WO2015016616A1 - 삭사틸린-Ｆｃ 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

삭사틸린-Ｆｃ 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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허지회
권일
김동익
장양수
김영대
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Definitions

  • the present invention was made by task number A085136 under the support of the Ministry of Health and Welfare of Korea, the research and management institution of the project is the Korea Health Industry Development Institute, the research project name is “lead-type specialized R & D project,” and the research title is “lead-type brain cardiovascular The Center for Disease Convergence Research ”, the lead organization is Yonsei University Industry-Academic Cooperation Group, and the research period is from Dec. 01, 2012 to Nov.
  • the present invention relates to saxatilin derivatives having increased half-life and uses thereof.
  • rt-PA tissue plasmionogen activator
  • rt-PA has been reported to have neurotoxicity (Chen and Strickl, 1997; Wang, Tsirka et al., 1998; Nicole, Docagne et al., 2001; Yepes, Sandkvist et al., 2002; and Matys and Strickl, 2003).
  • thrombolytic agents that are more potent than rt-PA, as they cause limitations and potential side effects of applicability.
  • Such attempts include variants of t-PA, plasminogen activators from animal sources and microplasmin.
  • the above mentioned drugs have the following purposes: (a) increase fibrin specificity; (b) prolongation of half-life in plasma; (c) decreased inhibition by plasminogen activator inhibitor-1; And (d) avoiding neurotoxicity.
  • thrombolytics such as rt-PA and eurokinase.
  • thrombi are formed by platelet-fibrinogen interactions.
  • Thrombin, leukocytes and erythrocytes are also components of thrombi.
  • Thrombosis resistance to thrombolytic agents targeting fibrin is one of the main reasons for the low recanalization rates seen in stroke patients, and this phenomenon is more common than in platelet-rich thrombus occlusion. Can happen.
  • the therapy targeting platelets may be an optional or additional method for therapy targeting fibrin for improved thrombolytic efficacy.
  • Platelet glycoprotein (GP) IIb / IIIa a member of the integrin family, is present on the surface of platelet membranes at high density (Shattil and Ginsberg, 1997). GPIIb / IIIa receptors mediate the final stage of the platelet aggregation pathway by specifically binding to fibrinogen (Phillips, Charo et al., 1988). Therefore, targeting platelet GPIIb / IIIa receptors was the mainstay for drug development that acts on platelets.
  • platelet GPIIb / IIIa antagonists have been developed, such as Fab fragments of human-mouse chimeric antibodies against GP IIb / IIIa, non-peptide analogs of RGD peptide (tyropiban and ramiphan) and KGD motifs.
  • Circular heptapeptide disintegrin (eptifibatide) comprising (Seitz, Meisel et al., 2004; Abou-Chebl, Bajzer et al., 2005; and Eckert, Koch et al., 2005).
  • GPIIb / IIIa antagonists were effective in patients with unstable angina pectoris, acute myocardial infarction, and percutaneous transfemoral coronary angioplasty (PTCA) and stent surgery.
  • PTCA percutaneous transfemoral coronary angioplasty
  • abciximab did not show efficacy in treated patients 5 to 6 hours after onset of symptoms (Adams, Effron et al., 2008).
  • GPIIb / IIIa antagonists dissolve thrombi in reoccluded stroke patients and are effective in selected patients (Heo, Lee et al., 2003; Seitz, Hamzavi et al., 2003; Seitz, Meisel et al., 2004; Eckert, Koch et al., 2005; and Chen, Mo et al., 2007).
  • Saxatilin a novel disintegrin purified and cloned from Korean snake venom, has a tripeptide sequence, ArgGlyAsp (RGD), which is the recognition site of disintegrins for platelet GPIIb / IIIa receptors.
  • RGD ArgGlyAsp
  • Saxatilin is known to have a potent inhibitory effect on platelet aggregation (Hong, Koh et al., 2002) and platelet activation (Jang, Jeon et al., 2007), thus preventing thrombus generation.
  • the present inventors have sought to develop thrombolytic agents that can inhibit the production of blood clots in blood vessels or effectively dissolve blood clots that have already been formed to repenetrate partially or completely occluded blood vessels.
  • recombinant proteins or saxatilin derivatives consisting of disintegrin, specifically saxatilin and immunoglobulin Fc fragments derived from snake venom, have similar thrombolytic ability as saxatilin protein and are remarkable.
  • the present invention was shown to show an increased protein half-life, and that the FeCl3-induced carotid artery animal model can be used to efficiently dissolve blood clots that have already formed in blood vessels and that their efficacy can be sustained for longer than the parent protein saxatilin. To complete.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleotide sequence encoding the saxatilin derivative.
  • Another object of the present invention is to provide a recombinant vector comprising the nucleotide sequence.
  • Another object of the present invention to provide a cell transformed by the recombinant vector.
  • Another object of the present invention to provide a composition for dissolving a blood clot.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of vascular stenosis or occlusion disease.
  • the present invention provides a saxatilin derivative in which the Fc region of saxatilin and immunoglobulin, consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2, is conjugated.
  • the present invention provides a nucleotide sequence encoding the aforementioned saxatilin derivative.
  • the present invention provides a kit comprising: (a) the nucleotide sequence described above; And (b) a promoter operatively linked to the nucleotide sequence.
  • the invention provides a cell or transformant transformed with the recombinant vector described above.
  • the present inventors have sought to develop thrombolytic agents that can inhibit the production of blood clots in blood vessels or effectively dissolve blood clots that have already been formed to repenetrate partially or completely occluded blood vessels.
  • recombinant proteins or saxatilin derivatives consisting of disintegrins, specifically saxatilin and immunoglobulin Fc fragments derived from snake venom, not only have similar thrombus solubility as saxatilin protein but also significantly increased
  • the protein half-life was shown, and it was confirmed that the FeCl 3 -derived carotid animal model using the same can dissolve the blood clot formed in the blood vessel very efficiently and its effect can be sustained for a longer time than the parent protein saxatilin.
  • Saxatilin derivatives of the present invention namely the fusion protein of saxatilin (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) and the Fc, are the Fc regions of saxatilin and immunoglobulin consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 2 It is composed of a protein consisting of: integrins present in thrombi, specifically, GP (glycoprotein) IIb-IIIa on the surface of the platelets constituting the thrombus, which compete (competition binding) to remove platelets from constituents of thrombi such as fibrinogen It can break down blood clots efficiently.
  • integrins present in thrombi specifically, GP (glycoprotein) IIb-IIIa on the surface of the platelets constituting the thrombus, which compete (competition binding) to remove platelets from constituents of thrombi such as fibrinogen It can break down blood clots efficiently.
  • GP glycoprotein IIb-IIIa
  • the saxatilin derivatives of the present invention have a similar thrombolytic ability as saxatilin, the parent protein.
  • the saxatilin derivative of the present invention has an IC 50 value of 100-500 nM, preferably 100-250 nM for platelet aggregation.
  • IC 50 values of the parent protein saxatilin and Fc-saxatilin and saxatilin-Fc of the present invention were 150 nM, 196 nM and 362 nM, respectively (see FIG. 4).
  • the term "IC 50 values (half maximal inhibitory concentration)" as used herein, a biological or biochemical activity as an index for evaluating the efficacy of a compound to inhibit a particular drug or other substance (e.g., saksa motilin derivatives of the present invention) Provides quantitative concentration measurements necessary to inhibit up to half of a particular biological process (eg, thrombolytic) or components involved in the process (eg, enzymes, cell receptors, etc.).
  • thrombolytic activity can be determined by various methods known in the art, for example, Astrup A and Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity.Arch Biochem Biophys 40: 346-351 (1952) ), A method for detecting D-dimer indicative of thrombolysis (US Patent Publication No. US2009 / 0305301 A1), a method using a radioisotope (International Patent Publication No. WO94 / 22494), blood vessel It can be measured using the method of measuring the internal thrombus, turbidity of the pulverized powder after thrombolysis, and the like, but is not limited thereto.
  • the saxatilin derivatives of the present invention have a Kd (dissociation constant) value of 1 ⁇ 10 ⁇ 8 to 1 ⁇ 10 ⁇ 10 M with respect to integrin ⁇ M ⁇ 2 present in neutrophils. Has a bonding force.
  • the saxatilin derivative of the present invention has a dissociation constant (Kd) value of 1 x 10 -8 to 1 x 10 -10 M with respect to integrin ⁇ L ⁇ 2 present in neutrophils. Has a bonding force.
  • the throughput of the saxatilin derivatives of the invention is 1-20 mg / kg, more specifically 3-15 mg / kg, most specifically 5-10 mg / kg.
  • the saxatilin derivatives of the present invention have shown an effect on repenetration of completely occluded vessels at low doses (see FIGS. 6A-6C).
  • FIGS. 6A-6C 130 nmol / kg of saxatilin, Fc-saxatilin or saxatilin-Fc treatment showed about 30% blood flow recovery effect on the re-penetration of the completely occluded vessel.
  • the saxatilin treated group progressed reclosure about 90 minutes, while the Fc-saxatilin or saxatilin-Fc treated group showed continuous repenetrating effect.
  • the saxatilin derivatives of the invention may be administered orally or parenterally, specifically parenterally, and in the case of parenteral administration, bolus injection, intravenous injection, intraarterial Injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, intraperitoneal injection, topical administration, transdermal administration, etc., most specifically bolus injection.
  • the drug eg, the saxatilin derivative of the present invention
  • the drug having a re-penetrating effect of blood vessels preferably has a suitable duration, specifically, having a duration of about 10 minutes is most clinically suitable and effective. .
  • the Fc region of an immunoglobulin (immunoglobulin) contained in the saxatilin derivatives of the invention is conjugated to the N-terminus or C-terminus of saxatilin, more specifically to the N-terminus It is conjugated.
  • the saxatilin derivatives of the invention further comprise a leader sequence at the N-terminus.
  • a fusion protein in which the Fc region of the immunoglobulin is bound to the target protein is less effective than the parent protein, or the half-life increase effect is not so great.
  • the saxatilin derivatives of the present invention not only had similar thrombolytic activity as the saxatilin parent protein, but also showed much increased half-life than saxatilin parent protein (see FIGS. 5A-5C).
  • the half-lives of the Fc-saxatilin and saxatilin-Fc of the present invention were 8.6 and 12.5 minutes, respectively, which were much longer than the half-life (2.0 minutes) of the parent protein saxatilin.
  • the saxatilin derivatives of the present invention have a half-life increased by at least four times that of the parent protein, saxatilin, and more particularly have an increased half-life of about 4-6.5 times.
  • Fc region refers to the carboxyl terminal portion of an immunoglobulin chain constant region, specifically the immunoglobulin heavy chain constant region or portion thereof.
  • immunoglobulin Fc regions that can be used in the preparation of saxatilin derivatives of the invention include (a) a CH1 domain, a CH2 domain and a CH3 domain; (b) a CH1 domain and a CH2 domain; (c) a CH1 domain and a CH3 domain; (d) CH2 domain and CH3 domain; Or (e) a combination of two or more domains and an immunoglobulin hinge region.
  • the immunoglobulin Fc region used in the preparation of the saxatilin derivatives of the invention may comprise a human immunoglobulin Fc region (GenBank Accession No., CAA49866.1) and fragments thereof (e.g. 7 sequences).
  • the invention also relates to amino acid sequences encoded by the nucleotide sequences disclosed in the GenBank and / or EMBL databases in addition to the human immunoglobulin Fc region, for example AF045536.1 ( Macaca fuscicularis ), AF045537.1 ( Macaca mulatta ), AB016710 ( Felix catus ), K00752 ( Oryctolagus cuniculus ), U03780 ( Sus scrofa ), Z48947 ( Camelus dromedarius ), X62916 ( Bos taurus ), L07789 ( Mustela vision ), X69797 ( Ovis aries ), U17166 ( Cricetulus migratorius ), X07189 ( Rattus rat Other immunoglobulin Fc regions or fragment sequences thereof, including AF57619.1 ( Trichosurus vulpecula ) or AF035195 ( Monodelphis domestica ), and the like, can also be used.
  • substitutions or deletions of amino acid sequences in immunoglobulin heavy chain constant regions may be useful for preparing the saxatilin derivatives of the present invention.
  • Fc variants prepared through such substitutions or deletions are useful for the production of more optimized fusion proteins by improving the stability, solubility and structural integrity of the fusion protein.
  • the present invention provides a nucleotide encoding a fusion protein (SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6) consisting of a saxatilin of SEQ ID NO: 2 and an Fc region of an immunoglobulin of SEQ ID NO: 7 It is apparent to those skilled in the art that a sequence is provided and specifically illustrated as SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 5, but is not limited to any nucleotide sequence encoding the fusion protein. .
  • the fusion proteins of the invention can be tagged with a variety of detectable tag tags, the tag comprising His (n), flag, c-Myc, HA, V5, VSV-G and HSV However, it is not limited thereto.
  • the term "tag” refers to a polypeptide sequence having 3-40 amino acid sequences, and refers to fusion proteins, peptides, protein ligands (eg, fusion proteins of the invention) or non- Confers specific binding affinity to the peptide ligand.
  • a tag that may be used in the present invention may include a fluorescent tag, a luminescent tag, and a chromogenic tag.
  • the saxatilin derivatives of the present invention comprise (a) a nucleotide sequence encoding the saxatilin derivatives; And (b) a recombinant vector comprising a promoter operatively linked to the nucleotide sequence.
  • promoter refers to a DNA sequence that regulates the expression of a coding sequence or functional RNA.
  • the expression target (ie, saxatilin-Fc fusion protein) -encoding nucleotide sequence is operably linked to the promoter.
  • operatively linked refers to the functional binding between nucleic acid expression control sequences (eg, promoter sequences, signal sequences, or arrays of transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences. By means of which the regulatory sequence will regulate the transcription and / or translation of the other nucleic acid sequence.
  • the vector system of the present invention may be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), This document is incorporated herein by reference.
  • the expression vector of the present invention is a prokaryotic cell as a host
  • powerful promoters capable of promoting transcription e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL promoter, pR promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • ribosomal binding sites for initiation of translation and transcription / detox termination sequences e.g., tac promoter, lac promoter, lacUV5 promoter, lpp promoter, pL promoter, pR promoter, rac5 promoter, amp promoter, recA promoter, SP6 promoter, trp promoter and T7 promoter, etc.
  • the bacterial replication initiation point may be selected from those well known in the art useful for stable bacterial replication of long DNA inserts, and include ColE1, F-factor and P1 replicon ( replicon), but is not limited thereto
  • the bacterial selection marker of the present invention may use bacterial selection marker genes known in the art.
  • bacterial selection marker genes include, but are not limited to, genes that confer resistance to antibiotics such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, zeosin, neomycin, hygromycin and chloramphenicol.
  • antibiotics such as ampicillin, kanamycin, tetracycline, zeosin, neomycin, hygromycin and chloramphenicol.
  • E. coli E. coli is used as the host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol. , 158: 1018-1024 (1984)) and the leftward promoter of phage ⁇ (pL ⁇ ). Promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet. , 14: 399-445 (1980)) can be used as regulatory sites
  • a promoter that can be used when the recombinant vector of the present invention is applied to eukaryotic cells is capable of regulating the transcription of the expression material of the present invention, and is derived from a promoter derived from a mammalian virus and a genome of a mammalian cell.
  • Promoters such as the cytomegalo virus (CMV) promoter, adenovirus late promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, tk promoter of HSV, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallothionine promoter, beta- Actin promoter, promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene and promoter of human GM-CSF gene.
  • CMV cytomegalo virus
  • the recombinant vector used in the present invention comprises a polyaninated sequence (e.g., a plastic field hormone terminator or a SV40 derived poly adenylation sequence).
  • a polyaninated sequence e.g., a plastic field hormone terminator or a SV40 derived poly adenylation sequence.
  • the method of carrying the vector of the present invention into a host cell may use various methods known in the art, for example, when the host cell is a prokaryotic cell, the CaCl2 method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973)), one method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D. , J. Mol. Biol., 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res., 16: 6127-6145 (1988)) and the like.
  • transduction, electroporation, lipofection, microinjection, gene bombardment, yeast globular / cell fusion used in YAC, used in plant cells Agrobacterium-mediated transformation can be carried out using such.
  • the production of animal cells transformed using the recombinant expression vector of the present invention can be carried out by gene transfer methods commonly known in the art. For example, electroporation, liposome-mediated transfer methods (Wong, et al., 1980) and retrovirus-mediated transfer methods (Chen, HY, et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41: 173-182; Kopchick, JJ et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos.In Transgenic Animals, ed.NL First & FP Haseltine, pp. 275-293, Boston; Butterworth-Heinemann; Lee , M.-R. and Shuman, R. (1990) Proc. 4th World Congr. Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110).
  • the above-described transformed animal cell is a mammal-derived cell.
  • the foreign gene in selecting animal cells into which the foreign gene of the present invention has been introduced, preferably comprises an antibiotic resistance gene as a selection marker.
  • Selection markers that may be used in the present invention may be any gene that confers antibiotics on eukaryotic cells, including, but not limited to, neomycin and kanamycin resistance genes.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of the saxatilin derivative described above; And (b) provides a composition for dissolving a thrombus comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of stenosis or occlusion disease of the blood vessel comprising the composition for thrombolytic dissolution.
  • composition of the present invention includes the saxatilin derivatives of the present invention as described above as an active ingredient, the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • compositions of the present invention can effectively dissolve the already clogged clots and can be applied simply and efficiently in the treatment of various vascular stenosis or occlusion diseases. That is, the composition of the present invention can be applied to treat vascular stenosis or occlusion disease on the principle of dissolving already formed thrombi to effectively penetrate blood vessels.
  • occlusion is a term encompassing a state in which a blood vessel is completely blocked or partially blocked and the blood vessel is narrowed.
  • the degree of occlusion referred to in the present invention can be determined based on the measured blood flow. In other words, the degree of occlusion is classified as partial occlusion or complete occlusion, and partial occlusion refers to a case where the level is reduced to 40-80% of the baseline blood flow. It means the case reduced to 90-100% level.
  • the method of measuring blood flow in the blood vessel may be performed according to a method known in the art, for example, ultrasonic dilution method (Lee KH, Park JY, Choi SJ, Kim JK, Hwang SD, Joh JH, Clinical utility of access blood flow measurement by ultrasound dilution in hemodialysis patients.Korean J Nephrol, 24: 265-273 (2005)), Doppler ultrasonography (Strauch B, O'Connoll R, Geoly K, Forcasting thrombosis of vascular access with doppler flow imaging.Am J Kidney Dis, 19: 554-557, (1992)), glucose pump test (GPT; Magnasco A, Alloatti S, Martinoli C, Solari P, Glucose pump test: a new method for blood flow measurements.Neprol Dial Transplant, 17: 2244-2248 (2002)), using near infrared (700-1000 nm) (Buunk G, van der Hoeven JG, Meinders AE, A comparison of near-
  • the animal to which the composition of the present invention may be applied is not particularly limited and is specifically a mammal, and more specifically human, mouse, rat, rabbit, monkey, pig, horse, Cattle, sheep, nutrition, dogs and cats, and more specifically humans and mice.
  • the animal blood vessels include arteries, veins, capillaries, and more specifically, aorta, carotid artery, subclavian artery, celiac artery, mesenteric arteries, renal artery, iliac artery, Small arteries, capillaries, predetermined veins, most preferably aorta and carotid arteries.
  • vascular stenosis or occlusion diseases such as cerebrovascular disease (CVD), cardiovascular disease, atherosclerotic vascular disease (arteriovascular disease), coronary artery Coronary artery disease (CAD), peripheral artery disease (PAD), and more specifically, stroke, cerebral infarction, cerebral thrombosis, embolism, ruptured cerebral infarction, acute coronary syndrome, angina pectoris, aortic stenosis, myocardial myocardium Infarction, migraine, blockade, cerebral ischemia, acute ischemic arteriovascular event, thrombophlebitis, venous thromboembolism, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, peripheral vascular disease, vascular headache, Atherosclerosis, angiospasm, restenosis, stenosis after instrumental angioplasty and vascular obstruction due to vasculitis, Most specifically include stroke, cerebral infarction, thrombosis,
  • CVD Cerebrovascular disease
  • CAD and / or PAD peripheral artery disease
  • CAD and / or PAD peripheral artery disease
  • comorbid disease that occurs in conjunction with, ischemic disease or diseases that cause a lack of blood flow.
  • CVD includes but is not limited to ischemic cerebrovascular disease, acute cerebral infarction, stroke, ischemic stroke, hemorrhagic stroke, varicose veins, mild cognitive impairment (MCI) or transient ischemic attacks (TIA). It is not limited.
  • the terms "cardiovascular disease” or “arteriovascular disease” are used to classify a number of conditions that affect the vasculature of the heart, heart valves, blood, and the body. In general terms, it includes diseases affecting the heart or blood vessels. Specifically, metabolic syndrome, syndrome X, atherosclerosis, atherothrombosis, coronary artery disease, stable and unstable angina, aortic diseases such as stroke, aortic stenosis or aortic aneurysm, cerebrovascular disease, peripheral vascular disease or acute ischemic atherosclerotic events It includes, but is not limited to. In particular, atherosclerotic vascular disease (arteriovascular disease) refers to ischemic disease or proischemic disease rather than non-ischemic disease.
  • CAD coronary artery disease
  • myocardium coronary artery
  • CAD results in a decrease in blood flow to the myocardium, which causes the myocardium to not receive a sufficient amount of oxygen and ultimately to necrosis.
  • CAD includes, but is not limited to, acute coronary syndrome, myocardial infarction (heart attack), angina (stable and unstable) or atherosclerosis and atherothrombosis occurring in blood vessels that supply blood to the heart.
  • peripheral artery disease refers to diseases such as atherosclerosis and atherothrombosis that occur outside the heart and brain and are commonly associated with CAD (comorbid disease). It includes.
  • the term “pharmaceutically effective amount” means an amount sufficient to achieve the efficacy or activity (ie, thrombus solubility) of the saxatilin derivatives described above.
  • the pharmaceutical composition of the present invention comprises a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • a lubricant e.g., talc, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, kaolin, a kaolin, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, sorbitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mannitol, mann
  • Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion, and response to reaction. Can be.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and when administered parenterally, it can be administered by bolus injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, transdermal administration, and most particularly. In the form of a direct injection into the blood vessel (eg, bolus injection or intravenous injection).
  • arteries, veins, blood vessels including capillaries such as the aorta, carotid artery, subclavian artery, celiac artery, mesenteric arteries, renal artery, iliac artery, artery, capillaries, and vein.
  • Means to be administered into the blood vessel, and the method of administration can be appropriately selected according to the blood vessel site where the thrombus.
  • the route of administration is determined according to the type of disease to be applied and the decision of the prescription.
  • concentration of the saxatilin derivative, which is an active ingredient included in the composition of the present invention may be determined in consideration of the purpose of treatment, the condition of the patient, the duration of need, and the like, and is not limited to a specific range of concentration.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is 0.001-1,000 mg / kg.
  • compositions of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not merely to prevent or treat the above diseases by the principle of preventing the formation of blood clots, but to treat the vascular stenosis or occlusion disease as a principle of effectively piercing blood vessels by melting already formed blood clots.
  • pharmaceutical compositions eg, aspirin
  • rt-PA tissue plasminogen activator
  • Treatment by is currently the only approved cerebral infarction therapy that can be performed within 3 hours after onset of cerebral infarction.
  • the treatment with plasminogen activator is not only limited to the above time limit, but in the reality that more than half of patients fail to achieve successful recanalization after thrombolytic treatment, they effectively prevent the generated thrombi.
  • the pharmaceutical composition of the present invention that can be dissolved will be said to be a very realistic and technological solution in the treatment of stenosis or occlusion disease of the disease once developed.
  • the pharmaceutical composition for treatment of vascular stenosis or occlusion disease of the present invention is of great value in that it effectively treats microvascular occlusion and does not cause restenosis.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a vascular stenosis or occlusion disease comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a saxatilin derivative.
  • the vascular stenosis or occlusion disease is stroke, cerebral infarction, thrombosis, cerebral embolism, hiatus cerebral infarction, acute coronary syndrome, angina pectoris, aortic stenosis, myocardial infarction, migraine, blockade, cerebral ischemia, acute ischemic Acute ischemic arteriovascular event, thrombophlebitis, venous thromboembolism, deep vein thrombosis, pulmonary embolism, peripheral vascular disease, vascular headache, atherosclerosis, vasospasm, restenosis, instrument Post angioplasty and vascular occlusion due to stenosis and vasculitis.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present invention is performed by administering to the subject the 'saxatilin derivative', which is another embodiment of the present invention, the overlapping content will be omitted to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention provides the use of saxatilin derivatives for the prevention or treatment of vascular stenosis or occlusion disease.
  • the duplicated content will be omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the present invention relates to saxatilin derivatives having increased half-life and uses thereof.
  • the saxatilin derivatives of the present invention not only have similar thrombus solubility as the parent protein saxatilin but also have a significantly increased protein half-life, using which the blood vessels formed in blood vessels in FeCl3-induced carotid animal models can be used. Dissolves very efficiently for long periods of time.
  • the composition comprising the saxatilin derivatives of the present invention as an active ingredient does not cause restenosis after penetrating, but effectively opens up the microvascular vessels to prevent stenosis or occlusion of blood vessels (eg, cerebrovascular disease, cardiovascular disease, artery). It is very effective in the treatment of sclerotic vascular disease, coronary artery disease, peripheral vascular disease, etc.).
  • blood vessels eg, cerebrovascular disease, cardiovascular disease, artery.
  • 1 is a diagram showing the structure of a saxatilin derivative cloned at the multicloning position of pYK603 vector and pYK602 vector, respectively. Distances between components or distances between restriction sites are not shown in proportions.
  • leader leader sequence
  • immunoglobulin G2a gamma chain immunoglobulin G2a gamma chain.
  • Figure 2 is a Western blotting result confirming the expression of the saxatilin derivatives of the present invention.
  • centrifugation was performed at 5,000 rpm for 10 minutes to investigate the presence of precipitate (lane 2 and lane 4).
  • the saxatilin derivative of the present invention was very stable (no precipitate formed).
  • 3A and 3B show the results of purification of Fc-saxatilin and saxatilin-Fc, respectively, showing gel-electrophoresis images (left panel) and electropherogram (right panel).
  • the parent protein saxatilin and saxatilin derivatives of the present invention (Fc-saxatilin and saxatilin-Fc).
  • the parent proteins saxatilin and Fc-saxatilin used 50, 100, 150, 200, 250 and 300 nM, and saxatilin-Fc was 200, 300, 350, 400, 500 and 600 nM was used.
  • 5A to 5C show the results of measuring half-lives of saxatilin, which is a parent protein, and saxatilin derivatives of the present invention (Fc-saxatilin and saxatilin-Fc), respectively.
  • Figure 6 shows the result of comparing the effect of the saxatilin 650 nmol / kg and the thrombolytic effect of the saxatilin derivatives. In addition, the result of having measured the degree of repenetration and the extent by measuring blood flow is shown.
  • Figure 8 shows the results of analyzing the blood flow average percentage of the normal blood flow during the last 10 minutes of the two hours measured the thrombolytic effect.
  • the inventors performed PCR using the primer pairs (Saxatilin-F and Saxatilin-R) described in Table 1 below.
  • the obtained PCR product was digested with restriction enzyme sfi I (thermo scientific) and cloned into pYK603 vector and pYK602 vector (A & Al Ceraputix) using T4 DNA ligase (thermo scientific), respectively, for Fc-saxatilin and saxatilin-.
  • a recombinant vector for expressing Fc protein was prepared (FIG. 1).
  • Recombinant vectors containing the above-described Fc-saxatilin or saxatilin-Fc were each transfected into 292E cells using PEI (polyethylenimine; Polysciences). Supernatants were harvested on day 2 or 5 of the cell culture after transfection and subjected to SDS-PAGE followed by transfer to NC membrane (Mipbrane; Millipore) and the secondary antibody anti-HuFc-HRP (1: 2000 dilution). ; thermo scientific) and reacted at room temperature for 1 hour. The NC membrane was washed three times with PBS / T and then subjected to western blotting by developing the film with ECL solution (FIG. 2).
  • the Agilent 2100 Bioanalyzer is an analytical instrument based on lab-on-a-chip technology that automatically analyzes protein size and concentration simultaneously. The analysis results can be confirmed in two forms (electrophorograms such as gel-electrophoresis images and chromatography) by conducting simultaneous separation and detection processes.
  • the lower blood cell layer was again centrifuged at 3,000 rpm for 10-15 minutes to obtain a supernatant (plasma).
  • the supernatant 600 ⁇ l was centrifuged at 10,000 rpm for 2 minutes to obtain platelet-poor plasma (PPP) from which blood cells and the like were removed, and the remaining plasma was mixed with the PRP separated in the previous step. It was used for.
  • Platelet aggregation assay was performed using an aggregometer (Aggregometer Model 700; Chrono-log).
  • First cuvettes 500 ⁇ l added cuvettes (# 312; Chrono-log) and PRP (480 ⁇ l) and saxatilin (10 ⁇ l) or recombinant saxatilin (Fc-saxatilin or saxatilin-Fc; 10 Insert a second cuvette with ⁇ l) into the flocculation meter and set the baseline, and then add 10 ⁇ l of ADP (final concentration, 20 ⁇ M; # 384; Chrono-log) to the second cuvette. Mix by pipetting and measure the degree of aggregation.
  • the degree of aggregation when only ADP was added was calculated as 100%, and the degree of aggregation of each sample was calculated as a relative value. That is, at 100%, the limit of aggregation rate (%) of each sample is calculated as the inhibition rate (%).
  • IC 50 concentration of motilin natural saksa for platelet aggregation is 150 nM
  • IC 50 concentration of motilin and Fc- saksa saksa motilin -Fc of the present invention was 196 nM and 362 nM, respectively ( Figure 4), which is a recombinant of the present invention It is shown that saxatilin exhibits good platelet aggregation activity comparable to saxatilin.
  • N-Hydroxysuccinimide-Rhodamine (# 46406, 10 mg / ml; Thermo Scientific Pierce, USA) in a reaction tube containing saxatilin, Fc-saxatilin and saxatilin-Fc (in PBS, pH 7.4) was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • Non-reacted NHS-rhodamine was removed using a PD10 salting column (# 17-0851-01; GE Healthcare, USA).
  • the concentration of rhodamine-conjugated protein was measured with the BCA Protein Assay Kit (# 23225; Thermo Scientific Pierce, USA) and then stored in dark at 4 ° C. until used for the experiment.
  • 80 ⁇ l of the obtained serum was placed in a black 96-well plate (# 43711; Thermo Scientific Pierce, USA) and microplate fluorometer; excitation wavelength of 552 nm and emission wavelength of 575 nm; Thermo Scientific Pierce, USA The half-life was calculated by fluorescence measurement using).
  • Rhodamine-conjugated Fc-saxatilin or saxatilin-Fc was diluted with PBS buffer to 0.5 mg / ml, and then nine-week-old ICR mice (5) were injected into the tail vein using an insulin syringe. . At this time, the administration dose was performed at 5 mg / 10 ml / kg (mouse weight). Blood was collected from the jugular vein of the mouse at 0, 5, 10, 30 and 60 minutes, and 2, 4 and 8 hours after administration of the protein and maintained at room temperature for 30 minutes to maintain blood conditions. Solidified. The blood was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C to separate supernatant (serum).
  • 80 ⁇ l of the obtained serum was placed in a black 96-well plate (# 43711; Thermo Scientific Pierce, USA) and measured for fluorescence using a microplate fluorometer (excitation wavelength of 552 nm and emission wavelength of 575 nm). Half-life was calculated.
  • Each integrin ( ⁇ IIb ⁇ 3 , ⁇ v ⁇ 3 , ⁇ M ⁇ 2 and ⁇ L ⁇ 2 ) was added to the 96-well plate at 100 ng / well and coated overnight at 4 ° C. After coating, the plate was washed three times with PBS-T (0.5% Tween 20). Blocking was performed at room temperature with 1% BSA (in PBS-T) solution for 2 hours. After blocking, three washes were performed with PBS-T. Eight sample solutions were prepared by serial dilution of saxatilin-Fc or Fc-saxatilin from 100 nM by 1/4.
  • Integrins ⁇ M ⁇ 2 and ⁇ L ⁇ 2 are integrins present in neutrophils, which interact with ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) present in endothelial cells to collect neutrophils in endothelial cells.
  • ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1
  • Fc-saxatilin bound strongly with integrin ⁇ M ⁇ 2 and ⁇ L ⁇ 2 (Kd, 6.9 ⁇ 10 ⁇ 9 M and 9.2 ⁇ 10 ⁇ 9 M).
  • saxatilin-Fc also binds to integrin ⁇ M ⁇ 2 and ⁇ L ⁇ 2 (Kd, 3.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M and 4.4 ⁇ 10 ⁇ 7 M) (FIG. 9).
  • a FeCl 3 (Sigma-Aldrich, USA) -induced carotid thrombus model was used to test the in vivo thrombolytic activity of saxatilin and saxatilin-Fc.
  • a midline cervical incision was performed to carefully dissect the left common carotid artery under a surgical microscope (SEILER, USA).
  • An ultrasonic Doppler flow probe (Transonic MA 0.7 PSB) was placed in the central portion of the total carotid artery (CCA).
  • Carotid artery blood flow was measured using an ultrasound TS420 blood flow meter (Transonic Instruments, Ithaca, NY) and an iWorx IX-304T data acquisition system (iWorx Systems, Inc., Dover, NH).
  • the basal blood flow of CCA was measured for 5 minutes as a control. After determination of control basal blood flow, the probe was removed.
  • Oxidative vascular damage caused by chemical stress was induced by contacting the outer surface of the exposed CCA midpoint with filter paper (700 ⁇ 500 ⁇ m; ADVANTEC, Japan) saturated with 50% FeCl 3 for 5 minutes. After removing the filter paper, CCA was washed with saline and the blood flow thereof was measured. Thrombus formation and arterial occlusion were determined by decreasing blood flow, and complete occlusion was defined as the absence of blood flow for 10 minutes.
  • the mean value of each group was calculated and expressed as a dose response curve (mean ⁇ standard deviation, FIG. 7). It was also compared with the thrombolytic effect (mean; red line, standard deviation; red region) of saxatilin 650 nmol / kg obtained in the previous study. On the other hand, the average of blood flow was calculated every 1 minute in each animal, and time-dependently confirmed representative patterns for the dose and the method of administration respectively (FIG. 6A). The mean value of all animals in each group was calculated and the change over time was shown as a continuous bar graph (mean ⁇ standard deviation).
  • the average percentage of blood flow in the administration groups compared to normal blood flow was as follows (FIG. 7): (a) saline administration group, 3.03 ⁇ 0.75%; (b) Fc-saxatilin 1.5 nmol / kg dose group, 17.81 ⁇ 12.22%; (c) Fc-saxatilin 7.5 nmol / kg dose group, 89.40 ⁇ 41.18%; (d) Fc-saxatilin 15 nmol / kg dose group, 59.94 ⁇ 16.97%; (e) Fc-saxatilin 150 nmol / kg dose group, 74.68 ⁇ 20.53%; And (f) saxatilin 650 nmol / kg administration group, 78.24 ⁇ 48.61% (mean ⁇ standard deviation).
  • Fc-saxatilin showed dose-dependent thrombolytic effects, mean thrombolytic effects by 7.5 nmol / kg, 15 nmol / kg, and 150 nmol / kg of Fc-saxatilin and for the last 10 minutes.
  • the thrombolytic effect was statistically similar when compared with the conventional saxatilin 650 nmol / kg.

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Abstract

본 발명은 증가된 반감기를 가지는 삭사틸린 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 삭사틸린 유도체는 모 단백질인 삭사틸린과 유사한 혈전 용해능을 가질 뿐 아니라 현저하게 증가된 단백질 반감기를 가지고, 이를 이용하여 FeCl3-유도된 경동맥 동물 모델에서 혈관 내 이미 형성된 혈전을 장기간 동안 매우 효율적으로 용해시킨다. 따라서, 본 발명의 삭사틸린 유도체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 관통 후 재협착도 일으키지 않고, 미세혈관까지 효과적으로 개방시켜 혈관의 협착 또는 폐색 질환(예컨대, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 동맥경화성 혈관질환, 관상동맥질환, 말초혈관질환, 등)의 치료에 매우 효과적이다.

Description

삭사틸린-Ｆｃ 융합 단백질 및 이의 용도
본 발명은 대한민국 보건복지부의 지원 하에서 과제번호 A085136에 의해 이루어진 것으로서, 상기 과제의 연구관리전문기관은 한국보건산업진흥원, 연구사업명은 “선도형특성화연구개발사업”, 연구과제명은 “선도형 뇌심혈관질환 융합연구사업단”, 주관기관은 연세대학교 산학협력단, 연구기간은 2012. 12. 01 ~ 2013. 11. 30 이다.
본 특허출원은 2013년7월 30일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2013-0090468호 및 2014년 7월 30일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2014-0097461호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 증가된 반감기를 가지는 삭사틸린 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다.
대부분의 뇌졸중은 주 또는 더 작은 뇌내 동맥의 혈전색전성폐색(thromboembolic occlusion)에 의해 야기된다(Wardlaw, Murray et al., 2009). 허혈성 뇌졸중의 경우, 빠른 혈전용해만이 불가피한 완전한 경색의 발병을 억제하기 위한 유일하게 확립된 치료방법이다(1995; 및 Choi, Bateman et al., 2006). 재조합 조직 플라스미누겐 활성인자(recombinant tissue plasmionogen activator, rt-PA)의 정맥내 투여에 의한 치료법은 허혈성 뇌졸중의 발병(onset) 후 4.5시간 내에 행할 수 있는 현재 유일하게 승인된 허혈성 뇌졸중에 대한 치료법이다(Caplan, Mohr et al., 1997; 및 Lopez-Yunez, Bruno et al., 2001). 하지만, 절반 이상의 환자들이 혈전용해 치료 후 성공적인 재관통(recanalization)을 이루는데 실패한다(Rha and Saver, 2007; 및 Lee et al., Stroke, 2007; 38: 192-193). 비록 폐색된 동맥이 혈전용해 치료법에 의해 성공적으로 재관통된다 할 지라도, 이러한 회복(benefits)은 재관류 손상(Hallenbeck and Dutka, 1990), 뇌출혈(Adams et al., 2005) 및 재폐색(Heo, Lee et al., 2003)의 위험에 의해 다시 약화된다. 또한, rt-PA는 신경독성을 가지는 것으로 보고되었다(Chen and Strickl, 1997; Wang, Tsirka et al., 1998; Nicole, Docagne et al., 2001; Yepes, Sandkvist et al., 2002; 및 Matys and Strickl, 2003).
재관통 전략은 그 효능이 증명되었지만, 적용가능성의 한계 및 잠재적인 부작용을 유발하기 때문에, rt-PA보다 더 효능이 좋은 신규한 혈전용해 제제(agents)를 개발하기 위한 많은 시도(efforts)가 있었다. 이러한 시도들은 t-PA의 변이체들, 동물 소스로부터 유래한 플라스미노겐 활성인자들 및 마이크로플라스민을 포함한다. 상술한 약물들(drugs)은 다음과 같은 목적을 지닌다: (a) 피브린 특이성의 증대; (b) 혈장 내 반감기의 연장; (c) 플라스미노겐 활성인자 억제제-1에 의한 억제능 감소; 및 (d) 신경독성의 회피. 여러 가지 약물들은 임상 실험을 완료하였으며, 몇몇 약물들은 현재 효능을 연구하고 있는 상태이다. 이러한 약물들은 혈전 내 피브린을 타겟으로 하며, 예를 드어 rt-PA, 유로키나제(urokinase) 등의 혈전용해제가 이에 해당된다. 하지만, 혈전은 혈소판-피브리노겐 상호작용에 의해 형성된다. 또한, 트롬빈, 백혈구 및 적혈구세포도 혈전의 구성성분들이다. 피브린을 타겟으로 하는 혈전용해 제제들에 대한 혈전의 저항성은 뇌졸중 환자들에서 보여지는 낮은 재개통율(recanalization rates)의 주된 이유들 중 하나이고, 이러한 현상은 혈소판-풍부 혈전에 의한 폐색에서 보다 더 일반적으로 일어날 수 있다. 이러한 측면에서, 혈소판을 타겟으로 하는 치료법이 개선된 혈전용해 효능을 위해 피브린을 타겟팅하는 치료법에 대한 선택적인 또는 추가적인 방법일 수 있다.
인테그린 패밀리의 멤버인 혈소판 당단백질(Platelet glycoprotein, GP) IIb/IIIa는 고밀도로 혈소판 막 표면에 존재한다(Shattil and Ginsberg, 1997). GPIIb/IIIa 수용체는 피브리노겐에 특이적으로 결합함으로써 혈소판 응집 경로의 최종 단계를 매개한다(Phillips, Charo et al., 1988). 따라서, 혈소판 GPIIb/IIIa 수용체를 타겟팅하는 것이 혈소판에 작용하는 약물 개발을 위한 대들보(mainstay)였다. 많은 혈소판 GPIIb/IIIa 길항제들이 개발되어 졌는데, 이들은 GP IIb/IIIa에 대한 인간-마우스 키메릭 항체의 Fab 단편(abciximab), RGD 펩타이드의 비-펩타이드 유사체들(티로피반 및 라미피반) 및 KGD 모티프를 포함하는 원형 헵타펩타이드 디스인테그린(eptifibatide)을 포함한다(Seitz, Meisel et al., 2004; Abou-Chebl, Bajzer et al., 2005; 및 Eckert, Koch et al., 2005). 상술한 GPIIb/IIIa 길항제들은 불안정성 협심증, 급성 심근경색, 그리고 경피적 관상동맥 성형술(percutaneous transfemoral coronary angioplasty, PTCA) 및 스텐트시술을 받은 환자들에게 효과적이었다. 뇌졸중의 경우, 압식시맙(abciximab)은 증상이 발병한 지 5시간 내지 6시간이 지나고 처리된 환자들에서 그 효능을 나타내지 못했다(Adams, Effron et al., 2008). 하지만, GPIIb/IIIa 길항제들은 재폐색된 뇌졸중 환자들에서 혈전을 용해시키고 선택된 환자들에 효과적이다(Heo, Lee et al., 2003; Seitz, Hamzavi et al., 2003; Seitz, Meisel et al., 2004; Eckert, Koch et al., 2005; 및 Chen, Mo et al., 2007).
한국 뱀독으로부터 정제되고 클로닝된 신규한 디스인테그린인 삭사틸린(Saxatilin)은 트리펩타이드 서열인 ArgGlyAsp(RGD)를 가지는데, 이 서열은 혈소판 GPIIb/IIIa 수용체에 대한 디스인테그린의 인지 부위(recognition site)이다(Hong, Koh et al., 2002; 및 Hong, Sohn et al., 2002). 삭사틸린은 혈소판 응집(Hong, Koh et al., 2002) 및 혈소판 활성화(Jang, Jeon et al., 2007) 상에 강력한 억제효능을 가져서, 혈전 생성을 방해하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 혈관 내 혈전의 생성을 억제하거나 또는 이미 생성된 혈전을 효과적으로 용해하여 부분적으로 또는 완전 폐색된 혈관을 재관통시킬 수 있는 혈전 용해제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 디스인테그린, 구체적으로는 뱀독으로부터 유래한 삭사틸린(saxatilin)과 면역글로블린 Fc 단편으로 이루어진 재조합 단백질(또는 삭사틸린 유도체)이 삭사틸린 단백질과 유사한 혈전 용해능을 가질 뿐 아니라 현저하게 증가된 단백질 반감기를 나타내고, 이를 이용한 FeCl3-유도된 경동맥 동물 모델에서 혈관 내 이미 형성된 혈전을 매우 효율적으로 용해시킬 수 있고 그 효능도 모단백질인 삭사틸린보다 장기간 지속될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 삭사틸린 유도체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 삭사틸린 유도체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터에 의해 형질전환된 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈전 용해용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 혈관 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료에 이용되는 삭사틸린 유도체의 용도를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 삭사틸린(saxatilin)과 면역글로블린(immunoglobulin)의 Fc 영역이 컨쥬게이션(conjugation)된 삭사틸린 유도체를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 삭사틸린 유도체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 재조합 벡터로 형질전환된 세포 또는 형질전환체를 제공한다.
본 발명자들은 혈관 내 혈전의 생성을 억제하거나 또는 이미 생성된 혈전을 효과적으로 용해하여 부분적으로 또는 완전 폐색된 혈관을 재관통시킬 수 있는 혈전 용해제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 디스인테그린, 구체적으로는 뱀독으로부터 유래한 삭사틸린과 면역글로블린 Fc 단편으로 이루어진 재조합 단백질(또는 삭사틸린 유도체)이 삭사틸린 단백질과 유사한 혈전 용해능을 가질 뿐 아니라 현저하게 증가된 단백질 반감기를 나타내고, 이를 이용한 FeCl3-유도된 경동맥 동물 모델에서 혈관 내 이미 형성된 혈전을 매우 효율적으로 용해시킬 수 있고 그 효능도 모단백질인 삭사틸린보다 장기간 지속될 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 삭사틸린 유도체, 즉 삭사틸린(서열목록 제1서열 및 서열목록 제2서열)과 Fc의 융합 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 삭사틸린과 면역글로블린(immunoglobulin)의 Fc 영역으로 구성된 단백질로, 혈전 내 존재하는 인테그린, 구체적으로는 혈전을 구성하는 혈소판 표면의 GP(glycoprotein)IIb-IIIa에 경쟁 결합(competition binding)하여 혈소판 등을 피브리노겐 등 혈전의 구성 성분으로부터 떼어 내는 원리로 혈전을 효율적으로 분해할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 모단백질인 삭사틸린과 유사한 혈전용해능을 가진다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 혈소판 응집에 대한 IC50 값이 100-500 nM, 바람직하게는 100-250 nM이다.
구체적으로는, 모단백질인 삭사틸린, 그리고 본 발명의 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc의 IC50 값은 각각 150 nM, 196 nM 및 362 nM이었다(참고: 도 4). 본 명세서에서 사용되는 용어 "IC50 값(half maximal inhibitory concentration)"은 생물학적 또는 생화학적 활성을 억제하는 화합물의 효능을 평가하는 지표로, 특정 약물 또는 다른 물질(예컨대, 본 발명의 삭사틸린 유도체)가 특정 생물학적 과정(예컨대, 혈전 용해) 또는 상기 과정에 포함된 구성성분(예컨대, 효소, 세포 수용체, 등)을 절반까지 억제하는 데 필요한 정량적인 농도 측정치를 제공한다. 통상적으로, 약리학적 연구에서 길항제로서 약물의 강력함(potency)을 평가하는 데 이용된다. 한편, 혈전용해능은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 피브린 플레이트 어세이 방법(Astrup A and Mullertz S. The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity. Arch Biochem Biophys 40: 346-351(1952)), 혈전분해를 나타내는 D-다이머(D-dimer)를 검출하는 방법(미국공개 특허번호 제US2009/0305301 A1호), 방사선 동위원소를 이용하는 방법(국제공개 특허번호 제WO94/22494호), 혈관 내 혈전무게 측정법, 혈전용해 후 유리된 분쇄물의 탁도(turbidity) 측정법 등을 이용하여 측정될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 중성구(neutrophil)에 존재하는 integrin αMβ2 에 대하여 1 x 10-8 내지 1 x 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 중성구(neutrophil)에 존재하는 integrin αLβ2 에 대하여 1 x 10-8 내지 1 x 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체의 처리량은 1-20 mg/kg이고, 보다 구체적으로는 3-15 mg/kg이며, 가장 구체적으로는 5-10 mg/kg이다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 적은 투여량으로 완전 폐색된 혈관의 재관통에 효과를 나타냈다(참고: 도 6a 내지 도 6c). 도 6에서 확인할 수 있듯이, 130 nmol/kg의 삭사틸린, Fc-삭사틸린 또는 삭사틸린-Fc 처리는 완전 폐색된 혈관의 재관통에 약 30% 정도의 혈류량 회복 효과를 나타냈다. 더 나아가, 삭사틸린 처리 그룹은 약 90분 쯤 재폐색이 진행되었으나, Fc-삭사틸린 또는 삭사틸린-Fc 처리 그룹은 지속적으로 재관통 효과를 나타냈다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 경구 또는 비경구, 구체적으로는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 볼루스(bolus) 주입, 정맥내 주입, 동맥내 주입, 근육 주입, 피하 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 가장 구체적으로는 볼루스 주입이다.
또한, 혈관의 재관통 효과를 가지는 약물(예컨대, 본 발명의 삭사틸린 유도체)은 적합한 지속시간을 가지는 것이 바람직하며, 구체적으로는 10분 내외의 지속시간을 가지는 것이 임상적으로 가장 적합하고 유효하다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체에 포함된 면역글로블린(immunoglobulin)의 Fc 영역은 삭사틸린의 N-말단 또는 C-말단에 컨쥬게이션되고, 보다 구체적으로는 N-말단에 컨쥬게이션된다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 N-말단에 리더 서열(leader sequence)을 추가적으로 포함한다.
통상적으로, 목적 단백질에 면역글로블린의 Fc 영역이 결합된 융합 단백질은 모 단백질보다 효능이 낮게 나타나거나, 또는 반감기 증가 효과가 그리 크지 않다. 이에 반해, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 삭사틸린 모 단백질과 유사한 혈전 용해 활성을 가질 뿐 아니라, 삭사틸린 모 단백질보다 훨씬 증가된 반감기를 나타냈다(참고: 도 5a 내지 도 5c). 구체적으로는, 본 발명의 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc의 반감기는 각각 8.6분 및 12.5분으로, 모단백질인 삭사틸린의 반감기(2.0분) 보다 훨씬 더 길었다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 모단백질인 삭사틸린보다 4배 이상 증가된 반감기를 가지고, 보다 구체적으로는 약 4-6.5배의 증가된 반감기를 가진다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Fc 영역"은 면역글로블린 연쇄 불변 영역의 카르복실 말단 부분을 의미하고, 구체적으로는 면역글로블린 중쇄 불변 영역 또는 이의 일부를 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 삭사틸린 유도체의 제조에 이용될 수 있는 면역글로블린 Fc 영역은 (a) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인; (b) CH1 도메인 및 CH2 도메인; (c) CH1 도메인 및 CH3 도메인; (d) CH2 도메인 및 CH3 도메인; 또는 (e) 2개 이상의 도메인과 면역글로블린 힌지 영역의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 삭사틸린 유도체의 제조에 이용된 면역글로블린 Fc 영역은 인간 면역글로블린 Fc 영역(GenBank Accession No., CAA49866.1) 및 이의 단편들(예컨대, 서열목록 제7서열)을 포함한다.
또한, 본 발명은 인간 면역글로블린 Fc 영역 이외에도 GenBank 및/또는 EMBL 데이터베이스에 개시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열, 예를 들어 AF045536.1(Macaca fuscicularis), AF045537.1(Macaca mulatta), AB016710(Felix catus), K00752(Oryctolagus cuniculus), U03780(Sus scrofa), Z48947(Camelus dromedarius), X62916(Bos taurus), L07789(Mustela vision), X69797(Ovis aries), U17166(Cricetulus migratorius), X07189(Rattus rattus), AF57619.1(Trichosurus vulpecula) 또는 AF035195(Monodelphis domestica) 등을 포함하는 다른 면역글로블린 Fc 영역 또는 이의 단편 서열도 이용될 수 있다.
더 나아가, 면역글로블린 중쇄 불변 영역 내의 아미노산 서열의 치환 또는 결실이 본 발명의 삭사틸린 유도체 제조에 유용할 수 있다. 상기 치환 또는 결실을 통해 제조된 Fc 변이체들은 융합 단백질의 안정성, 용해성 및 구조적 무결성(integrity) 등을 개선시켜 보다 최적화된 융합 단백질의 제조에 유용하다.
본 발명은 서열목록 제2서열의 삭사틸린(saxatilin)과 서열목록 제7서열의 면역글로블린(immunoglobulin)의 Fc 영역으로 구성된 융합 단백질(서열목록 제4서열 또는 서열목록 제6서열)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 제공하며, 구체적으로는 서열목록 제3서열 및 서열목록 제5서열로 예시되어 있지만, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열이라면 어떠한 것도 이용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.
또한, 본 발명의 융합 단백질은 다양한 검출 가능한 표지 인자(tag)로 태깅될 수 있으며, 상기 택은 His(n), 플랙(flag), c-Myc, HA, V5, VSV-G 및 HSV을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "택(tag)"은 3-40개의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드 서열을 의미하며, 본 발명의 융합 단백질, 펩타이드, 단백질 리간드(예컨대, 본 발명의 융합 단백질) 또는 비-펩타이드 리간드에 특이적인 결합 친화성(affinity)을 부여한다. 또한, 본 발명에서 이용될 수 있는 택은 형광(fluorescent) 택, 발광(luminescent) 택 및 발색(chromogenic) 택을 포함할 수 있다.
본 발명의 삭사틸린 유도체는 (a) 상기 삭사틸린 유도체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여 저-비용으로 대량 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 본 발명의 재조합 발현벡터에서 발현대상물질(즉, 삭사틸린-Fc 융합 단백질)-인코딩 뉴클레오타이드 서열은 상기 프로모터에 작동적으로 연결된다. 본 명세서에서 언급되는 용어 "작동적으로 결합된(operatively linked)"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터 서열, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명의 발현 벡터가 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL프로모터, pR프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 이때, 박테리아 복제 개시점은 긴 DNA 삽입물(inserts)의 안정적인 박테리아 복제에 유용한 당업계에 잘 알려진 복제 개시점들로부터 선택될 수 있으며, ColE1, F-인자(F-factor) 및 P1 레플리콘(replicon)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 박테리아 선택마커는 당업계에 알려진 박테리아 선택마커 유전자를 이용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 선택마커 유전자는 암피실린, 카나마이신, 테트라사이클린, 제오신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 클로람페니콜 같은 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자들을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위(Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 벡터가 진핵세포에 적용되는 경우에 이용될 수 있는 프로모터는 본 발명의 발현대상물질의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, CMV(cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 이용되는 재조합 벡터는 폴리 아네닐화 서열을 포함한다(예: 소성장 호르몬 터미네이터 또는 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열).
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법(Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있으며, 진핵세포인 경우, 트랜스덕션(transduction), 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 마이크로인젝션, 유전자총(particle bombardment), YAC에서 이용되는 효모 구형질체/세포 융합, 식물세포에서 이용되는 아그로박테리움-매개된 형질전환 등을 이용하여 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 형질전환된 동물세포의 제조는 당업계에 통상적으로 공지된 유전자 전이방법에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어, 전기동공법(electroporation), 리포좀-매개 전이방법(Wong, 등, 1980) 및 레트로바이러스-매개 전이방법(Chen, H.Y., et al., (1990), J. Reprod. Fert. 41:173-182; Kopchick, J.J. et al., (1991) Methods for the introduction of recombinant DNA into chicken embryos. In Transgenic Animals, ed. N.L. First & F.P. Haseltine, pp.275-293, Boston; Butterworth-Heinemann; Lee, M.-R. and Shuman, R. (1990) Proc. 4th World Congr. Genet. Appl. Livestock Prod. 16, 107-110)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상술한 형질전환된 동물세포는 포유동물-유래된 세포이다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 외래 유전자가 도입된 동물세포 를 선택함에 있어, 상기 외래 유전자는 선택 마커로서 바람직하게는 항생제 내성 유전자를 포함한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 선택 마커는, 진핵세포에 항생제를 부여하는 어떠한 유전자도 가능하며, 예컨대, 네오마이신 및 카나마이신 내성 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상술한 삭사틸린 유도체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈전 용해용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 혈전 용해용 조성물을 포함하는 혈관의 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로써 상술한 본 발명의 삭사틸린 유도체를 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 조성물은 이미 생성되어 덩어리진 혈전을 효과적으로 용해하여 다양한 혈관 협착 또는 폐색 질환의 치료에 간편하고 효율적으로 적용될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 이미 생긴 혈전을 녹여내어 혈관을 효과적으로 뚫는 원리로 혈관 협착 또는 폐색 질환 치료에 적용될 수 있다.
본 명세서의 용어 "폐색(occlusion)"은 혈관이 완전히 막히거나 또는 부분적으로 막혀 혈관이 좁아져 있는 상태를 포괄하는 용어이다. 본 발명에서 언급된 폐색의 정도는 측정된 혈류량에 기초하여 판단될 수 있다. 즉, 폐색의 정도는 부분적 폐색(partial occlusion) 또는 완전 폐색(complete occlusion)으로 분류되며, 부분적 폐색은 정상 혈류량(baseline blood flow)의 40-80% 수준으로 감소된 경우를 의미하며, 완전 폐색은 90-100% 수준으로 감소된 경우를 의미한다.
혈관 내 혈류량을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 실시될 수 있으며, 예를 들어 초음파 희석법(Lee KH, Park JY, Choi SJ, Kim JK, Hwang SD, Joh JH, Clinical utility of access blood flow measurement by ultrasound dilution in hemodialysis patients. Korean J Nephrol, 24: 265-273(2005)), 도플러 초음파법(Strauch B, O'Connoll R, Geoly K, Forcasting thrombosis of vascular access with doppler flow imaging. Am J Kidney Dis, 19: 554-557, (1992)), 글루코오스 펌프 테스트(glucose pump test, GPT; Magnasco A, Alloatti S, Martinoli C, Solari P, Glucose pump test: a new method for blood flow measurements. Nephrol Dial Transplant, 17: 2244-2248(2002)), 근적외선(700-1000 nm)을 이용하는 방법(Buunk G, van der Hoeven JG, Meinders AE, A comparison of near-infrared spectroscopy and jugular bulb oximetry in comatose patients resuscitated from a cardiac arrest. Anesthesia, 53: 13-19(1998)), 열전도혈류측정법(Ogata N, Fournier JY, Imhof HG, et al., Thermal diffusion blood flow monitoring during aneurysm surgery. Acta Neurochir(Wien), 138: 726-731(1996)) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명에서 혈류량 측정 방법은 초음파를 이용한 도플러 초음파법을 이용한다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 동물은 특별하게 제한되지 않으며, 구체적으로는 포유동물이고, 보다 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개 및 고양이이고, 보다 더 구체적으로는 인간 및 마우스이다.
본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 상기 동물 혈관은 동맥, 정맥, 모세혈관을 포함하고, 보다 구체적으로는 대동맥, 경동맥, 쇄골하 동맥, 복강동맥, 장간막동맥(mesenteric arteries), 신동맥, 장골동맥, 소동맥, 모세혈관, 소정맥을 포함하며, 가장 바람직하게는 대동맥 및 경동맥을 포함한다.
본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환은 다양한 혈관 협착 또는 폐색 질환들을 포함하며, 예컨대 뇌혈관질환(cerebrovascular disease, CVD), 심혈관질환(cardiovascular disease), 동맥경화성 혈관질환(arteriovascular disease), 관상동맥질환(coronary artery disease, CAD), 말초혈관질환(peripheral artery disease, PAD) 등이 있으며, 보다 구체적으로는 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증, 열공성 뇌경색, 급성 관동맥 증후군, 협심증, 대동맥 협착증, 심근경색증, 편두통, 각차단, 뇌허혈, 급성 허혈성 심혈관질환(acute ischemic arteriovascular event), 혈전성 정맥염, 정맥혈전색전증, 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis), 폐색전증(pulmonary embolism), 말초혈관질환, 혈관성 두통, 아테롬성 동맥경화증, 혈관경련, 재협착증, 기구 혈관형성술 이후 재협착증 및 혈관염에 의한 혈관 폐색증을 포함하고, 가장 구체적으로는 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증 및 심근경색증을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "뇌혈관질환(cerebrovascular disease, CVD)"은 산소-풍부 혈액을 안면 및 뇌에 공급하는 혈관에서 일어나는 동맥경화성 혈관질환으로, 일반적으로 CAD 및/또는 PAD(peripheral artery disease)와 함께 발생하는 동반질환(comorbid disease) 뿐 아니라, 허혈성 질환 또는 혈류량의 부족을 야기하는 질환도 포함한다. 예를 들어, CVD는 허혈성 뇌혈관질환, 급성 뇌경색, 뇌졸중, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중, 정맥류, 경증인지장애(mild cognitive impairment, MCI) 또는 일과성 허혈발작(transient ischemic attacks, TIA)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "심혈관질환(cardiovascular disease)" 또는 "동맥경화성 혈관질환(arteriovascular disease)"은 심장, 심장 판막, 혈액 및 몸의 혈관구조(vasculature)에 영향을 미치는 수많은 상태를 분류하는데 이용되는 일반적인 용어로, 심장 또는 혈관에 영향을 미치는 질병들을 포함한다. 구체적으로는, 대사증후군, 증후군 X, 아테롬성 동맥경화증, 죽상혈전증, 관상동맥질환, 안정 및 불안정 협심증, 뇌졸중, 대동맥 협착증 또는 대동맥류 같은 대동맥 질환, 뇌혈관질환, 말초혈관질환 또는 급성 허혈성 동맥경화성 이벤트를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특히, 동맥경화성 혈관질환(arteriovascular disease)은 비-허혈성 질환보다는 허혈성 질환 또는 허혈유발성(proischemic) 질환을 의미한다.
본 명세서에서 언급하는 용어 "관상동맥질환(coronary artery disease, CAD)"은 심근에 혈액을 공급하는 동맥(관상동맥)이 죽상경화(atherosclerotic), 칼슘 침전에 의한 경화 및/또는 좁아져서 발생되는 동맥경화성 혈관질환을 의미한다. CAD는 심근으로의 혈류량 감소를 초래하며 이에 따라 심근이 충분한 양의 산소를 공급받지 못하고 궁극적으로 괴사(necrosis)를 야기한다. CAD는 급성 관상동맥증후군, 심근경색(심장마비), 협심증(안정 및 불안정) 또는 심장으로 혈액을 공급하는 혈관에서 발생하는 아테롬성 동맥경화증 및 죽상혈전증을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "말초혈관질환(peripheral artery disease, PAD)"은 심장 및 뇌 이외의 곳에서 발생하는 아테롬성 동맥경화증 및 죽상혈전증 같은 질환으로 일반적으로 CAD와 함께 발생하는 동반질환(comorbid disease)을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적 유효량"은 상술한 삭사틸린 유도체의 효능 또는 활성(즉, 혈전 용해능)을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 볼루스 주입, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 가장 구체적으로는 혈관 내로 직접 주입되는 방식(예컨대, 볼루스 주입 또는 정맥내 주입)으로 투여될 수 있다. 혈관 내로 직접 투입되는 방식이란 동맥, 정맥, 모세혈관을 포함하는 혈관, 예컨대 대동맥, 경동맥, 쇄골하동맥, 복강동맥, 장간막동맥(mesenteric arteries), 신동맥, 장골동맥, 소동맥, 모세혈관, 소정맥을 포함하는 혈관 내로 투여되는 것을 의미하며 혈전이 생긴 혈관 부위에 따라 적절하게 그 투여방법을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류 및 처방의의 결정에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 조성물에 포함되는 유효성분인 삭사틸린 유도체의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요기간 등을 고려하여 결정할 수 있으며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다. 본 발명의 어떤 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1,000 mg/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 단순히 혈전 생성을 예방하는 원리로 상기 질병들을 예방 또는 치료하는 것이 아니라, 이미 생긴 혈전을 녹여내어 혈관을 효과적으로 뚫는 원리로서 상기 혈관 협착 또는 폐색성 질환을 치료하는 데 그 특징이 있다. 예컨대 뇌경색의 경우, 혈전 생성을 예방하는 방식의 약제학적 조성물(예컨대, 아스피린)은 이미 잘 알려져 있다. 그러나, 일단 혈전이 생성되고 뇌혈관을 폐색시켜 뇌경색이 발병한 이상 이를 효과적으로 치료할 수 있는 약제학적 조성물은 거의 없는 실정이며, 플라스미노겐 활성인자(recombinant tissue plasminogen activator, rt-PA)의 정맥내 투여에 의한 치료법은 뇌경색 발병 후 3시간 내에 행할 수 있는 현재 유일하게 승인된 뇌경색 치료법이다. 하지만, 플라스미노겐 활성인자를 이용한 치료법의 경우 상기와 같은 시간적 제한을 받을 뿐만 아니라, 절반 이상의 환자들이 혈전용해 치료 후 성공적인 재관통(recanalization)을 이루는데 실패하는 현실에서, 이미 생성된 혈전을 효과적으로 용해해 낼 수 있는 본 발명의 약제학적 조성물은 일단 발병한 혈관의 협착 또는 폐색 질환의 치료에 있어 매우 현실적이고 획기적인 방안이라 할 것이다. 그 뿐만 아니라, 본 발명의 혈관 협착 또는 폐색 질환의 치료용 약제학적 조성물은 미세 혈관의 폐색도 효과적으로 치료하며 또한 재협착도 일으키지 않는다는 점에서 그 가치가 크다고 할 것이다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 삭사틸린 유도체의 약제학적 유효량을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 혈관의 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 혈관의 협착 또는 폐색 질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증, 열공성 뇌경색, 급성 관동맥 증후군, 협심증, 대동맥 협착증, 심근경색증, 편두통, 각차단, 뇌허혈, 급성 허혈성 심혈관질환(acute ischemic arteriovascular event), 혈전성 정맥염, 정맥혈전색전증, 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis), 폐색전증(pulmonary embolism), 말초혈관질환, 혈관성 두통, 아테롬성 동맥경화증, 혈관경련, 재협착증, 기구 혈관형성술 이후 재협착증 및 혈관염에 의한 혈관 폐색증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 예방 또는 치료 방법은 상기 본 발명의 다른 일 양태인 ‘삭사틸린 유도체’를 대상에 투여함으로써 이루어지므로, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 혈관의 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료를 위한 삭사틸린 유도체의 용도를 제공한다.
본 발명의 용도는 상기 본 발명의 다른 일 양태인 ‘삭사틸린 유도체’를 이용하는 용도에 관한 것이므로, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 증가된 반감기를 가지는 삭사틸린 유도체 및 이의 용도에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 삭사틸린 유도체는 모 단백질인 삭사틸린과 유사한 혈전 용해능을 가질 뿐 아니라 현저하게 증가된 단백질 반감기를 가지고, 이를 이용하여 FeCl3-유도된 경동맥 동물 모델에서 혈관 내 이미 형성된 혈전을 장기간 동안 매우 효율적으로 용해시킨다.
(c) 따라서, 본 발명의 삭사틸린 유도체를 유효성분으로 포함하는 조성물은 관통 후 재협착도 일으키지 않고, 미세혈관까지 효과적으로 개방시켜 혈관의 협착 또는 폐색 질환(예컨대, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 동맥경화성 혈관질환, 관상동맥질환, 말초혈관질환, 등)의 치료에 매우 효과적이다.
도 1은 각각 pYK603 벡터 및 pYK602 벡터의 멀티클로닝 위치에 클로닝된 삭사틸린 유도체의 구조를 도식적으로 나타내는 도면이다. 구성성분들 간의 거리 또는 제한효소 위치들 간의 거리는 비율에 따라 표시되어 있지 않다. leader(리더 서열), 면역글로블린 G2a 감마 체인.
도 2는 본 발명의 삭사틸린 유도체의 발현을 확인한 웨스턴 블랏팅 결과이다. 정제된 단백질의 안정성을 확인하기 위해, 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전물의 생성 유무를 조사하였다(레인 2 및 레인 4). 그 결과, 본 발명의 삭사틸린 유도체는 매우 안정하였다(침전물이 생기지 않았음).
도 3a 및 도 3b는 각각 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc의 정제 결과를 보여주는 도면으로, 겔-전기영동 이미지(좌측 패널) 및 전기이동그램(electropherogram; 우측 패널)이 제시된다.
도 4는 모단백질인 삭사틸린 및 본 발명의 삭사틸린 유도체(Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc)의 혈소판 응집 억제 활성을 측정한 결과이다. 혈소판 응집 어세이를 위해, 모단백질인 삭사틸린과 Fc-삭사틸린은 50, 100, 150, 200, 250 및 300 nM을 사용하였으며, 삭사틸린-Fc는 200, 300, 350, 400, 500 및 600 nM을 사용하였다.
도 5a 내지 도 5c는 각각 모단백질인 삭사틸린 및 본 발명의 삭사틸린 유도체(Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc)의 반감기를 측정한 결과이다.
도 6은 삭사틸린 650 nmol/kg의 효과와 삭사틸린 유도체의 혈전용해 효과를 비교한 결과를 나타낸다. 또한, 혈류량을 측정함으로써 재관통 여부 및 그 정도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 용량-반응 연구에서 얻어진 각 그룹의 평균값에 대한 용량반응곡선을 나타낸다. 선행연구에서 얻어진 삭사틸린 650 nmol/kg의 혈전용해효과(평균; 적색 선, 표준편차; 적색 영역)와 비교한 결과를 나타내었다.
도 8은 혈전용해 효과를 측정한 2시간 중 마지막 10분 동안의 정상혈류량 대비 혈류량 평균 백분율을 분석한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험방법 및 실험결과
재조합 삭사틸린(saxatilin) 단백질 발현 벡터 제작, 발현 및 정제
Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc 단백질 발현 벡터 제작
재조합 삭사틸린 단백질을 발현시키기 위하여, 본 발명자들은 하기 표 1에 기재된 프라이머쌍(삭사틸린-F 및 삭사틸린-R)을 이용하여 PCR을 실시하였다. 얻어진 PCR 산물을 제한효소 sfiI(thermo scientific)으로 절단하여 pYK603 벡터 및 pYK602 벡터(에이앤알쎄라퓨틱스)에 T4 DNA 리가제(thermo scientific)를 이용하여 클로닝하여 각각 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc 단백질 발현용 재조합 벡터를 제조하였다(도 1).
표 1 Fc-삭사틸린의 발현 벡터용 프라이머 서열(제한효소 절단 서열, 밑줄로 표시됨).
프라이머 이름 서열(5' -> 3')
삭사틸린-F agta ggccgtgggggcc gaggccggagaagaatgtgactgt
삭사틸린-R gcat ggccgacgcggcc aaggcatggaagggatttctgggaca
Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc 단백질 발현 확인
상술한 Fc-삭사틸린 또는 삭사틸린-Fc를 포함하는 재조합 벡터를 각각 292E 세포에 PEI(polyethylenimine; Polysciences)를 이용하여 트랜스펙션(transfection)시켰다. 트랜스펙션 후 세포 배양 2일 또는 5일 째에 상층액(supernatant)을 수거하여 SDS-PAGE를 실시한 후 NC 막(membrane; Millipore)으로 옮기고 2차 항체인 항-HuFc-HRP(1:2000 희석; thermo scientific)와 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 NC 막을 PBS/T로 3번에 걸쳐서 세척한 후 ECL 용액으로 필름을 현상하여 웨스턴 블랏팅을 실시하였다(도 2).
Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc 단백질 정제
상술한 바와 같이 트랜스펙션된 293E 세포의 배양에서 3, 5 또는 7일 째의 배양 상층액을 0.22 μm 탑-필터(top-filter; Millipore)를 사용하여 여과하였다. 여과된 상층액을 500 μl 단백질 A 비드(GE healthcare가 패킹되어 있는 5 ml 컬럼에 로딩하여 비드와 결합시켰다. 펌프(peri-start pump; Bio-rad)를 사용하여 0.9 ml/min의 유속으로 4℃에서 하룻밤 동안 결합시킨 후, 100 ml 이상의 PBS로 세척하고 0.1 M 글라이신(Glycine)-HCl을 이용하여 6개의 분획(fraction)으로 용출시켰다. 상기 용출액들은 1 M Tris(pH 9.0) 용액으로 중화(neutralization)시켰다. 이후, 단백질의 양을 정량하고 2-3개의 분획에 포함된 단백질들을 아미콘 울트라 원심분리 필터(amicon ultra centrifugal filter; Millipore)를 사용하여 농축시켰다. PBS로 10번 이상 완충액을 교환시켰다.
얻어진 단백질 농축액의 순도(purity)는 Agilent 2100 생체분석기(Bioanalyzer)를 이용하여 분석하였다(도 3a 및 도 3b). Agilent 2100 생체분석기는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip) 기술을 기반으로 한 분석 장비로 단백질의 크기와 농도를 동시에 자동으로 분석할 수 있는 시스템으로, 마이크로칩 안에서 샘플 처리, 분리 및 검출 전-과정을 동시에 수행하여 신뢰성 높은 데이터를 두 가지 형태(겔-전기영동 이미지 및 크로마토그래피 같은 전기이동그램(electropherogram))으로 분석결과를 확인할 수 있다.
Fc - 삭사틸린 및 삭사틸린 - Fc 단백질의 혈소판 응집 억제능
졸레틸(zoletil 50; VirBac)과 럼푼(rompun; Bayer)을 3:1의 비율로 혼합한 후, 생리식염수로 10배 희석시킨 마취 용액을 제조하였다. 수컷 ICR(Institute of Cancer Research) 마우스((주)오린엔트 바이오, 대한민국)의 체중을 측정하여 g 당 10 μl의 상기 마취용액을 복강내 주입하였다. 마취된 마우스를 고정시켜 개복한 후, 복대정맥에서 혈액을 채취하여 소듐 시트레이트 튜브(sodium citrate tube, #363048; BD Science)에 넣고 잘 섞어주었다. 상기 채취된 혈액을 15 ml 튜브로 옮겨 1,000 rpm으로 15분 동안 원심분리시켜 혈소판(platelet)을 포함하는 혈장층(platelet-rich plasma, PRP)을 수득하였다. 또한, 아래쪽의 혈구층을 다시 3,000 rpm으로 10-15분 동안 원심분리시켜 상층액(혈장)을 얻었다. 상기 상층액(600 μl)을 10,000 rpm으로 2분 동안 원심분리시켜 혈구세포 등이 제거된 PPP(platelet-poor plasma, PPP)를 수득하고, 남은 혈장은 이전 단계에서 분리한 PRP와 혼합하여 이후 실험에 이용하였다. 혈소판 응집 어세이는 응집측정기(Aggregometer Model 700; Chrono-log)를 이용하여 실시하였다. PPP(500 μl)을 첨가한 첫 번째 큐벳(cuvettes, #312; Chrono-log)과 PRP(480 μl)과 삭사틸린(10 μl) 또는 재조합 삭사틸린(Fc-삭사틸린 또는 삭사틸린-Fc; 10 μl)을 첨가한 두 번째 큐벳(cuvette)을 응집측정기에 꽂고 기준선(baseline)을 셋팅한 후, 상기 두 번째 큐벳에 10 μl의 ADP(최종농도, 20 μM; #384; Chrono-log)를 넣어 파이펫팅(pipetting)으로 혼합시키고 응집 정도를 측정하였다. 이때, ADP만을 넣었을 때의 응집 정도를 100%로 산정하고 이에 대한 상대적인 수치로 각 시료의 응집 정도를 계산하였다. 즉, 100%에서 각 시료의 응집율(%)을 제한 값이 억제율(%)로 계산된다. 혈소판 응집에 대한 천연 삭사틸린의 IC50 농도는 150 nM이고, 본 발명의 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc의 IC50 농도는 각각 196 nM 및 362 nM이었는데(도 4), 이는 본 발명의 재조합 삭사틸린이 삭사틸린과 비교될 정도의 우수한 혈소판 응집 활성을 나타낸다는 것을 보여준다.
Fc - 삭사틸린 및 삭사틸린 - Fc 단백질의 반감기
삭사틸린, Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc(in PBS, pH 7.4)을 포함하는 반응 튜브에 NHS-로다민(N-Hydroxysuccinimide-Rhodamine; #46406, 10 mg/ml; Thermo Scientific Pierce, 미국)을 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. PD10 탈염 칼럼(salting column)(#17-0851-01; GE Healthcare, 미국)을 이용하여 반응하지 않은(non-reacted) NHS-로다민을 제거하였다. 로다민-컨쥬게이션된(conjugated) 단백질의 농도를 BCA 단백질 어세이 키트(#23225; Thermo Scientific Pierce, 미국)로 측정한 후, 실험에 이용할 때까지 4℃에서 암 조건으로 보관하였다.
로다민-표지된 삭사틸린을 0.5 mg/ml이 되도록 PBS 완충액으로 희석시킨 후, 8-주령된 ICR 마우스(3마리; (주)오린엔트 바이오, 대한민국)에 인슐린 주사기(#32882; BD Science, 미국)를 이용하여 꼬리정맥에 주입하였다. 이때, 투여 용량은 5 mg/10 ml/kg(마우스 무게)으로 실시하였다. 상기 단백질 투여 후 0분, 5분, 10분, 20분, 40분 및 80분 째에 상기 마우스의 경정맥에서 혈액을 채취하여 상온에서 30분 동안 암 조건으로 유지시켜 혈액을 응고시켰다. 상기 혈액을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리시켜 상층액(혈청)을 분리하였다. 상기 수득된 혈청 80 μl를 검은색 96-웰 플레이트(#43711; Thermo Scientific Pierce, 미국)에 넣고 마이크로플레이트 형광측정기(microplate fluorometer; 552 nm의 여기 파장 및 575 nm의 발광 파장; Thermo Scientific Pierce, 미국)를 이용하여 형광 측정하여 반감기를 계산하였다.
로다민-컨쥬게이션된 Fc-삭사틸린 또는 삭사틸린-Fc를 0.5 mg/ml이 되도록 PBS 완충액으로 희석시킨 후, 9-주령된 ICR 마우스(5마리)에 인슐린 주사기를 이용하여 꼬리정맥에 주입하였다. 이때, 투여 용량은 5 mg/10 ml/kg(마우스 무게)으로 실시하였다. 상기 단백질 투여 후 0분, 5분, 10분, 30분 및 60분, 그리고 2시간, 4시간 및 8시간 째에 상기 마우스의 경정맥에서 혈액을 채취하여 상온에서 30분 동안 암 조건으로 유지시켜 혈액을 응고시켰다. 상기 혈액을 4℃에서 12,000 rpm으로 10분 동안 원심분리시켜 상층액(혈청)을 분리하였다. 상기 수득된 혈청 80 μl를 검은색 96-웰 플레이트(#43711; Thermo Scientific Pierce, 미국)에 넣고 마이크로플레이트 형광측정기(microplate fluorometer; 552 nm의 여기 파장 및 575 nm의 발광 파장)를 이용하여 형광 측정하여 반감기를 계산하였다.
그 결과, 로다민-컨쥬게이션된 삭사틸린, Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc의 반감기는 각각 2.0분, 8.6분 및 12.5분이었다(도 5a 내지 도 5c). 따라서, 본 발명의 Fc-삭사틸린 및 삭사틸린-Fc는 삭사틸린과 비교하여 현저하게 증가된 반감기를 가진다는 것을 확인할 수 있었다.
인테그린과 삭사틸린의 결합
96-웰 플레이트에 각 인테그린(αⅡbβ3, αvβ3, αMβ2 및 αLβ2)을 100 ng/웰씩 첨가하고, 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 후 PBS-T(0.5% Tween 20)로 3차례 세척하였다. 1% BSA(in PBS-T) 용액으로 상온에서 2시간 동안 블로킹(blocking)하였다. 블로킹 후 PBS-T로 3차례 세척하였다. 삭사틸린-Fc 또는 Fc-삭사틸린을 100 nM 부터 1/4씩 연속 희석하여 8개의 샘플 용액을 제조하였다.
상기 샘플 용액을 100 ㎕씩 3 중으로 각 웰에 로딩하고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-T로 3차례 세척하였다. 항-인간 IgG(Fc) 컨쥬게이티드 HRP 항체를 1:2,000으로 희석하여 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 PBS-T로 4차례 세척하였다. TMB 용액을 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시킨 후, 종결 용액(stop solution, 0.5 M H2SO4)를 첨가하여 반응을 종결시키고 450 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 중성구 및 내피세포의 상호작용에 관여하는 인테그린과 삭사틸린의 결합을 확인하였다.
인테그린 αMβ2 및 αLβ2는 중성구에 존재하는 인테그린으로, 내피세포에 존재하는 ICAM-1(Intercellular Adhesion Molecule 1)과 상호작용하여 중성구가 내피세포에 모이도록 한다. ELISA를 이용한 결합 분석 결과, Fc-삭사틸린은 인테그린 αMβ2 및 αLβ2와 강하게 결합하였다(Kd, 6.9×10-9 M 및 9.2×10-9 M). 또한 Fc-삭사틸린 보다는 약하지만 삭사틸린-Fc도 인테그린 αMβ2 및 αLβ2와 결합하였다(Kd, 3.0×10-7 M 및 4.4×10-7 M)(도 9).
FeCl 3 에 의한 혈전생성모델을 이용한 재조합 삭사틸린 유도체의 혈전용해 효과
32-34 g의 8-주령된 수컷 ICR 마우스를 이용하였다. 실험실 동물의 관리 및 이용은 국제실험동물관리인증협회(AAALAC)의 지침에 합당한 기준으로 연세대학교 의과대학 동물실험윤리위원회(IACUC)의 검토와 승인을 받은 프로토콜에 따라 실시하였다. 수술 과정을 살펴보면, 동물은 70% N2O및 30% O2로 구성된 혼합물(대한특수가스, 대한민국) 내 5% 이소플루란(일성신약, 대한민국)의 흡입을 통해 마취시켰다. 마취는 2% 이소플루란으로 유지시켰다. 수술 과정 동안, 동물의 체온은 직장용 프로브로 지속적으로 모니터링하였으며, 항온피복 조절 유니트(Homeothermic blanket control unit) 및 히팅 패드(Harvard Apparatus, Holliston, MA)를 이용하여 37.0±0.2℃로 유지하였다. 삭사틸린 및 삭사틸린-Fc 의 인 비보 혈전용해 활성을 테스트하기 위해 FeCl3(Sigma-Aldrich, 미국)-유도된 경동맥 혈전 모델을 이용하였다. 경부 정중절개(midline cervical incision)를 실시하여 좌측 총경동맥을 수술 현미경(SEILER, 미국) 하에서 조심스럽게 해부하였다. 초음파 도플러 유속프로브(ultrasonic Doppler flow probe; Transonic MA0.7PSB)를 총경동맥(CCA)의 중앙부위에 위치시켰다. 경동맥 혈류량은 초음파 TS420 혈류량계(Transonic Instruments, Ithaca, NY) 및 iWorx IX-304T 데이터 획득 시스템(iWorx Systems, Inc., Dover, NH)을 이용하여 측정하였다. 대조군으로서 CCA의 기본 혈류량을 5분 동안 측정하였다. 대조군 기본혈류량의 결정 후, 프로브를 제거하였다. 노출된 CCA 중앙지점의 바깥쪽 표면(adventitial surface)에 50% FeCl3로 포화된 여과지(700 × 500 μm; ADVANTEC, 일본)를 5분 동안 접촉시킴으로써 화학적 스트레스에 의한 산화적 혈관 손상이 유도되었다. 여과지를 제거한 후, CCA를 생리식염수로 세척하고 이의 혈류량을 측정하였다. 혈류량의 감소를 통해 혈전 형성 및 동맥 폐색을 결정하였으며, 완전 폐색(complete occlusion)은 혈류가 10분 동안 부재한 경우로 정의되었다.
CCA 폐색 10분 후, PE-10 튜빙(Becton Dickinson and Company, 미국)과 연결된 주입펌프(KD Scinetific Inc., 미국)을 이용하여 좌측 대퇴정맥을 통해 0, 1.5, 7.5, 15, 150 nmol/kg의 Fc-삭사틸린을 볼루스 주입하였다. 경동맥 혈류량을 주입 개시시간부터 2시간동안 연속적으로 모니터링하였다. 각 그룹 당 5 마리의 마우스를 이용하여 혈전용해 효과를 평가하고, 선행연구에서 평가한 삭사틸린 650 nmol/kg의 효과와 비교하였다.
또한, 혈류량을 측정함으로써 재관통 여부 및 그 정도를 측정하였다(도 6의 B). 기본 혈류량에 대한 데이터 및 CCA 폐색 후 2시간동안 지속적으로 모니터링된 혈류량에 대한 데이터가 iWorx Labscribe2 데이터 획득 소프트웨어(version 2.045000)를 이용하여 얻어졌다. 그 결과 얻어진 혈류시간(flow-time) 곡선 아래의 면적을 계산하여 경동맥 혈류량을 분석하였다. 동물들 간의 생리학적 조건의 변이에 따라 야기되는 오차(differences)를 피하기 위해, 모든 측정된 수치들은 각 동물의 최소 혈류량에 의해 표준화되었다. 혈전용해 효과를 아래와 같이 계산하고 정상 혈류량의 평균값에 대한 백분율로 표시하였다: (삭사틸린 유도체 투여 후 2시간 동안의 평균 혈류량/정상혈류량의 평균값) × 100(%). 용량-반응 연구에서 각 그룹의 평균값이 계산되고 이를 용량반응곡선으로 나타냈다(평균값±표준편차, 도 7). 또한, 선행연구에서 얻어진 삭사틸린 650 nmol/kg의 혈전용해효과(평균; 적색 선, 표준편차; 적색 영역)와 비교하였다. 한편, 각 동물에서 매 1분 동안 혈류량의 평균을 계산하였고, 투여량 및 투여방법에 대해 각각 대표적인 패턴을 시간-의존적으로 확인하였다(도 6의 A). 각 그룹에서 모든 동물의 평균값을 계산하였으며 시간에 따른 변화를 연속적인 막대그래프로 보여줬다(평균값±표준편차).
정상 혈류량과 비교하여 투여 그룹들에서의 혈류량의 평균백분율은 다음과 같았다(도 7): (a) 생리식염수 투여 그룹, 3.03 ± 0.75%; (b) Fc-삭사틸린 1.5 nmol/kg 투여 그룹, 17.81 ± 12.22%; (c) Fc-삭사틸린 7.5 nmol/kg 투여 그룹, 89.40 ± 41.18%; (d) Fc-삭사틸린 15 nmol/kg 투여 그룹, 59.94 ± 16.97%; (e) Fc-삭사틸린 150 nmol/kg 투여 그룹, 74.68 ± 20.53%; 및 (f) 삭사틸린 650 nmol/kg 투여 그룹, 78.24 ± 48.61% (평균값±표준편차).
혈전용해 효과를 측정한 2시간 중 마지막 10분 동안의 정상혈류량 대비 혈류량 평균 백분율을 분석하였다(도 8). (a) 생리식염수 투여 그룹, 3.29 ± 1.25%; (b) Fc-삭사틸린 1.5 nmol/kg 투여 그룹, 23.06 ± 11.75%; (c) Fc-삭사틸린 7.5 nmol/kg 투여 그룹, 119.52 ± 46.32%; (d) Fc-삭사틸린 15 nmol/kg 투여 그룹, 69.05 ± 26.07%; (e) Fc-삭사틸린 150 nmol/kg 투여 그룹, 72.49 ± 22.49%; 및 (f) 삭사틸린 650 nmol/kg 투여 그룹, 81.54 ± 57.50% (평균값±표준편차).
종합해 보면, Fc-삭사틸린은 투여용량-의존적인 혈전용해효과를 보였고 Fc-삭사틸린 7.5 nmol/kg, 15 nmol/kg, 150 nmol/kg 투여에 의한 평균 혈전용해효과 및 마지막 10분 동안의 혈전용해효과는 기존의 삭사틸린 650 nmol/kg를 투여했을 때와 비교했을 때 통계적으로 비슷한 수준의 효과를 보였다.
650 nmol/kg 삭사틸린을 투여한 경우 시간이 지나감에 따라 삭사틸린 투여군에서 혈전용해 효과 및 혈전 재형성 억제 효과의 뚜렷한 감소가 관찰되었다. 상술한 갑작스런 재폐색은 삭사틸린을 볼루스 주입한 총 5마리 마우스 중 3마리에서 평균 약 90분째 관찰되었다(도6의 A 화살표). 이에 반해, Fc-삭사틸린 7.5 nmol/kg 이상의 용량을 투여한 경우 혈관의 재개통 이후에 재폐색이 없이 2시간 동안 혈전용해 및 혈전형성 억제효과가 일정하게 유지되는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 어떤 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명 의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (24)

  1. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 삭사틸린(saxatilin)과 면역글로블린(immunoglobulin)의 Fc 영역이 컨쥬게이션(conjugation)된 삭사틸린 유도체.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 면역글로블린(immunoglobulin)의 Fc 영역은 상기 삭사틸린의 N-말단 또는 C-말단에 컨쥬게이션되어 있는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 N-말단에 리더 서열(leader sequence)이 추가적으로 컨쥬게이션되어 있는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 천연의 삭사틸린보다 4-6.5배의 증가된 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 천연의 삭사틸린과 유사한 혈전용해능을 가지는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 혈소판 응집에 대한 IC50 값이 100-500 nM인 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
    　
  7. 제6항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 혈소판 응집에 대한 IC50 값이 100-250 nM인 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 혈전 내 존재하는 인테그린(integrin)에 결합하여 혈전을 분해하는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 혈전을 구성하는 혈소판 표면의 GP(glycoprotein)IIb-IIIa에 결합하여 혈전을 분해하는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 중성구(neutrophil)에 존재하는 integrin αMβ2 에 대하여 1 x 10-8 내지 1 x 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 삭사틸린 유도체는 중성구(neutrophil)에 존재하는 integrin αLβ2 에 대하여 1 x 10-8 내지 1 x 10-10 M의 Kd(dissociation constant) 값의 결합력을 갖는 것을 특징으로 하는 삭사틸린 유도체.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 삭사틸린 유도체를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열.
  13. (a) 제 12 항의 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
  14. 제 13 항의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
  15. (a) 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 삭사틸린 유도체의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈전 용해용 조성물.
  16. 제 15 항의 조성물을 포함하는 혈관의 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 혈관은 대동맥, 경동맥, 쇠골하동맥, 복강동맥, 장간막동맥(mesenteric arteries), 신동맥, 장골동맥, 소동맥, 모세혈관 또는 소정맥인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 혈관의 협착 또는 폐색 질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증, 열공성 뇌경색, 급성 관동맥 증후군, 협심증, 대동맥 협착증, 심근경색증, 편두통, 각차단, 뇌허혈, 급성 허혈성 심혈관질환(acute ischemic arteriovascular event), 혈전성 정맥염, 정맥혈전색전증, 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis), 폐색전증(pulmonary embolism), 말초혈관질환, 혈관성 두통, 아테롬성 동맥경화증, 혈관경련, 재협착증, 기구 혈관형성술 이후 재협착증 및 혈관염에 의한 혈관 폐색증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  19. 제 16 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 혈관 내로 직접 주입되는 방식으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 혈전에 의해 혈관이 폐색된 환자에 투여되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 폐색은 부분적 폐색 또는 완전 폐색인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  22. 제 16 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 플라스미노겐 활성제(Plasminogen activator)를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  23. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항의 삭사틸린 유도체의 약제학적 유효량을 대상(subject)에 투여하는 단계를 포함하는 혈관의 협착 또는 폐색 질환의 예방 또는 치료 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 혈관의 협착 또는 폐색 질환은 뇌졸중, 뇌경색, 뇌혈전증, 뇌색전증, 열공성 뇌경색, 급성 관동맥 증후군, 협심증, 대동맥 협착증, 심근경색증, 편두통, 각차단, 뇌허혈, 급성 허혈성 심혈관질환(acute ischemic arteriovascular event), 혈전성 정맥염, 정맥혈전색전증, 심부정맥혈전증(deep vein thrombosis), 폐색전증(pulmonary embolism), 말초혈관질환, 혈관성 두통, 아테롬성 동맥경화증, 혈관경련, 재협착증, 기구 혈관형성술 이후 재협착증 및 혈관염에 의한 혈관 폐색증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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