WO2014189201A1 - Pink1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Pink1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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문영미
손혜진
양은지
김은경
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating autoimmune diseases including PINK1 (PTEN-induced kinase 1) protein or a polynucleotide encoding the same as an active ingredient.
  • PINK1 PTEN-induced kinase 1
  • Immunity is one of the body's self-protective systems against all foreign polymers (antigens) that invade or are injected into living tissue.
  • the main component of the immune system is lymphocytes, which are white blood cells that are made in the bone marrow and circulate along the blood into lymph tissues and organs, mainly lymph node spleen and tonsils.
  • lymphocytes white blood cells that are made in the bone marrow and circulate along the blood into lymph tissues and organs, mainly lymph node spleen and tonsils.
  • B cells multiply rapidly when stimulated by an appropriate antigen, forming a clone that produces a special antibody (immunoglobulin) that neutralizes that antigen, and the antibodies that B cells produce circulate in body fluids.
  • Humoral immunity is performed.
  • T cells are produced in the thymus and migrate to lymphoid tissue, responsible for cell-mediated immunity that directly attacks antigens.
  • autoimmune diseases are diseases caused by abnormal reactions to magnetic cells
  • drugs mainly for suppressing autoimmune function are used.
  • many side effects are difficult to use continuously and do not sufficiently prevent relapses, so there is a limit to treatment for cure.
  • beta interferon is used, but the side effects are less expensive, the treatment costs are high, the life-long injection is inconvenient, and the effect of preventing recurrence is minimal.
  • the method of inhibiting the interaction between cells by the antibody administration to CD40 ligand, etc. has been used, but not very successful.
  • immunotherapies There are many other immunotherapies, but no one has yet been proven to show definite therapeutic efficacy.
  • autoimmune diseases can be effectively treated and harmless to the human body, there is a need for research on a therapeutic agent without side effects.
  • PINK1 protein inhibits the activity of Th17, promotes the activity of regulatory T cells (Treg), Treg cells
  • Treg regulatory T cells
  • compositions for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising PINK1 protein as an active ingredient.
  • It is also an object of the present invention to provide a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising a polynucleotide encoding a PINK1 protein and a recombinant vector operably linked to the polynucleotide as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising PINK1 protein as an active ingredient.
  • the PINK1 protein may have an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the PINK1 protein may be to inhibit or reduce the activity of Th17 or to promote or increase the activity of regulatory T cells.
  • the PINK1 protein may be to reduce osteoclast differentiation or to inhibit the invasion of inflammatory cells.
  • the present invention also provides a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising a polynucleotide encoding PINK1 protein as an active ingredient.
  • the polynucleotide may have a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases comprising a recombinant vector operably linked to a polynucleotide encoding the PINK1 protein of the present invention as an active ingredient.
  • the autoimmune disease may be selected from the group consisting of rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, gastrointestinal diabetes, atopic dermatitis, autoimmune encephalomyelitis, asthma and Crohn's disease.
  • the present invention is characterized by providing a composition for the prevention or treatment of autoimmune diseases comprising PINK1 protein as an active ingredient.
  • PINK1 protein is a gene of autosomal recessive familiar PD and is expressed in both neurons and glial cells and is known to be effective in preventing diseases such as cancer and type 1 diabetes.
  • diseases such as cancer and type 1 diabetes.
  • autoimmune diseases there is no literature on the use of autoimmune diseases. None known.
  • PINK1 protein has an effect of regulating Treg function by increasing autodigestion in Treg cells.
  • the arthritis index and the incidence index were measured in the arthritis model.
  • the arthritis index and the onset index were markedly suppressed, and the proliferative activity of T cells was suppressed in the lymph node cells of the PINK1 injected group (FIGS. 1A and FIG. 1b).
  • hematoxylin and eosin staining, toluidin blue and safranin O staining to analyze the degree of arthritis improvement according to PINK1 protein treatment
  • the joints of the control group not treated with the PINK1 protein were destroyed and the inflammatory cells were infiltrated.
  • the experimental animal group injected with the PINK1 protein of the present invention had reduced osteoclast differentiation compared to the control group.
  • PINK1 protein As a result of analyzing the expression of inflammatory cytokines in the joint tissues according to the treatment of PINK1 protein, IL-17, IL-6, IL-1b and TNF in the joint tissue of the PINK1 injection group of the present invention
  • Expression of inflammatory cytokines such as-was significantly inhibited compared to the control group, suggesting that PINK1 protein can regulate the activity of inflammatory cytokines in autoimmune arthritis diseases (see Figure 3).
  • a flow cytometry FACS, fluorescence-activated cell sorter
  • splenocytes of an arthritis mouse animal model to confirm the co-regulation effect of Th17 and Treg cells according to the treatment of PINK1 protein
  • FACS fluorescence-activated cell sorter
  • Th17 cells were reduced by more than half and Treg cells were nearly doubled (see FIGS. 4A and 4B), from which PINK1 protein can simultaneously regulate the activity of Th17 / Treg cells. It can be seen.
  • Th17 cells which are pathogenic cells in the spleen of mice treated with PINK1 protein, are significantly inhibited compared to the control arthritis experimental animals.
  • the expression of Treg cells in the spleen of the mouse treated with PINK1 protein is significantly increased compared to the control arthritis experimental animals
  • Expression of Foxp3 and SOCS3 genes, which are representative transcription factors of Treg cells was also increased, and the expression of phosphorylated STAT5, which is a transcription factor of Treg cells, was significantly increased in the PINK1 injection group (see FIGS. 6A to 6C).
  • the cells injected with the PINK1 gene significantly inhibited the expression of TNF- according to the conA response.
  • FIG. 7 it can be seen from the in vitro efficacy evaluation that PINK1 protein can directly regulate the expression of inflammatory cytokines.
  • confocal microscopy of the autophagy expressed in Th17 and Treg cells in the group injected with PINK1 protein to the splenocytes of the mouse and the control group not injected with the PINK1 protein Compared with Th17 cells, expression of LC3 and coxIV was increased in splenic Treg cells of mice injected with PINK1 protein, and these markers of Treg cells were activated (see FIG. 8).
  • the PINK1 protein of the present invention increases autodigestion in Treg cells to regulate Treg function to prevent or treat autoimmune diseases. It could be used to
  • the PINK1 protein of the present invention or the polynucleotide encoding the protein has an activity of increasing autophagy in Treg cells, thereby promoting autoimmune diseases through the action of promoting or increasing the activity or amplification of regulatory T cells (Treg). It is characterized by preventing or treating.
  • the term "active" refers to the promotion or enhancement of all mechanisms of Treg cells including regulatory T cells, that is, natural and adaptive Treg cells in vivo. It means that an immunomodulatory action, such as an immunosuppressive reaction, is promoted or promoted so that the immune response in the body is maintained in a steady state.
  • the expression “expansion” refers to the differentiation and proliferation of undifferentiated T cells into regulatory T cells
  • the term “differentiation” refers to the structure or growth of cells while they divide and grow.
  • Specialization of function that is, the change in form or function of a cell, tissue, etc. of a living organism to perform a given task
  • 'proliferation' refers to the division of cells and the expansion of homogeneous ones. The increase in the number of cells in an organism's body.
  • the PINK1 protein according to the present invention may preferably be a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the PINK1 protein of the present invention may be a functional equivalent to the polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the term "functional equivalent” means at least 60%, preferably 70%, more preferably 80% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as a result of the addition, substitution or deletion of an amino acid.
  • a polypeptide or protein having homology it refers to a polypeptide that exhibits substantially homogeneous activity with the PINK1 protein of the present invention.
  • substantially homogeneous activity means the activity of the PINK1 protein described above.
  • Such functional equivalents may include, for example, amino acid sequence variants in which some of the amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added.
  • Substitution of amino acids may preferably be conservative substitutions, examples of conservative substitutions of amino acids present in nature are as follows; Aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn ) And sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Deletion of amino acids may preferably be located at portions not directly involved in the activity of the PINK1 protein of the invention.
  • the functional equivalent may also include polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic backbone of PINK1 protein and its physiological activity.
  • polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide are modified while maintaining the basic backbone of PINK1 protein and its physiological activity.
  • fusion proteins made by fusion with other proteins while maintaining structural changes and physiological activities for altering the stability, storage, volatility or solubility of the polypeptide of the present invention may be included.
  • the PINK1 protein or the polynucleotide encoding the protein according to the present invention can reduce or inhibit pathological Th17 cells, while preventing autoimmune diseases through the action of promoting or enhancing the activity or amplification of regulatory T cells. Or can be treated.
  • the "autoimmune disease” when the "autoimmune disease" is a problem in inducing or maintaining self-tolerance, an immune response occurs to autoantigens, thereby causing a phenomenon of attacking own tissues. It means a disease that becomes.
  • the type of autoimmune disease in the present invention may be selected from the group consisting of, but not limited to, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, digestive diabetes, atopic dermatitis, autoimmune encephalomyelitis, asthma and Crohn's disease.
  • the term 'treatment' unless stated otherwise, reverses, alleviates, or inhibits the progression of the disease or condition to which the term applies, or one or more symptoms of the disease or condition, , Or to prevent, and the term 'treatment' as used herein refers to the act of treating when 'treating' is defined as above.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases according to the present invention may include a pharmaceutically effective amount of PINK1 protein alone or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount herein refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of autoimmune diseases.
  • the pharmaceutically effective amount of PINK1 protein according to the invention is 0.5100 / day / kg body weight, preferably 0.55 / day / kg body weight. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed depending on the degree of symptoms of autoimmune disease, the age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment of the patient.
  • the expression "pharmaceutically acceptable” as used herein refers to a composition which is physiologically acceptable and does not normally cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness or the like when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • composition for preventing or treating autoimmune diseases according to the present invention can be administered through various routes including oral, transdermal, subcutaneous, intravenous or intramuscular, the dosage of the active ingredient is the route of administration, the age, sex of the patient According to the present invention, the composition for preventing or treating autoimmune diseases according to the present invention may be appropriately selected according to various factors such as weight, severity of the patient, and the like. It can be administered in parallel.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for preventing or treating autoimmune diseases containing PINK1 protein as an active ingredient, and the present invention can further provide an immunosuppressive agent containing PINK1 protein as an active ingredient.
  • PINK1 protein according to the present invention is made through the mechanism of inhibiting the activity of Th17, or promote the activity of Regulatory T cells (Treg), increase the autophagy in Treg cells to regulate excessive immune response Therefore, it can be usefully used as a pharmaceutical composition or an immunosuppressant that can prevent or treat autoimmune diseases caused by abnormal control of various immune responses such as arthritis.
  • FIGS. 1A and 1B are graphs showing the results of confirming T cell activity in arthritis index and cells isolated from lymph nodes after injecting PINK1 protein into an arthritis induced animal model according to one embodiment of the present invention.
  • Figures 2a and 2b is a hematoxylin and eosin staining and toluidine blue for cartilage destruction and infiltration of inflammatory cells in the group treated with PINK1 protein and the group not treated with the control group arthritis induction animal model according to an embodiment of the present invention And safranin O staining results confirmed.
  • Figure 3 is a hydrochlorine staining picture showing the inhibition of inflammatory cytokine expression in the joint tissue by PINK1 protein in arthritis induced animal model according to one embodiment of the present invention.
  • 4A and 4B are flow cytometry results and graphs showing the co-regulation effects of Th17 and Treg cells by PINK1 protein treatment in arthritis induced animal models according to one embodiment of the present invention.
  • 5A to 5C show confocal microscopy of cells expressing IL-17 and STAT3 genes in splenocytes treated with PINK1 protein and not treated with the control group in the arthritis induced animal model according to one embodiment of the present invention.
  • This is a graph showing the pictures confirmed and the expression of the RORrT gene transcription factor of Th17 cells.
  • Figures 6a to 6c is confirmed by confocal microscopy of the cells expressing the CD25 and STAT5 gene in the splenocytes of the group treated with PINK1 protein and not treated with the control group arthritis induced animal model according to an embodiment of the present invention Photograph and graph showing expression of STAT5 gene, a transcription factor of Treg cells.
  • Figure 7 is a graph showing the inhibitory regulatory effect of inflammatory cytokines by in vitro transfection of PINK1 gene in NIH T cells according to one embodiment of the invention.
  • 8A and 8B are confocal microscopy of autophagy expressed in Th17 and Treg cells in a group treated with the PINK1 protein and a group not treated with the control group in the arthritis induced animal model according to one embodiment of the present invention. Photographs and graphs show the results.
  • the present inventors In order to determine whether the PINK1 protein is effective in preventing and treating arthritis, the present inventors first prepared a arthritis model by injecting type collagen into DBA1 / J normal mice, and injected the PINK1 DNA vector into the animal model and then arthritis index. Measured.
  • the inventors first immunized by mixing Type collagen 100 and CFA (Complete Freund's Adjuvant) and injected into the subcutaneous tail of the mouse, and after 2 weeks of first immunization, by mixing Type Collagen 100 and IFA (incomplete Freund's Adjuvant) Was boosted to booster immunization.
  • 100 PINK DNA vectors were injected intravenously one week after Type collagen injection, and 100 PINK DNA vectors were injected into the posterior right and left leg muscles of mice at weekly intervals after intravenous infusion.
  • PINK1 was amplified from human cDNA, which was cut and inserted into pcDNA3.1 (Invitrogen) with Hind and EcoR1, and expression of the inserted PINK1 was overexpressed by western blotting using protein lysate obtained by transduction into COS cells. It was confirmed. A mock vector was used instead of the PINK vector as a control.
  • T cells from splenocytes of arthritis model mice were activated T cells by anti-CD3 stimulation for 3 days to analyze the effect of PINK1 protein on T cell activity.
  • activated T cells were treated with 3H isotopes to evaluate the degree of cell proliferation activity.
  • IgG and IgG1 were examined using the sandwich ELISA in the serum of each mouse group.
  • 96-well plates were reacted with monoclonal anti-mouse IgG at room temperature for 1 hour, and then treated with blocking solution (1% BSA / PBST) to block nonspecific binding.
  • Mouse control serum was serially diluted by 1/2 and used as a standard.
  • Cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 1 hour. Thereafter, the anti-mouse IgG-HRP was reacted at room temperature for 1 hour, washed four times after the reaction, and then developed by TMB system to measure absorbance at 450 wavelength.
  • the arthritis index was reduced by nearly 70% in the experimental group administered the PINK1 protein of the present invention compared to the control group not treated with the PINK1 protein, and the PINK1 injected group received the PINK1 protein because the CPM, which is the proliferative response index, was lowered in T cells. It was confirmed that the T cell proliferation activity was significantly suppressed (FIG. 1A).
  • the incidence index was significantly decreased, and the expression level of IgG in the serum, which is an indicator of arthritis disease activity, was significantly suppressed (FIG. 1B).
  • the present inventors performed histological examination of the articular tissue of the arthritis mouse animal model to analyze the degree of arthritis improvement according to PINK1 protein treatment.
  • mice treated with the PINK1 protein and controls were fixed with paraffin after fixing the hind paws of each mouse group with 10% formalin at 56 days after arthritis induction and decalcifying bone.
  • the joint section 7 was prepared and attached to the slide. After deparaffinization using xylene, the joint section was hydrated using high and low ethanol, and the joint sections were stained with hematoxylin and eosin. In addition, toluidine blue and safranin O stained to confirm the degree of cartilage destruction.
  • the present inventors further performed histological examination of the joint tissues of the arthritis mouse animal model to analyze the expression of inflammatory cytokines in the joint tissues according to the PINK1 protein treatment.
  • the present inventors prepared the joint section 7 in the same manner as in Example 2, attached to the slide, and then representative inflammatory cytokines IL-17, IL-6, IL-1b and autoimmune arthritis and TNF- was stained using immunochemical staining and analyzed by light microscopy.
  • IL-17, IL-6, IL-1b and TNF- was significantly inhibited in the joint tissue of the PINK1 protein injection group of the present invention compared with the control group. It was confirmed that the activity of inflammatory cytokines can be controlled (Fig. 3).
  • the present inventors performed flow cytometry on splenocytes of arthritis mouse animal model in order to confirm the co-regulatory effect of Th17 and Treg cells according to PINK1 protein treatment.
  • the inventors reacted the splenocytes of each mouse with anti-CD4-PerCP and anti-CD25-APC for 4 to 30 minutes, and after permeabilization of the cells after the reaction, the anti-IL-17-PE, anti- Reaction was performed with IFNr-FITC or anti-Foxp3-PE fluorescent antibodies. After the reaction, each cell was analyzed using a FACS caliber.
  • Th17 cells which are pathological cells, were significantly inhibited in the spleen of mice treated with the PINK1 protein compared to the control arthritis experimental animals (FIG. 5A), and expression of the RORrT gene, which is a transcription factor of Th17 cells, was suppressed (FIG. 5C).
  • the expression of phosphorylated STAT3 was significantly suppressed in the PINK1 injection group (FIG. 5B). From the above results, it was confirmed that PINK can regulate the activities of RORrT and STAT3 when regulating the inhibition of activity of Th17 cells.
  • Treg cells were significantly increased in the spleen of mice treated with PINK1 protein compared to control arthritis experimental animals (FIG. 6A), and the activity of STAT5, a transcription factor of Treg cells, was confirmed in the spleen tissue.
  • STAT5 was significantly increased in the PINK1 infusion group (FIG. 6B).
  • TNF-recombinant was used as a standard by diluting serially by 1/2 concentration, and the cell culture supernatant was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • biotinylated anti-TNF-antibody was reacted at room temperature for 2 hours, washed four times after the reaction, and diluted with an ExtraAvidin-Alkaline phosphatase conjugate, followed by 2 at room temperature.
  • the reaction was carried out for a time.
  • a PNPP / DEA solution was added and developed. The absorbance was measured at 405 wavelength after color development.
  • PINK1 protein can directly regulate the expression of inflammatory cytokines in the in vitro efficacy evaluation.
  • Example 8 Activity analysis of autophagy by PINK1 protein treatment in animal models of arthritis
  • mice splenocytes as anti-CD4-percp, anti-CD25-APC, anti-Foxp3-PE and anti-LC3-FITC or anti-CD4-percp, anti-CD25-APC, anti-Foxp3- Confocal microscopic analysis was performed after staining with PE and anti-coxiV-FITC antibodies.
  • the PINK1 protein enhances the activity of Treg cells and inhibits the activity of Th17 to alleviate joint destruction of joint tissues, and excellent in inhibiting arthritis. It can be seen that PINK1 can be effectively used for the prevention or treatment of autoimmune diseases including arthritis.

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Abstract

본 발명은 PINK1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PINK1 단백질은 Th17의 활성을 억제시키거나, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키며, Treg 세포에서 자가소화작용을 증가시켜 과도한 면역반응을 조절하는 기작을 통해 이루어지므로 관절염 등 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

PINK1 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역은 생체 조직으로 침입하거나 주입되는 모든 외부 고분자물질(항원)에 대한 생체의 자기보호 체계의 하나이다. 면역체계의 주요한 구성성분으로 림프구가 있는데, 이는 골수에서 만들어져서 혈액을 따라 림프 조직이나 기관, 주로 림프절비장편도 등으로 순환하는 백혈구다. 면역반응에 관여하는 세포로서, B세포는 적절한 항원에 의해 자극되면 빠르게 증식하여, 그 항원을 중화시킬 특별한 항체(면역글로불린)를 만들어내는 클론을 형성하며, B세포가 생성하는 항체는 체액에서 순환하면서 체액성면역을 수행한다. 또한, T 세포는 흉선에서 생성되어 림프 조직으로 이동하는데, 항원을 직접 공격하는 세포매개성면역을 담당한다.
한편, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 많은 비자기(non-self) 항원에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것이다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 한다.
이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하면서 다발성 경화증(multiple sclerosis), 1형 당뇨병, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염 등의 자가면역질환이 발생하게 되며, 뿐만아니라 이식과 같은 시술 이후 면역거부 반응이 발생하게 된다.
구체적으로 자가면역질환은 자기 세포에 대한 이상 반응으로 나타나는 질병이므로 치료는 주로 자기면역 기능을 억제하는 약물이 사용되고 있다. 그러나 부작용이 많아 지속적으로 사용하기 곤란하고 재발을 충분히 막지 못하여 완치를 위한 치료에는 한계가 있다. 다발성경화증의 경우 베타인터페론이 사용되고 있으나 부작용이 덜한 대신 치료비가 비싸고 평생동안 주사를 맞아야 하는 불편함이 있고 재발을 막는 효과가 미미 하다. 또한 CD40 리간드에 항체 투여 등으로 세포간의 상호작용을 억제하는 방법이 사용되었으나 그다지 성공적이지 않다. 기타 여러 가지 면역요법들이 있으나 아직 확실한 치료효능을 보이는 방법으로 인정된 사례는 없다.
따라서 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있으며 인체에 무해하고 부작용이 없는 치료제에 대한 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 자가면역질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 새로운 치료방법을 연구하던 중, PINK1 단백질이 Th17의 활성을 억제시키고, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키며, Treg 세포에서 자가소화작용(autophage)을 증가시켜 Treg 기능을 조절할 수 있어 자가면역질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 PINK1 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 PINK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PINK1 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 PINK1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서 상기 PINK1 단백질은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나, 조절 T 세포의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 PINK1 단백질은 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성세포의 침윤을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 PINK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 PINK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구현예에 있어서, 상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 소화기 당뇨병, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명은 PINK1 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공함을 그 특징으로 한다.
PINK1 단백질은 autosomal recessive familiar PD의 유전자로써 신경세포와 신경교세포 모두에서 발현하며, 암, 1형 당뇨병 등의 질병을 예방해 주는 효과가 있다고 알려져 있으나, 아직까지 자가면역질환의 치료에 사용된다는 문헌은 전혀 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 PINK1 단백질이 Treg 세포에서 자가소화작용을 증가시켜 Treg 기능을 조절할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였다.
이러한 결과는 본 발명의 한 구현예에 의해 확인할 수 있는데, PINK1 단백질에 관절염의 예방 및 치료 효과가 있는지를 알아보기 위하여 관절염 모델에서 관절염 지수와 발병 지수를 측정한 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 본 발명의 PINK1 단백질을 투여한 실험동물군에서 관절염 지수 및 발병 지수가 현저히 억제되고, 또한 PINK1 주입군의 림프절 세포에서 T 세포의 증식 활성이 억제되어 있음을 알 수 있었다(도 1a 및 도 1b 참조).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, PINK1 단백질 처리에 따른 관절염 개선 정도를 분석하기 위하여 헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(Eosin) 염색, 톨루이딘 블루(Toluidin blue)와 사프라닌 O(Safranin O) 염색으로 조직학적 검사를 실시한 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군의 관절은 파괴되어 있고 염증성 세포들이 침윤되어 있으나, 본 발명의 PINK1 단백질을 주입한 실험동물군은 대조군 대비 파골세포의 분화가 감소되어 있고, 또한 염증성 세포의 침윤도 억제되어 있음을 확인할 수 있었다(도 2a 및 도 2b 참조).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, PINK1 단백질의 처리에 따른 관절 조직 내 염증성 사이토카인 발현을 분석한 결과, 본 발명의 PINK1 주입군의 관절 조직에서는 IL-17, IL-6, IL-1b 및 TNF-와 같은 염증성 사이토카인의 발현이 대조군에 비해 현저히 억제되어 있었는데, 이는 PINK1 단백질이 자가면역 관절염 질환에 있어서 염증성 사이토카인의 활성을 조절할 수 있음을 시사한다(도 3 참조).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, PINK1 단백질의 처리에 따른 Th17 및 Treg 세포의 동시 조절 효과를 확인하기 위해 관절염 마우스 동물모델의 비장세포에 유세포분석(FACS, fluorescence-activated cell sorter)을 실시한 결과, PINK1 단백질이 주입된 군에서는 Th17 세포가 절반이상 감소하고 Treg 세포는 2배 가까이 증가한 것으로 나타났으며(도 4a 및 도 4b 참조), 이로부터 PINK1 단백질이 Th17/Treg 세포의 활성을 동시에 조절할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 Th17 세포 억제 효과를 확인한 결과, 대조군인 관절염 실험동물에 비해 PINK1 단백질을 처리한 마우스의 비장에서 병인세포인 Th17 세포는 현저히 억제되고, Th17 세포의 전사인자인 RORrT 유전자의 발현이 억제되며, 또한 Th17 세포의 전사인자인 인산화된 STAT3의 발현은 PINK1 주입군에서 현저하게 억제되었는데(도 5a 내지 도 5c 참조), 이는 PINK1 단백질이 Th17 세포의 활성 억제 조절시 RORrT와 STAT3의 활성을 조절할 수 있음을 나타낸다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 Treg 세포 증가 효과를 확인한 결과, 대조군인 관절염 실험동물에 비해 PINK1 단백질을 처리한 마우스의 비장에서 Treg 세포의 발현은 현저히 증가되고, Treg 세포의 대표 전사인자인 Foxp3, SOCS3 유전자의 발현도 증가되며, 또한 Treg 세포의 전사인자인 인산화된 STAT5의 발현은 PINK1 주입군에서 현저하게 증가되었다(도 6a 내지 도 6c 참조).
본 발명의 다른 구현예에 따르면, PINK1 유전자의 시험관내 전달감염(transfection)에 의한 염증성 사이토카인의 억제 조절 효과를 확인한 결과, PINK1 유전자가 주입된 세포에서는 conA 반응에 따른 TNF-의 발현을 현저히 억제시켰는데(도 7 참조), 이로부터 시험관내 효능 평가에서도 PINK1 단백질이 염증성 사이토카인의 발현을 직접적으로 조절할 수 있음을 알 수 있다.
아울러, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 마우스의 비장세포에 PINK1 단백질을 주입한 군과 PINK1 단백질을 주입하지 않은 대조군에서 Th17와 Treg 세포에서 발현되는 자가소화작용을 공초점 현미경으로 관찰한 결과, Th17 세포와 비교하여 PINK1 단백질을 주입한 마우스의 비장 Treg 세포에서 LC3 및 coxIV의 발현이 증가되었고, 또한 Treg 세포의 이러한 마커들이 활성화됨을 알 수 있었다(도 8 참조).
따라서 이와 같은 공지의 사실과 함께 본 발명의 한 구현예를 통해 확인된 사실에 기초하여, 본 발명의 PINK1 단백질이 Treg 세포에서 자가소화작용을 증가시켜 Treg 기능을 조절하여 자가면역질환을 예방 또는 치료하는데 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
그러므로 본 발명의 PINK1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 Treg 세포에서 자가소화작용을 증가시키는 활성을 가지고 있어 조절 T 세포(Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는 작용을 통해 자가면역질환을 예방 또는 치료하는 특징이 있다.
본 발명에 있어서, "활성"이란 용어는 생체 내에서 조절 T 세포, 즉 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.
또한, 본 발명에 있어서, "증폭(expansion)"이란 표현은 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.
본 발명에 따른 상기 PINK1 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질일 수 있다. 또한, 상기 본 발명의 PINK1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 본 발명에 있어서, "기능적 동등물"이란 용어는 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드 또는 단백질을 말하는 것으로서, 본 발명의 PINK1 단백질과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, "실질적으로 동질의 활성"이란 상기에서 기재한 PINK1 단백질의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 PINK1 단백질의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 PINK1 단백질의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른단백질과융합으로 만들어진융합단백질등이 이에 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 PINK1 단백질 또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 병적세포인 Th17 세포를 감소 또는 억제시킬 수 있고, 반면 조절 T 세포의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증진시키는 작용을 통해 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "자가면역질환"은 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다. 또한, 본 발명에서 상기 자가면역질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 소화기 당뇨병, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 있어서, '치료'란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 '치료'란 용어는 '치료하는'이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.
본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적조성물은 약학적으로 유효한 양의 PINK1 단백질을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다. 본 발명에 따른 PINK1 단백질의 약학적으로 유효한 양은 0.5100/day/체중kg, 바람직하게는 0.55/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 자가면역질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는" 이란 표현은 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 자가면역질환의 예방 또는 치료용 조성물은 자가면역질환의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 PINK1 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적조성물을 제공할 수 있으며, 나아가 본 발명은 PINK1 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 PINK1 단백질은 Th17의 활성을 억제시키거나, 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성을 촉진시키며, Treg 세포에서 자가소화작용을 증가시켜 과도한 면역반응을 조절하는 기작을 통해 이루어지므로 관절염 등 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 한 구현예에 따라 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 주입한 뒤 관절염 지수 및 림프절에서 분리된 세포에서 T 세포의 활성을 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 한 구현예에 따라 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 처리한 군과 대조군으로 처리하지 않은 군의 연골 파괴 및 염증세포의 침윤을 헤마톡실린과 에오신 염색 및 톨루이딘 블루와 사프라닌 O 염색으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 한 구현예에 따라 관절염 유도 동물모델에서 PINK1 단백질에 의한 관절 조직 내 염증성 사이토카인 발현의 억제를 보여주는 염역화학 염색 사진이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 한 구현예에 따라 관절염 유도 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 Th17 및 Treg 세포의 동시 조절 효과를 보여주는 유세포분석 결과 및 그래프이다.
도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 한 구현예에 따라 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 처리하였을 때와 대조군으로 처리하지 않은 군의 비장세포에서 IL-17 및 STAT3 유전자를 발현하는 세포를 공초점 현미경으로 확인한 사진과 Th17 세포의 전사인자인 RORrT 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 한 구현예에 따라 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 처리하였을 때와 대조군으로 처리하지 않은 군의 비장세포에서 CD25 및 STAT5 유전자를 발현하는 세포를 공초점 현미경으로 확인한 사진과 Treg 세포의 전사인자인 STAT5 유전자의 발현을 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 한 구현예에 따라 NIH T 세포에서 PINK1 유전자의 시험관내 전달감염에 의한 염증성 사이토카인의 억제 조절 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8a 및 도 8b는 본 발명의 한 구현예에 따라 관절염 유도 동물모델에 PINK1 단백질을 처리한 군과 대조군으로 처리하지 않은 군을 대상으로 Th17과 Treg 세포에서 발현되는 자가소화작용을 공초점 현미경으로 확인한 결과를 보여주는 사진 및 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. PINK1 단백질 처리에 따른 관절염 개선 정도 측정 및 T 세포 활성 정도 분석
본 발명자들은 PINK1 단백질이 관절염의 예방 및 치료 효과가 있는지를 알아보기 위하여 먼저 DBA1/J 정상 마우스에 Type 콜라겐을 주입하여 관절염 모델을 제작하였으며, 상기 동물모델에 PINK1 DNA 벡터를 주입한 뒤 관절염 지수를 측정하였다.
이를 위하여, 본 발명자들은 Type 콜라겐 100과 CFA(Complete Freund's Adjuvant)를 섞어서 마우스의 꼬리 피하에 주입하여 1차 면역시켰고, 1차 면역 2주 후 Type 콜라겐 100과 IFA(incomplete Freund's Adjuvant)를 섞어서 꼬리 피하에 재주입하여 부스터(booster) 면역시켰다. 100의 PINK DNA 벡터는 Type 콜라겐 주입 후 일주일 후 정맥을 통해 주입하였고, 정맥 주입 후 1주일 간격으로 100의 PINK DNA 벡터를 마우스의 뒷 오른쪽 및 왼쪽 다리 근육에 주입하였다. PINK1은 human cDNA로부터 증폭시켰고 이는 pcDNA3.1(Invitrogen)에 Hind와 EcoR1으로 잘라서 삽입하였으며, 삽입된 PINK1의 발현은 COS 세포에 형질도입하여 얻은 단백질 용해물을 이용해 웨스턴 블롯팅(western blot)으로 과발현 여부를 확인하였다. PINK 벡터 대신에 mock 벡터를 사용한 것을 대조군으로 하였다.
또한, 본 발명자들은 PINK1 단백질이 T 세포 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 관절염 모델 마우스의 비장세포로부터 T 세포를 분리하였고, 분리된 T 세포를 3일 동안 항-CD3 자극하여 T 세포를 활성화시켰으며, 또한 활성화된 T 세포에 3H 동위원소를 처리하여 세포 증식 활성 정도를 평가하였다.
아울러, 각 마우스 군의 혈청에서 샌드위치 ELISA를 이용하여 IgG 및 IgG1의 발현 정도를 조사하였다. 이를 위하여, 96-웰 플레이트에 단클론성 항-마우스 IgG로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 차단용액(1% BSA/PBST)을 처리하여 비특이적 결합을 차단하였다. 마우스 대조군 혈청을 1/2씩 연속적으로 희석하여 표준물(standard)로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 항-마우스 IgG-HRP를 실온에서 1시간 동안 반응시켰고, 반응 후 4회 세척한 후, TMB 시스템으로 발색시켜 450 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 본 발명의 PINK1 단백질을 투여한 실험군에서는 관절염 지수가 70% 가까이 감소되었고, 또한 PINK1 주입군에서는 T 세포에서 증식반응 지수인 CPM이 낮아져서 PINK1 단백질을 투여 시 T 세포 증식 활성이 현저히 억제됨을 확인할 수 있었다(도 1a). 아울러, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군에 비하여 본 발명의 PINK1 단백질을 투여한 실험군에서는 발병 지수가 현저히 감소되었고, 관절염 질환 활성의 지표인 혈청내 IgG의 발현양이 현저히 억제되었다(도 1b).
실시예 2. PINK1 단백질이 관절 조직의 관절 파괴 정도에 미치는 영향 분석
본 발명자들은 PINK1 단백질 처리에 따른 관절염 개선 정도를 분석하기 위하여 관절염 마우스 동물모델의 관절 조직에 대한 조직학적 검사를 실시하였다.
이를 위하여, PINK1 단백질이 투여된 동물과 대조군을 관절염 유도 후 56일에 각 마우스 군의 뒷발을 10% 포르말린으로 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 후 파라핀으로 블록을 제조하였다. 이로부터 관절 절편(7)을 준비하여 슬라이드에 부착하였고, 자일렌을 이용하여 탈 파라핀 과정을 거친 후, 고농도 및 저농도 에탄올을 이용하여 함수시켰으며, 헤마톡실린과 에오신으로 관절 절편을 염색하였다. 또한, 연골파괴 정도를 확인하기 위하여 톨루이딘 블루와 사프라닌 O 염색하였다.
상기와 같은 실험 후 실험동물군의 관절 내 연골 및 염증도를 관찰한 결과, PINK1 단백질을 처리하지 않은 대조군의 관절은 파괴되어 있고 염증성 세포들이 침윤되어 있었으나 본 발명의 PINK1 단백질을 주입한 실험동물군은 대조군 대비 파골세포 분화가 감소되어 있었으며, 염증성 세포의 침윤도 억제되었음을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).
실시예 3. 관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 관절 조직 내 염증성 사이토카인 발현의 억제 효과
본 발명자들은 PINK1 단백질 처리에 따른 관절 조직 내 염증성 사이토카인 발현을 분석하기 위하여 관절염 마우스 동물모델의 관절 조직에 대한 조직학적 검사를 추가로 실시하였다.
이를 위하여, 본 발명자들은 상기 실시예 2와 동일한 방식으로 관절 절편(7)을 준비하여 슬라이드에 부착한 후, 자가면역 관절염과 관련된 대표적인 염증성 사이토카인인 IL-17, IL-6, IL-1b 및 TNF-를 면역화학염색법을 이용하여 염색하였고, 이를 광학현미경으로 분석하였다.
그 결과, 본 발명의 PINK1 단백질 주입군의 관절 조직에서 IL-17, IL-6, IL-1b 및 TNF-의 발현이 대조군에 비해 현저히 억제되어 있었으며, 상기 결과로부터 PINK1 단백질이 자가면역 관절염 질환에 있어서 염증성 사이토카인의 활성을 조절할 수 있음을 확인하였다(도 3).
실시예 4. 관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 Th17 및 Treg 세포의 동시 조절 효과
본 발명자들은 PINK1 단백질 처리에 따른 Th17 및 Treg 세포의 동시 조절 효과를 확인하기 위하여 관절염 마우스 동물모델의 비장세포에 유세포분석을 실시하였다.
이를 위하여, 본 발명자들은 각 마우스의 비장세포에 항-CD4-PerCP 및 항-CD25-APC를 4에서 30분 동안 반응시켰고, 반응 후 세포를 permeabilization한 후, 항-IL-17-PE, 항-IFNr-FITC 혹은 항-Foxp3-PE 형광 항체로 반응시켰다. 상기 반응 후 FACS caliber를 이용하여 각 세포를 분석하였다.
그 결과, PINK1 단백질이 주입된 군에서는 Th17 세포가 절반이상 감소하였고(도 4a), Treg 세포는 2배 가까이 증가한 것으로 나타났으며(도 4b), 상기 결과로부터 PINK1 단백질은 Th17/Treg 세포의 활성을 동시에 조절할 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 Th17 세포 억제 효과
본 발명자들은 본 발명의 PINK1 단백질 처리가 Th17 세포에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 마우스의 비장에서 분리된 세포(1106)에 항-CD4-pe, 항-IL-17-FITC를 염색하거나, 항-CD4-pe, 항-pSTAT3 705-FITC를 염색한 후, Th17 세포의 발현양을 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 또한, 각 마우스의 비장 세포에 RNA zolB를 처리하여 RNA를 단리한 후, 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하여 RORrT 유전자의 발현을 실시간(realtime) PCR로 분석하였다.
그 결과, 대조군인 관절염 실험동물에 비해 PINK1 단백질을 처리한 마우스의 비장에서 병인세포인 Th17 세포는 현저히 억제되었고(도 5a), Th17 세포의 전사인자인 RORrT 유전자의 발현이 억제되었다(도 5c). 또한, Th17 세포의 전사인자인 STAT3의 활성을 비장 조직에서 확인한 결과, 인산화된 STAT3의 발현은 PINK1 주입군에서 현저하게 억제되었다(도 5b). 상기 결과로부터, PINK는 Th17 세포의 활성 억제 조절시 RORrT와 STAT3의 활성을 조절할 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. 관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 Treg 세포 증가 효과
본 발명자들은 본 발명의 PINK1 단백질 처리가 Treg 세포에 어떠한 영향을 미치는지 조사하기 위하여 마우스의 비장에서 분리된 세포(1106)에 항-CD4-pe, 항-CD25-APC, 항-Foxp3-FITC를 염색하거나, 항-CD4-pe, 항-pSTAT3 705-FITC를 염색한 후, Treg 세포의 발현양을 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다. 또한, 각 마우스의 비장 세포에 RNA zolB를 처리하여 RNA를 단리한 후, 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하여 Foxp3 및 SOCS3 유전자의 발현을 실시간PCR로 분석하였다.
그 결과, 대조군인 관절염 실험동물에 비해 PINK1 단백질을 처리한 마우스의 비장에서 Treg 세포의 발현은 현저히 증가되었고(도 6a), Treg 세포의 전사인자인 STAT5의 활성을 비장 조직에서 확인한 결과, 인산화된 STAT5의 발현은 PINK1 주입군에서 현저하게 증가되었다(도 6b). 또한, Treg 세포의 대표 전사인자인 Foxp3, SOCS3 유전자의 발현이 증가되었다(도 6c).
실시예 7. PINK1 유전자의 시험관내 전달감염(transfection)에 의한 염증성 사이토카인의 억제 조절 효과
본 발명자들은 NIH T 세포에 각 벡터를 주입한 후 conA로 세포를 활성화시켰다. 각 벡터 주입 3일 후 배양된 상층액을 모아 샌드위치 ELISA를 이용하여 TNF-의 발현 정도를 조사하였다. 이를 위하여, 96-웰 플레이트에 2/의 단클론성 항-TNF- 항체를 4에서 밤새 반응시켰고, 반응 후 차단 용액(1% BSA/PBST)으로 비특이적 결합을 차단하였다. TNF- 재조합체를 1/2 농도씩 연속 희석하여 표준물로 사용하였으며, 세포배양 상층액을 넣고 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 바이오틴화 항-TNF- 항체를 2시간 동안 실온에서 반응시켰고, 반응 후 4회 세척하였으며, 엑스트라아비딘-알칼린 포스파타아제 접합체(ExtraAvidin-Alkaline phosphatase conjugate)를 희석하여 넣은 후, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PNPP/DEA 용액을 넣고 발색하였으며, 발색 후 405 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PINK1 유전자가 주입된 세포에서는 conA 반응에 따른 TNF-의 발현을 현저히 억제시켰다(도 7). 상기 결과로부터, 시험관내 효능 평가에서도 PINK1 단백질은 염증성 사이토카인의 발현을 직접적으로 조절할 수 있음을 확인하였다.
실시예 8. 관절염 동물모델에서 PINK1 단백질 처리에 의한 자가소화작용의 활성 분석
본 발명자들은 상기 실시예 5 및 실시예 6에서 관찰된 Th17 세포의 감소 및 Treg 세포의 증가와 관련된 기작을 좀 더 명확히 이해하고자 PINK1 단백질이 자가소화작용을 활성화시키는지 여부와 그러한 기작으로 실제로 Th17 세포가 감소되고 Treg 세포가 증가하는지 확인하였다. 이를 위하여 본 발명자들은 마우스의 비장세포를 항-CD4-percp, 항-CD25-APC, 항-Foxp3-PE 및 항-LC3-FITC 또는 항-CD4-percp, 항-CD25-APC, 항-Foxp3-PE 및 항-coxiV-FITC 항체로 염색한 후 공초점 현미경 분석을 수행하였다.
PINK1 단백질을 주입한 군과 PINK1 단백질을 주입하지 않은 대조군에서 Treg 세포에서 발현되는 자가소화작용을 공초점 현미경으로 관찰한 결과, PINK1 단백질을 주입한 마우스의 비장 조직에서 LC3 및 coxIV를 발현하는 Treg 세포가 증가되었고, 또한 Treg 세포의 이러한 마커들이 활성화되었다(도 8). 상기 결과로부터, PINK1 단백질은 Treg 세포의 자가소화작용의 활성화를 유도하여 Treg 세포의 기능이 강화되고, 이로 인해 자가면역 관절염에서 Th17 세포 및 병인 사이토카인들이 조절될 수 있음을 확인하였다.
상기와 같은 실시예 1 내지 실시예 8에 따르면, PINK1 단백질은 Treg 세포의 활성을 증진시키고 Th17의 활성을 억제시킴으로써 관절조직의 관절 파괴를 완화시키고, 관절염을 억제하는 효과가 탁월한 바, 본 발명의 PINK1은 관절염을 비롯한 자가면역질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용 가능하다는 것을 알 수 있다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (10)

  1. PINK1(PTEN-induced kinase 1) 단백질을 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 PINK1 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 PINK1 단백질은 Th17의 활성을 억제 또는 감소시키거나, 조절 T 세포의 활성을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 PINK1 단백질은 파골세포 분화를 감소시키거나, 염증성세포의 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 소화기 당뇨병, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. PINK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 청구항 6에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 소화기 당뇨병, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. PINK1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동 가능하도록 연결된 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스 관절염, 전신 홍반성 낭창, 소화기 당뇨병, 아토피 피부염, 자가면역성 뇌척수염, 천식 및 크론씨병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는약학적 조성물.
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