluation device assigns each measured amount of light or each photon number at least one of the corresponding detection time window characterizing size and / or that the control device assigns each measured amount of light or each photon number respectively the detection time window beginning of each associated detection time window, the latter in particular if the second distances of the detection time windows are the same for the respective preceding excitation light pulse.
  • control device or a Evaluation device calculates the time derivative and / or the numerical time derivative of the amount of tuples associated with each other.
  • control device or an evaluation device determines a Abklinglebenszeit and / or a fluorescence half-life from the set of mutually associated tuples.
  • FIG. 1 is a schematic illustration of the temporal arrangement and dimension of the excitation light pulses and the detection time window with respect to an exemplary embodiment of a method according to the invention
  • Fig. 2 to 9 Schematically the principle of measured value acquisition
  • FIG. 1 schematically shows an illustration of the temporal arrangement and dimension of the excitation light pulses 1 and the detection time windows 2 in relation to a possible embodiment of a method according to the invention.
  • the excitation light pulses 1 for illuminating a sample area of a sample are emitted at a constant repetition rate and all have the same pulse duration and the same pulsed light power.
  • the light quantity and / or the number of photons of the detection light emanating from the sample area, in particular fluorescence light, is measured in each case between the excitation light pulses 1 and exclusively within a detection time window 2 following an excitation light pulse 1, whereby the time lengths of the detection time windows t a , t b, t c and t d are different from each other.
  • the detection time window start of a detection time window is defined in each case by a first time interval t 1a , t 1b , t 1c , t 1d to the respectively preceding excitation light pulse 1.
  • the detection time-slot end is defined in each case by a second time interval t 2a , t 2b , t 2c , t 2c i relative to the preceding excitation light pulse, wherein the time intervals t 2a , t 2b , t 2c , t 2d to the preceding excitation light pulse in this exemplary embodiment always are the same.
  • the first temporal distance t 1a , t 1b , t 1c , t 1d is progressively increased to produce unequal detection time windows 2 and thereby the time lengths of the detection time windows t a , t b, t c, t d decreased.
  • FIGS. 2 to 9 illustrate how, by measuring the amount of light and / or the number of photons of the detection light in each detection time window 2, the temporal integral 3 of the fluorescence decay curve 4 - starting from initially long detection time windows 2 (FIG. 2) and transitioning to increasingly shorter detection time windows 2 ( Figures 3 to 9) is scanned successively.
  • Each measured amount of light or each measured number of photons is assigned to at least one of the associated detection time window characterizing size, namely respectively the detection time window beginning and so 2er tuple generated by measurement data, which are shown in FIGS. 2 to 9 as crosses on the integral curve 3.
  • the course of the integral curve 3 By numerical derivation by time using the 2-tuple or by temporal derivation of the determined integral curve 3 can on the Fluoresezenzabklingkurve 4 and thus on the life of an excited state, in particular a fluorescence lifetime, and / or one with a lifetime of an excited state, especially a fluorescence lifetime, correlated property of a sample. In particular, it is possible with the aid of the measured and / or calculated quantities to generate a FLIM image of a sample area.
  • t a , t b , t c , t d is the time length of the detection time window tia > tib, tic, tid first time interval

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Description

VERFAHREN UND VORRICHTUNG UM UNTERSUCHEN EINER PROBE IN BEZUG AUF DIE LEBENSDAUER EINES ANGEREGTEN ZUSTANDS
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen einer Probe in Bezug auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder in Bezug auf einen mit einer 5 Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe, wobei ein Probenbereich mit einer Folge von Anregungslichtpulsen beleuchtet wird, und eine Vorrichtung zur Ausführung eines solchen Verfahrens.
Die Erfindung betrifft außerdem eine Vorrichtung, Mikroskop, insbesondere 10 Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop, zum Untersuchen einer Probe in Bezug auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder in Bezug auf einen mit einer Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe, mit einer 15 Lichtquelle, die eine Folge von Anregungslichtpulsen zum Beleuchten eines Probenbereichs einer Probe erzeugt.
Durch Untersuchen der Lebensdauer der angeregten Zustände einer mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen markierten Probe können wichtige Erkenntnisse über die Eigenschaften der Probe gewonnen 20 werden. Insbesondere bei der Verwendung mehrerer
Fluoreszenzfarbstoffe können mithilfe der Fluorecence Lifetime Imaging Microscopy (FLI M) beispielsweise Erkenntnisse über einen untersuchten Probenbereich, wie die Zusammensetzung oder dessen Umgebung, gewonnen werden. So kann beispielsweise in der Zellbiologie durch Messung der Lebensdauer der Fluoreszenzfarbstoffe indirekt auf die Kalziumkonzentration in einem Probenbereich geschlossen werden .
FLI M ist insbesondere eine Technik, mit welcher die unterschiedlichen Fluoreszenzabklingzeiten (z.B. verursacht durch Verwendung
verschiedener Farbstoffe oder durch unterschiedliche Mikroumgebung) als Kontrast in einem mikroskopischen Bild dargestellt werden können. Dabei werden Pixel für Pixel die Fluorezenzabklingzeiten gemessen dargestellt, wobei beispielsweise Pixeln mit unterschiedlichen
Fluoreszenzabklingzeiten unterschiedliche Farben zugeordnet werden. Es gibt eine Reihe von Methoden zur Messung der Lebensdauer der angeregten Zustände von Fluoreszenzfarbstoffen. Einige dieser
Methoden sind in den Kapiteln 4 und 5 des Lehrbuchs von Joseph R. Lakowicz, "Principles of Fluorescence Spectroscopy", Kluwer
Academic/Plenum Publishers, second edition, 1999, ausführlich beschrieben. Beispielsweise ist es möglich, die Leistung des
Anregungslichtes zeitlich zu modulieren, um aus der Phasenverzögerung des Emissionslichtes auf die Lebensdauer des angeregten Zustandes zu schließen.
Es ist auch möglich, die Fluoreszenzfarbstoffe mit kurzen Lichtpulsen anzuregen, um elektronisch den zeitlichen Versatz der
Emissionslichtpulse zu messen. Beispielsweise ist aus DE 10 2004 017 956 A1 ein Mikroskop zur Untersuchung der Lebensdauer angeregter Zustände in einer Probe mit mindestens einer Lichtquelle, die
Anregungslicht erzeugt, und mit mindestens einem Detektor, der von der Probe ausgehendes Detektionslicht empfängt, bekannt. Das Mikroskop ist dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle einen Halbleiterlaser beinhaltet, der gepulstes Anregungslicht emittiert, wobei eine
Einsteilvorrichtung zur Einstellung der Pulsrepetitionsrate auf die spezifischen Lebensdauereigenschaften der Probe vorgesehen ist. Insbesondere die zur Datenauswertung erforderliche Elektronik wird - oft in Form von PC-Einsteckkarten - kommerziell angeboten. Eine solche Zeitmesskarte ist jedoch sehr aufwändig und teuer.
Es ist daher die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren anzugeben, das es erlaubt, auf einfache Weise Rückschlüsse in Bezug auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder in Bezug auf einen mit einer
Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer
Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe ziehen zu können.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das dadurch gekennzeichnet ist, dass zeitlich zwischen den Anregungslichtpulsen jeweils innerhalb eines Detektionszeitfensters die Lichtmenge und/oder die Anzahl der Photonen des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes, gemessen wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung anzugeben, die einfach aufgebaut sein kann und die es erlaubt, Rückschlüsse in Bezug auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder in Bezug auf einen mit einer Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe ziehen zu können.
Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gelöst, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ein Detektor zeitlich zwischen den Anregungslichtpulsen jeweils innerhalb eines Detektionszeitfensters die Lichtmenge und/oder die Anzahl der Photonen des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes, misst.
Bei einer besonderen Ausführungsform ist vorgesehen, dass wenigstens zwei der Detektionszeitfenster zeitlich unterschiedlich lang sind und/oder dass wenigstens zwei zeitlich zwischen unterschiedlichen Anregungslichtpulsen angeordnete Detektionszeitfenster zeitlich unterschiedlich lang sind. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass eine Steuerungsvorrichtung während eines Beleuchtens eines Probenbereichs mit der Folge von Anregungslichtpulsen die Dauer der Detektionszeitfenster verändert.
Es kann insbesondere vorgesehen sein, dass ein Detektionszeitfensterbeginn eines Detektionszeitfenster durch einen ersten zeitlichen Abstand zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls definiert ist und dass ein Detektionszeitfensterende durch einen zweiten zeitlichen Abstand zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls definiert ist.
Bei einer besonders einfach umsetzbaren Ausführung ist vorgesehen, dass die zweiten zeitlichen Abstände der Detektionszeitfenster zum vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich sind und dass während des Beleuchtens mit der Folge von Anregungslichtpulsen der erste zeitliche Abstand zur Erzeugung ungleich langer Detektionszeitfenster verändert, insbesondere vergrößert, wird.
Zur Ausführung des Verfahrens ist es vollkommen ausreichend, wenn zwischen zwei Anregungslichtpulsen ausschließlich jeweils ein einziges Detektionszeitfenster vorgesehen ist.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils wenigstens einer das dazugehörige Detektionszeitfenster charakterisierenden Größe zugeordnet wird und/oder dass jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils dem Detektionszeitfensterbeginn des jeweils dazugehörigen Detektionszeitfensters zugeordnet wird, insbesondere wenn die zweiten Abstände der Detektionszeitfenster zum jeweils vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich sind. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass durch die Zuordnung eine Menge von n-Tupeln für die weitere Auswertung gebildet wird. Auf diese Weise wird das Integral über die Abklingkurve sukzessive abgetastet. Durch Bilden der zeitlichen Ableitung kann dann auf den Verlauf der Abklingkurve geschlossen werden.
Beispielsweise durch ein Vergrößern des ersten zeitlichen Abstandes des Detektionszeitfensterbeginns zu dem jeweils vorausgegangenen Anregungslichtpuls bei gleichbleibenden zweiten Abständen der Detektionszeitfensterenden zu den jeweils vorausgegangenen Anregungslichtpulsen ist es ermöglicht, das Abklingverhalten eines Angeregten Zustandes bzw. der Angeregten Zustände der im Probenbereich befindlichen Fluoreszenzfarbstoffe auf einfache Weise zu charakterisieren. Durch das Konstanthalten der zweiten zeitlichen Abstände ist jedes Detektionszeitfenster durch eine einzige Größe, nämlich durch den Detektionszeitfensterbeginn, vollständig beschrieben. Dies ermöglicht es, die jeweils gemessene Lichtmenge bzw. die jeweils gemessene Photonenzahl lediglich einer einzigen Größe zuordnen zu müssen, so dass durch die Bildung von 2er-Tupeln das zeitliche Verhalten der Probe im Beleuchteten Bereich als Antwort auf die Anregungslichtpulse festgehalten und weiter ausgewertet werden kann.
Die Menge der durch die Zuordnung gebildeten n-Tupel, insbesondere 2er-Tupel, kann beispielsweise durch numerische Verfahren in Bezug auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder in Bezug auf einen mit einer Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe ausgewertet werden.
Wie bereits erwähnt kann beispielsweise vorgesehen sein, dass, insbesondere zur Ermittlung einer Fluoreszenzabklingkurve, die numerische zeitliche Ableitung aus der Menge der einander zugeordneten Tupel gebildet werden. Es ist auch möglich, aus den Ermittelten Tupeln zunächst auf den Verlauf einer durch die Tupel festgelegten Kurve zu schließen und dies dann zeitlich abzuleiten. Es kann auch vorgesehen sein, dass aus der Menge der einander zugeordneten Tupel eine Abklinglebenszeit und/oder eine Fluoreszenzhalbwertzeit ermittelt werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass aus den gewonnenen Daten, insbesondere aus den n-Tupeln, die Zeitabstände ermittelt werden, innerhalb der die Zahl der detektieren Photonen auf 1/e bzw. um die Hälfte abgenommen hat.
Insbesondere um die Vergleichbarkeit der innerhalb der Detektionszeitfenster detektierten Lichtmengen bzw. Photonenzahlen zu gewährleisten ist vorzugsweise vorgesehen, dass die Anregungslichtpulse, insbesondere hinsichtlich Pulsdauer und Pulsenergie, gleich sind und/oder dass die zeitlichen Abstände der Anregungslichtpulse gleich sind. Insbesondere können Vorrichtungen zur Regelung der Pulsdauer und/oder zur Regelung der Lichtleistung vorgesehen sein, die diese Randbedingungen gewährleisten. Alternativ kann auch vorgesehen sein, dass Schwankungen betreffend der Eigenschaften der Anregungslichtpulse gemessen werden und bei der Auswertung zur Korrektur der gewonnenen Daten berücksichtigt werden.
Besonders vielseitig einsetzbar ist eine Ausführung, bei der die Anregungslichtpulse mit einem Weißlichtlaser, insbesondere einem Weißlichtlaser, der eine Photonic-Band-Gap-Faser oder eine Photonic-Cristal- Faser aufweist, erzeugt werden. Dies hat den Vorteil, dass weitgehend für jeden Fluoreszenzfarbstoff Licht der geeigneten Anregungslichtwellenlänge zur Verfügung gestellt werden kann. Es ist natürlich auch möglich, die Probe simultan mit Licht mehrerer Wellenlängen zu beaufschlagen, beispielsweise wenn die Probe mehrere unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe beinhaltet.
Eine besonders präzise Detektion der jeweiligen Lichtmenge bzw. Photonenzahl ist möglich, wenn das Detektionslicht mit einem Hybriddetektor detektiert wird. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass das Detektionslicht mit einem Detektor detektiert wird, der eine Photokathode, aufweist, der ein Elektronenbeschleuniger und/oder ein Elektronenvervielfacher und anschließend eine Avalanchediode nachgeschaltet ist. Insbesondere solche Detektoren weisen Eigenschaften auf, die eine besonders präzise Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ermöglichen; nämlich einen großen Dynamikbereich, eine große Empfindlichkeit und ein geringes Signal-zu-Rausch-Verhältnis. Bei einer besonders vorteilhaften Ausführung wird das Verfahren mit einem Scanmikroskop, insbesondere einem konfokalen Scanmikroskop, das beispielsweise eine Scaneinrichtung zum Lenken des Anregungslichtes und/oder des Detektionslichtes aufweisen kann, ausgeführt. Auf diese Weise ist es möglich, FLI M-Abbildungen des beleuchteten Probenbereichs zu erzeugen und dem Benutzer auf einem Display anzuzeigen.
Im Hinblick auf die erfindungsgemäße Vorrichtung kann insbesondere eine, vorzugsweise elektronische Steuerungsvorrichtung vorgesehen sein, die die zweiten Abstände der Detektionszeitfenster zum vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich hält und während des Beleuchtens mit der Folge von Anregungslichtpulsen den ersten Abstand, als den jeweiligen Detektionszeitfensterbeginn, verändert, insbesondere vergrößert.
Darüber hinaus kann auch vorgesehen sein, dass die Steuerungsvorrichtung oder eine Auswertevorrichtung jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils wenigstens einer das dazugehörige Detektionszeitfenster charakterisierenden Größe zuordnet und/oder dass die Steuerungsvorrichtung jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils dem Detektionszeitfensterbeginn des jeweils dazugehörigen Detektionszeitfensters zuordnet, letzteres insbesondere wenn die zweiten Abstände der Detektionszeitfenster zum jeweils vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich sind.
Insbesondere zur Ermittlung einer Fluoreszenzabklingkurve, kann vorteilhaft vorgesehen sein, dass die Steuerungsvorrichtung oder eine Auswertevorrichtung die zeitliche Ableitung und/oder die numerische zeitliche Ableitung aus der Menge der einander zugeordneten Tupel errechnet.
Es kann auch vorgesehen sein, dass die Steuerungsvorrichtung oder eine Auswertevorrichtung aus der Menge der einander zugeordneten Tupel eine Abklinglebenszeit und/oder eine Fluoreszenzhalbwertzeit ermittelt.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleiche oder gleich wirkende Elemente zumeist mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigen:
Fig. 1 Schematisch eine Illustration der zeitlichen Anordnung und Dimension der Anregungslichtpulse und der Detektionszeitfenster in Bezug auf ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens,
Fig. 2 bis 9 Schematisch das Prinzip der Messwertgewinnung und
Datenauswertung in Bezug auf ein Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
Figur 1 zeigt schematisch eine Illustration der zeitlichen Anordnung und Dimension der Anregungslichtpulse 1 und der Detektionszeitfenster 2 in Bezug auf ein mögliches Ausführungsbeispiel eines erfindungsgemäßen Verfahrens.
Die Anregungslichtpulse 1 zur Beleuchtung eines Probenbereichs einer Probe beispielsweise mit einem konfokalen Scanmikroskop werden mit konstanter Repetitionsrate emittiert und weisen alle dieselbe Pulsdauer, sowie dieselbe Pulslichtleistung auf.
Zeitlich zwischen den Anregungslichtpulsen 1 und ausschließlich jeweils innerhalb eines auf einen Anregungslichtpuls 1 folgenden Detektionszeitfensters 2 wird jeweils die Lichtmenge und/oder die Anzahl der Photonen des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes, gemessen, wobei sich die zeitlichen Längen der Detektionszeitfenster ta, tb, tc und td voneinander unterscheiden. Der Detektionszeitfensterbeginn eines Detektionszeitfenster ist jeweils durch einen ersten zeitlichen Abstand t1a, t1b, t1c, t1d zu dem jeweils vorausgegangenen Anregungslichtpuls 1 definiert. Das Detektionszeitfensterende ist jeweils durch einen zweiten zeitlichen Abstand t2a, t2b, t2c, t2ci zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls definiert, wobei die zeitlichen Abstände t2a, t2b, t2c, t2d zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls in diesem Ausführungsbeispiel stets gleich sind.
Während des Beleuchtens mit der Folge von Anregungslichtpulsen 1 wird der erste zeitliche Abstand t1a, t1b, t1c, t1d zur Erzeugung ungleich langer Detektionszeitfenster 2 zunehmend vergrößert und dadurch die zeitlichen Längen der Detektionszeitfenster ta, tb, tc, td verringert.
Die Figuren 2 bis 9 illustrieren, wie durch Messung der Lichtmenge und/oder der Anzahl der Photonen des Detektionslichtes in jedem Detektionszeitfenster 2 das zeitliche Integral 3 der Fluoresezenzabklingkurve 4 - ausgehend von zunächst langen Detektionszeitfenstern 2 (Figur 2) und übergehend zu zunehmend kürzer werdenden Detektionszeitfenstern 2 (Figuren 3 bis 9) sukzessive abgetastet wird.
Jede gemessene Lichtmenge oder jede gemessene Photonenanzahl wird jeweils wenigstens einer das dazugehörige Detektionszeitfenster charakterisierenden Größe, nämlich jeweils dem Detektionszeitfensterbeginn zugeordnet und so 2er-Tupel von Messdaten erzeugt, die in den Figuren 2 bis 9 als Kreuze auf der Integralkurve 3 eingezeichnet sind.
Beispielsweise durch Interpolation kann auf den Verlauf der Integralkurve 3 geschlossen werden. Durch nummerisches Ableiten nach der Zeit unter Verwendung der 2er-Tupel oder durch zeitliches Ableiten der ermittelten Integralkurve 3 kann auf die Fluoresezenzabklingkurve 4 und damit auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder auf eine mit einer Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe geschlossen werden. Insbesondere ist es möglich mit Hilfe der gemessenen und/oder errechneten Größen eine FLIM-Abbildung eines Probenbereiches zu erzeugen.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
Bezugszeichenliste:
1 Anregungslichtpulse
2 Detektionszeitfenster
3 Integral der Fluoresezenzabklingkurve 4
4 Fluoresezenzabklingkurve
ta, tb, tc, td zeitliche Länge des Detektionszeitfensters tia> tib, tic, tid erster zeitlicher Abstand
t2a, t2b, hc, hd zweiter zeitlicher Abstand

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Untersuchen einer Probe in Bezug auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder in Bezug auf einen mit einer Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe, wobei ein Probenbereich mit einer Folge von Anregungslichtpulsen beleuchtet wird, dadurch gekennzeichnet, dass zeitlich zwischen den Anregungslichtpulsen jeweils innerhalb eines Detektionszeitfensters die Lichtmenge und/oder die Anzahl der Photonen des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes, gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass a. wenigstens zwei Detektionszeitfenster zeitlich unterschiedlich lang sind und/oder dass b. wenigstens zwei zeitlich zwischen unterschiedlichen Anregungslichtpulsen angeordnete Detektionszeitfenster zeitlich unterschiedlich lang sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektionszeitfensterbeginn eines Detektionszeitfenster durch einen ersten zeitlichen Abstand zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls definiert ist und dass ein Detektionszeitfensterende durch einen zweiten zeitlichen Abstand zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls definiert ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweiten zeitlichen Abstände der Detektionszeitfenster zum vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich sind und dass während des Beleuchtens mit der Folge von Anregungslichtpulsen der erste zeitliche Abstand zur Erzeugung ungleich langer Detektionszeitfenster verändert, insbesondere vergrößert, wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen zwei Anregungslichtpulsen ausschließlich jeweils ein einziges Detektionszeitfenster vorgesehen ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass a. jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils wenigstens einer das dazugehörige Detektionszeitfenster charakterisierenden Größe, insbesondere Zeitgröße, zugeordnet wird und/oder dass b. jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils dem Detektionszeitfensterbeginn des jeweils dazugehörigen Detektionszeitfensters zugeordnet wird, insbesondere wenn die zweiten zeitlichen Abstände der Detektionszeitfenster zum jeweils vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass, insbesondere zur Ermittlung einer Fluoreszenzabklingkurve, die zeitliche Ableitung und/oder die numerische zeitliche Ableitung aus der Menge der einander zugeordneten Tupel gebildet werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass aus der Menge der einander zugeordneten Tupel eine Abklinglebenszeit und/oder eine Fluoreszenzhalbwertzeit ermittelt werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtpulse, insbesondere hinsichtlich
Pulsdauer und Pulsenergie, gleich sind und/oder dass die zeitlichen Abstände der Anregungslichtpulse gleich sind.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtpulse mit einem Weißlichtlaser, insbesondere einem Weißlichtlaser, der eine Photonic-Band-Gap-Faser oder eine Photonic-Cristal-Faser aufweist, erzeugt werden.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass a. das Detektionslicht mit einem Hybriddetektor detektiert wird und/oder dass b. das Detektionslicht mit einem Detektor detektiert wird, der eine Photokathode, aufweist, der ein Elektronenbeschleuniger und/oder ein Elektronenvervielfacher und anschließend eine Avalanchediode nachgeschaltet ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das eine Scaneinrichtung zum Lenken des Anregungslichtes und/oder des Detektionslichtes verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass eine FLI M-Abbildung des Probenbereichs erzeugt wird.
14. Vorrichtung, Mikroskop, insbesondere Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop, zur Ausführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
15. Vorrichtung, Mikroskop, insbesondere Scanmikroskop, insbesondere konfokales Scanmikroskop, zum Untersuchen einer Probe in Bezug auf die Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, und/oder in Bezug auf einen mit einer Lebensdauer eines angeregten Zustandes, insbesondere einer Fluoreszenzlebensdauer, korrelierten Eigenschaft einer Probe, mit einer Lichtquelle, die eine Folge von Anregungslichtpulsen zum Beleuchten eines Probenbereichs einer Probe erzeugt, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektor zeitlich zwischen den Anregungslichtpulsen jeweils innerhalb eines Detektionszeitfensters die Lichtmenge und/oder die Anzahl der Photonen des von dem Probenbereich ausgehenden Detektionslichtes, insbesondere Fluoreszenzlichtes, misst.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass, eine Steuerungsvorrichtung während eines Beleuchtens eines Probenbereichs mit der Folge von Anregungslichtpulsen die Dauer der Detektionszeitfenster verändert.
17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein Detektionszeitfensterbeginn eines Detektionszeitfenster durch einen ersten zeitlichen Abstand zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls definiert ist und dass ein Detektionszeitfensterende durch einen zweiten zeitlichen Abstand zu dem vorausgegangenen Anregungslichtpuls definiert ist und dass die zweiten Abstände der Detektionszeitfenster zum vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich sind und dass die Steuerungsvorrichtung während des Beleuchtens mit der Folge von Anregungslichtpulsen den ersten Abstand verändert, insbesondere vergrößert.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass a. die Steuerungsvorrichtung oder eine Auswertevorrichtung jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils wenigstens einer das dazugehörige Detektionszeitfenster charakterisierenden Größe zuordnet und/oder dass b. die Steuerungsvorrichtung oder eine Auswertevorrichtung jede gemessene Lichtmenge oder jede Photonenanzahl jeweils dem Detektionszeitfensterbeginn des jeweils dazugehörigen Detektionszeitfensters zuordnet, insbesondere wenn die zweiten Abstände der Detektionszeitfenster zum jeweils vorausgegangenen Anregungslichtpuls gleich sind.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass, insbesondere zur Ermittlung einer Fluoreszenzabklingkurve, die Steuerungsvorrichtung oder eine Auswertevorrichtung die zeitliche Ableitung und/oder die numerische zeitliche Ableitung aus der Menge der einander zugeordneten Tupel errechnet.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Steuerungsvorrichtung oder eine Auswertevorrichtung aus der Menge der einander zugeordneten Tupel eine Abklinglebenszeit und/oder eine Fluoreszenzhalbwertzeit ermittelt.
21 . Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Anregungslichtpulse, insbesondere hinsichtlich Pulsdauer und Pulsenergie, gleich sind und/oder dass die zeitlichen Abstände der Anregungslichtpulse gleich sind.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle einen Weißlichtlaser aufweist und/oder dass die Lichtquelle eine Photonic-Band-Gap-Faser oder eine Photonic- Cristal-Faser aufweist.
23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass der Detektor als Hybriddetektor ausgebildet ist und/oder dass der Detektor eine Photokathode, aufweist, der ein Elektronenbeschleuniger und/oder ein Elektronenvervielfacher und anschließend eine Avalanchediode nachgeschaltet ist.
24. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass eine Auswertevorrichtung eine FLIM-Abbildung des beleuchteten Probenbereichs erzeugt.
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