WO2014051098A1 - 粒子凝集測定用ラテックス粒子 - Google Patents

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latex particles
particle
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polymerizable monomer
particle aggregation
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北原　慎一郎
由紀 高橋
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Sekisui Medical Co Ltd
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    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to latex particles for particle aggregation measurement capable of highly sensitive measurement while highly suppressing non-specific reaction and a particle aggregation measurement reagent using the particles.
  • the latex immunoturbidimetric method using latex particles carrying antibodies or the like (hereinafter sometimes referred to as sensitized latex particles) is widely used in laboratories because it is simple and has a short measurement time. Quantification of the antigen or antibody in the specimen by latex immunoturbidimetry is performed by optically detecting a change in absorbance due to aggregation of sensitized latex particles accompanying immune complex formation. This change in absorbance is based on the apparent change in particle size due to aggregation of the sensitized latex particles.
  • Patent Document 1 it is easy to immobilize (sensitize) an antigen or antibody that specifically reacts with a detection target substance, is relatively inexpensive, and polymerizes. Since the reaction is easy to control, polystyrene latex particles mainly composed of polystyrene have been used. However, polystyrene latex particles have the merit of physical adsorption (sensitization) of antigens and antibodies, but also adsorb non-detection target proteins in the specimen, so they are not based on specific reactions due to antigen-antibody reactions. The agglutination reaction of the sensitized latex particles, which may cause a so-called non-specific reaction, has been a conventional problem to suppress this non-specific reaction.
  • Patent Document 1 an attempt is made to block latex particles sensitized with an antigen or antibody with bovine serum albumin (BSA) or the like in order to suppress nonspecific reaction, but the effect cannot be sufficiently obtained. Since many give a high background value, it was a big subject in producing the reagent which can perform a highly sensitive measurement.
  • BSA bovine serum albumin
  • Patent Document 2 styrene, a compound represented by the following general formula, a salt of styrene sulfonic acid, and a water-soluble radical polymerization initiator are used for copolymerization in water to form polymer particles.
  • styrene a compound represented by the following general formula
  • a salt of styrene sulfonic acid and a water-soluble radical polymerization initiator
  • a compound other than styrene a compound represented by the following general formula, a salt of styrene sulfonic acid, and a water-soluble radical polymerization initiator is used in the production of carrier particles.
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 immunological measurement reagents using polymers composed of a compound represented by the following general formula as a main component monomer as an aggregation promoter are shown.
  • the polymer may be a copolymer, but it is preferable that the polymer has a structural unit of the following general formula in the polymer at 20% or more. It is described that may be used.
  • the copolymer is present in the reaction solution in a free state as a chain polymer and is not shown to be used in the form of latex particles.
  • Patent Document 4 when a coagulation accelerator such as polyethylene glycol is added to the reaction solution, non-specific turbidity occurs due to salting out and the blank value increases, but the compound represented by the following general formula is the main component. It is described that when a polymer constituted as a monomer is used as an aggregation accelerator, non-specific turbidity due to salting out hardly occurs. However, there is no indication that these polymers can suppress excessive aggregation such as dissociated specimens that cause nonspecific aggregation reactions.
  • a coagulation accelerator such as polyethylene glycol
  • R 1 to R 3 are each independently an alkyl group optionally having a hydrogen atom or a hydroxyl group
  • R 4 is an alkylene group
  • R 5 may have a substituent
  • R 6 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • X represents an oxygen atom or a —NH— group
  • the present invention has been made to solve the problems in the conventional latex immunoturbidimetric method as described above, and is capable of highly sensitive measurement while highly suppressing non-specific reaction, and can be easily diagnosed.
  • An object of the present invention is to provide latex particles for particle aggregation measurement capable of producing a drug and a particle aggregation measurement reagent using the particles.
  • the present inventors have prepared latex particles for particle aggregation measurement of the present invention by making the composition specific during latex particle polymerization. As a result, the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows. *
  • It contains a polymerizable monomer having a phenyl group, a polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate, and a polymerizable monomer having the formula (1) as components, and has the formula (1)
  • the above-mentioned polymerizable monomer having a phenyl group is at least one selected from the group consisting of styrene, o-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, and 4-vinylbenzoic acid.
  • the polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate is selected from the group consisting of styrene sulfonate, divinylbenzene sulfonate, o-methyl styrene sulfonate, and p-methyl styrene sulfonate.
  • a biologically-derived substance such as a protein or a specific component in a test reagent is involved in an immune reaction, and a target specific reaction (for example, Since it is possible to suppress reactions that are not suitable for measurement purposes other than antigen-antibody reactions (for example, excessive agglutination reactions that occur in dissociated specimens), only the desired specific agglutination reactions can be measured with higher sensitivity than before. It is possible to produce a medicine.
  • the latex particles of the present invention are prepared by a one-step polymerization reaction, and the latex particles are designed to be sensitized with antigens or antibodies by physical adsorption. Thus, it is possible to obtain highly sensitive latex particles for particle aggregation measurement in a very simple process.
  • FIG. 1 is a calibration curve obtained by measuring D-dimer standard antigen using latex particles for particle aggregation measurement of Examples and Comparative Examples sensitized with anti-D-dimer antibody.
  • FIG. 2 shows the results of measuring D-dimer detachment sample 1 and D-dimer detachment sample 2 using the latex particles for particle aggregation measurement of Examples and Comparative Examples sensitized with anti-D dimer antibody, and based on the calibration curve of FIG. It is the graph converted into concentration.
  • the present invention relates to a polymerizable monomer having a phenyl group, a polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate, and a monomer represented by formula (1) (hereinafter referred to as “MPC monomer”).
  • MPC monomer a monomer represented by formula (1)
  • the present invention provides latex particles for particle aggregation measurement which are contained as monomer components and have a density (functional group density) of MPC monomers on the particle surface of 0.003 to 0.05 ⁇ mol / m 2 .
  • the polymerizable monomer having a phenyl group used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include styrene, o-methylstyrene, p-methylstyrene, p-chlorostyrene, and 4-vinylbenzoic acid. . These may be used alone or in combination of two or more. Of these, styrene is preferably used.
  • the polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate is not particularly limited as long as it is a monomer that can contain a sulfonic acid group on the surface of the polymerized particles.
  • styrene sulfonate divinyl
  • examples thereof include benzene sulfonate, o-methyl styrene sulfonate, and p-methyl styrene sulfonate.
  • it does not specifically limit as a salt in this case Sodium salt, potassium salt, lithium salt, ammonium salt etc. are mentioned. These may be used independently and 2 or more types may be used together. Of these, styrene sulfonate is preferable, and sodium styrene sulfonate is more preferably used.
  • the MPC monomer is a monomer represented by the following general formula (1).
  • CH 2 CR 1 —COOCH 2 CH 2 O (PO 2 ) OCH 2 CH 2 —N (CH 3 ) 3
  • R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • Examples include ethyl phosphate (manufactured by Tokyo Chemical Industry).
  • the polar group portion of the MPC monomer of the present invention is the same as the polar group structure of the phospholipid constituting the cell membrane, and the polymer polymerized with the MPC monomer as the main component is generally the same as the biological cell membrane component.
  • this polymer has high biocompatibility, and it is known that when it is coated on plastic equipment, it hardly adsorbs protein in blood and exhibits the property of suppressing non-specific adsorption. Application is under consideration.
  • Patent Document 3 and Patent Document 4 As an application to a diagnostic agent, as shown in Patent Document 3 and Patent Document 4, a role as an aggregation promoter is known.
  • a specific constituent component in a biological substance such as a protein or a test reagent is involved in an immune reaction, and is not suitable for a measurement purpose other than a target specific reaction (for example, an antigen-antibody reaction).
  • a target specific reaction for example, an antigen-antibody reaction.
  • the latex particles of the present invention can be obtained by soap-free emulsion polymerization in an aqueous medium containing a polymerizable monomer having a phenyl group, a polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate, and an MPC monomer. It is done.
  • a conventionally known soap-free emulsion polymerization method can be used. For example, a polymerizable monomer having a phenyl group, a polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate, an MPC monomer, and a polymerization initiator are added to a reaction vessel filled with water as a medium. And a method of heating with stirring in a nitrogen atmosphere.
  • the polymerization temperature is preferably 50 to 100 ° C, more preferably 60 to 85 ° C.
  • the polymerization time is usually 5 to 50 hours, although it depends on conditions such as the composition and concentration of the polymerizable monomer and the polymerization initiator.
  • aqueous medium water (deionized water) alone or a mixed solvent of water and a water-soluble solvent is preferably used, for example, a mixed solvent of water and alcohol such as ethanol. Among these, it is preferable to use water alone.
  • a known radical initiator can be used.
  • persulfates such as potassium persulfate, sodium persulfate, ammonium persulfate, 2,2′-azobisisobutyronitrile, 2,2′-azobis (4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile),
  • Organic compounds such as azo compounds such as 2,2′-azobis-2,4-dimethylvaleronitrile, benzoyl peroxide, di-t-butyl peroxide, lauroyl peroxide, t-butylperoxy-2-ethylhexanoate Mention may be made of peroxides.
  • persulfate is preferable, and potassium persulfate is more preferably used.
  • the amount of the polymerization initiator used is not particularly limited, but it is preferably used in the range of 0.01 to 5% by weight based on the amount of the polymerizable monomer.
  • a polymerizable unsaturated monomer copolymerizable with the above monomer may be further added during the above polymerization.
  • the polymerizable unsaturated monomer is not particularly limited as long as it can be used for ordinary radical polymerization.
  • (meth) acrylic acid means acrylic acid or methacrylic acid.
  • the styrene derivative is a styrene derivative other than the polymerizable monomer having a phenyl group and the polymerizable monomer having a phenyl group and a sulfonate used in the present invention.
  • the amount of the MPC monomer of the present invention used for the polymerization is not particularly limited as long as the density (functional group density) of the MPC monomer on the particle surface is 0.003 to 0.05 ⁇ mol / m 2. Absent. If the density of functional groups on the particle surface is increased, the effect of suppressing non-specific reaction is high, but the sensitivity is significantly lowered, which is not preferable. In addition, if the density of the functional group on the particle surface is too low, the effect of suppressing nonspecific reaction of the MPC monomer is reduced, and there is no difference from particles that do not use the MPC monomer. Absent.
  • the functional group density of the MPC monomer is set to 0.003 to 0.05 ⁇ mol / m 2 , preferably 0.004 to 0.02 ⁇ mol / m 2 . This is very important.
  • the functional group density can be calculated in detail by the following method.
  • r average particle diameter (nm) of produced latex particles
  • V Total volume of latex particles (cm 3 )
  • S Total surface area of latex particles (cm 2 )
  • x Total number of latexes
  • Z Functional group density ( ⁇ mol / m 2 )
  • K Total weight (g) of polymerizable monomers having a phenyl group, polymerizable monomers having a phenyl group and a sulfonate, polymerization initiator, and MPC monomer used in the polymerization reaction
  • V 4 / 3 ⁇ (r / 2 ⁇ 10 ⁇ 7 ) 3 ⁇ x
  • S 4 ⁇ (r / 2 ⁇ 10
  • the average particle size of the latex particles for particle aggregation measurement of the present invention is preferably 0.05 to 1.0 ⁇ m. If it is less than 0.05 ⁇ m, the amount of optical change due to aggregation is too small to obtain the sensitivity required for measurement, and much time is required for centrifugation during reagent preparation, and the reagent cost increases. If it exceeds 1.0 ⁇ m, the amount of optical change due to particle aggregation exceeds the measurable region when the concentration of the detection target substance is high, and an optical change amount corresponding to the amount of detection target substance cannot be obtained. . Although it varies depending on the measuring method and measuring instrument using latex particles for particle aggregation measurement, it is preferably 0.05 to 0.7 ⁇ m, more preferably 0.05 to 0.4 ⁇ m.
  • the particle diameter variation coefficient (CV value) of the particles is preferably 20% or less. If it exceeds 20%, the lot reproducibility at the time of reagent preparation may be poor, and the reproducibility of the measurement reagent may be lowered. More preferably, it is 15% or less.
  • the functional group density which is the density occupied by the MPC monomer, on the surface of the latex particle for particle aggregation measurement of the present invention can be controlled by the molar amount of the MPC monomer used for producing the latex particle. That is, the amount of functional groups on the surface of the latex particles per unit area is determined not by the weight of the MPC monomer used for the production of the latex particles but by the molar amount, so that MPC monomers having different molecular weights can be used. As long as the following general formula (1) is satisfied, the functional group density can be determined by a simple operation, and the effects of the present invention can be obtained.
  • CH 2 CR 1 —COOCH 2 CH 2 O (PO 2 ) OCH 2 CH 2 —N (CH 3 ) 3 (1) (Wherein R 1 represents a hydrogen atom or a methyl group)
  • the latex particles for particle aggregation measurement of the present invention are obtained in a state suspended in water or an aqueous solvent.
  • the particle concentration is not particularly limited, but it is usually preferably 1 to 20% by weight. If it is less than 1% by weight, it needs to be concentrated during preparation of the reagent, and if it exceeds 20% by weight, it may aggregate.
  • a latex particle for particle aggregation measurement in which a substance that specifically binds to a detection target substance is physically adsorbed and supported is also one aspect of the present invention.
  • Substances that specifically bind to the substance to be detected include immunoserologic test reagents (used in immunological agglutination and agglutination inhibition reactions) and physiologically active substances usually used as biochemical measurement methods. There is no particular limitation as long as it is present, but among these, those that can be used for antigen-antibody reaction are preferred.
  • antigen-antibody reaction examples include antigens such as proteins, nucleic acids, nucleoproteins, estrogens, lipids, and antibodies.
  • antigen examples include various antigens, receptors, enzymes, and the like. ⁇ 2 microglobulin, C-reactive protein (CRP), insulin, human fibrinogen, ferritin, rheumatoid factor (RA), ⁇ -fetoprotein (AFP), Examples include mycoplasma antigen and HBs antigen.
  • CRP C-reactive protein
  • RA rheumatoid factor
  • AFP ⁇ -fetoprotein
  • mycoplasma antigen and HBs antigen examples include mycoplasma antigen and HBs antigen.
  • the antibody examples include antibodies against various toxins and pathogens, such as anti-streptolysin O antibody, anti-estrogen antibody, anti- ⁇ 2 microglobulin antibody, anti-syphilis treponema antibody, antibody against syphilis lipid antigen, anti-HBs antibody.
  • the antibody may be a fragment such as F (ab ′) 2 .
  • either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody may be used as the antibody.
  • the method of supporting (sensitizing) a substance that specifically binds to the detection target substance on the latex particles is not particularly limited as long as it is a physical adsorption method, and may be supported by a conventionally known method.
  • sensitized latex dispersion After loading, if necessary, it can be blocked with bovine serum albumin or the like and dispersed in an appropriate buffer solution to prepare a sensitized latex dispersion.
  • a buffer solution and a standard substance used for measurement are attached to this sensitized latex dispersion, and can be used as a kit for a reagent for measuring particle agglutination.
  • the amount of the substance that specifically reacts with the detection target substance supported on the latex particles varies depending on the type of the substance that specifically reacts with the detection target substance used, and is not particularly limited.
  • sensitizers When using a measurement reagent containing the above-mentioned latex particles for particle aggregation measurement carrying an antigen or an antibody, various sensitizers may be contained in order to improve measurement sensitivity or promote antigen-antibody reaction.
  • the sensitizer include alkylated polysaccharides such as methylcellulose and ethylcellulose, pullulan, and polyvinylpyrrolidone.
  • a protein such as albumin (bovine serum albumin, egg albumin), casein, gelatin or the like, a decomposition product thereof, an amino acid or a surfactant may be contained.
  • the detection target substance may be diluted with an appropriate diluent.
  • an appropriate diluent any buffer solution having a pH of 5.0 to 9.0 can be used.
  • phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, borate buffer, citric acid examples include a buffer solution.
  • reaction amount of the detection target substance in the specimen can be measured.
  • any optical bioanalyzer represented by an optical instrument capable of detecting scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, etc., or an optical instrument provided with a plurality of these detection methods, etc. can also be used.
  • a conventionally known method is used. For example, an integrating sphere turbidity method in which a change in forward scattered light due to the formation of aggregates is measured using an integrating sphere, and the ratio to the transmitted light intensity is compared.
  • a speed test (obtaining at least two measurement values at different time points, and determining the degree of aggregation based on the increment (increase rate) of the measurement values between these time points ( Rate assay)
  • an end point test (end point assay) in which one measurement value is obtained at a certain time point (usually considered as an end point of the reaction), and the degree of aggregation is determined based on this measurement value.
  • the end point test by the turbidimetric method is preferable from the viewpoint of simplicity of measurement and rapidity.
  • the particle diameter of the obtained latex particles for particle aggregation measurement was measured as follows.
  • Particle size measurement of latex particles for particle aggregation measurement The latex particles for particle aggregation measurement are placed on a collodion film according to a conventional method, a particle image is taken with a transmission electron microscope, and the average particle size and standard deviation are obtained by measuring the particle size (100 or more) on the image. It was.
  • Example 1 In a glass reaction vessel (capacity 2 L) equipped with a stirrer, reflux condenser, temperature detector, nitrogen inlet tube and jacket, 1000 g of ultrapure water, 135 g of styrene monomer, 2- (methacryloyloxy) ethyl-2- (trimethyl) (Ammonium) 0.021 g of ethyl phosphate (manufactured by Tokyo Chemical Industry), 1.2 g of sodium styrenesulfonate, 0.7 g of potassium persulfate were added, the inside of the container was replaced with nitrogen gas, and the mixture was stirred at 70 ° C. and 210 rpm. The polymerization was carried out for 24 hours.
  • the solution was filtered with a filter paper, and latex particles were taken out. Thereafter, a dialysis treatment was performed for 48 hours with a dialysis membrane to obtain purified latex particles.
  • the obtained latex particles had a particle size of 0.108 ⁇ m (CV 9.7%) and an MPC density of 0.010 ⁇ mol / m 2 .
  • Latex particles were obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.021 g of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2- (trimethylammonium) ethyl phosphate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was changed to 0.009 g.
  • the obtained latex particles had a particle size of 0.102 ⁇ m (CV 10.4%) and an MPC density of 0.004 ⁇ mol / m 2 .
  • Latex particles were obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.021 g of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2- (trimethylammonium) ethyl phosphate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was changed to 0.042 g.
  • the obtained latex particles had a particle size of 0.105 ⁇ m (CV 10.1%) and an MPC density of 0.019 ⁇ mol / m 2 .
  • Latex particles were obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.021 g of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2- (trimethylammonium) ethyl phosphate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was not used.
  • the particle size of the obtained latex particles was 0.107 ⁇ m (CV 10.3%).
  • the MPC density is 0 because no MPC monomer is used.
  • Latex particles were obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.021 g of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2- (trimethylammonium) ethyl phosphate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was changed to 0.005 g.
  • the obtained latex particles had a particle size of 0.105 ⁇ m (CV 9.8%) and an MPC density of 0.002 ⁇ mol / m 2 .
  • Latex particles were obtained in the same manner as in Example 1 except that 0.021 g of 2- (methacryloyloxy) ethyl-2- (trimethylammonium) ethyl phosphate (manufactured by Tokyo Chemical Industry) was changed to 0.120 g.
  • the obtained latex particles had a particle size of 0.110 ⁇ m (CV 9.1%) and an MPC density of 0.058 ⁇ mol / m 2 .
  • the particle agglutination measurement reagent for D-dimer obtained by collecting this was adjusted to 0.5% (w / v) using a buffer solution to obtain an antibody-sensitized latex dispersion.
  • a calibration curve was prepared using a D-dimer antigen standard solution.
  • Substance to be detected (0-58 ⁇ g / mL D-dimer standard solution): 12 ⁇ L First reagent (sample dilution buffer: 0.15% (w / v) BSA, 30 mM Tris-HCl (pH 8.5): 100 ⁇ L Second reagent (0.5% (w / v) dispersion of antibody-sensitized latex particles): 100 ⁇ L Photometric point: 18-34
  • the latex particles for particle aggregation measurement of the present invention in order to induce only the target specific aggregation reaction without adsorbing the non-detection target protein in the sample causing the nonspecific aggregation reaction, It is possible to obtain a diagnostic agent with higher sensitivity than before. It is useful as an immunoserologic test reagent (used in immunological agglutination and agglutination inhibition reactions) and a test reagent for physiologically active substances usually used as biochemical measurement methods.

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Abstract

　非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能、かつ簡便に診断薬を作製できる粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定試薬を提供する。フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び式（１）を有する重合性単量体を成分として含み、式（１）を有する重合性単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．００３～０．０５μｍｏｌ／ｍ2である粒子凝集測定用ラテックス粒子。　ＣＨ2＝ＣＲ1－ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＰＯ2）ＯＣＨ2ＣＨ2－Ｎ（ＣＨ3）3・・・（１） （式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す）

Description

粒子凝集測定用ラテックス粒子
　本発明は、非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能な粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定試薬に関する。
　臨床検査の分野において検体中の微量物質を定量する方法として、抗原抗体反応を利用した免疫測定法が広く行われている。中でも抗体等を担持させたラテックス粒子（以下、感作ラテックス粒子ということがある）を用いたラテックス免疫比濁法は簡便かつ測定時間が短いことから、広く検査室等で用いられている。ラテックス免疫比濁法による検体中の抗原または抗体の定量は、免疫複合体形成に伴う感作ラテックス粒子の凝集による吸光度変化を光学的に検出することにより行われる。この吸光度の変化は、感作ラテックス粒子の凝集による見かけの粒径変化に基づくものである。
　従来、ラテックス免疫比濁法には、特許文献１に見られるように、検出対象物質と特異的に反応する抗原または抗体の固定化（感作）が容易であり、比較的安価で、かつ重合反応も制御しやすいことから、ポリスチレンを主成分とするポリスチレン系ラテックス粒子が用いられてきた。しかし、ポリスチレン系ラテックス粒子では、抗原や抗体を物理的に吸着（感作）できるメリットがある一方、検体中の非検出対象タンパク質等をも吸着するため、抗原抗体反応による特異的反応に基づかない感作ラテックス粒子の凝集反応、いわゆる非特異的反応を引き起こすことがあり、この非特異的反応を抑制することが従来からの課題であった。
　特許文献１では、非特異的反応を抑制するために、抗原や抗体を感作したラテックス粒子をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などでブロッキングする試みがなされているが、十分に効果を得られないことも多く、高いバックグラウンド値を与えることから、高感度測定が可能な試薬を作製する上での大きな課題であった。
　特許文献２では、スチレンと下記一般式で表される化合物とスチレンスルホン酸の塩と水溶性ラジカル重合開始剤を用いて水中で共重合させてポリマー粒子となし、診断薬用担体粒子を作製している。これにより、非特異的反応が抑制されるとしているが、非特異的反応の抑制を担う下記一般式の化合物を高濃度で含むように作製されたポリマー粒子は、抗原や抗体を粒子表面に物理吸着させにくく、診断薬用担体としての目的を果たすことができないものであった。また、担体粒子作製の際、スチレンと下記一般式で表される化合物とスチレンスルホン酸の塩と水溶性ラジカル重合開始剤以外の化合物を用いることは示されていなかった。
　ＣＨ2＝ＣＲ3－ＣＯＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）X（ＣＨ（ＣＨ3）ＣＨ2Ｏ）y（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ZＲ4
（式中、Ｒ3はＨまたはＣＨ3、Ｒ4はＨまたはＣＨ3を示し、ｘ、ｙおよびｚはそれぞれ０または１００以下の整数であって、ｘ、ｙ、ｚは１≦ｘ+ｙ+ｚ≦１００を満たす）　
　特許文献３及び特許文献４では、下記一般式で表される化合物を主成分モノマーとして構成されているポリマー類を凝集促進剤として用いる免疫学的測定用試薬が示されている。この際、ポリマーはコポリマーであってもかまわないが、下記一般式の構成単位をポリマー中に２０％以上を有していることが好ましく、またコポリマーにおける下記一般式以外の構成単位として、スチレン誘導体を用いても良い旨が記載されている。しかし、コポリマーは鎖状ポリマーとして反応液中に遊離状態で存在し、ラテックス粒子の形態として用いることは何ら示されていない。また特許文献４では、ポリエチレングリコール等の凝集促進剤を反応液に添加した場合、塩析により非特異的な濁りが生じてブランク値が上昇するが、下記一般式で表される化合物を主成分モノマーとして構成されているポリマー類を凝集促進剤として用いた場合には、塩析による非特異的な濁りが生じ難くなることが記載されている。しかし、これらのポリマー類が、非特異的に凝集反応を起こす乖離検体等の過剰凝集を抑制できることまでは何ら示されていない。
　ＣＨ2＝ＣＲ6－ＣＯ－Ｘ－Ｒ5－Ｏ（ＰＯ2）ＯＲ4－Ｎ－（Ｒ1）（Ｒ2）（Ｒ3）
（式中、Ｒ1からＲ3はそれぞれ独立して水素原子または水酸基を有していてもよいアルキル基、Ｒ4はアルキレン基、Ｒ5は置換基を有していてもよく、かつ鎖中に酸素原子を有していても良いアルキレン基、Ｒ6は水素原子またはメチル基、Ｘは酸素原子または－ＮＨ－基を示す）
特許第３７０８９４２号公報 特公昭５８－３４４８６号公報 特開２００５－１０６６０９号公報 特開２００２－３６５２９６号公報
　本発明は、上記のような従来のラテックス免疫比濁法における問題を解決するためになされたものであり、非特異的反応を高度に抑制しながら、高感度測定が可能で、かつ簡便に診断薬を作製できる粒子凝集測定用ラテックス粒子および該粒子を用いた粒子凝集測定試薬を提供することを目的としている。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ラテックス粒子重合の際、その組成を特定のものとすることにより、本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子を作製することが可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下のものである。　
　[１]フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び式（１）を有する重合性単量体を成分として含み、式（１）を有する重合性単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．００３～０．０５μｍｏｌ／ｍ2であることを特徴とする粒子凝集測定用ラテックス粒子。
　ＣＨ2＝ＣＲ1－ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＰＯ2）ＯＣＨ2ＣＨ2－Ｎ（ＣＨ3）3・・・（１）
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す）
　[２]上記フェニル基を有する重合性単量体が、スチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、４－ビニル安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである上記[１]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
　[３]上記フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体が、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ－メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ－メチルスチレンスルホン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである上記[１]または[２]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
　[４]上記フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムであることを特徴とする上記[１]に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
　[５]抗原または抗体を物理吸着により担持することを特徴とする上記[１]～[４]のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
　[６]上記[１]～[５]のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
　本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子および粒子凝集測定試薬を用いることにより、タンパク質のような生体由来物質や検査試薬中の特定の構成成分が免疫反応に関与し、目的とする特異的反応（例えば抗原抗体反応）以外の測定目的に適わない反応（例えば乖離検体で起こる過剰凝集反応）を抑制することができるので、目的とする特異的な凝集反応のみを、従来よりも高感度に測定できる診断薬を製造することが可能である。また、本発明のラテックス粒子は一段階の重合反応で作製されており、さらにラテックス粒子への抗原や抗体の感作は物理吸着で行うよう設計されている。このように、高感度な粒子凝集測定用ラテックス粒子を非常に簡便な工程で得ることが可能である。
図１は、抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例および比較例の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー標準抗原を測定した検量線である。 図２は、抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例および比較例の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いて、Ｄダイマー乖離検体１及びＤダイマー乖離検体２を測定し、図１の検量線に基づき濃度換算したグラフである。
　本発明は、フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び式（１）に示す単量体（以下、「ＭＰＣ単量体」という）を単量体成分として含み、ＭＰＣ単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．００３～０．０５μｍｏｌ／ｍ2である粒子凝集測定用ラテックス粒子を提供するものである。
　以下、本発明をさらに詳説する。本発明に用いられるフェニル基を有する重合性単量体としては、特に限定されず、例えば、スチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、４－ビニル安息香酸などが挙げられる。これらは単独で用いても良く、２種以上が混合されていても良い。なかでもスチレンが好ましく用いられる。
　フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体としては、重合後の粒子表面にスルホン酸基を含有させることができる単量体であれば特に限定されず、例えば、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ－メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ－メチルスチレンスルホン酸塩などが挙げられる。また、この場合の塩としても、特に限定されず、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。これらは単独で用いられてもよく、２種以上が併用されてもよい。なかでも、スチレンスルホン酸塩が好ましく、スチレンスルホン酸ナトリウムが更に好ましく用いられる。
　ＭＰＣ単量体は、下記一般式（１）により示される単量体である。
　ＣＨ2＝ＣＲ1－ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＰＯ2）ＯＣＨ2ＣＨ2－Ｎ（ＣＨ3）3・・・（１）
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す）
　具体的には、Ｒ1が水素原子である２－（アクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート、Ｒ1がメチル基である２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（東京化成製）が挙げられる。　
　本発明のＭＰＣ単量体の極性基部分は、細胞膜を構成するリン脂質の極性基構造と同一であり、該ＭＰＣ単量体を主成分として重合したポリマーは、一般に生体の細胞膜成分と同様の性質を有する。該ポリマーを人工的に水に溶解させると２分子膜ベシクルを形成してＷ／Ｏ／Ｗエマルションとして安定的に水中に存在することができる。この性質を利用し、薬物送達システムなどへの研究が盛んに行われている。また、このポリマーは、生体適合性が高いうえ、プラスチック機材等にコーティングすると血液中のタンパク質をほとんど吸着せず、非特異吸着を抑制する性質を示すことが知られており、医療器材などへの適用が検討されている。診断薬への適用としては、特許文献３及び特許文献４に示されているように、凝集促進剤としての役割が知られている。しかし、本発明のように、タンパク質のような生体由来物質や検査試薬中の特定の構成成分が免疫反応に関与し、目的とする特異的反応（例えば抗原抗体反応）以外の測定目的に適わない反応が惹起された非特異的反応を抑制する目的での適用例はない。　
　本発明のラテックス粒子は、上記フェニル基を有する重合性単量体とフェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体とＭＰＣ単量体を含む水性媒体中でソープフリー乳化重合することにより得られる。上記重合の方法としては、従来公知のソープフリー乳化重合法を用いることができる。例えば、媒体として、水を満たした反応容器内に、上記フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、ＭＰＣ単量体、重合開始剤を添加し、窒素雰囲気下で攪拌しながら加熱する方法等が挙げられる。
　重合温度は、５０～１００℃が好ましく、より好ましくは６０～８５℃である。また、重合時間は、重合性単量体の組成、濃度、及び、重合開始剤等の条件にもよるが、通常５～５０時間である。
　上記水性媒体としては、水（脱イオン水）単独、もしくは水および水溶性溶媒の混合溶媒を使用することが好ましく、例えば水とエタノールなどのアルコールとの混合溶媒である。中でも水単独を用いることが好ましい。
　上記重合開始剤としては、公知のラジカル開始剤を用いることができる。例えば、過硫酸カリウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、２，２'－アゾビスイソブチロニトリル、２，２'－アゾビス（４－メトキシ－２，４－ジメチルバレロニトリル）、２，２'－アゾビス－２，４－ジメチルバレロニトリル等のアゾ化合物、ベンゾイルパーオキサイド、ジ－ｔ－ブチルパーオキサイド、ラウロイルパーオキサイド、ｔ－ブチルパーオキシ－２－エチルヘキサノエート等の有機過酸化物を挙げることができる。なかでも過硫酸塩が好ましく、より好ましくは、過硫酸カリウムが用いられる。上記重合開始剤の使用量としては特に限定されないが、好ましくは重合性単量体量に対して０．０１～５重量％の範囲で用いる。
　また、本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子の用途によっては、上記重合の際に、更に上記単量体と共重合可能な重合性不飽和単量体を添加してもよい。重合性不飽和単量体としては通常のラジカル重合に使用可能なものであれば特に限定されず、例えば、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸エステル、スチレン誘導体、（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクリル酸アミド、ハロゲン化ビニル、ビニルエステル、（メタ）アクロレイン、マレイン酸誘導体、フマル酸誘導体等が挙げられる。なお、本発明において（メタ）アクリル酸とは、アクリル酸またはメタクリル酸を意味する。また、上記スチレン誘導体は、本発明に用いられるフェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体以外のスチレン誘導体である。
　重合に用いる本発明のＭＰＣ単量体の量としては、ＭＰＣ単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．００３～０．０５μｍｏｌ／ｍ2となるように用いれば特に限定はない。粒子表面に占める官能基密度が高くなると、非特異的反応を抑制する効果は高いが、感度の低下も著しくなり、好ましくない。また、粒子表面に占める官能基密度が低くなりすぎると、ＭＰＣ単量体が有する非特異的反応抑制の効果が減少し、ＭＰＣ単量体を用いない粒子と何ら変わりがなくなってしまうため、好ましくない。感度を低下させずに非特異的反応を抑制するには、ＭＰＣ単量体の官能基密度を０．００３～０．０５μｍｏｌ／ｍ2、好ましくは０．００４～０．０２μｍｏｌ／ｍ2とすることが重要である。
　尚、ＭＰＣ単量体の官能基密度は、以下の計算式により算出する。
　官能基密度（μｍｏｌ／ｍ2）＝（ラテックス粒子製造に用いたＭＰＣ単量体のモル数）／（生成したラテックスの全表面積）
　　官能基密度は、詳しくは下記の方法で計算できる。
　ｒ：生成したラテックス粒子の平均粒径（ｎｍ）
　Ｙ：ラテックス粒子の製造に用いたＭＰＣ単量体のモル数（μｍｏｌ）
　すなわち、
　Ｙ＝（製造に用いたＭＰＣ単量体の重量（ｇ））／（製造に用いたＭＰＣ単量体の平均分子量）
　Ｖ：ラテックス粒子の総体積（ｃｍ3）
　Ｓ：ラテックス粒子の総表面積（ｃｍ2）
　ｘ：ラテックスの総数（個）
　Ｚ：官能基密度（μｍｏｌ／ｍ2）
　Ｋ：重合反応に用いられる、フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基及びスルホン酸塩を有する重合性単量体、重合開始剤、ＭＰＣ単量体の重量の総和（ｇ）
としたとき、
　Ｖ＝４／３π（ｒ／２×１０-7）3×ｘ
　Ｓ＝４π（ｒ／２×１０-7）2×ｘ
　より、Ｓ＝６Ｖ／（ｒ×１０-7）
　よって、
　Ｚ＝Ｙ／（Ｓ×１０-4）
　　＝Ｙ×ｒ×１０-3／６Ｖ
　ここで、重合したポリスチレンの比重が１．０６ｇ／ｃｍ3より、
　Ｖ＝Ｋ／１．０６
　Ｚ＝１．７６６×１０-4×Ｙ×ｒ／Ｋ
　本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子の平均粒子径は、０．０５～１．０μｍであることが望ましい。０．０５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さすぎて測定に必要な感度が得られず、また、試薬調製時の遠心分離の際に多くの時間がかかり試薬コストが高くなる。１．０μｍを超えると、検出対象物質が高濃度であるときに粒子の凝集による光学的変化量が測定可能領域を越えてしまい、検出対象物質の量に応じた光学的変化量が得られない。粒子凝集測定用ラテックス粒子を使用する測定方法、測定機器によって異なるが、好ましくは０．０５～０．７μｍ、より好ましくは０．０５～０．４μｍである。
　上記粒子の粒子径の変動係数（ＣＶ値）は、２０％以下であることが好ましい。２０％を超えると、試薬調製時のロット再現性が悪く、測定試薬の再現性が低下することがある。より好ましくは１５％以下である。尚、上記粒子径の変動係数は、次の式により算出される。
　粒子径の変動係数（ＣＶ値）＝粒子径の標準偏差／平均粒子径
　本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子の表面におけるＭＰＣ単量体の占める密度である官能基密度は、ラテックス粒子の製造に用いるＭＰＣ単量体のモル量によって制御することができる。すなわち、単位面積当たりのラテックス粒子表面の官能基の量を、ラテックス粒子の製造に用いるＭＰＣ単量体の重量ではなく、モル量によって規定することにより、分子量の異なるＭＰＣ単量体であっても、下記一般式（１）を満足するものであれば、いかなるものでも簡便な操作で官能基密度を決定でき、本発明の効果を得ることができる。　
　ＣＨ2＝ＣＲ1－ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＰＯ2）ＯＣＨ2ＣＨ2－Ｎ（ＣＨ3）3・・・（１）
（式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す）
　本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子は、水又は水系溶媒に懸濁した状態で得られる。粒子濃度としては特に限定されないが、通常は１～２０重量％であることが好ましい。１重量％未満であると、試薬調製時に濃縮する必要があり、２０重量％を超えると、凝集してしまうことがある。
　検出対象物質と特異的に結合する物質が物理的に吸着して担持された粒子凝集測定用ラテックス粒子（粒子凝集測定試薬）も本発明の１つである。上記検出対象物質と特異的に結合する物質としては、免疫血清学的検査試薬（免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において使用されるもの）、生化学測定法として通常使用される生理活性物質であれば特に限定されないが、なかでも、抗原抗体反応に利用できるものが好適である。　
　上記抗原抗体反応に利用できるものとしては、例えば、タンパク質、核酸、核タンパク質、エストロゲン、脂質等の抗原、又は抗体が挙げられる。抗原としては、例えば、各種抗原、レセプター、酵素等が挙げられ、β２マイクログロブリン、Ｃ－反応性蛋白質（ＣＲＰ）、インスリン、ヒトフィブリノーゲン、フェリチン、リウマチ因子（ＲＡ）、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、マイコプラズマ抗原、ＨＢｓ抗原等が挙げられる。また、抗体としては、例えば、各種の毒素や病原菌等に対する抗体が挙げられ、抗ストレプトリジンＯ抗体、抗エストロゲン抗体、抗β２マイクログロブリン抗体、抗梅毒トレポネーマ抗体、梅毒脂質抗原に対する抗体、抗ＨＢｓ抗体、抗ＨＢｃ抗体、抗ＨＢｅ抗体、抗ＰＳＡ抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗インスリン抗体、抗Ｄダイマー抗体等が挙げられる。なお、抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ（ａｂ’）2のような断片であってもよい。更に抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。　
　上記ラテックス粒子に検出対象物質と特異的に結合する物質を担持（感作）させる方法としては、物理的な吸着方法であれば、特に限定されず、従来公知の方法により担持させればよい。　
　また、担持後には、必要に応じてウシ血清アルブミン等でブロッキング処理を施し、適当な緩衝液に分散して感作ラテックス分散液を作製することができる。この感作ラテックス分散液に、測定に用いる緩衝液および標準物質等を添付し、粒子凝集測定試薬のキットとして用いることができる。　
　上記検出対象物質と特異的に反応する物質がラテックス粒子に担持される量としては、用いられる検出対象物質と特異的に反応する物質の種類により異なり、特に限定されない。
　抗原や抗体などを担持する上記粒子凝集測定用ラテックス粒子を含む測定試薬を使用するにあたっては、測定感度の向上や抗原抗体反応の促進のために種々の増感剤を含有してもよい。上記増感剤としては、メチルセルロース、エチルセルロース等のアルキル化多糖類、プルラン、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
　本発明のラテックス粒子を用いることで、高度に非特異的反応が抑制されるが、更に、検体中に存在する他の物質により引き起こされる非特異的反応を抑制するため、又は、試薬の安定性を高めるために、アルブミン（ウシ血清アルブミン、卵性アルブミン）、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質やその分解物、アミノ酸又は界面活性剤等を含有してもよい。
　また、検出対象物質は、適当な希釈液で希釈してもよい。上記希釈液としてはｐＨ５．０～９．０の緩衝液であればどのようなものでも用いることができ、たとえば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等が挙げられる。
　本発明の抗原や抗体などを担持する上記粒子凝集測定用ラテックス粒子を含む測定試薬を用い、検体中の検出対象物質とラテックス粒子に担持された検出対象物質に特異的に反応する物質との反応により生じるラテックス粒子の凝集の度合いを光学的に測定することにより、検体中の検出対象物質の反応量を測定することができる。上記光学的測定には、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器、またはこれらの検出方法を複数備えた光学機器などに代表される一般の生化学自動分析機であればいずれも使用することができる。　
　上記凝集の度合いを光学的に測定する方法としては従来公知の方法が用いられ、例えば、凝集の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
　また、凝集度合いの変化量の測定法としては、例えば、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分（増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、ある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）等が挙げられる。なかでも、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による終点試験が好適である。
　以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。尚、得られた粒子凝集測定用ラテックス粒子の粒径は下記のように測定した。
　粒子凝集測定用ラテックス粒子の粒径測定：
　粒子凝集測定用ラテックス粒子を常法に従ってコロジオン膜状に載せ、透過型電子顕微鏡により粒子画像を撮影し、画像上の粒子径（１００個以上）を計測することにより平均粒径及び標準偏差を求めた。
［実施例１］
　攪拌機、還流用冷却器、温度検出器、窒素導入管及びジャケットを備えたガラス製反応容器（容量２Ｌ）に、超純水１０００ｇ、スチレンモノマー１３５ｇ、２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（東京化成製）０．０２１ｇ、スチレンスルホン酸ナトリウム１．２ｇ、過硫酸カリウム０．７ｇを添加し、容器内を窒素ガスで置換した後、７０℃、２１０ｒｐｍの速度で攪拌しながら２４時間重合を実施した。重合終了後、上記溶液をろ紙でろ過処理し、ラテックス粒子を取り出した。その後、透析膜にて４８時間透析処理を行い、精製されたラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０８μｍ（ＣＶ９．７％）、ＭＰＣ密度は０．０１０μｍｏｌ／ｍ2であった。
［実施例２］
　２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（東京化成製）０．０２１ｇを０．００９ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０２μｍ（ＣＶ１０．４％）、ＭＰＣ密度は０．００４μｍｏｌ／ｍ2であった。
［実施例３］
　２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（東京化成製）０．０２１ｇを０．０４２ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０５μｍ（ＣＶ１０．１％）、ＭＰＣ密度は０．０１９μｍｏｌ／ｍ2であった。
［比較例１］
　２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（東京化成製）０．０２１ｇを用いなかったこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０７μｍ（ＣＶ１０．３％）であった。尚、ＭＰＣ単量体を用いていないため、ＭＰＣ密度は０である。
［比較例２］
　２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（東京化成製）０．０２１ｇを０．００５ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１０５μｍ（ＣＶ９．８％）、ＭＰＣ密度は０．００２μｍｏｌ／ｍ2であった。
［比較例３］
　２－（メタクリロイルオキシ）エチル－２－（トリメチルアンモニウム）エチルホスフェート（東京化成製）０．０２１ｇを０．１２０ｇに変更したこと以外は実施例１と同様にしてラテックス粒子を得た。得られたラテックス粒子の粒径は０．１１０μｍ（ＣＶ９．１％）、ＭＰＣ密度は０．０５８μｍｏｌ／ｍ2であった。
［適用例］
　実施例及び比較例のラテックス粒子を用いてＤダイマー用粒子凝集測定試薬の評価を実施した。用いた試薬及び材料は以下の通りである。
　＜試薬及び材料＞
　・抗Ｄダイマー抗体
　・抗体担持ラテックス調製用緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。
　・ブロッキング用緩衝液：２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ 、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いた。
　・検体希釈用緩衝液：０．１５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．５）を用いた。
　＜Ｄダイマー用粒子凝集測定試薬の調製＞
　実施例１～３、比較例１～３で得られたラテックス粒子を遠心分離で精製した後、５％（ｗ／ｖ）となるよう抗体担持ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈ラテックス液を調製した。
　一方、抗Ｄダイマー抗体を濃度１ｍｇ／ｍＬとなるよう抗体担持ラテックス調製用緩衝液にて希釈して、希釈抗体溶液を調製した。
　上記希釈ラテックス液１容を攪拌しながら上記希釈抗体溶液１容を添加・混合し、更に攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液２容を追加添加し、攪拌を続けた。その後、これを回収して得られたＤダイマー用粒子凝集測定試薬を、緩衝液を用いて０．５％（ｗ／ｖ）に調整して、抗体感作ラテックス分散液とした。この抗体感作ラテックス分散液を用い、Ｄダイマー抗原標準液にて検量線を作成した。
　装置：日立 ７１７０型自動分析装置
　使用波長：５７０／８００ｎｍ、測定温度：３７℃
　検出対象物質（０～５８μｇ／ｍＬのＤダイマー標準液）：１２μＬ
　第１試薬（検体希釈用緩衝液：０．１５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ８．５）：１００μＬ
　第２試薬（抗体感作ラテックス粒子の０．５％（ｗ／ｖ）分散液）：１００μＬ　測光ポイント：１８－３４
［測定例１］
　抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例１～３および比較例１～３の抗体感作ラテックス粒子（０．５％（ｗ／ｖ））を用いて、上記測定方法に従い測定し、検量線を作成した（図１）。実施例１～３の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は比較的高感度の測定が可能であった。一方、比較例１～３の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は、実施例に比較して低い感度しか得られなかった。
［測定例２］
　抗Ｄダイマー抗体を感作した実施例１～３および比較例１～３の抗体感作ラテックス粒子（０．５％（ｗ／ｖ））とＤダイマー乖離検体（２種）を用いて、上記測定方法に従い測定し、その値を測定例１によって求めた検量線からそれぞれ濃度換算を行った。ここで、Ｄダイマー乖離検体とは、従来のＤダイマー免疫比濁測定系で非特異的凝集反応が観察された検体をいう。その結果を図２に示す。実施例１～３の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は、ＭＰＣ単量体を用いなかった比較例１に対して、乖離検体の非特異凝集反応を高度に抑制することが認められた。また、比較例３の抗体感作ラテックス粒子を用いた場合は、乖離検体の非特異的な凝集反応を実施例１～３と同様に抑制することが認められたが、測定例１で示されたように感度が大幅に低下した。この理由としては、ＭＰＣ単量体の密度が高すぎた為に、ラテックス粒子表面に抗体が十分に吸着（感作）しなかったことが考えられる。
　本発明の粒子凝集測定用ラテックス粒子および粒子凝集測定用試薬を用いることにより、非特異凝集反応を引き起こす検体中の非検出対象タンパク質を吸着させず、目的とする特異凝集反応のみを惹起させるため、従来よりも高感度な診断薬を得ることが可能である。免疫血清学的検査試薬（免疫学的凝集反応及び凝集阻止反応において使用されるもの）、生化学測定法として通常使用される生理活性物質の検査試薬として有用である。

Claims (6)

  1. 　フェニル基を有する重合性単量体、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体、及び式（１）を有する重合性単量体を成分として含み、式（１）を有する重合性単量体の粒子表面に占める密度（官能基密度）が０．００３～０．０５μｍｏｌ／ｍ2であることを特徴とする粒子凝集測定用ラテックス粒子。　
    　ＣＨ2＝ＣＲ1－ＣＯＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＰＯ2）ＯＣＨ2ＣＨ2－Ｎ（ＣＨ3）3・・・（１）
    （式中、Ｒ1は水素原子またはメチル基を示す）
  2. 　上記フェニル基を有する重合性単量体が、スチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン、ｐ－クロロスチレン、４－ビニル安息香酸からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
  3. 　上記フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体が、スチレンスルホン酸塩、ジビニルベンゼンスルホン酸塩、ｏ－メチルスチレンスルホン酸塩、ｐ－メチルスチレンスルホン酸塩からなる群から選ばれる少なくとも１つである請求項１または２に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
  4. 　上記フェニル基を有する重合性単量体がスチレン、フェニル基とスルホン酸塩を有する重合性単量体がスチレンスルホン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
  5. 　抗原または抗体を物理吸着により担持することを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子。
  6. 　上記請求項１～５のいずれかに記載の粒子凝集測定用ラテックス粒子を用いる粒子凝集測定試薬。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018030910A (ja) * 2016-08-22 2018-03-01 東ソー・ファインケム株式会社 ポリマーエマルション及びその製造方法
WO2025135129A1 (ja) * 2023-12-22 2025-06-26 デンカ株式会社 凝集反応用改善剤、標的抗原の測定方法の改善方法、及びヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドの測定試薬
WO2025206089A1 (ja) * 2024-03-28 2025-10-02 積水メディカル株式会社 非特異反応抑制剤、生化学的測定用試薬、生化学的測定用試薬キット、共重合体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2698633B1 (en) * 2011-03-28 2017-10-11 Sekisui Medical Co., Ltd. Psa assay method and reagent therefor

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5876762A (ja) * 1981-10-31 1983-05-09 Sekisui Chem Co Ltd 診断試薬用ラテツクスの製造方法
JPS5834486B2 (ja) 1980-08-19 1983-07-27 積水化学工業株式会社 診断試薬用ラテツクスの製造方法
JPH0344085B2 (ja) * 1983-06-15 1991-07-04 Japan Exlan Co Ltd
JPH06265552A (ja) * 1992-12-22 1994-09-22 Eastman Kodak Co 乾式イムノアッセイ分析要素
JPH0682128B2 (ja) * 1986-07-23 1994-10-19 株式会社トクヤマ ラテツクス試薬
JPH0810224B2 (ja) * 1987-04-30 1996-01-31 日東電工株式会社 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬
WO2002018953A1 (en) * 2000-08-29 2002-03-07 Kyowa Medex Co.,Ltd Highly reproducible agglutination immunoassay method and reagents
JP2002318233A (ja) * 2001-04-19 2002-10-31 Shino Test Corp 測定対象物質の比濁法測定試薬及び測定対象物質の比濁法測定方法
JP2002365296A (ja) 2001-06-05 2002-12-18 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫学的測定法用凝集促進剤
WO2003005031A1 (en) * 2001-07-02 2003-01-16 Sekisui Chemical Co., Ltd. Carrier particle latex for assay reagent and assay reagent
JP2003231648A (ja) * 2001-12-07 2003-08-19 Jsr Corp 生理活性物質担体用ポリマー粒子およびその製造方法
JP2005106609A (ja) 2003-09-30 2005-04-21 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫学的測定用試薬

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR860001409B1 (ko) 1983-06-10 1986-09-23 니혼엑스란 고오교오 가부시끼가이샤 비이드상 폴리머의 제조법
US5166077A (en) 1987-04-30 1992-11-24 Nitto Denko Corporation Latex for immobilization of physiologically active substances for immuno nephelometry
US5714340A (en) * 1992-12-22 1998-02-03 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Immunoassay elements having a receptor zone
KR102013464B1 (ko) 2011-03-31 2019-08-22 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 측정 시약용 라텍스 입자, 감작 라텍스 입자 및 면역 비탁법용 측정 시약
JP6188577B2 (ja) 2011-12-28 2017-08-30 積水メディカル株式会社 粒子凝集測定用ラテックス粒子
CN104335048B (zh) 2012-03-30 2017-05-17 积水医疗株式会社 凝集测定用胶乳粒子

Patent Citations (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5834486B2 (ja) 1980-08-19 1983-07-27 積水化学工業株式会社 診断試薬用ラテツクスの製造方法
JPS5876762A (ja) * 1981-10-31 1983-05-09 Sekisui Chem Co Ltd 診断試薬用ラテツクスの製造方法
JPH0344085B2 (ja) * 1983-06-15 1991-07-04 Japan Exlan Co Ltd
JPH0682128B2 (ja) * 1986-07-23 1994-10-19 株式会社トクヤマ ラテツクス試薬
JPH0810224B2 (ja) * 1987-04-30 1996-01-31 日東電工株式会社 生理活性物質固定化用ラテツクス及びこのラテツクスを用いるラテツクス試薬
JPH06265552A (ja) * 1992-12-22 1994-09-22 Eastman Kodak Co 乾式イムノアッセイ分析要素
WO2002018953A1 (en) * 2000-08-29 2002-03-07 Kyowa Medex Co.,Ltd Highly reproducible agglutination immunoassay method and reagents
JP2002318233A (ja) * 2001-04-19 2002-10-31 Shino Test Corp 測定対象物質の比濁法測定試薬及び測定対象物質の比濁法測定方法
JP2002365296A (ja) 2001-06-05 2002-12-18 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫学的測定法用凝集促進剤
WO2003005031A1 (en) * 2001-07-02 2003-01-16 Sekisui Chemical Co., Ltd. Carrier particle latex for assay reagent and assay reagent
JP3708942B2 (ja) 2001-07-02 2005-10-19 積水化学工業株式会社 測定試薬用担体粒子ラテックス及び測定試薬
JP2003231648A (ja) * 2001-12-07 2003-08-19 Jsr Corp 生理活性物質担体用ポリマー粒子およびその製造方法
JP2005106609A (ja) 2003-09-30 2005-04-21 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫学的測定用試薬

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2018030910A (ja) * 2016-08-22 2018-03-01 東ソー・ファインケム株式会社 ポリマーエマルション及びその製造方法
WO2025135129A1 (ja) * 2023-12-22 2025-06-26 デンカ株式会社 凝集反応用改善剤、標的抗原の測定方法の改善方法、及びヒト脳性ナトリウム利尿ペプチドの測定試薬
WO2025206089A1 (ja) * 2024-03-28 2025-10-02 積水メディカル株式会社 非特異反応抑制剤、生化学的測定用試薬、生化学的測定用試薬キット、共重合体

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US9383356B2 (en) 2016-07-05

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