WO2014186854A1 - Processo de obtenção de fio de sutura enriquecido com celulas-tronco, fios obtidos, kit de sutura e seus usos - Google Patents

Processo de obtenção de fio de sutura enriquecido com celulas-tronco, fios obtidos, kit de sutura e seus usos Download PDF

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culture
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Joaquim Murray Bustorf SILVA
Bruno Bosch VOLPE
Ângela Cristina Malheiros LUZO
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    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/64—Animal cells

Definitions

  • the present invention is a process for obtaining stem cell enriched suture, obtained suture, suture kit and its uses.
  • the present invention has application in treatment, recovery and healing and may be employed in surgical procedures, such as plastic surgery and gastrointestinal fistulas, burns, fistulas in Crohn's disease patients, among others.
  • Gastrointestinal fistulas are an abnormal communication between two epithelialized surfaces, through which drainage of digestive secretion (debit) occurs. Its onset represents a series of complications for the patient, and there are few surgical problems that need more attention than gastrointestinal fistulas. Its onset may occur due to poor surgical technique or as an evolution of inflammatory bowel diseases, especially in patients with Crohn's disease. Gastrointestinal fistulas cause a series of disorders to the patient, such as hydroelectrolytic disorders, infections, sepsis, skin lesions, malnutrition, digestive hemorrhage, intestinal obstruction, among others. The severity of all these disorders depends on a number of issues such as etiology, type of fistula, anatomical location, fistula output (amount and quality of fluid lost) and age of the patient.
  • the thread used by them was only 4 cm, being efficient in some situations but not for large sutures, because it is small in size.
  • the suture thread of the present invention is 30 cm and is considered a large size suture thread. This way it can be used in various areas that want to heal and recover the site faster and more efficiently.
  • the technique had a suture enriched with mesenchymal cells capable of assisting in the treatment, recovery and healing of patients with fistula, transfer mesenchymal stem cells to the site of injury, causing recovery and healing. advanced because these cells release immunomodulation factors.
  • the thread can be used in various types of fistulas and can still be useful in healing other types of diseases, such as burns, diabetic wounds, plastic surgery, among others.
  • the present invention is a process for obtaining stem cell enriched suture, obtained suture, suture kit and its uses.
  • the obtained threads and the suture kit help in the treatment, recovery and healing and can be used in surgical procedures, such as plastic surgery and gastrointestinal fistulas, burns, fistulas in Crohn's disease patients, among others.
  • Figure 1 represents the statistical analysis comparing the three groups of the in vivo test (control, injection and wires) in relation to the evolution of the fistula area on the day of operation until the 21st day.
  • Figure 2 represents the statistical analysis comparing the evolution of the fistula area in the three in vivo test groups (control, injection and wires) on days 0, 12 and 21.
  • Figure 3 is an immunofluorescence confocal microscopy image.
  • A Control suture, without staining, showing the absence of cells.
  • B Control of marked cells (green).
  • C Arrow points to the suture wrapped by a large number of cells, 10x magnification
  • D Arrow points to the suture wrapped by a large number of cells, 20x magnification
  • Figure 4 represents a scanning electron microscopy image.
  • B: The arrows and the red bow show the action of fibrin glue forming a cell layer along the wire.
  • Figure 5 is an image of a fistula control group animal.
  • A First day of fistula formation and well-infected region.
  • B 21st day, region is almost healed and with localized infection.
  • Figure 6 is an image of a fistula control group animal.
  • A First day of fistula formation and well-infected region.
  • B 21st day, fistula healing did not occur and region is well infected with high stool output.
  • Figure 7 is an image of a fistula control group animal.
  • A First day of fistula formation and no site infection.
  • B Day 21, the healing of the fistula was almost complete and the presentation of a small infection site.
  • Figure 8 is an image of an animal from the group presenting with fistula and mesenchymal cell application.
  • Figure 9 is an image of an animal of the group using the present invention.
  • A First day of fistula formation and small site infection with low stool output.
  • B 21st day, the healing of the fistula was practically complete and the presentation of a small infection site.
  • Figure 10 is an image of an animal of the group using the present invention.
  • A First day of fistula formation and small site infection with low stool output.
  • B Day 21, the healing of the fistula was complete and the circle shows the area where the fistula was.
  • the present invention is a process for obtaining stem cell enriched suture, obtained suture, suture kit and its uses.
  • the process for obtaining enriched suture comprises the following steps:
  • the ratio of thrombin, calcium chloride solution and fibrinogen is variable from 4-6: 0.5-1, 5: 1 -3, preferably from 3: 1: 2.
  • the concentration of the calcium chloride solution is preferably 40umol / ml.
  • Stem cells used in step (b) can be selected from adipose tissue, umbilical cord blood and bone marrow mesenchymals. Stem cell concentration varies between 1x10 5 and 2x10 6 , preferably 1x10 6 .
  • Culture medium can be selected from group 199 medium, MEM medium, RPMI medium, Dulbecco MEM medium, HAM F-12 nutrient, Leibowitz L-15 medium, HAM F-10 nutrient, SOL. BAI. From Hanks, half Alpha MEM, half Glasgow, half DMEM / HAM F-12, half RPMI 1640 with Hepes, half DMEM, half Schneider's, half TC-100, CTS, MesenCult SF Culture Kit and MesenCult XF Medium.
  • Step (e) is dispensed with if the selected culture medium is
  • the serum may be selected from the group of inactivated fetal bovine serum (10-bio100i) (FBS), fetal bovine serum (10-bio100i) (FBS), sterile equine serum, calf serum (NCS) and human serum.
  • FBS inactivated fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • NCS sterile equine serum
  • NCS calf serum
  • 4-0 Poly Vicryl J-304 Polyiglactin 910 Ethicon® suture sutures were used.
  • the wires were opened into the laminar flow, then cut to a size of approximately 30 cm and placed in petri dishes (1 wire per plate).
  • the fibrin glue used was prepared within the laminar flow with the following proportions: 20uL of fibrinogen, 30uL of thrombin and 10ul of calcium chloride.
  • confocal immunofluorescence microscopy To confirm the presence of cells adhered to the surface of the wire and between the filaments of the wire, confocal immunofluorescence microscopy and scanning electron microscopy were performed. In confocal immunofluorescence microscopy, the technique used was Live and Dead ® .
  • the suture kit comprises the following components:
  • the ratio of thrombin, calcium chloride solution and fibrinogen is variable from 4-6: 0.5-1, 5: 1 -3, preferably from 3: 1: 2.
  • the concentration of the calcium chloride solution is preferably 40umol / ml.
  • Culture medium can be selected from group 199 medium, MEM medium, RPMI medium, Dulbecco MEM medium, HAM F-12 nutrient, Leibowitz L-15 medium, HAM F-10 nutrient, SOL. BAI. From Hanks, half Alpha MEM, half Glasgow, half DMEM / HAM F-12, half RPMI 1640 with Hepes, half DMEM, half Schneider's, half TC-100, CTS, MesenCult SF Culture Kit and MesenCult XF Medium.
  • the serum may be selected from the group of inactivated fetal bovine serum (10-bio100i) (FBS), fetal bovine serum (10-bio100i) (FBS), sterile equine serum, calf serum (NCS) and human serum.
  • FBS inactivated fetal bovine serum
  • FBS fetal bovine serum
  • NCS sterile equine serum
  • human serum human serum
  • Stem cells is an optional component of the kit.
  • Group 1 control had 5 cecal fistula animals without any treatment and were observed for 21 days.
  • Group 2 cell injection had 8 animals with caecal fistula, received injection of 1 x 10 6 mesenchymal stem cells of adipose tissue around the cecal fistula and were observed for 21 days.
  • Group 3 suture of the present invention had 9 cecal fistula animals, had the cecal fistula sutured with the suture of the present invention containing 1 x 10 6 adhered adipose mesenchymal stem cells, and were observed for 21 days.
  • Mesenchymal stem cells are cells capable of self-renewal and differentiation in several cell lines. Recent advances in the use of stem cells have provided a new modality within medicine, which is the use of stem cells in cell therapy.
  • Stem cells were obtained from fat from patients who underwent the liposuction procedure.
  • Table 1 Control group - Evolution of fistula area and average percentage of reduction of areas. The control animals did not have any support.
  • Table 2 Cell Injection Group - Evolution of fistula area and average percentage of reduction of areas. Animals in the cell injection group received an injection of 1x10 6 mesenchymal stem cells around the fistula.
  • Table 3 Suture thread group of the present invention - Evolution of the fistula area and mean percentage reduction of the areas.
  • the animals in this group received a suture containing 1 x 10 6 mesenchymal stem cells.

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Abstract

A presente invenção trata-se de um processo de obtenção de fio de sutura enriquecido com células-tronco, fio de sutura obtido, kit de sutura e seus usos. Os fios obtidos e o kit de sutura auxiliam no tratamento, recuperação e cicatrização e podem ser empregados em procedimentos cirúrgicos, como por exemplo, em cirurgias plásticas e em fístulas gastrointestinais, queimaduras, fístulas em pacientes com doença de Crohn, entre outras. O fio e o kit de sutura podem ser utilizados em diversos tipos de fístulas e ainda podem ser útil em cicatrização de outros tipos de enfermidades, como, queimaduras, feridas de diabéticos, em cirurgias plásticas, entre outras.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE FIO DE SUTURA ENRIQUECIDO COM CÉLULAS-TRONCO, FIOS OBTIDOS, KIT DE SUTURA E SEUS USOS Campo da invenção
A presente invenção trata-se de um processo de obtenção de fio de sutura enriquecido com células-tronco, fio de sutura obtido, kit de sutura e seus usos.
A presente invenção tem aplicação no tratamento, recuperação e cicatrização e podem ser empregados em procedimentos cirúrgicos, como por exemplo, em cirurgias plásticas e em fístulas gastrointestinais, queimaduras, fístulas em pacientes com doença de Crohn, entre outras.
Fundamentos da invenção
As fístulas gastrointestinais são uma comunicação anormal entre duas superfícies epitelizadas, através do qual ocorre drenagem de secreção digestiva (débito). O seu surgimento representa uma série de complicações para o paciente, sendo que existem poucos problemas cirúrgicos que necessitem de mais atenção do que as fístulas gastrointestinais. O seu surgimento pode ocorrer por má técnica cirúrgica ou como evolução de doenças inflamatórias intestinais, principalmente em pacientes com Doença de Crohn. As fístulas gastrointestinais acarretam uma série de transtornos ao paciente, como, distúrbios hidroeletrolíticos, infecções, sepse, lesões cutâneas, desnutrição, hemorragia digestiva, obstrução intestinal, entre outras. A gravidade de todos esses transtornos depende de uma série de questões como etiologia, tipo de fístula, localização anatómica, débito da fístula (quantidade e qualidade do líquido perdido) e idade do paciente.
Os tratamentos convencionais que existem hoje (controle nutricional do paciente, tratamento medicamentoso e cirurgia) para auxiliar recuperação e cicatrização de pacientes com fístulas enterocutaneas não apresentam bons índices de recuperação do paciente, sendo que em muitos pacientes a fístula leva de 3 a 8 semanas para sua cicatrização e ainda existem chances dessa fístula voltar a abrir. Damián García-Olmo, et al. (2005) testaram o tratamento de fístulas em pacientes com doença de Crohn com o transplante de células tronco mesenquimais derivadas de tecido adiposo. O grupo injetou de 3 a 30 x 106 células (dependendo do tempo da cultura utilizada) ao redor do local da fístula. Foram tratadas 9 pacientes com diferentes tipos de fístulas. 66% das fístulas foram consideradas curadas com 8 semanas de tratamento, 22% não fecharam e continuaram abertas e 11 % não puderam ser avaliadas por serem consideradas inadequadas para o tratamento.
Quanto à adesão de células em fios de sutura, Jacques P. Guyette, et al. (2012) aderiram células tronco mesenquimais humanas em suturas biológicas. Os fios de sutura utilizados eram de 4 cm e foram colocados dentro de um tubo de Silastic® onde foram adicionadas 1 x 106 células em suspenção. O crescimento e adesão das células foram observados depois de 24 horas. Foram realizadas imagens de microscopia confocal de imunufluorescência com coloração Hoechst e Phalloidin para comprovar a adesão das células. Os resultados demonstraram que ficaram aderidas em média 1 1.806 células tronco mesenquimais em cada fio de sutura de 2cm. Os fios enriquecidos com células tronco mesenquimais foram testados em coração de ratos. O grupo comparou a eficiência do fio enriquecido junto com um grupo de injeção das células diretamente no local. Como resultado o grupo animal onde foi utilizado o fio com células teve uma maior transferência de células para o local da lesão.
Comparando-se o estudo do grupo acima com o objeto da presente invenção as imagens de microscopia demonstram que há um número muito maior de células aderidas quando utilizamos a cola de fibrina. O fio utilizado por eles era de apenas 4 cm, sendo eficiente em algumas situações mais não para suturas grandes, por ser de tamanho pequeno. O fio de sutura da presente invenção tem 30 cm sendo um fio considerado de tamanho grande para suturas. Desta forma ele pode ser utilizado em várias áreas que pretendem ter uma cicatrização e recuperação do local de forma mais rápida e eficiente. Diante do exposto seria útil se a técnica dispusesse de um fio de sutura enriquecido com células mesenquimais capaz de auxiliar no tratamento, recuperação e cicatrização de pacientes com fístulas, transferir células tronco mesenquimais para o local da lesão, fazendo com que haja uma recuperação e cicatrização de forma avançada por essas células liberarem fatores de imunomodulação. O fio pode ser utilizado em diversos tipos de fístulas e ainda pode ser útil em cicatrização de outros tipos de enfermidades, como, queimaduras, feridas de diabéticos, em cirurgias plásticas, entre outras.
Breve descrição da invenção
A presente invenção trata-se de um processo de obtenção de fio de sutura enriquecido com células-tronco, fio de sutura obtido, kit de sutura e seus usos.
Os fios obtidos e o kit de sutura auxiliam no tratamento, recuperação e cicatrização e podem ser empregados em procedimentos cirúrgicos, como por exemplo, em cirurgias plásticas e em fístulas gastrointestinais, queimaduras, fístulas em pacientes com doença de Crohn, entre outras.
Breve descrição das figuras
A Figura 1 representa a análise estatística comparando-se os três grupos do teste in vivo (controle, injeção e fios) em relação à evolução da área da fístula no dia da operação até o 21º dia.
A Figura 2 representa a análise estatística comparando-se a evolução da área da fístula nos três grupos do teste in vivo (controle, injeção e fios) nos dias 0, 12 e 21.
A Figura 3 representa uma imagem de microscopia confocal de imunofluorescência. A: Fio de sutura controle, sem coloração, demostrando a ausência de células. B: Controle de células marcadas (verde). C: A seta aponta o fio de sutura envolvido por um grande número de células, aumento 10x D: A seta aponta o fio de sutura envolvido por um grande número de células, aumento 20x. A Figura 4 representa uma imagem de microscopia eletrônica de varredura. A: As setas amarelas mostram algumas células em cima e entre os filamentos do fio de sutura. B: As setas e o arco vermelho mostram a ação da cola de fibrina formando uma camada celular ao longo do fio.
A Figura 5 representa uma imagem de um animal do grupo controle com fístula. A: Primeiro dia da formação da fístula e a região bem infeccionada. B: 21 º dia, região está quase cicatrizada e com infecção localizada.
A Figura 6 representa uma imagem de um animal do grupo controle com fístula. A: Primeiro dia da formação da fístula e a região bem infeccionada. B: 21 º dia, a cicatrização da fístula não ocorreu e região está bem infeccionada com alto débito de fezes.
A Figura 7 representa uma imagem de um animal do grupo controle com fístula. A: Primeiro dia da formação da fístula e sem infecção no local. B: 21 º dia, a cicatrização da fístula foi quase total e apresentação de um pequeno quadro de infecção no local.
A Figura 8 representa uma imagem de um animal do grupo que apresenta fístula e houve aplicação de células mesenquimais. A: Primeiro dia da formação da fístula e pequena infecção no local com baixo débito de fezes. B: 21 º dia, a cicatrização da fístula foi praticamente total e apresentação de um pequeno quadro de infecção no local.
A Figura 9 representa uma imagem de um animal do grupo com utilização da presente invenção. A: Primeiro dia da formação da fístula e pequena infecção no local com baixo débito de fezes. B: 21 º dia, a cicatrização da fístula foi praticamente total e apresentação de um pequeno quadro de infecção no local.
A Figura 10 representa uma imagem de um animal do grupo com utilização da presente invenção. A: Primeiro dia da formação da fístula e pequena infecção no local com baixo débito de fezes. B: 21 º dia, a cicatrização da fístula foi total e o círculo demonstra a área onde estava a fístula.
Descrição detalhada da invenção A presente invenção trata-se de um processo de obtenção de fio de sutura enriquecido com células-tronco, fio de sutura obtido, kit de sutura e seus usos.
O processo de obtenção de fio de sutura enriquecido compreende as seguintes etapas:
a) Gotejamento de trombina e cloreto de cálcio por toda a extensão do fio de sutura;
b) Gotejamento de células-tronco;
c) Gotejamento de fibrinogênio;
d) Adição de meio de cultura suficiente para recobrimento do fio de sutura;
e) Adição de 10% soro em relação à quantidade de meio de cultura adicionado, e
f) Manter por um período variável entre 2 e 24 horas em estufa de CO2 para cultivo celular.
A proporção entre trombina, solução de cloreto de cálcio e fibrinogênio é variável entre 4-6:0,5-1 ,5:1 -3, preferencialmente de 3:1 :2.
A concentração da solução de cloreto de cálcio é preferencialmente 40umol/mL.
As células-tronco utilizadas na etapa (b) podem ser selecionadas entre mesenquimais de tecido adiposo, de sangue de cordão umbilical e medula óssea. A concentração de células-tronco é variável entre 1x105 e 2x106, preferencialmente 1x106.
O meio de cultura pode ser selecionado do grupo meio 199, meio MEM, meio RPMI, meio Dulbecco MEM, nutriente HAM F-12, meio Leibowitz L- 15, nutriente HAM F-10, SOL. BAI. De Hanks, meio MEM Alfa, meio Glasgow, meio DMEM/HAM F-12, meio RPMI 1640 com Hepes, meio DMEM, meio Schneider's, meio TC-100, CTS, MesenCult SF Culture Kit e MesenCult XF Médium.
A etapa (e) é dispensada se o meio de cultura selecionado for
CTS, MesenCult SF Culture Kit e MesenCult XF Médium. O soro pode ser selecionado do grupo soro fetal bovino inativado (10-bio100i) (FBS), soro fetal bovino (10-bio100) (FBS), soro equino estéril, soro de vitelo (NCS) e soro humano. No exemplo de concretização da presente invenção foram utilizados fios de sutura 4-0 Poly Vicryl J-304 Poliglactina 910 Ethicon®. Os fios foram abertos dentro do fluxo laminar, em seguida foram cortados em um tamanho de aproximadamente 30cm e colocados em placas de petri (1 fio por placa). A cola de fibrina utilizada foi preparada dentro do fluxo laminar com as seguintes proporções: 20uL de fibrinogênio, 30uL de trombina e 10ul_ de cloreto de cálcio.
O efeito da formação da cola é muito rápido, desta forma, para facilitar no manuseio adicionamos 30uL de trombina com os 10uL de cloreto de cálcio e somente após toda a preparação do fio e o gotejamento das células sobre o fio, adicionamos os 20uL de fibrinogênio para finalizar o procedimento.
Após 24 horas as placas contendo fios com células aderidas foram observadas em microscopia confocal para confirmação da presença de células.
Para a confirmação da presença de células aderidas na superfície do fio e entre os filamentos do fio foram realizados as análises de microscopia confocal de imunofluorescência e microscopia eletrônica de varredura. Na microscopia confocal de imunofluorescência a técnica utilizada foi a Live and Dead®.
O kit de sutura compreende os seguintes componentes:
- fio de sutura;
- trombina e cloreto de cálcio;
- fibrinogênio;
- meio de cultura, e
- soro.
A proporção entre trombina, solução de cloreto de cálcio e fibrinogênio é variável entre 4-6:0,5-1 ,5:1 -3, preferencialmente de 3:1 :2. A concentração da solução de cloreto de cálcio é preferencialmente 40umol/ml_.
O meio de cultura pode ser selecionado do grupo meio 199, meio MEM, meio RPMI, meio Dulbecco MEM, nutriente HAM F-12, meio Leibowitz L- 15, nutriente HAM F-10, SOL. BAI. De Hanks, meio MEM Alfa, meio Glasgow, meio DMEM/HAM F-12, meio RPMI 1640 com Hepes, meio DMEM, meio Schneider's, meio TC-100, CTS, MesenCult SF Culture Kit e MesenCult XF Médium.
O soro pode ser selecionado do grupo soro fetal bovino inativado (10-bio100i) (FBS), soro fetal bovino (10-bio100) (FBS), soro equino estéril, soro de vitelo (NCS) e soro humano.
Células-tronco é um componente opcional do kit.
Testes in vivo
Foi realizado um estudo comparativo in vivo com 3 grupos de ratos. O grupo 1 (controle) possuía 5 animais com fístula cecal, sem nenhum tipo de tratamento e foram observados por 21 dias. O grupo 2 (injeção de células) possuía 8 animais com fístula cecal, receberam injeção de 1 x106 células tronco mesenquimais de tecido adiposo ao redor da fístula cecal e foram observados por 21 dias. O grupo 3 (fio de sutura da presente invenção) possuía 9 animais com fístula cecal, tiveram a fístula cecal suturadas com fio de sutura da presente invenção contendo 1 x106 células tronco mesenquimais de tecido adiposo aderidas, e foram observados por 21 dias.
Foram realizadas fotos nos dias 3, 6, 9, 12, 15, 17, 19 e 21. O programa ImageJ (Image Processing and Analysis in Java) foi utilizado para o levantamento das áreas das fístulas de cada animal.
A média de cicatrização e fechamento da fístula pelo ponto de visto das áreas das fístulas foi de 46,54% no grupo 1 , 71 ,80% no grupo 2 e 90,34% no grupo 3. Os resultados demonstraram que a recuperação dos animais que a presente invenção foi aplicada (grupo 3) foi mais efetiva que os demais grupos.
Exemplos A adesão das células foi testada em outros tipos de fios de sutura e sem a ajuda da cola de fibrina.
Em todos os tipos de fio a adesão das células foi semelhante. A escolha pelo 4-0 Poly Vicryl J-304 Poliglactina 910 Ethicon® ocorreu, pois este tipo de fio de sutura já é amplamente utilizado em cirurgias e seu uso está liberado pela Anvisa há muitos anos.
A adesão das células aos fios de sutura sem cola de fibrina não foi efetiva, já que a manipulação do fio fazia com que uma grande quantidade de células se desgrudasse do fio. A cola de fibrina fez com essas células ficassem aderidas em grande quantidade ao fio e fez com que não houvesse perda efetiva de células durante seu manuseio.
As células tronco mesenquimais são células com capacidade de auto-renovação e diferenciação em diversas linhagens celulares. Os recentes avanços na utilização de células-tronco propiciaram uma nova modalidade dentro da medicina que é a utilização das células tronco na terapia celular.
As células-tronco foram obtidas de gordura de pacientes que passaram pelo procedimento de lipoaspiração.
Tabela 1 : Grupo controle - Evolução da área da fístula e porcentagem média da redução das áreas. Os animais do grupo controle não tiveram nenhum tipo de suporte.
Figure imgf000009_0001
Tabela 2: Grupo Injeção de células - Evolução da área da fístula e porcentagem média da redução das áreas. Os animais do grupo injeção de células receberam uma injeção de 1x106 células tronco mesenquimais ao redor da fístula.
Figure imgf000010_0001
Tabela 3: Grupo fio de sutura da presente invenção - Evolução da área da fístula e porcentagem média da redução das áreas. Os animais deste grupo receberam um fio de sutura contendo 1 x106 células tronco mesenquimais.
Figure imgf000010_0002

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Processo de obtenção de fio de sutura enriquecido caracterizado por compreender as seguintes etapas:
a) Gotejamento de trombina e cloreto de cálcio por toda a extensão do fio de sutura;
b) Gotejamento de células-tronco;
c) Gotejamento de fibrinogênio;
d) Adição de meio de cultura suficiente para recobrimento do fio de sutura;
e) Adição de 10% soro em relação à quantidade de meio de cultura adicionado, e
f) Manter por um período variável entre 2 e 24 horas em estufa de CO2 para cultivo celular.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da proporção entre trombina, cloreto de cálcio e fibrinogênio ser variável entre 4-
6:0,5-1 ,5:1 -3, preferencialmente de 3:1 :2.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da concentração da solução de cloreto de cálcio ser preferencialmente 40umol/mL.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato das células-tronco poderem ser selecionadas entre mesenquimais de tecido adiposo, de sangue de cordão umbilical e medula óssea.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da concentração de células-tronco ser variável entre 1 x105 e 2x106, preferencialmente 1 x106.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato do meio de cultura poder ser selecionado do grupo meio 199, meio MEM, meio RPMI, meio Dulbecco MEM, nutriente HAM F-12, meio Leibowitz L-15, nutriente HAM F-10, SOL. BAI. De Hanks, meio MEM Alfa, meio Glasgow, meio DMEM/HAM F-12, meio RPMI 1640 com Hepes, meio DMEM, meio Schneider's, meio TC- 100, CTS, MesenCult SF Culture Kit e MesenCult XF Médium.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato da etapa (e) ser dispensada se o meio de cultura selecionado for CTS, MesenCult SF Culture Kit e MesenCult XF Médium.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato do soro poder ser selecionado do grupo soro fetal bovino inativado (10-bio100i) (FBS), soro fetal bovino (10-bio100) (FBS), soro equino estéril, soro de vitelo (NCS) e soro humano.
9. Fio de sutura caracterizado por ser enriquecido de acordo com as reivindicações de 1 a 8.
10. Uso do fio de sutura conforme descrito na reivindicação 9 caracterizado por ser aplicável em suturas de qualquer natureza.
11. Kit de sutura caracterizado por compreender os seguintes componentes:
- fio de sutura;
- trombina e cloreto de cálcio;
- fibrinogênio;
- meio de cultura, e
- soro.
12. Kit de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato da proporção entre trombina, cloreto de cálcio e fibrinogênio ser variável entre 4-6:0,5-1 ,5:1 - 3, preferencialmente de 3:1 :2.
13. Kit de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato da concentração da solução de cloreto de cálcio ser preferencialmente 40umol/mL.
14. Kit de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato do meio de cultura poder ser selecionado do grupo meio 199, meio MEM, meio RPMI, meio
Dulbecco MEM, nutriente HAM F-12, meio Leibowitz L-15, nutriente HAM F-10, SOL. BAI. De Hanks, meio MEM Alfa, meio Glasgow, meio DMEM/HAM F-12, meio RPMI 1640 com Hepes, meio DMEM, meio Schneider's, meio TC-100, CTS, MesenCult SF Culture Kit e MesenCult XF Médium.
15. Kit de acordo com a reivindicação 11 caracterizado pelo fato do soro poder ser selecionado do grupo soro fetal bovino inativado (10-bio100i) (FBS), soro fetal bovino (10-bio100) (FBS), soro equino estéril, soro de vitelo (NCS) e soro humano.
16. Kit de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por ser um componente opcional células-tronco.
17. Uso do kit de sutura conforme descrito nas reivindicações de 11 a 16 caracterizado por ser aplicável em suturas de qualquer natureza.
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