WO2014193183A1 - 시알산 유도체의 제조방법 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention provides a process for preparing CMP-N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc) from N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) and galactose such as lactose in one reactor.
  • CMP-NeuAc CMP-N-acetylneuraminic acid
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • galactose such as lactose in one reactor.
  • the present invention relates to a method for preparing a sialic acid derivative, which is performed together with a process for preparing a sialic acid (neuraminic acid) derivative which binds sialic acid to a derivative.
  • Sugar is one of the widest and most abundant biomolecules in nature and the most common molecule involved in recognition and signaling in cells. Most sugar units can be added to aglycons when activated by nucleic acids. Nucleotide-sugar is an activated form of monosaccharides and acts as a donor in glycosyltransferase reactions by glycosyltransferases. However, the sugar transition has problems such as the weak reactivity of the sugar transfer enzyme and the limited utilization of the activated glycan structural unit.
  • sialic acid-containing sugar chains containing N-acetylneuraminic acid (NeuAc) at their ends are sugar chains having important functions such as cell adhesion and becoming receptors for virus infection.
  • Sialic acid containing sugar chains are generally synthesized by catalysis of sialic acid transferase.
  • Sialic acid transferase is an enzyme that transfers sialic acid to receptors such as sugar chains using CMP-N-acetylneuraminic acid as a sugar supply.
  • CMP-N-acetylneuraminic acid used as a sugar feed is very expensive and only a small amount of reagent level is supplied.
  • CMP-N-acetylneuraminic acid is prepared by using a cytidine 5'-triphosphate (CTP) and N-acetylneuraminic acid (NeuAc) as a substrate for the synthesis of CMP-N-acetylneuraminic acid synthase (synthetase).
  • CTP cytidine 5'-triphosphate
  • NeuAc N-acetylneuraminic acid
  • synthetase CMP-N-acetylneuraminic acid synthase
  • a method for synthesizing by a catalyst is known, CTP-N-acetylneuraminic acid synthesized as a raw material is also expensive because CTP and NeuAc as raw materials are expensive.
  • CMP-N-acetylneuraminic acid As a method for producing CMP-N-acetylneuraminic acid (CMP-NeuAc), (1) N-acetylneuraminic acid lyase or N-acetylneuraminic acid synthase is used. Method prepared from N-acetyl-D-mannosamine (ManNAc) ( J. Am. Chem. Soc ., 110: 6481, 1988; J. Am. Chem. Soc ., 110 (7159, 1988; Japanese Patent Laid-Open No.
  • ManNAc N-acetyl-D-mannosamine
  • N-acetylneuraminic acid (NeuAc) from N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) using the method (WO 95/26399; Japanese Patent Laid-Open No. Hei 3-180190; Japanese Patent Laid-Open No. 2001-136982), (4) A method for synthesizing CMP-N-acetylneuraminic acid using E. coli and yeast cells (WO 2004/009830), and the like have been reported.
  • the method of (1) is expensive for N-acetyl-D-mannosamine (ManNAc) as a raw material
  • the method of (2) is a method of using inexpensive N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc) as a raw material.
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • the process of purifying ManNAc from a mixture of GlcNAc and N-acetyl-D-mannosamine (ManNAc) is complicated.
  • the GlcNAc2-epimerase used in the method of (3) requires ATP (adenosine triphosphate), it is necessary to add expensive ATP or to generate ATP from adenine, which is a precursor of ATP, using microorganisms.
  • the method of (4) has a problem that the method using E. coli and yeast cells is complicated in the process.
  • Korean Patent Publication No. 10-2006-0010706 discloses a method for preparing CMP-N-acetylneuraminic acid, which encodes a gene encoding N-acetylglucosamine-2-epimerase and an N-acetylneuraminic acid aldose.
  • a neuramic acid was synthesized by adding cytidine 5'-monophosphate (CMP), N-acetyl-D-glucosamine, sodium pyruvate and yeast to a transformant to which a coexpression vector containing the gene was added.
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • N-acetyl-D-glucosamine sodium pyruvate
  • yeast a transformant to which a coexpression vector containing the gene was added.
  • a co-expression vector comprising CMP-N-acetylneuraminic acid synthase or a gene encoding N-acetylneuraminic acid aldorase and a gene encoding CMP-N-acetylneuraminic acid synthase
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • N-acetyl-D-glucosamine N-acetyl-D-glucosamine
  • pyruvic acid and yeast a transformant.
  • Glycoproteins glycans containing sialoligosaccharides and fucose sugars, play an important role in biological processes.
  • sialic acid transferase sialic acid transferase
  • CMP-N-acetylneuraminic acid expensive CMP-N-acetylneuraminic acid as a starting material
  • sialic acid derivatives have been prepared using N-acetyl-D-glucosamine as a starting material, there is a disadvantage in that the efficiencies of sialic acid derivatives are low due to poor activity range and activity of sialic acid transferase (Kim Dae-Hee, Sun Moon University, Ph.D. Thesis, 2011).
  • the present inventors have diligently tried to develop a method for preparing a sialic acid derivative of a bioactive substance at a more economical and high efficiency.
  • N-acetyl-D-glucosamine and cytidine 5'-monophosphate (CMP) are used as starting materials.
  • the step of preparing CMP-N-acetylneuraminic acid and the step of preparing a bioactive substance derivative combined with sialic acid from CMP-N-acetylneuraminic acid using a sialic acid transferase mutant in a single reaction vessel
  • CMP cytidine 5'- monophosphate
  • the present invention (a) in a single reaction vessel, cytidine 5'-monophosphate (CMP), NTP (Nucleotide triphosphate), sodium pyruvate, galactose residues Compounds were added to the substrate, cytidine monophosphate kinase (CMK), acetate kinase (ACK), CMP-N-acetylneuraminic acid synthase (CMP-NeuAc synthetase, NEU), N-acetylglucosamine-2-epimerase (GlcNAc-2-epimerase, NANE), N-acetylneuraminic acid aldolase (NeuAc aldolase, NAN) and sialic acid transferase (Sialyltransferase) Reacting the solution to prepare a sialic acid derivative of a compound comprising sialyllactose or galactose residues; And (b) in a single reaction vessel
  • Figure 1 shows a synthetic process for producing 2,3-sialylactose and 2,6-sialylactose in a one-pot (integrated batch) reaction according to the present invention.
  • Figure 2 confirms the 2,6 sialic acid transfer side reaction of the 2,3 sialic acid transferase variant, (a) shows the results in the conditions of pH 4.5 ⁇ 6.0, (b) is a condition of pH 6.5 ⁇ 7.0 It shows the result in.
  • Figure 3 shows the results confirmed by LC and Mass 2,3-sialylactose synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • Figure 4 shows the results confirmed by LC and Mass 2,6-sialylactose synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • Figure 5 shows the synthetic process for preparing sialylgalactose in one-pot reaction according to the present invention.
  • Figure 6 shows the results of the sialyl galactose synthesized by the one-pot reaction of the present invention confirmed by TLC and Mass.
  • Figure 7 shows the synthesis process of sialic acid derivatives of the linker coupled to lactose.
  • Figure 8 shows the results confirmed by TLC and Mass of the sialic acid derivative (aminohexyl linker 2,3-sialyllactose) of the linker combined with lactose synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • Figure 9 shows the synthesis of the sialic acid derivative of the derivative containing the galactose residue of the flavonoid CSH-I-54.
  • Figure 10 shows the results confirmed by LC and Mass 2,3-sialylactose-CSH-I-54 synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • Figure 11 shows the synthesis of sialic acid derivatives of the immunosuppressive agent tacrolimus galactose derivatives.
  • Figure 12 shows the results confirmed by LC and Mass 2,3-sialylactose-tacrolimus synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • Figure 13 shows the synthesis of sialic acid derivatives of the anticancer drug taxol (taxol) galactose derivatives.
  • Figure 14 shows the results confirmed by LC and Mass 2,3-sialylactose-taxol synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • Figure 15 shows the synthesis of the sialic acid derivative of the antibiotic vancomycin derivative (vancomycin) derivative.
  • Figure 16a shows the results confirmed by LC to 2,3-sialylactose-vancomycin synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • Figure 16b shows the results confirmed by the mass of 2,3-sialylactose-vancomycin synthesized by the one-pot reaction of the present invention.
  • the present invention adds (a) a compound comprising cytidine 5'-monophosphate (CMP), acetyl phosphate, NTP (Nucleotide triphosphate), N-acetyl-D-glucosamine, pyruvic acid and galactose or galactose residues as a substrate, Cytidine monophosphate kinase (CMK), acetate kinase (ACK), CMP-N-acetylneuraminic acid synthase (CMP-NeuAc synthetase, NEU), N-acetylglucosamine-2 Sialyl lactose or galactose by reacting the reaction solution containing epimerase (GlcNAc-2-epimerase, NANE), N-acetylneuramidal aldolase (NAN) and sialic acid transferase (Sialyltransferase) Preparing a sialic acid derivative of a
  • a process for preparing CMP-N-acetylneuraminic acid from N-acetyl-D-glucosamine and a sialic acid to which sialic acid is bound to a derivative including galactose in one reactor, a process for preparing CMP-N-acetylneuraminic acid from N-acetyl-D-glucosamine and a sialic acid to which sialic acid is bound to a derivative including galactose
  • the process of preparing an acid (neuraminic acid) derivative can be carried out together to produce a sialic acid derivative in high yield while being able to recycle an expensive substrate, cytidine 5'-monophosphate (CMP).
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • sialic acid derivatives Conventional methods for preparing sialic acid derivatives have been CMP-N-acetylneuraminic acid as a starting material, and sialic acid is bound to derivatives containing lactose or galactose by sialic acid transferase, but CMP-N Since acetylneuraminic acid is a very expensive substance, it was expensive to produce sialic acid derivatives.
  • the inventors have used a novel N-acetylglucosamine-2-epimerase enzyme derived from Bacteroides fragilis NCTC 9343, and a cytidine 5'-monophosphate (CMP) and Using a very small amount of NTP and various substrates and enzymes, a method for producing CMP-N-acetylneuraminic acid in high yield has been developed (Korean Patent No. 0888513).
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • CMP-N-acetylneuraminic acid and lactose When CMP-N-acetylneuraminic acid and lactose are reacted with sialic acid transferase, sialic acid is transferred to lactose, thereby producing sialylactose and cytidine 5'-monophosphate (CMP).
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • a process for producing CMP-N-acetylneuraminic acid and a sialic acid transfer process using cytidine 5'-monophosphate (CMP) as a substrate is performed in a different container, and the generated city Dean 5'-monophosphate (CMP) could not be recycled.
  • a sialic acid transferase is used to obtain a CMP-N-acetylneuraminic acid from cytidine 5'-monophosphate (CMP) and a sialic acid transferase to a derivative containing galactose such as CMP-N-acetylneuraminic acid and lactose. Since the reaction in which the acid derivative and the cytidine 5'-monophosphate (CMP) are produced is carried out in the same reaction vessel, the cytidine 5'-monophosphate (CMP) produced by the sialic acid transfer reaction is converted to CMP-N-acetylnuclear. It can be recycled to the reaction for producing lamine acid.
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • FIG. 1 shows a synthesis process for preparing 2,3-sialylactose and 2,6-sialylactose in a single container according to the present invention.
  • sialyllactose is a one-pot from N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), sodium pyruvate, cytidine 5'- monophosphate (CMP), etc., which are inexpensive substrates in vitro . Produced by reaction. Under the CMP-N-acetylneuraminic acid production rate of 7.5 mM / hr to 8.5 mM / hr, the conversion of sialyl lactose was 650% based on cytidine 5'-monophosphate (CMP) and N-acetyl-D-glucosamine ( 81% from GlcNAc).
  • the one-pot sialyl lactose production method according to the present invention is compared with the conventional two-pot sialyl lactose production method. Even when the concentration of 5'-monophosphate (CMP) was reduced to 1/5, the amount of sialylactose produced was doubled (see Table 4).
  • CMP 5'-monophosphate
  • sialic acid transferase (Sialyltransferase) can be used 2,3-sialic acid transferase, 2,6-sialic acid transferase or 2,8-sialic acid transferase, preferably 2,3- Sialic acid transferase or 2,6-sialic acid transferase can be used.
  • CMK cytidine monophosphate kinase
  • ACEtate kinase acetate kinase
  • N-acetyl an enzyme involved in the reaction for producing CMP-N-acetylneuraminic acid.
  • NAN Neuramic acid aldolase
  • NMP CMP-N-acetylneuraminic acid synthase
  • GlcNAc-2-epimerase N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • NAN Neuramic acid aldolase
  • NMP CMP-N-acetylneuraminic acid synthase
  • GlcNAc-2-epimerase N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • NANE N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • the 2,3-sialic acid transferase of the present invention may be characterized as a variant enzyme of 2,3-sialic acid transferase having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 6,
  • the 6-sialic acid transferase may be characterized as a variant enzyme of 2,6-sialic acid transferase having an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 14-18.
  • the preparation reaction of the sialic acid derivative of the present invention is preferably carried out at 25 ⁇ 38 °C in consideration of the activity temperature of each enzyme involved in the reaction, pH 7-9 in consideration of the active pH of each enzyme involved in the reaction Preference is given to performing at.
  • the sequence N-acetylglucosamine-2-epimerase (GlcNAc-2-epimerase, NANE) is a N-acetylglucosamine-2-epimerase enzyme derived from Bacteroides fragilis NCTC 9343. It is preferable to use an enzyme having an amino acid sequence of No. 25, but is not limited thereto.
  • the compound comprising a galactose residue may be a derivative comprising a galactose of a compound selected from the group consisting of monosaccharides, oligosaccharides, linkers, flavonoids, anticancer agents, antibiotics, immunosuppressants and antibodies.
  • the monosaccharide may be glucose, N-acetyl-D-glucosamine, mannose, or the like
  • the linker may be a functional group that can be linked by using an ester or amide bond, for example, formyl, acetyl A linker capable of connecting a group, a propionyl group, a butyl group, an acryl group, an ethyl succinyl group, a succinyl group, an aminohexyl group, and the like.
  • the mutant of 2,6-sialic acid transferase used in the present invention is derived from the strain of Photobacterium damselae and 2,3-sial derived from Pasteurella based on the structural folding and sequence of the sugar transferase . It belongs to the GT family 80, such as acid transferase.
  • the activity of 2,6 siallylase and sialyltransferase has recently been revealed, but the activity of this side reaction is much higher than that of 2,6-sialic acid transfer. Since it is insignificant (more than 150 times), most of the sialic acid transfer activity is considered.
  • 2,6-sialylactose is additionally produced by 2,3-sialic acid transferase, so conventional reaction produces CMP-N-acetylneuraminic acid at neutral pH and buffer solution
  • the conversion of 8 to 9 was carried out to perform a two-step reaction in which 2,3-sialic acid transferase was applied. Therefore, in the case of 2,3-sialic acid transferase, it is possible to suppress the formation of side reactions, thereby enabling batch-integrated reactions, and to speed up the catalytic reaction to improve the productivity and efficiency of various 2,3-sialyl derivatives including 2,3-sialyl lactose. Can be improved.
  • a hybrid that is, a semi-rational method was used.
  • This method combines directed evolution and rational design to ensure that only a small number of high-quality variant libraries are available.
  • This method involves analyzing the target portion of a protein and performing mutations by selecting residues of specific amino acids using the protein's sequence, structure and function, and computer programs.
  • sialic acid transferase refers to an enzyme that transfers N-acetylneuraminic acid from CMP-N-acetylneuraminic acid to a receptor glycoside as a leuoiric transferase.
  • One of the receptor substrates, lactose is an oligosaccharide composed of Gal ⁇ 1,4Glc (galactose and glucose linked by ⁇ 1,4 bonds).
  • 2,3- and 2,6-sialyl oligosaccharides are oligosaccharides in which N-acetylneuraminic acid (sialic acid) is linked by a2,3 or a2,6 linkages to the galactose moiety, and other sugars are added to galactose or glucose.
  • N-acetylneuraminic acid sialic acid
  • 2,3- and 2,6-sialylactose means a tritane substance consisting of Neu5Aca2,3 / 2,6Gal ⁇ , 4Glc (sialic acid is linked by ⁇ 2,3 or ⁇ 2,6 bond to lactose galactose) do.
  • the whole cell reaction refers to a reaction using whole cell without breaking down the cell containing the specific enzyme or using the cell contents or separating and purifying the enzyme, and the reaction of the present invention may be performed as a whole cell reaction.
  • each purified enzyme can be added independently, and each enzyme can be purified and fixed in the form of beads.
  • site directed mutagenesis refers to introducing a change in a designated base sequence at a designated position of a gene
  • saturation mutagenesis refers to introducing a change in various base sequences at a designated position of a gene.
  • Saturation mutation refers to inserting a mutation through PCR by inserting a NNK codon instead of a sequence to be mutated on a primer of a complementary sequence that binds to the template strand.
  • N in the NNK codon means A, T, G, C of the nucleotides
  • K means T, G.
  • Vectors refer to polynucleotides consisting of single-stranded, double-stranded, circular or ultra-stranded DNA or RNA, and may include components operably linked at appropriate distances to produce recombinant proteins.
  • Such components may include replication origins, promoters, enhancers, 5'mRNA leader sequences, ribosomal binding sites, nucleic acid cassettes, termination and polyadenylation sites, or selectable label formats, and such components may be used for specific applications. So one or more may be missing.
  • the nucleic acid cassette may comprise restriction enzyme sites for insertion of the recombinant protein to be expressed.
  • the nucleic acid cassette contains a nucleic acid sequence to be expressed that includes a translation initiation and termination site, and may use a vector capable of inserting two kinds of cassettes into the vector, if necessary, and the functions mentioned above may be added. Can be sequenced.
  • the gene inserted into the recombinant vector may be E. coli BW25113 (DE3), BL21 (DE3) for expression, but may vary depending on the type of the inserted vector.
  • E. coli BW25113 DE3
  • BL21 DE3
  • Such vectors and expression strains can be readily selected by those skilled in the art.
  • LacNAc was successfully used to obtain Lewis X as a lactose derivative.
  • various functional oligosaccharides such as sialyl Lewis X (SLeX) can be produced.
  • an enzymatic approach using two glycotransferases of ⁇ 1,4-GalT and ⁇ 2,3-SiaT was used to synthesize sialyl vancomycin derivatives, and vancomycin and vancomycin analogues (pseudo)
  • the combination of galactose and sialic acid was demonstrated in the glucose portion of vancomycin.
  • the antimicrobial activity of galactose-containing derivatives against MRSA and VSEF was the same or higher than that of galactose / sialic acid.
  • the transferase having a loose substrate specificity according to the present invention can be applied to the sialylation of other glycopeptide antibiotics or small molecules in nature to which sugars such as polyketide and nonribosomal peptide are bound.
  • 2,3-sialic acid transferase used in the present invention confirmed the substrate binding pocket portion from the crystal structure
  • 2,6-sialic acid transferase is a crystal of 2,6-sialic acid transferase derived from other photobacterium
  • the substrate binding part was confirmed from the model structure which used the structure as a template.
  • Residues located within 5-20 ⁇ s of CMP-N-acetylneuraminic acid and the receptor substrate were selected from 2,3-sialic acid transferase and 2,6-sialic acid transferase, respectively.
  • the wild type 2,3-Sylyltransferase used in the present invention is derived from Pasteurella multosida (ATCC15742), and the wild type 2,6-Sialyltransferase is derived from Photobacterium damselae (ATCC29690).
  • sequence alignment was performed using sequence information of bioinformatics, and preservation of amino acid residues at specific positions in the protein structure was excluded as variant residues.
  • residues selected above among the substrate binding residues a positional mutation with alanine was performed to select functional residues to undergo saturation mutation. Substitution with alanine can interpret whether a particular residue contributes important catalytic activity due to its interaction with the substrate, such as when the residue is removed. After substitution with alanine, the enzyme activity was measured by colorimetric method to compare the difference of activity with wild strains.
  • the alanine substitution mutant strain was selected to maintain the folding (folding) degree of the expressed protein compared to the wild strain.
  • the alanine substitution of the 2,3 and 2,6-sialic acid transferase showed at least 30%, preferably at least 50%, more preferably at least 60% of the activity of the alanine substitutional mutant strains and maintaining the folding of the protein.
  • the residue was selected as the functional residue to perform the next step of saturation variation.
  • the saturation mutation By performing saturation mutations on residues of alanine substitutional mutants that maintain the original activity and folding of the enzyme, leaving residues that essentially contribute to the interaction with the substrate in the catalysis, that is, the main activity of the sialic acid transfer
  • the saturation mutation can produce an enzyme-substrate complex of the active type that more appropriately fits the substrate than the wild strain.
  • a NNK sequence (N is A, C, G or T, and K is G or T), which randomly substitutes the AGA and ACC sequences corresponding to amino acid positions 313 and 265 of 2,3-sialic acid transferase PCR was performed on the whole vector using the prepared primers to construct a library. Since the 2,3-sialic acid transferase of the present invention is a form in which 24 amino acids are removed at the N-terminus, the 25th from the first methionine sequence becomes methionine.
  • a NNK sequence (N is A, C, G or T, and K is G or T) having randomly substituted ATT and CTG sequences corresponding to amino acid positions 411 and 433 of 2,6-sialic acid transferase Libraries were constructed by PCR of the entire vector using the prepared primers.
  • methionine is numbered 1 from the first methionine sequence.
  • the amplified gene of sialic acid transferase including the vector sequence was transformed into E. coli DH5a after Dpnase treatment to remove the original plasmid. Mutant genes were extracted from all generated colonies and transformed into E. coli BW25113 (DE3).
  • Each transformed colony was inoculated in 500 ⁇ L of LB medium containing ampicillin on 96-well and shaken incubated for 18 to 24 hours at 30-37 ° C., and then a portion of the culture solution was added with 100 ⁇ g mL ⁇ 1 ampicillin and IPTG. Inoculated in 500 ⁇ L LB medium and incubated for 18-40 hours at 18-30 °C. The cultured cells were centrifuged, and the cells were resuspended in 100 ⁇ L of 1-10 mM Tris buffer, and then 10 ⁇ L of all cells were used for mutant screening reaction or 50 ⁇ L of BugBuster protein extraction reagent.
  • the cell extracts were obtained after centrifugation, and 10 ⁇ L of the cells was used for the mutant strain search reaction.
  • 90 ⁇ L of the reaction solution contains 1 to 10 mM Tris buffer solution, 1 to 5 mM CMP-N-acetylneuraminic acid and lactose, 0.1 to 1 mM pH indicator, and simultaneously reacts with addition of 10 ⁇ L of whole cell or cell extract of sialic acid transferase. Proceed to observe the reaction rate of 10-30 minutes at a time interval of 1 minute compared to the wild strain.
  • Intrinsic activity of single amino acid substitution strains of 2,3 and 2,6-sialic acid transferase was analyzed by enzyme activity analysis using the pH indicator using the same amount of protein, respectively, and the reaction proceeded for 5-10 minutes. It was calculated as the activity (unit) per mg enzyme when the conversion yield of 10-25% relative to the initial receptor substrate concentration, it is shown in Table 1.
  • the arginine of R313 is located on a loop near the glucose of lactose.
  • the mutant strains substituted with small size amino acids such as alanine and glycine showed neutral activity compared to wild strains and were substituted with hydrophilic amino acids such as serine, threonine, tyrosine, aspartic acid, asparagine and histidine. Mutants were 1.5 times more active than wild strains.
  • T265 mutants located within 20 20 of CMP-N-acetylneuraminic acid the mutants substituted with glycine, serine and asparagine were found to have similar or higher activity than wild strains.
  • R313 As a result of comparing the relative activity of the wild type against the R313 mutants, R313 was able to accept a relatively wide range of mutants. Among them, R313N had the highest specific activity of 231% compared to the wild type. In addition, the relative intrinsic activity relative to the wild type for the T265 mutant strain is shown in Table 1.
  • the selected functional residues of the 2,6-sialic acid transferase were also screened by colorimetric method using a pH indicator for the mutant library after the saturation mutation was carried out by PCR using NNK codon.
  • I411 and L433 are located within 5-20 km of CMP-N-acetylneuraminic acid.
  • L433S and L433T showed a three-fold increase in activity compared to wild type.
  • I411T was found to be twice as active as the wild type.
  • the expression in the pET28a vector was increased compared to the pET15b vector.
  • the cloned strains were cloned into the pET28a vector to confirm their intrinsic activity (Table 1).
  • the single amino acid substitution variant R313N of R313 of 2,3-sialic acid transferase R313N is a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a hydrophilic amino acid sequence at the amino acid position of 313, and encoding the protein of SEQ ID NO: 2 DNA is SEQ ID NO: 8 and may also include all DNA sequences encoding the amino acids described above.
  • R313H represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and a protein having a hydrophilic amino acid sequence at the 313th amino acid position and an enzyme having a sialic acid transfer activity with 97% or more homology including this variant sequence are also possible.
  • the DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 9 and any DNA sequence encoding the amino acid may also be included.
  • T265S represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and a protein having a hydrophilic amino acid sequence at the 265th amino acid position and an enzyme having a sialic acid transfer activity with at least 97% homology including the variant sequence are also possible.
  • the DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 3 is SEQ ID NO: 10 and any DNA sequence encoding the amino acid may also be included.
  • the combination variant of R313N and T265S represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5
  • the combination variant of R313H and T265S represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • both a protein having a hydrophilic amino acid sequence at the 313th amino acid position or the 265th amino acid position and an enzyme having a sialic acid transfer activity with at least 97% homology including the variant sequence are possible.
  • the DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 5 is SEQ ID NO: 11
  • the DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 6 is SEQ ID NO: 12, and any DNA sequence encoding the amino acid may also be included.
  • An example having more than 97% homology with the above-described variant of 2,3-sialic acid transferase includes a mutated sequence of the above variant and is named or predicted to have activity of 2,3-sialic acid transferase.
  • a sequence derived from the genus Pasteurella in particular multocida species, may be included.
  • Kinetic parameters were analyzed using the colorimetric detection method using the colorimetric method, and the reaction was performed for 5 to 10 minutes at room temperature and showed a conversion yield of 10 to 25% of the initial receptor substrate concentration at intervals every 30 seconds. The initial reaction rate of was measured. Kinetic parameters were measured for both donor substrate CMP-N-acetylneuraminic acid and receptor substrate lactose, with substrate concentrations ranging from 0.1 to 30 mM. Kinetic parameters of kcat and K m were obtained by nonlinear regression of the Michaelis-Menten equation using the SigmaPlot program. Kinetic parameters for wild and mutant strains of 2,3-sialic acid transferase are shown in Table 2.
  • the single amino acid substitution variants R313N and R313H had increased k cat values for CMP-N-acetylneuraminic acid and lactose, and the k cat / K m of R313N and R313H for both substrates were about 1.4-fold and about 1.4, respectively. 1.2 fold increase.
  • the combination variants R313N / T265S and R313H / T265S increased the k cat value for both substrates, and the two combination variants increased k cat / K m about CMP-N-acetylneuraminic acid by about 1.6 fold.
  • R313N / T265S and R313H / T265S increased k cat / K m against lactose by 1.5 and 1.8 times, respectively.
  • a single amino acid substitution variant I411T of I411 of 2,6-sialic acid transferase I411T indicates an amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 and has a small size or hydrophilic amino acid sequence at the 411th amino acid position and the variant sequence All enzymes with homology of 55% or more and sialic acid transfer activity are possible.
  • the DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 14 is SEQ ID NO: 20 and may also include any DNA sequence encoding the above amino acids.
  • L433S represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15
  • L433T represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 and has a protein having a hydrophilic amino acid sequence at the 433th amino acid position and at least 55% homology including the variant sequence All enzymes with sialic acid transfer activity are possible.
  • DNAs encoding the proteins of SEQ ID NOs: 15 and 16 are SEQ ID NOs: 21 and 22 and any DNA sequence encoding the amino acids may also be included.
  • the combination variant of I411T and L433S represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, and the combination variant of I411T and L433T represents the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18.
  • a protein having a small size or a hydrophilic amino acid sequence at the 411th amino acid position or the 433th amino acid position and an enzyme having a sialic acid transfer activity with at least 55% homology including the variant sequence are possible.
  • the DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 17 is SEQ ID NO: 23 and the DNA encoding the protein of SEQ ID NO: 19 is SEQ ID NO: 24, and any DNA sequence encoding the amino acid may also be included.
  • An example having at least 55% homology with a variant of the 2,6-sialic acid transferase described above includes a mutated sequence of the variant and is named or predicted to have activity of 2,6-sialic acid transferase.
  • sequences from the genus Photobacterium in particular Photobacterium damseale and Photobacterium leiognathi , may be included.
  • the photobacterium Jt-Ish-224 2,6-sialic acid transfer which is a template protein forming the protein model structure of the present invention, having 55% homology with the 2,6-sialic acid transferase of the present invention. Sequences of enzymes may be included.
  • a single amino acid substitution mutant of I411T of 2,6-sialic acid transferase having a high intrinsic activity and a single amino acid substitution mutant of L433S and L433T were made, respectively, and among the combination mutants, I411T / L433S And I411T / L433T showed higher intrinsic activity of 194% and 510%, respectively.
  • kinetic parameters were measured for single amino acid substitution variants and combination variants and are shown in Table 3.
  • k cat / K m increased 2.4-fold and 2.6-fold, respectively
  • L433T increased affinity with the substrate for the I411T and L433S single amino acid substitution mutants.
  • the k cat / k m was increased 6.7 fold compared to wild state.
  • k cat increased 4.5-fold compared to wild strain and k cat / K m increased 2-fold and 8-fold, respectively.
  • Variants of the 2,3 and 2,6-sialic acid transferase produced through the present invention as well as the above-mentioned lactose receptor substrate as well as the disaccharide receptor substrate, N-acetyllactosamine (LacNAc), azaido ⁇ -D- Galactopyranosyl- (1-4) - ⁇ -D-glucopyranoside (Lac ⁇ N3), 3-Azaidopropyl ⁇ -D-galactopyranosyl- (1-4) - ⁇ -D-glucopyrano It can be applied to various oligosaccharide substrates including galactose moieties, including the side (Lac ⁇ ProN3), methyl ⁇ -D-galactopyranosyl- (1-4) - ⁇ -D-glucopyranoside (Lac ⁇ OMe).
  • LacNAc N-acetyllactosamine
  • Lac ⁇ N3 azaido ⁇ -D- Galactopyranos
  • mutant strains of 2,3 and 2,6-sialic acid transferase produced through the present invention as well as the above-mentioned CMP-N-acetylneuraminic acid donor substrate, as well as cytidine monophosphate diaminoneuraminic acid (CMP- KDN, CMP-deaminoneuraminic acid) and cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid (CMP-Neu5Gc, CMP-N-glycolylneuraminic acid) can be applied to various derivative substrates.
  • CMP- KDN CMP-deaminoneuraminic acid
  • CMP-Neu5Gc CMP-N-glycolylneuraminic acid
  • Enzymes used in the preparation of CMP-N-acetylneuraminic acid from N-acetyl-D-glucosamine include cytidine monophosphate kinase (CMK), acetate kinase (ACK), N-acetylneuraminic acid aldolase (NAN), CMP-N-acetylneuraminic acid synthase (CMP-NeuAc synthetase, NEU) and N-acetylglucosamine-2-epimerase (GlcNAc-2- epimerase (NANE), and the enzyme for producing 2,3-sialylactose by reacting CMP-N-acetylneuraminic acid with lactose is 2,3-sialic acid transferase, CMP-N-acetylneuramid
  • the enzyme for producing 2,6-sialylactose by reacting acid with lactose is 2,6-sialic acid transferas
  • nanE gene encoding the N-acetylglucosamine-2-epimerase (GlcNAc 2-epimerase, SEQ ID NO: 25) from the genome of the bacteroid Praxilis NCTC 9343 (Bacteroides fragilis NCTC 9343, NC_003228).
  • the nanE gene was amplified by PCR using chromosomal DNA of strain Bacteroides fragilis NCTC 9343 as a template and primers of SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 27.
  • the amplified PCR product was purified, digested with restriction enzymes NcoI and BamHI, and linked to plasmid pET28a (+) (Novagen) T4 DNA (Takara) digested with the same restriction enzymes NcoI and BamHI using ligase. And recombinant vector pNANe was prepared. The recombinant vector was introduced into E. coli BL21 (DE3) (Invitrogen) to obtain E. coli / pNANe.
  • nanA gene which encodes N-acetylneuraminic acid dorado (NeuNAc aldolase)
  • the chromosomal DNA of E. coli K-12 C600 (KCTC 1116) strain was templated.
  • the nanA gene was amplified by PCR using primers of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30.
  • the amplified PCR product was purified, digested with restriction enzymes NcoI and XhoI, and linked to plasmid pET32a (+) (Novagen) T4 DNA (Takara) digested with the same restriction enzymes NcoI and XhoI using ligase.
  • the recombinant vector pNANa was produced.
  • the pNANa was introduced into E. coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) to obtain E. coli / pNANa.
  • Chromosomes of E. coli K-12 (KCTC 1116) strains for cloning the cmk gene (SEQ ID NO: 31) encoding cytidine 5'monophosphate kinase DNA was used as a template and the cmk gene was amplified by PCR using primers of SEQ ID NO: 32 and SEQ ID NO: 33.
  • SEQ ID NO: 32 5′-cat atg acggca att gcc ccg gtt att ac
  • the amplified PCR product was purified, digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI and linked to plasmid pET22b (+) (Novagen) T4 DNA (Takara) digested with the same restriction enzymes NdeI and EcoRI using ligase.
  • Recombinant vector pCMK was prepared.
  • the pCMK was introduced into E. coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) to give E. coli / pCMK.
  • the primer of number 36 was used to amplify the ack gene by PCR.
  • the amplified PCR product was purified, digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, ligated to plasmid pET24ma (+) (Novagen) T4 DNA (Takara) digested with the same restriction enzymes NdeI and EcoRI, using ligase, Recombinant vector pACKa was prepared.
  • the pACKa was introduced into E. coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen) to prepare E. coli / pACKa.
  • CMP-N-acetylneuraminic acid synthase CMP-NeuNAc synthetase, NEU
  • the neu gene (SEQ ID NO: 37) encoding CMP-N-acetylneuraminic acid synthase (CMP-NeuNAc synthetase), chromosomal DNA of Neisseria meningitidis (Koram Biotech) strain was used as a template.
  • the neu gene was amplified by PCR using primer DNAs of SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39.
  • the amplified PCR product was purified, digested with restriction enzymes NdeI and EcoRI, and ligated to the plasmid pET32a (+) (Novagen) T4 DNA (Takara) digested with the same restriction enzymes NdeI and EcoRI.
  • Recombinant vector pSYNb was prepared.
  • Enzymes such as N-acetylglucosamine-2-epimerase (GlcNAc 2-epimerase) were purified by precipitation and ion exchange resin columns using ammonium sulfate (Protein purification techniqes 2nd edition, Oxford University Press). , 2001).
  • CMK cytidine monophosphate kinase
  • ACK acetate kinase
  • NAN N- Acetylneuramid aldolase
  • NEU CMP-N-acetylneuraminic acid synthase
  • GlcNAc-2-epimerase N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • the chemical reaction for producing 2,3-sialylactose or 2,6-sialylactose from N-acetyl-D-glucosamine is shown in FIG. 1, and is an expensive substrate based on performance in a single reaction vessel. It is shown that the Dean 5'-monophosphate (CMP) can be recycled.
  • CMP Dean 5'-monophosphate
  • Reaction mixture [5-10 mM cytidine 5'- monophosphate (CMP, Shanghai QZU Bioscience & Biotechnology), 20-80 mM N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc, Shanghai Jiubang Chemical), 40-120 mM pyruvate (Sodium pyruvate, ZMC) Inc), 40-120 mM Lactose, DMV Inc, 20 mM MgCl 2 H 2 O (Duksan), 1 mM NTP (Nucleotide triphosphate, sigma), 80-300 mM Acetyl phosphate (sigma), 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.0), maintained at pH 6.5-8.0 using 2 M NaOH at 37 ° C.] was synthesized with cytidine monophosphate kinase (CMK), acetate kinase (ACK), N-acetylneuraminic acid Aldolase (Neu), CMP-N-acet
  • Electrochemical Detector gold electrode
  • 2,6-sialic acid which is 2,6-sialic acid transferase, instead of 2,3-sialic acid transferase, is added to the reaction solution.
  • Transfer reaction (2,6STN L433S) was added to the reaction to synthesize 2,6-sialylactose (FIG. 4).
  • Reaction mixture [5-10 mM cytidine 5'-monophosphate (CMP), 20-80 mM N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), 40-120 mM sodium pyruvate, 40-120 mM Galactose 20 mM MgCl 2 Maintaining pH 6.5-8.0 using H 2 O, 1 mM Nucleotide triphosphate (NTP), 80-300 mM acetyl phosphate, 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.0), 37 ° C.
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • NDP Nucleotide triphosphate
  • Tris HCl buffer pH 7.0
  • CMP-N-acetylneuraminic acid synthase CMP-NeuAc synthetase (NEU)
  • GlcNAc-2-epimerase N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • PST2,3st R313N 2,3-sialic acid transferase
  • Reaction mixture [5-10 mM cytidine 5'- monophosphate (CMP), 20-80 mM N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), 40-120 mM sodium pyruvate, 40-120 mM galactose terminal aminonucleic linker, 20 mM MgCl 2 H 2 O, 1 mM Nucleotide triphosphate (NTP), 80-300 mM acetyl phosphate, 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.0), 37 ° C.
  • CMP cytidine 5'- monophosphate
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • CCMK 5'-monophosphate kinase
  • ACK N-acetylneuraminic acid aldolase
  • NAN N-acetylneuraminic acid aldolase
  • CMP-NeuAc synthetase N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • GlcNAc-2-epimerase N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • NANE 2,3-sialic acid transferase (2,3-Sialyltransferase
  • Reaction mixture [5-10 mM cytidine 5'-monophosphate (CMP), 20-80 mM N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), 40-120 mM sodium pyruvate, 40-120 mM flavonoid CSH-I-54 Lactose derivative, 20 mM MgCl 2 H 2 O, 1 mM Nucleotide triphosphate (NTP), 80-300 mM acetyl phosphate, 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.0), pH 6.5-8.0 using 37 ° C.
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • CMP-NeuAc synthetase, NEU CMP-N-acetylneuraminic acid Synthetase
  • GlcNAc-2-epimerase N-acetylglucosamine-2-epimerase
  • NANE 2,3-sialic acid transferase
  • Reaction mixture [5-10 mM cytidine 5'-monophosphate (CMP), 20-80 mM N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), 40-120 mM sodium pyruvate, 40-120 mM tacrolimus galactose derivative, 20 mM MgCl 2 Maintaining pH 6.5-8.0 using H 2 O, 1 mM Nucleotide triphosphate (NTP), 80-300 mM acetyl phosphate, 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.0), 37 ° C.
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • Reaction mixture [5-10 mM cytidine 5'- monophosphate (CMP), 20-80 mM N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), 40-120 mM sodium pyruvate, 40-120 mM Taxol galactose derivative, 20 mM MgCl 2 Maintaining pH 6.5-8.0 using H 2 O, 1 mM Nucleotide triphosphate (NTP), 80-300 mM acetyl phosphate, 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.0), 37 ° C.
  • CMP cytidine 5'- monophosphate
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • Reaction mixture [5-10 mM cytidine 5'- monophosphate (CMP), 20-80 mM N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), 40-120 mM sodium pyruvate, 40-120 mM vancomycin galactose derivative, 20 mM MgCl 2 Maintaining pH 6.5-8.0 using H 2 O, 1 mM Nucleotide triphosphate (NTP), 80-300 mM acetyl phosphate, 50 mM Tris HCl buffer (pH 7.0), 37 ° C.
  • CMP cytidine 5'- monophosphate
  • GlcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • VcNAc N-acetyl-D-glucosamine
  • VcNAc N-120 mM vancomycin galactose derivative
  • 20 mM MgCl 2 Maintaining pH 6.5-8.0 using H 2 O, 1 mM
  • CMP cytidine 5'-monophosphate
  • inexpensive N-acetyl Sialic acid derivatives can be prepared using -D-glucosamine and pyruvic acid as substrates, and the sialic acid derivatives can be produced more efficiently.

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Abstract

본 발명은 하나의 반응기 내에서, N-아세틸-D-글루코사민을 이용하여 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 공정과 갈락토오스 또는 갈락토오스 유도체에 시알산을 결합시키는 시알산(뉴라민산) 유도체를 제조하는 공정을 함께 수행하는 것을 특징으로 하는 시알산 유도체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 고가의 시티딘 5'-일인산(CMP)을 반응용기 내에서 재활용할 수 있어, 반응에 투입되는 시티딘 5'-일인산(CMP)양을 줄이고, 저가의 N-아세틸-D-글루코사민과 피루브산을 기질로 하여, 시알산 유도체를 제조할 수 있으며, 보다 고효율로 시알산 유도체를 제조할 수 있는 효과가 있다.

Description

시알산 유도체의 제조방법
본 발명은 하나의 반응기 내에서, N-아세틸-D-글루코사민(N-acetyl-D-glucosamine, GlcNAc)으로부터 CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-NeuAc)을 제조하는 공정과 락토오스 등 갈락토오스를 포함하는 유도체에 시알산을 결합시키는 시알산(뉴라민산) 유도체를 제조하는 공정을 함께 수행하는 것을 특징으로 하는 시알산 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
당(sugar)은 자연계에서 가장 넓고 풍부하게 존재하는 생체분자 중에 하나이며, 세포에서 인식 및 신호전달에 관여하는 가장 일반적인 분자이다. 대부분의 당 구성단위는 핵산에 의해서 활성화될 때 aglycon에 부가될 수 있다. 핵산당(nucleotide-sugar)은 단당류들의 활성화된 형태이며, 당전이 효소(glycosyltransferase)에 의한 당전이 반응에서 공여체로써 역할을 한다. 그러나 당전이는 아직까지 당전이 효소의 반응성이 약하고, 활성화된 glycan 구성단위들의 활용이 제한적인 점 등의 문제점을 가지고 있다.
최근, 당쇄에 관한 구조 및 기능에 관한 연구가 급속하게 진행되어 생리 활성을 갖는 올리고당, 당 지질, 당 단백질 등의 의약품 또는 기능성 소재로서의 용도 개발이 활발히 이루어지고 있다. 그 중, 말단에 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 함유하는 시알산 함유 당쇄는 세포 접착이나 바이러스 감염시 수용체가 되는 등 중요한 기능을 갖는 당쇄이다.
시알산 함유 당쇄는 일반적으로 시알산 전이효소의 촉매작용에 의해 합성된다. 시알산 전이효소는 CMP-N-아세틸뉴라민산을 당 공급체로 하여 당쇄 등의 수용체에 시알산을 전달하는 효소이다. 그러나, 당 공급체로서 사용하는 CMP-N-아세틸뉴라민산은 매우 비싸고 양적으로도 시약 수준의 적은 양으로밖에 공급되지 않는 것이 현실이다.
CMP-N-아세틸뉴라민산의 제조방법으로는 시티딘 5’-삼인산(CTP)과 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 기질로 하여 CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (synthetase)의 촉매에 의해 합성하는 방법이 알려져 있으나, 원료가 되는 CTP 및 NeuAc가 고가이기 때문에 직접 원료로 하여 합성된 CMP-N-아세틸뉴라민산도 고가일 수 밖에 없다.
CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-N-acetylneuraminic acid, CMP-NeuAc)의 생산방법으로는 (1) N-아세틸뉴라민산 리아제 (lyase)또는 N-아세틸뉴라민산 신타아제를 사용하여 N-아세틸-D-만노사민(N-acetyl-D-mannosamine, ManNAc)으로부터 제조하는 방법(J. Am. Chem. Soc., 110:6481, 1988; J. Am. Chem. Soc., 110:7159, 1988; 일본공개특허 평 제10-4961호), (2) 알칼리 조건하에서 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)을 N-아세틸-D-만노사민(ManNAc)으로 변환시키고, 여기에 N-아세틸뉴라민산 리아제 또는 N-아세틸뉴라민산 신타아제를 첨가하여 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 제조하는 방법(일본공개특허 평 제5-211884호; Biotechnol. Bioeng., 66:2, 1999; Enzyme Microb. Technol., 20, 1997), (3) GlcNAc에서 ManNAc로의 변환을 촉매하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 2-에피머라아제 (epimerase)와 N-아세틸뉴라민산 리아제 또는 N-아세틸뉴라민산 신타아제를 사용하여 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)로부터 N-아세틸뉴라민산(NeuAc)을 제조하는 방법 (WO 95/26399; 일본공개특허 평3-180190호; 일본공개특허 2001-136982호), (4) 대장균과 효모 균체를 이용하여 CMP-N-아세틸뉴라민산을 합성하는 방법(WO 2004/009830) 등이 보고되고 있다.
그러나, (1)의 방법은 원료인 N-아세틸-D-만노사민(ManNAc)이 고가이고, (2)의 방법은 저렴한 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)을 원료로 하는 방법이기는 하지만, GlcNAc과 N-아세틸-D-만노사민(ManNAc)의 혼합물에서 ManNAc를 정제하는 공정이 복잡하다는 문제가 있다. 또한, (3)의 방법에서 사용하는 GlcNAc2-에피머라아제는 ATP(아데노신 트리 포스페이트)가 필요하기 때문에 고가의 ATP를 첨가하거나, 미생물을 사용하여 ATP의 전구체인 아데닌에서 ATP를 생성시켜야 한다는 단점이 있고, (4)의 방법은 대장균과 효모 균체를 이용하는 방법이 공정상 복잡하다는 문제가 있다.
대한민국공개특허 제10-2006-0010706호에서는 CMP-N-아세틸뉴라민산의 제조방법으로, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제를 코딩하는 유전자 및 N-아세틸뉴라민산 알도라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 공발현 벡터가 도입된 형질전환체에 시티딘 5’-일인산(CMP), N-아세틸-D-글루코사민, 피루브산(Sodium pyruvate) 및 효모를 첨가하여 뉴라민산을 합성한 후, CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소를 첨가하거나, N-아세틸뉴라민산 알도라제를 코딩하는 유전자 및 CMP-N-아세틸뉴라민산 합성효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 공발현 벡터가 도입된 형질전환체에 시티딘 5’-일인산(CMP), N-아세틸-D-글루코사민, 피루브산 및 효모를 첨가하여 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법을 개시하고 있으나, CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는데 있어 여러 단계를 거쳐야 하고, 기질로 사용되는 시티딘 5'-일인산(CMP)이 시티딘 5'-삼인산(CTP)로 전환되는 수율이 낮은 문제점이 있었다.
당단백질, 당지질에 시알릴올리고당들과 푸코스(fucose)당이 포함된 glycan 들은 생물학적 과정에서 여러 가지로 매우 중요한 역할을 한다.
그러나, 종래 알려진 시알산과 생리활성물질 유도체들을 결합시키는 반응은 고가의 CMP-N-아세틸뉴라민산을 출발물질로하여, 시알산 전이효소(Sialyltransferase)에 의하여 제조되고, 제조효율 또한 낮은 단점이 있었으며, N-아세틸-D-글루코사민을 출발물질로 하여, 시알산 유도체를 제조한 기술도 존재하였으나, 시알산 전이효소의 활성범위와 활성이 떨어져 시알산 유도체의 제조효율이 낮은 단점이 있었다(김대희, 선문대학교 대학원 이학박사학위논문, 2011).
이에, 본 발명자들은 보다 경제적이면서도 높은 효율로 생리활성물질의 시알산 유도체를 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, N-아세틸-D-글루코사민과 시티딘 5’-일인산(CMP)를 출발물질로하여, CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 단계와 CMP-N-아세틸뉴라민산으로부터 시알산과 결합한 생리활성물질 유도체를 제조하는 단계를 시알산 전이효소 변이주를 이용하여, 단일 반응용기에서 수행하는 경우, 고가원료인 시티딘 5'-일인산(CMP)의 재활용이 가능하고, 높은 수율로 생리활성 물질의 시알산 유도체를 제조할 수 있다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 높은 수율과 낮은 단가로 시알산 유도체를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 단일반응 용기에서, 시티딘 5'-일인산(Cytidine 5’-monophosphate, CMP), NTP(Nucleotide triphosphate), 피루브산(Sodium pyruvate), 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물을 기질로 첨가하고, 시티딘 5’-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), CMP-N-아세틸뉴라민산 합성 효소(CMP-NeuAc synthetase, NEU), N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN) 및 시알산 전이효소(Sialyltransferase)를 첨가한 반응액을 반응시켜 시알릴락토오스(Sialyllactose) 또는 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물의 시알산 유도체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 시알릴락토오스 또는 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물의 시알산 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 시알산 유도체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 원팟 (One-pot, 일체형 회분식) 반응으로 2,3-시알릴락토오스 및 2,6-시알릴락토오스를 제조하는 합성과정을 나타낸 것이다.
도 2는 2,3 시알산 전이효소 변이체의 2,6 시알산 전이 부반응을 확인한 것으로, (a)는 pH 4.5~6.0의 조건에서의 결과를 나타낸 것이고, (b)는 pH 6.5~7.0의 조건에서의 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 2,3-시알릴락토오스를 LC와 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 2,6-시알릴락토오스를 LC와 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 원팟 반응으로 시알릴갈락토오스를 제조하는 합성과정을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 시알릴갈락토오스를 TLC 및 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 락토오스와 결합된 링커의 시알산 유도체 합성과정을 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 락토오스와 결합된 링커의 시알산 유도체(aminohexyl linker 2,3-sialyllactose)를 TLC 및 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 플라보노이드 CSH-I-54의 갈락토오스 잔기를 포함하는 유도체의 시알산 유도체의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 2,3-시알릴락토오스-CSH-I-54를 LC 및 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 면역억제제 타크로리무스 (tacrolimus) 갈락토오스 유도체의 시알산 유도체의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 2,3-시알릴락토오스-타크로리무스를 LC 및 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 항암제 탁솔 (taxol) 갈락토오스 유도체의 시알산 유도체의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 2,3-시알릴락토오스-탁솔을 LC 및 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 항생제 반코마이신 (vancomycin) 유도체의 시알산 유도체의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 16a는 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 2,3-시알릴락토오스-반코마이신을 LC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16b는 본 발명의 원팟 반응으로 합성된 2,3-시알릴락토오스-반코마이신을 Mass로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 (a) 시티딘 5’-일인산(CMP), 아세틸 포스페이트, NTP(Nucleotide triphosphate), N-아세틸-D-글루코사민, 피루브산 및 갈락토오스 또는 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합을 기질로 첨가하고, 시티딘 5’-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU), N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN) 및 시알산 전이효소(Sialyltransferase)를 첨가한 반응액을 반응시켜 시알릴락토오스 또는 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물의 시알산 유도체를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 제조된 시알릴락토오스 또는 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물의 시알산 유도체를 수득하는 단계를 포함하는 시알산 유도체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 시알산 유도체의 제조방법에 따르면 하나의 반응기 내에서, N-아세틸-D-글루코사민으로부터 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 공정과 갈락토오스를 포함하는 유도체에 시알산을 결합시키는 시알산(뉴라민산) 유도체를 제조하는 공정을 함께 수행하여, 고가의 기질인 시티딘 5'-일인산(CMP)를 재활용할 수 있으면서, 높은 수율로 시알산 유도체를 제조할 수 있다.
종래 시알산 유도체의 제조방법은 CMP-N-아세틸뉴라민산을 출발물질로 하여, 시알산 전이효소(sialyltransferase)에 의해 락토오스 또는 갈락토오스를 포함하는 유도체에 시알산을 결합시키는 공정이었으나, CMP-N-아세틸뉴라민산이 매우 고가의 물질이므로, 시알산 유도체 생산에 많은 비용이 소요되었다.
본 발명자들은 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343) 유래 신규 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 효소를 이용하여, 시티딘 5'-일인산(CMP) 및 극소량의 NTP와 여러 기질과 효소를 사용하여, 고수율로 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 방법을 개발한 바 있다(대한민국 등록특허 제0888513호).
CMP-N-아세틸뉴라민산과 락토오스를 시알산 전이효소와 반응시키면, 락토오스에 시알산이 전이되면서, 시알릴락토오스와 시티딘 5'-일인산(CMP)가 생성되게 된다. 종래의 시알릴락토오스 제조공정에서는 시티딘 5'-일인산(CMP)를 기질로 하여 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 공정과 시알산 전이 공정이 다른 용기에서 진행되어, 상기 생성되는 시티딘 5’-일인산(CMP)를 재활용할 수가 없었다.
본 발명에서는 시티딘 5’-일인산(CMP)로부터 CMP-N-아세틸뉴라민산이 제조되는 반응과 CMP-N-아세틸뉴라민산과 락토오스 등과 같은 갈락토오스를 포함하는 유도체에 시알산 전이효소에 의하여 시알산 유도체와 시티딘 5'-일인산(CMP)가 생성되는 반응이 동일한 반응용기에서 수행되므로, 시알산 전이 반응에 의해 생성된 시티딘 5’-일인산(CMP)를 CMP-N-아세틸뉴라민산 제조 반응에 재활용할 수 있다.
본 발명에 따른 단일용기에서의 2,3-시알릴락토오스 및 2,6-시알릴락토오스를 제조하는 합성과정을 도 1에 나타내었다.
본 발명의 일 양태에서, 시알릴락토오스(sialyllactose)는 in vitro에서 저렴한 기질인 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 피루브산(Sodium pyruvate), 시티딘 5’-일인산(CMP) 등으로부터 원팟 반응으로 생산한다. 7.5mM/hr~8.5mM/hr의 CMP-N-아세틸뉴라민산 생성 속도하에서 시알릴락토오스의 전환율은 시티딘 5'-일인산(CMP) 기준으로 650%이고 N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc)로부터 81%이다. 98% 이상의 순도를 가지는 시알릴락토오스의 정제 수율은 75%이다. In situ의 시티딘 5’-일인산(CMP) 재사용 시스템에 의한 시알릴락토오스 생산은 세포 추출액 효소를 이용하여 성공적으로 수행되었다.
본 발명의 다른 양태에서는 본 발명에 따른 원팟 시알릴락토오스 생산방법과 기존의 투팟(two-pot) 시알릴락토오스 제조방법을 비교한 결과, 본 발명의 원팟 시알릴락토오스 생산방법이, 첨가하는 시티딘 5’-일인산(CMP)의 농도가 1/5로 줄어도, 생산되는 시알릴락토오스의 량은 2배 증가하는 것을 확인하였다(표 4 참조).
본 발명에서, 시알산 전이효소(Sialyltransferase)는 2,3-시알산 전이효소, 2,6-시알산 전이효소 또는 2,8-시알산 전이효소를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2,3-시알산 전이효소 또는 2,6-시알산 전이효소를 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서는 CMP-N-아세틸뉴라민산이 제조되는 반응에 관여하는 효소인 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE)과 동일한 활성 조건에서도 높은 활성을 나타내는 시알산 전이효소(Sialyltransferase)를 개발하기 위하여, 파스텔라 멀토시다(Pasteurella multocida) 유래의 2,3-시알산 전이효소와 포토박테리움 담셀라(Photobacterium damselae) 균주 유래의 2,6-시알산 전이효소를 변이시켜, 상기 다른 효소들과 동일 조건에서 높은 활성을 가지는 변이효소를 개발하였다.
따라서 본 발명의 2,3-시알산 전이효소는 서열번호 2~6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 2,3-시알산 전이효소의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있고, 본 발명의 2,6-시알산 전이효소는 서열번호 14~18 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 2,6-시알산 전이효소의 변이효소인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 시알산 유도체의 제조반응은 반응에 관여하는 각 효소의 활성온도를 감안하여 25~38℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 반응에 관여하는 각 효소의 활성 pH를 감안하여, pH 7~9에서 수행하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE)는 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343)유래 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제 효소인 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 효소를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물은 단당, 올리고당, 링커, 플라보노이드, 항암제, 항생제, 면역억제제 및 항체로 구성되는 군에서 선택되는 화합물의 갈락토오스를 포함하는 유도체인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단당은 글루코오스, N-아세틸-D-글루코사민, 만노스 등일 수 있으며, 상기 링커는 에스테르 또는 아마이드 결합을 활용하여 연결할 수 있는 관능기일 수 있으며, 예를 들면, 포밀(Formyl), 아세틸기, 프로핀오닐(propionyl)기, 부틸기, 아크릴기, 에틸석시닐(ethylsuccinyl)기, 석시닐(succinyl)기, 아미노헥실(aminohexyl)기 등을 연결할 수 있는 링커를 의미한다.
본 발명에 이용된 2,6-시알산 전이효소의 변이주는 포토박테리움 담셀라 (Photobacterium damselae) 균주에서 유래하며 당전이 효소의 구조 접힘과 서열로 볼때 파스테우렐라에서 유래한 2,3-시알산 전이효소와 같은 GT family 80에 속한다. 포토박테리움 유래의 2,6-시알산 전이효소의 경우에도 최근 2,6 시알릴다아제와 시알릴트랜스퍼라아제의 활성이 밝혀졌으나 이러한 부반응의 활성이 2,6-시알산 전이의 활성보다 매우 미미하기 때문에 (150배 이상) 시알산 전이의 활성이 대부분이라 볼 수 있다. 2,6-시알산 전이효소의 경우 부반응이 거의 없고 2,6-시알산 전이의 활성이 대부분이며 기질 특이성이 다양하다는 장점을 가진 반면, 효소 활성의 차이가 파스테우렐라 유래의 2,3-시알산 전이효소보다 5-6배 이상 낮은 단점을 가지고 있다.
2,3 및 2,6 결합을 가지는 다양한 시알릴올리고당의 생산 효율을 증가시키기 위해서는 위에서 명시한 기질특이성이 다양한 2,3 및 2,6-시알산 전이효소의 기능이 향상된 변이주를 생성하고 이들을 시알릴올리고당 생산에 응용할 필요가 있다.
시알산 전이효소의 시알산 공여체인 CMP-N-아세틸뉴라민산의 다섯 가지 효소에 의한 생합성은 중성 pH에서 최적의 생산성을 나타내는 반면, 2,3-전이효소에 의한 시알산 전이 반응은 pH 8~9에서 최적의 반응성을 나타낸다. 이는 2,3-시알산 전이효소가 넓은 범위의 pH내에서 활성을 나타내지만 중성 pH 이하에서 부반응을 나타내는 다기능적 특성에 기인한다. 중성 pH이하에서는 2,3-시알산 전이효소에 의해 2,6-시알릴락토오스가 부가적으로 생성되기 때문에 기존의 반응에서는 중성 pH에서 CMP-N-아세틸뉴라민산을 생산하고 완충용액을 pH 8내지 9로 전환하는 단계를 거쳐 2,3-시알산 전이효소를 적용하는 2단계의 반응을 수행하였다. 따라서 2,3-시알산 전이효소의 경우 부반응의 생성을 억제함으로써 회분식 일체형 반응을 가능케 하고 촉매반응을 빠르게 하여 2,3-시알릴락토오스를 포함한 다양한 2,3-시알릴유도체의 생산성 및 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서는 시알산 전이효소의 변이주를 생성하기 위하여, 하이브리드(hybrid) 즉, 세미-래셔널(semi-rational) 방법을 사용하였다. 이 방법은 방향성 진화 (directed evolution)와 논리적 예측 (rational design) 방법을 결합한 것으로서 양질의 적은 수의 변이주 라이브러리만을 확보하고자 하기 위함이다. 이 방법은 단백질의 목적이 되는 부분을 분석하고 단백질의 서열, 구조와 기능 및 컴퓨터 프로그램을 이용하여 특정 아미노산의 잔기를 선택하여 변이를 수행하는 것을 말한다.
본 발명에서, 시알산 전이효소는 를루아르 당전이 효소로서, CMP-N-아세틸뉴라민산으로부터 N-아세틸뉴라민산을 수용체 당물질에 전이하는 효소를 의미한다. 수용체 기질 중 하나인, 락토오스는 Galβ1,4Glc (갈락토오스와 글루코오스가 β1,4 결합으로 연결됨)로 구성된 올리고당이다.
2,3- 및 2,6-시알릴올리고당은 N-아세틸뉴라민산 (시알산)이 갈락토오스 부분에 a2,3 또는 a2,6 결합으로 연결된 올리고당을 의미하며, 갈락토오스 또는 글루코오스에 다른 당이 더 결합할 수 있다. 2,3- 및 2,6-시알릴락토오스는 Neu5Aca2,3/2,6Galβ,4Glc (시알산이 락토오스의 갈락토오스에 α2,3 또는 α2,6 결합으로 연결됨)로 구성된 삼탄당 (triose) 물질을 의미한다.
본 발명에서, 전세포 반응은 특정 효소를 포함하는 세포를 파쇄하여 세포 내용물을 이용하거나 또는 효소를 분리정제하지 않고 온전한 세포 전체를 이용한 반응을 의미하며, 본 발명의 반응은 전세포반응으로 수행할 수도 있고, 정제된 각각의 효소를 독립적으로 첨가하여 수행할 수 있으며, 각각의 효소를 정제하여 비드형태로 고정하여 수행할 수도 있다.
본 발명에서, 위치지정 돌연변이 (site directed mutagenesis)는 유전자의 지정된 위치에 지정된 염기배열의 변화를 도입하는 것을 말하며, 포화 변이 (saturation mutagenesis)는 유전자의 지정된 위치에 다양한 염기배열의 변화를 도입하는 것을 말한다. 포화 변이는 주형가닥에 결합하는 상보적인 서열의 프라이머 (primer)상에 변이시키고자 하는 서열대신 NNK 코돈 (codon)을 삽입하여 PCR을 통해 변이를 삽입시키는 것을 말한다. 이 때, NNK 코돈에서 N은 뉴클레오디드의 A, T, G, C를 의미하며 K는 T, G를 의미한다.
벡터는 단일가닥, 이중가닥, 원형 또는 초나선 DNA 또는 RNA로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 적절한 거리에 작동적으로 연결되어 있는 구성요소들을 포함할 수 있다.
이러한 구성요소에는 복제 오리진, 프로모터, 인핸서, 5’mRNA 리더 서열, 리보솜 결합부위, 핵산 카세트, 종결 및 폴리아데닐화 부위, 또는 선별 가능한 표지 서식 등이 포함될 수 있으며, 상기 구성요소들은 특이적인 용도에 따라 하나 또는 그 이상이 빠질 수도 있다. 핵산 카세트는 발현할 재조합 단백질의 삽입을 위한 제한효소 부위를 포함할 수 있다. 기능적 벡터에 있어서, 핵산 카세트는 번역 개시 및 종결 부위를 포함하는 발현될 핵산 서열을 함유하며, 필요에 따라 벡터에 내에 두 종류의 카세트를 삽입할 수 있는 벡터를 사용하기도 하며 상기 언급한 기능들이 부가적으로 서열화 될 수 있다.
재조합 벡터에 삽입된 유전자는 발현용 대장균 BW25113(DE3), BL21(DE3) 등을 사용할 수 있으나, 삽입된 벡터의 종류에 따라 달라질 수 있다. 이러한 벡터 및 발현 균주는 당업자라면 용이하게 선택할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는 락토오스 유도체로, LacNAc를 사용하여, Lewis X을 성공적으로 얻을 수 있었다. 본 발명에 따르면 sialyl Lewis X(SLeX)와 같은 다양한 기능성 올리고당들을 생산할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는 시알릴 반코마이신(vancomycin) 유도체들을 합성하기 위하여 β1,4-GalT와 α2,3-SiaT 2개의 당전이 효소를 이용한 효소적인 접근방법을 사용하였고, 반코마이신과 반코마이신 유사체(pseudo-vancomycin)의 글루코오스(glucose) 부분에 갈락토오스(galactose)와 시알산의 결합을 증명하였다. 게다가 MIC 시험 결과 갈락토오스를 포함한 유도체들의 MRSA와 VSEF에 대한 항생제 활성은 갈락토오스/시알산을 포한한 유도체보다 같거나 높았다. 본 발명에 따른 느슨한 기질 특이성을 가지는 전이효소는 다른 glycopeptide 항생제들이나 polyketide와 nonribosomal peptide 같은 당이 결합된 자연계의 작은 분자들의 시알릴레이션(sialylation)에 적용할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 시알산전이효소의 변이주의 제조
본 발명에서 사용되는 2,3-시알산 전이효소는 결정구조로부터 기질 결합 포켓부분을 확인하였으며, 2,6-시알산 전이효소는 다른 포토박테리움 유래의 2,6-시알산 전이효소의 결정구조를 주형으로 한 모델구조로부터 기질 결합 부분을 확인하였다. CMP-N-아세틸뉴라민산과 수용체 기질로부터 5~20 Å이내에 위치하는 잔기들을 각각의 2,3-시알산 전이효소와 2,6-시알산 전이효소로부터 선택하였다.
본 발명에서 사용한 야생형 2,3-Sialyltransferase는 Pasteurella multosida (ATCC15742) 유래이고, 야생형 2,6-Sialyltransferase는 Photobacterium damselae (ATCC29690) 유래이다.
본 발명에서는 생물정보학의 서열정보를 이용한 다수서열정렬 (multiple sequence alignment)을 수행하였고 단백질 구조 내에 특정 위치의 아미노산 잔기를 보존하고 있는 것은 변이 잔기로서 배제하였다. 기질 결합 잔기들 중에서 위에서 선택된 잔기들 중, 포화변이를 수행할 기능적 잔기 (functional residues)를 선택하기 위해서 알라닌으로 위치지정 돌연변이를 수행하였다. 알라닌으로의 치환은 잔기가 제거된 것과 같이, 특정 잔기가 기질과의 작용으로 인해 중요한 촉매 활성에 기여를 하는지의 여부를 해석할 수 있다. 알라닌으로 치환 이후에 효소활성을 비색법으로 측정하여 야생주와의 활성의 차이를 비교하였다.
또한 본 발명에서는 야생주와 비교하여 발현된 단백질의 접힘 (folding) 정도를 유지하는 알라닌 치환 변이주를 선택하였다. 결론적으로 각 2,3 및 2,6-시알산 전이효소의 알라닌 치환변이주 중에서 야생주에 비해 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상의 활성을 나타내고 단백질의 폴딩을 유지하는 잔기를 다음 단계인 포화 변이를 수행할 기능적 잔기로 선택하였다.
촉매반응에 있어서 기질과의 상호작용에 필수적으로 기여하는, 즉 시알산 전이의 주된 활성에 기여하는 잔기들은 그대로 두고, 효소의 폴딩 및 본래 활성을 유지하는 알라닌 치환 변이주의 잔기에 포화변이를 수행함으로써 효소의 ‘중립적 움직임’ (neutral drift)을 유도하여, 포화변이를 통해서 야생주보다 기질에 더욱 적절하게 맞는 활성형의 효소-기질 복합체를 생성시킬 수 있다.
1-1: 시알산 전이효소의 기능적 잔기에 대한 포화 변이 수행 및 변이주 탐색
2,3-시알산 전이효소의 아미노산 위치 313 및 265에 해당하는 AGA 및 ACC서열을 랜덤하게 치환한 NNK 서열(N은 A, C, G 또는 T이고, K는 G 또는 T인 서열)이 도입된 프라이머를 이용하여 벡터전체를 PCR하여 라이브러리를 구축하였다. 본 발명의 2,3-시알산 전이효소는 N 말단에 24개의 아미노산이 제거된 형태이기 때문에 첫 메티오닌 서열부터 25번째가 메티오닌이 된다.
2,6-시알산 전이효소의 아미노산 위치 411 및 433에 해당하는 ATT 및 CTG서열을 랜덤하게 치환한 NNK 서열 (N은 A, C, G 또는 T이고, K는 G 또는 T인 서열)이 도입된 프라이머를 이용하여 벡터 전체를 PCR하여 라이브러리를 구축하였다. 본 발명의 2,6-시알산 전이효소는 첫 메티오닌 서열부터 헤아릴 경우 메티오닌이 1번이 된다. 벡터 서열을 포함한 시알산 전이효소의 증폭된 유전자는 본래의 플라스미드를 제거하기 위해 Dpn효소 처리 후, 대장균 DH5a에 형질전환시켰다. 발생된 모든 콜로니로부터 변이 유전자를 추출하여 이를 대장균 BW25113 (DE3)에 형질전환하였다. 형질전환된 각각의 콜로니를 96-정 상에서 암피실린이 포함된 LB 배지 500μL에 접종하여 30~37℃에서 18내지 24시간 동안 진탕 배양 후, 배양액 일부를 100 μg mL-1 암피실린과 IPTG가 포함된 새로운 LB 배지 500μL에 접종하여 18~30℃에서 18~40 시간을 배양하였다. 배양된 세포들은 원심분리 후, 세포를 1~10 mM 트리스 완충용액 100μL에 재부유 시킨 다음 이 중 10 μL의 전세포를 변이주 탐색반응에 사용하거나 또는 세포를 50μL의 버그부스터(BugBuster) 단백질 추출 시약으로 재부유시켜 원심분리 후에 세포추출물을 얻어 이 중 10μL를 변이주 탐색반응에 사용하였다. 90μL의 반응 용액은 1~10mM 트리스 완충용액, 1~5mM CMP-N-아세틸뉴라민산과 락토오스, 0.1~1mM pH 지시약을 포함하며 시알산 전이효소의 전세포 또는 세포 추출액 10μL를 첨가함과 동시에 반응을 진행하여 1분의 시간간격으로 10-30 분간의 반응 속도를 야생주와 비교하여 관찰하였다.
대장균 BW25113 (DE3)에 형질전환된 시알산 전이효소의 야생주 및 변이주는 50 mL의 배양 부피로 인듀서인 IPTG를 이용하여 발현 한 이후 Ni-NTA 컬럼을 이용하여 순수 단백질만을 정제하고, 고유 활성도 및 동역학 변수를 측정하였다.
2,3 및 2,6-시알산 전이효소의 단일 아미노산 치환 변이주의 고유 활성도는 각각 동일한 양의 단백질을 사용하여 상기 pH 지시약을 이용한 효소 활성 분석 방법을 통해 분석하였으며, 반응은 5~10 분간 진행하여 초기 수용체 기질 농도 대비 10~25%의 전환 수율을 나타냈을 때의 효소 mg 당 활성 (unit)으로 계산하였으며, 이를 표 1에 나타내었다.
2,3-시알산 전이효소의 선택된 기능적 잔기들에 대해 NNK 코돈을 사용하여 PCR을 통해 포화변이를 수행한 후, 변이주 라이브러리에 대해 pH 지시약을 이용한 비색법을 통해 스크리닝하였다. 야생주에 비해 시간에 따른 흡광도의 변화가 증가한 변이주를 1차적으로 탐색한 후, 이들 변이주들을 배양하여 수득한 세포추출물을 이용하여 초기반응 속도를 세포추출물의 부피 (mL)당 unit으로 계산하였다.
2,3-시알산 전이효소 변이주의 경우, R313의 아르기닌은 락토오스의 글루코오스 근처의 루프(loop)상에 위치하고 있다. R313의 변이주들에 대해, 알라닌과 글리신과 같은 작은 크기 아미노산으로의 치환된 변이주는 야생주에 비해 중립적인 활성을 나타냈고 세린, 트레오닌, 티로신, 아스파르트산, 아스파라긴, 히스티딘과 같은 친수성 아미노산으로 치환된 변이주들은 야생주에 비해 1.5배 이상의 활성을 나타냈다.
CMP-N-아세틸뉴라민산의 20 Å 이내에 위치하는 T265 변이주에 대해서는 글리신, 세린, 아스파라긴으로 치환된 변이주가 야생주와 비슷하거나 높은 활성을 가진 것으로 탐색되었다.
R313 변이주에 대해 야생형 대비 상대적인 고유활성도를 비교한 결과, R313은 상대적으로 다양한 변이주들을 받아들일 수 있었으며, 그 중 R313N의 고유활성도가 야생주 대비 231%로서 단일 변이주 중 가장 높았다. 또한 T265 변이주에 대한 야생형 대비 상대적인 고유활성도를 표 1에 나타내었다.
표 1 2,3-및 2,6-시알산 전이효소의 활성
효소(a2,3 PST) Rel.Specific Ac(％) 효소(a2,6 PdST) Rel.Specific Ac(％)
WT 100 WT 100
R313N 231 I411T 198
R313H 146 L433S 289
R313T 129 L433T 296
R313Y 125 I411T/L433S 194
R313D 108 I411T/L433T 510
T265N 126
T265S 116
T265G 94
R313N/T265S 216
R313H/T265S 237
반면, 2,6-시알산 전이효소의 선택된 기능적 잔기들에 대해서도 마찬가지로 NNK 코돈을 사용하여 PCR 을 통해 포화 변이 수행 이후, 변이주 라이브러리에 대해 pH 지시약을 이용한 비색법을 통해 스크리닝을 수행하였다. I411과 L433은 CMP-N-아세틸뉴라민산으로부터 5~20 Å 거리 내에 위치하고 있다. L433의 변이주들 중에서 L433S와 L433T가 야생형 대비 3배의 증가된 활성을 나타냈다. I411의 변이주들 중에서는 I411T가 야생형 대비 2배의 활성을 나타내는 것으로 탐색되었다. 야생형 2,6-시알산 전이효소의 경우 pET15b벡터보다 pET28a벡터에서의 발현이 증가되는 바, 탐색된 변이주들들 pET28a벡터에 클로닝하여 이들의 고유활성도를 확인하였다(표 1).
1-2: 2,3-시알산 전이효소의 시알산 전이효소의 변이주 특성 분석
본 발명에서 2,3-시알산 전이효소의 R313의 단일 아미노산 치환 변이주 R313N은 서열번호 2의 아미노산 서열을 나타내며 313 번째의 아미노산 위치에 친수성 아미노산 서열을 갖는 단백질이며, 서열번호 2의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열번호 8이며 상기의 아미노산을 암호화하는 모든 DNA 서열 또한 포함할 수 있다.
또한, R313H은 서열번호 3의 아미노산 서열을 나타내며 313번째의 아미노산 위치에 친수성 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이 변이체 서열이 포함된 97% 이상의 상동성을 가지고 시알산 전이의 활성을 가지는 효소도 모두 가능하다. 서열번호 3의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열번호 9이며 상기의 아미노산을 암호화하는 모든 DNA 서열 또한 포함될 수 있다.
또한, T265S는 서열번호 4의 아미노산 서열을 나타내며 265번째의 아미노산 위치에 친수성 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이 변이체 서열이 포함된 97% 이상의 상동성을 가지고 시알산 전이의 활성을 가지는 효소도 모두 가능하다. 서열번호 3의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열번호 10이며 상기의 아미노산을 암호화하는 모든 DNA 서열 또한 포함될 수 있다.
또한, R313N과 T265S의 조합적 변이주는 서열번호 5의 아미노산 서열을 나타내며 R313H와 T265S의 조합적 변이주는 서열번호 6의 아미노산 서열을 나타낸다. 또한 313 번째의 아미노산 위치 또는 265번째의 아미노산 위치에 친수성 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이 변이체 서열이 포함된 97% 이상의 상동성을 가지고 시알산 전이의 활성을 가지는 효소도 모두 가능하다. 서열번호 5의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열번호 11이고, 서열번호 6의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열 12이며, 상기의 아미노산을 암호화하는 모든 DNA 서열 또한 포함될 수 있다.
상기 명시한 2,3-시알산 전이효소의 변이체와 97% 이상의 상동성을 가지는 예로서는, 상기 변이체의 변이된 서열을 포함하고 있으며, 2,3-시알산 전이효소의 활성을 갖는다고 명명, 또는 예측되는 서열로서, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속 (genus), 특히 그 중 멀토시다 (multocida) 종 (species) 유래의 서열이 포함될 수 있다.
본 발명에서는 또한 높은 고유 활성도를 가지는 2,3-시알산 전이효소의 R313의 단일 아미노산 치환 변이주와 T265의 단일 아미노산 치환 변이주에 대해서 각각의 조합적인 변이주를 만들었으며, 조합적 변이주 중 R313H/T265S와 R313N/T265S가 야생주 대비 각각 237%와 216%의 높은 고유활성도를 나타냈다. 기질 공여체와 수용체에 대해 각각의 변이가 미치는 영향을 알아보기 위해 단일 아미노산 치환 변이주와 조합적 변이주에 대해 동역학 변수를 측정하였다.
동역학변수의 측정은 상기 비색법을 이용한 변이주 탐색 방법을 통해 분석하였고, 반응은 실온에서 5~10분간 수행하여 30 초마다의 간격을 두고 초기 수용체 기질 농도 대비 10~25%의 전환 수율을 나타냈을 때의 초기 반응속도를 측정하였다. 동역학 변수의 측정은 공여체 기질인 CMP-N-아세틸뉴라민산과 수용체 기질인 락토오스 두 가지에 대해 모두 측정하였으며 기질 농도는 0.1 에서 30 mM 까지의 범위를 사용하였다. kcat 과 K m의 동역학 변수는 시그마 플롯 (SigmaPlot) 프로그램을 사용하여 미카엘리스-멘텐 (Michaelis-Menten)방정식의 비선형 회귀분석을 통해 얻었다. 2,3-시알산 전이효소의 야생주와 변이주에 대한 동역학변수는 표 2에 나타내었다.
표 2 2,3-시알산 전이효소의 동역학 변수
효소(a2,3 PST) CMP-Neu5Aca Lacb
k cat (s-1) K m (mM) K cat/K m k cat (s-1) K m (mM) k cat /K m
(s-1 mM-1) (s-1 mM-1)
WT 12.9 1.83 7.01 57.4 2.31 24.8
R313N 23.9 2.51 9.51 89.9 2.55 35.2
R313H 26.8 3.24 8.26 80.5 2.68 30.1
T265S 22.1 2.23 9.91 63.2 2.43 26.1
R313N/T265S 36.9 3.33 11.1 82.4 2.21 37.3
R313H/T265S 43.4 3.94 11.0 73.9 1.65 44.8
단일 아미노산 치환 변이주인 R313N과 R313H는 CMP-N-아세틸뉴라민산과 락토오스에 대해서 k cat 값이 증가하였고, 두 기질에 대한 R313N 및 R313H의 k cat/K m은 야생주 대비 각각 약 1.4 배 및 약 1.2 배 증가하였다. 조합 변이체인 R313N/T265S와 R313H/T265S는 두 기질에 대해 k cat 값이 증가하였고, 두 조합 변이체는 CMP-N-아세틸뉴라민산에 대해 k cat/K m이 약 1.6 배 증가하였다. 또한 R313N/T265S와 R313H/T265S는 락토오스에 대한 k cat/K m이 야생주 대비 각각 약 1.5배 및 약 1.8배 증가하였다.
본 발명에서는 또한 2,3-시알산 전이효소의 313번째 아미노산 위치에 아르기닌을 대체하여 다른 친수성 아미노산 (N, D, Y, T, H)으로 전환됐을 때 효소의 고유 활성도가 증가하는 것을 확인함과 함께, 이들 변이주에 대해서 2,6-시알산 전이 부반응을 확인하였다. 2,6-시알산 전이 부반응이 발생하는 pH 4.5~7.0에서 R313N, R313D, R313Y, R313T, R313H 및 조합변이주인 R313N/T265S와 R313H/T265S의 2,6-시알산 전이 부반응을 측정한 결과 pH 4.5~6.0(도 2의 a)에서는 2,6-시알릴락토오스의 생성량이 야생주에 비해 4-30배 감소하였으며, pH 6.5내지 pH 7.0(도 2의 b)에서는 2,6-시알릴락토오스의 생성량이 R313Y (15배 감소)를 제외하고 모두 사라진 것을 확인할 수 있었으며, 이는 도 2에 나타내었다.
1-3: 2,6-시알산 전이효소의 시알산 전이효소의 변이주 특성 분석
본 발명에서 2,6-시알산 전이효소의 I411의 단일 아미노산 치환 변이주 I411T는 서열번호 14의 아미노산 서열을 나타내며 411 번째의 아미노산 위치에 작은 크기 또는 친수성 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이 변이체 서열이 포함된 55% 이상의 상동성을 가지고 시알산 전이의 활성을 가지는 효소도 모두 가능하다. 서열번호 14의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열번호 20이며 상기의 아미노산을 암호화하는 모든 DNA 서열 또한 포함할 수 있다.
또한, L433S은 서열번호 15의 아미노산 서열을 나타내고, L433T는 서열번호 16의 아미노산 서열을 나타내며, 433번째의 아미노산 위치에 친수성 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이 변이체 서열이 포함된 55% 이상의 상동성을 가지고 시알산 전이의 활성을 가지는 효소도 모두 가능하다. 서열번호 15 및 16의 단백질을 암호화하는 DNA는 서열번호 21 및 22이며 상기의 아미노산을 암호화하는 모든 DNA 서열 또한 포함될 수 있다.
또한, I411T과 L433S의 조합적 변이주는 서열번호 17의 아미노산 서열을 나타내며 I411T와 L433T의 조합적 변이주는 서열번호 18의 아미노산 서열을 나타낸다. 또한 411 번째의 아미노산 위치 또는 433번째의 아미노산 위치에 작은 크기 또는 친수성 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 이 변이체 서열이 포함된 55% 이상의 상동성을 가지고 시알산 전이의 활성을 가지는 효소도 모두 가능하다. 서열번호17의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열번호 23이고 서열번호 19의 단백질을 암호화 하는 DNA는 서열번호 24이며, 상기의 아미노산을 암호화하는 모든 DNA 서열 또한 포함될 수 있다.
상기 명시한 2,6-시알산 전이효소의 변이체와 55% 이상의 상동성을 가지는 예로서는, 상기 변이체의 변이된 서열을 포함하고 있으며 2,6-시알산 전이효소의 활성을 갖는다고 명명, 또는 예측되는 서열로서, 포토박테리움 (Photobacterium) 속, 특히 그 중 담셀라 (Photobacterium damseale), 레이오그나티 (Photobacterium leiognathi)종 유래의 서열이 포함될 수 있다. 또한 본 발명의 2,6-시알산 전이효소와 55%의 상동성을 가짐으로 인해 본 발명의 단백질 모델 구조를 형성하는 주형 단백질이 되는 포토박테리움 Jt-Ish-224 2,6-시알산 전이효소의 서열이 포함될 수 있다.
본 발명에서는 높은 고유 활성도를 가지는 2,6-시알산 전이효소의 I411T의 단일 아미노산 치환 변이주와 L433S 및 L433T의 단일 아미노산 치환 변이주에 대해서 각각의 조합적인 변이주를 만들었으며, 조합적 변이주 중 I411T/L433S와 I411T/L433T가 야생주 대비 각각 194%와 510%의 높은 고유활성도를 나타냈다. 기질 공여체와 수용체에 대해 각각의 변이가 미치는 영향을 알아보기 위해 단일 아미노산 치환 변이주와 조합적 변이주에 대해 동역학 변수를 측정하였으며 이를 표 3에 나타냈다.
표 3 α-2,6 시알산 전이효소의 동역학 변수
Enzymes(a2,6 PdST) CMP-Neu5Aca Lacb
k cat (s-1) K m (mM) k cat /K m k cat (s-1) K m (mM) k cat /K m
(s-1 mM-1) (s-1 mM-1)
WT 3.99 5.47 0.73 4.45 9.03 0.49
I411T 11.1 6.36 1.75 25.7 28.4 0.90
L433S 18.3 9.54 1.92 85.4 59.1 1.45
L433T 10.4 2.11 4.90 73.2 56.7 1.29
I411T/L433S 17.4 11.9 1.47 113 78.5 1.31
I411T/L433T 18.1 3.09 5.86 119 57.0 1.90
수용체 기질인 락토오스에 대해서 모든 변이주가 기질과의 결합력은 감소한데 반해 k cat값을 증가시켰으며, 야생주에 비해 k cat값이 6배에서 최대 27배까지 증가하였다. 단일 변이주인 I411T, L433S와 L433T의 kcat/Km은 야생주 대비 각각 1.8배, 3배와 2.6배 증가하였으며 조합변이주인 I411T/L433S와 I411T/L433T의 k cat/K m은 야생주 대비 각각 2.7배와 3.9배 증가하였다.
반면, 공여체 기질인 CMP-N-아세틸뉴라민산에 대해서는 I411T와 L433S 단일 아미노산 치환 변이주의 경우 k cat/K m는 야생주 대비 각각 2.4배와 2.6배 증가하였고 L433T는 기질과의 친화력도 함께 증가하여 k cat/K m이 야생주 대비 6.7배 증가하였다. I411T/L433S와 I411T/L433T의 조합적인 변이주의 경우, k cat이 야생주 대비 4.5배 증가하였고 k cat/K m은 각각 2배와 8배 증가하였다.
본 발명을 통해 생산한 2,3 및 2,6-시알산 전이효소의 변이주는 상기 언급한 락토오스 수용체 기질뿐 만 아니라 이당류 수용체 기질인, N-아세틸락토사민 (LacNAc), 아자이도 β-D-갈락토피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노사이드 (LacβN3), 3-아자이도프로필 β-D-갈락토피라노실-(1-4)-β-D-글루코피라노사이드 (LacβProN3), 메틸 β-D-갈락토피라노실-(1-4)- β-D-글루코피라노사이드 (LacβOMe)를 포함하여 갈락토오스 부분을 포함하는 다양한 올리고당 기질에 적용할 수 있다.
또한 본 발명을 통해 생산한 2,3 및 2,6-시알산 전이효소의 변이주는 상기 언급한 CMP-N-아세틸뉴라민산 공여체 기질뿐 만 아니라 시티딘 일인산 디아미노뉴라민산 (CMP-KDN, CMP-deaminoneuraminic acid), 시티딘 일인산-N-글리콜릴뉴라민산 (CMP-Neu5Gc, CMP-N-glycolylneuraminic acid)을 포함한 다양한 유도체 기질에 적용할 수 있다.
실시예 2: CMP-N-아세틸뉴라민산 합성을 위한 효소의 제조
시알릴레이션(siaylation) 반응의 중간물질인 CMP-N-아세틸뉴라민산 제조를 위하여, 사용되는 효소를 제조하였다.
N-아세틸-D-글루코사민에서 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 단계에 사용되는 효소는 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE)이며, CMP-N-아세틸뉴라민산과 락토오스를 반응시켜 2,3-시알릴락토오스(Sialyllactose)를 제조하는 효소는 2,3-시알산 전이효소이고, CMP-N-아세틸뉴라민산과 락토오스를 반응시켜 2,6-시알릴락토오스(Sialyllactose)를 제조하는 효소는 2,6-시알산 전이효소이다.
상기 N-아세틸-D-글루코사민에서 CMP-N-아세틸뉴라민산을 제조하는 단계에 사용되는 상기 효소의 제조방법은 대한민국 특허공개 10-2008-0055588에 자세히 기재되어 있다.
간략히 요약하면, 다음과 같다:
(1) N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase)의 제조
박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343, NC_003228)의 게놈으로부터 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase, 서열번호 25)를 코딩하는 nanE 유전자를 클로닝하기 위하여, 박테로이드 프라질리스 NCTC 9343(Bacteroides fragilis NCTC 9343) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 26 및 서열번호 27의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 nanE 유전자를 증폭하였다.
서열번호 26: 5’-ct gcc atg gtt atg aat act aca g
서열번호 27: 5’-aat gga tcc tta ttt ttc tga cag
상기 증폭된 PCR 산물을 정제한 후, 제한효소 NcoI 및 BamHI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NcoI 및 BamHI로 절단된 플라스미드 pET28a(＋)(Novagen) T4 DNA (Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하고 재조합벡터 pNANe를 제작하였다. 상기 재조합벡터를 E.coli BL21(DE3)(Invitrogen)에 도입하고, 이를 E.coli/pNANe을 수득하였다.
(2) N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuNAc aldolase)의 제조
N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuNAc aldolase)를 코딩하는 nanA 유전자(서열번호 28)를 클로닝하기 위하여, 대장균 K-12(E. coli K-12 C600(KCTC 1116)균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 29 및 서열번호 30의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 nanA 유전자를 증폭하였다.
서열번호 29: 5’-ggtatccatggcaacgaatttacg
서열번호 30: 5’-ggtaggctcgagcgaggggaaac
상기 증폭된 PCR 산물을 정제한 후, 제한효소 NcoI 및 XhoI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NcoI 및 XhoI로 절단된 플라스미드 pET32a(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하여 재조합 벡터 pNANa를 제작하였다. 상기 pNANa를 E.coli BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)에 도입시켜, E. coli/pNANa를 수득하였다.
(3) 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine 5'monophosphate kinase, CMK)의 제조
시티딘 5' 5'-일인산 키나아제(cytidine 5'monophosphate kinase)를 코딩하는 cmk 유전자(서열번호 31)를 클로닝하기 위하여, 대장균 K-12(E. coli K-12 (KCTC 1116) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 32 및 서열번호 33의 프라이머를 사용하여 PCR 법에 의해 cmk 유전자를 증폭하였다.
서열번호 32: 5’-cat atg acggca att gcc ccg gtt att ac
서열번호 33: 5’-gaa ttc ggt cgc tta tgc gag agc c
증폭된 PCR 산물을 정제하고, 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단한 플라스미드 pET22b(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하였여, 재조합 벡터 pCMK를 제조하였다. 상기 pCMK를 E.coli BL21(DE3)pLysS(Invitrogen)에 도입시켜, E.coli/pCMK를 수득하였다.
(4) 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK)의 제조
아세테이트 키나아제(acetate kinase)를 코딩하는 ack 유전자(서열번호 34)를 클로닝하기 위하여, 대장균 K-12(E. coli K-12(KCTC 1116) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 35 및 서열번호 36의 프라이머를 사용하여, PCR 법에 의해 ack 유전자를 증폭하였다.
서열번호 35: 5’-catatgtcgagtaagttagtttctg
서열번호 36: 5’-gaatcctcaggcagtcaggcggctcgcgtc
증폭된 PCR 산물을 정제하고, 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단한 플라스미드 pET24ma(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하여, 재조합 벡터 pACKa를 제조하였다.
상기 pACKa를 E. coli BL21(DE3)pLysS (Invitrogen)에 도입하여, E. coli/pACKa를 제작하였다.
(5) CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuNAc synthetase, NEU)의 제조
CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuNAc synthetase)를 코딩하는 neu 유전자(서열번호 37)를 클로닝하기 위하여, 네이세리아 메니기티디스(Neisseria meningitidis, Koram Biotech) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 38 및 서열번호 39의 프라이머 DNA를 사용하여 PCR 법에 의해 neu 유전자를 증폭하였다.
서열번호 38: 5’-aagcatatggaaaaacaaaatattgcg
서열번호 39: 5’-gtggaattcttagctttccttgtg
상기 증폭된 PCR 산물을 정제하고, 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 NdeI 및 EcoRI로 절단한 플라스미드 pET32a(＋)(Novagen) T4 DNA(Takara)에 리가아제를 사용하여 연결하여, 재조합 벡터 pSYNb를 제조하였다.
상기 pSYNb를 E.coli BL21(DE3)(Invitrogen)에 도입하여, E. coli/pSYNb를 제작하였다.
상기 형질전환체 E. coli/pNANe, E. coli/pNANa, E. coli/pCMK, E. coli/pACKa 및 E. coli/pSYNb를 LB 배지에서 배양한 종균 500㎖를 본배양 LB 배지 5ℓ에 접종하고, 접종 4시간 후 발현 유도물질로 IPTG를 1-2mM 첨가하여 단백질의 고발현을 유도하였다. 세포의 밀도(OD600)가 약 3~5일 때 세포를 수확하였다. 상기 수득된 세포를 초음파 파쇄기 또는 프렌치프레스로 파쇄한 후, SDS-PAGE 젤을 통해 각각의 효소 발현 정도를 확인하였다. 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphe kinase), 아세테이트 키나아제(acetate kinase), N-아세틸뉴라민산 알도라제(NeuNAc aldolase), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제 (CMP-NeuAc synthetase), N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc 2-epimerase) 등의 효소를 황산암모늄(ammonium sulfe)을 이용한 침전 및 이온교환 수지 컬럼으로 정제하였다(Protein purification techniqes 제2판, Oxford University Press, 2001).
실시예 3: 2,3-시알산 전이효소를 이용한 락토오스의 원팟 시알릴레이션(sialylation)
실시예 1과 2에서 제조한 2,3-시알산 전이효소(PST2,3st R313N), 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE)가 혼합된 효소반응액을 이용하여, N-아세틸-D-글루코사민, 피루브산, 락토오스를 기질로 하여, 락토오스의 원팟 시알릴레이션을 수행하였다.
N-아세틸-D-글루코사민에서 2,3-시알릴락토오스 또는 2,6-시알릴락토오스를 생산하는 화학반응식은 도 1에 나타내었으며, 단일반응용기 내에서의 수행에 따라, 고가의 기질인 시티딘 5'-일인산 (CMP)를 재순환할 수 있다는 것이 나타나 있다.
반응 혼합액[5~10mM 시티딘 5'-일인산(CMP, Shanghai QZU Bioscience ＆ Biotechnology), 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc, Shanghai Jiubang Chemical), 40~120mM 피루브산(Sodium pyruvate, ZMC Inc), 40~120mM 락토오스(Lactose, DMV Inc), 20mM MgCl2·H2O(Duksan), 1mM NTP(Nucleotide triphosphate, sigma), 80~300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate, sigma), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0), 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), 2,3-시알산 전이효소(PST2,3st R313N)를 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.
LC, Mass 분석 결과, 2,3-시알릴락토오스가 합성되었다는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). LC의 경우, Dionex DX-500 Chromatography system을 사용하여 수행하였으며, 조건은 다음과 같다:
Column : CarboPac PA100 Analytical Column(P/N 043055) with guard (P/N 043054)
Flow : 1ml/min
Run time : 20min
Injection volume : 25μl
Detection: ED40 Electrochemical Detector (gold electrode)
Eluent : 100mM NaOH / 100mM NaOAc.
2,3-시알릴락토오스의 mass 분석결과 Molecular ion이 [M-H]- 형태로 m/z 632.2으로 검출되었다.
동일한 방법으로, 상기 반응용액에, 2,3-시알산 전이효소(2,3- Sialyltransferase)를 대신하여, 2,6-시알산 전이효소(2,6-Sialyltransferase)인 2,6- 시알산 전이효소(2,6STN L433S)를 첨가하여, 반응시킨 결과, 2,6-시알릴락토오스를 합성하였다 (도 4).
실시예 4: 락토오스의 원팟 시알릴레이션(sialylation)과 기존 방법의 비교
실시예 3의 방법과 동일한 원팟 방법으로, 표 4의 기질농도를 사용하여 시알락토오스의 제조한 방법과의 시알릴락토오스 생산량과 기존의 투팟(two-pot) 방법을 사용한 시알릴락토오스의 제조한 방법의 시알릴락토오스 생산량을 비교하였다.
기존의 투팟(two-pot) 방법은 반응 혼합액[50mM 시티딘 5'-일인산(CMP), 100mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 100mM 피루브산(Sodium pyruvate), 20mM MgCl2·H2O, 1mM NTP(Nucleotide triphosphate), 300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0) 7ℓ, 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 상기 실시예 2에서 제조한 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE)를 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켜, CMP-N-아세틸뉴라민산을 합성하였다.
50mM Tris HCl(pH7.5) 완충용액에 상기 합성된 약 40mM CMP-N-아세틸뉴라민산에 100mM 락토오스를 넣고 2,3-시알산 전이효소를 첨가하여 반응시켜, 시알릴락토오스를 생산하였으며, 표준 시알릴락토오스(Sigma)의 표준곡선과 비교하여, LC로 시알릴락토오스양을 측정하였다.
표 4 본 발명과 기존방법의 비교
합성에 필요한 주요 기질 기존 방법(Two step) 본 발명의 시알산 전이효소를 사용한 방법(One step)
CMP 50mM 10mM
N-아세틸-D-글루코사민 100mM 80mM
피루브산 100mM 80mM
아세틸포스페이트 300mM 200mM
락토오스 100mM 80mM
시알릴락토오스 생산량 20g/L 40g/L
그 결과, 표 4에 나타난 바와 같이, 본원발명의 원팟 시알릴락토오스 생산방법으로 제조할 경우, 첨가하는 CMP의 농도가 1/5로 줄어도, 시알릴락토오스의 생산량은 2배 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5: 갈락토오스의 원팟 시알릴레이션(sialylation)
단당인 갈락토오스(sigma) 시알릴레이션을 수행하였으며, 시알릴레이션 과정을 도 5에 나타내었다.
반응 혼합액[5~10mM 시티딘 5'-일인산(CMP), 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 40~120mM 피루브산(Sodium pyruvate), 40~120mM 갈락토오스(Galactose) 20mM MgCl2·H2O, 1mM NTP(Nucleotide triphosphate), 80~300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0), 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), 2,3-시알산 전이효소(PST2,3st R313N)를 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.
LC, Mass 및 TLC 분석 결과, 시알릴 갈락토오스가 합성되었다는 것을 확인할 수 있었으며, Mass 분석결과 Molecular ion이 [M-H]- 형태로 m/z 470.2으로 검출되었다(도 6).
실시예 6: 링커의 시알산 유도체 제조
갈락토오스를 말단 잔기로 포함하는 아미노 핵실 링커(Aminohexyl linker)의 시알릴레이션을 수행하였으며, 시알릴레이션 과정을 도 7에 나타내었다.
반응 혼합액[5~10mM 시티딘 5'-일인산(CMP), 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 40~120mM 피루브산(Sodium pyruvate), 40~120mM 갈락토오스 말단의 아미노핵실 링커, 20mM MgCl2·H2O, 1mM NTP(Nucleotide triphosphate), 80~300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0), 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), 2,3-시알산 전이효소(2,3-Sialyltransferase)를 각각 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.
TLC 및 Mass 분석 결과, 2,3-시알릴락토오스-링커가 합성되었다는 것을 확인할 수 있었으며, Mass 의 경우, Molecular ion이 [M-H]- 형태로 m/z 731.3으로 검출되었다 (도 8).
실시예 7: 플라보노이드의 시알산 유도체 제조
하기 화학식 1의 구조를 가지는 플라보노이드 CSH-I-54의 락토오스 유도체의 시알릴레이션을 수행하였으며, 시알릴레이션 과정을 도 9에 나타내었다.
화학식 1
Figure PCTKR2014004823-appb-I000001
반응 혼합액[5~10mM 시티딘 5'-일인산(CMP), 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 40~120mM 피루브산(Sodium pyruvate), 40~120mM 플라보노이드 CSH-I-54의 락토오스 유도체, 20mM MgCl2·H2O, 1mM NTP(Nucleotide triphosphate), 80~300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0), 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), 2,3-시알산 전이효소(2,3-Sialyltransferase)를 각각 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.
2,3-시알릴락토오스-CSH-I-54의 합성은 LC와 Mass로 확인하였으며, LC 분석 조건은 하기와 같다:
Column : Thermo ODS Hypersil (250＊4.6mm)
Detection : UV 340nm
Temp.: R.T
Flow rate: 1mL/min
Inj. Volume: 20μl
Mobile phase: A buffer: 0.1 M TEAA
B buffer : CH3CN
초기: B conc. 0%
15min 70%
20min 100%
22min 100%
25min 0%
30min 0%
LC 및 Mass 분석 결과, 2,3-시알릴락토오스-CSH-I-54가 합성되었다는 것을 확인할 수 있었으며, mass 분석의 경우, Molecular ion이 [M-H]- 형태로 m/z 912.3으로 검출되었다 (도 10).
실시예 8: 타크로리무스의 시알산 유도체 제조
화학식 2의 구조를 가지는 면역억제제 타크로리무스의 갈락토오스 유도체와 화학식 3의 구조를 가지는 링커를 가진 타크로리무스의 갈락토오스 유도체의 시알릴레이션을 수행하였으며, 시알릴레이션 과정을 도 11에 나타내었다.
타크로리무스의 갈락토오스 유도체
화학식 2
Figure PCTKR2014004823-appb-I000002
화학식 3
Figure PCTKR2014004823-appb-I000003
반응 혼합액[5~10mM 시티딘 5'-일인산(CMP), 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 40~120mM 피루브산(Sodium pyruvate), 40~120mM 타크로리무스 갈락토오스 유도체, 20mM MgCl2·H2O, 1mM NTP(Nucleotide triphosphate), 80~300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0), 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), 2,3-시알산 전이효소(2,3-Sialyltransferase)를 각각 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.
2,3-시알릴락토오스-타크로리무스의 합성은 LC와 Mass로 확인하였으며, LC 분석 조건은 하기와 같다 (도 12):
Column : Thermo ODS Hypersil (250＊4.6mm)
Detection : UV 225nm
Temp.: 55℃
Flow rate: 1mL/min
Inj. Volume: 20μl
Mobile phase: A buffer: H2O
B buffer : CH3CN
초기: B conc. 30%
5min 30%
35min 80%
36min 80%
38min 100%
45min 100%
46min 30%
50min 30%
Mass 분석결과, 화학식 2의 갈락토오스-타크로리무스의 경우, Molecular ion이 [M+Na]+ 형태로 m/z 1564.3으로 검출되었으며, 화학식 3의 아미노 헥실 링커(Aminohexyl linker)가 있는 2,3-시알릴락토오스-타크로리무스의 경우, Molecular ion이 [M-2H]2- 형태로 m/z 1616.8로 검출되었다 (도 12).
실시예 9: 항암제 탁솔의 시알산 유도체 제조
화학식 4의 구조를 가지는 면역억제제 탁솔(Taxol)의 갈락토오스 유도체의 시알릴레이션을 수행하였으며, 시알릴레이션 과정을 도 13에 나타내었다.
탁솔(Taxol)의 갈락토오스 유도체
화학식 4
Figure PCTKR2014004823-appb-I000004
반응 혼합액[5~10mM 시티딘 5'-일인산(CMP), 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 40~120mM 피루브산(Sodium pyruvate), 40~120mM 탁솔 갈락토오스 유도체, 20mM MgCl2·H2O, 1mM NTP(Nucleotide triphosphate), 80~300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0), 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), 2,3-시알산 전이효소(2,3-Sialyltransferase)를 각각 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.
2,3-시알릴락토오스-탁솔의 합성은 LC와 Mass로 확인하였으며, LC 분석 조건은 하기와 같다 (도 14):
Column : Termo ODS Hypersil(4.6＊250mm)
Detection : UV 260nm
Temp.: R.T
Flow rate: 1mL/min
Inj. Volume: 20μl
Mobile phase: A buffer: 0.1 M TEAA
B buffer : CH3CN
초기: B conc. 35%
30min 65%
33min 65%
35min 35%
38min 35%
Mass 분석결과, 갈락토오스-탁솔의 경우, Molecular ion이 [M+Na]+ 형태로 m/z 1255.3으로 검출되었으며, 2,3-시알릴락토오스-탁솔의 경우, Molecular ion이 [M+Na]+ 형태로 m/z 1568.0으로 검출되었다 (도 14).
실시예 10: 항생제 반코마이신의 시알산 유도체 제조
화학식 5의 구조를 가지는 항생제 반코마이신(Vancomycin)의 갈락토오스 유도체의 시알릴레이션을 수행하였으며, 시알릴레이션 과정을 도 15에 나타내었다.
반코마이신(Vancomycin)의 갈락토오스 유도체
화학식 5
Figure PCTKR2014004823-appb-I000005
반응 혼합액[5~10mM 시티딘 5'-일인산(CMP), 20~80mM N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 40~120mM 피루브산(Sodium pyruvate), 40~120mM 반코마이신 갈락토오스 유도체, 20mM MgCl2·H2O, 1mM NTP(Nucleotide triphosphate), 80~300mM 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), 50mM Tris ＨCl 버퍼(pH 7.0), 37℃ 2M NaOH를 사용하여 pH 6.5~8.0 유지]을 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU) 및 N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), 2,3-시알산 전이효소(2,3-Sialyltransferase)를 각각 혼합한 후, 반응기에서 교반하여 5~12시간 동안 반응시켰다.
2,3-시알릴락토오스-반코마이신의 합성은 LC와 Mass로 확인하였으며, LC 분석 조건은 하기와 같다 (도 16a):
Column : Chromollth performance RP-18e, 4.6 ×100mm
Detection : UV 260nm
Temp.: R.T
Flow rate: 1mL/min
Inj. Volume: 20μl
Mobile phase: A buffer: H2O
B buffer : CH3CN
초기: B conc. 5%
3min 10%
20min 20%
25min 30%
30min 80%
35min 80%
37min 5%
40min 5%
Mass 분석결과, 2,3-시알릴락토오스-반코마이신의 경우, Molecular ion이 [M+4H]+ 형태로 m/z 1905.4로 검출되었다 (도 16b).
본 발명에 따르면, 고가의 시티딘 5'-일인산(CMP)를 반응용기 내에서 재활용할 수 있어, 반응에 투입되는 시티딘 5'-일인산(CMP) 양을 줄이고, 저가의 N-아세틸-D-글루코사민과 피루브산을 기질로 하여, 시알산 유도체를 제조할 수 있으며, 보다 고효율로 시알산 유도체를 제조할 수 있는 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (8)

  1. 다음 단계를 포함하는 시알산 유도체의 제조방법:
    (a) 단일반응 용기에서, 시티딘 5'-일인산(CMP), 아세틸 포스페이트(Acetyl phosphate), NTP(Nucleotide triphosphate), N-아세틸-D-글루코사민(GlcNAc), 피루브산(Sodium pyruvate) 및 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물을 기질로 첨가하고, 시티딘 5'-일인산 키나아제(cytidine monophosphate kinase, CMK), 아세테이트 키나아제(acetate kinase, ACK), CMP-N-아세틸뉴라민산 신타아제(CMP-NeuAc synthetase, NEU), N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase, NANE), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(NeuAc aldolase, NAN) 및 시알산전이효소(Sialyltransferase)를 첨가한 반응액을 반응시켜 시알릴락토오스 또는 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물의 시알산 유도체를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 제조된 시알릴락토오스 또는 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물의 시알산 유도체를 수득하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 시알산 전이효소(Sialyltransferase)는 α-2,3 시알산 전이효소, α-2,6 시알산 전이효소 및 α-2,8 시알산 전이효소로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, α-2,3 시알산 전이효소는 서열번호 2~6 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, α-2,6 시알산 전이효소는 서열번호 14~18 중 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 반응은 25~38℃에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 반응액의 pH는 7~9인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, N-아세틸글루코사민-2-에피머라아제(GlcNAc-2-epimerase)는 서열번호 25의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 갈락토오스 잔기를 포함하는 화합물은 단당, 올리고당, 링커, 플라보노이드, 항암제, 항생제, 면역억제제 및 항체로 구성되는 군에서 선택되는 화합물의 갈락토오스 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
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