WO2014118041A1 - Stabilisierung von wässrigen xanthen-farbstofflösungen mittels antichaotroper verbindungen - Google Patents

Stabilisierung von wässrigen xanthen-farbstofflösungen mittels antichaotroper verbindungen Download PDF

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Oliver Lade
Saskia Rausch
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Siemens AG
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B67/00—Influencing the physical, e.g. the dyeing or printing properties of dyestuffs without chemical reactions, e.g. by treating with solvents grinding or grinding assistants, coating of pigments or dyes; Process features in the making of dyestuff preparations; Dyestuff preparations of a special physical nature, e.g. tablets, films
    • C09B67/0071—Process features in the making of dyestuff preparations; Dehydrating agents; Dispersing agents; Dustfree compositions
    • C09B67/0083—Solutions of dyes

Definitions

  • the present invention relates to the stabilization of aqueous xanthene dye solutions by means of antichaotropic compounds, correspondingly stabilized dye solutions, and the use of the corresponding dye solutions for coloring cell preparations.
  • Dye solutions are used for a long time in microscopy to make animal or plant cell and Gewebebe ⁇ constituents visible and to enable the identification and differentiation of such tissue.
  • Dyes for microscopy are primarily used in histology, cytology and microbiology, but are also used to analyze textile fibers, paper and other technical products.
  • xanthene dyes such as e.g. Eosin, fluorescein, pyronine and rhodamine are used in histology for staining cells.
  • Eosin for example, is used for hematoxylin-eosin staining and pyronin G (also referred to as pyronine Y) for Pappenheim-Unna staining.
  • Hematoxylin-eosin staining is a histological staining procedure that stains the various structures of a histological section. It is used to distinguish different tissue structures in the microscopic picture from two different single stains and is one of the most widely used routine staining methods for morphological studies.
  • Eosin is a synthetic acid dye that dyes acidophilic or basic (eosinophilic) structures red, which mainly includes the cytoplasmic proteins.
  • the dye eosin is unstable in aqueous solutions and tends to precipitate out of the solution. This leads to a deterioration of the dyeing performance and a reduction in the durability of the dyeing solution.
  • an alcoholic eosin solution can be used instead of an aqueous one.
  • solutions of eosin in ethanol or methanol are used.
  • eosin can be stabilized in alcoholic staining solutions by the addition of stabilizers.
  • EP 0313975 A2 describes the stabilization of dye solutions by the addition of dimethylammonium sulfate and Minim ⁇ least one crystallization inhibitor, such as Gly cerin, polyethylene glycol and / or ethylene glycol.
  • the stabilizers known from the prior art have the disadvantage that they are poorly water-soluble, harmful salts such as dimethyl ammonium sulfate han ⁇ delt, or alcoholic dyeing solutions are used, which have the disadvantage of being toxic and flammable.
  • Object of the present invention is therefore to provide stabilization ⁇ factors for aqueous xanthene dye solutions are available, which are not toxic or flammable and provide a good stabilization of the dye in the aqueous solution, and thus a long shelf life, as well as a uniform coloring performance.
  • the object is achieved by using antichaotropic compounds for stabilizing the dye solutions.
  • the dye solutions according to the invention are stable and readily storable. Even after prolonged storage for a period of for example 2 to 3 months at temperatures between, for example, 0 ° C and 50 ° C, the dye solutions remain stable and there is no deterioration of the dyeing.
  • the staining solutions according to the invention contain no toxic or combustible stabilizers.
  • FIG. 1 shows a micrograph of human oral mucosal cells which were stained by means of a freshly prepared staining solution according to the invention.
  • Fig. 2 shows human oral mucosal cells by means of
  • the stabilization of the dye solutions takes place by the addition of water-soluble antichaotropic compounds as stabilizers.
  • Antichaotropic compounds act as precipitants and who ⁇ used, for example, for precipitation (the so-called salting out) of proteins. Antichaotropic compounds enhance the hydrophobic effects in aqueous protein solutions and thereby promote protein aggregation via hydrophobic interactions, resulting in the failure of proteins from the solution. Surprisingly, it has been found in the present invention that the use of antichaotropic compounds in dyeing solutions to stabilize the dyes in the solution leads.
  • antichaotropic compounds in the context of the present inven- tion, it is preferably urea and / or anti ⁇ chaotropic salts, wherein the anti-chaotropic salts are preferable which have shown in the Hofmeister series anti-chaotropic cations and anions. Ammonium ions, potassium ions and sodium ions and magnesium ions or combinations of these cations are particularly preferred antichaotropic cations.
  • antichaotropic anions especially preferably Sulfati ⁇ tions, fluoride ions and chloride ions, or combinations of these anions are used.
  • stabilizers according to the invention particularly preferred at ⁇ tichaotrope compounds are urea, sodium chloride, Am ⁇ moniumsulfat and / or sodium sulfate, especially Natriumsul ⁇ fat.
  • An antichaotropic compound or a mixture of two or more antichaotropic compounds may be used. Only one anti-chaotropic compound is preferably set a ⁇ .
  • the antichaotropic compound is preferably used in an amount of 0.01-1% by weight, more preferably 0.01-0.5% by weight, in particular 0.01-0.1% by weight, particularly preferably
  • any water-soluble dye from the group of xanthene dyes and / or derivatives and / or salts of the xanthene dyes can be used.
  • the preferred dye is eosin (for example eosin G (also referred to as eosin Y) or eosin B), fluorescein, pyronine G (also referred to as pyronine Y), rhodamine (for example Rhodium).
  • Eosin G and / or eosin B is particularly preferably used, very particularly preferably eosin G.
  • a dye or a mixture of two or more dyes may be used. Preferably, only one dye is used.
  • the dye is dissolved in water. Both tap water and distilled or demineralized water can be used. Preferably, distilled or demineralized water is used.
  • the dye is preferably in an amount of
  • 0.1-1.0 wt.% Particularly preferably 0.2-0.5 wt. ⁇ 6, in particular particularly preferably 0.3 wt.%, In each case based on the total weight of the dyeing solution used.
  • dye solutions are obtained which have a high stability and storage life. Even after prolonged storage for a period of, for example, 2 to 3 months, the dye solutions remain stable and there is no precipitation of eosin and no deterioration of the dyeing power.
  • the dye solutions may be stabilized zusharm ⁇ Lich by adding a crystallization inhibitor.
  • Suitable crystallization inhibitors are preferably glycerol, polyethylene glycol, ethylene glycol and / or its aliphatic ethers, in particular ethylene glycol, glycerol and / or polyethylene glycol having a molecular weight of up to about 300, particularly preferred is glycerol.
  • a crystallization inhibitor or a mixture of two or more crystallization inhibitors may be used. Preferably, only a crystallization inhibitor is used.
  • the crystallization inhibitor is preferably used in an amount of 1 - 25 wt%, particularly preferably 5 -. 20% by weight, in particular ⁇ sondere. 10 - 15 wt%, particularly preferably 12 -. 14% by weight, especially particularly preferably 13 wt.%. %, in each case based on the total weight of the dyeing solution used.
  • the stabilized staining solutions according to the invention are used for staining of biological material, preferably cell preparations, in hematology, cytology and His ⁇ ontology, in particular for staining microscopy samples.
  • the eosin solutions of the invention can be used for HE staining.
  • HE staining protocols are published as Standard Procedures (SOP) in Rüegg and Gon, "Histopathology in Hematoxylin & Eosin stained muscle sections", SOP_ID: MDC1A_M.1.2.004, TREAT-NMD / CURE CMD.
  • SOP Standard Procedures
  • HE staining is performed according to known standard protocols using known hematoxylin solutions.
  • the eosin color solutions according to the invention containing eosin and anti-chaotropic compounds, are used.
  • the cell samples are first stained with hematoxylin after fixation on a microscope slide (H staining).
  • Hematoxylin stains all of the acidic or ba ⁇ sophilen structures blue, particularly cell nuclei with ⁇ represent deoxyribonucleic acid contained in (DNA) and the somen enriched ribo- rough endoplasmic reticulum (RER).
  • RER ribo- rough endoplasmic reticulum
  • the nuclei initially appear reddish brown due to the low pH of the staining solution. By increasing the pH, the hue turns into the typical blue violet (blueing); This is effected by rinsing in Lei ⁇ tion water.
  • E staining is a red color of all acidophilic or basic (eosinophilic) structures, which mainly includes the cytoplasmic proteins.
  • a standard protocol for carrying out the HE staining comprises, for example, the following steps: (1) Fixation of the cells to be examined on the slide by means of 1-2 spray bursts of an alcoholic fixative spray (2) Hematoxylin staining (H staining) 1-2 min
  • acid hematoxylin is used according to Ehrlich or acidic hemalum according to Mayer.
  • the staining solution contains: hematoxylin, Natriumj odat, potash alum ⁇ , chloral hydrate, hydrochloric acid, 0.1% strength ammonia solution, sodium bicarbonate and citric acid.
  • the staining solution contains: hematoxylin, isopropanol 96%, glycerol, potassium alum, acetic acid, sodium iodate, sodium bicarbonate and ammonia solution
  • Tables 1 to 3 describe the composition of various staining solutions.
  • the staining solutions were prepared by dissolving the appropriate components, in the indicated amounts, in distilled water.
  • the dyeing solution according to Comparative Example 1 comprises a dyeing solution containing 0.3% by weight of eosin and the staining solution according to Example 2, a staining solution containing 0.3 wt.% Eosin, 0.1 wt.% Ammonium sulfate and 3.0 wt.% Glycerol.
  • the staining solution according to Example 16 comprises a staining solution containing 0.3% by weight of eosin, 13% by weight of glycerol and 0.01% by weight of ammonium sulfate.
  • the non-stabilized staining solutions already show after a week at the latest after two weeks one MACHINES SHOW ⁇ chen rainfall and have only a unzurei ⁇ -reaching coloring effect.
  • the staining solutions according to the invention have a constant good staining effect even after storage for 3 months at temperatures between 4 ° C and 40 ° C.
  • the staining solution according to Example 27 was used as an eosin solution for staining human oral mucosal cells by means of HE staining.
  • the cells were harvested by brush biopsy.
  • the HE staining of the cells was carried out according to the following protocol:
  • the staining of the cells was carried out with a freshly prepared staining solution and with a dyeing dye stored for 3 months. solution stored under the conditions given in Table 3 for Example 27, the solution being stored at room temperature from the 23rd day for a further period up to a total of 3 months.
  • Comparative Example 1 0.3% eosin wweeiinnrroott ,, kkllaarr ++ burgundy, clear ++ Comparative Example 2 0.3% eosin, wweeiinnrroott ,, kkllaarr ++ burgundy, clear ++
  • Example 1 0.3% eosin, burgundy, clear (+) burgundy, clear +
  • Example 3 0.3% eosin, burgundy, clear burgundy, clear
  • Comparative Example 5 0.3% eosin, burgundy, clear burgundy, clear
  • Comparative Example 6 0.3% eosin, burgundy, clear burgundy, clear
  • Example 4 0.3% eosin, burgundy, clear burgundy, clear
  • Example 5 0.3% eosin, burgundy, clear burgundy, clear
  • Example 6 0.3% eosin, burgundy, clear (+) burgundy, clear
  • Comparative Example 7 0.3% eosin burgundy, clear burgundy, clear Comparative Example 8 0.3% eosin, burgundy, clear burgundy, clear
  • Comparative Example 9 0.3% eosin, burgundy, clear burgundy, clear
  • Example 7 0.3% eosin, burgundy, clear, (+) burgundy, clear,
  • Example 8 0.3% eosin, burgundy, clear, burgundy, clear,
  • Example 13 0.3% eosin + cherry red, clear cherry red, clear
  • Example 15 0.3% eosin + cherry red, clear cherry red, clear
  • Example 12 0.3% eosin + cherry red, clear (+) cherry red, clear
  • Example 13 0.3 * 's eosin + cherry red, clear ((+)) cherry red, clear (+)
  • Example 15 0.3 * 's eosin + cherry red, clear ((+)) cherry red, clear (+)
  • Example 16 + 0.01% NH 4 S0 4 cherry red, (((+))) cherry red, ((+)) cherry red,
  • Example 20 + 1% NH 4 S0 4 cherry red, (((+))) cherry red, cherry red,
  • Example 21 + 0.01% NaCl cherry red, cherry red, + / (+) cherry red,
  • Example 22 + 0.05% NaCl cherry red, (((+))) cherry red, (+) cherry red,
  • Example 23 +0, 1% NaCl cherry red, (((+))) cherry red, (+) cherry red,
  • Example 26 +0, 01% NaS0 4 cherry red, (((+))) cherry red, ((+)) cherry red,
  • Example 27 +0, 05% NaS0 4 cherry red, cherry red, (+) cherry red,
  • Example 30 + 1% NaS0 4 cherry red, (((+))) cherry red, (+) / + cherry red, ((+)) clearly clear

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von antichaotropen Verbindungen zur Stabilisierung von wässrigen Xanthen-Farbstofflösungen. Durch Verwendung von antichaotropen Verbindungen können stabile wässrige Xanthen-Farbstofflösungen erhalten werden, die beispielsweise zum Einfärben von Zellpräparaten in der Mikroskopie verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen Farbstofflösungen sind stabil und gut lagerfähig. Auch nach längerer Lagerung bleiben die Farbstofflösungen stabil und es kommt zu keiner Verschlechterung der Färbeleistung. Außerdem enthalten die erfindungsgemäßen Färbelösungen keine toxischen oder brennbaren Stabilisatoren.

Description

Beschreibung
Stabilisierung von wässrigen Xanthen-Farbstofflösungen mittels antichaotroper Verbindungen
Die vorliegende Erfindung betrifft die Stabilisierung von wässrigen Xanthen-Farbstofflösungen mittels antichaotroper Verbindungen, entsprechend stabilisierte Farbstofflösungen, sowie die Verwendung der entsprechenden Farbstofflösungen zum Einfärben von Zellpräparaten.
Farbstofflösungen werden seit Langem in der Mikroskopie verwendet, um tierische oder pflanzliche Zell- und Gewebebe¬ standteile sichtbar zu machen und eine Identifizierung und Differenzierung derartiger Gewebe zu ermöglichen.
Farbstoffe für die Mikroskopie werden in erster Linie in der Histologie, Zytologie und Mikrobiologie eingesetzt, werden aber auch zum Analysieren von Textilfasern, Papier und ande- ren technischen Produkten verwendet.
So werden beispielsweise Xanthenfarbstoffe wie z.B. Eosin, Fluorescein, Pyronin und Rhodamin in der Histologie zum Einfärben von Zellen verwendet. So wird unter anderem Eosin für die Hämatoxylin-Eosin-Färbung und Pyronin G (auch als Pyronin Y bezeichnet) für die Pappenheim-Unna-Färbung eingesetzt.
Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung (HE-Färbung) , ist ein histologisches Färbeverfahren, mit dem die verschiedenen Strukturen eines feingeweblichen Schnittes angefärbt werden können. Sie dient der Unterscheidung verschiedener Gewebestrukturen im mikroskopischen Bild anhand von zwei verschiedenen Einzelfärbungen und ist eine der am weitesten verbreiteten Routinefärbemethoden für morphologische Untersuchungen. Eosin ist ein synthetischer saurer Farbstoff der acidophile beziehungsweise basische (eosinophile) Strukturen rot färbt, was vor allem die Zellplasmaproteine umfasst. Der Farbstoff Eosin ist jedoch instabil in wässrigen Lösungen und neigt zum Ausfallen aus der Lösung. Dies führt zu einer Verschlechterung der Färbeleistung und einer Verringerung der Haltbarkeit der Färbelösung. Um die Stabilität von Eosin in Lösung zu erhöhen, kann anstatt einer wässrigen eine alkoholische Eosin-Lösung verwendet werden. Es werden beispielsweise Lösungen von Eosin in Ethanol oder Methanol verwendet. Darüber hinaus kann Eosin in alkoholischen Färbelösungen durch die Zugabe von Stabilisato- ren stabilisiert werden.
So beschreibt die DE-OS 35 33 515, dass durch den Zusatz von Dimethylammoniumsulfat die Stabilität von alkoholischen Fär¬ belösungen erhöht werden kann.
EP 0 313 975 A2 beschreibt die Stabilisierung von Färbelösungen durch den Zusatz von Dimethylammoniumsulfat und mindes¬ tens einem Kristallisationsinhibitor wie beispielsweise Gly- cerin, Polyethylenglykol und/oder Ethylenglykol .
Die aus dem Stand der Technik bekannten Stabilisatoren haben jedoch den Nachteil, dass es sich um wenig wasserlösliche, gesundheitsgefährdende Salze wie Dimethylammoniumsulfat han¬ delt, bzw. alkoholische Färbelösungen eingesetzt werden, die den Nachteil haben, toxisch und brennbar zu sein.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es deshalb, Stabilisa¬ toren für wässrige Xanthen-Farbstofflösungen zur Verfügung zu stellen, die nicht toxisch oder brennbar sind und die eine gute Stabilisierung des Farbstoffs in der wässrigen Lösung und somit eine lange Haltbarkeit sowie eine gleichbleibende Färbeleistung ermöglichen. Die Aufgabe wird durch Verwendung von antichaotropen Verbindungen zur Stabilisierung der Farbstofflösungen gelöst. Die erfindungsgemäßen Farbstofflösungen sind stabil und gut lagerfähig. Auch nach längerer Lagerung über einen Zeitraum von beispielsweise 2 bis 3 Monaten bei Temperaturen zwischen beispielsweise 0°C und 50°C bleiben die Farbstofflösungen stabil und es kommt zu keiner Verschlechterung der Färbeleis- tung. Außerdem enthalten die erfindungsgemäßen Färbelösungen keine toxischen oder brennbaren Stabilisatoren.
Beschreibung der Figuren Fig. 1 Zeigt eine Mikroskopieaufnahme von humanen Mund¬ schleimhautzellen, die mittels einer frisch hergestellten erfindungsgemäßen Färbelösung eingefärbt wurden . Fig. 2 Zeigt humane Mundschleimhautzellen, die mittels
einer erfindungsgemäßen Färbelösung, die 3 Monate gelagert wurde, eingefärbt wurden.
Die Stabilisierung der Farbstofflösungen erfolgt durch die Zugabe von wasserlöslichen antichaotropen Verbindungen als Stabilisatoren.
Antichaotrope Verbindungen wirken als Fällungsmittel und wer¬ den beispielsweise zum Ausfällen (dem sogenannten Aussalzen) von Proteinen genutzt. Antichaotrope Verbindungen verstärken die hydrophoben Effekte in wässrigen Proteinlösungen und fördern dadurch Proteinaggregationen über hydrophobe Wechselwirkungen, was zum Ausfall von Proteinen aus der Lösung führt. Überraschenderweise hat sich in der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass die Verwendung von antichaotropen Verbindungen in Färbelösungen zur Stabilisierung der Farbstoffe in der Lösung führt .
Bei antichaotropen Verbindungen im Sinne der vorliegenden Er- findung handelt es sich bevorzugt um Harnstoff und/oder anti¬ chaotrope Salze, wobei die antichaotropen Salze bevorzugt die in der Hofmeister-Reihe dargestellten antichaotropen Kationen und Anionen aufweisen. Ammoniumionen, Kaliumionen sowie Natriumionen und Magnesiumionen oder Kombinationen dieser Kationen sind besonders bevorzugte antichaotrope Kationen.
Als antichaotrope Anionen werden besonders bevorzugt Sulfati¬ onen, Fluoridionen, sowie Chloridionen oder Kombinationen dieser Anionen eingesetzt. Als erfindungsgemäße Stabilisatoren besonders bevorzugte an¬ tichaotrope Verbindungen sind Harnstoff, Natriumchlorid, Am¬ moniumsulfat und/oder Natriumsulfat, insbesondere Natriumsul¬ fat . Es kann eine antichaotrope Verbindung oder eine Mischung von zwei oder mehreren antichaotropen Verbindungen eingesetzt werden. Bevorzugt wird nur eine antichaotrope Verbindung ein¬ gesetzt. Die antichaotrope Verbindung wird bevorzugt in einer Menge von 0.01 - 1 Gew.%, besonders bevorzugt 0.01 - 0,5 Gew.%, insbesondere 0.01 - 0,1 Gew.%, insbesondere bevorzugt
0.02 -0.08 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt
0.04-0.06 Gew.%, im speziellen 0,05 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.
Als Farbstoff kann ein beliebiger wasserlöslicher Farbstoff aus der Gruppe der Xanthenfarbstoffe und/oder Derivate und/oder Salze der Xanthenfarbstoffe verwendet werden. Bevor- zugt wird als Farbstoff Eosin (beispielsweise Eosin G (auch als Eosin Y bezeichnet) oder Eosin B) , Fluorescein, Pyronin G (auch als Pyronin Y bezeichnet) , Rhodamin (beispielsweise Rho- damin 6G, Rhodamin B, Rhodamin 123, Texas Red ( Sulforhodamine 101 Säurechlorid) und Tetramethylrhodamin-methylester (TMRM+) und/oder Derivate und/oder Salze dieser Farbstoffe verwendet. Besonders bevorzugt wird Eosin G und/oder Eosin B verwendet, ganz besonders bevorzugt Eosin G.
Es kann ein Farbstoff oder eine Mischung von zwei oder mehreren Farbstoffen eingesetzt werden. Bevorzugt wird nur ein Farbstoff eingesetzt.
Zur Herstellung der wässrigen Farbstofflösung wird der Farbstoff in Wasser gelöst. Es kann sowohl Leitungswasser als auch destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwendet werden. Bevorzugt wird destilliertes oder demineralisiertes Wasser verwendet.
Der Farbstoff wird bevorzugt in einer Menge von
0,05 - 10 Gew.%, besonders bevorzugt 0,07 - 5,0 Gew.%, ganz besonders bevorzugt 0,08 - 2,0 Gew.%, insbesondere
0,1 - 1,0 Gew.%, insbesondere bevorzugt 0,2 - 0,5 Gew . ~6 , ins besondere besonders bevorzugt 0,3 Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.
Durch Zugabe der erfindungsgemäßen Stabilisatoren zu den wässrigen Farbstofflösungen, werden Farbstofflösungen erhalten, die eine hohe Stabilität und Lagerfähigkeit aufweisen. Auch nach längerer Lagerung über einen Zeitraum von beispielsweise 2 bis 3 Monaten bleiben die Farbstofflösungen stabil und es kommt zu keiner Ausfällung von Eosin und keiner Verschlechterung der Färbeleistung.
In einer bevorzugten Ausführungsform können die Farbstofflösungen durch Zusatz eines Kristallisationsinhibitors zusätz¬ lich stabilisiert werden.
Als Kristallisationsinhibitoren eignen sich vorzugsweise Gly- cerin, Polyethylenglykol , Ethylenglykol und/oder dessen aliphatische Ether, insbesondere Ethylenglykol , Glycerin und/oder Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von bis zu etwa 300, besonders bevorzugt ist Glycerin. Es kann ein Kristallisationsinhibitor oder eine Mischung von zwei oder mehreren Kristallisationsinhibitoren eingesetzt werden. Bevorzugt wird nur ein Kristallisationsinhibitor eingesetzt.
Der Kristallisationsinhibitor wird vorzugsweise in einer Menge von 1 - 25 Gew.%, besonders bevorzugt 5 - 20 Gew.%, insbe¬ sondere 10 - 15 Gew.%, insbesondere bevorzugt 12 - 14 Gew.%, insbesondere besonders bevorzugt 13% Gew.%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung, eingesetzt.
Durch Zugabe von Kristallisationsinhibitoren zu den erfindungsgemäßen Farbstofflösungen kann die Stabilität der Farbstofflösungen und damit die Haltbarkeit nochmals gesteigert werden .
Die erfindungsgemäßen stabilisierten Färbelösungen finden Verwendung zum Anfärben von biologischem Material, vorzugsweise Zellpräparaten, in der Hämatologie, Zytologie und His¬ tologie, insbesondere zum Anfärben von Mikroskopieproben.
Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Eosin-Lösungen zur HE-Färbung verwendet werden.
Das Verfahren zum Einfärben von Zellpräparaten mittels HE- Färbung erfolgt gemäß Standardprotokollen, die dem Fachmann geläufig sind. Protokolle zur HE-Färbung sind beispielsweise als Standardverfahren (SOP „Standard operating procedure") in Rüegg und Meinen, „Histopathology in Hematoxylin & Eosin stained muscle sections", SOP_ID: MDC1A_M.1.2.004, TREAT-NMD / CURE CMD veröffentlicht. Die HE-Färbung wird gemäß bekannten Standardprotokollen durchgeführt, wobei bekannte Hämatoxylin-Lösungen verwendet werden. Anstelle der aus dem Stand der Technik bekannten, üblicherweise verwendeten Eosin-Lösungen, werden die erfin- dungsgemäßen Eosin-Farblösungen, enthaltend Eosin und anti- chaotrope Verbindungen, eingesetzt.
Bei der HE-Färbung werden die Zellproben nach der Fixierung auf einem Objektträger zunächst mit Hämatoxylin gefärbt (H- Färbung) . Hämatoxylin färbt alle sauren beziehungsweise ba¬ sophilen Strukturen blau, insbesondere Zellkerne mit der dar¬ in enthaltenen Desoxyribonukleinsäure (DNA) und das mit Ribo- somen angereicherte raue endoplasmatische Retikulum (rER) . Nach der H-Färbung erscheinen die Zellkerne zunächst rötlichbraun aufgrund des niedrigen pH-Wertes der Färbelösung. Durch Erhöhung des pH-Wertes schlägt der Farbton in das typische Blauviolett um (Bläuen) ; dies wird mittels Spülen in Lei¬ tungswasser bewirkt.
Anschließend folgt die Eosin-Färbung (E-Färbung) mit einer Eosin-Lösung. Eosin ist ein färbt alle acidophilen beziehungsweise basischen (eosinophilen) Strukturen rot, was vor allem die Zellplasmaproteine umfasst.
Durch weitere Spülschritte über Alkohollösungen in aufstei¬ gender Konzentration bis zu absolutem Alkohol wird das Wasser aus dem Gewebeschnitt verdrängt. Schließlich wird der entwäs¬ serte Schnitt in einem organischen Lösungsmittel wie bei- spielsweise Xylol geklärt.
Ein Standardprotokoll zur Durchführung der HE-Färbung umfasst beispielsweise folgende Schritte: (1) Fixierung der zu untersuchenden Zellen auf dem Objektträger mittels 1-2 Spraystöße eines alkoholischen Fixiersprays (2) Hämatoxylin-Färbung (H-Färbung) 1-2 min
(3) Entfärbung 3 min, unter laufenden warmen Wasser
(4) Entfärbung 2 min, unter laufenden kalten Wasser
(5) Entfärbung 1 min, mit destilliertem Wasser
(6) Eosin-Färbung (E-Färbung) 2-3 min
(7) Entwässerung / Fixierung mit 70 % Ethanol
(8) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 90 % Ethanol
(9) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 96 % Ethanol
(10) Entwässerung / Fixierung 2 mal 5 min mit 100 % Ethanol
(11) Entwässerung / Fixierung 2 mal 10 min mit 100% Xylol
Zur Hämatoxylin-Färbung wird saures Hämatoxylin nach Ehrlich oder saures Hämalaun nach Mayer verwendet.
Hämalaun nach Mayer:
Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Natriumj odat , Kali¬ alaun, Chloralhydrat , Salzsäure 0,1 %ig, Ammoniaklösung, Natriumhydrogencarbonat und Zitronensäure.
Hämatoxylin nach Ehrlich:
Die Färbelösung enthält: Hämatoxylin, Isopropanol 96%ig, Gly- cerin, Kalialaun, Essigsäure, Natriumj odat , Natriumhydrogencarbonat und Ammoniaklösung
Beispiele
Die Tabellen 1 bis 3 beschreiben die Zusammensetzung verschiedener Färbelösungen. Die Färbelösungen wurden durch Lösen, der entsprechenden Komponenten, in den angegebenen Mengen, in destilliertem Wasser hergestellt.
Sämtliche Mengenangaben in den folgenden Beispielen und Vergleichsbeispielen sind in Gew.% angegeben, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Färbelösung.
So umfasst beispielsweise die Färbelösung gemäß Vergleichs¬ beispiel 1 eine Färbelösung enthaltend 0,3 Gew.% Eosin und die Färbelösung gemäß Beispiel 2 eine Färbelösung enthaltend 0,3 Gew.% Eosin, 0,1 Gew.% Ammoniumsulfat und 3,0 Gew.% Gly- cerin .
Die Färbelösung gemäß Beispiel 16 umfasst eine Färbelösung enthaltend 0,3 Gew.% Eosin, 13 Gew.% Glycerin und 0,01 Gew Ammoniumsulfat .
Es wurden jeweils 250ml Färbelösung hergestellt, die in 500ml Labor-Schraubflaschen aus Glas (ISO 4796) abgefüllt wurden. Die Färbelösungen wurden jeweils unter den in den Tabellen 1 bis 3 angegeben Bedingungen gelagert und zu den in den Tabellen angegebenen Zeitpunkten wurde jeweils visuell die Menge an rotem Niederschlag, gebildet durch die Absetzung von Farbstoffmolekülen, beurteilt und die Färbelösungen wurden wie folgt klassifiziert:
+++ sehr viel Niederschlag
++ viel Niederschlag
+ mäßig Niederschlag
(+) wenig Niederschlag
( ( + ) ) sehr wenig Niederschlag
( ( (+) ) ) kaum sichtbarer Niederschlag
kein Niederschlag
Der Vergleich der Beispiele mit den Vergleichsbeispielen, zeigt, dass die erfindungsgemäßen Färbelösungen, enthaltend die erfindungsgemäßen Stabilisatoren, auch nach längerer Lagerung deutlich weniger Niederschlag und damit eine deutlich höhere Stabilität aufweisen.
So zeigt beispielsweise der Vergleich der Beispiele 1 bis 3 mit den Vergleichsbeispielen 1 bis 3, dass die erfindungsge¬ mäßen Färbelösungen, enthaltend die antichaotrope Verbindung Ammoniumsulfat als Stabilisator, deutlich weniger roten Niederschlag und damit eine deutlich besser Stabilität aufweisen als Eosin-Lösungen ohne den Zusatz von antichaotropen Verbindungen .
Die nicht stabilisierten Färbelösungen zeigen bereits nach einer Woche, spätestens jedoch nach zwei Wochen einen deutli¬ chen Niederschlag und verfügen nur noch über eine unzurei¬ chende Färbewirkung.
Die erfindungsgemäßen Färbelösungen hingegen besitzen auch nach einer Lagerung von 3 Monaten bei Temperaturen zwischen 4°C und 40 °C eine konstant gute Färbewirkung.
So wurde beispielsweise die Färbelösung gemäß Beispiel 27 als Eosin-Lösung zum Anfärben von humanen Mundschleimhautzellen mittels HE-Färbung verwendet. Die Zellen wurden mittels Bürs- tenbiopsie gewonnen. Die HE-Färbung der Zellen wurde gemäß folgendem Protokoll durchgeführt:
(1) Fixierung der zu untersuchenden Zellen auf dem Objektträger mittels 1-2 Spraystößen eines alkoholischen Fixiersprays (Merckofix® Fixationsspray der Firma Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland)
(2) Hämatoxylin-Färbung (H-Färbung) mittels Hämalaun nach Mayer 2 min
(3) Entfärbung 3 min, unter laufenden warmen Wasser
(4) Entfärbung 2 min, unter laufenden kalten Wasser
(5) Entfärbung 1 min, mit destilliertem Wasser
(6) Eosin-Färbung mit der Färbelösung gemäß Beispiel 27 für 3 min
(7) Entwässerung / Fixierung mit 70 % Ethanol
(8) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 90 % Ethanol
(9) Entwässerung / Fixierung 3 min mit 96 % Ethanol
(10) Entwässerung / Fixierung 2 mal 5 min mit 100 % Ethanol
(11) Entwässerung / Fixierung 2 mal 10 min mit 100% Xylol
Die Anfärbung der Zellen erfolgte mit einer frisch hergestellter Färbelösung und mit einer 3 Monate gelagerten Färbe- lösung die unter den Bedingungen, wie sie in der Tabelle 3 für das Beispiel 27 angegeben sind, gelagert wurde, wobei die Lösung ab dem 23. Tag für den weiteren Zeitraum bis zu einer Gesamtdauer von 3 Monaten unter Raumtemperatur gelagert wur- de .
Der Vergleich der mit frischer Färbelösung angefärbten Zellen (Fig. 1) mit den mit 3 Monate gelagerter Färbelösung angefärbten Zellen (Fig. 2), zeigt, dass die erfindungsgemäße Färbelösung auch nach 3 Monaten eine gleichbleibende Färbe¬ wirkung aufweist.
Tabelle 1: Beispiele 1 bis 9 und Vergleichsbeispiele 1 bis 9
Lagerung bei 4°C, lichtgeschützt
nach 5 Tagen nach 12 Tagen Farbe roter Nie¬ Farbe roter Niederschlag derschlag
Vergleichsbeispiel 1 0,3% Eosin wweeiinnrroott,, kkllaarr ++ weinrot, klar ++ Vergleichsbeispiel 2 0,3% Eosin, wweeiinnrroott,, kkllaarr ++ weinrot, klar ++
3% Glycerin
Vergleichsbeispiel 3 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar +
13% Glycerin
Beispiel 1 0,3% Eosin, weinrot, klar ( + ) weinrot, klar +
0,1% Ammoniumsulfat
Beispiel 2 0,3% Eosin, weinrot, klar ( + ) weinrot, klar +
0,1% Ammoniumsulfat,
3% Glycerin
Beispiel 3 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar
0,1% Ammoniumsulfat,
13% Glycerin
Lagerung bei 40°C, lichtgeschützt
nach 5 Tagen nach 12 Tagen Farbe roter Nie¬ Farbe roter Nie¬ derschlag derschlag
Vergleichsbeispiel 4 0,3% Eosin weinrot, klar +/ (+) weinrot, klar +
Vergleichsbeispiel 5 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar
3% Glycerin
Vergleichsbeispiel 6 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar
13% Glycerin
Beispiel 4 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar
0,1% Ammoniumsulfat
Beispiel 5 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar
0,1% Ammoniumsulfat,
3% Glycerin
Beispiel 6 0,3% Eosin, weinrot, klar ( + ) weinrot, klar
0,1% Ammoniumsulfat,
13% Glycerin
Lagerung bei Raumtemperatur unter Lichtexposition
nach 5 Tagen nach 7 Farbe roter NieFarbe derschlag
Vergleichsbeispiel 7 0,3% Eosin weinrot, klar weinrot, klar Vergleichsbeispiel 8 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar
3% Glycerin
Vergleichsbeispiel 9 0,3% Eosin, weinrot, klar weinrot, klar
13% Glycerin
Beispiel 7 0,3% Eosin, weinrot, klar, (+) weinrot, klar,
0,1% Ammoniumsulfat dunkler dunkler
Beispiel 8 0,3% Eosin, weinrot, klar, weinrot, klar,
0,1% Ammoniumsulfat, dunkler dunkler
3% Glycerin
Beispiel 9 Eosin, weinrot, klar, weinrot, klar,
Ammoniumsulfat, dunkler dunkler Glycerin
Tabelle 2: Beispiele 10 bis 15 und Vergleichsbeispiele 10 und 11
Lagerung bei Raumtemperatur unter Lichtexposition
nach 7 Tagen nach 10 Tagen
Farbe roter NieFarbe roter Nie¬ derschlag derschlag
Vergleichsbeispiel 0,3% Eosin kirschrot, klar kirschrot, klar +/ ( + ) Vergleichsbeispiel 0,3% Eosin + kirschrot, klar kirschrot, klar ( + )
13% Glycerin
Beispiel 10 0,3% Eosin + dunkelkirschrot, dunkelkirschrot, ( + )
0,1% Ammoniumsulfat klar klar
Beispiel 11 0,3% Eosin + dunkelkirschrot, dunkelkirschrot, ( + )
0,1% Ammoniumsulfat klar klar
13% Glycerin
Beispiel 12 0,3% Eosin + kirschrot, klar kirschrot, klar ( + )
0, 1% NaCl
Beispiel 13 0,3% Eosin + kirschrot, klar kirschrot, klar
0, 1% NaCl +
13% Glycerin
Beispiel 14 0,3% Eosin + kirschrot, klar ( + ) kirschrot, klar ( + )
0, 1% NaS04
Beispiel 15 0,3% Eosin + kirschrot, klar kirschrot, klar
0, 1% NaS04 +
13% Glycerin
nach weiteren 7 Tagen bei 4°C nach weiteren 7 Tagen bei 40°C
Farbe roter Nie- Farbe roter Nie¬ derschlag derschlag
Vergleichsbeispiel 0,3% Eosin kirschrot, klar ++ kirschrot, klar ++ Vergleichsbeispiel 0,3% Eosin + kirschrot, klar ( ( + ) ) kirschrot, klar +
13% Glycerin
Beispiel 10 0,3% Eosin + kirschrot, klar +/ ( + ) kirschrot, klar ++
0,1* 's Ammoniumsulfat
Beispiel 11 0,3*'s Eosin + kirschrot, klar kirschrot, klar ( + )
0,1*'s Ammoniumsulfat
13% Glycerin
Beispiel 12 0,3% Eosin + kirschrot, klar ( + ) kirschrot, klar
0,1*'s NaCl
Beispiel 13 0,3*'s Eosin + kirschrot, klar ( ( + ) ) kirschrot, klar ( + )
0,1*'s NaCl +
13% Glycerin
Beispiel 14 0,3% Eosin + kirschrot, klar kirschrot, klar
0,1*'s NaS04
Beispiel 15 0,3*'s Eosin + kirschrot, klar ( ( + ) ) kirschrot, klar ( + )
0,1*'s NaS04 +
13% Glycerin
Tabelle 3: Beispiele 16 bis 30
Lagerung bei Raumtemperatur, lichtgeschützt
nach 8 Tagen nach weiteren 7 Tagen nach weiteren 7 Tagen bei 4°C bei 40°C
Farbe roter Nie- Farbe roter NieFarbe roter Niederschlag derschlag derschlag
0,3% Eosin + 13% Glycerin
Beispiel 16 +0,01% NH4S04 kirschrot, (((+))) kirschrot, ( (+) ) kirschrot,
klar klar klar
Beispiel 17 +0,05% NH4S04 kirschrot, kirschrot, ( (+) ) kirschrot, (+) klar klar klar
Beispiel 18 +0,1% NH4S04 kirschrot, kirschrot, kirschrot, (((+))) klar klar klar
Beispiel 19 +0,3% NH4S04 kirschrot, kirschrot, kirschrot, (((+))) klar klar klar
Beispiel 20 +1% NH4S04 kirschrot, (((+))) kirschrot, kirschrot,
klar klar klar
Beispiel 21 +0,01% NaCl kirschrot, kirschrot, +/ (+) kirschrot,
klar klar klar
Beispiel 22 +0,05% NaCl kirschrot, (((+))) kirschrot, (+) kirschrot,
klar klar klar
Beispiel 23 +0, 1% NaCl kirschrot, (((+))) kirschrot, ( + ) kirschrot,
klar klar klar
Beispiel 24 +0,3% NaCl kirschrot, kirschrot, ( + ) kirschrot, (((+))) klar klar klar
Beispiel 25 +1, 0% NaCl kirschrot, kirschrot, ( + ) kirschrot, (((+))) klar klar klar
Beispiel 26 +0, 01% NaS04 kirschrot, (((+))) kirschrot, ( ( + ) ) kirschrot,
klar klar klar
Beispiel 27 +0, 05% NaS04 kirschrot, kirschrot, ( + ) kirschrot,
klar klar klar
Beispiel 28 +0, 1% NaS04 kirschrot, (((+))) kirschrot, ( + ) kirschrot, (((+))) klar klar klar
Beispiel 29 +0,3% NaS04 kirschrot, (((+))) kirschrot, ( + ) kirschrot, ( ( + ) ) klar klar klar
Beispiel 30 + 1% NaS04 kirschrot, (((+))) kirschrot, ( + ) /+ kirschrot, ( ( + ) ) klar klar klar

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von antichaotropen Verbindungen zur Stabilisierung von wässrigen Farbstofflösungen, wobei die Farb- stofflösung mindestens einen Xanthenfarbstoff enthält.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei als antichaotrope Ver¬ bindung Harnstoff und/oder mindestens ein Salz, ausge¬ wählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid, Nat- riumsulfat und Ammoniumsulfat verwendet wird.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Xanthen- farbstoff mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Eosin, Fluorescein, Pyronin, Rhoda- min und/oder deren Derivaten und/oder deren Salzen ist.
4. Verwendung gemäß Anspruch 3, wobei der Xanthenfarbstoff Eosin Y und/oder Eosin B ist.
5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die antichaotrope Verbindung in einer Menge von 0.01 - 1 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, einge¬ setzt wird.
6. Wässrige Farbstofflösung, enthaltend mindestens einen
Xanthenfarbstoff und mindestens eine antichaotrope Ver¬ bindung .
7. Farbstofflösung gemäß Anspruch 6, wobei als antichaotrope Verbindung Harnstoff und/oder mindestens ein Salz, ausge¬ wählt aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid, Nat¬ riumsulfat und Ammoniumsulfat verwendet wird.
8. Farbstofflösung gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei der
Xanthenfarbstoff mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Eosin, Fluorescein, Pyro¬ nin, Rhodamin und/oder deren Derivaten und/oder deren Salzen ist.
9. Farbstofflösung gemäß Anspruch 8, wobei der Xanthen- farbstoff Eosin Y und/oder Eosin B ist.
Farbstofflösung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Farbstofflösung die antichaotrope Verbindung in einer Menge von 0.01 - 1 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Lösung, enthält.
11. Farbstofflösung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die Farbstofflösung darüber hinaus einen Kristallisationsinhibitor enthält.
12. Farbstofflösung gemäß Anspruch 11, wobei als Kristallisa- tionsinhibitor mindestens eine Verbindung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glycerin, Polyethylenglykol , Ethylenglykol und/oder dessen aliphatische Ether, einge¬ setzt wird.
13. Farbstofflösung gemäß einem der Ansprüche 11 bis 12, wo¬ bei der Kristallisationsinhibitor in einer Menge von 1-25 Gew.%, bezogen auf das Gesamtvolumen der Farbstofflösung, eingesetzt wird.
14. Verwendung der Farbstofflösung gemäß einem der Ansprüche 6-13 zum Einfärben von Zellpräparaten.
15. Verwendung gemäß Anspruch 14 zur Mikroskopie.
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