WO2014136885A1 - 組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キット - Google Patents

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中野　寧
武寿 磯田
秀樹 郷田
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    • G01N2001/302—Stain compositions

Definitions

  • the present invention relates to a tissue staining stain, a method for producing a tissue staining stain, and a tissue staining kit containing a tissue staining stain.
  • Pathological diagnosis is performed as one of medical diagnoses.
  • a pathologist diagnoses a disease from a piece of tissue collected from a human body and informs a clinician whether treatment or surgery is necessary.
  • the medical doctor determines the drug treatment policy, and the surgical doctor determines whether or not to perform an operation.
  • tissue specimens obtained by organ excision and needle biopsy are sliced to a thickness of several microns to create tissue specimens, and they are widely observed with an optical microscope to obtain various findings. It has been broken.
  • tissue specimens are prepared by dehydrating and fixing paraffin blocks to fix the collected tissues, then slicing them to a thickness of several ⁇ m and removing the paraffin.
  • immunostaining In pathological diagnosis, immunostaining called immunostaining is performed to confirm the expression of antigens and genes to be detected in tissue specimens, followed by immunological observations to diagnose functional abnormalities such as abnormal expression of genes and proteins. ing.
  • DAB staining for example, a dye staining method using an enzyme (DAB staining or the like) is used (Patent Document 1).
  • DAB staining the antigen to be observed is stained with the peroxidase-modified antibody by coloring, and the peroxidase substrate diaminobenzidine (DAB) is added to develop the color. It measures.
  • staining with an enzyme such as DAB staining has a problem that it is difficult to estimate the actual amount of antigen or the like from the staining concentration because the staining concentration is greatly influenced by environmental conditions such as temperature and time.
  • Non-Patent Document 1 a fluorescent labeling method using a fluorescent label is used instead of staining with an enzyme label. This method is characterized in that it has better quantitativeness than DAB staining.
  • the amount of antigen is measured by staining and observing an antigen of interest using an antibody modified with a fluorescent dye.
  • tissue specimen hardly absorbs and scatters light and is almost colorless and transparent. Therefore, prior to observation, the tissue specimen may be stained with a dye for morphological observation.
  • Various dyeing techniques have been proposed. In particular, for tissue specimens, hematoxylin and eosin staining (HE staining) using two pigments of hematoxylin and eosin is standardly used as morphological observation staining for observing the morphology (Non-patent Document 1).
  • Cell nucleus, lime, cartilage tissue, bacteria and mucus are stained blue-blue to light blue by hematoxylin staining, and cytoplasm, stroma, various fibers, erythrocytes and keratinocytes are stained red to dark red by eosin staining. .
  • a pathologist makes a diagnosis based on morphological information and staining information such as changes in the size and shape of cell nuclei and changes in the pattern of tissue in a microscopic image of a stained tissue specimen. Yes.
  • morphological observation staining include Papanicolaou staining (Pap staining) used for cytodiagnosis.
  • water-based mounting agents and oil-based mounting media are known as mounting media for mounting pathological sections after staining. Since an aqueous encapsulant generally has a large refractive index difference from the specimen, there is a problem that it is difficult to make the tissue specimen transparent.
  • oil-based encapsulants are used for permanent specimens because they have a small refractive index difference from tissue specimens, can make tissue specimens transparent, and have good morphological dyeing and color development. For this reason, oil-based encapsulants are preferably used for preparing tissue specimens.
  • dye resin particles resin particles in which a fluorescent substance is fixed and used in the fluorescent dye labeling method
  • the amount of adsorption of the dye resin particles can be evaluated by the number of bright spots derived from the dye resin particles.
  • the present inventors When evaluating the number of bright spots derived from the dye resin particles, if the bright spot intensity varies, the determination accuracy of the fluorescent signal deteriorates. As a result of intensive studies on the cause of the variation in the bright spot, the present inventors have found that the variation in the particle diameter of the dye resin particles deteriorates the determination accuracy of the fluorescent signal.
  • the original detection is performed.
  • the problem that the fluorescent signal should not be detected occurs.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and includes a staining for tissue staining with improved determination accuracy of a fluorescence signal, a method for producing the staining for tissue staining, and a tissue staining kit including the same.
  • the issue is to provide.
  • the tissue staining stain reflecting one aspect of the present invention includes a thermosetting resin resin particle and a fluorescent dye fixed to the resin particle.
  • the variation coefficient of the particle diameter of the dye resin particles is 15% or less.
  • the method for producing a stain for tissue staining reflecting one aspect of the present invention provides a coefficient of variation of the dye resin particles by adding a surfactant to a reaction system when the resin particles are produced by a synthetic reaction. Including a step of 15% or less.
  • tissue staining kit reflecting one aspect of the present invention includes any of the above-mentioned tissue staining stains as a constituent.
  • the coefficient of variation of the particle diameter of the dye resin particles is 15% or less, the above-described problem of bright spot variation is solved.
  • the fluorescent dye and the thermoplastic resin are ionically or covalently bonded to prevent the fluorescent dye from bleeding during fluorescence observation.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing a state in which a section of a tissue specimen is immunostained with a stain for tissue staining containing the dye resin particles according to the present invention, and illustrates the binding state between the resin particles of the dye resin particles and the dye. It is a figure to do.
  • FIG. 2 is a diagram showing a flow of producing the slice of FIG. 1 by performing staining, penetration and encapsulation.
  • (A) is a schematic view showing a state in which fluorescence observation is performed by immunostaining cells of a section of a tissue specimen using a conventional tissue staining stain.
  • FIG. B is a schematic view showing a state in which fluorescence is observed by immunostaining cells of a section of a tissue specimen using the tissue staining dye according to the present invention.
  • (A) is a photograph stained with a secondary antibody labeled with dye resin particles according to a comparative example.
  • (B) is a photograph stained with a secondary antibody labeled with dye resin particles according to the example.
  • tissue staining kit according to the present invention, the method for producing the tissue staining stain, and the tissue staining kit containing the tissue staining kit will be described with reference to FIGS.
  • the tissue staining dye according to the present invention is a tissue staining dye containing, as a staining component, resin particles of thermosetting resin and dye resin particles having a fluorescent dye fixed to the resin particles.
  • the coefficient of variation of the particle size of the resin particles is 15% or less.
  • the fluorescent dye may be included in the resin particles.
  • the substituent contributing to the ionic bond may be a negatively charged substituent for the fluorescent dye, and a positively charged substituent for the resin particles.
  • the charge of the entire fluorescent dye and the charge of the resin particles may be the same as the charge of the substituent that contributes to the ionic bond.
  • the fluorescent dye may have a molecular weight / charge of one molecule of the fluorescent dye and the number of substituents ⁇ 400.
  • the fluorescent dye may have at least two negatively charged substituents per molecule of the fluorescent dye.
  • the positively charged substituent may be an amino group, and the negatively charged substituent may be a sulfo group or a carboxyl group.
  • At least one of the negatively charged substituents of the fluorescent dye may be a sulfo group.
  • the fluorescent dye may be rhodamine, BODIPY, squarylium or an aromatic hydrocarbon dye molecule.
  • the resin particles may be formed using melamine, and the fluorescent dye may be rhodamine or an aromatic hydrocarbon dye molecule.
  • the resin particles and the fluorescent dye may be covalently bonded by any one of an amide bond, an ester bond, an ether bond, and a CN bond.
  • the thermosetting resin may contain a structural unit formed from at least one monomer selected from the group consisting of melamine, urea, guanamine, phenol and xylene.
  • the method for producing a staining agent for tissue staining includes a step of setting a coefficient of variation of the dye resin particles to 15% or less by adding a surfactant to a reaction system when the resin particles are produced by a synthetic reaction. including.
  • the tissue staining kit according to the present invention contains any of the above-mentioned tissue staining stains as a constituent.
  • the dye resin particles are resin particles and fluorescent dyes that are ion-bonded or covalently bonded.
  • a dye resin particle is formed by ion-bonding an ammonium group in which a proton is added to an amino group of a resin constituting the resin particle and a sulfo group of the fluorescent dye ( (See the broken line in the left rectangle in FIG. 1).
  • the amino group possessed by the monomer-derived portion constituting the resin particle and the sulfo group possessed by the fluorescent dye are covalently bonded to constitute the dye resin particle (FIG. 1). (See dashed line in right rectangle).
  • Each bond between the resin particle and the fluorescent dye is performed between the inside and / or outer surface of the resin particle and the dye molecule.
  • the example shown in FIG. 1 shows an example in which the dye is immobilized on the inner surface and / or the outer surface by ionic bond or covalent bond, respectively (surface immobilization is not shown).
  • the bond between the resin particle and the fluorescent dye may include both an ionic bond and a covalent bond.
  • the fluorescent dye encapsulated and / or surface-immobilized in the resin particles may be fixed to a resin particle by any one of the fluorescent dyes described later alone or by mixing a plurality of kinds. Good.
  • two or more kinds of fluorescent dyes different from each other in the excitation wavelength and the emission wavelength may be included.
  • the method for fixing the fluorescent dye to the resin particles is not particularly limited.
  • a method of synthesizing dye resin particles by ion-bonding and / or covalently bonding fluorescent dye molecules to monomers and oligomers, which are raw materials for resin particles, and polymerizing them, and by adsorbing the dye to the produced resin particles Any method may be used for introducing the fluorescent dye into the resin particles, such as a method of introducing it.
  • the average particle diameter of the dye resin particles is not particularly limited, but is usually 10 to 500 nm, and preferably 50 to 200 nm.
  • one of the linkers such as streptavidin or biotin is added to the resin particles, and the other linker is added to the secondary antibody. Therefore, it may be configured to be used for immunostaining.
  • thermosetting resin constituting the dye resin particles according to the present invention is not particularly limited as long as it includes a thermosetting resin capable of fixing the fluorescent dye by the above-described ionic bond and / or covalent bond.
  • thermosetting resin used for ionic bonding with the fluorescent dye has at least part of hydrogen contained in its structural unit replaced by a charged substituent or a part of its chemical structure having a charge. It exists.
  • thermosetting resins used for covalent bonding with fluorescent dyes have a site that can be covalently bonded to the dye in part of the chemical structure, regardless of the presence or absence of the above-mentioned substituent having a charge. It only needs to be covalently bonded to the dye.
  • the “substituent or moiety having a charge” means a substituent or a chemical structure that is positively or negatively charged when dissolved in water or acidic or basic water.
  • thermosetting resin a thermosetting resin containing a structural unit formed from at least one monomer selected from the group consisting of melamine, urea, guanamine, phenol, xylene, and derivatives thereof is preferably used. Can do.
  • melamine, urea and guanamine are monomers having an amino group as a part of the structure as a positively charged substituent.
  • Phenol is a monomer having a phenolic hydroxyl group in a part of the structure as a negatively charged substituent. Since xylene is a monomer having no charged substituents or moieties, it can be used for ionic bonding with a fluorescent dye by substituting some of the hydrogens it has with positive or negative charge substituents.
  • thermosetting resins are obtained by a known polymerization method using a monomer containing a charged substituent or site, or a monomer of a thermosetting resin having a reactive group that forms a covalent bond with a functional group of a fluorescent dye. It can be produced by polymerization.
  • the structure contains a substituent having a charge from the beginning, such as melamine, it is not necessary to introduce the substituent and it can be suitably used.
  • thermosetting resin monomer examples include a sulfo group (—SO 3 ⁇ ) and a carboxyl group (—COO ⁇ ). Further, examples of the positively charged substituent that the thermosetting resin monomer has include an ammonium group (—NR 3 + ).
  • R is hydrogen or an alkyl group.
  • the introduction of a carboxyl group may be directly introduced by a Friedel-Crafts reaction, or an alkyl compound having a carboxyl group
  • the monomer may be converted into a halide and boronic acid and combined by a Suzuki coupling reaction, or the alkyl compound having a carboxyl group and the monomer may be converted into a halide to be coupled with a Grignard reaction or the like. It may be introduced by binding in a reaction.
  • the monomer may be directly sulfonated with fuming sulfuric acid or chlorosulfuric acid, or the alkyl compound having the sulfo group and the monomer are converted into halide and boronic acid and introduced by the Suzuki coupling reaction.
  • an alkyl compound having a sulfo group and a monomer may be converted into a halide and combined and introduced by a coupling reaction such as a Grignard reaction.
  • amino group it may be converted to amino group by nitration with fuming nitric acid and reduction reaction of nitro group, or the monomer may be converted to halogenated form and aminated by direct reaction with ammonia or Gabriel reaction.
  • an alkyl compound having an amino group and a monomer may be converted into a halide and a boronic acid and then bonded by a Suzuki coupling reaction, or an alkyl compound having a carboxyl group and a monomer may be converted into a halide. They may be converted and combined and introduced by a coupling reaction such as a Grignard reaction.
  • a protective group may be appropriately introduced, and after introduction into the monomer as a protected carboxyl group, sulfo group or amino group, deprotection may be performed to form a carboxyl group, sulfo group or amino group.
  • thermosetting resin is a three-dimensional network structure, which is created by cross-linking polymers. For this reason, the fluorescent dye encapsulated in the resin particles of the thermosetting resin is unlikely to elute to the outside of the resin particles, and the effect of suppressing bright spot bleeding during fluorescence observation can be obtained.
  • the thermosetting resin is not limited to a homopolymer, and may be a copolymer. Specifically, a copolymer obtained by copolymerizing a plurality of types of monomers or oligomers constituting the above polymelamine or the like, or a copolymer obtained by copolymerizing these monomers or oligomers and other types of monomers or oligomers. It may be.
  • the fluorescent dye can be obtained or produced by a known method.
  • the monomer or oligomer of the resin material and the fluorescent dye have opposite charges as shown in the left rectangle of FIG. Accordingly, the resin material and the dye molecules are ion-bonded and associated with each other before the resin material is thermally cured, and the fluorescent dye can be easily included in the resin particles.
  • the fluorescent dye Since the resin particles and the fluorescent dye associate with each other, the molecules of the fluorescent dye are fixed to the resin particles, so that the elution of the dye from the resin particles hardly occurs.
  • the fluorescent dye has two or more substituents.
  • the fluorescent dye enters between the substituents of the adjacent resin and functions as a cross-linking agent that connects the two, and the bonding between the resin structural units is strengthened. Also, the resin particles and the fluorescent dye The bond between the dye and the resin is less likely to be eluted. Furthermore, since the molecules of the fluorescent dye are stabilized and the heat resistance of the fluorescent dye is further increased, when the resin particles are formed by polymerization reaction by thermosetting, the fluorescent dyes are less susceptible to the adverse effects of heat. From this, the fluorescent dye is difficult to elute.
  • the fluorescent dye preferably has two or more reactive groups for the same reason as described above.
  • Fluorescent dyes can be selected from, for example, each type of dye molecule such as rhodamine dye molecules, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen), squarylium dye molecules, aromatic hydrocarbon dye molecules, and the like.
  • fluorescent dyes such as aromatic ring dye molecules (aromatic hydrocarbon dye molecules) and rhodamine dye molecules are preferable because of their relatively high light resistance, and among them, perylene belonging to aromatic ring dye molecules. Pyrene and perylene diimide are preferable. Furthermore, rhodamine dyes and perylene diimide are excellent in quantum yield, light absorption, and the like, and are excellent in luminous efficiency. Therefore, resin particles encapsulating them have superior emission intensity compared to resin particles encapsulating other dyes.
  • rhodamine dye molecules include 5-carboxy-rhodamine, 6-carboxy-rhodamine, 5,6-dicarboxy-rhodamine, rhodamine 6G, tetramethylrhodamine, X-rhodamine, Texas Red, Spectrum® Red, LD700® PERCHLORATE And derivatives thereof.
  • BODIPY dye molecules include BODIPY FL, BODIPY TMR, BODIPY 493/503, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, 3061/3061 , BODIPY 650/665 (manufactured by Invitrogen), and derivatives thereof.
  • squarylium dye molecule examples include SRfluor 680-Carboxylate, 1,3-Bis [4- (dimethylamino) -2-hydroxyphenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 1,3-Bis, dimethylyl)) phenyl] -2,4-dihydroxycyclobutenedidium dihydroxide, bis, 2- (4- (Dithylamino) -2-hydroxy-4-hydroxy, 4- (dithyrimino) -2-hydryloxy-2-hydroxy-3-2-hydroxy-3 oxocyclobut-1-eno ate, 2- (4- (Dibutylamino) -2-hydroxyphenyl) -4- (4- (dibutylimino) -2-hydroxycyclohexa-2,5-diylenedene) -3-oxycyclobut-1-enolate, 2- (8-Hydroxy) -1,1,7,7-tetramethyl
  • aromatic hydrocarbon dye molecule examples include N, N-Bis- (2,6-diisopropylphenyl) -1,6,7,12- (4-tert-butylphenoxy) -perylene-3,4,9 , 10-tetracarbonbonide diimide, N, N′-Bis (2,6-diisopropenylphenyl) -1,6,7,12-tetraphenylperylene-3, 4: 9,10-tetracarboximide, N, N′-Bis (2,6 -Diisopropylphenyl) perylene-3,4,9,10-bis (dicarbide), 16, N, N'-Bis (2,6-dimethylphenyl) perylene-3,4,9,10-tetraca rboxylic diimide, 4,4 '-[(8,16-Dihydro-8,16-dioxodibenzo [a, j] perylene-2,10-diyl
  • the dye resin particles having a coefficient of variation of 15% or less, preferably less than 15%, according to the present invention are produced, for example, according to the following steps, and the dye resin particles are obtained by thermosetting one or more monomers or oligomers.
  • a surfactant having an emulsifying action in the range of 10 to 60% by weight By adding a surfactant having an emulsifying action in the range of 10 to 60% by weight to the resin raw material, an arbitrary particle size can be obtained, for example, particles of 30 to 300 nm can be produced. Further, when the ratio of the surfactant is increased, even smaller particles can be produced and can be made 30 nm or less.
  • the ratio of the surfactant is reduced, larger particles can be prepared, and particles of 300 nm or more can also be prepared. Further, the surfactant during the preparation of the particles can be arbitrarily changed from 0.1 to 3.0% by weight. Preferably it is 0.25 to 1.0% by weight. The ratio and addition amount of these surfactants are examples, and can be changed within an arbitrary range.
  • the mixing step is a step of mixing the fluorescent dye, the surfactant, the proton supply agent, and one or more monomers or oligomers constituting the resin particles.
  • the present inventors have found that the coefficient of variation of the particle size of the dye resin particles to be produced varies depending on the molar ratio of the surfactant and the monomer (monomer as the resin constituent unit) and the type of the surfactant. ing. For this reason, it is necessary to polymerize the resin by adjusting the type of the surfactant and the molar ratio with the monomer so that the variation coefficient of the dye resin particles is 15% or less.
  • the type of surfactant all anionic, nonionic and cationic surfactants can be used.
  • the magnitude of the influence of the charge of the surfactant on the coefficient of variation of the particle size of the resin particles has a relationship of nonionic system> anionic system> cationic system with respect to the cationic resin monomer. It is preferable to use a nonionic surfactant.
  • the magnitude of the influence of the surfactant charge on the anionic resin monomer is nonionic> cationic> anionic, it is preferable to use a cationic or nonionic surfactant.
  • the surfactant the following can be used, but is not limited thereto.
  • the anionic surfactant include sodium dodecylbenzenesulfonate.
  • nonionic surfactants include polyethylene glycol and polyoxyethylene alkyl ether.
  • the cationic surfactant include dodecyltrimethylammonium bromide.
  • Emulgen or Neoperex registered trademark, manufactured by Kao Corporation
  • the active ingredient of Emulgen is polyoxyethylene alkyl ether
  • the active ingredient of Neoperex is sodium dodecylbenzenesulfonate.
  • the surfactant that is positioned plays a role of adjusting the amount of monomer inflow from the aqueous phase, and the particle diameters of the resin particles to be produced are uniform.
  • the monomer in the water phase is surface active. It is easily attracted to the agent and easily supplied to the oil phase inside the micelle. Therefore, when a cationic monomer is used, an anionic or nonionic surfactant can be suitably used.
  • thermosetting reaction temperature used in the polymerization step. If a cloud point lower than the thermosetting reaction temperature is selected, the surfactant loses hydration power with water and does not perform its function, and resin particles cannot be formed, resulting in a resin mass. It is.
  • thermosetting resin for example, an acid can be used. It is known that the reaction of melamine resin, urea resin, xylene resin, and phenol resin is promoted by an acid catalyst.
  • acid for example, formic acid, acetic acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, nitric acid, paratoluenesulfonic acid, dodecylbenzenesulfonic acid, and the like are known.
  • the reaction of the thermosetting resin proceeds only by heating, it proceeds at a lower temperature when a reaction accelerator is added, and therefore can be added within a range in which the reaction and performance can be controlled.
  • the polymerization step is a step of thermosetting, that is, polymerizing monomers or oligomers to form dye resin particles.
  • the reaction conditions (thermosetting temperature, polymerization time) in the polymerization step are determined from the composition of the monomer or oligomer to be polymerized and can be carried out in accordance with a known method. Here, it is necessary to set the reaction conditions (within the heat resistant temperature range of the fluorescent dye) so that the performance of the fluorescent dye does not deteriorate.
  • the formation reaction of the melamine resin is performed at 70 ° C. to 200 ° C. Heating at 150 to 200 ° C. is preferable.
  • the heat resistant temperatures of the fluorescent dyes are rhodamine dye molecules 200 ° C., BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) 200 ° C., squarylium dye molecules 200 ° C., and aromatic hydrocarbon dye molecules 300 ° C. or more, and can withstand the formation reaction. It is necessary to use fluorescent dyes that can be obtained.
  • the encapsulated fluorescent dye becomes difficult to elute from the dye resin particles.
  • the produced dye resin particles are converted into dyes and resin particles at temperatures below the decomposition temperature or melting temperature of the resin used.
  • heat treatment that is, crosslinking may be promoted by heat treatment to suppress bleeding of the fluorescent dye.
  • the washing step is a step of removing impurities such as excess resin raw materials, fluorescent dyes and emulsifiers from the obtained dispersion of dye resin particles.
  • the resin component is centrifuged from the reaction solution, and after removing the supernatant, washing is performed by adding ultrapure water, irradiating with ultrasonic waves, and dispersing again.
  • a series of washing operations such as centrifugation, supernatant removal, and redispersion in ultrapure water is preferably repeated a plurality of times until no absorbance or fluorescence derived from the resin or pigment is observed in the supernatant.
  • the addition step is a step of adding a linker or the like for immunostaining to the dye resin particles.
  • the type of linker added to the dye resin particles may be a linker such as streptavidin-biotin, but is not limited thereto.
  • streptavidin-biotin linker is performed, for example, as follows. First, a thiol group is added to streptavidin by a thiol group introduction reagent, while an amino group is introduced to the surface of the dye resin particle by an amino group introduction reagent, and then an active ester and a thiol group that react with the amino group In this method, dye resin particles and streptavidin are linked using a linker such as PEG having maleimide groups that react with each other at both ends.
  • a linker such as PEG having maleimide groups that react with each other at both ends.
  • amino group introduction reagents include aminopropyltrimethoxysilane.
  • thiol group introduction reagent include N-succimidyl S acetylthioacetic acid, and the reagent and the addition itself can be performed by a known method.
  • the particle diameter of the dye resin particles is determined by taking an electron micrograph of the produced dye resin particles using a scanning electron microscope (SEM), measuring the cross-sectional area of the dye resin particles, and measuring the measured value of the corresponding circle. It can be measured as the diameter (area circle equivalent diameter) when the area is taken.
  • the average (average particle diameter) and coefficient of variation of the population of the dye resin particles are determined by measuring the particle diameter as described above for a sufficient number (for example, 300 particles) of the dye resin particles.
  • the coefficient of variation is calculated by the formula: 100 ⁇ standard deviation of particle diameter / average particle diameter.
  • tissue staining As a tissue staining method, a fluorescent staining method is used in which the dye resin particles are used as a fluorescent label for immunostaining to stain a biological material to be detected.
  • a fluorescent label conjuggate
  • a fluorescent label conjuggate
  • a fluorescent label conjugate
  • a fluorescent label conjugate
  • a fluorescent label conjugate
  • a fluorescent label conjugate
  • a fluorescent label conjugate
  • a fluorescent label in which a dye resin particle and a primary antibody are directly bonded via the linker
  • the antigen is stained
  • Secondary antibody method a method in which a fluorescent labeling body in which a dye resin particle and a secondary antibody are directly bound to each other is prepared, and a primary antibody bound to an antigen is stained (secondary antibody method), referring to FIG.
  • a fluorescent labeling body in which dye resin particles and biotin are directly bound is prepared, and staining is performed using a primary antibody and an avidin- or streptavidin-modified secondary antibody bound to an antigen.
  • a fluorescent labeling material in which avidin or streptavidin is directly bound to dye resin particles is prepared, and staining is performed using a primary antibody bound to an antigen and a secondary antibody modified with biotin (biotin- An avidin method or a sandwich method) can be used.
  • Any primary antibody may be used for immunostaining and will vary depending on the subject to be immunostained. For example, when performing immunostaining using HER2 as an antigen, an anti-HER2 antibody is used.
  • any secondary antibody may be used, and varies depending on the primary antibody. Examples include anti-mouse, anti-rabbit, anti-cow, anti-goat, anti-sheep, anti-dog and anti-chicken antibodies.
  • Any existing method may be used for binding the dye resin particles to the antibody or biotin.
  • amidation in the reaction of amine and carboxylic acid, sulfidation by reaction of maleimide and thiol, imination by reaction of aldehyde and amine, amination by reaction of epoxy and amine, and the like can be used.
  • the above immunostaining is not limited to tissue staining, and can also be applied to cell staining.
  • the biological substance to be detected is not limited as long as a substance that specifically binds to the biological substance exists.
  • a combination of an antigen and an antibody is used as described above.
  • a combination of a nucleic acid molecule (oligonucleotide, polynucleotide) and a nucleic acid molecule having a sequence capable of hybridizing thereto may be used.
  • the fluorescence emitted from the fluorescent dye is observed by irradiating the excitation light having an appropriate wavelength according to the fluorescent dye of the dye resin particles used in the pathological section subjected to the tissue staining by the above process.
  • a predetermined biomolecule present in the pathological section can be detected and used as information for determining whether or not an antibody drug (for example, Herceptin labeled with HER2) is necessary. be able to.
  • an antibody drug for example, Herceptin labeled with HER2
  • a predetermined wavelength may be selected from a laser light source provided in the fluorescence microscope as necessary.
  • Fluorescence observation may be performed from a lens barrel of a fluorescence microscope, or may be performed by separately displaying an image photographed by a camera installed on the fluorescence microscope on a display means (a monitor or the like). Although it depends on the fluorescent dye, there are cases where it is possible to observe the fluorescence through taking an image with a camera, even if the fluorescence cannot be sufficiently observed by visual observation from the tube of the fluorescence microscope. You may use the filter which selectively passes a predetermined wavelength as needed.
  • the luminance of the immunostaining part is a value obtained as an average value of the luminances of the parts stained with the fluorescent label for immunostaining.
  • the bright spot of the immunostained portion means a spot that shines at a site stained with a fluorescent label for immunostaining, as shown in FIG. 3 (see FIGS. 3A and 3B).
  • tissue staining kit includes the above-described tissue staining dye as a constituent.
  • Other components may include reagents such as antibodies relating to immunostaining.
  • FIGS. 1 When the coefficient of variation of the particle size of the dye resin particles is 15% or less, the result is that the size of the bright spot is uniform. As a result, the coefficient of variation exceeds 15%. The size is uniform (see FIGS. 3A and 3B or FIGS. 4A and 4B in comparison). For this reason, the fluorescence signals from all the bright spots fall within the dynamic range set in the fluorescence observation. As a result, the above-mentioned problems such as the fusion of adjacent bright spots by saturation are solved, and discrimination between bright spots is ensured. As a result, the determination accuracy of the fluorescent signal is improved.
  • the fluorescent dye has a positively charged or negatively charged substituent
  • the thermosetting resin constituting the resin of the dye resin particle has an oppositely charged substituent and is ionically bonded to the fluorescent dye.
  • the fluorescent dye Since the fluorescent dye is encapsulated in the resin particles, the fluorescent dye is not unnecessarily exposed to light, thereby preventing degradation of the fluorescent dye and performance degradation as a fluorescent label.
  • the substituent contributing to the ionic bond is such that the fluorescent dye is a negatively charged substituent and the resin particle is a positively charged substituent.
  • the bleeding of the fluorescent dye can be particularly suppressed, and the brightness of the stained image can be ensured.
  • the fluorescent dye has at least two negatively charged substituents per fluorescent dye molecule, so that it is sandwiched between a plurality of positively charged substituents of the resin as shown in the left rectangle of FIG. To be fixed.
  • the fluorescent dye is fixed and functions like a crosslinking agent. As a result, it is possible to prevent bleeding of the fluorescent dye in the tissue-stained image as compared with the case of having one substituent in that it is more firmly fixed. In addition, brightness performance can be secured, and fusion of bright spots can be prevented.
  • the positively charged substituent is an amino group
  • the negatively charged substituent is a sulfo group or a carboxyl group, so that the strongly negatively charged sulfo group is compared to the amino group (—NH + —).
  • the (SO 3 ⁇ ) electron pair can be coordinated to firmly bond the resin and the fluorescent dye.
  • a fluorescent dye having a sulfo group can be firmly bonded to a thermosetting resin having an amino group such as melamine.
  • the fluorescent dye is rhodamine, BODIPY, squarylium or an aromatic hydrocarbon dye molecule
  • the dye molecule is firmly bonded together with the ionic bond of the substituent by the interaction of the fluorescent dye and the hydrophobic portion of the resin. And resin can be combined. Thereby, it is possible to further prevent bleeding of the fluorescent dye in the tissue stained image.
  • thermosetting resin is formed using melamine, and the fluorescent dye is rhodamine or an aromatic hydrocarbon dye molecule, so that the melamine resin and the rhodamine or aromatic hydrocarbon dye molecule are each
  • the dye molecule and the resin can be bound more firmly by the hydrophobic interaction between the benzene rings. Thereby, it is possible to further prevent bleeding of the fluorescent dye in the tissue-stained image after preparation of the tissue section (FIG. 2).
  • rhodamine and aromatic hydrocarbons are preferably used from the viewpoint of luminance and light resistance.
  • thermosetting resin and the fluorescent dye are covalently bonded by any one of an amide bond, an ester bond, an ether bond, and a CN bond. Since the fluorescent dye is encapsulated in the resin particles and firmly maintained during the penetration of the resin, the seepage of the resin particles outside the resin particles is suppressed.
  • a coefficient of variation of 15% or less is included by adding a predetermined amount of a surfactant to a reaction system when the resin particles are produced by a synthetic reaction to make the coefficient of variation of the resin particles 15% or less.
  • the dye resin particles can be produced, and a tissue staining dye having the above-described effects can be provided.
  • a tissue staining kit having the above-described effects can be provided as long as it is a tissue staining kit containing the tissue staining stain as a constituent.
  • Compounds 1-1 to 4-4 in Table 1-1 to Table 1-2 each have a skeleton of rhodamine, BODIPY, squarylium, pyrene, or perylene diimide (see Table 1-3), and have a substituent.
  • a carboxylic acid a sulfonic acid, an ammonium group, a dye having a covalent bond site, or a dye having no such substituent.
  • the compounds 1-1 to 1-8 have a carboxyl group or a sulfo group and have a negative charge as a whole molecule.
  • Compounds 2-1 and 2-2 have an ammonium group and have a positive charge as a whole molecule.
  • Compounds 3-1 and 3-2 have a covalent bond site.
  • Compounds 4-1 to 4-4 do not have the above substituent.
  • rhodamine contains one ammonium group in the skeleton. However, since the contribution of the substituent contained in the skeleton is small, it is not counted in the number of charges (substituents) of the dye. The same applies to squarylium.
  • [Compound 1-1] Commercially available sulforhodamine 101 (Sigma Aldrich) was used.
  • Compound 1-2 A fluorescent dye related to compound 1-2 having a structural formula close to that of AlEXA594 was prepared and used according to the published Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-18049.
  • Compound 1-3 The compound 1-2 was NHS esterified, reacted with 2-Aminoethanesulfonic Acid (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) in DFM at 90 ° C. for 1 hour, purified by column chromatography and used.
  • [Compound 1-4] A commercially available Disodium-1,3,5,7,8-pentamethylpyrromethene-2,6-disulfonate-difluoroborate complex (Exiton) was used. [Compound 1-5] It was synthesized and used according to the method described in the literature (J. Phys. Chem. A 2005, 109, 5571). [Compound 1-6] Commercially available 8-Methoxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (Sigma Aldrich) was used. [Compounds 1-7, 1-8, 3-1, 3, 2, 4-4] It was prepared and used according to the previously reported Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1528.
  • [Compound 2-1] Commercially available rhodamine B (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used.
  • [Compound 2-2] Commercially available sulforhodamine 101 acid chloride (Dojin Chemical Co., Ltd.) and ethylamine (Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd.) were reacted in DFM at 90 ° C. for 1 hour, used after purification by column chromatography.
  • [Compound 4-1] Commercially available tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate (Sigma Aldrich) was used.
  • the structure of the above compound is expressed as an inner salt, but for example, a form in which an anion such as a halide ion, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonate or the like is attached as a counter ion may be used.
  • Carboxylic acid and sulfonic acid are expressed in acid form, but may be a salt of an alkali metal or the like.
  • the numbers of carboxylic acid, sulfonic acid and ammonium group in the molecule are shown, but this number does not include the number of acids and ammonium salts contained in the dye skeleton itself. For example, rhodamine contains one ammonium group in the dye skeleton, but this is not counted. Similarly, squarylium contains a square acid and ammonium group in the dye skeleton, but this is not counted.
  • This solution was heated to 70 ° C. while stirring on a hot stirrer, and then 0.65 g of melamine resin raw material Nicalak MX-035 (manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) was added to this solution.
  • the concentration of the resulting dye resin particles was adjusted to 3 nM using phosphate buffered saline (PBS) containing 2 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  • PBS phosphate buffered saline
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
  • SM (PEG) 12 Succinimidyl-[(N-maleoidopropionamid) -dodecaethyleneglycol] ester, manufactured by Thermo Scientific Co., Ltd.
  • the mixture was reacted at 20 ° C. for 1 hour to obtain a mixed solution containing dye resin particles having a fluorescent dye with a maleimide at the end.
  • the mixture was centrifuged at 10,000 G for 20 minutes, the supernatant was removed, PBS containing 2 mM EDTA was added to disperse the precipitate, and the mixture was centrifuged again. The above washing by the same procedure was performed three times.
  • streptavidin manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • streptavidin and N-succimidyl S-acetylthioacetic acid are used to add a thiol group to the streptavidin and perform gel filtration.
  • SATA N-succinimidyl S-acetylthioacetate
  • tissue staining Human breast tissue was immunostained using a tissue staining dye containing the dye resin particles.
  • a buffer solution such as a PBS buffer solution containing 1% BSA was used as the stain for tissue staining.
  • a tissue array slide manufactured by Cosmo Bio, product number CB-A712 was used as the stained section. The tissue array slide was deparaffinized, washed with water, and autoclaved in 10 mM citrate buffer (pH 6.0) for 15 minutes to activate the antigen.
  • Anti-HER2 rabbit monoclonal antibody (4B5) diluted to 0.05 nM with PBS buffer containing 1% BSA was washed with the tissue array slide after antigen activation treatment with PBS buffer and reacted for 2 hours with tissue sections. I let you. After washing with PBS, it was reacted with a biotin-labeled anti-rabbit antibody diluted with 1% BSA-containing PBS buffer for 30 minutes. Furthermore, an immunohistochemically stained section was obtained by using the above-mentioned staining dye for tissue staining, that is, by reacting with the prepared dye resin particles having streptavidin for 2 hours and then washing. The obtained immunohistochemically stained section was immersed in a 4% neutral paraformaldehyde aqueous buffer solution for 10 minutes for fixation.
  • the “elution amount of the fluorescent dye” in Tables 2 and 4 to 7 is a value obtained by immersing the dye resin particles in ethanol and evaluating the amount of the dye eluted in ethanol. Specifically, 0.1 mg of pigment resin particles are immersed in 1 mL of ethanol, subjected to ultrasonic waves for 10 minutes with a bath-type ultrasonic device (As One Co., Ltd.), centrifuged to remove the particles, and the supernatant liquid is removed. It is a value obtained by calculating the dye amount (pmol) in 1 mL from a calibration curve of the dye concentration and the peak value of the fluorometer measured in advance with a fluorometer F7000 (Hitachi). From this value, it is possible to indirectly estimate the dye bleeding of the evaluation 1: Her2 stained image.
  • Example 2 (Compound 1-1-encapsulated polyurea particles) Production of pigment resin particles in the same manner as in Example 1 except that 0.80 g of urea resin raw material was used instead of 0.65 g of melamine resin raw material Nicarax MX-035 (Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) in Example 1. Went. This urea resin has a positive charge because the skeleton itself contains many amino groups.
  • the urea resin raw material was urea produced by an existing method and having a methylolation degree of 40 to 70%.
  • Example 3 Compound 1-1-encapsulated polyxylene particles
  • Example 1 instead of 0.65 g of the melamine resin raw material Nicarax MX-035 (manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.), 0.80 g of xylene resin raw material Nicarak Y-50 (manufactured by Fudou), butyl isocyanate 0.8.
  • Dye resin particles were produced in the same manner as in Example 1 except that 20 g and 0.20 g of Nicalac MX-035 (Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) were used. Since this polyxylene resin contained many amino groups, the resin became a positive charge.
  • Example 1 [Examples 4, 7, 10, 13, 16, 19, 24, 27, 30, 34] (Compound 1-2-3-2 encapsulated polymelamine particles)
  • Compound 1-1 was converted to Compound 1-2 (Example 4), Compound 1-3 (Example 7), Compound 1-4 (Example 10), Compound 1-5 (Example 13).
  • Compound 1-6 (Example 16), Compound 1-7 (Example 19), Compound 2-1 (Example 24), Compound 2-2 (Example 27), Compound 3-1 (Example 30)
  • Dye resin particles were prepared in the same manner except that the compound 3-2 (Example 34) was changed.
  • Example 2 [Examples 5, 8, 11, 14, 17, 20, 25, 28, 31, 35] (Compound 1-2-3-2 encapsulated polyurea particles)
  • Compound 1-1 was changed to Compound 1-2 (Example 5), Compound 1-3 (Example 8), Compound 1-4 (Example 11), Compound 1-5 (Example) 14), Compound 1-6 (Example 17), Compound 1-7 (Example 20), Compound 2-1 (Example 25), Compound 2-2 (Example 28), Compound 3-1 (Example) Dye resin particles were prepared in the same manner except that 31) and compound 3-2 (Example 35) were changed.
  • Examples 6, 9, 12, 15, 18, 21, 26, 29, 33, 37 (Compound 1-2-3-2 encapsulated polyxylene particles)
  • compound 1-1 was converted to compound 1-2 (Example 6), compound 1-3 (Example 9), compound 1-4 (Example 12), compound 1-5 (Example 15).
  • Compound 1-6 (Example 18), Compound 1-7 (Example 21), Compound 2-1 (Example 26), Compound 2-2 (Example 29), Compound 3-1 (Example 33)
  • Dye resin particles were prepared in the same manner except that the compound was changed to compound 3-2 (Example 37).
  • Example 22 (Compound 1-8-encapsulated polyphenol particles)
  • the fluorescent dye was changed from Compound 1-1 to Compound 1-8, and instead of 0.65 g of melamine resin raw material Nicarac MX-035 (manufactured by Nippon Carbide Industries), phenol resin raw material Nikanol PR-1440M (Fudo Corporation) Without using heating and stirring (heating stirring at 70 ° C. for 50 minutes) after adding 1000 ⁇ L of 10% aqueous solution of dodecylbenzenesulfonic acid (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), using 0.80 g and 0.20 g of phenol.
  • Dye resin particles were produced in the same manner as in Example 1 except that only heating and stirring at 90 ° C. for 20 minutes were performed, and then heating was performed at 125 ° C. for 5 minutes in an autoclave. In addition, since the resin particle contained phenol, it became a negative charge.
  • Example 23 (Compound 1-8-encapsulated polyxylene particles)
  • Compound 1-1 was changed to Compound 1-8, and instead of 0.65 g of melamine resin Nicarak MX-035 (Nihon Carbide Kogyo Co., Ltd.), xylene resin raw material Nikanol Y-50 (Fudo Co., Ltd.) 0.20 g, phenol resin raw material Nikanol PR-1440M (manufactured by Fudo) 0.20 g, 3- (4-Hydroxyphenil) propionic acid 0.20 g, dodecylbenzenesulfonic acid (manufactured by Kanto Chemical) 10% Without heating and stirring after adding 1000 ⁇ L of aqueous solution (heating and stirring at 70 ° C.
  • Example 32 (Compound 3-1 and Compound 3-2 encapsulated polyphenol particles)
  • dye resin particles were prepared in the same manner except that Compound 1-8 was changed to Compound 3-1 (Example 32) and Compound 3-2 (Example 36).
  • melamine resin particles had a characteristic that the coefficient of variation of the particles was larger than that of the particles prepared in Example 1. Using the resulting dye resin particles, immunohistological staining and morphological staining were performed in the same manner as in Example 1.
  • Comparative Example 4 (Compound 1-1 encapsulating polyurea particles)
  • dye resin particles were produced in the same manner as in Example 1 except that 1.6 g of urea resin raw material was used instead of 1.5 g of melamine resin raw material Nicalac MX-035 (Nippon Carbide Industries Co., Ltd.). did.
  • the urea resin raw material is urea produced by an existing method and having a methylolation degree of 40 to 70%.
  • Comparative Example 5 (Compound 1-1 encapsulating polyxylene particles)
  • Comparative Example 3 0.80 g of phenol resin raw material K-100 (manufactured by Fudou Co., Ltd.) and 0.20 g of 3,5-Dimethylaniline were used instead of 1.5 g of melamine resin raw material Nicarax MX-035 (manufactured by Nippon Carbide Industries Co., Ltd.) Except that, pigment resin particles were produced in the same manner as in Example 1. Since the present xylene resin contains a lot of amino groups, the resin has a positive charge.
  • Comparative Example 25 (Compound 1-8-encapsulated polyxylene particles)
  • Compound 1-1 was changed to Compound 1-8, and instead of 1.5 g of melamine resin raw material Nicarac MX-035 (Nihon Carbide Industries Co., Ltd.), phenol resin raw material Nikanol PR-1440 (Fudo Corporation) ) Using 0.80 g and 0.20 g of phenol, without adding 10 ⁇ L of 10% aqueous solution of dodecylbenzenesulfonic acid (manufactured by Kanto Chemical Co., Inc.) without performing heating and stirring (heating and stirring at 70 ° C.
  • Comparative Examples 40, 43, 46, and 49 have a coefficient of variation of 15% or less, but include a dye containing a fluorescent dye (compounds 4-1 to 4-4) that has no charge with respect to the urea resin particles.
  • a dye containing a fluorescent dye compounds 4-1 to 4-4 that has no charge with respect to the urea resin particles.
  • Comparative Examples 41, 44, 47, and 50 the variation coefficient is 15% or less, but the fluorescent dye (compounds 4-1 to 4-4) having no charge is fixed to the polyurea resin particles. This is an example.
  • Comparative Examples 42, 45, 48, and 51 the coefficient of variation is 15% or less, but fluorescent dyes (compounds 4-1 to 4-4) having no charge are fixed to the polyxylene resin particles. This is an example.
  • Example 53 (Compound 1-1 encapsulating polyxylene particles)
  • dye resin particles were prepared, streptavidin was prepared, and morphological dyeing was performed except that a negatively charged polyxylene resin was used instead of a positively charged polymelamine resin (Table 1). 6).
  • Comparative Examples 52, 54, 58, 60, 62, and 64 have a coefficient of variation of 15% or less, but have the same negative ( ⁇ ) charge with respect to the negative ( ⁇ ) charged polyphenol resin particles.
  • the coefficient of variation is 15% or less, but the same minus ( ⁇ ) with respect to particles of poly (xylene) resin having a minus ( ⁇ ) charge.
  • dye resin particles in which a fluorescent dye having a charge (compounds 1-1 to 1-7) is encapsulated are manufactured, and immunohistochemical staining, morphological staining, and evaluation of a tissue image are performed.
  • Example 38 (Compound 1-1 Encapsulating Polymelamine Particles)
  • the time of centrifugal separation for washing the dye resin particles with pure water was reduced from 15 minutes to 10 minutes. Further, as in Example 1, centrifugation was performed 5 times, the supernatant was removed, and the redispersion in ultrapure water was performed, and then a new centrifugation was performed for 1 minute to remove the precipitate. Other than that was the same as Example 1.
  • Example 39 to 48 (Compound 1-2 to 3-2 encapsulated polymelamine particles)
  • Compound 1-1 was converted to Compound 1-2 (Example 39), Compound 1-3 (Example 40), Compound 1-4 (Example 41), Compound 1-5 (Example 42).
  • Compound 1-6 (Example 43), Compound 1-7 (Example 44), Compound 2-1 (Example 45), Compound 2-2 (Example 46), Compound 3-1 (Example 47)
  • Dye resin particles were prepared in the same manner except that the compound 3-2 (Example 48) was changed.

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Abstract

　本発明は、蛍光シグナルの判定精度を向上させた組織染色用染色剤およびこれを含む組織染色用キットを提供することを課題とする。熱硬化性樹脂の樹脂粒子および該樹脂粒子に固定された蛍光色素からなる色素樹脂粒子を染色成分として含有する組織染色用染色剤であって、前記樹脂粒子が前記蛍光色素と逆の電荷の置換基を有して前記蛍光色素とイオン結合、または、共有結合しており、前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下とする。

Description

組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キット
　本発明は、組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キットに関する。
　医学的診断の１つとして、病理診断が行なわれている。病理診断では、病理医は人体から採取した組織片から病気を診断し、治療や手術の要否を臨床医に伝える。患者の状態と病理診断によって、内科系医師は薬物治療方針を決定し、外科系医師は手術を行うか否かを決定する。
　病理診断では、臓器摘出や針生検によって得た組織検体を厚さ数ミクロン程度に薄切して組織標本を作成し、様々な所見を得るために光学顕微鏡を用いて拡大観察することが広く行われている。多くの場合、組織標本は、採取した組織を固定するために脱水し、パラフィンブロック化した後、数μｍの厚さに薄切りし、パラフィンを取り除いて作製される。
　病理診断では、免疫染色と呼ばれる、組織標本に含まれる検出対象の抗原や遺伝子の発現を確認するための染色を行なった後、遺伝子やタンパクの発現異常といった機能異常を診断する免疫観察が行なわれている。
　免疫染色には、例えば、酵素を用いた色素染色法（ＤＡＢ染色等）が用いられる（特許文献１）。ＤＡＢ染色は、ペルオキシダーゼで修飾された抗体を用いて観察対象となる抗原を当該発色により染色し、ペルオキシダーゼの基質であるジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を添加して発色させ、これを観察することで抗原量を測るものである。
　しかしながら、ＤＡＢ染色のような酵素による染色は、染色濃度が温度・時間などの環境条件により大きく左右されるため、染色濃度から実際の抗原等の量を見積もることが難しいという課題がある。
　そのため、病理診断における免疫観察では、酵素標識による染色の代わりに、蛍光標識体を用いる蛍光標識法が行われている。この方法はＤＡＢ染色と比べて定量性に優れるという特徴がある（非特許文献１）。蛍光色素が修飾された抗体を用いて対象となる抗原を染色して観察することで抗原量を測るものである。
　なお、組織標本は、殆ど光を吸収および散乱せず、無色透明に近いため、観察に先立って、形態観察のために色素による染色を施されることがある。染色手法としては種々のものが提案されている。特に組織標本に関しては、形態を観察するための形態観察染色として、ヘマトキシリンおよびエオジンの２つの色素を用いるヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が標準的に用いられている（非特許文献１）。
　ヘマトキシリン染色により細胞核・石灰部・軟骨組織・細菌・粘液が青藍色～淡青色に染色され、エオジン染色により細胞質・間質・各種線維・赤血球・角化細胞が赤～濃赤色に染色される。
　病理医は、染色された組織標本の顕微鏡画像の中で、細胞の核の大きさや形の変化、組織としてのパターンの変化などの形態学的な情報および染色情報をもとに診断を行っている。なお、この他の形態観察染色としては、例えば、細胞診断に用いられるパパニコロウ染色（Ｐａｐ染色）等がある。一つの切片に対して形態染色と免疫染色の両方を行なうことにより、標本の形態観察と免疫観察を同時に行うこともできる。
　組織標本の作製において、染色後の病理切片を封入するための封入剤としては、水系封入剤および油系封入剤が知られている。水系封入剤は一般に標本との屈折率差が大きいため、組織標本を透明にしにくいという課題がある。一方、油系封入剤は、組織標本との屈折率差が小さく、組織標本を透明にすることができる上に、形態染色の色味や発色が良いため、永久標本用として用いられている。このため、油系封入剤が組織標本作成に好適に用いられる。
　蛍光標識法で用いられる組織染色用染色剤として、蛍光物質が固定され蛍光色素標識法に用いられる樹脂粒子（以下、色素樹脂粒子という。）を含むものが知られている。この染色剤を用いて組織標本である切片を免疫染色および蛍光顕微鏡による観察をして抗原の定量を行う場合、色素樹脂粒子の吸着量は色素樹脂粒子由来の輝点数により評価することができる。
特開２０１０－１３４１９５号公報
Robbins Basic Pathology: With STUDENT CONSULT Online Acess, 9e (Robbins Pathology) Saunders, (2012)
　色素樹脂粒子由来の輝点数を評価する際に、輝点強度にバラツキが生じると、蛍光シグナルの判定精度が悪化する。本発明者らは、輝点のバラツキの原因について鋭意検討した結果、色素樹脂粒子の粒子径のバラツキが蛍光シグナルの判定精度を悪化させることを見出した。
　具体的には、色素樹脂粒子の粒子径の大小により色素樹脂粒子の輝度が変化するため、例えば設定した蛍光シグナル検出閾値未満の輝度の粒子径となる色素樹脂粒子が存在する場合、本来検出すべき蛍光シグナルが検出されない問題が発生する。
　逆に、設定した蛍光シグナル検出閾値をはるかに超える輝度となる粒子径となる色素樹脂粒子が存在する場合、サチレーションにより輝点同士が融合して個々の輝点の判別がつかなくなる問題が発生する。
　また、永久切片を作成する際に（図２参照）、切片の水分をエタノール・キシレンで置換する透徹を行うため、透徹によっても蛍光色素の溶出の問題が発生する。例えば、蛍光色素を内包する電荷を有しないポリスチレン粒子を色素樹脂粒子として含む染色剤を用いて染色した切片を透徹すると、蛍光色素が滲み出て、輝点の観察が困難となって蛍光シグナルの判定精度が悪化する問題が存在する。特に、化学構造中にベンゼン環を含む蛍光色素の場合、永久切片の作成に使用される油系封入剤に蛍光色素が滲み出やすいため、蛍光シグナルの判定精度を悪化させる問題がある。
　本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであって、蛍光シグナルの判定精度を向上させた組織染色用染色剤、及び該組織染色用染色剤の製造方法およびこれを含む組織染色用キットの提供をすることを課題とする。
　すなわち、上述した目的のうち、少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した組織染色用染色剤は、熱硬化性樹脂の樹脂粒子および該樹脂粒子に固定された蛍光色素を有する色素樹脂粒子を染色成分として含有する組織染色用染色剤であって、前記樹脂粒子が前記蛍光色素と逆の電荷の置換基を有して前記蛍光色素とイオン結合、または、共有結合しており、前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下である。
　また、本発明の一側面を反映した組織染色用染色剤の製造方法は、前記樹脂粒子を合成反応により製造する際の反応系に界面活性剤を添加することにより前記色素樹脂粒子の変動係数を１５％以下とする工程を含む。
　また、本発明の一側面を反映した組織染色用キットは、上記のいずれかの組織染色用染色剤を構成品として含む。
　本発明によれば、色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下であることにより、上記輝点のバラツキの問題が解消される。また、蛍光色素と熱可塑性樹脂とがイオン結合または共有結合をすることで蛍光観察時の蛍光色素の滲みが防止される。これらの結果、蛍光シグナルの判定精度が改善された組織染色用染色剤、該組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キットを提供することができる。
図１は、本発明に係る色素樹脂粒子を含む組織染色用染色剤により、組織標本の切片を免疫染色した状態を示す模式図であり、色素樹脂粒子の樹脂粒子と色素との結合状態を説明する図である。 図２は、染色、透徹および封入を行って、図１の切片を作製する流れを示す図である。 （Ａ）は、従来の組織染色用染色剤を用いて、組織標本の切片の細胞を免疫染色して蛍光観察をした状態を示す模式図である。（Ｂ）は、本発明に係る組織染色用染色剤を用いて、組織標本の切片の細胞を免疫染色して蛍光観察をした状態を示す模式図である。 （Ａ）は、比較例に係る色素樹脂粒子で標識した２次抗体で染色した写真である。（Ｂ）は、実施例に係る色素樹脂粒子で標識した２次抗体で染色した写真である。
　以下、本発明に係る組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用染色剤を含む組織染色用キットについて、図１～図４を参照しながら説明する。
　本発明に係る組織染色用染色剤は、熱硬化性樹脂の樹脂粒子および該樹脂粒子に固定された蛍光色素を有する色素樹脂粒子を染色成分として含有する組織染色用染色剤であって、前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下である。
　前記組織染色用染色剤において、前記蛍光色素が前記樹脂粒子に内包されていてもよい。また、前記イオン結合に寄与している置換基が、前記蛍光色素はマイナス電荷の置換基であり、前記樹脂粒子はプラス電荷の置換基であってもよい。
　さらに、前記蛍光色素全体の電荷および前記樹脂粒子全体の電荷が、前記イオン結合に寄与している置換基の電荷と同一の電荷であってもよい。また、前記蛍光色素は、蛍光色素１分子の分子量／電荷を有する置換基数＜４００であってもよい。
　また、前記蛍光色素は、蛍光色素１分子あたりにマイナス電荷の置換基を少なくとも２つ有していてもよい。また、前記プラス電荷の置換基がアミノ基であり、前記マイナス電荷の置換基がスルホ基またはカルボキシル基であってもよい。
　前記蛍光色素のマイナス電荷の置換基の少なくとも１つがスルホ基であってもよい。また、前記蛍光色素が、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウムまたは芳香族炭化水素系色素分子であってもよい。
　前記樹脂粒子がメラミンを用いて形成され、前記蛍光色素がローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子であってもよい。また、前記樹脂粒子と前記蛍光色素とが、アミド結合、エステル結合、エーテル結合およびＣ－Ｎ結合のいずれかによって共有結合していてもよい。
　前記熱硬化性樹脂が、メラミン、尿素、グアナミン、フェノールおよびキシレンからなる群から選択された少なくとも１つのモノマーから形成される構成単位を含んでいてもよい。
　本発明に係る組織染色用染色剤の製造方法は、前記樹脂粒子を合成反応により製造する際の反応系に界面活性剤を添加することにより前記色素樹脂粒子の変動係数を１５％以下とする工程を含む。
　本発明に係る組織染色用キットは、上述したいずれかの組織染色用染色剤を構成品として含む。
　＜色素樹脂粒子＞
　この色素樹脂粒子は、図１に示すように、樹脂粒子と蛍光色素とがイオン結合または共有結合したものである。前者の例は、樹脂粒子を構成する樹脂が有するアミノ基に対してプロトンが付加したアンモニウム基と、蛍光色素が有するスルホ基がイオン結合して、色素樹脂粒子を構成しているものである（図１の左側矩形内の破線参照）。一方、後者の例は、樹脂粒子を構成するモノマー由来の部分が有するアミノ基と、蛍光色素が有するスルホ基とが共有結合して、色素樹脂粒子を構成しているものである（図１の右側矩形内の破線参照）。
　樹脂粒子と蛍光色素との各結合は、樹脂粒子の内部および／または外表面と色素分子との間で行われる。図１に示す例は、それぞれイオン結合または共有結合により色素を内包および／または外表面に固定している例を示している（表面固定については図示省略）。ここで、樹脂粒子と蛍光色素との結合は、イオン結合と共有結合との双方を含むものであってもよい。
　また、樹脂粒子に内包および／または表面固定させる蛍光色素は、樹脂粒子に対して、後述する蛍光色素のいずれか一種を単独で固定しても、複数種を混合して固定させるようにしてもよい。例えば、励起波長と発光波長とにおいて、それぞれ相互に異なる２種以上の蛍光色素を含ませてもよい。
　また、樹脂粒子に蛍光色素を固定する方法は、特に限定されるものではない。樹脂粒子の原料であるモノマーやオリゴマーに蛍光色素分子をイオン結合および／または共有結合させて、これを重合することにより色素樹脂粒子を合成する方法、製造した樹脂粒子に対して色素を吸着せて導入する方法等、樹脂粒子への蛍光色素の導入にはいかなる方法を用いても構わない。
　色素樹脂粒子の平均粒径は、特に限定されないが、通常１０～５００ｎｍであり、好ましくは、５０～２００ｎｍである。
　また、色素樹脂粒子を免疫染色に用いる場合、図１に示すように、例えば、樹脂粒子に対してストレプトアビジンまたはビオチン等のリンカーの一方を付加して、２次抗体にリンカーの他方を付加することにより、免疫染色に用いる構成としてもよい。
　＜熱硬化性樹脂＞
　本発明に係る色素樹脂粒子を構成する熱硬化性樹脂は、蛍光色素を上述したイオン結合および／または共有結合により固定することができる熱硬化性樹脂を含むものであれば、特に限定されない。
　蛍光色素とのイオン結合に用いられる熱硬化性樹脂は、その構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を有する置換基に置き換えられているか、その化学構造の一部に電荷を有する部分が存在するものである。一方、蛍光色素との共有結合に用いられる熱硬化性樹脂は、上記電荷を有する置換基の有無に関係なく、化学構造の一部に色素と共有結合可能な部位があり、ここを利用して色素と共有結合していればよい。なお、「電荷を有する置換基または部分」とは、水または酸性または塩基性の水に溶解させたときにプラスまたはマイナスに帯電する置換基または化学構造上の部分を意味する。
　上記熱硬化性樹脂としては、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、キシレン、およびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つのモノマーから形成される構成単位を含む熱硬化性樹脂を好適に用いることができる。
　このうち、メラミン、尿素およびグアナミンは、プラス電荷の置換基としてアミノ基を構造の一部に有するモノマーである。フェノールは、マイナス電荷の置換基としてフェノール性水酸基を構造の一部に有するモノマーである。キシレンは、電荷を有する置換基や部分のないモノマーであるので、それらが有する水素の一部をプラス電荷またはマイナス電荷の置換基に置換して蛍光色素とのイオン結合に用いることができる。
　これらの熱硬化性樹脂は、電荷を有する置換基ないし部位を含むモノマー、または、蛍光色素が有する官能基と共有結合を生じる反応性基を有する熱硬化性樹脂のモノマーを、公知の重合法により重合させることで製造することができる。
　メラミンのように、最初から電荷を有する置換基が構造に含まれているものであれば、置換基を導入する必要がなく、好適に用いることができる。
　熱硬化性樹脂のモノマーが有するマイナス電荷の置換基としては、スルホ基（－ＳＯ3 -）、カルボキシル基（－ＣＯＯ-）等を例示できる。また、熱硬化性樹脂のモノマーが有するプラス電荷の置換基としては、アンモニウム基（－ＮＲ3 +）を挙げることができる。ここでＲは水素またはアルキル基である。
　熱硬化性樹脂のモノマー等に電荷を有する置換基を導入する方法としては、例えば、カルボキシル基の導入については、フリーデルクラフツ反応により直接導入してもよく、あるいは、カルボキシル基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物とボロン酸に変換して鈴木カップリング反応によって結合して導入してもよく、あるいは、カルボキシル基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物に変換してグリニャール反応等のカップリング反応で結合して導入してもよい。
　スルホ基の導入については、モノマーを発煙硫酸やクロロ硫酸により直接スルホン化してもよく、あるいはスルホ基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物とボロン酸に変換して鈴木カップリング反応によって導入してもよく、あるいはスルホ基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物に変換してグリニャール反応等のカップリング反応で結合して導入してもよい。
　アミノ基の導入については、発煙硝酸によるニトロ化とニトロ基の還元反応によってアミノ基に変換してもよく、あるいはモノマーをハロゲン化の形に導きアンモニアとの直接反応やガブリエル反応によってアミノ化してもよく、あるいはアミノ基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物とボロン酸に変換して鈴木カップリング反応によって結合して導入してもよく、あるいはカルボキシル基を持ったアルキル化合物とモノマーをハロゲン化物に変換してグリニャール反応等のカップリング反応で結合して導入してもよい。
　上記反応の際には適宜保護基を導入し、保護されたカルボキシル基やスルホ基、アミノ基としてモノマーに導入後、脱保護を行なって、カルボキシル基やスルホ基、アミノ基としてもよい。
　熱硬化性樹脂の分子構造は三次元的な網目構造であり、高分子同士が架橋することによって作られる。このため、熱硬化性樹脂の樹脂粒子に内包された蛍光色素は樹脂粒子の外側に溶出しにくく、蛍光観察の際に輝点の滲みを抑制する効果が得られる。
　熱硬化性樹脂は、ホモポリマーに限定されず、コポリマーであってもよい。具体的には、上記のポリメラミン等を構成する複数種のモノマーまたはオリゴマーを組み合わせて共重合させたコポリマーや、これらのモノマーまたはオリゴマーと、それ以外種類のモノマーまたはオリゴマーとを共重合させたコポリマーであってもよい。
　＜蛍光色素＞
　本発明で用いることが可能な蛍光色素としては、既存のいかなるものを用いても構わない。ただし、熱硬化性樹脂の合成反応の加熱条件下であっても該加熱により悪影響を受けない蛍光色素を用いることが望ましい。蛍光色素は、公知の方法により入手または作製することができる。
　樹脂粒子と蛍光色素とをイオン結合させる場合、図１の左側の矩形内に示すように、樹脂材料のモノマーまたはオリゴマーと蛍光色素とは反対の電荷を有していることが好ましい。これにより、樹脂材料を熱硬化させる前の段階で、樹脂材料と色素分子とがイオン結合して会合し、蛍光色素を樹脂粒子に内包させやすくすることができる。
　樹脂粒子と蛍光色素とが会合することにより、蛍光色素の分子が樹脂粒子に固定されるので、樹脂粒子からの色素の溶出が起こり難くなる。同じ会合様式で樹脂粒子と色素を固定する場合、会合部位が多い程、色素と樹脂の固定が強くなるので、色素の溶出は起こり難くなる。このため、蛍光色素は、２以上の置換基を有していることが好ましい。
　また、蛍光色素が隣接する樹脂と樹脂との置換基の間に入り込んで、両者をつなぐ架橋剤のように機能して、樹脂構成単位同士の結合が強固となり、また、樹脂粒子と蛍光色素との結合も強固となるため、色素と樹脂の会合物の溶出も起こり難くなる。さらに、蛍光色素の分子が安定し蛍光色素の耐熱性がさらに上昇するため、熱硬化により重合反応させて樹脂粒子を形成する際に、蛍光色素が熱による悪影響をより受けにくいものとなり、樹脂粒子から蛍光色素が溶出しにくいものとなる。
　樹脂粒子と蛍光色素とを共有結合させる場合も、上述と同様の理由から蛍光色素が２つ以上の反応基を有していることが好ましい。
　蛍光色素としては、例えば、ローダミン系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）、スクアリリウム系色素分子、芳香族炭化水素系色素分子等の各系統の色素分子の中から選択することができる。
　このうち、芳香環系色素分子（芳香族炭化水素系色素分子）、ローダミン系色素分子などの蛍光色素は、比較的耐光性が高いため好ましく、なかでも芳香環系色素分子に属するペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ）やピレン（Ｐｙｒｅｎｅ）、ペリレンジイミド（ｐｅｒｙｌｅｎｅ　ｄｉｉｍｉｄｅ）が好ましい。さらにローダミン系色素やペリレンジイミドは量子収率や吸光等が優れており、発光効率が優れるため、これらを内包した樹脂粒子は、他の色素を内包した樹脂粒子と比べて発光強度が優れる。
　ローダミン系色素分子の具体例としては、５－カルボキシ－ローダミン、６－カルボキシ－ローダミン、５，６－ジカルボキシ－ローダミン、ローダミン　６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ－ローダミン、テキサスレッド、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｒｅｄ、ＬＤ７００ ＰＥＲＣＨＬＯＲＡＴＥ、それらの誘導体などが挙げられる。
　ＢＯＤＩＰＹ系色素分子の具体例としては、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ　４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ　５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ　５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ　５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ　５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ　５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ　６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ　６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、それらの誘導体などが挙げられる。
　スクアリリウム系色素分子の具体例としては、ＳＲｆｌｕｏｒ ６８０－Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、１，３－Ｂｉｓ［４－（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ］－２，４－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｂｕｔｅｎｅｄｉｙｌｉｕｍ　ｄｉｈｙｄｒｏｘｉｄｅ，　ｂｉｓ、２－（４－（Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｅｔｈｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（４－（Ｄｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）－４－（４－（ｄｉｂｕｔｙｌｉｍｉｎｉｏ）－２－ｈｙｄｒｏｘｙｃｙｃｌｏｈｅｘａ－２，５－ｄｉｅｎｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、２－（８－Ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－１，２，３，５，６，７－ｈｅｘａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎ－９－ｙｌ）－４－（８－ｈｙｄｒｏｘｙ－１，１，７，７－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ－２，３，６，７－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ－１Ｈ－ｐｙｒｉｄｏ［３，２，１－ｉｊ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｉｕｍ－９（５Ｈ）－ｙｌｉｄｅｎｅ）－３－ｏｘｏｃｙｃｌｏｂｕｔ－１－ｅｎｏｌａｔｅ、それらの誘導体などが挙げられる。
　芳香族炭化水素系色素分子の具体例としては、Ｎ, Ｎ－Ｂｉｓ－（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－（４－ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）－ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｎａｃｉｄ ｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）－１，６，７，１２－ｔｅｔｒａｐｈｅｎｏｘｙｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４：９，１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｄｉｉｍｉｄｅ、Ｎ，Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３，４，９，１０－ｂｉｓ（ｄｉｃａｒｂｉｍｉｄｅ）、１６，Ｎ,Ｎ'－Ｂｉｓ（２，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）ｐｅｒｙｌｅｎｅ－３,４,９,１０－ｔｅｔｒａｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ｄｉｉｍｉｄｅ、４，４'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｂｕｔｙｒｉc  ａｃｉｄ、２，１０－Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ－ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ、２，１０－Ｂｉｓ（３－ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎｅ－８,１６－ｄｉｏｎｅ, ３，３'－[（８，１６－Ｄｉｈｙｄｒｏ－８,１６－ｄｉｏｘｏｄｉｂｅｎｚｏ[ａ,ｊ]ｐｅｒｙｌｅｎ－２,１０－ｄｉｙｌ）ｄｉｏｘｙ]ｄｉｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｅ、１７－ＢＩＳ（Ｏｃｔｙｌｏｘｙ）Ａｎｔｈｒａ［９，１，２－ｃｄｅ－］Ｂｅｎｚｏ［ＲＳＴ］Ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－５－１０－Ｄｉｏｎｅ、Ｏｃｔａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ, ５，１０－ｄｉｈｙｄｒｏ－５,１０－ｄｉｏｘｏａｎｔｈｒａ[９，１，２－ｃｄｅ]ｂｅｎｚｏ[ｒｓｔ]ｐｅｎｔａｐｈｅｎｅ－１６,１７－ｄｉｙｌｅｓｔｅｒ、Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚａｎｔｈｒｏｎｅ、Ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ, ４，４'，４''，４'''－[[２，９－ｂｉｓ[２，６－ｂｉｓ(１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ)ｐｈｅｎｙｌ]－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ-，Ｂｅｎｚｅｎｅｅｔｈａｎａｍｉｎｉｕｍ、 ４，４'，４''，４'''－［［２，９－ｂｉｓ［２，６－ｂｉｓ（１－ｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１,２,３,８,９,１０－ｈｅｘａｈｙｄｒｏ－１,３,８,１０－ｔｅｔｒａｏｘｏａｎｔｈｒａ[２，１，９－ｄｅｆ：６，５，１０－ｄ'ｅ'ｆ']ｄｉｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ－５，６，１２，１３－ｔｅｔｒａｙｌ]ｔｅｔｒａｋｉｓ（ｏｘｙ）]ｔｅｔｒａｋｉｓ[Ｎ,Ｎ,Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ－］、それらの誘導体などが挙げられる。
　＜色素樹脂粒子の製造方法＞
　本発明に係る変動係数１５％以下、好ましくは１５％未満の色素樹脂粒子は、例えば以下の各工程に沿って製造され、１種または２種以上のモノマーまたはオリゴマーを熱硬化させて色素樹脂粒子を製造する際に、界面活性剤が所定量存在した状態で重合反応を行うことにより製造することができる。樹脂原料に対し、１０～６０重量％の範囲で乳化作用を有する界面活性剤を加える事で、任意の粒子径を得る事ができ、例えば、３０～３００ｎｍの粒子を作製できる。また、界面活性剤の割合を増やすと更に小さい粒子も作製可能で３０ｎｍ以下とすることができる。あるいは、界面活性剤の割合を減らすと更に大きい粒子も作製可能で３００ｎｍ以上の粒子も作製可能である。また、粒子作製時の界面活性剤は０．１から３．０重量％で任意に変更できる。好ましくは０．２５から１．０重量％である。これら界面活性剤の割合と添加量は一例であり、任意の範囲で変更できる。
　（１）混合工程
　混合工程は、上記蛍光色素と、界面活性剤と、プロトン供給剤と、樹脂粒子を構成するモノマーまたはオリゴマーの１種または２種以上等とを混合する工程である。
　（界面活性剤）
　本発明者らは、製造される色素樹脂粒子の粒径の変動係数が、界面活性剤とモノマー（樹脂構成単位としてのモノマー）とのモル比や、界面活性剤の種類により変化することを見出している。このため、色素樹脂粒子の変動係数が１５％以下となるように、界面活性剤の種類やモノマーとのモル比を調節して樹脂を重合させる必要がある。
　界面活性剤の種類としては、アニオン系、ノニオン系およびカチオン系の全ての界面活性剤を用いることができる。このうち、樹脂粒子の粒径の変動係数に与える界面活性剤の電荷の影響の大きさは、カチオン系の樹脂モノマーに対しては、ノニオン系＞アニオン系＞カチオン系の関係となるため、アニオン系、ノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。逆に、アニオン系の樹脂モノマーに対する界面活性剤の電荷の影響の大きさは、ノニオン系＞カチオン系＞アニオン系の関係となるため、カチオン系、ノニオン系の界面活性剤を用いることが好ましい。
　界面活性剤としては、以下のものを用いることができるがこれらに限定されない。アニオン系の界面活性剤としては、例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム等が挙げられる。ノニオン系の界面活性剤としては、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が挙げられる。カチオン系の界面活性剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド等を挙げることができる。
　また、重合反応系におけるモノマーと界面活性剤との重量比は、モノマー：界面活性剤＝１０：１～１０：６となるように設定することが好ましい。実施例に示すように、モノマー単位：界面活性剤（モル比）が、１００：１．５～１００：３．５程度となるように設定することが、より好ましい。
　界面活性剤としては、例えば、エマルゲンやネオペレックス（登録商標、花王社製）を好適に用いることができる。なお、エマルゲンの有効成分はポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、ネオペレックスの有効成分はドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムである。界面活性剤により、外側が水相で内側が油相のミセルが形成され、ミセル内側の油相に上記樹脂を構成するモノマーが包含された状態となり、このミセル内側で重合反応が行われることとなる。
　ミセル内側の油相で重合反応が進み油相内のモノマーが枯渇してくると、水相に分散しているモノマーが油相に移動するようになるが、この際に水と油の界面に位置する界面活性剤が、水相からのモノマー流入量を調節する役割を果たし、製造される樹脂粒子の粒径が揃うと考えられる。
　ミセル内側の油相とミセル外側の水相との界面に位置する界面活性剤の電荷が、水相から油相へ供給されるモノマーの電荷と反対の場合には、水相のモノマーが界面活性剤に電気的に引き付けられて、ミセル内側の油相へ供給されやすくなる。そのため、カチオン系のモノマーを用いる場合、使用する界面活性剤は、アニオン系、ノニオン系のものを好適に用いることができる。
　また、使用する乳化重合用乳化剤は、重合工程で行う熱硬化反応温度より曇点が高いものを選択する必要がある。熱硬化反応温度より曇点が低いものを選択すると、界面活性剤が水との水和力を失って、その機能を果たさなくなり、樹脂粒子ができずに、樹脂の塊状物となってしまうからである。
　（プロトン供給剤）
　熱硬化性樹脂と蛍光色素とをイオン結合させる場合、プラス電荷となる熱硬化性樹脂の置換基や蛍光色素の置換基にＨ+を積極的に供給してプラス電荷とするプロトン供給剤を用いる事もできる。例えば、ギ酸や酢酸、パラトルエンスルホン酸等、これらに類するものが挙げられる。色素に付いている置換基がカルボン酸やスルホン酸等の酸の場合、これがプロトン供給剤として機能する事もできる。逆に熱硬化樹脂のマイナス電荷となる置換基や蛍光色素の置換基からＨ+を積極的に抜き取るプロトン受容剤を用いる事もできる。例えば、水酸化ナトリウム等の塩基の場合、これがプロトン受容剤として機能する。
　（重合反応促進剤）
　熱硬化性樹脂の反応促進剤として、例えば酸を用いる事ができる。メラミン樹脂や尿素樹脂、キシレン樹脂、フェノール樹脂は、いずれも酸触媒により反応が促進される事が知られている。酸としては、例えば、ギ酸、酢酸、硫酸、塩酸、硝酸、パラトルエンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、等が知られている。熱硬化性樹脂の反応は加温のみでも進行するが、反応促進剤を加えるとより低温で進行するので、反応や性能を制御できる範囲で添加することができる。
　（２）重合工程
　重合工程は、モノマーまたはオリゴマーを熱硬化、即ち重合させて色素樹脂粒子を形成する工程である。重合工程の反応条件（熱硬化温度、重合時間）は、重合させるモノマーまたはオリゴマーの組成から決定され、公知の方法に即して行うことができる。ここで、蛍光色素の性能が低下しない反応条件（蛍光色素の耐熱温度範囲内）とする必要がある。
　例えば、熱硬化性樹脂にメラミン樹脂を選択する場合、メラミン樹脂の生成反応は７０℃～２００℃で行われる。好ましくは１５０～２００℃加熱である。蛍光色素の耐熱温度は、ローダミン系色素分子２００℃、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）２００℃、スクアリリウム系色素分子２００℃、芳香族炭化水素系色素分子３００℃以上であり、生成反応に耐えうる蛍光色素を用いる必要がある。
　重合工程により、内包されている蛍光色素が色素樹脂粒子から溶出しにくいものとなる。万が一、重合反応が不十分で色素樹脂粒子からの蛍光色素の滲みの問題が生じる場合には、製造した色素樹脂粒子を、用いた樹脂の分解温度や溶融温度以下の温度の色素と樹脂粒子に悪影響が出ない範囲でさらに加熱処理にて熱硬化、つまり架橋を促進させて、蛍光色素の滲みを抑制させる処理を行ってもよい。
　（３）洗浄工程
　洗浄工程は、得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素、乳化剤等の不純物を除く工程である。例えば、反応液から樹脂成分を遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再度分散させることで洗浄を行う。遠心分離、上澄み除去、超純水への再分散の一連の洗浄操作は、上澄みに樹脂や色素に由来する吸光・蛍光が見られなくなるまで、複数回繰り返し行うことが好ましい。
　（４）付加工程
　付加工程は、色素樹脂粒子に免疫染色用のリンカー等を付加する工程である。色素樹脂粒子に付加するリンカーの種類は、ストレプトアビジン－ビオチン等のリンカーを用いることができるが、これに限定されない。
　例示したストレプトアビジン－ビオチンのリンカーの付加は、例えば、以下のように行われる。まず、ストレプトアビジンに対してチオール基導入試薬によりチオール基を付加する一方で、色素樹脂粒子の表面に対してアミノ基導入試薬によりアミノ基を導入した後、アミノ基と反応する活性エステルとチオール基と反応するマレイミド基を両端に有するＰＥＧ等のリンカーを用いて、色素樹脂粒子とストレプトアビジンとをリンクさせる方法である。
　アミノ基導入試薬としては、アミノプロピルトリメトキシシラン等が挙げられる。チオール基導入試薬としては、Ｎ－スクシミジルＳアセチルチオ酢酸が挙げられ、該試薬と上記の付加自体は公知の方法で行うことができる。
　＜製造した色素樹脂粒子の確認＞
（樹脂粒子の粒径と変動係数）
　色素樹脂粒子の粒径は、製造した色素樹脂粒子を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し、色素樹脂粒子の断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径（面積円相当径）として測定することができる。色素樹脂粒子の集団の粒子径の平均（平均粒径）および変動係数は、十分な数（たとえば３００個）の色素樹脂粒子について、上記のように粒子径を測定した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径により算出される。
　［組織染色］
　組織染色の方法としては、上記色素樹脂粒子を免疫染色用の蛍光標識体として検出対象の生体物質を染色する蛍光染色法が用いられる。たとえば、特定の抗原に対して免疫染色を行う際には、上記リンカーを介して色素樹脂粒子と１次抗体を直接結合した蛍光標識体（コンジュゲート）を作製し、抗原を染色する方法（１次抗体法）、色素樹脂粒子と２次抗体とを直接結合した蛍光標識体を作製し、抗原に１次抗体を結合したものを染色する方法（２次抗体法）、図１を参照して上述したように、色素樹脂粒子とビオチンを直接結合した蛍光標識体を作製し、抗原に１次抗体、及び、アビジンあるいはストレプトアビジン修飾した２次抗体を結合したものを用いて染色する方法、同様に色素樹脂粒子にアビジンあるいはストレプトアビジンを直接結合した蛍光標識体を作製し、抗原に1次抗体、及び、ビオチン修飾した２次抗体を結合したものを用いて染色する方法（ビオチン－アビジン法またはサンドイッチ法）、等を用いることができる。
　免疫染色に用いる１次抗体はいかなるものでも構わず、免疫染色を行いたい対象によって変わる。例えばＨＥＲ２を抗原とする免疫染色を行う場合には、抗ＨＥＲ２抗体を用いる。また、２次抗体はいかなるものを用いても構わず、１次抗体によって変わる。例えば、抗マウス、抗ラビット、抗牛、抗ヤギ、抗羊、抗イヌ、および、抗チキン抗体が挙げられる。
　色素樹脂粒子と抗体やビオチンとの結合は既存のいかなる方法を用いても構わない。例えば、アミンとカルボン酸の反応におけるアミド化、マレイミドとチオールの反応によるスルフィド化、アルデヒドとアミンの反応によるイミン化、および、エポキシとアミンの反応によるアミノ化等を用いることができる。
　なお、上記の免疫染色は、組織染色に限定されるものではなく、細胞染色に適用することも可能である。また、検出対象とする生体物質は、それと特異的に結合する物質が存在するものであれば限定されるものではない。典型的には、上記のように抗原および抗体の組み合わせが用いられるが、たとえば核酸分子（オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド）およびそれにハイブリダイズしうる配列の核酸分子の組み合わせを用いることも可能である。
　［蛍光観察］
　上記工程により組織染色が施された病理切片に用いられている色素樹脂粒子の蛍光色素に応じた適切な波長を有する励起光を照射することで、蛍光色素が発する蛍光を観察する。このような工程により、その病理切片に存在する所定の生体分子を検出することができ、抗体医薬（たとえばＨＥＲ２を標識とするハ―セプチン）の適用の要否を判断するための情報として利用することができる。励起光の照射には、一般的な蛍光観察と同様の照射手段を用いればよく、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザ光源から、必要に応じて所定の波長を選択すればよい。
　蛍光の観察は、蛍光顕微鏡の鏡筒から行ってもよいし、蛍光顕微鏡に設置されたカメラが撮影した画像を別途表示手段（モニタ等）に表示して行ってもよい。蛍光色素によるが、蛍光顕微鏡の鏡筒から目視によっては十分に蛍光を観察することができない場合があっても、カメラによる画像の撮影を通じて蛍光を観察することが可能な場合もある。必要に応じて所定の波長を選択的に通過させるフィルタを用いてもよい。
　ここで、免疫染色部の輝度は、免疫染色用の蛍光標識体によって染色された部位の輝度の平均値として取得される値である。また、免疫染色部の輝点とは、図３に示すように、免疫染色用の蛍光標識体によって染色された部位で輝く点を意味する（図３（Ａ）および（Ｂ）参照）。
　＜組織染色用キット＞
　本発明に係る組織染色用キットは、上述した組織染色用染色剤を構成品として含む。他の構成品は免疫染色に関する抗体等の試薬等を含んでいてよい。
　以下、本発明に係る組織染色用染色剤、組織染色用染色剤の製造方法および組織染色用キットによる作用・効果について、図１～図４を参照しながら説明する。
　(1)色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下の場合、輝点の大きさが揃う結果、変動係数が１５％を超えるものと異なり、蛍光観察を行った場合の各輝点の大きさが一様となる（図３（Ａ）と（Ｂ）または図４（Ａ）と（Ｂ）を対比して参照）。このため、蛍光観察で設定するダイナミックレンジに全ての輝点からの蛍光シグナルが収まるようになる。この結果、隣接する輝点同士がサチレーションにより融合する等の上記問題が解消され、輝点同士の判別が担保される。この結果、蛍光シグナルの判定精度が改善される。
　蛍光色素がプラス電荷またはマイナス電荷の置換基を有し、色素樹脂粒子の樹脂を構成する熱硬化性樹脂が前記蛍光色素とは逆の電荷の置換基を有してイオン結合していることで(図１参照)、色素樹脂粒子により組織切片を染色した後の透徹の際に、樹脂粒子に内包された色素が樹脂粒子の外側に滲み出にくいものとなる。
　(2)蛍光色素が前記樹脂粒子に内包されていることで、不必要に蛍光色素が光に曝されず、これによる蛍光色素の分解・蛍光標識として性能低下を防止することができる。
　(3) 特に、前記イオン結合に寄与している置換基が、前記蛍光色素はマイナス電荷の置換基であり、前記樹脂粒子はプラス電荷の置換基であることにより、組織染色後の蛍光観察における蛍光色素の滲みを特に抑制することができ、染色像の明るさを確保することができる。
　(4)前記蛍光色素全体の電荷および前記樹脂粒子全体の電荷が、前記イオン結合に寄与している置換基の電荷と異なる電荷である場合、蛍光色素と樹脂の両分子が互いに電気的に引き寄せられて、各分子の置換基がイオン結合するため、より蛍光色素が樹脂に固定されやすいものとなる。
　(5)蛍光色素１分子の分子量／電荷を有する置換基数＜４００であることで、他の分子量頻度で前記置換基を有しているものよりも、組織染色像の蛍光色素の滲み、明るさおよび輝点における性能バランスを高めることができる。
　(6)前記蛍光色素は、蛍光色素１分子あたりにマイナス電荷の置換基を少なくとも２つ有することにより、図１の左側の矩形に示すように、樹脂が有する複数のプラス電荷の置換基に挟持されるように固定される。また、場合によっては、蛍光色素が架橋剤のように固定されて機能する。この結果、より強固に固定される点で１つの置換基を有する場合よりも組織染色像の蛍光色素の滲みを防止することができる。加えて、明るさの性能を確保することができ、輝点の融合等を防止することができる。
　(7,8)プラス電荷の置換基がアミノ基であり、マイナス電荷の置換基がスルホ基またはカルボキシル基であることにより、アミノ基（－ＮＨ+－）に対して、強いマイナス電荷のスルホ基（ＳＯ3 -）の電子対を配位結合させて樹脂と蛍光色素とを強固に結合させることができる。例えば、メラミン等のアミノ基を有する熱硬化性樹脂に対して、スルホ基を有する蛍光色素を強固に結合させることができる。
　(9)前記蛍光色素が、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウムまたは芳香族炭化水素系色素分子であることで、蛍光色素と樹脂の疎水性部分の相互作用により、置換基のイオン結合と共に、強固に色素分子と樹脂とを結合させることができる。これにより、組織染色像の蛍光色素の滲みをより一層防止することができる。
　(10,12)前記熱硬化性樹脂がメラミンを用いて形成され、前記蛍光色素がローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子であることにより、メラミン樹脂とローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子がそれぞれ有するベンゼン環同士の疎水的相互作用により、上述した置換基のイオン結合に加えて、より強固に色素分子と樹脂とを結合させることができる。これにより、組織切片作成（図２）後の組織染色像の蛍光色素の滲みをより一層防止することができる。また、輝度と耐光性の観点からも、ローダミンや芳香族炭化水素は好適に用いられる。
　(11)前記熱硬化性樹脂と前記蛍光色素とが、アミド結合、エステル結合、エーテル結合およびＣ－Ｎ結合のいずれかによって共有結合していることで、色素樹脂粒子により組織切片を染色した後の透徹の際に、蛍光色素が樹脂粒子に内包され強固に維持されるので、樹脂粒子の外側に滲み出ることが抑制される。
　(13)前記樹脂粒子を合成反応により製造する際の反応系に界面活性剤を所定量添加することにより前記樹脂粒子の変動係数を１５％以下とする工程を含むことで、変動係数１５％以下の色素樹脂粒子を製造することができ、上記効果を有する組織染色用染色剤を提供することができる。
　(14)上記組織染色用染色剤を構成品として含む組織染色用キットであれば、上記効果を有する組織染色用キットを提供することができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
　［色素］
　以下の実施例、比較例に用いた色素を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表１－１～表１－２の化合物１－１～４－４は、それぞれ、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウム、ピレン、または、ペリレンジイミドの骨格（表１－３参照）を持ち、且つ、置換基としてカルボン酸やスルホン酸、アンモニウム基、共有結合部位を持つ色素、あるいは前記置換基が無い色素である。このうち、化合物１－１～１－８は、カルボキシル基やスルホ基を有しており、分子全体としてマイナスの電荷をもっている。化合物２－１～２－２はアンモニウム基を有しており、分子全体としてプラスの電荷を持っている。化合物３－１～３－２は、共有結合部位を有している。化合物４－１～４－４は前記置換基がない。なお、表１－３の通り、ローダミンは骨格にアンモニウム基を一つ含むが、骨格に含まれる置換基については寄与が小さいので、色素の電荷（置換基）の数にはカウントしない。スクアリリウムも同様である。
［化合物１－１］
　市販のスルホローダミン１０１（シグマアルドリッチ社）を使用した。
［化合物１－２］
　ＡｌＥＸＡ５９４に近い構造式を有する化合物１－２に係る蛍光色素を、既報の特開２０１０－１８０４９に従って作製して使用した。
［化合物１－３］
　前記化合物１－２をＮＨＳエステル化した後、2-Aminoethanesulfonic Acid（東京化成工業社）とＤＦＭ中で９０℃、１時間反応し、カラムクロマトグラフィーで精製後、使用した。
［化合物１－４］
　市販のＤｉｓｏｄｉｕｍ－１,３,５,７,８－ｐｅｎｔａｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ－２,６－ｄｉｓｕｌｆｏｎａｔｅ‐ｄｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ（Exiton社）を使用した。
［化合物１－５］
　文献（J. Phys. Chem. A 2005, 109, 5571）に記載の方法に従い合成し、使用した。
［化合物１－６］
　市販の8-Methoxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt（シグマアルドリッチ社）を使用した。
［化合物１－７，１－８，３－１，３－２，４－４］
　既報のAngew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 1528に従って作製し、使用した。
［化合物２－１］
　市販のローダミンＢ（和光純薬工業社）を使用した。
［化合物２－２］
　市販のスルホローダミン１０１アシッドクロライド（同仁化学社）とエチルアミン（東京化成工業社）をＤＦＭ中で９０℃、１時間反応し、カラムクロマトグラフィーで精製後、使用した。
［化合物４－１］
　市販のテトラメチルローダミンエチルエステル過塩素酸塩（シグマアルドリッチ社）を使用した。
［化合物４－２］
　市販の1,3,5,7,8-pentamethyl-2,6-diethylpyrromethene-difluoroborate complex（Exiton社）を使用した。
［化合物４－３］
　市販の1,3-ビス[4-(ジメチルアミノ)フェニル]-2,4-ジヒドロキシシクロブテンジイリウム 二水酸化物, ビス(分子内塩)（シグマアルドリッチ社）を使用した。
　なお、上記化合物の構造は分子内塩として表記しているが、例えばハロゲン化物イオンやメタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホナート等のアニオンがカウンターイオンとして付いている形式でも良い。また、カルボン酸、スルホン酸は酸の形で表記しているが、アルカリ金属等の塩としても良い。また、分子内のカルボン酸、スルホン酸、アンモニウム基の個数を表記しているが、この数には色素骨格自体が含む酸やアンモニウム塩の数は含まない。例えば、ローダミンは色素骨格に１つのアンモニウム基を含むがこれは数えない。同様にスクアリリウムは色素骨格に四角酸とアンモニウム基を含むがこれは数えない。
　《蛍光色素と熱硬化性樹脂とをイオン結合または共有結合した変動係数15%以下の色素樹脂粒子の製造、組織染色等》
　［実施例１］（化合物１－１内包ポリメラミン粒子）
　蛍光色素として化合物１－１であるＳｕｌｆｏＲｈｏｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）１４．４ｍｇを水２２ｍＬに加えて溶解した。その後、この溶液に乳化重合用乳化剤のエマルゲン（登録商標）４３０（ポリオキシエチレンオレイルエーテル、花王社製）の５％水溶液を２ｍＬ加えた。この溶液をホットスターラー上で撹拌しながら７０℃まで昇温させた後、この溶液にメラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）を０．６５ｇ加えた。
　さらに、この溶液に界面活性剤としてドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）の１０％水溶液を１０００μＬ加え、７０℃で５０分間加熱撹拌した。その後、９０℃に昇温して２０分間加熱撹拌した。得られた色素樹脂粒子の分散液から、余剰の樹脂原料や蛍光色素等の不純物を除くため、純水による洗浄を行った。
　具体的には、遠心分離機（クボタ社製マイクロ冷却遠心機３７４０）にて２００００Ｇで１５分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散した。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン粒子はメラミン樹脂自体が骨格に多くのアミノ基を含むことから、プラス電荷となった。樹脂粒子の電荷の評価は、ＮＭＲやＩＲ等による樹脂組成分析と、ゼータ電位測定により行なった。
　得られた色素樹脂粒子０．１ｍｇをエタノール１．５ｍＬ中に分散し、アミノプロピルトリメトキシシラン（ＬＳ－３１５０、信越化学工業社製）２μＬを加え、８時間反応させることにより、樹脂粒子の樹脂表面に存在するヒドロキシル基をアミノ基に変換する表面アミノ化処理を行った。
　２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有したリン酸緩衝液生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いて、得られた色素樹脂粒子の濃度を３ｎＭに調整した。濃度調整した色素樹脂粒子の分散液に対して、終濃度１０ｍＭとなるように、ＳＭ（ＰＥＧ）１２（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－［（Ｎ－ｍａｌｅоｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄ）－ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔeｒ、サーモサイエンティフィック社製）を混合し、２０℃１時間反応させて、末端にマレイミドがついた蛍光色素を有する色素樹脂粒子を含む混合液を得た。
　この混合液を１００００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳを加えて沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による上記洗浄を３回行った。
　（ストレプトアビジンの調製）
　一方、ストレプトアビジン（和光純薬工業社製）とＮ－スクシミジル Ｓアセチルチオ酢酸（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　Ｓ－ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ、略称：ＳＡＴＡ）を用いて、ストレプトアビジンに対してチオール基の付加処理を行い、ゲル濾過を行って色素樹脂粒子に結合可能なストレプトアビジンを別途用意した。
　（樹脂粒子とストレプトアビジンの結合）
　上記色素樹脂粒子とストレプトアビジンを、２ｍＭのＥＤＴＡを含有したＰＢＳ中で混合後、室温で１時間反応させて、両者を結合させる反応を行った。反応後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加して反応を停止させた。得られた溶液をφ＝０．６５μｍの遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲル濾過カラムを用いて未反応のストレプトアビジン等を除去し、ストレプトアビジンが結合した色素樹脂粒子を得た。
　（免疫組織染色）
　この色素樹脂粒子を含む組織染色用染色剤を用いて、ヒト乳房組織の免疫染色を行った。ここで組織染色用染色剤は、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液等の緩衝液を用いた。染色切片は組織アレイスライド（コスモ・バイオ社製、品番ＣＢ－Ａ７１２）を用いた。組織アレイスライドを脱パラフィン処理後、水に置換洗浄し、１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１５分間オートクレーブ処理することで、抗原の賦活化処理を行った。抗原の賦活化処理後の組織アレイスライドを、ＰＢＳ緩衝液を用いて洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で０．０５ｎＭに稀釈した抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体（４Ｂ５）を組織切片と２時間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で稀釈したビオチン標識抗ウサギ抗体と、３０分間反応させた。さらに、上記組織染色用染色剤を用いて、すなわち上記製造したストレプトアビジンを有する色素樹脂粒子と２時間反応させ、その後洗浄を行うことにより、免疫組織化学染色切片が得られた。得られた免疫組織化学染色切片を４％中性パラホルムアルデヒド水系緩衝液に１０分間浸漬することにより、固定処理を行った。
　（形態染色）
　上記固定処理をした各免疫組織化学染色切片に対してヘマトキシリン染色を行い、染色後の切片をエタノールに浸漬することにより脱水し、脱水切片をさらにキシレンに浸漬して透徹し、封入剤で封入して風乾させることにより、二重染色切片が得られた。ヘマトキシリン染色は、後述の評価において影響はなかった。また、形態染色を行わない場合はエタノール浸漬とキシレン浸漬による透徹のみ、あるいは形態染色としてエオシン染色を追加することもできた。
　（組織像の評価）
　市販の蛍光顕微鏡を用いて色素内包樹脂粒子の蛍光組織画像を取得し、輝点計測への影響、組織像の色素にじみ、染色像の明るさについて評価した。
　なお、表２，４～７の「蛍光色素の溶出量」は、色素樹脂粒子をエタノール浸漬し、エタノール中に溶出した色素量を評価した値である。具体的には、色素樹脂粒子０．１ｍｇを１ｍＬのエタノールに浸漬してバス式超音波装置（アズワン社）で１０分間超音波を掛けた後、遠心分離をして粒子を除き、上澄み液を蛍光光度計Ｆ７０００（日立社）で測定し、予め作製した色素濃度と蛍光光度計のピーク値の検量線から、１ｍＬ中の色素量（pmol）を算出した値である。この値から、評価１：Ｈｅｒ２染色像の色素にじみを間接的に類推できる。
　また、表２中、評価１について、「○」は、蛍光色素の滲みが無いことを示し、「△」は蛍光色素の滲みがあるが輝点を認識することができることを示し、「×」は蛍光色素の滲みにより輝点が確認できないことを示す。
　また、表２中、評価２については、「◎」は、特にＨｅｒ２染色像が明るいことを示している。「○」は蛍光観察の露光条件を４００ｍｓとした場合に像に輝点が確認できることを意味し、「△」は、輝点が見えにくいことを意味し、「×」は輝点が確認できないことを意味する。
　また、表２中、評価３については、「○」は蛍光観察画像で輝点数を計測できることを意味し、「△」は計測しにくいことを意味し、「×」は計測不可能であることを意味する。なお、これらの基準は以下の表３～表７および他の例においても同様である。
　［実施例２］（化合物１－１内包ポリ尿素粒子）
　実施例１において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）０．６５ｇの代わりに、尿素樹脂原料０．８０ｇを使用した以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。本尿素樹脂は、骨格自体にアミノ基を多く含有することで樹脂がプラス電荷となった。なお、尿素樹脂原料は既存の方法により作製した、メチロール化度が４０～７０％の尿素であった。
　［実施例３］（化合物１－１内包ポリキシレン粒子）
　実施例１において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）の使用量を０．６５ｇの代わりに、キシレン樹脂原料ニカラックＹ－５０（フドー社製）０．８０ｇ、ブチルイソシアネート０．２０ｇ、および、ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）０．２０ｇを使用した点以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。本ポリキシレン樹脂は、アミノ基を多く含有することで樹脂がプラス電荷となった。
　［実施例4,7,10,13,16,19,24,27,30,34］（化合物1-2～3-2内包ポリメラミン粒子）
　実施例1において、化合物１－１を、化合物１－２（実施例４）、化合物１－３（実施例７）、化合物１－４（実施例１０）、化合物１－５（実施例１３）、化合物１－６（実施例１６）、化合物１－７（実施例１９）、化合物２－１（実施例２４）、化合物２－２（実施例２７）、化合物３－１（実施例３０）、化合物３－２（実施例３４）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　［実施例5,8,11,14,17,20,25,28,31,35］（化合物1-2～3－2内包ポリ尿素粒子）
　実施例２において、化合物１－１を、化合物１－２に変更（実施例５）、化合物１－３（実施例８）、化合物１－４（実施例１１）、化合物１－５（実施例１４）、化合物１－６（実施例１７）、化合物１－７（実施例２０）、化合物２－１（実施例２５）、化合物２－２（実施例２８）、化合物３－１（実施例３１）および化合物３－２（実施例３５）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　［実施例6,9,12,15,18,21,26,29,33,37］（化合物1-2～3-2内包ポリキシレン粒子）
　実施例３において、化合物１－１を、化合物１－２（実施例６）、化合物１－３（実施例９）、化合物１－４（実施例１２）、化合物１－５（実施例１５）、化合物１－６（実施例１８）、化合物１－７（実施例２１）、化合物２－１（実施例２６）、化合物２－２（実施例２９）、化合物３－１（実施例３３）および化合物３－２（実施例３７）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　［実施例２２］（化合物１－８内包ポリフェノール粒子）
　実施例１において、蛍光色素を化合物１－１から化合物１－８に変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業製）０．６５ｇの代わりにフェノール樹脂原料ニカノールＰＲ－１４４０Ｍ（フドー社製）０．８０ｇとフェノール０．２０ｇを用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃で５分間加熱した点以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。なお、樹脂粒子はフェノールを含むためマイナス電荷となった。
　［実施例２３］（化合物１－８内包ポリキシレン粒子）
　実施例１において、化合物１－１を化合物１－８に変更し、メラミン樹脂ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）０．６５ｇの代わりに、キシレン樹脂原料ニカノールＹ－５０（フドー社製）０．２０ｇ、フェノール樹脂原料ニカノールＰＲ－１４４０Ｍ（フドー社製）０．２０ｇ、３－（４－Hydroxyphenil）propionic Acid ０．２０ｇ、を用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃、５分間加熱した点以外は実施例１と同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。なお、本樹脂粒子は、フェニル基とカルボキシル基を有するため、マイナス電荷となった。
　［実施例３２，３６］（化合物３－１，化合物３－２内包ポリフェノール粒子）
　実施例２２において、化合物１－８を、化合物３－１（実施例３２）、化合物３－２（実施例３６）に変更した以外実施例は同様に色素樹脂粒子の作製等を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　（考察）
　蛍光色素と樹脂の電荷が逆であり、且つ、色素樹脂粒子の変動係数が１５％以下であることから、蛍光観察時の蛍光色素の滲みがほとんどなく、輝度や輝点計測の結果がよいものとなった（実施例１～３７）。
　《熱可塑性樹脂または半導体を用いて形成した蛍光色素粒子による組織染色等》
　［比較例１，２］
　実施例１で製造した色素樹脂粒子の代わりに、市販のインビトロジェン社製の末端にアミノ基が付いたポリスチレン製の色素樹脂粒子（比較例１）、末端にアミノ基が付いた市販の半導体ナノ粒子「Ｑ－ｄоｔ」（比較例２）を用いて実施例１と同様に免疫組織染色および形態染色を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　（考察）
　熱可塑性樹脂であるポリスチレン粒子に蛍光色素を固定した色素樹脂粒子であり、色素溶出が生じて組織像の評価３では色素が滲んで組織像が見えない結果となった（比較例１）。
　また、変動係数が１０％以下であっても、市販の半導体ナノ粒子である「Ｑ－ｄоｔ」では単体輝度が低いため、染色像が見えない結果となった（比較例２）。
《各種電荷の蛍光色素および熱硬化性樹脂で形成した変動係数１５％を超える色素樹脂粒子の場合》
［比較例３］（化合物１－１内包ポリメラミン粒子）
　蛍光色素として化合物１－１であるＳｕｌｆоＲｈоｄａｍｉｎｅ１０１（シグマアルドリッチ社製）２．５ｍｇを水２２．５ｍＬに加え溶解した。その後、ホットスターラー上で７０℃まで昇温させた後、メラミン樹脂ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇを加え、５分間加熱撹拌した。ギ酸１００μＬを加え、７０℃で２０分間、加熱撹拌した後、室温放冷した。冷却後、反応混合物を遠心用チューブに入れて遠心分離機に２００００Ｇで２０分間、遠心分離し、上澄み除去後、超純水を加えて超音波照射して再分散させた。遠心分離、上澄み除去および超純水への再分散による洗浄を５回繰り返した。得られたメラミン樹脂粒子は実施例１で作成した粒子と比べて、粒子の変動係数が大きい特徴を有していた。得られた色素樹脂粒子を用いて、実施例１と同様に免疫組織染色および形態染色を行った。
［比較例４］（化合物1-1内包ポリ尿素粒子）
　比較例３において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、尿素樹脂原料１．６ｇを使用した点以外は、実施例１と同様に色素樹脂粒子を製造した。なお、尿素樹脂原料は既存の方法により作製した、メチロール化度が４０～７０％の尿素である。
［比較例５］（化合物1-1内包ポリキシレン粒子）
　比較例３において、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、フェノール樹脂原料Ｋ－１００（フドー社製）０．８０ｇと3,5-Dimethylaniline０．２０ｇを使用した以外は実施例１と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。本キシレン樹脂はアミノ基を多く含有する事で樹脂がプラス電荷となった。
　［比較例6,9,12,15,18,21,26,29,32,36］（化合物1-2～3-2内包ポリメラミン粒子）
　比較例３において、化合物１－１を、化合物１－２（比較例６）、化合物１－３（比較例９）、化合物１－４（比較例１２）、化合物１－５（比較例１５）、化合物１－６（比較例１８）、化合物１－７（比較例２１）、化合物２－１（比較例２６）、化合物２－２（比較例２９）、化合物３－１（比較例３２）、化合物３－２（比較例３６）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　［比較例7,10,13,16,19,22,27,30,33,37］（化合物1-2～3-2内包ポリ尿素粒子）
　比較例４において、化合物１－１を、化合物１－２（比較例７）、化合物１－３（比較例１０）、化合物１－４（比較例１３）、化合物１－５（比較例１６）、化合物１－６（比較例１９）、化合物１－７（比較例２２）、化合物１－８（比較例２７）、化合物２－１（比較例３０）、化合物２－２（比較例３３）、化合物３－１（比較例３７）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　［比較例8,11,14,17,20,23,28,31,35,39］（化合物1-2～3-2内包ポリキシレン粒子）
　比較例５において、化合物１－１を化合物１－２（比較例８）、化合物１－３（比較例１１）、化合物１－４（比較例１４）、化合物１－５（比較例１７）、化合物１－６（比較例２０）、化合物１－７（比較例２３）、化合物２－１（比較例２８）、化合物２－２（比較例３１）、化合物３－１（比較例３５）、化合物３－２（比較例３９）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　［比較例２４］（化合物1-8内包ポリフェノール粒子）
　比較例３において、化合物１－１を化合物１－８に変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、フェノール樹脂原料ニカノールＰＲ－１４４０Ｍ（フドー社製）０．８０ｇおよびフェノール０．２０ｇを用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃で５分間加熱した点以外は比較例３と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。なお、樹脂粒子はフェノールを含み、分子全体としてマイナス電荷となった。
　［比較例２５］（化合物1-8内包ポリキシレン粒子）
　比較例３において、化合物１－１を化合物１－８に変更し、メラミン樹脂原料ニカラックＭＸ－０３５（日本カーバイド工業社製）１．５ｇの代わりに、フェノール樹脂原料ニカノールＰＲ－１４４０（フドー社製）０．８０ｇおよびフェノール０．２０ｇを用いた点、ドデシルベンゼンスルホン酸（関東化学社製）１０％水溶液を１０００μＬ添加した後の加熱撹拌（７０℃で５０分間加熱撹拌）を行わずに、９０℃、２０分間の加熱撹拌のみ行い、その後、オートクレーブにて１２５℃５分間加熱した点以外は、比較例３と同様に色素樹脂粒子の製造等を行った。なお、樹脂粒子はフェノールとカルボキシル基を含み、分子全体としてマイナス電荷となった。
　［比較例３４、３８］
　比較例２４において、化合物１－８を、化合物３－１（比較例３４）、化合物３－２（比較例３８）に変更した以外は同様に色素樹脂粒子の製造、形態染色等を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　（考察）
　蛍光色素と樹脂の電荷が逆の電荷であっても、色素樹脂粒子の粒径サイズにバラツキがあり、変動係数１５％を超える場合、輝点計測等が困難となった（比較例３～３９）。
　《無電荷の蛍光色素とプラス電荷の樹脂から形成した変動係数15%以下の色素樹脂粒子の場合》
［比較例40,43,46,49］（化合物4-1～4-4内包ポリメラミン粒子）
　実施例１において、化合物１－１を、無電荷の化合物４－１（比較例４０）、化合物４－２（比較例４３）、化合物４－３（比較例４６）、化合物４－４（比較例４９）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　すなわち、比較例４０，４３，４６，４９は、変動係数は１５％以下であるが、尿素樹脂の粒子に対して電荷を有しない蛍光色素（化合物４－１～４－４）を内包した色素樹脂粒子を製造して、免疫組織染色、形態染色および組織像の評価等を行った例である。
　［比較例41,44,47,50］（化合物4-1～4-4内包ポリ尿素粒子）
　実施例２において、化合物１－１を、無電荷の化合物４－１（比較例４１）、化合物４－２（比較例４４）、化合物４－３（比較例４７）、化合物４－４（比較例５０）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　すなわち、比較例４１，４４，４７，５０は、変動係数１５％以下であるが、ポリ尿素製の樹脂粒子に対して、電荷を有しない蛍光色素（化合物４－１～４－４）を固定した場合の例である。
　［比較例42,45,48,51］（化合物4-1～4-4内包ポリキシレン粒子）
　実施例３において、化合物１－１を、無電荷の化合物４－１（比較例４２）、化合物４－２（比較例４５）、化合物４－３（比較例４８）、化合物４－４（比較例５１）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　すなわち、比較例４２，４５，４８，５１は、変動係数１５％以下であるが、ポリキシレン製の樹脂粒子に対して、電荷を有しない蛍光色素（化合物４－１～４－４）を固定した場合の例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　（考察）
　蛍光色素が電荷を有しておらず樹脂とイオン結合しない上に、共有結合もしないことから色素溶出量が大きく、染色後の蛍光観察時の色素にじみが多くなるため、輝点計測等が困難となった（比較例４０～５１）。
　《マイナス電荷の樹脂にマイナス電荷の蛍光色素を固定した変動係数15％以下の色素樹脂粒子の場合》
［比較例52］（化合物1-1内包ポリフェノール粒子）
　実施例１において、使用したプラス電荷のポリメラミン樹脂の代わりに、蛍光色素（化合物１－１）の電荷と同じマイナス電荷を有するポリフェノール樹脂を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、ストレプトアビジンの調製および形態染色等を行った（表６参照）。
［比較例53］（化合物1-1内包ポリキシレン粒子）
　実施例１において、使用した樹脂をプラス電荷のポリメラミン樹脂の代わりにマイナス電荷のポリキシレン樹脂を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、ストレプトアビジンの調製および形態染色等を行った（表６参照）。
［比較例54,56,58,60,62,64］（化合物1-2～1-7内包ポリフェノール粒子）
　比較例５２において、化合物１－１を、化合物１－２（比較例５４）、化合物１－３（比較例５６）、化合物１－４（比較例５８）、化合物１－５（比較例６０）、化合物１－６（比較例６２）、化合物１－７（比較例６４）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　すなわち、比較例５２，５４，５８，６０，６２，６４は、変動係数は１５％以下であるが、マイナス（－）電荷のポリフェノール樹脂の粒子に対して、同一のマイナス（－）電荷を有する蛍光色素（化合物１－１～１－７）を内包させた色素樹脂粒子を製造して、免疫組織染色、形態染色および組織像の評価等を行った例である。
［比較例55,57,59,61,63,65］（化合物1-2～1-7内包ポリキシレン粒子）
　比較例５３において、化合物１－１を、化合物１－２（比較例５５）、化合物１－３（比較例５７）、化合物１－４（比較例５９）、化合物１－５（比較例６１）、化合物１－６（比較例６３）、化合物１－７（比較例６５）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　すなわち、比較例５３，５５，５７，５９，６１，６３，６５は、変動係数は１５％以下であるが、マイナス（－）電荷のポリキシレン樹脂の粒子に対して、同一のマイナス（－）電荷を有する蛍光色素（化合物１－１～１－７）を内包させた色素樹脂粒子を製造して、免疫組織染色、形態染色および組織像の評価等を行った例である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　（考察）
　蛍光色素と樹脂の電荷が同一のマイナス電荷の場合、電気的に反発し合って、蛍光色素が樹脂にイオン結合で固定されず、また、共有結合もしていないので、染色後の蛍光観察において蛍光色素の滲みが生じて、輝度や輝点の計測が困難となった（比較例５２～６５）。
　《プラス電荷の樹脂にプラス電荷の蛍光色素を固定した変動係数15％以下の色素樹脂粒子場合》
［比較例66］（化合物1-8内包ポリメラミン粒子）
　実施例１において、マイナス電荷の蛍光色素（化合物１－１）の代わりに、樹脂と同じプラス電荷の蛍光色素（化合物１－８）を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、組織染色等を行った（表７参照）。
［比較例67］（化合物1-8内包のポリ尿素粒子）
　実施例２において、化合物１－１の代わりに化合物１－８を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、組織染色等を行った（表７参照）。
［比較例68］（化合物1-8内包のポリキシレン粒子）
　実施例３において、化合物１－１の代わりに化合物１－８を用いた以外は同様に色素樹脂粒子の製造、組織染色等を行った（表７参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　（考察）
　蛍光色素と樹脂の電荷が同一のプラス電荷の場合、電気的に反発し合って、蛍光色素が樹脂にイオン結合で固定されず、染色後の蛍光観察において蛍光色素の滲みが生じて、輝度や輝点の計測が困難となった（比較例６６～６８）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　［実施例３８］（化合物１－１内包ポリメラミン粒子）
　実施例１において、色素樹脂粒子の純水による洗浄の遠心分離の時間を１５分から１０分に短縮した。また、実施例１と同様に５回の遠心分離と上澄み除去と超純水への再分散の操作の後、新たに遠心分離を１分行ない、沈殿物を取り除いた。それ以外は実施例１と同様とした。
　［実施例３９～４８］（化合物1-2～3-2内包ポリメラミン粒子）
　実施例３８において、化合物１－１を、化合物１－２（実施例３９）、化合物１－３（実施例４０）、化合物１－４（実施例４１）、化合物１－５（実施例４２）、化合物１－６（実施例４３）、化合物１－７（実施例４４）、化合物２－１（実施例４５）、化合物２－２（実施例４６）、化合物３－１（実施例４７）、化合物３－２（実施例４８）に変更した以外は同様にして色素樹脂粒子の作製等を行った。
　以上、本発明を実施の形態および実施例に基づいて説明してきたが、本発明はこれら実施例等に限定されず、特許請求の範囲に記載された本発明の要旨を逸脱しない限り、設計変更等は許容される。

Claims (14)

  1. 　熱硬化性樹脂の樹脂粒子および該樹脂粒子に固定された蛍光色素を有する色素樹脂粒子を染色成分として含有する組織染色用染色剤であって、
    　前記樹脂粒子が前記蛍光色素と逆の電荷の置換基を有して前記蛍光色素とイオン結合、または、共有結合しており、
    　前記色素樹脂粒子の粒径の変動係数が１５％以下である、組織染色用染色剤。
  2. 　前記蛍光色素が前記樹脂粒子に内包されている、請求項１に記載の組織染色用染色剤。
  3. 　前記イオン結合に寄与している置換基が、前記蛍光色素はマイナス電荷の置換基であり、前記樹脂粒子はプラス電荷の置換基である、請求項１または２に記載の組織染色用染色剤。
  4. 　前記蛍光色素全体の電荷および前記樹脂粒子全体の電荷が、前記イオン結合に寄与している置換基の電荷と同一の電荷である、請求項１～３いずれか１項に記載の組織染色用染色剤。
  5. 　前記蛍光色素は、蛍光色素１分子の分子量／電荷を有する置換基数＜４００である、請求項１～４のいずれか１項に記載の組織染色用染色剤。
  6. 　前記蛍光色素は、蛍光色素１分子あたりにマイナス電荷の置換基を少なくとも２つ有する、請求項３～５いずれか１項に記載の組織染色用染色剤。
  7. 　前記プラス電荷の置換基がアミノ基であり、
    　前記マイナス電荷の置換基がスルホ基またはカルボキシル基である、請求項１～６のいずれか１項に記載の組織染色用染色剤。
  8. 　前記蛍光色素のマイナス電荷の置換基の少なくとも１つがスルホ基である、請求項６または７に記載の組織染色用染色剤。
  9. 　前記蛍光色素が、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、スクアリリウムまたは芳香族炭化水素系色素分子である、請求項１～８のいずれか１項に記載の組織染色用染色剤。
  10. 　前記樹脂粒子がメラミンを用いて形成され、前記蛍光色素がローダミンまたは芳香族炭化水素系色素分子である、請求項９に記載の組織染色用染色剤。
  11. 　前記樹脂粒子と前記蛍光色素とが、アミド結合、エステル結合、エーテル結合およびＣ－Ｎ結合のいずれかによって共有結合している、請求項１または２に記載の組織染色用染色剤。
  12. 　前記熱硬化性樹脂が、メラミン、尿素、グアナミン、フェノール、キシレンおよびこれらの誘導体からなる群から選択された少なくとも１つのモノマーから形成される構成単位を含み、かつその構成単位に含まれる水素の少なくとも一部が電荷を有する置換基に置き換えられている、請求項１～９および１１のいずれか１項に記載の組織染色用染色剤。
  13. 　前記樹脂粒子を合成反応により製造する際の反応系に界面活性剤を添加することにより前記色素樹脂粒子の変動係数を１５％以下とする工程を含む、組織染色用染色剤の製造方法。
  14. 　請求項１～１２の何れか１項に記載の組織染色用染色剤を構成品として含む、組織染色用キット。
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