WO2014198735A1 - Facteur vii transgénique presentant une n-glycosylation spécifique et point isoelectrique substantiellement homogene - Google Patents

Facteur vii transgénique presentant une n-glycosylation spécifique et point isoelectrique substantiellement homogene Download PDF

Info

Publication number
WO2014198735A1
WO2014198735A1 PCT/EP2014/062051 EP2014062051W WO2014198735A1 WO 2014198735 A1 WO2014198735 A1 WO 2014198735A1 EP 2014062051 W EP2014062051 W EP 2014062051W WO 2014198735 A1 WO2014198735 A1 WO 2014198735A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
factor vii
composition
composition according
vii
factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2014/062051
Other languages
English (en)
Inventor
Guillaume CHEVREUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by LFB SA filed Critical LFB SA
Priority to US14/896,763 priority Critical patent/US10683492B2/en
Priority to CA2915141A priority patent/CA2915141C/fr
Publication of WO2014198735A1 publication Critical patent/WO2014198735A1/fr
Anticipated expiration legal-status Critical
Priority to US16/868,803 priority patent/US11254920B2/en
Priority to US16/868,850 priority patent/US20200362329A1/en
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A01K2217/052—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic) inducing gain of function
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/107—Rabbit
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/02—Animal zootechnically ameliorated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • TRANSGENIC FACTOR VII HAVING A SPECIFIC N-GLYCOSYLATION AND SUBSTANTIALLY HOMOGENEOUS ISOELECTRIC POINT
  • the present invention relates to a factor VII composition having a substantially homogeneous isoelectric point and a method for formulating such a composition.
  • the present invention also relates to the therapeutic use of a factor VII composition having a substantially homogeneous isoelectric point.
  • Factor VII is a vitamin K-dependent glycoprotein involved in the extrinsic pathway of blood coagulation.
  • factor VIIIa participates in the coagulation process by complexing with tissue factor (TF) and activating factor X and factor IX in factor Xa and IXa, respectively.
  • FVIIa also has the ability to trigger blood coagulation when the cascade of reactions leading to blood coagulation is interrupted or deficient, for example in the absence of factor VIII or IX.
  • factor VII has long been used as a drug for the treatment of certain bleeding disorders, including treatment of patients with factor VIII deficiency (type A haemophilia) or factor IX (type B haemophilia) with inhibitors against these factors, to treat patients with congenital factor VII deficiency, or as a product for the prevention of haemorrhage that may occur during surgical operations.
  • factor VIII deficiency type A haemophilia
  • factor IX type B haemophilia
  • Vlla Factor VII is secreted as a single peptide chain of 406 residues, with a molecular weight of approximately 50 kDa, which is cleaved at the Argi 52 -Ilei 53 (Arginine 152-Isoleucine 153) binding when of its activation in FVIIa.
  • the resulting Vlla Factor thus consists of a light chain of 152 amino acids, a molecular weight of about 20 kDa, and a heavy chain of 254 amino acids, with a molecular weight of about 30. kDa, linked together by a single disulfide bridge (Cys 135 - Cys 2 6 2 ).
  • the plasma Factor VIIa also contains several post-translational modifications, among which: ⁇ -carboxylation of the first ten glutamic acids of its sequence, partial hydroxylation of aspartic acid 63, O-glycosylation of serines 52 and 60 ( Ser 52 and Ser 6 o) and the N-glycosylation of asparagines 145 and 322 (Asni 45 and Asn 322 ) (Fenaille et al., Mass spectrometric characterization of N- and O-glycans of plasma-derived coagulation factor VII. J. 25.9 (2008): 827-42).
  • factor VII thus strongly depends on the nature and proportion of oligosaccharide structures that are attached to the protein, and may affect many aspects of therapeutic efficacy such as, for example, solubility, resistance proteolytic attacks, thermal inactivation, immunogenicity, half-life, bioactivity, bioavailability and factor VII stability. It appears that these post-translational modifications, which often vary from one plasma factor VII molecule to another, lead to a certain heterogeneity of the molecules present in the factor VII pharmaceutical compositions. Such heterogeneity has the particular disadvantage of complicating the factor VII formulation steps for the preparation of pharmaceutical compositions for the treatment of patients.
  • factor VII a significant proportion of the purified factor VII molecules precipitate during the formulation step: this results in a loss of active raw material, as well as the presence of factor VII become inactive in the pharmaceutical compositions intended therapeutic treatment.
  • human plasma risk of viral contamination, difficulty of purification, supply, etc.
  • glycosylation is a complex post-translational modification that is directly dependent on the cellular system used, large scale production of proteins in heterologous cells often leads to the production of polypeptides with identical primary structure but variable oligosaccharide structures.
  • NovoSeven ® a drug authorized on the European market since 1996 and authorized on the American market in 1999, produced by the Danish firm NovoNordisk, whose active ingredient is eptacog alfa (activated factor VII of human recombinant coagulation genetically engineered from BHK kidney cells of newborn hamsters).
  • factor VII compositions having improved chemical and physical stability at room temperature and capable of facilitating and improving the performance of the formulation step for preparing pharmaceutical compositions for the treatment of patients. hemophilia with inhibitors or congenital factor VII deficiency.
  • factor VII compositions whose factor VII molecules have a substantially homogeneous isoelectric point facilitate the formulation step at an optimum pH, preferably at an optimum pH of 6.0 ⁇ 0.2. , pharmaceutical compositions avoiding the precipitation of factor VII.
  • the present invention thus relates to a factor VII composition in which the factor VII molecules have a substantially homogeneous isoelectric point.
  • the present invention relates to a factor VII composition in which, among all the N-glycan forms of factor VII of the composition, at least 60% of said N-glycan forms are monocharged, and of all the factor VII molecules of the composition, at least 80% of said molecules exhibit ⁇ -carboxylation on 9 residues of glutamic acid.
  • At least 65%, preferably at least 70%, or preferably at least 80% of the N-glycan forms of the factor VII of the composition are monocharged.
  • At least 85%, preferably 85% to 100%, or preferably 90% to 100%, or preferably 95% to 100%, of the factor VII molecules of the composition exhibit ⁇ -carboxylation on 9 residues of glutamic acid.
  • the ⁇ -carboxylation level of the factor VII composition of the invention on the glutamic acid residue is less than 20%, or preferably less than 15%), or even more preferably less than 10%, preferably less than 5%.
  • the present invention relates to a factor VII composition, wherein at least 60% of the N-glycan forms of the factors VII of the composition are monosialylated complexes.
  • At least 10%, preferably at least 15%, or preferably at least 20%, or preferably at least 25%, of the N-glycan forms of the factors VII of the composition are high Mannose / hybrid .
  • At least 90%, preferably at least 95%, of the factor VII molecules of the composition have an isoelectric point within a pH unit deviation of less than 1.2.
  • At least 50%, or preferably at least 55%, or preferably 60%, of the factor VII molecules of the composition have an isoelectric point within a pH unit deviation of less than 1; preferably less than 0.5; or preferably less than 0.4.
  • the factor VII of the invention is a recombinant or transgenic factor VII.
  • the factor VII of the composition is produced by transgenic rabbits.
  • the factor VII of the composition is an activated factor VII.
  • Another subject of the invention relates to the use of the factor VII composition for the treatment of bleeding episodes and for the prevention of haemorrhages occurring during surgical procedures or invasive procedures in the following groups of patients:
  • Another subject of the invention relates to a process for obtaining a factor VII composition according to the invention comprising the following steps:
  • step a) transferring embryos obtained in step a) into the oviduct of a non-human mammalian female so that it develops into a non-human adult mammal
  • step b) induction of lactation in the adult non-human mammal obtained in step b) of female type or in a female descendant of this non-human mammal in which the gene and the promoter are present in its genome
  • Another subject of the invention relates to a process for the formulation of a factor VII composition
  • a process for the formulation of a factor VII composition comprising mixing the factor VII composition according to the invention with a buffer solution, adjusting the pH if necessary, filtration and then desiccation if necessary. to get the solid form.
  • FIG. 1 Process for purification and extraction of factor VII of the invention.
  • Figure 2 Mass spectrum of the N-terminal peptides [Alai-Arg 36 ] and [Alai-Lys 32 ] of the factor VII of the invention.
  • FIG. 3 Charge Profiling of N-Glycine Factor VII Forms of the Invention Obtained by Ultra High Performance Liquid Chromatography Having anion Exchange Resin Coupled to Fluorescence Detection ("AEX-UPLC / FD") 4: Comparison of the isoelectric points of the factor VII of the invention and a recombinant factor VII (Novoseven®) obtained by the method of isoelectric focusing ("IEF").
  • FIG. 5 Charge Profiling of the N-glycan Forms of the Factor VII of the Invention, the Factor VII Resulting from the Application WO2007 / 138199 and a Recombinant Factor VII (Novoseven®) Obtained by Ultra-High Performance Liquid Chromatography having anion exchange resin coupled to fluorescence detection ("AEX-UPLC / FD”)
  • AEX-UPLC / FD Ultra-High Performance Liquid Chromatography having anion exchange resin coupled to fluorescence detection
  • Figure 6 Expression vector used for the generation of non-human mammals expressing recombinant human FVII according to the invention.
  • the factor VII composition chemically and physically stable at room temperature and easy to formulate according to the present invention, is characterized in that the factor VII molecules which compose it have a substantially homogeneous isoelectric point.
  • the factor VII composition according to the invention comprises factor VII molecules, in which the factor VII molecules have a substantially homogeneous isoelectric point.
  • factor VII or “FVII” is meant polypeptides comprising the wild-type human factor VII 1-406 sequence (as described, for example, in US Patent 4,784,950 A to ZymoGenetics Inc.), or the factor VII derived from another species (eg bovine, porcine, rabbit, goat, murine). It further includes natural allelic variations of factor VII that may exist.
  • factor VII also includes variants of FVII which exhibit the same activity or a higher biological activity compared to the activity of the wild form, these variants including in particular the polypeptides differing from wild-type FVII by insertion, deletion or substitution of fVII. one or more amino acids.
  • factor VII or "FVII” also includes uncleaved factor VII (zymogen) and activated factor VII ("factor VIIa” or “FVIIa”).
  • factor VIIa or "FVIIa”
  • the factor VII used in the composition according to the invention is preferably activated.
  • biological activity of factor VIIa is meant the ability of FVIIa to generate thrombin, for example at the surface of activated platelets.
  • the factor VII activity in the composition according to the invention can be evaluated in various ways.
  • the biological activity of FVIIa can for example be quantified by measuring the ability of an FVII composition to promote blood coagulation using FVII and thromboplastin deficient plasma, as described for example in US Patent No. 5,997,864. In this assay, biological activity is evaluated against a control sample and converted to "FVII units" as compared to pooled standard human serum containing 1 unit / ml of Factor VII activity.
  • the biological activity of factor VII can be quantified by (i) measuring the ability of Factor VIIa to produce factor Xa in a system comprising lipid membrane-mediated FT and Factor X (Persson et al. Biol Chem 272: 19919-1994, 1997); (ii) measuring the hydrolysis of factor X in an aqueous system (see “General Methods”below); (iii) by measuring the physical binding of FVIIa to FT via surface plasmon resonance (Persson, FEBS letts, 413: 359-363, 1997), (iv) by measuring the hydrolysis of a synthetic substrate or (v) measuring thrombin generation in an FT-independent in vitro system.
  • the factor VII of the invention is a recombinant factor VII.
  • recombinant factor VII is meant any factor VII derived from genetic engineering and resulting from the expression of the corresponding gene in any microorganism, plant, transgenic plant, animal or transgenic animal.
  • microorganism it is understood any bacterial, fungal, viral or cellular system.
  • Recombinant factor VII can also be produced from cultured eukaryotic cells such as plant or mammalian cells, for example animal or human cells.
  • the FVII of the invention is derived from the transcription and then the translation of a DNA molecule encoding FVII in a cellular host.
  • the recombinant FVII of the invention can be obtained using standard techniques, well known to those skilled in the art, allowing the expression of a protein in a biological system.
  • recombinant FVII means any FVII obtained by genetic recombination and expressed by a cultured cell line.
  • BHK Baby Hamster Kidney
  • BHK tk tsl3
  • COS-I ATCC CRL 1650
  • HEK293 ATCC CRL 1573, Graham et al., J. Gen.
  • the cell line is modified so that it produces compositions according to the invention, for example by modulating the expression of a glycosyltransferase, in particular by over-expressing a sialyltransferase.
  • the factor VII of the invention is a transgenic factor VII.
  • transgenic factor VII is meant any recombinant factor VII obtained from a transgenic animal.
  • Transgenic animal means any non-human animal with a change in its genome to allow the expression of factor VII according to the invention. Modification of the genome advantageously results from alteration, modification or insertion of a gene. This modification may be due to the action of conventional altering or mutagenic agents or by directed mutagenesis. The modification of the genome may also result from an insertion of gene (s) or replacement of gene (s) in its (their) wild or mutated form.
  • factor VII of the present invention is obtained from the milk of a transgenic animal.
  • a transgenic animal according to the invention may be chosen from the rabbit, the goat, the cow, the camel, the hamster, the mouse, the rat, the horse, the sow, the dromedary, the ewe, the llama, the n not being limiting.
  • the factor VII of the present invention is obtained from the milk of transgenic rabbits.
  • the secretion of factor VII by the mammary glands, allowing its secretion into the milk of the transgenic mammal, involves the control of factor VII expression tissue-dependent manner. Such control methods are well known to those skilled in the art. Expression control is performed through sequences that allow the expression of the protein to a particular tissue.
  • the expression in the mammary glands of the rabbit is carried out under the control of the beta-casein promoter well known to those skilled in the art.
  • a method for producing a recombinant protein in the milk of a transgenic animal may comprise the following steps: a synthetic DNA molecule comprising a gene coding for human FVII, this gene being under the control of a promoter of a a protein secreted naturally in milk, is integrated into an embryo of a non-human mammal. The embryo is then placed in a female mammal of the same species. Once the mammal from the embryo has grown sufficiently, the lactation of the mammal is induced, then the milk collected. The milk then contains the FVII of interest secreted by the transgenic animal.
  • the factor VII according to the invention is produced in the milk of transgenic rabbits.
  • a plasmid containing the beta promoter casein is manufactured by introducing a sequence comprising the promoter of the beta-casein gene, this plasmid being designed so as to be able to receive a foreign gene placed under the control of this promoter.
  • the gene coding for human FVII is integrated and placed under the control of the beta-casein promoter.
  • the plasmid containing the promoter and the coding sequence for the protein of interest is digested with restriction enzymes to release the DNA fragment containing the beta-casein promoter and the human FVII sequence.
  • the fragments are introduced by microinjection into the male pronucleus of wild-type rabbit embryos.
  • the embryos are then cultured before transfer into the oviduct of wild-type females hormonally prepared.
  • the offspring is evaluated by PCR to determine the transgenic animals.
  • the number of copies of the transgene and its integrity is revealed by the Southern technique from the DNA extracted from the transgenic rabbits obtained.
  • the concentration of human FVII expressed in the milk of the transgenic female progeny is evaluated using enzyme immunoassays.
  • the factor VII composition according to the invention is obtained by the process comprising the following steps:
  • step a) transferring embryos obtained in step a) into the oviduct of non-human mammalian females so that it develops into a non-human adult mammal
  • step b) induction of lactation in the non-human adult mammal obtained in step b) of the female type or in a female descendant of this non-human mammal in which the gene and the promoter are present in its genome
  • the non-human adult mammal or a female descendant of this non-human mammal is selected in particular for its ability to produce FVII compositions according to the invention.
  • the transgenic animal may also be selected according to other criteria such as the presence of a single transgene integration site and / or the integrity of the FVII produced.
  • the insertion of a DNA sequence comprising a gene encoding factor VII in a non-human mammalian embryo, said gene being under the transcriptional control of the beta-casein promoter is by micro injection more particularly in the male pronucleus of a rabbit embryo.
  • embryo is meant the male or female pronucleus of a nonhuman mammalian embryo, more particularly rabbit, fertilized.
  • Isoelectric point or “pi” means the pH for which the net elementary charge of the factor VII or factor VIIa molecule is zero, ie the pH at which the molecule is electrically neutral ( zwitterionic form).
  • the isoelectric point of the factor VII according to the invention can be measured by implementing a technique well known to those skilled in the art such as isoelectric focusing or iso-electric focusing ("IEF").
  • IEF isoelectric focusing
  • This electrophoretic technique allows the separation of proteins on the basis of their isoelectric point. It consists of a migration, induced by a uniform electric current, of proteins in a pH gradient until they reach a pH equivalent to their specific isoelectric point, at which point they stop migrating since their net charge is zero.
  • IEF gels are used to determine the isoelectric point of a given protein and to detect minor changes thereof due to post-translational modifications such as ⁇ -carboxylations, phosphorylations or glycosylations.
  • substantially homogeneous it is understood that at least 90%, preferably at least 95% of the factor VII molecules of the composition have an isoelectric point within a unit pH range of less than or equal to 1.2. .
  • at least 50%, preferably at least 55%, preferably 60%, of the factor VII molecules of the composition have an isoelectric point within a pH unit range. less than 1; preferably less than 0.5.
  • at least 50%, preferably at least 55%, preferably 60%, of the factor VII molecules of the composition have an isoelectric point within a pH unit range of 0. 4.
  • N-glycan forms all the N-glycan forms present at the two N-glycosylation sites of factor VII of the invention.
  • the N-glycan forms are said to be monocharged, if their total charge is equal to 1.
  • charge is meant a phosphate group, a sulfate group or a sialic acid molecule.
  • the N-glycan forms are said to be monocharged, if they contain only a phosphate group or a sulfate group or a molecule of sialic acid.
  • the term “bicharged” means that the total charge carried by the N-glycan forms is 2, that is, they have two charges selected from a phosphate group, a sulphate group and / or a molecule of sialic acid.
  • the bicharged N-glycan forms have a sialic acid molecule and a phosphate group, or a sialic acid molecule and a sulphate group, or two sialic acid molecules, or two phosphate groups, or two groups. sulphates, or a phosphate group and a sulphate group.
  • neutral meanwhile means that the N-glycan forms do not contain any charge.
  • the charge of the N-glycan forms of the factor VII according to the invention can be measured by implementing a technique well known to those skilled in the art, in particular by ultra-high performance liquid chromatography having a coupled anion exchange resin. fluorescence detection (AEX-UPLC / FD). This method makes it possible to separate the different N-glycan forms according to their apparent charge (see, in particular, Hermentin et al, Glycobiology, vol.6, No. 2, 1996).
  • anion exchange chromatography a positively charged resin is used as the stationary phase.
  • These positively charged resins generally consist of a crosslinked polymer or gel, on which positively charged groups are grafted.
  • a weak anion exchange column of aminopropyl type is used.
  • the Applicant has more particularly demonstrated that the substantially homogeneous isoelectric point of the factor VII composition according to the invention results from the combination of the glycosylation and ⁇ -carboxylation properties of the F VII molecules that compose it.
  • the factor VII molecules that form the composition according to the invention comprise, similarly to human plasma factor VII, two N-glycosylation sites, at positions 145 and 322, and 2 O-glycosylation sites, at positions 52 and 60. Each of these sites is likely to receive "glycans" or “sugar chains” or “oligosaccharide chains”.
  • the N-glycosylated and / or O-glycosylated oligosaccharide chains carried by each Factor VII molecule of the composition are likely to differ from one molecule to another. However, it is possible to measure the distribution of each pattern in the factor VII composition according to the invention using techniques known to those skilled in the art.
  • the factor VII composition according to the invention it appears that among all the N-glycan forms of the factor VII of the composition, at least 60% of the N-glycan forms, preferably at least 65%, preferably at least 70%, preferably at least 75%, preferably at least 80%, preferably at least 85%, preferably at least 90%, preferably at least 95%, are monocharged.
  • the factor VII molecules exhibiting monocharged N-glycan forms represent between 60% and 95% of the factor VII molecules of the composition, preferably between 65% and 90% of the factor VII molecules of the composition, preferably between 70% and 85% of the factor VII molecules of the composition, preferably between 70% and 80% of the factor VII molecules of the composition, preferably between 74% and 77% of the Factor VII molecules of the composition. the composition.
  • the factor VII composition according to the invention it appears that among all the N-glycan forms of the factor VII of the composition, between 3% and 10%, preferably between 3% and 7% of the N-forms. Glycans are neutral.
  • the factor VII composition according to the invention it appears that among all the N-glycan forms of the factor VII of the composition, between 15% and 25%, preferably between 18% and 22% of the N-forms. Glycans are bicharged.
  • the factor VII composition according to the invention it appears that among all the N-glycan forms of the factor VII of the composition, less than 5%, preferably less than 2%, preferably less than 1% of the N-glycan forms are tri-charged.
  • the factor VII composition according to the invention it appears that among all the N-glycan forms of the factor VII of the composition, less than 5%, preferably less than 2%, preferably less than 1% of the N-glycan forms are tetracharged. For purposes of the invention, it is understood that the percentages quoted above do not therefore take into account the glycan forms involved in O-glycosylation.
  • the factor VII molecules forming the composition of the invention comprise only sialic acids linked by ⁇ 2-6 type bonds. The Applicant has also found that the fucose content of factor VII has no effect on the isoelectric point of the factor VII composition. In the case of the factor VII composition according to the invention, it appears that at least
  • At least 10%, preferably at least 15%, preferably at least 20%, preferably at least 25% of the N-glycan forms of the factors VII of the composition are high Mannose / hybrid.
  • ⁇ -carboxylation is meant the product of a biochemical reaction to transform a plurality of glutamic acid residues present in the peptide sequence of factor VII into carboxy-glutamic acid or "GLA" residues.
  • the factor VII molecules which form the composition according to the invention have, for at least 80%> of them, ⁇ -carboxylation on nine residues of glutamic acid. In another embodiment, at least 85% of said molecules exhibit ⁇ -carboxylation on nine residues of glutamic acid. In another embodiment, between 85% and 100%, preferably between 90% and 100%, preferably between 95% and 100% of said molecules exhibit ⁇ -carboxylation on nine residues of glutamic acid.
  • the level of ⁇ -carboxylation on the glutamic acid residue (Glu 35) of the factor VII molecules of the composition is less than 20%. In another embodiment, the ⁇ -carboxylation level of the Glu35 residue is less than 15%, preferably less than 10%, and preferably less than 5%.
  • the Applicant has surprisingly discovered that it is the specific combination of the level of the monocharged N-glycan forms and the ⁇ -carboxylation rate which is responsible for the substantial homogeneity of the isoelectric points of the factor VII molecules forming the composition according to the invention. 'invention.
  • the FVII composition according to the invention can advantageously be formulated without causing the precipitation of the FVII molecules that compose it. Indeed, it is known that at the isoelectric point of a molecule, it aggregates and precipitates.
  • the factor VII molecules that form the composition according to the invention have an isoelectric point between 6.6 and 7.0. This results in a better stability of the factor VII composition according to the invention, especially when it is formulated at a pH below the isoelectric point, and in particular at pH 6.
  • the improvement in the stability of the factor composition VII according to the invention makes it possible to avoid the electrostatic interactions responsible for the precipitation and aggregation phenomena of the soluble and insoluble type, as well as to avoid the loss of active raw materials and thus a drop in yield resulting in a loss of quantity in active principle and therefore potentially to a loss of activity.
  • Another subject of the invention relates to a process for purifying activated factor VII according to the invention.
  • transgenic rabbits The milk of transgenic rabbits is obtained from the line of transgenic rabbits R69. Frozen transgenic rabbit milk is thawed and concentrated as a pool of transgenic rabbit milk.
  • the pool of transgenic rabbit milk thus obtained is then subjected to a clarification step using a depth filter having a porosity of 0.2 ⁇ m to remove lipids and insoluble compounds.
  • the milk thus clarified is then subjected to a viral inactivation step by treatment with a detergent type solvent, for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • a detergent type solvent for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • a detergent type solvent for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • a detergent type solvent for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • Such a treatment makes it possible in particular to effectively in
  • the factor VII eluate obtained at the end of this chromatography step is then subjected to an ultrafiltration and formulation step, thus making it possible to obtain an intermediate factor VII concentrate having a purity of 95%.
  • the intermediate factor VII concentrate is then subjected to a filtration step using a filter having a porosity of 0.2 ⁇ at 0.2 ⁇ followed by a nanofiltration step on filters having a porosity of 20 nm then 15 nm.
  • the product thus obtained, which contains factor VII is then subjected to a Q Sepharose XL gel chromatography step and then to a CHT-I chromatography step followed by SEC Superdex 200 chromatography.
  • Factor VII concentrate thus obtained is then subjected to a stabilization step and filter filtration having a porosity of 0.2 ⁇ .
  • the factor VII purification and extraction method is that described in EPI application 2305882.
  • Another subject of the present invention relates to a process for the formulation of an activated factor VII composition according to the invention.
  • the formulation method used is that described in application WO2010 / 149907.
  • This process comprises, in particular, mixing the activated factor VII composition according to the invention with a buffer solution, adjusting the pH if necessary, filtration and desiccation if necessary to obtain the solid form.
  • the step of mixing the activated factor VII composition with a buffer solution is carried out on gel filtration chromatography.
  • buffer solution includes at least one hydrophilic amino acid or a positively charged side chain, and an alkali metal salt, an alkaline earth metal salt, or a salt of a transition metal. It may especially be mentioned trisodium citrate, calcium chloride, or zinc chloride.
  • the salt used is preferably sodium citrate or calcium chloride.
  • the buffer solution also contains at least one hydrophobic amino acid.
  • the buffer solution comprises one or more of the chosen constituents a salt, preferably a citrate salt, preferably trisodium citrate;
  • an amino acid or a hydrophilic amino acid salt preferably a hydrophilic amino acid salt, preferably arginine hydrochloride and / or lysine hydrochloride;
  • an amino acid or a hydrophobic amino acid salt preferably a hydrophobic amino acid, preferably isoleucine and / or glycine.
  • composition of the invention may comprise one or more nonionic type detergents such as polysorbates, poloxamers, polyoxyethylene alkyl ethers, a co-polymer block of ethylene / polypropylene and polyethylene glycol.
  • nonionic type detergents such as polysorbates, poloxamers, polyoxyethylene alkyl ethers, a co-polymer block of ethylene / polypropylene and polyethylene glycol.
  • the preferred detergents are polysorbate 80 and polysorbate 20.
  • the factor VII composition obtained at the end of the mixing step with the buffer solution comprises:
  • the factor VII according to the invention preferably in activated form
  • the factor composition obtained at the end of the step of mixing with the buffer solution comprises factor VII (preferably in the form of factor VIIa) at 0.2 to 2 g / l, hydrochloride of arginine at 24 g / l, isoleucine at 6 g / l, trisodium citrate dihydrate at 1.5 g / l, glycine at 1.2 g / l, lysine hydrochloride at 1.2 g / l. and / or polysorbate 80 at 0.07 g / l.
  • factor VII preferably in the form of factor VIIa
  • hydrochloride of arginine at 24 g / l
  • isoleucine at 6 g / l
  • trisodium citrate dihydrate at 1.5 g / l
  • glycine at 1.2 g / l
  • lysine hydrochloride at 1.2 g / l.
  • polysorbate 80 at 0.07 g /
  • the factor composition obtained at the end of the step of mixing with the buffer solution comprises factor VII (preferably in the form of factor VIIa) at 0.2 to 2 g / l, hydrochloride of arginine at 24 g / l, isoleucine at 6 g / l, trisodium citrate dihydrate at 1.5 g / l, glycine at 1.2 g / l, lysine hydrochloride at 1.2 g / l. and / or polysorbate 80 at 0.09 g / l.
  • factor VII preferably in the form of factor VIIa
  • hydrochloride of arginine at 24 g / l
  • isoleucine at 6 g / l
  • trisodium citrate dihydrate at 1.5 g / l
  • glycine at 1.2 g / l
  • lysine hydrochloride at 1.2 g / l.
  • polysorbate 80 at 0.09 g /
  • the factor VII composition obtained at the end of the step of mixing with the buffer solution comprises factor VII (preferably in the form of factor VIIIa) at 0.2 to 2 g / l, hydrochloride of arginine at 34 g / l, calcium chloride dihydrate at 0.15 g / l, isoleucine at 6 g / l.
  • the factor VII composition according to the invention is devoid of any sugar, polyol or methionine.
  • Sugars to be avoided include, in addition to sucrose, di- and tri-saccharides and polysaccharides, such as dextrose, lactose, maltose, trehalose, cyclodextrins, maltodextrins and dextrans.
  • the polyols to be avoided include, in addition to mannitol, sorbitol and xylitol.
  • the composition is free of glycylglycine. More preferably, the composition is free of glycylglycine.
  • composition of the invention is furthermore devoid of any antioxidant agent.
  • Antioxidants include, for example, one or more of the following: homocysteine, cysteine, cystathionine, methionine, glutathione.
  • the pH of the solution before desiccation is preferably between 4.0 and 9.0, more particularly in the ranges 4.0 and 8.0; 4.0 and 7.5; 4,5 and 7,5; 5.0 and 7.5; 5.5 and 7.0; 6.0 and 7.5; 6.5 and 7.5.
  • Desiccation is a method of removing water at a high stage. It is a dehydration to remove as much water as possible. This phenomenon can be natural or forced. This desiccation can be carried out using freeze-drying, atomization and cryoatomization techniques.
  • the preferred mode of obtaining the solid form of the composition for pharmaceutical use according to the invention is lyophilization. Lyophilization methods are well known to those skilled in the art, see for example [Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000].
  • the formulation process further comprises a step of removal or inactivation of the infectious agents, for example by dry heating of the lyophilizate.
  • the formulation process further comprises a step of filtering the factor VII composition and / or a lyophilization step of the formulated factor VII composition.
  • the factor VII composition according to the invention is particularly advantageous when it is formulated according to the method described above. Indeed, the formulation method according to the invention applied to the factor VII composition according to the invention makes it possible to improve its stability.
  • Another subject of the invention relates to the use of the factor VII composition of the invention as a medicament for the treatment of hemorrhagic episodes.
  • Another subject of the invention concerns the use of the factor VII composition according to the invention for the prevention of haemorrhages occurring during surgical procedures or invasive procedures.
  • compositions according to the invention are a pharmaceutical composition comprising the factor VII composition according to the invention and a pharmaceutically acceptable excipient and / or vehicle.
  • the excipient may be any solution, such as saline, physiological, isotonic or buffered solution, as well as any suspension, gel or powder, compatible with a pharmaceutical use and known to those skilled in the art.
  • the compositions according to the invention may also contain one or more agents or vehicles chosen from dispersants, solubilizers, stabilizers, surfactants and preservatives.
  • the compositions according to the invention may comprise other agents or active principles.
  • compositions can be administered in different ways and in different forms.
  • the administration can be carried out by any conventional route for this type of therapeutic approach, such as in particular via the systemic route, in particular through intravenous, intradermal, intratumoral, subcutaneous, intraperitoneal, intramuscular or intra-arterial injection.
  • intratumoral injection or injection into an area close to the tumor or irrigating the tumor may be mentioned.
  • the doses may vary according to the number of administrations, the association with other active ingredients, the stage of evolution of the pathology, etc.
  • Example 1 Production of transgenic rabbits producing a human FVII protein in their milk.
  • An expression vector composed of a chicken beta-globin insulative sequence, a goat beta-casein promoter region, a cDNA sequence optimized for expression in mammalian cells encoding the Human FVII and an untranslated region of beta-casein in 3 ', in a skeleton of SuperCos.
  • the assembly in FIG. 6 represents the construction vector.
  • the transgene was prepared from digestion of the construct vector with NotI restriction endonuclease to release the SuperCos backbone and linearize the expression vector. The resulting fragments were separated by gel electrophoresis, purified from the gel and then used for microinjection.
  • transgenic rabbits To produce transgenic rabbits, microinjection of the transgene into male pronucleus of fertilized embryos collected from WT rabbits was performed. After an in vitro culture period of a few hours, the male pronuclei of microinjected embryos were transferred to the oviduct of hormonally prepared non-transgenic females. After gestation, offspring are obtained. Genetic analysis makes it possible to evaluate the presence of the human FVII transgene by PCR analysis using human FVII specific primer sequences.
  • the presence of the transgene and its integrity was revealed by the Southern Blot technique from DNA extracted from the transgenic rabbits obtained.
  • a phenotypic analysis makes it possible to evaluate the concentration of human FVII expressed in the milk of transgenic rabbits.
  • This measurement is carried out by immunoenzymatic method (ELISA) with commercial reagents (Diagnostica Stago). Briefly, the factor VII to be assayed is captured by an anti-human factor VII antibody immobilized on a solid phase. The fixed Factor VII is then recognized by a peroxidase immunoconjugate. The level of bound peroxidase is measured by its activity on the ortho-phenylenediamine substrate in the presence of hydrogen peroxide. The intensity of the staining, after stopping the reaction with a strong acid, is a function of the amount of factor VII initially present in the sample.
  • EXAMPLE 2 Purification and Extraction of the Factor VII Obtained
  • transgenic rabbits The milk of transgenic rabbits is obtained from the line of transgenic rabbits R69. Frozen transgenic rabbit milk is thawed and concentrated as a pool of transgenic rabbit milk.
  • the pool of transgenic rabbit milk thus obtained is then subjected to a clarification step using a depth filter having a porosity of 0.2 ⁇ m to remove lipids and insoluble compounds.
  • the thus clarified milk is then subjected to a viral inactivation step by treatment with a detergent type solvent, for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • a detergent type solvent for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • a detergent type solvent for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • a detergent type solvent for example Polysorbate 80 or Tri-n-Butyl Phosphate at 25 ° C ⁇ 2 ° C for at least two hours.
  • Such a treatment makes it possible in particular to effectively in
  • the intermediate factor VII concentrate is then subjected to a filtration step using a filter having a porosity of 0.2 ⁇ at 0.2 ⁇ followed by a nanofiltration step on filters having a porosity of 20 nm then 15 nm.
  • the product thus obtained containing factor VII is then subjected to a Q Sepharose XL gel chromatography step and then to a CHT-I chromatography step followed by SEC Superdex 200 chromatography.
  • Factor VII concentrate thus obtained is then subjected to a stabilization step and filter filtration having a porosity of 0.2 ⁇ .
  • the process thus described makes it possible to obtain a factor VII concentrate having a purity of approximately 99.9995%.
  • the Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) method is a variation of normal phase chromatography (NP) and effectively separates polar species, avoiding the disadvantages of using immiscible solvents in the water. 'water.
  • the stationary phase is a polar material generally based on silica or polymeric supports grafted with a functional group such as a cyano group, amino, diol, amide, etc. and the mobile phase is organic and contains water as a strong eluent.
  • Factor VII is first subjected to enzymatic digestion with PNGase F in order to specifically release the N-glycan derivatives.
  • N-glycan derivatives The analysis of the N-glycan derivatives is finally carried out by HILIC-HPLC / FD according to Guile et al (Guile, GR, et al, A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatography method for separating glycans mixtures and analyzing oligosaccharide profiles, Anal Biochem., 240, 210-226 (1996)).
  • Guile et al Guile et al (Guile, GR, et al, A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatography method for separating glycans mixtures and analyzing oligosaccharide profiles, Anal Biochem., 240, 210-226 (1996)).
  • the detection is ensured by fluorescence at wavelengths ⁇ excitation 330 nm and ⁇ emission 420 nm.
  • the factor VII of the invention has a rate of neutral N-glycan forms of between 3.6% and 4.3%, of ungated N-glycan forms of between 74.6% and 75.5%. and bi-charged N-glycan forms ranging from 20.6% to 21.2%.
  • Table 2 Quantification of neutral, monocharged and bicharged, tricharged, tetracharged H-type Factor VII-rec N-glycan forms
  • the results obtained by the HILIC method show that the neutral N-glycan forms of FVII-rec represent 11.3% of the N-glycan forms of FVII-rec, which the Single-charged N-glycan forms account for 25.1% of the N-glycan forms of FVII-rec, and the bi-charged N-glycan forms account for 55.1% of the N-glycan forms of FVII-rec.
  • the factor Vll-rec has a significant amount of tricharged and tetracharged forms.
  • the separation of the N-glycans according to their charge is carried out by AEX-UPLC / FD profiling of N-glycans derived at 2-AB.
  • the procedure for preparing N-glycans derivatives at 2-AB is identical to that described above for the analysis of N-glycans by HILIC-HPLC / FD.
  • the charge profiling of F VII N-glycans by AEX-UPLC / FD was carried out using a weak aminopropyl anion exchange column.
  • the glycans are separated according to their charge by applying a growing gradient of ammonium formate. Detection of the derivatives is carried out at the following wavelengths: excitation wavelength: 330 nm and emission wavelength: 420 nm.
  • the profile obtained by AEX- UPLC / FD for F VII (lot 1) is presented in Figure 3.
  • FIG. 5A presents the glycan profile of the FVII resulting from the application WO2007 / 138199
  • FIG. 5B presents the glycan profile of the FVII of the invention
  • FIG. 5C presents the glycan profile of the FVII. VII- rec.
  • FVII of FVII (from Factor VII-rec the invention requires
  • Quantification of the N-glycan forms of factor VII according to the invention is carried out using the HILIC method, as described in Example 3.
  • N-glycan forms FVII FVII FVII Charge
  • N-glycan forms FVII from the application for
  • Human factor VIIa has other post-translational modifications, such as ⁇ -carboxylation of the N-terminal GLA domain.
  • the top ten glutamic acids are all ⁇ -carboxylated (Jurlander B. et al., Recombinant activated factor VII (rFVIIa): Characterization, Manufacturing, and Clinical Development, Semin, Thromb, Hemost, 27.4 (2001): 373-84.
  • the tenth glutamic acid of NovoSeven® is only partially ⁇ -carboxylated (Thim L. et al., Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor Vlla from plasma and transfected baby hamster kidney cells. 1988): 7785-93.
  • the factor VII is reduced beforehand and alkylated then subjected to enzymatic digestion by means of a specific enzyme of the trypsin type.
  • the peptides thus generated are analyzed by electrospray mass spectrometry after separation by C18 reverse phase liquid chromatography (Yates, JR, Ruse, CL, Nakorchevsky, A., (2009) Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances, and applications Annu Rev Biomed Eng 11, 49-79.). This approach makes it possible to measure the precise mass of the ⁇ -carboxylated N-terminal peptide of Factor VII and to deduce its level of ⁇ -carboxylation.
  • Figure 2 shows the mass spectrum of the N-terminal peptide [Alai-Arg 36 ].
  • the average mass measured is 4768.0 Da, which is in agreement with the theoretical mass of 4768.0 Da (reduced and alkylated cysteines), which corresponds to 9 ⁇ -carboxylations.
  • the factor VII of the present invention thus has 9 ⁇ -carboxylations.
  • Figure 2 also contains the mass spectrum of the N-terminal peptide [Alai-Lys 32 ], which is eluted in a near retention time. The molecular weight of the peptide is also consistent with the presence of 9 ⁇ -carboxylations on the peptide.
  • factor VII of the invention has 9 ⁇ -carboxylated glutamic residues at the ten potential sites, and that the glutamic residue located at position 35 with respect to the sequence of human factor VII (Glu 35 ) does not is not ⁇ -carboxylated.
  • the peptide [Asp33-Gly 47 ] was isolated by peptide mapping. This peptide contains the amino acid GIU35 which was found mostly in its non-carboxylated form at a mass of 1786.9 Da. A minor form of this peptide was found at a mass of 1830.9 Da, corresponding to a modified GIU35. This form is estimated at less than 5%, based on MS signals. This result confirms the presence of ⁇ -carboxylations on the first nine glutamic acids of factor VII of the invention whereas the tenth is not predominantly ⁇ -carboxylated.
  • factor VII isoforms are separated on a strong anion exchange column (SAX).
  • SAX strong anion exchange column
  • a sample of Factor VII is first loaded on a column (Mono Q 5/50 GL, GE Healthcare) previously equilibrated to pH 9 with a 20 mM Tris buffer. The sample is then eluted by applying an increasing gradient of 20 mM Tris / 1 M NaCl elution buffer at pH 9.
  • FVII 9GLA means factor VII whose major isoforms have ⁇ -carboxylations on 9 residues of glutamic acid
  • F VII IOGLA means factor VII whose major isoforms have ⁇ -carboxylations on 10 residues of glutamic acid .
  • the major isoforms of the factor VII of the invention are the forms having 9 ⁇ -carboxylations (95%).
  • the isoforms of FVII-rec 76% of the isoforms have 9 ⁇ -carboxylations and 24% of isoforms have 10 ⁇ -carboxylations.
  • the quality of the batches of factor VII is evaluated by analysis of the different isoforms of the product after migration on a gradient gel of pH 3-10 under native conditions (non-reducing and non-denaturing), according to the general procedure of IEF analysis on a system. Multiphor (GE Healthcare).
  • IEF analysis is carried out on Focusgel 3-10 without a SERVA well.
  • the migration takes place according to the following electrical parameters (gradient mode):
  • the proteins are revealed by staining with Coomassie blue CCB-G250. Determination of the iso-forms pi is done after gel scanning and analysis by Quantity One software (Bio-Rad).
  • the determination of the pi of the bands is made with a standard whose pi are between 5.20 and 8.15.
  • the isoelectric point of factor VII of the invention is between 6.1 and 7.3.
  • the profile of the Factor VII isoforms of the invention includes two major bands between 6.6 and 7.0 as well as a more acidic trace at pi 6.1 and a more basic trace at pi 7.3.
  • the two main isoforms represent about 60% of all the factors VII of the composition.
  • the isoelectric point of factor VII-rec is between 5.5 and 7.5.
  • the profile of the Factor VII-rec isoforms of the invention includes two major bands between 6.4 and 6.8, thus more acidic traces between 5.5 and 6.4 and more basic traces between 6.8 and 6.4. 7.5.
  • the two main isoforms represent about 45% of the factors VII of the composition of FVII-rec.
  • isoelectric point of factor VII of the invention is substantially more homogeneous than that observed for FVII-rec.
  • the F VII assay is carried out by an amidolytic method (FVILam) which measures its biological activity, that is to say the ability of the factor VIIa / tissue factor complex to activate factor X in the presence of calcium ions and phospholipids.
  • FVILam amidolytic method
  • This method is a two step chromogenic kinetics assay: FVIIa activation of FX in a reaction mixture containing thromboplastin and calcium; then the enzymatic cleavage of a specific chromogenic substrate by FXa which releases a quantifiable chromophore by spectrophotometry.
  • the kinetic reading is carried out at 405 nm against 1 reference filter at 490 nm.
  • amidolytic activity of factor VII of the invention is between 3067 IU / ml and 3377 IU / ml.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

La présente invention concerne une composition de facteur VII présentant un point isoélectrique substantiellement homogène et un procédé de formulation d'une telle composition. La présente invention concerne également l'utilisation thérapeutique d'une composition de facteur VII présentant un point isoélectrique substantiellement homogène.

Description

FACTEUR VII TRANSGÉNIQUE PRESENTANT UNE N-GLYCOSYLATION SPÉCIFIQUE ET POINT ISOELECTRIQUE SUBSTANTIELLEMENT HOMOGENE
Domaine technique
La présente invention concerne une composition de facteur VII présentant un point isoélectrique substantiellement homogène et un procédé de formulation d'une telle composition. La présente invention concerne également l'utilisation thérapeutique d'une composition de facteur VII présentant un point isoélectrique substantiellement homogène. Arrière-plan technologique
Le Facteur VII (FVII) est une glycoprotéine dépendante de la vitamine K qui intervient dans la voie extrinsèque de la coagulation sanguine. Sous sa forme activée (FVIIa), le facteur Vlla participe au processus de coagulation en se complexant au facteur tissulaire (FT) et en activant le facteur X et le facteur IX en facteur Xa et IXa, respectivement. Le FVIIa possède en outre la capacité de déclencher la coagulation du sang lorsque la cascade de réactions conduisant à la coagulation sanguine est interrompue ou déficiente, par exemple en l'absence de facteur VIII ou IX. C'est pourquoi le facteur VII est utilisé depuis longtemps en tant que médicament pour le traitement de certains troubles de la coagulation sanguine se manifestant par des saignements, et notamment pour traiter les patients présentant un déficit en facteur VIII (hémophilie de type A) ou en facteur IX (hémophilie de type B) et présentant des inhibiteurs contre ces facteurs, pour traiter les patients présentant un déficit congénital en facteur VII, ou en tant que produit pour la prévention des hémorragies susceptibles de se produire lors d'opérations chirurgicales.
Le facteur VII est sécrété sous la forme d'une chaîne peptidique unique de 406 résidus, d'un poids moléculaire d'environ 50 kDa, laquelle est coupée au niveau de la liaison Argi52-Ilei53 (Arginine 152- Isoleucine 153) lors de son activation en FVIIa. Le Facteur Vlla qui en résulte se compose donc d'une chaîne légère de 152 acides aminés, d'un poids moléculaire d'environ 20 kDa, et d'une chaîne lourde de 254 acides aminés, d'un poids moléculaire d'environ 30 kDa, liées entre elles par un seul pont disulfure (Cys135 - Cys262). Quatre domaines structuraux distincts peuvent être identifiés dans la séquence du facteur VII: un domaine γ-carboxylique N-terminal (domaine Gla), deux domaines "epidermal growth factor (EGF)-like", ainsi qu'un domaine sérine protéase. Le Facteur Vlla plasmatique comporte par ailleurs plusieurs modifications post- traductionnelles, parmi lesquelles : la γ-carboxylation des dix premiers acides glutamiques de sa séquence, l'hydroxylation partielle de l'acide aspartique 63, la O-glycosylation des sérines 52 et 60 (Ser52 et Ser6o) et la N-glycosylation des asparagines 145 et 322 (Asni45 et Asn322) (Fenaille F. et al, Mass spectrometric characterization of N- and O-glycans of plasma-derived coagulation factor VII. Glycoconj. J. 25.9 (2008): 827-42).
L'activité biologique du facteur VII dépend ainsi fortement de la nature et de la proportion des structures oligosaccharidiques qui sont attachées à la protéine, et qui peuvent affecter de nombreux aspects de l'efficacité thérapeutique tels que, par exemple, la solubilité, la résistance aux attaques protéolytiques, l'inactivation thermique, l'immunogénicité, la demi- vie, la bioactivité, la biodisponibilité et la stabilité du facteur VII. II apparaît que ces modifications post-traductionnelles, qui varient souvent d'une molécule de facteur VII plasmatique à une autre, conduisent à une certaine hétérogénéité des molécules présentes dans les compositions pharmaceutiques de facteur VII. Une telle hétérogénéité présente notamment l'inconvénient de compliquer les étapes de formulation du facteur VII en vue de la préparation de compositions pharmaceutiques destinées au traitement des patients. En effet, il est fréquent qu'une proportion significative des molécules de facteur VII purifiées précipite lors de l'étape de formulation : il en résulte une perte de matière première active, ainsi que la présence de facteur VII devenu inactif dans les compositions pharmaceutiques destinées au traitement thérapeutique. En raison des nombreux désavantages de l'utilisation de plasma humain (risques de contamination virale, difficulté de purification, approvisionnement, ...) en tant que source de produits pharmaceutiques, il est maintenant préféré de produire le facteur VII dans des systèmes recombinants ou transgéniques. Toutefois, dans la mesure où la glycosylation est une modification post-traductionnelle complexe qui dépend directement du système cellulaire utilisé, la production à grande échelle de protéines dans des cellules hétérologues conduit souvent à la production de polypeptides ayant une structure primaire identique, mais possédant des structures oligosaccharidiques variables. C'est par exemple le cas du NovoSeven®, un médicament autorisé sur le marché européen depuis 1996 et autorisé sur le marché américain en 1999, produit par la firme danoise NovoNordisk, dont le principe actif est l'eptacog alfa (facteur VII activé de la coagulation recombinant humain produit par génie génétique à partir de cellules rénales BHK de hamsters nouveau-nés).
C'est également le cas, pour le F VII recombinant ou transgénique décrit dans la demande EP 2 037 955 A, déposée le 31 mai 2007 par LFB Biotechnologies. II apparaît ainsi que, pour ces facteurs VII recombinants, l'hétérogénéité des modifications post-traductionnelles portées par les molécules de Facteur VII perturbent l'étape de formulation et contribuent à diminuer la stabilité et/ou l'activité spécifique des produits pharmaceutiques finaux, en favorisant la présence de molécules précipitées de facteur VII. Il en résulte de nombreuses difficultés pour parvenir à la préparation de compositions pharmaceutiquement acceptables présentant une efficacité clinique uniforme et prédéterminée.
Il existe par conséquent un besoin croissant pour des compositions de facteur VII présentant une stabilité chimique et physique améliorée à température ambiante et capables de faciliter et d'améliorer le rendement de l'étape de formulation visant à préparer des compositions pharmaceutiques destinées au traitement des patients atteints d'hémophilie avec inhibiteurs ou de déficit congénital en facteur VII.
Résumé de l 'invention
La demanderesse a découvert de manière surprenante que des compositions de facteur VII dont les molécules de facteur VII présentent un point isoélectrique substantiellement homogène facilitent l'étape de formulation à un pH optimal, de préférence à un pH optimal de 6,0±0,2, des compositions pharmaceutiques en évitant la précipitation du facteur VII.
La présente invention concerne donc une composition de facteur VII dans laquelle les molécules de facteur VII présentent un point isoélectrique substantiellement homogène.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une composition de facteur VII dans laquelle, parmi toutes les formes N-glycanniques du facteur VII de la composition, au moins 60 % desdites formes N-glycanniques sont monochargées, et parmi toutes les molécules de facteur VII de la composition, au moins 80% desdites molécules présentent une γ-carboxylation sur 9 résidus d'acide glutamique.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins 65%, de préférence au moins 70%, ou de préférence au moins 80% des formes N-glycanniques du facteur VII de la composition sont monochargées.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins 85%, de préférence de 85% à 100%, ou de préférence de 90% à 100%, ou de préférence de 95% à 100% des molécules de facteur VII de la composition présentent une γ-carboxylation sur 9 résidus d'acide glutamique.
Dans un mode de réalisation particulier, le taux de γ-carboxylation de la composition de facteur VII de l'invention sur le résidu d'acide glutamique 35 (Glu35 par rapport à la séquence du facteur VII plasmatique) est inférieur à 20%, ou de préférence inférieur à 15%), ou encore de préférence inférieur à 10%, de préférence inférieur à 5%.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne une composition de facteur VII, dans laquelle au moins 60% des formes N-glycanniques des facteurs VII de la composition sont complexes monosialylées.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins 10%, de préférence au moins 15%, ou de préférence au moins 20%, ou de préférence au moins 25% des formes N-glycanniques des facteurs VII de la composition sont high Mannose/ hybride.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins 90%, de préférence au moins 95% des molécules de facteur VII de la composition ont un point isoélectrique compris dans un écart d'unité de pH inférieur à 1 ,2.
Dans un mode de réalisation particulier, au moins 50%, ou de préférence au moins 55%, ou de préférence 60% des molécules de facteur VII de la composition ont un point isoélectrique compris dans un écart d'unité de pH inférieur à 1 ; de préférence inférieur à 0,5 ; ou de préférence inférieur à 0,4.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le facteur VII de l'invention est un facteur VII recombinant ou transgénique. De manière préférée, le facteur VII de la composition est produit par des lapines transgéniques. Dans un mode de réalisation, le facteur VII de la composition est un facteur VII activé.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de la composition de facteur VII pour le traitement d'épisodes hémorragiques et pour la prévention des hémorragies survenant lors d'interventions chirurgicales ou de procédures invasives chez les groupes de patients suivants :
chez des patients atteints d'une hémophilie congénitale avec inhibiteurs dirigés contre les facteurs de coagulation VIII ou IX (hémophilie A ou B),
chez des patients atteints d'une hémophilie congénitale chez lesquels une forte réponse anamnestique à l'administration de facteur VIII ou de facteur IX est prévisible,
- chez des patients atteints d'une hémophilie acquise,
et/ou chez des patients ayant un déficit congénital en FVII.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé d'obtention d'une composition de facteur VII selon l'invention comprenant les étapes suivantes :
(a) l'insertion d'une séquence d'ADN comprenant un gène codant pour le facteur VII dans un embryon de mammifère non-humain, ledit gène étant sous le contrôle transcriptionnel du promoteur béta-caséine,
(b) le transfert d'embryons obtenus à l'étape a) dans l'oviducte d'une femelle de mammifère non-humain de manière à ce qu'il se développe en un mammifère adulte non humain,
(c) l'induction de la lactation chez le mammifère non- humain adulte obtenu à l'étape b) de type femelle ou dans un descendant femelle de ce mammifère non-humain dans lequel le gène et le promoteur sont présents dans son génome,
(d) la collection du lait dudit mammifère non-humain, et
(e) la purification du facteur VII présent dans le lait collecté.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de formulation d'une composition de facteur VII comprenant le mélange de la composition de facteur VII selon l'invention avec une solution tampon, l'ajustement du pH si nécessaire, fïltration puis dessication si nécessaire pour obtenir la forme solide. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit et du mode de réalisation préféré de l'invention, donnée à titre d'exemple et en référence aux figures annexées. Légende des figures
Figure 1 : Procédé de purification et d'extraction du facteur VII de l'invention.
Figure 2 : Spectre de masse des peptides N-terminaux [Alai-Arg36] et [Alai-Lys32] du facteur VII de l'invention.
Figure 3 : Profîlage de charge des formes N-glycanniques du facteur VII de l'invention obtenu par chromatographie en phase liquide à ultra haute performance ayant une résine échangeuse d'anions couplée à une détection par fluorescence (« AEX-UPLC/FD ») Figure 4 : Comparaison des points isoélectriques du facteur VII de l'invention et d'un facteur VII recombinant (Novoseven®) obtenu par la méthode de focalisation isoélectrique (« IEF »).
Figure 5 : Profîlage de charge des formes N-glycanniques du facteur VII de l'invention, du facteur VII issu de la demande WO2007/138199 et d'un facteur VII recombinant (Novoseven®) obtenu par chromatographie en phase liquide à ultra haute performance ayant une résine échangeuse d'anions couplée à une détection par fluorescence (« AEX- UPLC/FD »)
Figure 6 : Vecteur d'expression utilisé pour la génération de mammifères non humain exprimant du FVII recombinant humain selon l'invention.
Description détaillée
La composition de facteur VII, stable chimiquement et physiquement à température ambiante et facile à formuler selon la présente invention se caractérise en ce que les molécules de facteur VII qui la composent présentent un point isoélectrique substantiellement homogène.
Avantageusement, la composition de facteur VII selon l'invention comprend des molécules de facteur VII, dans laquelle les molécules de facteur VII présentent un point isoélectrique substantiellement homogène. Par « facteur VII » ou « FVII », il est entendu les polypeptides comprenant la séquence 1- 406 du facteur VII humain de type sauvage (comme décrit, par exemple, dans le brevet US 4,784,950 A de ZymoGenetics Inc.), ou du facteur VII dérivé d'une autre espèce (par exemple bovin, porcin, lapin, caprin, murin). Il comprend en outre les variations alléliques naturelles du facteur VII qui peuvent exister. Le terme « facteur VII » inclut aussi les variants du FVII qui présentent la même activité ou une activité biologique supérieure par rapport à l'activité de la forme sauvage, ces variants incluant notamment les polypeptides différant du FVII sauvage par insertion, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés.
Le terme « facteur VII » ou « FVII » comprend également le facteur VII non clivé (zymogène) et le facteur VII activé (« facteur Vlla » ou « FVIIa »). Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le facteur VII utilisé dans la composition selon l'invention est de préférence activé.
Par l'expression « activité biologique du facteur Vlla », il est entendu la capacité du FVIIa à générer de la thrombine, par exemple à la surface des plaquettes activées. L'activité du facteur VII dans la composition selon l'invention peut être évaluée de différentes manières. L'activité biologique du FVIIa peut par exemple être quantifiée en mesurant la capacité d'une composition de FVII à promouvoir la coagulation du sang en utilisant un plasma déficient en FVII et en thromboplastine, comme décrit par exemple dans le brevet US No. 5,997,864. Dans cet essai, l'activité biologique est évaluée par rapport à un échantillon témoin et est converti en « unités de FVII » par comparaison avec un sérum humain standard poolé contenant 1 unité/ml d'activité de Facteur VII. Alternativement, l'activité biologique du facteur VII peut être quantifiée par (i) la mesure de la capacité du Facteur Vlla à produire du facteur Xa dans un système comprenant du FT englobé dans une membrane lipidique et du Facteur X (Persson et al. J. Biol. Chem. 272 : 19919- 19924, 1997) ; (ii) en mesurant l'hydrolyse du facteur X dans un système aqueux (voir « Méthodes générales » plus bas) ; (iii) en mesurant la liaison physique du FVIIa au FT par l'intermédiaire de la résonance plasmon de surface (Persson , FEBS letts, 413 :359-363, 1997), (iv) en mesurant l'hydrolyse d'un substrat synthétique ou (v) en mesurant la génération de thrombine dans un système in vitro indépendant du FT. Dans un mode de réalisation particulier, le facteur VII de l'invention est un facteur VII recombinant. Par « facteur VII recombinant », il est entendu tout facteur VII issu du génie génétique et résultant de l'expression du gène correspondant dans tout microorganisme, plante, plante transgénique, animal ou animal transgénique. Par microorganisme, il est entendu tout système bactérien, fongique, viral ou cellulaire. Le facteur VII recombinant peut également être produit à partir de cellules eucaryotes en culture telles que des cellules de plante ou de mammifère, par exemple des cellules animales ou humaines. Ainsi, le FVII de l'invention est issu de la transcription puis de la traduction d'une molécule d'ADN codant pour le FVII dans un hôte cellulaire. Le FVII recombinant de l'invention peut être obtenu au moyen de techniques standards, bien connues de l'homme du métier, permettant l'expression d'une protéine dans un système biologique.
Plus particulièrement, on entend par « FVII recombinant » tout FVII obtenu par recombinaison génétique et exprimé par une lignée cellulaire mise en culture. A titre d'exemple, on peut citer les lignées suivantes : BHK (Baby. Hamster Kidney) et notamment BHK tk"tsl3 (CRL 10314, Waechter and Baserga, Proc. Natl . Acad. Sci. USA 79: 1106-1110, 1982), CHO (ATCC CCL 61), COS-I (ATCC CRL 1650), HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al, J. Gen. Virol . 36:59-72, 1977), Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600) , Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), Human lung (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) and DUKX cells (CHO cell line) (Urlaub and Chasin, Proc. Natl . Acad. Sci . USA 77:4216-4220, 1980), cellules 3T3 , cellules Namalwa, ou des cellules BHK adaptées à la culture sans sérum (Document US 6,903,069). Dans un mode de réalisation particulier, la lignée cellulaire est modifiée de manière à ce qu'elle produise des compositions selon l'invention, par exemple en modulant l'expression d'une glycosyltransférase, en particulier en sur-exprimant une sialyltransférase.
Dans un mode de réalisation particulier, le facteur VII de l'invention est un facteur VII transgénique. Par « facteur VII transgénique », il est entendu tout facteur VII recombinant obtenu à partir d'un animal transgénique.
Par « animal transgénique », il est entendu tout animal non-humain présentant une modification de son génome destinée à permettre l'expression du facteur VII selon l'invention. La modification du génome résulte avantageusement d'une altération, d'une modification ou de l'insertion d'un gène. Cette modification peut être due à l'action d'agents altérants ou mutagènes classiques ou bien effectuée par mutagenèse dirigée. La modification du génome peut également résulter d'une insertion de gène(s) ou de remplacement de gène(s) dans sa (leur) forme sauvage ou mutée. Dans un mode de réalisation préféré, le facteur VII de la présente invention est obtenu à partir du lait d'un animal transgénique. Un animal transgénique selon l'invention peut être choisi parmi le lapin, la chèvre, la vache, le chameau, le hamster, la souris, le rat, le cheval, la truie, le dromadaire, la brebis, le lama, la liste n'étant pas limitative. De préférence, le facteur VII de la présente invention est obtenu à partir du lait de lapines transgéniques. La sécrétion de facteur VII par les glandes mammaires, permettant sa sécrétion dans le lait du mammifère transgénique, implique le contrôle de l'expression du facteur VII de manière tissus- dépendante. De telles méthodes de contrôle sont bien connues de l'homme du métier. Le contrôle de l'expression est effectué grâce à des séquences permettant l'expression de la protéine vers un tissu particulier. Il s'agit notamment des séquences promotrices WAP, béta-caséine, béta-lactoglobuline et des séquences peptides signal, la liste n'étant pas limitative. De manière particulièrement avantageuse, l'expression dans les glandes mammaires de la lapine est effectuée sous le contrôle du promoteur de la béta-caséine bien connu de l'homme du métier.
Une méthode de production d'une protéine recombinante dans le lait d'un animal transgénique peut comporter les étapes suivantes : une molécule d'ADN synthétique comprenant un gène codant pour le FVII humain, ce gène étant sous le contrôle d'un promoteur d'une protéine sécrétée naturellement dans le lait, est intégrée dans un embryon d'un mammifère non humain. L'embryon est ensuite placé dans une femelle de mammifère de la même espèce. Une fois que le mammifère issu de l'embryon s'est suffisamment développé, la lactation du mammifère est induite, puis le lait collecté. Le lait contient alors le FVII d'intérêt sécrété par l'animal transgénique.
Un exemple de préparation de protéine dans le lait d'une femelle de mammifère autre que l'être humain est donné dans la demande EP 0 527 063 Bl (Institut National de la Recherche Agronomique), dont l'enseignement peut être repris pour la production du facteur VII de l'invention.
Dans un mode de réalisation préféré, le facteur VII selon l'invention est produit dans le lait de lapines transgéniques. En particulier, un plasmide contenant le promoteur béta- caséine est fabriqué par introduction d'une séquence comportant le promoteur du gène béta-caséine, ce plasmide étant réalisé de manière à pouvoir recevoir un gène étranger placé sous la dépendance de ce promoteur. Le gène codant pour le FVII humain est intégré, et placé sous la dépendance du promoteur béta-caséine. Le plasmide contenant le promoteur et la séquence codant pour la protéine d'intérêt est digéré par des enzymes de restriction pour libérer le fragment d'ADN contenant le promoteur béta-caséine et la séquence de FVII humain. Après purification, les fragments sont introduits, par microinjection dans le pronucléus mâle d'embryons de lapines Wild-type. Les embryons sont ensuite cultivés avant transfert dans l'oviducte de femelles Wild-type hormonalement préparées. A la mise bas de ces femelles, la descendance est évaluée par PCR pour déterminer les animaux transgéniques. Le nombre de copies du transgène et son intégrité est révélée par la technique de Southern à partir de l'ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus. La concentration de FVII humain exprimé dans le lait des descendants femelles transgéniques est évaluée à l'aide de tests immuno-enzymatiques.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition de facteur VII selon l'invention est obtenue par le procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) l'insertion d'une séquence d'ADN comprenant un gène codant pour le facteur VII dans un embryon de mammifère non-humain, ledit gène étant sous le contrôle transcriptionnel du promoteur béta-caséine,
(b) le transfert d'embryons obtenus à l'étape a) dans l'oviducte de femelles de mammifère non humain de manière à ce qu'il se développe en un mammifère adulte non humain,
(c) l'induction de la lactation chez le mammifère adulte non humain obtenu à l'étape b) de type femelle ou dans un descendant femelle de ce mammifère non humain dans lequel le gène et le promoteur sont présents dans son génome,
(d) la collection du lait dudit mammifère non humain, et
(e) la purification du FVII présent dans le lait collecté.
Dans un mode de réalisation particulier, le mammifère adulte non humain ou un descendant femelle de ce mammifère non-humain est sélectionné notamment pour sa capacité à produire des compositions de FVII selon l'invention. L'animal transgénique peut également être sélectionné selon d'autres critères comme par exemple la présence d'un seul site d'intégration du transgène et/ou l'intégrité du FVII produit. Dans un mode de réalisation particulier, l'insertion d'une séquence d'ADN comprenant un gène codant pour le facteur VII dans un embryon de mammifère non-humain, ledit gène étant sous le contrôle transcriptionnel du promoteur béta-caséine se fait par micro injection plus particulièrement dans le pronucléus mâle d'un embryon de lapin.
Par « embryon », il est entendu le pronucléus mâle ou femelle d'un embryon de mammifère non humain, plus particulièrement de lapin, fertilisé.
Par « point isoélectrique » ou « pi », il est entendu le pH pour lequel la charge élémentaire nette de la molécule de facteur VII ou de facteur Vlla est nulle, c'est-à-dire le pH auquel la molécule est électriquement neutre (forme zwitterionique). Le point isoélectrique du facteur VII selon l'invention peut être mesuré en mettant en œuvre une technique bien connue de l'homme du métier telle que la focalisation isoélectrique ou iso-electric focusing (« IEF »). Cette technique électrophorétique permet la séparation des protéines sur la base de leur point isoélectrique. Elle consiste en une migration, induite par un courant électrique uniforme, des protéines dans un gradient de pH jusqu'à ce qu'elles atteignent un pH équivalent à leur point isoélectrique spécifique, moment auquel elles cessent de migrer puisque leur charge nette est nulle. Les gels IEF sont utilisés pour déterminer le point isoélectrique d'une protéine donnée et pour détecter les changements mineurs de celle-ci dus à des modifications post-traductionnelles comme des γ-carboxylations, des phosphorylations ou des glycosylations.
Par « substantiellement homogène », il est entendu qu'au moins 90%, de préférence au moins 95% des molécules de facteur VII de la composition ont un point isoélectrique compris dans un écart d'unité de pH inférieure ou égale à 1,2. Dans un autre mode de réalisation de l'invention au moins 50%>, de préférence au moins 55%>, de préférence 60%> des molécules de facteur VII de la composition ont un point isoélectrique compris dans un écart d'unité de pH inférieure à 1 ; de préférence inférieure à 0,5. Dans un autre mode de réalisation préféré, au moins 50%>, de préférence au moins 55%>, de préférence 60%> des molécules de facteur VII de la composition ont un point isoélectrique compris dans un écart d'unité de pH de 0,4.
Par « formes N-glycanniques », il est entendu l'ensemble des formes N-glycanniques présentes sur les deux sites de N-glycosylation du facteur VII de l'invention. Les formes N-glycanniques sont dite monochargées, si leur charge totale est égale à 1. Au sens de la présente invention, par « charge », il est entendu un groupement phosphate, un groupement sulfate ou une molécule d'acide sialique. Ainsi les formes N-glycanniques sont dites monochargées, si elles contiennent uniquement un groupement phosphate ou un groupement sulfate ou une molécule d'acide sialique. Par opposition au terme « monochargée », le terme « bichargée » signifie que la charge totale portée par les formes N-glycanniques est égale à 2, c'est-à-dire qu'elles présentent deux charges choisies parmi un groupement phosphate, un groupement sulfate et/ou une molécule d'acide sialique. En d'autres termes, les formes N-glycanniques bichargées possèdent une molécule d'acide sialique et un groupement phosphate, ou une molécule d'acide sialique et un groupement sulfate, ou deux molécules acides sialiques, ou deux groupements phosphates, ou deux groupements sulfates, ou un groupement phosphate et un groupement sulfate. Le terme « neutre » quant à lui signifie que les formes N-glycanniques ne contiennent aucune charge.
La charge des formes N-glycanniques du facteur VII selon l'invention peut être mesurée en mettant en œuvre une technique bien connue de l'homme du métier, notamment par chromatographie en phase liquide à ultra haute performance ayant une résine échangeuse d'anions couplée à une détection par fluorescence (AEX-UPLC/FD). Cette méthode permet de séparer les différentes formes N-glycanniques en fonction de leur charge apparente (voir en particulier, Hermentin et al, Glycobiology, vol.6, no. 2, 1996). Dans le cadre d'une chromatographie échangeuse d'anions, une résine chargée positivement est utilisée comme phase stationnaire. Ces résines chargées positivement sont généralement constituées d'un polymère réticulé ou gel, sur lequel des groupements chargés positivement sont greffés. Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, une colonne échangeuse d'anions faible de type aminopropyl est utilisée.
La demanderesse a plus particulièrement mis en évidence que le point isoélectrique substantiellement homogène de la composition de facteur VII selon l'invention résulte de la combinaison des propriétés de glycosylation et de γ-carboxylation des molécules de F VII qui la composent.
Les molécules de facteur VII qui forment la composition selon l'invention comportent, similairement au facteur VII plasmatique humain, deux sites de N-glycosylation, en positions 145 et 322, et 2 sites de O-glycosylation, en positions 52 et 60. Chacun de ces sites est susceptible de recevoir des « glycanes » ou « chaînes de sucres » ou « chaînes oligosaccharidiques ». Les chaînes oligosaccharidiques N-glycosylées et/ou O-glycosylées portées par chaque molécule de Facteur VII de la composition sont susceptibles de différer d'une molécule à une autre. Toutefois, il est possible de mesurer la distribution de chaque motif dans la composition de facteur VII selon l'invention en employant des techniques connues de l'homme du métier.
Dans le cas de la composition de facteur VII selon l'invention, il apparaît que parmi toutes les formes N-glycanniques du facteur VII de la composition, au moins 60% des formes N- glycanniques , de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%, de préférence au moins 75%, de préférence au moins 80%, de préférence au moins 85%, de préférence au moins 90%, de préférence au moins 95%, sont monochargées. Dans un mode de réalisation préféré, les molécules de facteur VII présentant des formes N-glycanniques monochargées représentent entre 60% et 95% des molécules de facteur VII de la composition, de préférence entre 65% et 90% des molécules de facteur VII de la composition, de préférence entre 70% et 85% des molécules de facteur VII de la composition, de préférence entre 70% et 80% des molécules de facteur VII de la composition, de préférence entre 74% et 77% des molécules de facteur VII de la composition. Dans le cas de la composition de facteur VII selon l'invention, il apparaît que parmi toutes les formes N-glycanniques du facteur VII de la composition, entre 3% et 10%, de préférence entre 3% et 7% des formes N-glycanniques sont neutres.
Dans le cas de la composition de facteur VII selon l'invention, il apparaît que parmi toutes les formes N-glycanniques du facteur VII de la composition, entre 15% et 25%, de préférence entre 18% et 22% des formes N-glycanniques sont bichargées.
Dans le cas de la composition de facteur VII selon l'invention, il apparaît que parmi toutes les formes N-glycanniques du facteur VII de la composition, moins de 5%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1% des formes N-glycanniques sont trichargées.
Dans le cas de la composition de facteur VII selon l'invention, il apparaît que parmi toutes les formes N-glycanniques du facteur VII de la composition, moins de 5%, de préférence moins de 2%, de préférence moins de 1% des formes N-glycanniques sont tétrachargées. Aux fins de l'invention, il est entendu que les pourcentages cités ci-dessus ne tiennent donc pas compte des formes glycanniques impliquées dans la O-glycosylation. Par ailleurs, les molécules de facteur VII formant la composition de l'invention comprennent uniquement des acides sialiques liés par des liaisons de type a2-6. La Demanderesse a également constaté que la teneur en fucose du facteur VII n'avait aucun effet sur le point isoélectrique de la composition de facteur VII. Dans le cas de la composition de facteur VII selon l'invention, il apparaît qu'au moins
60%, de préférence au moins 65%, de préférence au moins 70%> des formes N- glycanniques des facteurs VII de la composition sont complexes monosialylées.
Les formes N-glycanniques complexes sont des formes bien connues de l'homme du métier (voir en particulier, Kornfeld R et al, Annual Review of Biochemistry. 1985;54:631-64. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides).
Dans un mode de réalisation particulier, au moins 10%>, de préférence au moins 15%, de préférence au moins 20%>, de préférence au moins 25% des formes N-glycanniques des facteurs VII de la composition sont high Mannose/ hybride. Par « γ-carboxylation », il est entendu le produit d'une réaction biochimique visant à transformer une pluralité de résidus d'acides glutamiques présents dans la séquence peptidique du facteur VII en résidus d'acide carboxy-glutamique ou " GLA ".
Avantageusement, les molécules de facteur VII qui forment la composition selon l'invention présentent, pour au moins 80%> d'entre elles, une γ-carboxylation sur neuf résidus d'acide glutamique. Dans un autre mode de réalisation, au moins 85% desdites molécules présentent une γ-carboxylation sur neuf résidus d'acide glutamique. Dans un autre mode de réalisation, entre 85% et 100%, de préférence entre 90%> et 100%, de préférence entre 95% et 100% desdites molécules présentent une γ-carboxylation sur neuf résidus d'acide glutamique. Avantageusement, le taux de γ-carboxylation sur le résidu d'acide glutamique 35 (Glu 35) des molécules de facteur VII de la composition est inférieur à 20%. Dans un autre mode de réalisation, le taux de γ-carboxylation du résidu Glu35 est inférieur à 15%, de préférence inférieur à 10%>, de préférence inférieur à 5%. La demanderesse a découvert de manière surprenante que c'est la combinaison spécifique du taux des formes N-glycanniques monochargées et du taux de γ-carboxylation qui est responsable de l'homogénéité substantielle des points isoélectriques des molécules de facteur VII formant la composition selon l'invention.
La composition de FVII selon l'invention peut avantageusement être formulée sans provoquer la précipitation des molécules de FVII qui la composent. En effet, il est connu qu'au point isoélectrique d'une molécule, celle-ci s'agrège et précipite. Les molécules de facteur VII qui forment la composition selon l'invention ont un point isoélectrique compris entre 6,6 et 7,0. Il en résulte une meilleure stabilité de la composition de facteur VII selon l'invention, notamment lorsque celle-ci est formulée à un pH inférieur au point isoélectrique, et en particulier à pH 6. L'amélioration de la stabilité de la composition de facteur VII selon l'invention permet d'éviter les interactions électrostatiques responsables des phénomènes de précipitation et d'agrégation de type soluble et insoluble, ainsi que d'éviter la perte de matières premières actives et donc une baisse de rendement aboutissant à une perte de quantité en principe actif et donc potentiellement à une perte d'activité.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé de purification du facteur VII activé selon l'invention.
Le lait de lapines transgéniques est obtenu à partir de la lignée de lapines transgéniques R69. Le lait de lapines transgéniques congelé est décongelé et concentré sous forme de pool de lait de lapines transgéniques.
Le pool de lait de lapines transgéniques ainsi obtenu est ensuite soumis à une étape de clarification utilisant un filtre en profondeur ayant une porosité de 0,2μιη, afin d'éliminer les lipides et les composés insolubles. Le lait ainsi clarifié est ensuite soumis à une étape d'inactivation virale par traitement par un solvant de type détergent, par exemple Polysorbate 80 ou Tri-n-Butyl Phosphate à 25°C ± 2°C pendant au moins deux heures. Un tel traitement permet notamment d'inactiver efficacement les virus et en particulier, les virus de type virus non-enveloppés. Le lait clarifié et viralement inactivé est ensuite soumis à une étape de chromatographie d'affinité utilisant un ligand d'affinité spécifique du facteur Vil/facteur Vlla. L'éluat de facteur VII obtenu à l'issue de cette étape de chromatographie est ensuite soumis à une étape d'ultrafîltration et de formulation, permettant ainsi d'obtenir un concentré de facteur VII intermédiaire ayant une pureté de 95%. Le concentré de facteur VII intermédiaire est ensuite soumis à une étape de fïltration utilisant un filtre ayant une porosité de 0,2μιη à 0,2μιη suivi d'une étape de nano fïltration sur des filtres ayant une porosité de 20nm puis 15nm. Le produit ainsi obtenu et contenant le facteur VII est ensuite soumis à une étape de chromatographie de type gel Q Sepharose XL puis à une étape de chromatographie de type CHT-I suivie d'une chromatographie de type SEC Superdex 200. Le concentré de facteur VII ainsi obtenu est ensuite soumis à une étape de stabilisation puis de fïltration sur filtre ayant une porosité de 0,2μιη.
Le procédé ainsi décrit permet d'obtenir un concentré de facteur VII ayant une pureté environ 99,9995%.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé de purification et d'extraction du facteur VII est celui décrit dans la demande EPI 2305882.
Un autre objet de la présente invention concerne un procédé de formulation d'une composition de facteur VII activé selon l'invention.
Avantageusement, le procédé de formulation utilisé est celui décrit dans la demande WO2010/149907.
Ce procédé comprend notamment le mélange de la composition de facteur VII activé selon l'invention avec une solution tampon, l'ajustement du pH si nécessaire, la fïltration et la dessication si nécessaire pour obtenir la forme solide.
Dans un mode de réalisation préféré, l'étape de mélange de la composition de facteur VII activé avec une solution tampon est mise en œuvre sur une chromatographie de type fïltration sur gel. Le terme " solution tampon " inclut au moins un acide aminé hydrophile ou portant une chaîne latérale chargée positivement, et un sel de métal alcalin, un sel de métal alcalino- terreux, ou un sel d'un métal de transition. On peut notamment citer le citrate trisodique, le chlorure de calcium, ou le chlorure de zinc. De manière préférée le sel utilisé est préférentiellement du citrate de sodium ou du chlorure de calcium. Avantageusement, la solution tampon contient également au moins un acide aminé hydrophobe.
Avantageusement, la solution tampon comprend un ou plusieurs des constituants choisis - un sel, de préférence un sel de citrate, de préférence du citrate trisodique ;
- un acide aminé ou un sel d'acide aminé hydrophile, de préférence un sel d'acide aminé hydrophile, de préférence le chlorhydrate d'arginine et/ou chlorhydrate de lysine ;
- un acide aminé ou un sel d'acide aminé hydrophobe, de préférence un acide aminé hydrophobe, de préférence l'isoleucine et/ou la glycine.
Enfin, la composition de l'invention peut comprendre un ou plusieurs détergents de type non ionique tels que les polysorbates, poloxamères, polyoxyéthylène alkyl éthers, un bloc co-polymères d'éthylène/polypropylène et polyéthylèneglycol. Avantageusement, les détergents préférés sont le polysorbate 80 et le polysorbate 20.
Avantageusement, la composition de facteur VII obtenue à l'issue de l'étape de mélange avec la solution tampon comprend :
- le facteur VII selon l'invention, de préférence sous forme activée ;
- de 10 à 40 g/1 d'arginine, éventuellement sous forme de chlorhydrate ;
- de 4,2 à 6,6 g/1 d'isoleucine ;
- de 0,6 à 1,8 g/1 de lysine ;
- de 0,6 à 1,8 g/1 de glycine ;
- de 1 à 2 g/1 de citrate trisodique dihydraté ou de 0 à 0,2 g/L de chlorure de calcium dihydraté; et le cas échéant de 0 à 0,5 g/1 de polysorbate 80.
Selon un exemple particulier, la composition de facteur obtenue à l'issue de l'étape de mélange avec la solution tampon comprend du facteur VII (de préférence sous forme de facteur Vlla) à 0,2 à 2g/l, du chlorhydrate d'arginine à 24 g/1, de l'isoleucine à 6g/l, du citrate trisodique dihydraté à 1,5 g/1, de la glycine à l,2g/l, du chlorhydrate de lysine à l,2g/l. et /ou du polysorbate 80 à 0,07g/l.
Selon un exemple particulier, la composition de facteur obtenue à l'issue de l'étape de mélange avec la solution tampon comprend du facteur VII (de préférence sous forme de facteur Vlla) à 0,2 à 2g/l, du chlorhydrate d'arginine à 24 g/1, de l'isoleucine à 6g/l, - du citrate trisodique dihydraté à 1,5 g/1, de la glycine à l,2g/l, du chlorhydrate de lysine à l,2g/l. et /ou du polysorbate 80 à 0,09g/l. Selon un autre exemple particulier, la composition de facteur VII obtenue à l'issue de l'étape de mélange avec la solution tampon comprend facteur VII (de préférence sous forme de facteur Vlla) à 0,2 à 2g/l, du chlorhydrate d'arginine à 34 g/1, du chlorure de calcium dihydraté à 0,15 g/1, de l'isoleucine à 6g/l.
De préférence, la composition de facteur VII selon l'invention est dépourvue de tout sucre, de polyol ou de méthionine. Les sucres à éviter incluent notamment, en plus du saccharose, les di- et tri-saccharides et les polysaccharides, tels que le dextrose, le lactose, le maltose, le trehalose, les cyclodextrines, les maltodextrines et les dextrans. Les polyols à éviter incluent notamment, en plus du mannitol, le sorbitol et le xylitol.
De préférence encore, la composition est dépourvue de glycylglycine. De préférence encore, la composition est dépourvue de glycylglycine.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition de l'invention est en outre dépourvue de tout agent antioxydant. Les antioxydants incluent par exemple un ou plusieurs des composés suivants : homocystéine, cystéine, cystathionine, méthionine, gluthation.
Le pH de la solution avant dessiccation est de préférence compris entre 4,0 et 9,0, plus particulièrement dans les domaines 4,0 et 8,0 ; 4,0 et 7,5 ; 4,5 et 7,5 ; 5,0 et 7,5 ; 5,5 et 7,0 ; 6,0 et 7,5 ; 6,5 et 7,5.
La dessiccation est un procédé d'élimination de l'eau à un stade poussé. Il s'agit d'une déshydratation visant à éliminer autant d'eau que possible. Ce phénomène peut être naturel ou forcé. Cette dessiccation peut être réalisée à l'aide des techniques de lyophilisation, d'atomisation et de cryoatomisation. Le mode préféré d'obtention de la forme solide de la composition à usage pharmaceutique selon l'invention est la lyophilisation. Les méthodes de lyophilisation sont bien connues de l'homme du métier, voir par exemple [Wang et al, Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals, International Journal of Pharmaceutics, Vol 203, p 1-60, 2000].
D'autres procédés appropriés pour réduire le degré d'humidité ou la teneur en eau de la composition sont envisageables. De préférence le degré d'humidité est inférieur ou égal à 3% en poids, de préférence inférieur ou égal à 2,5%, de préférence inférieur ou égal à 2%, de préférence inférieur ou égal à 1,5%. De manière préférée, le procédé de formulation comprend en outre une étape d'élimination ou d'inactivation des agents infectieux, par exemple par chauffage à sec du lyophilisât. De manière préférée, le procédé de formulation comprend en outre une étape de filtration de la composition de facteur VII et/ou une étape de lyophilisation de la composition de facteur VII formulée.
La composition de facteur VII selon l'invention est particulièrement avantageuse lorsqu'elle est formulée selon le procédé décrit ci-dessus. En effet, le procédé de formulation selon l'invention appliqué à la composition de facteur VII selon l'invention permet d'améliorer sa stabilité.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de la composition de facteur VII de l'invention comme médicament, pour le traitement d'épisodes hémorragiques.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation de la composition de facteur VII selon l'invention pour la prévention des hémorragies survenant lors d'interventions chirurgicales ou de procédures invasives.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique comprenant la composition de facteur VII selon l'invention et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptable. L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique ou tamponnée, ainsi que toute suspension, gel ou poudre, compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants et conservateurs. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs.
Par ailleurs, les compositions peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. L'administration peut être réalisée par toute voie classique pour ce type d'approche thérapeutique, comme notamment par voie systémique, en particulier par injection intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire ou intra-artérielle. On peut citer par exemple l'injection intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant la tumeur. Les doses peuvent varier en fonction du nombre d'administrations, de l'association à d'autres principes actifs, du stade d'évolution de la pathologie, etc.
Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux exemples et au mode de réalisation décrits et représentés, mais elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art.
EXEMPLES
Exemple 1 : Production de lapines transgéniques produisant une protéine de FVII humain dans leur lait.
On a préparé un vecteur d'expression composé d'une séquence insulatrice béta- globine de poulet, d'une région promotrice béta-caséine de chèvre, d'une séquence d'ADNc optimisée pour l'expression en cellules de mammifère codant pour le FVII humain et d'une région non traduite de la béta-caséine en 3', dans un squelette de SuperCos. L'assemblage en figure 6 représente le vecteur de construction.
Le transgène a été préparé à partir de la digestion du vecteur de construction avec l'endonucléase de restriction Notl pour libérer le squelette SuperCos et linéariser le vecteur d'expression. Les fragments résultants ont été séparés par électrophorèse sur gel, purifiés à partir du gel puis utilisés pour la micro-injection.
Pour produire des lapins transgéniques, la micro -injection du transgène dans des pronucléus mâles d'embryons fertilisés recueillis de lapins WT a été réalisée. Après une période de culture in vitro de quelques heures, les pronucléus mâles d'embryons microinjectés ont été transférés dans l'oviducte de femelles non-transgéniques hormonalement préparées. Après gestation, des descendants sont obtenus. Une analyse génétique permet d'évaluer la présence du transgène du FVII humain par analyse PCR en utilisant des séquences d'amorces spécifiques du FVII humain.
La présence du transgène et son intégrité a été révélée par la technique de Southern Blot à partir de 1ADN extrait des lapereaux transgéniques obtenus.
Une analyse phénotypique permet d'évaluer la concentration de FVII humain exprimé dans le lait des lapines transgéniques. Cette mesure est réalisée par méthode immunoenzymatique (ELISA) avec des réactifs commmerciaux (Diagnostica Stago). Brièvement, le facteur VII à doser est capté par un anticorps anti-facteur VII humain immobilisé sur une phase solide. Le Facteur VII fixé est ensuite reconnu par un immuno- conjugué à la peroxydase. Le taux de peroxydase liée est mesuré par son activité sur le substrat ortho-phénylènediamine en présence d'eau oxygénée. L'intensité de la coloration, après arrêt de la réaction par un acide fort, est fonction de la quantité de facteur VII présente initialement dans l'échantillon. Exemple 2 : Purification et extraction du facteur VII obtenu
Le procédé de purification et d'extraction du facteur VII mis en œuvre dans cet exemple est décrit ci-après.
Le lait de lapines transgéniques est obtenu à partir de la lignée de lapines transgéniques R69. Le lait de lapines transgéniques congelé est décongelé et concentré sous forme de pool de lait de lapines transgéniques.
Le pool de lait de lapines transgéniques ainsi obtenu est ensuite soumis à une étape de clarification utilisant un filtre en profondeur ayant une porosité de 0,2μιη, afin d'éliminer les lipides et les composés insolubles. Le lait ainsi clarifié est ensuite soumis à une étape d'inactivation virale par traitement par un solvant de type détergent, par exemple Polysorbate 80 ou Tri-n-Butyl Phosphate à 25°C ± 2°C pendant au moins deux heures. Un tel traitement permet notamment d'inactiver efficacement les virus et en particulier, les virus de type virus non-en veloppés. Le lait clarifié et viralement inactivé est ensuite soumis à une étape de chromatographie d'affinité utilisant un ligand d'affinité spécifique du facteur Vil/facteur Vlla. L'éluat de facteur VII obtenu à l'issue de cette étape de chromatographie est ensuite soumis à une étape d'ultrafïltration et de formulation, permettant ainsi d'obtenir un concentré de facteur VII intermédiaire ayant une pureté de 95%.
Le concentré de facteur VII intermédiaire est ensuite soumis à une étape de fïltration utilisant un filtre ayant une porosité de 0,2μιη à 0,2μιη suivi d'une étape de nano fïltration sur des filtres ayant une porosité de 20nm puis 15nm. Le produit ainsi obtenu et contenant le facteur VII est ensuite soumis à une étape de chromatographie de type gel Q Sepharose XL puis à une étape de chromatographie de type CHT-I suivie d'une chromatographie de type SEC Superdex 200. Le concentré de facteur VII ainsi obtenu est ensuite soumis à une étape de stabilisation puis de fïltration sur filtre ayant une porosité de 0,2μιη. Le procédé ainsi décrit permet d'obtenir un concentré de facteur VII ayant une pureté environ 99,9995%.
Le procédé de purification et d'extraction du facteur VII est décrit plus en détails dans la demande EP12305882. Dans les exemples figurant dans la présente demande, on appelle « FVII-rec », le facteur VII activé recombinant disponible sur le marché (Novoseven®), produit par génie génétique à partir de cellules rénales BHK de hamsters nouveau-nés. Exemple 3 : Etude du profilage de charge des N-glycannes
AJ L'identification et la quantification des oligosaccharides N-liés par chromatoraphie en phase liquide à haute performance à polarité de phase normale en mode HILIC couplée à une détection fluorimétrique (HILIC-HPLC/FD), dite méthode « HILIC »
La méthode de chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC ou Hydrophilic Interaction Chromatography) est une variante de la chromatographie en phase normal (NP) et permet de séparer efficacement les espèces polaires en évitant les désavantages liés à l'utilisation de solvants non miscibles dans l'eau. La phase stationnaire est un matériau polaire en général à base de silice ou de supports polymériques greffé par un groupement fonctionnel comme un groupe cyano, amino, diol, amide etc et la phase mobile est organique et contient de l'eau comme éluant fort.
Le facteur VII est tout d'abord soumis à une digestion enzymatique à la PNGase F afin de libérer spécifiquement les dérivés N-glycanniques.
Ceux-ci sont isolés par extraction sur phase solide (SPE) puis marqués à l'aide d'un fluorophore : le 2-aminobenzamide (2-AB) selon Bigge et al (Bigge, J.C., et al, Non- selective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-aminobenzamide and anthranilic acid, Anal. Biochem., 230, 229-238 (1995)). L'analyse des dérivés N- glycanniques est enfin réalisée par HILIC-HPLC/FD selon Guile et al (Guile, G.R., et al, A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatographie method for separating glycans mixtures and analyzing oligosaccharide profiles, Anal. Biochem., 240, 210-226 (1996)). La détection est assurée par fluorescence aux longueurs d'ondes λ excitation 330 nm et λ émission 420 nm.
Les résultats obtenus pour le facteur VII de l'invention ainsi que pour le FVII-rec sont présentés dans les tableaux ci-dessous. Tableau 1 : Quantification des formes N-glycanniques neutres, monochargées et bichargées du facteur VII de l'invention obtenue par la méthode HILIC
Figure imgf000025_0001
Les résultats obtenus par la méthode HILIC montrent que le facteur VII de l'invention possède un taux de formes N-glycanniques neutres comprises entre 3,6% et 4,3 %, de formes N-glycanniques monochargées comprises entre 74.6% et 75.5 % et de formes N- glycanniques bichargées comprises entre 20,6%> et 21,2%. Tableau 2 : Quantification des formes N-glycanniques neutres, monochargées et bichargées, trichargées, tétrachargées du facteur VII-rec obtenue par la méthode HILIC
Figure imgf000025_0002
(*Klausen et al., Analysis of the site-specifîc asparagine-linked glycosylation of recombinant human coagulation factor Vlla by glycosidase digestions, liquid chromatography, and mass spectrometry, Mol Biotechnol. 1998 June;9(3): 195-204. ).
Les résultats obtenus par la méthode HILIC montrent que les formes N-glycanniques neutres du FVII-rec représentent 11,3 % des formes N-glycanniques du FVII-rec, que les formes N-glycanniques monochargées représentent 25.1% des formes N-glycanniques du FVII-rec, et que les formes N-glycanniques bichargées représentent 55,1% des formes N- glycanniques du FVII-rec. De plus le facteur Vll-rec possède une quantité non négligeable de formes trichargées et tétrachargées.
Les résultats ainsi obtenus par la méthode HILIC sont donc conformes à ceux présentés dans la publication de Klausen et al.
B/ Identification et quantification des oligosaccharides N-liés par la méthode AEX/UPLC/FD
La séparation des N-glycannes en fonction de leur charge est effectuée par profïlage AEX- UPLC/FD des N-glycannes dérivés à la 2-AB. Le mode opératoire de préparation des N- glycannes dérivés à la 2-AB est identique à celui décrit précédemment pour l'analyse des N-glycannes par HILIC-HPLC/FD.
Le profïlage de charge des N-glycannes de F VII par AEX-UPLC/FD a été réalisé à l'aide d'une colonne d'échange d'anions faible de type aminopropyl. Les glycannes sont séparés en fonction de leur charge en appliquant un gradient croissant de formiate d'ammonium. La détection des dérivés est effectuée aux longueurs d'ondes suivantes : longueur d'ondes d'excitation : 330 nm et longueur d'ondes d'émission : 420 nm. Le profil obtenu par AEX- UPLC/FD pour le F VII (lot 1) est présenté en Figure 3.
Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 : Quantification des formes N-glycanniques neutres, monochargées et bichargées obtenues pour le facteur VII de l'invention par la méthode AEX-UPLC/FD
FVII (loti) FVII (lot2) FVII (lot3)
Formes N- Temps de exprimé en exprimé en exprimé en glycanniques s rétention % % %
Neutres 2-6 min 4,0 4,2 3,4
Monochargées 11-14 min 76,5 76,9 77,2
Bichargées 17-20 min 19,6 18,9 19,4 On observe que le pourcentage des formes N-glycanniques monochargées des trois lots de FVII selon l'invention est compris entre 76 et 78%.
Ces deux méthodes orthogonales (HILIC et AEX) montrent qu'au moins 74,6% des formes N-glycanniques de facteur VII de l'invention sont monochargées, indépendamment de la méthode de mesure utilisée.
Cl Identification, Quantification et Comparaison des oligosaccharides N-liés par la méthode AEX/UPLC/FD pour le facteur VII de l'invention, le facteur VII issu de la demande WO2007/138199 et du Facteur VII-rec.
Le mode opératoire utilisé est le même que celui décrit à l'Exemple 3. Le profilage de charge des N-glycannes de FVII par AEX-UPLC/FD a été réalisé sur le facteur VII de l'invention, le facteur VII issu de la demande WO2007/138199 et du Facteur VII-rec. Les profils glycanniques sont présentés en Figure 5. La Figure 5 A présente le profil glycannique du FVII issu de la demande WO2007/138199, la Figure 5B présente le profil glycannique du FVII de l'invention et la Figure 5C présente le profil glycannique du F VII- rec.
Tableau 4 : Quantification des formes N-glycanniques neutres, monochargées et bichargées obtenues par la méthode AEX-UPLC/FD
FVII de FVII (issu de la Facteur VII-rec l'invention demande
(Lot 4) WO2007/138199)
Formes N- Temps de exprimé en % exprimé en % exprimé en % glycanniques s rétention
Neutres (Z0) 3-5 min 7,0 3,0 7,0
Monochargées (Zi) 5-7 min 73,0 51,0 29,0
Bichargées (Z2) 7-10 min 20 39,0 54,0
Trichargées (Z3) 10-12 min 0,0 7,0 9,0
Tétrachargées (Z4) 12-14 min 0,0 0,0 1,0 En ce qui concerne le FVII issu de la demande WO2007/138199, les résultats obtenus par la méthode AEX/UPLC/FD montrent :
- que les formes N-glycanniques neutres du FVII issu de la demande WO2007/138199 représentent 3 % des formes N-glycanniques de ce FVII,
- que les formes N-glycanniques monochargées représentent 51% des formes N- glycanniques de ce FVII, et
- que les formes N-glycanniques bichargées représentent 39% des formes N- glycanniques de ce FVII.
- Une quantité non négligeable de formes trichargées.
Les résultats obtenus par la méthode AEX/UPLC/FD montrent que les formes N- glycanniques neutres du FVII-rec représentent 7,0 %> des formes N-glycanniques du FVII- rec, que les formes N-glycanniques monochargées représentent 29,0 %> des formes N- glycanniques du FVII-rec, et que les formes N-glycanniques bichargées représentent 54,0 %> des formes N-glycanniques du FVII-rec. De plus le facteur VII-rec possède une quantité non négligeable de formes trichargées et tétrachargées.
Exemple 4 : Identification, Quantification et Comparaison des formes N-glycanniques du facteur VII selon l'invention et du facteur VII issu de la demande WO2007/138199 par la méthode HILIC
AI Quantification des formes N-glycanniques du facteur VII selon l'invention réalisée à l'aide de la méthode HILIC
La quantification des formes N-glycanniques du facteur VII selon l'invention est réalisée à l'aide de la méthode HILIC, comme décrite dans l'exemple 3.
Les résultats ainsi obtenus sont présentés dans le tableau 5.
Tableau 5 : Quantification des N-glycannes obtenues pour la composition de facteur VII de l'invention
Formes N-glycanniques FVII FVII FVII Charge
(exprimées en %) (lot 1) (lot 2) (lot 3)
Al G0 0,5 0,8 0,5 0 Man5 1,3 1,5 1,4 0
Man4-A1G1 0,2 0,4 0,4 0
A2G2 1,4 1,1 1,2 0
A1G1S1 1,1 1,2 1,2 1
A2G2F 0,5 0,4 0,4 0
A2G1S1 0,5 0,7 0,3 1
Man4-A1G1S1 2,8 2,9 4,2 1
Man6PGlcNAc 9,8 9,1 9,9 1
A2G2S1 43,3 41,8 41,1 1
A2G2S1-S03H 0,9 0,9 0,9
Man5-A1G1S1 0,2 0,4 0,2 1
A2G2FS1 8,8 9,3 9,9 1
Man7PGlcNAc 2,8 3,2 3 1
A2G2FS1* 2 2,3 1,9 1
Man7PGlcNAc* 1,7 1,6 1,6 1
A2G2F2S1 2,2 2,2 2 1
A2G2S2 9,1 9,7 8,8 2
Man7(PGlcNAc)2 3,4 2,8 3,2 2
A2G2FS2 2,6 3,1 2,8 2
Man6PGlcNAc-AlGlSl 5 4,7 4,9 2
High-Mannose/Hybride
neutre 1,5 1,9 1,8 0
High-Mannose/Hybride
monochargé 17,3 17,2 18,9 1
High-Mannose/Hybride
bichargé 8,4 7,5 8,1 2
Total High- Mannose/Hybride 27,2 26,6 28,8 -
Formes N-glycanniques
monochargées 75,2 74,7 75,3 1
Complexe monosialylé 58,8 58,4 57,3 1
Complexe bisialylé 11,7 12,8 11,6 2
* Formes isomériques
L'analyse quantitative des différentes structures glycanniques (Tableau 5) montre que les formes N-glycanniques des facteurs VII de la composition sont majoritairement complexes monosialylées (à hauteur de 60% environ). Les formes N-glycanniques de type High Mannose/ Hybride sont présentes à au moins 25%.
B/ Quantification des formes N-glycanniques du facteur VII issu de la demande WO2007/138199 réalisée à l'aide de la méthode HILIC
La quantification des formes N-glycanniques du facteur VII issu de la demande WO2007/138199 est réalisée à l'aide de la méthode HILIC, comme décrite dans l'exemple 3. Les résultats ainsi obtenus sont présentés dans le tableau 6.
Tableau 6: Quantification des N-glycannes obtenues pour la composition de facteur VII issu de la demande WO2007/138199
Formes N-glycanniques FVII issu de la demande de
Charge
(exprimées en %) brevet WO2007/138199
Man5 0,7 0
A2G2 0,3 0
A1G1 S1 0,6 1
Man5-A1G1 0,3 0
A2G2F 0,3 0
A2G1 S1+A1G1FS1 0,4 1
Man4-A1G1 S1 0,8 1
ManôPGlcNAc 6,2 1
ManôPGlcNAc* 1,4 1
A2G2S1 18,2 1
A2G2FS1 9 1
Man7PGlcNAc 1,6 1
A2G2FS1 * 4 1
Man7PGlcNAc* 0,6 1
Monocharged HM/Hyb 0,3 1
A2G2F2S1 9,7 1
A2G2S2 10,9 2
A3G3S1 0,7 1
Man7(PGlcNAc)2 2 2
A2G2FS2 15,9 2
A3G3F0-1 S1 0,3 1
A3G3F0-1 S 1 * 0,9 1
A3G3F1-2S1 0,6 1
Man6PGlcNAc-Al Sl 4,3 2
A3G3S2 1,8 2 A3G3S2* 0,5 2
A3G3FS2 1 2
A3G3FS2* 1,1 2
A3G3F0-2S2 0,7 2
A3G3F0-2S2-3 0,7 3
A3G3S3 2,8 3
A3G3F0-2S3 1 3
A3G3F0-2S3* 0,3 3
High-Mannose/Hybride neutre 1 0
High-Mannose/Hybride
monochargé 10,9 1
High-Mannose/Hybride
bichargé 6,3 2
Total High-Mannose/Hybride 18,2 -
Formes N-glycanniques
monochargées 55,3 1
Complexe monosialylé 44,4 1
Complexe bisialylé 31,9 2
Neutre (Z0) 2 0
Monochargé (ZI) 55 1
Bichargé (Z2) 38 2
Trichargé (Z3) 5 3
* Formes isomériques
L'analyse quantitative des différentes structures glycanniques (Tableau 6) montre que les formes N-glycanniques des facteurs VII issu de la demande WO2007/138199 sont majoritairement de type complexes monosialylées (à hauteur de 45% environ). Les formes N-glycanniques de type High Mannose/hybride sont présentes à environ 18%.
Exemple 5 : Quantification des γ-carboxylations
Le facteur Vlla humain présente d'autres modifications post-traductionnelles, telles que la γ-carboxylation du domaine GLA N-terminal. Pour le facteur VII plasmatique, les dix premiers acides glutamiques sont tous γ-carboxylés (Jurlander B. et al, Recombinant activated factor VII (rFVIIa): characterization, manufacturing, and clinical development. Semin. Thromb. Hemost. 27.4 (2001): 373-84., alors que la dixième acide glutamique du NovoSeven® est seulement partiellement γ-carboxylé (Thim L. et al, Amino acid séquence and posttranslational modifications of human factor Vlla from plasma and transfected baby hamster kidney cells. Biochemistry. 27.20 (1988): 7785-93.
L'étude des γ-carboxylations du facteur VII de l'invention a été réalisée en utilisant la méthode de chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse décrite ci-dessous (LC-MS).
Le facteur VII est préalablement réduit et alkylé puis soumis à une digestion enzymatique au moyen d'une enzyme spécifique de type trypsine. Les peptides ainsi générés sont analysés par spectrométrie de masse électrospray après séparation par chromatographie liquide en phase inverse de type C18 (Yates, J.R., Ruse, CL, Nakorchevsky, A., (2009) Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances, and applications. Annu Rev Biomed Eng. 11, 49-79.). Cette approche permet de mesurer la masse précise du peptide N-terminal γ-carboxylé du facteur VII et d'en déduire son niveau de γ-carboxylation.
La figure 2 montre le spectre de masse du peptide N-terminal [Alai-Arg36]. La masse moyenne mesurée est de 4768,0 Da, ce qui est en accord avec la masse théorique de 4768,0 Da (cystéines réduites et alkylées), ce qui correspond à 9 γ-carboxylations. Le facteur VII de la présente invention présente donc 9 γ-carboxylations. La figure 2 contient également le spectre de masse du peptide N-terminal [Alai-Lys32], qui est élué dans un temps de rétention proche. La masse moléculaire du peptide est également en accord avec la présence de 9 γ-carboxylations sur le peptide. Il peut donc être conclu que le facteur VII de l'invention possède 9 résidus glutamiques γ-carboxylés sur les dix sites potentiels, et que le résidu glutamique situé en position 35 par rapport à la séquence du facteur VII humain (Glu35) n'est pas γ-carboxylé. Par ailleurs, le peptide [Asp33-Gly47] a été isolé par cartographie peptidique. Ce peptide contient l'acide aminé GIU35 qui a été trouvé majoritairement sous sa forme non-carboxylée à une masse de 1786,9 Da. Une forme minoritaire de ce peptide a été découverte à une masse de 1830,9 Da, correspondant à un GIU35 modifié. Cette forme est estimée à moins de 5%, basée sur les signaux MS. Ce résultat confirme la présence de γ-carboxylations sur les neuf premiers acides glutamiques du facteur VII de l'invention alors que le dixième n'est majoritairement pas γ-carboxylé.
La répartition des différents isoformes du facteur VII de l'invention a également été étudiée par chromatographie échangeuse d'ion dont le protocole est décrit ci-dessous. La même étude a été réalisée sur le FVII-rec.
Brièvement, les isoformes du facteur VII sont séparées sur colonne échangeuse d'anions fort (SAX). Un échantillon de facteur VII est d'abord chargé sur une colonne (Mono Q 5/50 GL, GE Healthcare) préalablement équilibrée à pH 9 avec un tampon Tris 20 mM. L'échantillon est ensuite élué en appliquant un gradient croissant de tampon d'élution de type Tris 20mM/NaCl 1M à pH 9.
Tableau 7 : Quantification des isoformes du facteur VII de l'invention et du FVII-rec - Intégration des pics observés sur les chromatogrammes « IEX ».
Facteur VII de l'invention
Figure imgf000033_0001
FVII-rec
No. Temps de rétention Nom du pic Quantification des
(min) isoformes du FVII (en %)
1 26,58 FVII-rec 9GLA 76
2 28,23 FVII-rec 10GLA 24
Total 100 Légende : « FVII 9GLA » signifie facteur VII dont les isoformes majoritaires présentent une y-carboxylations sur 9 résidus d'acide glutamique, « F VII IOGLA » signifie facteur VII dont les isoformes majoritaires présentent une y-carboxylations sur 10 résidus d'acide glutamique.
Il résulte des résultats présentés dans le tableau 5, que les isoformes majoritaires du facteur VII de l'invention sont les formes présentant 9 γ-carboxylations (95%). Parmi les isoformes du FVII-rec, 76 % des isoformes présentent 9 γ-carboxylations et 24 % des iso formes présentent 10 γ-carboxylations.
Exemple 6 : Etude du point isoélectrique
La séparation des différentes isoformes du facteur VII selon leur point isoélectrique a été réalisée par focalisation isoélectrique « IEF ». La migration électrophorétique s'est effectuée sur gel Focusgel 3-10 (Serva).
La qualité des lots de facteur VII est évaluée par analyse des différentes iso formes du produit après migration sur gel de gradient de pH 3-10 en conditions natives (non réductrices et non dénaturantes), selon la procédure générale d'analyse par IEF sur système Multiphor (GE Healthcare).
L'analyse IEF s'effectue sur Focusgel 3-10 sans puits SERVA. La concentration est estimé par prise de DO 280 nm (ε = 1.36 g-1. L.cm-1) après dessalage du produit sur membrane d'ultracentrifugation (seuil de coupure : 10 kDa).
La migration a lieu selon les paramètres électriques suivants (mode gradient) :
Figure imgf000034_0001
Les protéines sont révélées par coloration au bleu de Coomassie CCB-G250. La détermination du pi des iso formes se fait après numérisation du gel et analyse par le logiciel Quantity One (Bio-Rad).
Les profils « IEF » du lot de facteur VII de l'invention et du FVII-rec sont présentés en Figure 4.
La détermination du pi des bandes est faite avec un standard dont les pi sont compris entre 5,20 et 8,15. Le point isoélectrique du facteur VII de l'invention est compris entre 6,1 et 7,3. Le profil des iso formes du facteur VII de l'invention inclut deux bandes majeures comprises entre 6,6 et 7,0 ainsi qu'une trace plus acide à pi 6,1 et une trace plus basique à pi 7,3. Les deux iso formes principals représentent environ 60% de la totalité des facteurs VII de la composition.
Le point isoélectrique du facteur VII-rec est compris entre 5,5 et 7,5. Le profil des isoformes du facteur VII-rec de l'invention inclut deux bandes majeures comprises entre 6,4 et 6,8 ainsi des traces plus acide comprises entre 5,5 et 6,4 et des traces plus basique entre 6,8 et 7,5. Les deux iso formes principales représentent environ 45% des facteurs VII de la composition du FVII-rec.
Il en résulte donc que point isoélectrique du facteur VII de l'invention est substantiellement plus homogène que celui observé pour le FVII-rec.
Exemple 7 : Activité du facteur VII de l'invention
Le dosage du F VII s'effectue par une méthode amidolytique (FVILam) qui mesure son activité biologique, c'est-à-dire la capacité du complexe facteur Vlla / facteur tissulaire à activer le facteur X en présence d'ions calcium et de phospholipides.
Cette méthode est un dosage chromogènique en cinétique en deux étapes: l'activation du FX, sous l'action du FVIIa, dans un mélange réactionnel contenant de la thromboplastine et du calcium; puis le clivage enzymatique d'un substrat chromogène spécifique par le FXa qui libère un chromophore quantifîable par spectrophotométrie.
La lecture en cinétique est effectuée à 405nm contre 1 filtre de référence à 490 nm.
Les résultats ainsi obtenus sont présentés dans le Tableau 8. Tableau 8 : Dosage de l'activité spécifique du facteur VII de l'invention
Figure imgf000036_0001
L'activité amidolytique du facteur VII de l'invention est comprise entre 3067 Ul/ml et 3377 Ul/ml.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition de facteur VII dans laquelle les molécules de facteur VII présentent un point isoélectrique substantiellement homogène.
2. Composition de facteur VII dans laquelle parmi toutes les formes N-glycanniques du facteur VII de la composition, au moins 60 % desdites formes N-glycanniques sont monochargées, et au moins 80% desdites molécules présentent une γ- carboxylation sur 9 résidus d'acide glutamique.
3. Composition selon la revendication 2 dans laquelle, au moins 65%, de préférence au moins 70%>, de préférence au moins 80%> des formes N-glycanniques du facteur VII de la composition sont monochargées.
4. Composition selon l'une des revendications 2 à 3, dans laquelle parmi toutes les molécules de facteur VII de la composition, au moins 85%, de préférence de 85% à 100%, de préférence de 90% à 100%, de préférence de 95% à 100% desdites molécules présentent une γ-carboxylation sur 9 résidus d'acide glutamique.
5. Composition selon la revendication 4, dans laquelle le taux de γ-carboxylation présent sur le résidu d'acide glutamique 35 (Glu35) est inférieur à 20%, de préférence inférieur à 15%, de préférence inférieur à 10%.
6. Composition de facteur VII selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle au moins 60% des formes N-glycanniques des facteurs VII de la composition sont complexes monosialylées.
7. Composition de facteur VII selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle au moins 10%, de préférence au moins 15%, de préférence au moins 20%, de préférence au moins 25% des formes N-glycanniques des facteurs VII de la composition sont high Mannose/ hybride.
8. Composition selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle au moins 90%, de préférence au moins 95% des molécules de facteur VII de la composition ont un point isoélectrique compris dans un écart d'unité de pH inférieur à 1,2.
9. Composition selon l'une des revendications 1 à 8, dans laquelle au moins 50%, de préférence au moins 55%, de préférence 60%> des molécules de facteur VII de la composition ont un point isoélectrique compris dans un écart d'unité de pH inférieur à 1 ; de préférence inférieur à 0,5, de préférence inférieur à 0,4.
10. Composition selon l'une des revendications 1 à 9, dans laquelle le facteur VII est recombinant ou transgénique.
11. Composition selon l'une des revendications 1 à 10, dans laquelle le facteur VII de la composition est produit par des lapines transgéniques.
12. Composition selon l'une des revendications 1 à 1 1, dans laquelle le facteur VII est un facteur VII activé.
13. Composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour une utilisation dans le traitement des épisodes hémorragiques.
14. Composition de facteur VII selon l'une quelconque des revendications 1 à 12 pour une utilisation dans la prévention des hémorragies survenant lors d'interventions chirurgicales ou de procédures invasives.
15. Composition de facteur VII selon l'une des revendications 1 à 14 susceptible d'être obtenue par un procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) l'insertion d'une séquence d'ADN comprenant un gène codant pour le facteur VII dans un embryon de mammifère non-humain, ledit gène étant sous le contrôle transcriptionnel du promoteur béta-caséine,
(b) le transfert d'embryons obtenus à l'étape a) dans l'oviducte d'une femelle de mammifère non-humain de manière à ce qu'il se développe en un mammifère adulte,
(c) l'induction de la lactation chez le mammifère adulte non-humain obtenu à l'étape b) de type femelle ou dans un descendant femelle de ce mammifère non- humain dans lequel le gène et le promoteur sont présents dans son génome,
(d) la collection du lait dudit mammifère non-humain, et
(e) la purification du facteur VII présent dans le lait collecté.
16. Procédé de formulation d'une composition de facteur VII activé selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, ledit procédé comprenant le mélange de la composition de facteur VII activé avec une solution tampon, l'ajustement du pH si nécessaire, la filtration puis la dessication si nécessaire pour obtenir la forme solide.
17. Procédé de formulation selon la revendication 16, dans lequel l'étape de mélange de la composition de facteur VII activé avec une solution tampon est mise en œuvre sur une chromatographie de type gel filtration.
18. Procédé de formulation selon l'une des revendications 16 à 17, dans lequel la solution tampon comprend un ou plusieurs des constituants choisis parmi :
- un sel, de préférence un sel de citrate, de préférence du citrate trisodique ;
- un acide aminé ou un sel d'acide aminé hydrophile, de préférence un sel d'acide aminé hydrophile, de préférence le chlorhydrate d'arginine et/ou chlorhydrate de lysine ;
- un acide aminé ou un sel d'acide aminé hydrophobe, de préférence un acide aminé hydrophobe, de préférence l'isoleucine et/ou la glycine.
19. Procédé de formulation selon l'une des revendications 16 à 18, ledit procédé comprenant en outre une étape de filtration de la composition de facteur VII formulée.
20. Procédé de formulation selon l'une des revendications 16 à 18, ledit procédé comprenant en outre une étape de lyophilisation de la composition de facteur VII formulée.
PCT/EP2014/062051 2013-06-11 2014-06-10 Facteur vii transgénique presentant une n-glycosylation spécifique et point isoelectrique substantiellement homogene Ceased WO2014198735A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/896,763 US10683492B2 (en) 2013-06-11 2014-06-10 Transgenic factor VII having a specific N-glycosylation and substantially homogenous isoelectric point
CA2915141A CA2915141C (fr) 2013-06-11 2014-06-10 Facteur vii transgenique presentant une n-glycosylation specifique et point isoelectrique substantiellement homogene
US16/868,803 US11254920B2 (en) 2013-06-11 2020-05-07 Factor VII composition having a substantially homogenous isoelectric point
US16/868,850 US20200362329A1 (en) 2013-06-11 2020-05-07 Factor VII Composition Having a Substantially Homogeneous Isoelectric Point

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1355403A FR3006591B1 (fr) 2013-06-11 2013-06-11 Composition de facteur vii presentant un point isoelectrique substantiellement homogene
FRFR13/55403 2013-06-11

Related Child Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US14/896,763 A-371-Of-International US10683492B2 (en) 2013-06-11 2014-06-10 Transgenic factor VII having a specific N-glycosylation and substantially homogenous isoelectric point
US16/868,850 Continuation US20200362329A1 (en) 2013-06-11 2020-05-07 Factor VII Composition Having a Substantially Homogeneous Isoelectric Point
US16/868,803 Division US11254920B2 (en) 2013-06-11 2020-05-07 Factor VII composition having a substantially homogenous isoelectric point

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014198735A1 true WO2014198735A1 (fr) 2014-12-18

Family

ID=49510238

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2014/062051 Ceased WO2014198735A1 (fr) 2013-06-11 2014-06-10 Facteur vii transgénique presentant une n-glycosylation spécifique et point isoelectrique substantiellement homogene

Country Status (6)

Country Link
US (3) US10683492B2 (fr)
AR (1) AR096579A1 (fr)
CA (1) CA2915141C (fr)
FR (1) FR3006591B1 (fr)
TW (1) TW201509954A (fr)
WO (1) WO2014198735A1 (fr)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3006591B1 (fr) * 2013-06-11 2016-05-06 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii presentant un point isoelectrique substantiellement homogene

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4784950A (en) 1985-04-17 1988-11-15 Zymogenetics, Inc. Expression of factor VII activity in mammalian cells
EP0527063A1 (fr) * 1991-06-12 1993-02-10 Institut National De La Recherche Agronomique Production d'une protéine d'intérêt dans le lait d'un mammifère transgènique
US5997864A (en) 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US6903069B2 (en) 2000-10-02 2005-06-07 Novo Nordisk Health Care A/S Factor VII glycoforms
US20060179500A1 (en) * 1998-06-19 2006-08-10 Gtc-Biotherapeutics, Inc. Methods and vectors for improving nucleic acid expression
WO2007138199A2 (fr) 2006-05-31 2007-12-06 Lfb Biotechnologies Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
WO2008099077A2 (fr) * 2006-12-29 2008-08-21 Lfb Biotechnologies Procédé d'extraction d'une protéine présente dans du lait
WO2010149907A1 (fr) 2009-06-26 2010-12-29 Lfb-Biotechnologies Composition de facteur vii
EP2687595A1 (fr) * 2012-07-19 2014-01-22 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Procédé de purification de facteur VII transgénique

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3006591B1 (fr) * 2013-06-11 2016-05-06 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii presentant un point isoelectrique substantiellement homogene

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4784950A (en) 1985-04-17 1988-11-15 Zymogenetics, Inc. Expression of factor VII activity in mammalian cells
EP0527063A1 (fr) * 1991-06-12 1993-02-10 Institut National De La Recherche Agronomique Production d'une protéine d'intérêt dans le lait d'un mammifère transgènique
EP0527063B1 (fr) 1991-06-12 2003-08-27 Institut National De La Recherche Agronomique Production d'une protéine d'intérêt dans le lait d'un mammifère transgènique
US5997864A (en) 1995-06-07 1999-12-07 Novo Nordisk A/S Modified factor VII
US20060179500A1 (en) * 1998-06-19 2006-08-10 Gtc-Biotherapeutics, Inc. Methods and vectors for improving nucleic acid expression
US6903069B2 (en) 2000-10-02 2005-06-07 Novo Nordisk Health Care A/S Factor VII glycoforms
WO2007138199A2 (fr) 2006-05-31 2007-12-06 Lfb Biotechnologies Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
FR2901707A1 (fr) * 2006-05-31 2007-12-07 Lab Francais Du Fractionnement Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
EP2037955A2 (fr) 2006-05-31 2009-03-25 LFB Biotechnologies Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
WO2008099077A2 (fr) * 2006-12-29 2008-08-21 Lfb Biotechnologies Procédé d'extraction d'une protéine présente dans du lait
WO2010149907A1 (fr) 2009-06-26 2010-12-29 Lfb-Biotechnologies Composition de facteur vii
EP2687595A1 (fr) * 2012-07-19 2014-01-22 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Procédé de purification de facteur VII transgénique

Non-Patent Citations (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANONYMOUS: "GTC BIOTHERAPEUTICS REPORTS THIRD QUARTER 2007 FINANCIAL RESULTS for rEVO Biologics, Inc. (GTCB)", 1 January 2007 (2007-01-01), pages 1 - 16, XP055131257, Retrieved from the Internet <URL:http://www.wikinvest.com/stock/GTC_Biotherapeutics_(GTCB)/Gtc_Biotherapeutics_Reports_2007_Financial_Results> [retrieved on 20140723] *
BIGGE, J.C. ET AL.: "Non-selective and efficient fluorescent labeling of glycans using 2-aminobenzamide and anthranilic acid", ANAL. BIOCHEM., vol. 230, 1995, pages 229 - 238
FENAILLE F. ET AL.: "Mass spectrometric characterization of N- and 0-glycans of plasma-derived coagulation factor VII", GLYCOCONJ. J., vol. 25.9, 2008, pages 827 - 42
G. CHEVREUX ET AL: "N-/O-glycosylation analysis of human FVIIa produced in the milk of transgenic rabbits", GLYCOBIOLOGY, vol. 23, no. 12, 2 October 2013 (2013-10-02), pages 1531 - 1546, XP055090715, ISSN: 0959-6658, DOI: 10.1093/glycob/cwt085 *
GRAHAM ET AL., J. GEN. VIROL., vol. 36, 1977, pages 59 - 72
GUILE, G.R. ET AL.: "A rapid and high-resolution high-performance liquid chromatographie method for separating glycans mixtures and analyzing oligosaccharide profiles", ANAL. BIOCHEM., vol. 240, 1996, pages 210 - 226
HERMENTIN ET AL., GLYCOBIOLOGY, vol. 6, no. 2, 1996
INTERNATIONAL JOURNAL OF PHARMACEUTICS, vol. 203, 2000, pages 1 - 60
JURLANDER B. ET AL.: "Recombinant activated factor VII (rFVIIa): characterization, manufacturing, and clinical development", SEMIN. THROMB. HEMOST., vol. 27.4, 2001, pages 373 - 84
KLAUSEN ET AL.: "Analysis of the site-specific asparagine-linked glycosylation of recombinant human coagulation factor VIIa by glycosidase digestions, liquid chromatography, and mass spectrometry", MOL BIOTECHNOL., vol. 9, no. 3, June 1998 (1998-06-01), pages 195 - 204
KORNFELD R ET AL., ANNUAL REVIEW OF BIOCHEMISTRY, vol. 54, 1985, pages 631 - 64
MAKSIMENKO O G ET AL: "Use of transgenic animals in biotechnology: prospects and problems.", ACTA NATURAE JAN 2013, vol. 5, no. 1, January 2013 (2013-01-01), pages 33 - 46, XP005513122, ISSN: 2075-8251 *
PERSSON ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 272, 1997, pages 19919 - 19924
PERSSON, FEBS LETTS, vol. 413, 1997, pages 359 - 363
THIM L. ET AL.: "Amino acid sequence and posttranslational modifications of human factor VIIa from plasma and transfected baby hamster kidney cells", BIOCHEMISTRY, vol. 27.20, 1988, pages 7785 - 93
URLAUB; CHASIN, PROC. NATL . ACAD. SCI . USA, vol. 77, 1980, pages 4216 - 4220
WAECHTER; BASERGA, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 79, 1982, pages 1106 - 1110
YANN ECHELARD ET AL: "Transgenic Technology: a Validated Approach for Large-Scale Manufacturing", IPT ONLINE, vol. 29, 11 June 2009 (2009-06-11), pages 50 - 54, XP055131254 *
YATES, J.R.; RUSE, C.I.; NAKORCHEVSKY, A.: "Proteomics by mass spectrometry: approaches, advances, and applications", ANNU REV BIOMED ENG., vol. 11, 2009, pages 49 - 79

Also Published As

Publication number Publication date
FR3006591A1 (fr) 2014-12-12
CA2915141A1 (fr) 2014-12-18
US11254920B2 (en) 2022-02-22
TW201509954A (zh) 2015-03-16
US10683492B2 (en) 2020-06-16
FR3006591B1 (fr) 2016-05-06
CA2915141C (fr) 2021-04-13
US20200270596A1 (en) 2020-08-27
US20200362329A1 (en) 2020-11-19
US20160152965A1 (en) 2016-06-02
AR096579A1 (es) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2037955B1 (fr) Composition de facteur vii recombinant ou transgenique, chaque molecule de facteur vii possedant deux sites de n-glycosylation a motifs glycanniques definis
EP2627665B1 (fr) Procédés et compositions pour traiter l&#39;hémophilie B
TWI595004B (zh) 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
RU2731507C1 (ru) Gla домены в качестве нацеливающих агентов
RU2563231C2 (ru) Химерные молекулы фактора vii
EP2049150A2 (fr) Composition de facteur vii recombinant
KR20110005862A (ko) 변형된 제ｉｘ인자 폴리펩티드 및 이의 용도
EA028865B1 (ru) Модифицированные полипептиды фактора х и их применение
EP3806891B1 (fr) Combinaison de facteur vii et d&#39;un anticorps bispécifique anti-facteurs ix et x
JP2011507919A (ja) 修飾第ｉｘ因子
US11254920B2 (en) Factor VII composition having a substantially homogenous isoelectric point
FR3069540B1 (fr) Proteine modifiee avec demi-vie amelioree
EP2162147A2 (fr) Facteur vii/viia humain modifie et composition pharmaceutique contenant celui-ci
HK1185623B (en) Methods and compositions for treating hemophilia b

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14729000

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14896763

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2915141

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 14729000

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1