WO2015003679A1 - Verfahren zur biosynthese von spezifisch isotopenmarkierten sekundärmetaboliten - Google Patents

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    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi

Definitions

  • Phytopathogenic fungi not only cause direct crop losses in agriculture, but also often contaminate agricultural products with mycotoxins. These biologically active substances, including acutely toxic, teratogenic and carcinogenic, pose a constant threat to the health of consumers and livestock. For their protection, the exact quantitative assessment of mycotoxins is therefore enormous
  • Reference substances are hereby used isotopically labeled secondary metabolites, which differ in the same chemical properties based on their altered mass of the target analytes. Reference substances are essential aids in the analysis of sample materials. Only through them, the identity and content of the proven substance can be detected.
  • isotope-labeled secondary metabolites are produced by the addition of labeled glucose or labeled nitrogen or sulfur salts to the culture medium (see patent WO 2006105563). In doing so may
  • the previously used method for total marking is very complicated and expensive.
  • a key cost factor is the isotope-labeled precursors, which must be fully labeled (eg, glucose 13 C6).
  • genetic engineering methods in the genome of bacterial or fungal secondary metabolite produce genes of the
  • auxotrophic Molecular structure of secondary metabolites are integrated. Due to this genetic modification, the organisms are no longer able to survive z.T. produce essential amino acids or their precursors, which is why they are referred to as auxotrophic. Either
  • auxotrophic mutants By adding these amino acids or donors in isotopically labeled form into the culture medium, the auxotrophic mutants exclusively form target molecules with completely labeled functional groups or atoms in the metabolism of the respective organisms.
  • the inventive method of directed incorporation of isotope-labeled functional groups of amino acids or complete amino acids or fragments thereof into secondary metabolites is characterized by a combination of molecular genetic and biotechnological methods.
  • the use of isotope-labeled substances is much more targeted than in the currently used method.
  • Through the use of specific intermediates or precursors are the metabolism physiological
  • the substances that can be produced with this process are precisely defined markings and a very high incorporation rate
  • Fumonisins contain two methyl groups (see marker Abbl.), which are transferred during the biosynthesis of S-adenosyl-methionine (SAM) on fumonisin.
  • SAM is generated in a one-step enzyme reaction, catalyzed by methionine adenosyl transferase, directly from the amino acid methionine.
  • a key enzyme in methionine synthesis is 5-methyltetrahydropteroyl triglutamate homocysteine methyltransferase ( Figure 2).
  • Targeted genetic manipulation (see experimental procedure) in Fusarium verticillioides has deleted the gene for homocysteine methyltransferase.
  • the method according to the invention comprises the following method steps
  • the native gene is replaced by the antibiotic resistance marker (see Fig. 3).
  • Transformants in which the gene for the homocysteine methyltransferase has been successfully deleted can be reduced to minimal medium without added
  • Methionine does not grow. However, on methionine-supplemented medium the deletion mutants reach similar growth rates as the wild type (see Fig. 4). The growth experiment shows that the function of the
  • Homocysteine methyltransferase in the deletion mutants can not be complemented by other enzymes. Conidia of the mef mutants sprout only on methionine-supplemented medium, indicating the need for de novo synthesis of methionine for the growth of F. verticillioides. This fulfills important prerequisites for the biosynthesis of labeled fumonisins of high purity.
  • the data from the mass spectrometric analysis confirm the expected mass shift for fumonisin of m + 6 with addition of D3-methyl-methionine or m + 2 with the addition of 13 C-methyl-methionine (see Fig. 5). In addition, the percentage of unlabelled and labeled fumonisin clearly indicates that product purity actually depends only on the purity of the labeled precursors, ie donor of the two methyl groups of the
  • Deletion mutants are exclusively added methionine (see Table 1).
  • the two methyl groups are derived from methionine or S-adenosyl-methionine (SAM) and are transferred from a methyltransferase to the fumonisin core.
  • SAM S-adenosyl-methionine
  • This strategy can be used to produce secondary metabolites with methyl groups derived from SAM and methionine, respectively.
  • the procedure described opens up the possibility for
  • Culture medium can, in a manner analogous to the method according to the invention, specifically mark a large number of natural substances.
  • FIG. 2 SAM synthesis; modified according to Thomas and Surdin-Kerjan (1997), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61 (1997): 503-532.
  • FIG. 3A DJ-PCR for generating gene-specific deletion constructs
  • FIG. 3B Transformation of F. verticillioides and deletion of the homocysteine methyltransferase gene by homologous recombination
  • FIG. 4 phenotype of the met mutant; Mycelium growth of the F. verticillioides wild type and a methionine auxotrophic (met " ) mutant
  • Figure 5 LC-MS analysis of the crude extracts of F. iert / c / 7 // o / des-liquid cultures without labeled methionine (A), with deuterium-labeled methionine (B) and with 13C-labeled methionine (C).
  • FIG. 6 Quantification of fumonisin B1 from F.I.t / ' c / 7 // o / des-liquid cultures without labeled methionine (samples 1 and 2), with deuterium-labeled Methionine (samples 3 and 4) and 13C-labeled methionine (samples 5 and 6).
  • Deletion mutants are due to the purity of the added isotope-labeled methionine (13C-methyl-methionine 99%, D3-methyl-methionine 98%).
  • BN5WT wild-type strain
  • ⁇ 5 ⁇ met " mutant

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Biosynthese von spezifisch isotopenmarkierten Sekundärmetaboliten. Zielsetzung der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung eines Verfahrens zur spezifischen Markierung von mikrobiellen Sekundärmetaboliten mit stabilen oder radioaktiven Isotopen, mit dem unter stark reduziertem Einsatz markierter Vorstufen höchste Einbau- und Markierungsraten erzielt werden können. Erfindungsgemäß werden mittels gentechnischer Methoden im Genom von bakteriellen bzw. pilzlichen Sekundärmetabolitproduzenten Gene der Aminosäurebiosynthese ausgeschaltet, deren Endprodukte (Aminosäuren) als Donoren funktioneller Gruppen von Sekundärmetaboliten dienen bzw. teilweise oder vollständig in die Molekülstruktur von Sekundärmetaboliten integriert werden. Der Einsatz isotopenmarkierter Substanzen erfolgt dabei wesentlich gezielter als bei dem gegenwärtig eingesetzten Verfahren zur Totalmarkierung, welches auf einer Zugabe von markierten Aminosäuren in ein Kulturmedium beruht. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur gezielten Markierung einer Vielzahl von Naturstoffen, eingesetzt werden. Die besondere Bedeutung des Verfahrens liegt dabei in der Herstellung preiswerter, verlässlicher Referenzsubstanzen/Standards für die moderne, hochsensitive Analytik-Verfahren wie SIDA-MS/MS.

Description

Verfahren zur Biosynthese von spezifisch isotopenmarkierten
Sekundärmetaboliten
Phytopathogene Pilze verursachen in der Landwirtschaft nicht nur direkte Ertragsverluste, sondern kontaminieren landwirtschaftliche Produkte auch häufig mit Mykotoxinen. Diese biologisch aktiven Substanzen, darunter akut toxische, teratogene und kanzerogene, stellen eine ständige Bedrohung der Gesundheit von Verbrauchern und Nutztieren dar. Für deren Schutz ist die genaue quantitative Erfassung von Mykotoxinen somit von enormer
Wichtigkeit, wobei massenspektrometrische Methoden aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Effizienz zunehmend zum Einsatz kommen. Entscheidend für die schnelle und exakte Quantifizierung von Mykotoxinen ist dabei die
Verwendung von Referenzsubstanzen bzw. internen Standards. Als
Referenzsubstanzen kommen hierbei isotopenmarkierte Sekundärmetaboliten zum Einsatz, die sich bei gleichen chemischen Eigenschaften anhand ihrer veränderten Masse von den Zielanalyten unterscheiden. Referenzsubstanzen sind zwingend notwendige Hilfsmittel in der Analytik von Probenmaterialien. Erst durch sie werden Identität und Gehalt der nachgewiesenen Substanz erfassbar.
Gegenwärtig werden isotopenmarkierte Sekundärmetaboliten durch die Zugabe markierter Glucose oder markierter Stickstoff- bzw. Schwefelsalze ins Kulturmedium hergestellt (s. Patent WO 2006105563). Dabei dürfen
ausschließlich markierte C-, N- oder S-Quellen im Medium vorhanden sein, um den Einbau nichtmarkierter Vorstufen in das Zielmolekül zu verhindern.
Der Einbau von Isotopen in Sekundärmetaboliten mittels Zugabe markierter Aminosäuren ins Kulturmedium wurde zwar beschrieben (z. B. Lukacs et ol. Chromatographia, 1996, Vol. 43, No. 3,4), es wurde jedoch bisher ausschließlich mit prototrophen Organismen gearbeitet. Die Konkurrenz zwischen der markierten Aminosäure und der in prototrophen Stämmen synthetisierten nichtmarkierten Aminosäure schränkt die Einbaurate und damit die
Nachweisgrenze und -genauigkeit der auf solchen Standards aufgebauten
Isotopenverdünnungsmethoden („stable-isotope dilution assays") deutlich ein.
Das bisher angewendete Verfahren zur Totalmarkierung ist sehr aufwändig und teuer. Ein entscheidender Kostenfaktor sind die isotopenmarkierten Vorstufen, die einerseits vollständig markiert vorliegen müssen (z. B. Glucose 13C6).
Andererseits erscheint nur ein Bruchteil der eingesetzten kostenintensiven Vorstufen tatsächlich im gewünschten sekundären Stoffwechselprodukt. So wird der überwiegende Teil markierter Glucose für die Energiegewinnung, Zellwand- und Proteinsynthese etc. verbraucht. Ähnliches gilt für andere niedermolekulare Vorstufen bzw. Salze. Die bisher verwendeten Verfahren, die auf einer Fütterung mit markierten Aminosäuren basieren, haben den entscheidenden Nachteil, dass die
natürliche, nicht markierte Aminosäure mit der extern zugegebenen
Aminosäure beim Einbau in die Metabolite konkurriert und damit die
Einbaurate begrenzt. Es stellte sich somit die Aufgabe, ein Verfahren zur spezifischen Markierung von mikrobiellen Sekundärmetaboliten mit stabilen oder radioaktiven Isotopen zu entwickeln, mit dem unter stark reduziertem Einsatz markierter Vorstufen höchste Einbau- und Markierungsraten erzielt werden können.
Erfindungsgemäß werden mittels gentechnischer Methoden im Genom von bakteriellen bzw. pilzlichen Sekundärmetabolitproduzenten Gene der
Aminosäurebiosynthese ausgeschaltet, deren Endprodukte (Aminosäuren) als Donoren funktioneller Gruppen, z.B. CH3 von Methionin, von
Sekundärmetaboliten dienen bzw. teilweise oder vollständig in die
Molekülstruktur von Sekundärmetaboliten integriert werden. Durch diese gentechnische Veränderung sind die Organismen nicht mehr selber in der Lage, diese für das Überleben z.T. essentiellen Aminosäuren oder deren Vorstufen zu produzieren, weshalb sie als auxotroph bezeichnet werden. Sowohl
Wachstum/Vermehrung als auch die Produktion der spezifischen
Sekundärmetabolite ist somit von der externen Verfügbarkeit dieser
Aminosäuren abhängig. Durch die Zugabe dieser Aminosäuren bzw. Donoren in isotopenmarkierter Form in das Kulturmedium werden von den auxotrophen Mutanten ausschließlich Zielmoleküle mit vollständig markierten funktionellen Gruppen bzw. Atomen im Stoffwechsel der jeweiligen Organismen gebildet.
Das erfindungsgemäße Verfahren des gerichteten Einbaus isotopenmarkierter funktioneller Gruppen von Aminosäuren bzw. vollständiger Aminosäuren oder deren Fragmente in sekundäre Stoffwechselprodukte zeichnet sich durch eine Kombination molekulargenetischer und biotechnologischer Methoden aus. Der Einsatz isotopenmarkierter Substanzen erfolgt dabei wesentlich gezielter als bei dem gegenwärtig eingesetzten Verfahren. Durch den Einsatz spezifischer Zwischenprodukte oder Vorstufen sind die stoffwechselphysiologischen
Verwendungs-/Produktbildungsmöglichkeiten in qualitativer und quantitativer Hinsicht, anders als z. B. beim Einsatz markierter Glucose, begrenzt.
Dadurch kann die Menge kostenintensiver markierter Substanzen drastisch reduziert werden. Die mit diesem Verfahren herstellbaren Substanzen sind durch exakt definierte Markierungen und eine sehr hohe Einbaurate
gekennzeichnet und entsprechen dadurch höchsten Qualitätsanforderungen bei gleichzeitiger starker Kostenreduktion, verglichen mit dem bisherigen Verfahren. Im Rahmen eines Referenzprojekts wurden Methionin-auxotrophe Mutanten des Phytopathogens Fusarium verticillioides hergestellt. Dieser Pilz produziert hepato- und nephrotoxisch wirkende Fumonisine (Abb. 1) während der
Infektion von Maispflanzen. Fumonisine enthalten zwei Methylgruppen (s. Markierung Abbl.), die während der Biosynthese von S-Adenosyl-Methionin (SAM) auf Fumonisin übertragen werden. SAM wird in einer Ein-Schritt-Enzymreaktion, katalysiert durch die Methionin-Adenosyl-Transferase, direkt aus der Aminosäure Methionin erzeugt. Ein zentrales Enzym der Methionin-Synthese ist die 5-Methyltetrahydropteroyl- triglutamat-Homocystein-Methyltransferase (Abb. 2). Durch eine gezielte gentechnische Manipulation (s. experimentelle Vorgehensweise) wurde in Fusarium verticillioides das Gen für die Homocystein-Methyltransferase deletiert. Die Deletion dieses Gens führt zur Methionin-Auxotrophie, d. h. dem vollständigen Verlust der eigenständigen Methionin-Synthese und damit zur Notwendigkeit, diese Aminosäure aus dem Medium zu beziehen. Zugesetztes Methionin, das eine Isotopenmarkierung in der Methylgruppe trägt, wird dadurch zum alleinigen Methylgruppendonor in der Fumonisin-Biosynthese.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei folgende Verfahrensschritte
(erläutert am Referenz-Beispiel der Gewinnung isotopenmarkierten
Fumonisins):
(1) Amplifikation der 5' und 3'- flankierenden nichtkodierenden DNA-Bereiche des Homocystein-Methyltransferasegens und Fusion mit einem Antibiotika- Resistenzgen mittels Double-Joint-PCR (Yu et al., Fungal Genetics and Biology 41, 2004: 973-981)
(2) Protoplasten-Transformation von Fusarium verticillioides mittels eines modifizierten Standard-Protokolls nach Glenn et al. (Molecular Plant-Microbe Interactions 21, 2008: 87-97) unter Zugabe des o.g. Deletionskonstruktes;
aufgrund homologer Rekombination kommt es zum Austausch des nativen Gens mit dem Antibiotika-Resistenzmarker (s. Abb. 3).
(3) Selektion positiver Transformanten auf antibiotikahaltigem
Komplettmedium (4) Selektion Methionin-auxotropher (met ) Transformanten auf
Minimalmedium ohne Methionin (s. Abb. 4)
(5) Kultivierung von mef-Stämmem mit isotopenmarkiertem Methionin und MS-Analyse (s. Abb. 5)
Transformanten, in denen das Gen für die Homocystein-Methyltransferase erfolgreich deletiert wurde, können auf Minimalmedium ohne zugesetztes
Methionin nicht wachsen. Auf Methionin-supplementiertem Medium erreichen die Deletionsmutanten jedoch ähnlich Wachstumsgeschwindigkeiten wie der Wildtyp (s. Abb. 4). Der Wachstumsversuch zeigt, dass die Funktion der
Homocystein-Methyltransferase in den Deletionsmutanten nicht durch andere Enzyme komplementiert werden kann. Konidien der mef-Mutanten keimen nur auf Methionin-supplementiertem Medium, was auf die Notwendigkeit der de novo-Synthese von Methionin für das Wachstum von F. verticillioides hinweist. Damit sind wichtige Voraussetzungen für die Biosynthese markierter Fumonisine von hoher Reinheit erfüllt. Die Daten der massenspektrometrischen Analyse bestätigen den erwarteten Massenshift für Fumonisin von m+6 bei Zugabe von D3-Methyl-Methionin bzw. m+2 bei Zugabe von 13C-Methyl-Methionin (s. Abb 5). Darüber hinaus zeigt das prozentuale Verhältnis von unmarkierten und markiertem Fumonisin deutlich, dass die Produktreinheit tatsächlich nur von der Reinheit der markierten Vorstufen abhängt, d. h. Donor der beiden Methylgruppen des
Fumonisinmoleküls im Stoffwechsel von Methionin-auxotrophen
Deletionsmutanten ist ausschließlich zugesetztes Methionin (s. Tab. 1).
Die beiden markierten Methylgruppen stammen vom Methionin bzw. S- Adenosyl-Methionin (SAM) und werden von einer Methyltransferase auf das Fumonisin-Gru ndgerüst übertragen.
Durch Deletion des Gens für die Homocystein-Methyltransferase wurden Methionin-auxotrophe Fusarium verticillioides- Mutanten erzeugt.
Diese Strategie lässt sich zur Herstellung von sekundären Metaboliten mit Methylgruppen, die von SAM bzw. Methionin stammen, einsetzen. Darüber hinaus eröffnet die beschriebene Vorgehensweise die Möglichkeit zur
Markierung seku ndärer Metabolite, die keine vom Methionin abgeleiteten Methylgruppen tragen, aber Aminosäuren bzw. deren Derivate im Grundgerüst des Moleküls enthalten. Durch Erzeugung der entsprechenden auxotrophen Mutanten oder durch Einsatz natürlich vorkommender auxotropher Stämme und Zugabe der jeweiligen isotopenmarkierten Aminosäuren in das
Kulturmedium lässt sich, analog zum erfindungsgemäßen Verfahren, eine Vielzahl von Naturstoffen gezielt markieren. Erläuterungen zu den Figuren
Figur 1: Chemische Struktur von Fumonisinen
Figur 2: SAM -Synthese; modifiziert nach Thomas and Surdin-Kerjan (1997), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61 (1997):503-532.
Figur 3A: DJ-PCR zur Erzeugung genspezifischer Deletionskonstrukte
Figur 3B: Transformation von F. verticillioides und Deletion des Homocystein- Methyltransferasegens durch homologe Rekombination
Figur 4: Phänotyp der met -Mutante; Myzel Wachstum des F. verticillioides - Wildtyps und einer Methionin-auxotrophen (met") Mutante auf
Minimalmedium mit bzw. ohne Methionin
Figur 5: LC-MS Analyse der Rohextrakte von F. i ert/c/7//o/des-Flüssigkulturen ohne markiertes Methionin (A), mit Deuterium-markiertem Methionin (B) sowie mit 13C-markiertem Methionin (C).
Figur 6: Quantifizierung von Fumonisin Bl aus F. i ert/'c/7//o/des-Flüssigkulturen ohne markiertes Methionin (Proben 1 und 2), mit Deuterium-markiertem Methionin (Proben 3 und 4) und mit 13C-markiertem Methionin (Proben 5 und 6). Der geringe Anteil an unmarkiertem Fumonisin im Medium der
Deletionsmutanten ist auf die Reinheit des zugesetzten isotopenmarkierten Methionins zurückzuführen (13C-methyl-Methionin 99%, D3-methyl-Methionin 98%).
BN5WT: Wildtypstamm, ΒΝ5Δ: met"-Mutante, lx/2x Zugabe von Methionin zu Beginn der Kultivierung (lx) bzw. erneute Zugabe von 100 mg/l Methionin nach 11 Tagen (2x).

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Biosynthese von spezifisch isotopenmarkierten
sekundären Stoffwechselprodukten von Pilzen oder Bakterien zur Herstellung interner Standards für die Analytik, für metabolischen Studien zur Aufklärung von Stoffwechselkreisläufen, Abbauwegen, Abbauzeitspannen sowie
Gewebeeinlagerungen gekennzeichnet dadurch, dass a) pilzliche oder bakterielle Organismen verwendet werden, die auxotroph für Aminosäuren oder deren Derivate oder Vorstufen sind, deren
Molekülstrukturen/bestandteile teilweise oder vollständig in das sekundäre Stoffwechselprodukt eingebaut werden bzw. Donoren funktioneller Gruppen des Stoffwechselprodukts darstellen, b) die auxotrophen Organismen durch gentechnische Veränderungen erzeugt werden oder natürliche Varianten darstellen, c) die auxotrophen Organismen unter Zugabe von isotopenmarkierten D/L- Aminosäuren, deren Derivaten und/oder deren niedermolekularen Vorstufen kultiviert werden, wodurch die Isotopenmarkierung durch Biosynthese in das bzw. die sekundäre(n) Stoffwechselprodukt(e) eingebaut werden,
2. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die isotopenmarkierten sekundären Stoffwechselprodukte pilzlichen oder bakteriellen Ursprungs sind, insbesondere Polyketide, nichtribosomale Peptide, Terpene, Terpenoide, Alkaloide, Amine, Phenole, Glycoside, Glucosinolate, Phenazine, Furane, Fettsäuren, Isoprenoide, Phenylpropanoide, Polyacetylene, Flavonoide, Aminoglycoside.
3. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die auxotrophen Mutanten durch gezielte Gendeletionen, Disruptionen und/oder Insertionen hergestellt werden.
4. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die auxotrophen Mutanten durch RNAi-basierte Silencingverfahren hergestellt werden.
5. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die auxotrophen Mutanten durch Zufallsmutagenese hergestellt werden.
6. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die auxotrophen Mutanten natürlich vorkommende Varianten der
Organismen sein können.
7. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die infolge der Auxotrophie nicht mehr synthetisierten Aminosäuren oder deren Derivate, welche als Vorstufen oder Donoren funktioneller Gruppen von sekundären Stoffwechselprodukten dienen, als isotopenmarkierte Substanzen dem Kulturmedium zugegeben und auf biosynthetischem Weg
isotopenmarkierte sekundäre Stoffwechselprodukte
hergestellt werden, die in Abhängigkeit vom Markierungsgrad der zugesetzten isotopenmarkierten Aminosäure, Aminosäurederivate oder deren
niedermolekulare Vorstufen einen Reinheitsgrad von 95-100%, bezogen auf die Isotopenmarkierung, aufweisen.
8. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass mit stabilen Isotopen, insbesondere 13C, 15N, 33S, 34S und Deuterium, teilweise oder vollständig markierte Aminosäuren oder deren Derivate oder deren niedermolekulare Vorstufen dem Kulturmedium zugesetzt werden.
9. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass mit radioaktiven Isotopen, insbesondere 3H,35S,14C oder32P, 125l, und 126l, teilweise oder vollständig markierte Aminosäuren oder deren Derivate oder deren niedermolekulare Vorstufen dem Kulturmedium zugesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass als Aminosäuren proteinogene Aminosäuren eingesetzt werden.
11. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass als Aminosäuren nicht proteinogene Aminosäuren eingesetzt werden.
12. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass niedermolekulare Vorläufermoleküle von Aminosäuren eingesetzt werden.
13. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass als Aminosäure Methionin eingesetzt wird.
14. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass als Donor von Methylgruppen Methionin verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass als Donor von Methylgruppen S-Adenosyl-Methionin eingesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass die isotopenmarkierten sekundären Stoffwechselprodukte aus dem Kulturmedium durch Extraktion und Aufkonzentration gewonnen werden.
17. Verfahren nach einem der obigen Ansprüche gekennzeichnet dadurch, dass als Reinigungsverfahren chromatographische Verfahren eingesetzt werden.
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