WO2015020234A1 - ドパミン神経細胞の製造方法 - Google Patents

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    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing dopamine neurons. Furthermore, the present invention also provides a medicament containing dopamine neurons obtained by the method, and reagents and kits for use in the method.
  • Dopamine (3,4-dihydroxyphenylethylamine) is an in vivo molecule having various actions and functions mainly as a neurotransmitter in the central nervous system.
  • dopamine is biosynthesized in cells by the action of two enzymes, tyrosine hydroxylase and dopa decarboxylase, starting from the amino acid tyrosine.
  • Dopamine neurons are neurons that synthesize and release dopamine as a neurotransmitter, and are present mainly in the midbrain in the brain and partly in the hypothalamus. Dopamine neurons existing in the midbrain play an important role in the control of movement and emotion, and when the midbrain dopamine neurons degenerate and drop off, for example, severe neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease can be caused.
  • One of the most promising therapeutic approaches for treating such neurodegenerative diseases is cell transplantation therapy in which dopamine neurons are transplanted into a subject.
  • dopamine neurons include stem cells such as embryonic stem cells (sometimes referred to herein as ES cells) and induced pluripotent stem cells (sometimes referred to herein as iPS cells).
  • stem cells such as embryonic stem cells (sometimes referred to herein as ES cells) and induced pluripotent stem cells (sometimes referred to herein as iPS cells).
  • ES cells embryonic stem cells
  • iPS cells induced pluripotent stem cells
  • Non-Patent Document 1 a method of differentiating stem cells into bottom plate cells using two types of SMAD (Small Mothers against Decaplegic) signaling inhibitors
  • Patent Document 2 a method of inducing midbrain dopamine neurons by inducing bottom plate cells and further culturing the bottom plate cells with neurotrophic factors
  • Patent Document 5 a method of inducing bottom plate cells efficiently by causing a Nodal inhibitor to act has been reported one after another.
  • dopamine neurons obtained by these methods are still low, and the cells are not functionally sufficient such as inability to reproduce responsiveness to oxidative stress and drug stimulation in vitro. Therefore, there is still a need to develop a method for efficiently obtaining high-quality dopamine neurons.
  • the present inventors have cultivated neural progenitor cells in a medium containing (i) a cAMP analog and (ii) a MEK inhibitor. It has been found that cells can be produced. Furthermore, it was confirmed that the obtained dopamine neurons were high-quality dopamine neurons, such as having the same phenotype and function as dopamine neurons in vivo, and the present invention was completed.
  • the present invention provides the following.
  • a method for producing dopamine neurons characterized in that the bottom plate cells are subjected to the following step (1): (1) culturing in a medium containing (i) cAMP analog and (ii) MEK inhibitor; [2] The production method of the above-mentioned [1], wherein the medium further contains ascorbic acid or a salt thereof; [3] The production method according to [2], wherein the medium further contains an activator receptor-like kinase-4,7 activator; [4] The production method of [1], wherein the cAMP analog is dibutyryl cAMP.
  • the MEK inhibitor is (i) N-[(2R) -2,3-dihydroxypropoxy] -3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodo-phenyl) amino] benzamide (PD0325901).
  • dopamine neurons produced according to the present invention are similar to the dopamine neurons in vivo, such as responsiveness to oxidative stress and drug stimulation not observed in dopamine neurons produced by conventional methods. Has phenotype and function. Therefore, the dopamine neurons produced according to the present invention achieve a high engraftment rate in cell transplantation therapy for treating diseases caused by decreased production (release) of dopamine, such as neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease.
  • FIG. 1 shows the results of inducing bottom plate cells using Neuro / B27 supplemented with various combinations of differentiation-inducing factors and examining the expression variation of the bottom plate cell marker by quantitative RT-PCR on the 13th day of culture.
  • [-] Indicates that each differentiation-inducing factor is not added, and [All] uses all five types of LDN193189 (LDN), SB431542 (SB), Sonic Hedgehog (SHH), purmorphamine (Pur), and CHIR99021 (CHIR). Shows the conditions.
  • LDN193189 LDN
  • SB431542 SB
  • SHH Sonic Hedgehog
  • Pur purmorphamine
  • CHIR99021 CHIR99021
  • FIG. 2 shows the results of inducing bottom plate cells and immunofluorescent staining using anti-FOXA2 antibody and anti-LMX1A antibody on day 13 of culture.
  • the cell line 253G1 was used. Red indicates nuclei of FOXA2-positive cells, green indicates nuclei of LMX1A-positive cells, and blue (DAPI staining) indicates cell nuclei.
  • FIG. 1 shows the results of inducing bottom plate cells and immunofluorescent staining using anti-FOXA2 antibody and anti-LMX1A antibody on day 13 of culture.
  • the cell line 253G1 was used. Red indicates nuclei of FOXA2-positive cells, green indicates nuclei of LMX1A-positive cells, and blue (DAPI staining) indicates cell nuclei.
  • FIG. 3 shows that from 13 days after the induction of the bottom plate cells, ascorbic acid (AA), dibutyryl cAMP (dbcAMP) and PD0325901 (PD) were added in various combinations and cultured, and NURR1 expression fluctuation was observed on the 45th day.
  • AA ascorbic acid
  • dbcAMP dibutyryl cAMP
  • PD0325901 PD
  • the result investigated by quantitative RT-PCR is shown.
  • the cell lines used were 253G1 and 201B7.
  • the value on the Y axis indicates the value obtained by correcting the copy number of each gene with the copy number of GAPDH, and the error bar indicates the standard deviation.
  • FIG. 4 shows the result of differentiation induction performed in the same manner as in FIG. 3 and immunofluorescence staining using anti-TH antibody and anti-NURR1 antibody on the 45th day of culture.
  • the cell lines used were 253G1 and 201B7. Green indicates the cell body of TH positive cells, and red indicates the nucleus of NURR1 positive cells.
  • FIG. 5 shows that from the 13th day after the induction of the bottom plate cells, ascorbic acid (AA), dibutyryl cAMP (dbcAMP) and PD0325901 (PD) were added and cultured, and the 45th day (253G1 strain) or the 52nd day (201B7). The results of immunofluorescent staining using anti-TH antibody, anti-NURR1 antibody and anti-FOXA2 antibody are shown.
  • the cell lines used were 253G1 and 201B7.
  • Green indicates the cell body of TH positive cells, red indicates the nuclei of NURR1-positive cells, magenta indicates the nuclei of FOXA2-positive cells, and blue (DAPI staining) indicates the cell nuclei.
  • FIG. 6 shows a diagram obtained by observing the results obtained using the 253G1 strain of FIG. 5 at a high magnification. Green indicates the cell body of TH positive cells, red indicates the nuclei of NURR1 positive cells, and blue (DAPI staining) indicates the cell nuclei.
  • FIG. 7 shows the results of differentiation induction performed in the same manner as in FIG. The cell lines are 253G1 and 201B7, and two independent experimental results are shown.
  • FIG. 8 shows the culturing by adding various MEK inhibitors (including FGFR inhibitors) in addition to ascorbic acid (AA) and dibutyryl cAMP (dbcAMP) from the 13th day after induction of the bottom plate cells.
  • MEK inhibitors including FGFR inhibitors
  • AA ascorbic acid
  • dbcAMP dibutyryl cAMP
  • FIG. 9 shows a schematic diagram of a method for inducing differentiation of human iPS cells into bottom plate cells and dopamine neurons.
  • FIG. 10 shows the results of quantitative RT-PCR examining changes in expression of various differentiation markers over time when differentiation was induced according to the method of FIG. [All] is performed according to FIG. 9, [-] excludes CHIR99021, LDN193189, SB431542, SHH, and purmorphamine, [-SHH] excludes SHH only, and [-Pur] excludes purmorphamine only. Shows that differentiation was induced.
  • the cell lines used were 253G1 and 201B7.
  • the value on the Y axis indicates the value obtained by correcting the copy number of each gene with the copy number of GAPDH, and the error bar indicates the standard deviation.
  • FIG. 11 shows that in Step 3 shown in FIG. 9, ascorbic acid (AA), dibutyryl cAMP (dbcAMP), PD0325901 (PD) and activin A (Act) were added in various combinations to induce differentiation, and culture was performed for 26 days.
  • variation of the dopamine neuron marker by quantitative RT-PCR in eyes is shown. [-] Indicates the case where each differentiation-inducing factor is not added.
  • the cell lines used were 253G1 and 201B7.
  • FIG. 12 shows the result of performing differentiation induction in the same manner as in FIG. 11 and performing immunofluorescent staining using anti-TH antibody and anti-NURR1 antibody on the 26th day of culture.
  • the cell lines used were 253G1 and 201B7. Green indicates the cell body of TH positive cells, and red indicates the nucleus of NURR1 positive cells.
  • FIG. 13 shows step 3 shown in FIG.
  • AA ascorbic acid
  • dbcAMP dibutyryl cAMP
  • PD0325901 PD
  • ACT activin A
  • FIG. 14 shows the result of thawing cryopreserved cells in the same manner as FIG. 13 and adding AA, dbcAMP, PD and ACT, culturing for 2 weeks, and then performing immunofluorescence staining using anti-TH antibody and anti-NURR1 antibody Indicates. Green indicates the cell body of TH positive cells, and red indicates the nucleus of NURR1 positive cells. Blue (DAPI staining) indicates cell nuclei.
  • FIG. 15 shows the addition of ascorbic acid, dbcAMP, PD0325901 (Control group; 4 panels on the left side) or ascorbic acid, dbcAMP, PD0325901 and activin A (Activin A group; 4 panels on the right side) in Step 3 shown in FIG. Then, differentiation was induced, and cells were collected on the 26th day of culture and transplanted into mouse striatum. The results of tissue staining performed 4 weeks after transplantation are shown. Green indicates the cell body of TH positive cells, and red indicates the nucleus of hNuc positive cells. Blue (DAPI staining) indicates cell nuclei.
  • FIG. 16 shows the result of transplantation in the same manner as in FIG. 15 and tissue staining 8 weeks after transplantation.
  • Green indicates the cell body of TH positive cells, and red indicates the nucleus of hNuc positive cells. Blue (DAPI staining) indicates cell nuclei.
  • FIG. 17 shows the result of transplanting in the same manner as in FIG. 15 and performing tissue staining 12 weeks after transplantation. Green indicates the cell body of TH positive cells, and red indicates the nucleus of hNuc positive cells. Blue (DAPI staining) indicates cell nuclei.
  • dopamine neuron means a neuron having an ability to produce dopamine (3,4-dihydroxyphenylethylamine).
  • Dopamine neurons need not always produce dopamine, as long as they have the ability to produce dopamine. Further, the amount of dopamine produced is not particularly limited.
  • dopamine neurons existing in the living body in particular, dopamine neurons existing in the midbrain of the substantia nigra and ventral tegmental area are tyrosine hydroxylase (TH), FOXA2 (forkhead box A2) in vitro.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • FOXA2 forkhead box A2
  • the dopamine neurons present in the midbrain can also be characterized in vitro by the expression of specific cell markers such as TH, FOXA2, LMX1A (LIM homebox transcription factor 1 alpha), NURR1 gene / protein.
  • a “dopamine neuron” obtained by subjecting a base plate cell to the production method of the present invention is a dopamine neuron existing in the midbrain (ie, midbrain dopamine neuron).
  • the “neural progenitor cell” refers to a cell capable of generating a dopamine neuron after differentiation. Specifically, for example, it is characterized by an expression marker such as a bottom plate cell or an intermediate filament protein Nestin. Examples of such cells are neuroectodermal cells, and the most preferred are bottom plate cells.
  • floor plate cell means a morphologically specialized organizer cell located in the ventral midline of the neural tube from the spinal cord to the diencephalon.
  • bottom plate cells especially those located in the ventral midbrain can be characterized in vitro by the expression of certain cell markers such as FOXA2 and LMX1A gene / protein.
  • stem cell refers to a cell that can be cultured in vitro and can differentiate into a plurality of cells constituting a living body.
  • ES cells embryonic primordial germ cell-derived pluripotent stem cells (EG cells: Proc Natl Acad Sci US A. 1998, 95: 13726-31), testis-derived pluripotent stem cells (GS cells: Nature, 2008, 456: 344-9), somatic cell-derived induced pluripotent stem cells (iPS cells), human pluripotent somatic stem cells (neural stem cells), preferably iPS cells and ES cells, more preferably iPS cells.
  • EG cells embryonic primordial germ cell-derived pluripotent stem cells
  • GS cells Nature, 2008, 456: 344-9
  • somatic cell-derived induced pluripotent stem cells iPS cells
  • human pluripotent somatic stem cells preferably iPS cells and ES cells, more preferably iPS cells.
  • ES cells ES cells derived from any warm-blooded animal, preferably a mammal, can be used.
  • mammals include mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, goats, monkeys, and humans.
  • Preferable examples of ES cells include human-derived ES cells.
  • Specific examples of ES cells include ES cells such as mammals established by culturing early embryos before implantation, ES established by culturing early embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei. ES cells in which the genes on the chromosomes of these cells and these ES cells have been modified using genetic engineering techniques.
  • Each ES cell can be prepared according to a method commonly practiced in the art or a known literature.
  • Mouse ES cells were obtained in 1981 from Evans et al. (1981, Nature 292: 154-6) and Martin et al. (Martin GR. Et al., 1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634-8). And can be purchased from, for example, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • Human ES cells were established in 1998 by Thomson et al. (Science, 1998, 282: 1145-7) and are available at the WiCell Research Institute (WiCell Research Institute, website: http: // www. available from Wisell.org/, Madison, Wisconsin, USA, National Institute of Health, Kyoto University, etc., for example, Cellaritis (website: http://www.cellaritis.com). /, Sweden).
  • an iPS cell an iPS cell derived from any warm-blooded animal, preferably a mammal can be used.
  • the mammal include mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, cat, dog, sheep, pig, cow, horse, goat, monkey and human.
  • Preferred examples of iPS cells include iPS cells derived from humans.
  • Specific examples of iPS cells include cells obtained by introducing a plurality of genes into somatic cells such as skin cells, which have acquired pluripotency similar to ES cells.
  • Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, c- Examples include iPS cells obtained by introducing Myc gene and Sox2 gene, iPS cells obtained by introducing Oct3 / 4 gene, Klf4 gene and Sox2 gene (Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106).
  • a method in which a transgene is further reduced (Nature. 2008 Jul 31; 454 (7204): 646-50), a method using a low molecular weight compound (Cell Stem Cell. 2009 Jan 9; 4 (1): 16 -9, Cell Stem Cell. 2009 Nov 6; 5 (5): 491-503), a method using a transcription factor protein instead of a gene (Cell Stem Cell.
  • iPS cell lines include the 253G1 line (iPS cell line prepared by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 in skin fibroblasts of a 36-year-old female), 201B7 line (skin fiber of a 36-year-old female).
  • IPS cell line prepared by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC in blast cells
  • 1503-iPS (297A1) (OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC in skin fibroblasts of a 73-year-old woman) IPS cell line prepared by expression
  • 1392-iPS iPS cell line prepared by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC in 56-year-old male skin fibroblasts
  • NHDF- iPS (297L1) i produced by expressing OCT4 / SOX2 / KLF4 / c-MYC in newborn male skin fibroblasts S cell lines
  • the present invention provides a method for producing a dopamine neuron characterized by subjecting neural progenitor cells to the following step (1) (hereinafter also referred to as the production method of the present invention): (1) The step of culturing in a medium containing (i) cAMP (cyclic adenosine monophosphate) analog and (ii) MEK inhibitor is provided.
  • the method for obtaining neural progenitor cells used in the production method of the present invention is not particularly limited, and can be directly collected from the target animal embryo, but from the viewpoint of obtaining a large amount of neural progenitor cells, stem cells Is preferably used as a starting material.
  • the method for producing neural progenitor cells from stem cells is not particularly limited, and a method for culturing pluripotent stem cells in the presence of a low molecular weight BMP inhibitor, or a differentiation induction method by co-culture with stromal cells (SDIA method) A method known per se can be used.
  • the neural progenitor cells used in the production method of the present invention may be any cells as long as they can generate dopamine neurons after differentiation, but it is most preferable to use a bottom plate cell as a starting cell. Therefore, a method for differentiating stem cells into bottom plate cells will be specifically described below.
  • This differentiation method includes a step of culturing stem cells in a medium containing a bottom plate cell differentiation inducing factor.
  • stem cells are usually cultured on an incubator.
  • the incubator used here, for example, flask, tissue culture flask, dish, petri dish, tissue culture dish, multi-dish, microplate, microwell plate, multiplate, multiwell plate, chamber slide, petri dish, A tube, a tray, a culture bag, and a roller bottle are mentioned.
  • Preferred are a dish, a petri dish, a tissue culture dish, a multi-dish, a microplate, a microwell plate, a multiplate, and a multiwell plate.
  • the incubator is preferably provided with a coating suitable for maintaining and culturing stem cells. Specifically, it is preferable to use an incubator coated with feeder cells or extracellular matrix components.
  • a feeder cell for example, a fibroblast (a mouse
  • the feeder cells are preferably inactivated by a method known per se, for example, irradiation with radiation (such as gamma rays) or treatment with an anticancer agent (such as mitomycin C).
  • Extracellular matrix components include fibrous proteins such as gelatin, collagen and elastin, glucosaminoglycans and proteoglycans such as hyaluronic acid and chondroitin sulfate, cell adhesion proteins such as fibronectin, vitronectin and laminin, or basement membranes such as matrigel Ingredients and the like.
  • the bottom plate cell differentiation inducing factor used in this differentiation method is not particularly limited as long as it is a substance that induces differentiation into bottom plate cells, and any substance known as a bottom plate cell differentiation inducing factor can be used.
  • the substance includes a low molecular compound, a peptide, a protein and the like.
  • bottom plate cell differentiation inducing factors examples include BMP inhibitors such as Noggin, LDN-193189 (4- (6- (4- (piperazin-1-yl) phenyl) pyrazolo [1,5-a] pyrimidine-3 -Yl) quinoline hydrochloride), dorsomorphin (6- [4- (2-piperidin-1-ylethoxy) phenyl] -3-pyridin-4-ylpyrazolo [1,5-a] pyrimidine), etc .; TGF ⁇ family inhibitors, For example, SB431542 (4- [4- (1,3-benzodioxol-5-yl) -5- (2-pyridinyl) -1H-imidazol-2-yl] -benzamide), A-83-01 ( 3- (6-methylpyridin-2-yl) -1-phenylthiocarbamoyl-4-quinolin-4-ylpyrazole) and the like; GSK3 ⁇ inhibitor, For example, CH
  • the inventors performed primary culture for 3 to 5 days in a medium containing LDN193189, SB431542, purmorphamine and CHIR99021 (optionally containing SHH), and then in a medium containing LDN193189 and CHIR99021. It was found that stem cells can be induced to differentiate into bottom plate cells more efficiently by secondary culture for 5 to 8 days. Therefore, by using LDN193189, SB431542, purmorphamine and CHIR99021 in combination as the bottom plate cell differentiation inducing factor, stem cells can be efficiently induced to differentiate into bottom plate cells without adding protein components such as SHH to the medium. Therefore, it becomes possible to produce bottom plate cells, and thus dopamine neurons, at a lower cost than in the past.
  • the concentration of the bottom plate cell differentiation inducing factor in the medium in this differentiation method is appropriately set depending on the type of factor used.
  • the concentration when LDN193189, purmorphamine, CHIR99021 is used as the bottom plate cell differentiation inducing factor is: Each is usually 0.05 to 10 ⁇ M, preferably 0.1 to 5 ⁇ M.
  • the concentration when SB431542 is used as a bottom plate cell differentiation inducing factor is usually 1 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M.
  • the concentration when SHH is used as the bottom plate cell differentiation inducing factor is usually 10 to 500 ng / ml, preferably 100 to 300 ng / ml.
  • the medium used in this differentiation method is not particularly limited as long as it contains the above-mentioned bottom plate cell differentiation-inducing factor.
  • the bottom plate is a medium used for culturing stem cells (hereinafter sometimes referred to as a basal medium).
  • a cell differentiation inducer is added.
  • the above-mentioned basal medium is Neurobasal medium, Neurobasal-A medium, Neural Progenitor Basal medium, NS-A medium, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM medium, Improved MEM ZincOption medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium, IMDM medium Any medium that can be used for culturing animal cells, such as MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, DMEM / F12 medium, Ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixed medium thereof, is not particularly limited.
  • basal media can be purchased from Invitrogen, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Dainippon Sumitomo Pharmaceutical Co., Ltd., etc., and the medium composition is the same regardless of the manufacturer as long as it has the same name or the same brand name. It is.
  • a DMEM / F12 medium, a Neurobasal medium, and a mixed medium thereof are preferably used as a basal medium in that differentiation induction into bottom plate cells can be performed more efficiently.
  • the medium used in this differentiation method may be a serum-containing medium or a serum-free medium.
  • the serum-free medium means a basal medium that does not contain unconditioned or unpurified serum, and there is no medium in which purified blood-derived components or animal tissue-derived components (for example, growth factors) are mixed. It shall correspond to serum medium.
  • the medium used in this differentiation method is a serum-containing medium, mammalian serum such as fetal bovine serum can be used as the serum.
  • the concentration of the serum in the medium is usually 0.01 to 20% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
  • the medium used in this differentiation method may also contain a serum replacement.
  • serum substitutes include albumin (eg, lipid-rich albumin), transferrin, fatty acid, collagen precursor, trace elements (eg, zinc, selenium), B-27 supplement, N2 supplement, knockout sealum replacement, 2-mercapto Ethanol, 3 ′ thiol glycerol, or the equivalent thereof.
  • concentrations in these media are the same as those in the serum.
  • N2 supplements and B-27 supplements (Brewer GJ et al., J. Neurosci. Res. (1993) 35, 567) can be suitably added to the medium as serum substitutes.
  • the concentration of N2 supplement in the medium is preferably 0.1 to 10% by weight, more preferably 0.5 to 2% by weight, and the concentration of B-27 supplement is 0.1 to 10% by weight. Is more preferable, and more preferably 1 to 5% by weight.
  • Knockout sealum replacements can be purchased from Invitrogen. Other serum substitutes can be purchased from Invitrogen, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd., etc. It is the same regardless.
  • the medium used in this differentiation method also includes lipids, amino acids (eg, non-essential amino acids), vitamins, growth factors, cytokines, antioxidants, 2-mercaptoethanol, pyruvate, buffers, inorganic salts, antibiotics (eg, Penicillin or streptomycin) or an antibacterial agent (for example, amphotericin B) may be contained.
  • concentrations in these media are the same as those in the serum.
  • Other culture conditions such as culture temperature and CO 2 concentration can be set as appropriate.
  • the culture temperature is not particularly limited and is, for example, about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.
  • the CO 2 concentration is, for example, about 1 to 10%, preferably about 5%.
  • bottom plate cell markers proteins and genes expressed specifically in the bottom plate cells (in the present specification, these proteins and genes may be referred to as bottom plate cell markers). Can be done by evaluating The evaluation of the expression fluctuation of the bottom plate cell marker can be performed by, for example, a protein expression evaluation method using an antigen-antibody reaction, a gene expression evaluation method using quantitative RT-PCR, or the like. Examples of the bottom plate cell marker that differentiates into the midbrain include FOXA2 and LMX1A gene / protein.
  • Neural progenitor cells such as bottom plate cells obtained by the above differentiation method can be further differentiated into dopamine neurons by a step of culturing in a medium containing (i) cAMP analog and (ii) MEK inhibitor.
  • a neurotrophic factor such as factor (GDNF)
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic
  • the cAMP analog used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as it is a compound having a structure similar to cAMP capable of increasing the intracellular cAMP concentration upon contact with a cell.
  • Examples of the cAMP analog include 8-bromo cAMP, dibutyryl cAMP, N6-benzoyl cAMP, 8-thiomethyl cAMP and the like. These can be purchased from Sigma, Merck Bioscience, Wako Pure Chemical Industries, etc. If they have the same name or the same product name, they refer to the same substance, and the structure and physical properties are the same regardless of the manufacturer. . Even if it is not available as a commercial product, those skilled in the art can prepare it according to known literature.
  • the cAMP analog used in the production method of the present invention is preferably dibutyryl cAMP.
  • the concentration of the cAMP analog in the medium is appropriately set depending on the type of cAMP analog to be used, and the concentration when dibutyryl cAMP is used as the cAMP analog is usually 0.01 to 5 mM, preferably 0.1 to 1 mM.
  • the MEK inhibitor used in the production method of the present invention refers to a substance having a MAP kinase kinase (MITogen activated protein kinase / ERK Kinase; MEK) inhibitory activity, and upstream of the MEK signal transduction pathway as long as the action of MEK is inhibited.
  • Inhibitors for factors eg, FGF receptor inhibitors are also included in the MEK inhibitors of the present invention.
  • Examples of the MEK inhibitor include PD0325901 (N-[(2R) -2,3-dihydroxypropoxy] -3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodophenyl) amino] -benzamide), PD184352 (2- (2-chloro-4-iodophenylamino) -N-cyclopropylmethoxy-3,4-difluorobenzamide), SU5402 (3- [4-methyl-2- (2-oxo-1,2) -Dihydro-indole-3-ylidenemethyl) -1H-pyrrol-3-yl] -propanoic acid), PD 173074 (N- [2-[[4- (diethylamino) butyl] amino-6- (3,5-dimethoxyphenyl) ) Pyrido [2,3-d] pyrimidin-7-yl] -N ′-(1,1-dimethyl) urea).
  • the concentration of the MEK inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of MEK inhibitor to be used.
  • the concentration when using PD0325901 or PD184352 as the MEK inhibitor is usually 0.1 to 10 ⁇ M, preferably 1 to 5 ⁇ M. It is.
  • the concentration when SU5402 is used as the MEK inhibitor is usually 0.1 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M.
  • the cAMP analog and the MEK inhibitor may be added to the medium at the same time, and as long as differentiation from neural progenitor cells to dopamine neurons can be induced, a time difference is provided separately. It may be added to the medium. It is convenient and preferable that the cAMP analog and the MEK inhibitor are added simultaneously to the medium.
  • the medium used in the production method of the present invention is the above 1-1. It is prepared by adding a cAMP analog and MEK inhibitor to the basal medium exemplified in the differentiation method (which may contain various additives, serum or serum substitute as exemplified above if desired).
  • the medium used in the production method of the present invention is prepared using a different basal medium, even if it is prepared using the same basal medium as the basal medium used in the above-mentioned method for producing bottom plate cells. However, it is preferably prepared using the same type of basal medium.
  • ascorbic acid or a salt thereof By adding ascorbic acid or a salt thereof to the medium used in the production method of the present invention in addition to the cAMP analog and MEK inhibitor, high-quality dopamine neurons can be produced more efficiently.
  • ascorbate that can be used in the production method of the present invention include, but are not limited to, sodium ascorbate, potassium ascorbate, and calcium ascorbate.
  • the concentration when ascorbic acid or a salt thereof is added to the medium is usually 0.01 to 10 mM, preferably 0.05 to 1 mM.
  • Ascorbic acid or a salt thereof may be added to the medium at the same time as the cAMP analog and the MEK inhibitor, and as long as differentiation from neural progenitor cells to dopamine neurons can be induced, a separate time difference is provided in the medium. It may be added. Ascorbic acid or a salt thereof is conveniently and preferably added to the medium simultaneously with the cAMP analog and the MEK inhibitor.
  • activin receptor-like kinase-4,7 activator is added to the medium to further culture neural progenitor cells.
  • the activator of activin receptor-like kinase-4,7 is not particularly limited as long as activin receptor-like kinase-4 and / or activin receptor-like kinase-7 is activated.
  • Activin is preferred.
  • Activin is a 24 kD peptide cell growth and differentiation factor belonging to the TGF ⁇ (transforming growth factor ⁇ ) family, and two ⁇ subunits form a dimer via SS bonds (Ling, N., et al., (1986) Nature 321, 779-782; Vale, W., et al., (1986) Nature 321, 776-779).
  • Activins A, B, C, D and AB are known as activins, but any of activins A, B, C, D and AB can be used in the production method of the present invention. When activin is used in the production method of the present invention, activin A is particularly preferably used as activin.
  • activin derived from any mammal such as human and mouse can be used.
  • activin is used in the production method of the present invention, it is preferable to use activin derived from the same animal species as the neural progenitor cell to be used.
  • Activin is preferably used. These activins are commercially available.
  • the concentration of activin in the medium in the production method of the present invention is appropriately set depending on the type of activin used.
  • the concentration when activin A is used as activin is usually 0.1 to 200 ng / ml, preferably 5 to 150 ng / ml, particularly preferably 10 to 100 ng / ml.
  • Activin may be added to the medium at the same time as the cAMP analog and the MEK inhibitor, or may be added to the medium separately with a time difference as long as differentiation from neural progenitor cells to dopamine neurons can be induced. Good. Activin is conveniently and preferably added to the medium simultaneously with the cAMP analog and MEK inhibitor.
  • the production method of the present invention is CO 2 aerated with 1 to 10% (preferably 5%) carbon dioxide at a culture temperature suitable for culturing neural progenitor cells (usually about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C.). It is carried out by culturing in an incubator.
  • confirmation that neural progenitor cells have differentiated into dopamine neurons is confirmed by proteins or genes expressed specifically in dopamine neurons (in the present specification, the proteins and genes are referred to as dopamine neurons markers). This may be done by evaluating expression fluctuations.
  • the evaluation of the expression fluctuation of the dopamine neuron marker can be performed by, for example, a protein expression evaluation method using an antigen-antibody reaction, a gene expression evaluation method using quantitative RT-PCR, or the like.
  • Examples of the dopamine neuron marker present in the midbrain include tyrosine hydroxylase (TH), FOXA2, LMX1A, and NURR1 gene / protein.
  • confirmation that the dopamine neurons obtained by the production method of the present invention have the same functions as dopamine neurons in vivo is based on the evaluation of responsiveness to dopamine release, oxidative stress and drug stimulation. It can be carried out.
  • said 1-1 If the manufacturing method of this invention is used, said 1-1. It is also possible to efficiently produce high quality dopamine neurons using as starting materials bottom plate cells or neural progenitor cells other than the bottom plate cells obtained by this differentiation method.
  • high-quality dopamine neurons can be produced in large quantities by efficiently inducing differentiation of neural progenitor cells into dopamine neurons. Since this dopamine neuron has the same phenotype and function as dopamine neurons in vivo, it is used to treat diseases caused by decreased production (release) of dopamine, such as neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease. When used as a medicine in cell transplantation therapy, a high engraftment rate can be achieved. It is also useful as a tool for developing therapeutic agents for the disease.
  • the cells obtained in the course of the production method of the present invention and the dopamine neurons of the present invention can be cryopreserved and thawed.
  • Cell freezing and thawing methods are known in the art, and are not particularly limited as long as they do not affect cell differentiation ability, viability, dopamine production ability, and the like.
  • the cells are detached from the culture dish with a cell dispersion (eg, Accutase (registered trademark) Innovative Cell Technologies), the cell dispersion is removed, and the cryopreservation solution (E.g., suspended in Cell Banker 2 (LSI stipulatece Corporation)) and stored at -80 ° C.
  • a cell dispersion eg, Accutase (registered trademark) Innovative Cell Technologies
  • the cryopreservation solution E.g., suspended in Cell Banker 2 (LSI stipulatece Corporation)
  • Examples of the thawing method include a method of thawing in a 37 ° C. constant temperature bath, centrifuging a cryopreservation solution, suspending it in a medium, and the like.
  • a method of thawing in a 37 ° C. constant temperature bath centrifuging a cryopreservation solution, suspending it in a medium, and the like.
  • the present invention provides a medicament comprising the dopamine neuron produced by the production method of the present invention described above (sometimes abbreviated as the medicament of the present invention).
  • the dopamine neuron cell is not particularly limited as long as it is a cell obtained by the production method of the present invention described above.
  • dopamine neurons are used as they are or as cell masses such as pellets concentrated by filtration.
  • the medicament can be stored frozen by adding a protective agent such as DMSO (dimethyl sulfoxide).
  • the medicine can be subjected to treatment under conditions such as heat treatment, radiation treatment, etc., such that the protein of the pathogen is denatured while leaving the function as a dopamine neuron. Good.
  • treatment such as heat treatment, radiation treatment, etc.
  • the protein of the pathogen is denatured while leaving the function as a dopamine neuron.
  • the medicine can be subjected to treatment under conditions such as heat treatment, radiation treatment, etc., such that the protein of the pathogen is denatured while leaving the function as a dopamine neuron. Good.
  • a treatment such as a method of killing (suicide gene therapy).
  • the medicament of the present invention is safe and has low toxicity, and can be administered to mammals (eg, humans, mice, rats, guinea pigs, pigs, monkeys).
  • mammals eg, humans, mice, rats, guinea pigs, pigs, monkeys.
  • the administration form (transplantation method) of the medicament of the present invention to humans include, for example, Nature Neuroscience, 2, 1137 (1999) or N Engl J Med. 344: 710-9 (2001).
  • the medicament of the present invention is administered (transplanted) to a dopamine-deficient region of the brain.
  • the dosage (transplantation amount) and the number of administrations (transplantation number) of the medicament of the present invention can be appropriately determined depending on the age, weight, symptoms, etc. of the patient to be administered.
  • the medicament containing dopamine neurons of the present invention can be efficiently engrafted in a patient by administration (transplantation) itself, and as a result, efficient production (release) of dopamine in the patient becomes possible. . Therefore, the medicament of the present invention is useful for the treatment of diseases caused by decreased production (release) of dopamine, for example, neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Huntington's chorea, Alzheimer's disease, epilepsy and schizophrenia.
  • neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease, Huntington's chorea, Alzheimer's disease, epilepsy and schizophrenia.
  • the dopamine neurons of the present invention have the same phenotype and function as dopamine neurons in vivo, they are useful for screening pharmaceutical compounds, preferably compounds for treating neurodegenerative diseases. For example, whether or not the test compound is useful as a medicament by measuring the morphological or functional change of the test compound alone or in combination with other drugs in addition to the dopamine neuron of the present invention. Can be evaluated. An example of a functional change can be performed by measuring the amount of dopamine produced or released from the cell.
  • the dopamine neuron is preferably a cell exhibiting a phenotype similar to the disease to be treated, and particularly preferably a dopamine neuron produced by inducing differentiation of a stem cell prepared from a somatic cell derived from the disease.
  • the test compound include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, plasma and the like.
  • the test compound may form a salt.
  • a salt with a physiologically acceptable acid eg, inorganic acid, organic acid
  • base eg, alkali metal salt, alkaline earth metal salt, aluminum salt
  • the salt examples include a salt with an inorganic acid (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or an organic acid (for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid).
  • sodium salt potassium salt, calcium salt, magnesium salt, barium salt, aluminum salt can be used.
  • the medicine obtained by using the above screening can be formulated according to a known method using a physiologically acceptable additive.
  • the dosage form of the preparation thus obtained include oral preparations such as tablets, capsules, elixirs, and microcapsules with sugar coating as required; and parenteral preparations such as injections.
  • the content of the active ingredient (the compound selected by the above screening method) in these preparations is, for example, 0.1 to 90% by weight.
  • the additive examples include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, and gum arabic; excipients such as crystalline cellulose; swelling agents such as corn starch, gelatin, and alginic acid; lubricants such as magnesium stearate; sucrose Sweeteners such as lactose and saccharin; flavoring agents such as peppermint, red mono oil and cherry; oils and fats, water for injection, vegetable oils (eg sesame oil, coconut oil, soybean oil), buffers (eg phosphate buffer, acetic acid) Liquid carriers such as sodium buffer; solubilizers (eg, ethanol, propylene glycol, polyethylene glycol); nonionic surfactants (eg, polysorbate 80 TM , HCO-50); solubilizers (eg, benzoic acid) Benzyl, benzyl alcohol); soothing agent (eg, benzal chloride) Chloride, procaine hydrochloride); stabilizers (e.g., human serum album
  • water for injection examples include isotonic solutions including physiological saline; glucose, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride and the like.
  • medicine preferably therapeutic agent for neurodegenerative diseases obtained by the above screening is safe and low toxic, for example, mammals (eg, humans, mice, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, horses, cats, Canine, monkey, chimpanzee) orally or parenterally.
  • the dose and frequency of administration of the drug are appropriately set depending on the action, target disease, administration subject, administration route, and the like.
  • the dopamine neurons of the present invention can also be used for toxicity evaluation of compounds. For example, by adding a test compound alone or in combination with another drug to the dopamine neuron of the present invention and measuring a change in the morphology or function of the cell, it is determined whether or not the test compound is toxic. Can be evaluated. An example of a functional change can be performed by measuring the amount of dopamine produced or released from the cell.
  • the test compound include peptides, proteins, antibodies, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and plasma.
  • the test compound may form a salt as described in the above screening.
  • the dopamine neurons obtained by the production method of the present invention can be further used for verification of drug discovery targets and analysis of disease mechanisms.
  • the present invention also provides reagents and kits for producing dopamine neurons from neural progenitor cells comprising (i) a cAMP analog and (ii) a MEK inhibitor.
  • the reagents and kits may further contain (1) ascorbic acid or a salt thereof and / or (2) an activator receptor-like kinase-4,7 activator.
  • Examples of the cAMP analog, MEK inhibitor, and activin receptor-like kinase-4,7 activator include those that can be used in the production method of the present invention.
  • feeder cells mouse fibroblasts (MEFs, Kitayama Labes Co., Ltd.) that had been proliferated and inactivated by mitomycin C (Wako Pure Chemical Industries) treatment were seeded on gelatin-coated plates. .
  • a medium for primate ES cells Reprocell
  • 4 ng / ml bFGF basic fibroblast growth factor
  • Penicillin-streptomycin Wako Pure Chemical Industries
  • the iPS cells are detached from the plate in a cell mass state using a cell detachment solution for primate ES cells (manufactured by Reprocell), and then the detached iPS cells are seeded on new feeder cells. It went by.
  • iPS cells maintained in a cell mass state are treated with a primate ES cell detachment solution for 10 seconds, and lightly pipetted to give MEFs to some extent. Removed. Subsequently, the cells were washed with PBS, treated with Accutase (Innovative Cell Technologies) at 37 ° C. for 5 minutes, and dissociated until they became single cells. Subsequently, iPS cells dispersed in the medium were seeded in a 96-well plate at a density of 1.5 to 2 ⁇ 10 4 per well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 day (pre-culture). .
  • iPS cells maintained in a method that does not use feeder cells were treated with PBS supplemented with 0.5 mM EDTA at 37 ° C. for 10 minutes, Dissociate until single cells. Subsequently, iPS cells dispersed in the medium were seeded in a 96-well plate at a density of 1.5 to 2 ⁇ 10 4 per well and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 1 day (pre-culture). . As a culture solution at the time of seeding, Essential 8 supplemented with 10 ⁇ M Y27632 (Wako Pure Chemical Industries) was used. The 96-well plate was prepared by adding Matrigel (BD) diluted 1/30 to 1/40 with DMEM / F12 (Life Technologies) and coating at 37 ° C. overnight.
  • BD Matrigel
  • DMEM / F12 Life Technologies
  • the medium was replaced with a differentiation-inducing medium containing 0.5 ⁇ M LDN193189 and 1 ⁇ M CHIR99021, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 5 to 8 days (10 to 13 days in total).
  • a differentiation induction medium Neurobasal (Life Technologies, hereinafter referred to as Neuro / B27) (2) B27 (Life Technologies) and 2 mM GlutaMaxI (Life Technologies) (hereinafter referred to as Neuro / B27) DMEM / F12 (hereinafter referred to as N2B27) containing% N2 (Wako Pure Chemical Industries) and 2% B27 (Life Technologies) was used. During these culturing periods, the medium was changed every 3 to 4 days.
  • FOXA2 and LMX1A showed high expression. It was found that bottom plate cells can be induced. In addition, even when SHH was excluded from the above five types (-SHH in the figure), the expression of FOXA2 and LMX1A increased to some extent, so even when SHH was not used, that is, when only a compound was added as a differentiation-inducing factor, It was thought that cells could be induced. In addition to the above five types, even when FGF8, which is widely used as a factor for inducing the neuroectodermal differentiated from human ES / iPS cells, in the direction of the midbrain region, FOXA2 and LMX1A are hardly expressed. Since it did not change (All + FGF8 in FIG. 1), it was considered that FGF8 is not essential in this system.
  • the primary antibody is reacted with an anti-FOXA2 antibody (sc-6544, Santa Cruz) and an anti-LMX1A antibody (AB10533, Millipore), and further, as a secondary antibody, an Alexa488-labeled secondary antibody (according to the primary antibody immunized animal) ( Invitrogen) and Alexa568-labeled secondary antibody were sequentially reacted, and then observed with a fluorescence microscope.
  • an Alexa488-labeled secondary antibody accordinging to the primary antibody immunized animal
  • Alexa568-labeled secondary antibody were sequentially reacted, and then observed with a fluorescence microscope.
  • FIG. When either (a) or (b) was used as the differentiation-inducing medium, it was observed that most cells expressed both FOXA2 and LMX1A proteins.
  • the bottom plate was efficiently obtained by culturing for 5 days in a differentiation induction medium supplemented with LDN193189, SB431542, SHH, purmorphamine and CHIR99021, and then culturing in a differentiation induction medium supplemented with LDN193189 and CHIR99021. It became clear that cells could be induced.
  • Example 1 Induction of differentiation from baseplate cells to dopamine nerves Baseplate cells were induced in the same manner as described in Reference Examples 1 to 3, and on the 13th day of culture, (A) 0.1 mM ascorbic acid (SIGMA), 0 Neuro / B27 supplemented with 3 factors of 5 mM dibutyryl cAMP (SIGMA, hereinafter referred to as dbcAMP) and 3 ⁇ M PD0325901, or (B) Neuro / B27 supplemented with 2 factors of 0.1 mM ascorbic acid and 0.5 mM dbcAMP And cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 30 days or more. During the culture period, the medium was changed every 3 to 4 days.
  • SIGMA 0.1 mM ascorbic acid
  • dbcAMP dibutyryl cAMP
  • PD0325901 3 ⁇ M PD0325901
  • B Neuro / B27 supplemented with 2 factors of 0.1 mM ascor
  • TH, NURR1 and FOXA2 proteins which are midbrain dopamine neuron markers, was examined by immunofluorescence staining using anti-TH antibody, anti-NURR1 antibody and anti-FOXA2 antibody.
  • Base plate cells were induced by the same method as described in Reference Examples 1 to 3, and from day 13 of culture, (A) Neuro / B27 to which three factors of (A) ascorbic acid, dbcAMP and PD0325901 were added, or (B) ascorbic acid Further, differentiation was promoted by exchanging with Neuro / B27 supplemented with 2 factors of dbcAMP, and 4% PFA was added on the 45th to 52nd days of culture, and fixation was performed at room temperature for 30 minutes.
  • FIG. 6 shows a stained image when observed at a high magnification. The above results were obtained in substantially the same way with the 253G1 and 201B7 strains. From these facts, by inducing differentiation of bottom plate cells using Neuro / B27 of (A) above, the mesencephalic dopamine is several tens of times more efficient than when cAMP analog and MEK inhibitor are not added. It was found that nerve cells can be induced.
  • Example 2 Examination of various MEK inhibitors (including FGFR inhibitors) In place of PD0325901 in Neuro / B27 of (A), PD184352 (Axon MedChem), SU5402 (FGF receptor (FGFR) inhibitor, Wako Pure Chemical) or PD173074 Whether or not midbrain dopamine neurons can be induced by a medium containing any of (FGFR inhibitor, Axon MedChem) was examined.
  • FGFR inhibitors including FGFR inhibitors
  • Base plate cells were induced by the same method as described in Reference Examples 1 to 3, and from the 13th day of culture, (1) three factors of ascorbic acid, dbcAMP and PD0325901, (2) two factors of ascorbic acid and dbcAMP, ( 3) Ascorbic acid, dbcAMP and 3 ⁇ M PD184352, (4) Ascorbic acid, dbcAMP and 10 ⁇ M SU5402, or (5) Neuro / B27 supplemented with ascorbic acid, dbcAMP and 0.1 ⁇ M PD1733074 at 37 ° C., 5% CO 2 and cultured for 30 days or more. During the culture period, the medium was changed every 3 to 4 days.
  • step 1 the cells were cultured for 5 days in Neuro / B27 supplemented with 0.5 ⁇ M LDN193189, 10 ⁇ M SB431542, 0.5 ⁇ M purmorphamine, 200 ng / ml SHH and 1 ⁇ M CHIR99021.
  • step 2 the cells were cultured for 8 days in Neuro / B27 supplemented with 0.5 ⁇ M LDN193189 and 1 ⁇ M CHIR99021 (13 days in total).
  • step 3 the cells were cultured for 32 days in Neuro / B27 supplemented with 0.1 mM ascorbic acid, 0.5 mM dbcAM and 3 ⁇ M PD0325901 (45 days in total). After culturing, changes in expression of various differentiation markers over time were measured using the same method as in Reference Example 3. The result of expression analysis is shown in FIG.
  • the cells were cultured under conditions in which a differentiation-inducing factor was not added (-, in the figure), conditions excluding only SHH (-SHH in the figure) or conditions excluding only purmorphamine (-Pur in the figure), From step 2 onward, the group induced to differentiate under the conditions shown in FIG. 9 was also examined.
  • Example 3 Efficiency improvement of differentiation induction from bottom plate cell to dopamine neuron
  • step 3 a factor that promotes differentiation to dopamine neuron was searched. As a result, it was found that when activin A was added in step 3, the differentiation efficiency into dopamine neurons increased.
  • FIG. 11 shows the results obtained by collecting the cultured cells and examining the variation in expression of TH and NURR1 in the same manner as in Reference Example 3.
  • TH and NURR1 proteins which are dopamine neuron markers, was examined by immunofluorescence staining using anti-TH antibody and anti-NURR1 antibody.
  • Baseplate cells are induced, Neuro / B27 supplemented with one or more of 0.1 mM ascorbic acid, 0.5 mM dbcAMP, 3 ⁇ M PD0325901, 20 ng / ml activin A on day 12 of culture, or differentiation inducer as a control It was replaced with Neuro / B27 not added and cultured for another 14 days (26 days in total). After incubation, 4% PFA was added and fixation was performed at room temperature for 30 minutes.
  • the cells were suspended in Cell Banker 2 (Toji Field) at a concentration of about 2 ⁇ 10 6 cells / ml / tube and stored frozen at ⁇ 80 ° C.
  • the cryopreserved cells were immersed in a 37 ° C. constant temperature bath, thawed, centrifuged, and then seeded at a density of 2 ⁇ 10 4 cells per well in a 96-well plate, followed by 2 weeks at 37 ° C. and 5% CO 2. Cultured.
  • the cells cultured for 2 weeks after thawing were collected, and the results of examining expression changes of dopamine neuronal markers TH, NURR1, FOXA2, and LMX1A by the same method as in Reference Example 3 are shown in FIG.
  • each differentiation marker showed the highest expression.
  • the expression level of the differentiation marker was low, indicating that the differentiation factor is essential after thawing.
  • the presence or absence of Y27632 (10 ⁇ M) was examined, but almost no difference was observed in the expression level of the marker.
  • TH and NURR1 proteins were examined by immunofluorescence staining using anti-TH antibody and anti-NURR1 antibody.
  • 4% PFA was added to the cells cultured for 2 weeks after thawing and fixed at room temperature for 30 minutes, reacted with anti-TH antibody and anti-NURR1 antibody as primary antibodies, and Alexa488 labeled according to the immunized animal of the primary antibody After sequentially reacting with the secondary antibody and Alexa568-labeled secondary antibody, they were observed with a fluorescence microscope. The results are shown in FIG.
  • the cells on differentiation induction day 26 can be cryopreserved. Further, after thawing, by adding ascorbic acid, dbcAMP, activin A and PD0325901, and culturing, the TH and NURR1 proteins are expressed. It was revealed that brain dopamine nerve can be efficiently induced.
  • the cell concentration was adjusted to 1 ⁇ 10 5 cells / ⁇ l with Neuro / B27 medium and kept on ice until transplantation. .
  • the transplantation experiment into the mouse striatum was performed as follows. Twelve 8-week-old male NOD SCID mice (Charles River Japan) were divided into Control group and Activin A group (6 mice each). For transplantation into the Control group, cells cultured with addition of ascorbic acid, dbcAMP, and PD0325901 were used. For transplantation into the activin A group, cells cultured with addition of ascorbic acid, dbcAMP, PD0325901, and activin A were used.
  • mice Under the anesthesia of pentobarbital (50 mg / kg, ip), the mouse was shaved in the head surgery area and was applied with isodine. Several minutes later, the isodine was wiped off with a member soaked with 0.1% Osban aqueous solution to disinfect the skin, and the brain was fixed to a stereotaxic apparatus (David Coff, David Kopf, USA). The scalp was incised from the midline, the periosteum was removed and the mice were exposed to Bregma and Lambda.
  • AP +0.5 mm
  • ML +1.8 mm
  • the mouse brain in stereocoordinates drill a hole in the skull using an electric drill ( ⁇ 0.5 mm), and use a Hamilton syringe Was inserted at a depth of DV: ⁇ 3.5 mm from the surface of the skull, and cells (1 ⁇ 10 5 cells / ⁇ l, 2 ⁇ l) were transplanted for 10 minutes. After transplantation, the head incision was sutured and recovered. Two animals were sampled from each group 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks after transplantation.
  • mice were decapitated after isoflurane aspiration anesthesia, the head was fixed with 4% paraformaldehyde for 24 hours, and the skull was peeled off, followed by dehydration with 30% saccharose solution for 24 hours. Thereafter, the brain was frozen and embedded, and a frozen section (40 ⁇ m) was prepared using a cryostat (Leica CM3050S). Tissue staining of dopamine neurons was performed using anti-TH antibody and anti-human specific Nuclei antibody (MAB1281, Millipore) (hNuc). Four weeks after transplantation, TH / hNuc-positive cells were slightly observed (less than 5%) from the mouse striatum in the Control group (FIG.
  • both TH / hNuc were positive in the activin A group. Many cells were observed (over 40%, right in FIG. 15).
  • both TH / hNuc positive cells increased in the brain section of the Control group compared to 4 weeks later, whereas in the activin A group, both TH / hNuc positive cells increased further compared to 4 weeks and were more than 50%.
  • FIG. 16 At 12 weeks after transplantation, TH / hNuc positive cells were further increased after 8 weeks in the brain section of the Control group, but less than 10%. In the activin A group, the TH / hNuc positive cells were not significantly increased compared to 8 weeks (FIG. 17).
  • dopamine neurons produced according to the present invention are similar to the dopamine neurons in vivo, such as responsiveness to oxidative stress and drug stimulation not observed in dopamine neurons produced by conventional methods. Has phenotype and function. Therefore, the dopamine neurons produced according to the present invention achieve a high engraftment rate in cell transplantation therapy for treating diseases caused by decreased production (release) of dopamine, such as neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease.

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Abstract

　本発明は、神経前駆細胞から高品質なドパミン神経細胞をより効率的に製造する方法、具体的には、神経前駆細胞を、（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程に付すことを特徴とする、ドパミン神経細胞の製造方法を提供する。さらに本発明は、該方法により得られたドパミン神経細胞を含む医薬、ならびに該方法に使用するための試薬およびキットも提供する。

Description

ドパミン神経細胞の製造方法
　本発明は、ドパミン神経細胞の製造方法に関する。さらに本発明は、該方法により得られたドパミン神経細胞を含む医薬、ならびに該方法に使用するための試薬およびキットも提供する。
　ドパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ；３，４−ジヒドロキシフェニルエチルアミン）は、多様な作用を持つ生体内分子であり、主に中枢神経系における神経伝達物質として機能する。生体内では、ドパミンはアミノ酸チロシンを起点としてチロシン水酸化酵素およびドーパ脱炭酸酵素の二つの酵素の働きにより細胞内で生合成される。
　ドパミン神経細胞は、神経伝達物質としてドパミンを合成し、放出する神経細胞であり、脳内では主に中脳に存在し、一部は視床下部に存在する。中脳に存在するドパミン神経細胞は、運動や情動の制御において重要な役割を果たしており、中脳ドパミン神経細胞が変性・脱落すると、例えばパーキンソン病などの重篤な神経変性疾患が引き起こされ得る。このような神経変性疾患を治療するために最も期待されている治療的アプローチの一つが、ドパミン神経細胞を対象に移植する細胞移植療法である。
　現在、ドパミン神経細胞を得る方法として、胚性幹細胞（本明細書中、ＥＳ細胞と称することがある）や人工多能性幹細胞（本明細書中、ｉＰＳ細胞と称することがある）などの幹細胞を神経外胚葉に分化させた後、さらにドパミン神経細胞へと分化誘導する方法が知られている。
　最近、底板細胞（ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔｅ　ｃｅｌｌｓ）から中脳のドパミン神経細胞が産生されることが報告された。また、中脳ドパミン神経細胞を得るために２種類のＳＭＡＤ（Ｓｍａｌｌ　Ｍｏｔｈｅｒｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）シグナリング阻害剤を用いて幹細胞を底板細胞に分化させる方法（特許文献１、非特許文献１）や、ヒト幹細胞から底板細胞を誘導し、さらに神経栄養因子とともに底板細胞を培養することにより中脳ドパミン神経細胞を誘導する方法（特許文献２、非特許文献２~４）、ヒトＥＳ細胞にＧＳＫ３ｂｅｔａ阻害剤およびアクチビン／Ｎｏｄａｌ阻害剤を作用させることにより効率的に底板細胞を誘導する方法（非特許文献５）が相次いで報告されている。
　しかし、これらの方法によって得られるドパミン神経細胞の産生効率は依然として低く、また、当該細胞は酸化ストレスや薬剤刺激への応答性をインビトロで再現できないなど機能的にも十分でない。従って、高品質のドパミン神経細胞を効率的に得る方法の開発が依然として求められている。
米国特許出願公開第２０１２／００９４３８１号明細書 国際公開第２０１３／０６７３６２号パンフレット
Ｆａｓａｎｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　６（２０１０）３３６−３４７ Ｋｒｉｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　４８０（２０１１）５４７−５５３ Ｋｉｒｋｅｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１（２０１２）７０３−７１４ Ｘｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　３０（２０１２）１６５５−１６６３ Ｄｅｎｈａｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　３０（２０１２）２４００−２４１１
　本発明の目的は、高品質なドパミン神経細胞をより効率的に製造する方法を提供することである。さらに本発明は、該方法により得られたドパミン神経細胞を含む医薬、ならびに該方法に使用するための試薬およびキットの提供も目的とする。
　本発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意検討した結果、神経前駆細胞を（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養することにより、高密度に、再現性良くドパミン神経細胞を製造できることを見出した。さらに、得られたドパミン神経細胞が、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質および機能を有するなど、高品質なドパミン神経細胞であることを確認し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、以下を提供する。
［１］底板細胞を、以下の工程（１）に付すことを特徴とする、ドパミン神経細胞の製造方法：
（１）（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程；
［２］培地が、さらにアスコルビン酸またはその塩を含む培地である、上記［１］記載の製造方法；
［３］培地が、さらにアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地である、［２］記載の製造方法；
［４］ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰである、［１］記載の製造方法。
［５］ＭＥＫ阻害剤が
（ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、
（ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド（ＰＤ１８４３５２）、または
（ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸（ＳＵ５４０２）
である、［１］記載の製造方法；
［６］アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、［３］記載の製造方法；
［７］ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰであり、
ＭＥＫ阻害剤が
（ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、
（ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド（ＰＤ１８４３５２）、または
（ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸（ＳＵ５４０２）
であり、
アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、［３］記載の製造方法；
［８］［１］記載の製造方法で得られたドパミン神経細胞を含む、医薬；
［９］（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための試薬；
［１０］（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するためのキット；
［１１］底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤の使用。
　本発明によれば、神経前駆細胞から高品質のドパミン神経細胞をより効率的に製造することができる。本発明により製造されたドパミン神経細胞は、従来の方法により製造されたドパミン神経細胞では観察されなかった酸化ストレスや薬剤刺激への応答性が観察されるなど、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有する。従って、本発明により製造されたドパミン神経細胞は、ドパミンの産生（放出）の低下に起因する疾患、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患を治療するための細胞移植療法において、高い生着率を達成でき、極めて有用であるだけでなく、当該疾患の予防および／または治療に有用な化合物のスクリーニング、化合物の毒性評価、創薬ターゲットの検証、疾患メカニズムの解析など様々な用途に使用することができる。
　図１は分化誘導因子を様々な組み合わせで添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて底板細胞を誘導し、培養１３日目に底板細胞マーカーの発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔−〕は各分化誘導因子を添加しない場合、〔Ａｌｌ〕はＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ）、ＳＢ４３１５４２（ＳＢ）、Ｓｏｎｉｃ　Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、プルモルファミン（Ｐｕｒ）およびＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ）の５種類すべてを使用した条件を示す。〔−因子名〕はそれぞれの因子を除いた条件を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
　図２は底板細胞を誘導し、培養１３日目に抗ＦＯＸＡ２抗体および抗ＬＭＸ１Ａ抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株を用いた。赤色はＦＯＸＡ２陽性細胞の核、緑色はＬＭＸ１Ａ陽性細胞の核、青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
　図３は底板細胞を誘導後１３日目から、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）およびＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）を様々な組み合わせで添加して培養を行い、４５日目にＮＵＲＲ１の発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
　図４は図３と同様に分化誘導を行い、培養４５日目に抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を示す。
　図５は底板細胞を誘導後１３日目から、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）およびＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）を添加して培養を行い、４５日目（２５３Ｇ１株）または５２日目（２０１Ｂ７株）に抗ＴＨ抗体、抗ＮＵＲＲ１抗体および抗ＦＯＸＡ２抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を、マゼンタ色はＦＯＸＡ２陽性細胞の核を、青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
　図６は図５の２５３Ｇ１株を用いて得られた結果について高倍率で観察した図を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を、青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
　図７は図５と同様に分化誘導を行い、培養５０日目に高ＫＣｌ刺激によるドパミンの放出能を評価した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用い、独立した２つの実験結果を示す。ＣｔｒｌはＨＢＳＳで、ＫＣＬは５５ｍＭ　ＫＣｌを含むＨＢＳＳで刺激した条件を示す。また、Ｙ軸の値はコントロール群のドパミン放出量を１としたときの相対値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
　図８は底板細胞を誘導後１３日目から、アスコルビン酸（ＡＡ）およびジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）に加え、各種ＭＥＫ阻害剤（ＦＧＦＲ阻害剤を含む）を添加して培養を行い、４５日目にＮＵＲＲ１の発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
　図９はヒトｉＰＳ細胞からの底板細胞およびドパミン神経細胞への分化誘導法の模式図を示す。
　図１０は図９の方法に従って分化誘導を行った際の、各種分化マーカーの経時的な発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔Ａｌｌ〕は図９に従って行い、〔−〕はＣＨＩＲ９９０２１、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨおよびプルモルファミンを除いて、〔−ＳＨＨ〕はＳＨＨのみを除いて、〔−Ｐｕｒ〕はプルモルファミンのみを除いて分化誘導を行ったことを示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
　図１１は図９で示した工程３において、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）およびアクチビンＡ（Ａｃｔ）を様々な組み合わせで添加して分化誘導を行い、培養２６日目にドパミン神経細胞マーカーの発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔−〕は各分化誘導因子を添加しない場合を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
　図１２は図１１と同様に分化誘導を行い、培養２６日目に抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を示す。
　図１３は図９で示した工程３において、アスコルビン酸（ＡＡ）、ジブチリルｃＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、ＰＤ０３２５９０１（ＰＤ）およびアクチビンＡ（ＡＣＴ）を添加して分化誘導を行い、培養２６日目に細胞を凍結保存した。この細胞を解凍し、ＡＡ、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤおよびＡＣＴを様々な組み合わせで添加して２週間培養した後、ドパミン神経マーカーの発現変動を定量ＲＴ−ＰＣＲで調べた結果を示す。〔−〕は各分化誘導因子を添加しない場合を示す。細胞株は２５３Ｇ１株と２０１Ｂ７株を用いた。Ｙ軸の値は各遺伝子のコピー数をＧＡＰＤＨのコピー数で補正した値を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
　図１４は図１３と同様に凍結保存した細胞を解凍し、ＡＡ、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤおよびＡＣＴを添加して２週間培養した後、抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はＮＵＲＲ１陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
　図１５は図９で示した工程３において、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１（Ｃｏｎｔｒｏｌ群；左側４枚のパネル）またはアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１およびアクチビンＡ（ＡｃｔｉｖｉｎＡ群；右側４枚のパネル）を添加して分化誘導を行い、培養２６日目に細胞を回収してマウス線条体に移植した。移植４週後、組織染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はｈＮｕｃ陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
　図１６は図１５と同様に移植を行い、移植８週後に組織染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はｈＮｕｃ陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
　図１７は図１５と同様に移植を行い、移植１２週後に組織染色を実施した結果を示す。緑色はＴＨ陽性細胞の細胞体を、赤色はｈＮｕｃ陽性細胞の核を示す。青色（ＤＡＰＩ染色）は細胞核を示す。
　以下、本発明を説明する。本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味を有する。
　本明細書において、「ドパミン神経細胞」とは、ドパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ；３，４−ジヒドロキシフェニルエチルアミン）を産生する能力を有する神経細胞を意味する。ドパミン神経細胞は常にドパミンを産生している必要はなく、ドパミン産生能力を有していればよい。また、産生されるドパミン量は特に限定されない。
　生体内に存在するドパミン神経細胞のなかでも特に黒質緻密部や腹側被蓋野などの中脳に存在するドパミン神経細胞は、インビトロでは、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＦＯＸＡ２（ｆｏｒｋｈｅａｄ　ｂｏｘ　Ａ２）、ＮＵＲＲ１（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ　１）遺伝子／タンパク質などの特定の細胞マーカーの発現により特徴付けることができる。また、上記中脳に存在するドパミン神経細胞は、インビトロでは、ＴＨ、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ（ＬＩＭ　ｈｏｍｅｏｂｏｘ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１　ａｌｐｈａ）、ＮＵＲＲ１遺伝子／タンパク質などの特定の細胞マーカーの発現でも特徴付けることができる。
　底板細胞を本発明の製造方法に供して得られる「ドパミン神経細胞」は、中脳に存在するドパミン神経細胞（すなわち、中脳ドパミン神経細胞）である。
　本明細書において、「神経前駆細胞」とは、分化後にドパミン神経細胞を生成することのできる細胞をいい、具体的には、例えば、底板細胞、中間体フィラメントタンパク質Ｎｅｓｔｉｎなどの発現マーカーにより特徴付けられる神経外胚葉の細胞などが挙げられるが、最も好ましくは底板細胞である。
　本明細書において、「底板細胞」（ｆｌｏｏｒ　ｐｌａｔｅ　ｃｅｌｌ）とは、脊髄から間脳にかけて、神経管の腹側正中に位置する形態的に特殊化したオーガナイザー細胞を意味する。底板細胞のなかでも特に腹側中脳に位置する底板細胞は、インビトロでは、ＦＯＸＡ２やＬＭＸ１Ａ遺伝子／タンパク質などの特定の細胞マーカーの発現により特徴付けることができる。
　本明細書において、「幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ生体を構成する複数系列の細胞に分化しうる細胞をいう。具体的にはＥＳ細胞、胎児の始原生殖細胞由来の多能性幹細胞（ＥＧ細胞：Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９９８，９５：１３７２６−３１）、精巣由来の多能性幹細胞（ＧＳ細胞：Ｎａｔｕｒｅ．２００８，４５６：３４４−９）、体細胞由来人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ　ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ；ｉＰＳ細胞）、ヒト多能性体性幹細胞（神経幹細胞）が挙げられ、好ましくは、ｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞、さらに好ましくはｉＰＳ細胞である。
　ＥＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するＥＳ細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ＥＳ細胞の好ましい例としては、ヒトに由来するＥＳ細胞が挙げられる。
　ＥＳ細胞の具体例として、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物などのＥＳ細胞、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立したＥＳ細胞、およびこれらのＥＳ細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変したＥＳ細胞が挙げられる。
　各ＥＳ細胞は当該分野で通常実施されている方法や、公知文献に従って調製することができる。
　マウスのＥＳ細胞は、１９８１年にエバンスら（Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４−６）や、マーチンら（Ｍａｒｔｉｎ　ＧＲ．ｅｔ　ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　７８：７６３４−８）によって樹立されており、例えば大日本住友製薬株式会社（大阪、日本）などから購入可能である。
　ヒトのＥＳ細胞は、１９９８年にトムソンら（Ｔｈｏｍｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２：１１４５−７）によって樹立されており、ＷｉＣｅｌｌ研究施設（ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／、マジソン、ウイスコンシン州、米国）、米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ）、京都大学などから入手可能であり、例えばＣｅｌｌａｒｔｉｓ社（ウェブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌａｒｔｉｓ．ｃｏｍ／、スウェーデン）などから購入可能である。
　ｉＰＳ細胞としては、任意の温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するｉＰＳ細胞を使用できる。該哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。ｉＰＳ細胞の好ましい例としては、ヒトに由来するｉＰＳ細胞が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞の具体例として、皮膚細胞などの体細胞に複数の遺伝子を導入して得られる、ＥＳ細胞同様の多分化能を獲得した細胞が挙げられ、例えばＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ−Ｍｙｃ遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子およびＳｏｘ２遺伝子を導入することによって得られるｉＰＳ細胞（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　２００８；２６：１０１−１０６）が挙げられる。他にも、導入遺伝子をさらに減らした方法（Ｎａｔｕｒｅ．２００８　Ｊｕｌ　３１；４５４（７２０４）：６４６−５０）、低分子化合物を利用した方法（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００９　Ｊａｎ　９；４（１）：１６−９、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００９　Ｎｏｖ　６；５（５）：４９１−５０３）、遺伝子の代わりに転写因子タンパク質を利用した方法（Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２００９　Ｍａｙ　８；４（５）：３８１−４）などが挙げられる。
　作製されたｉＰＳ細胞は、その作出方法によらずいずれも本発明に用いられうる。
　ヒトｉＰＳ細胞株としては、具体的には、２５３Ｇ１株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４を発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、２０１Ｂ７株（３６歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、１５０３−ｉＰＳ（２９７Ａ１）（７３歳女性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、１３９２−ｉＰＳ（２９７Ｆ１）（５６歳男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）、ＮＨＤＦ−ｉＰＳ（２９７Ｌ１）（新生児男性の皮膚線維芽細胞にＯＣＴ４／ＳＯＸ２／ＫＬＦ４／ｃ−ＭＹＣを発現させて作製されたｉＰＳ細胞株）などが挙げられる。
１．ドパミン神経細胞の製造方法
　本発明は、神経前駆細胞を、以下の工程（１）に付すことを特徴とする、ドパミン神経細胞の製造方法（以下、本発明の製造方法と称することもある）：（１）（ｉ）ｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ　ａｄｅｎｏｓｉｎｅ　ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）アナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程、を提供する。
　本発明の製造方法で使用される神経前駆細胞を得る方法としては、特に限定されず、対象となる動物胚から直接採取することもできるが、大量に神経前駆細胞を得るという観点からは、幹細胞を出発材料として製造することが好ましい。
　幹細胞から神経前駆細胞を製造する方法としては、特に限定されず、低分子ＢＭＰ阻害剤の存在下で多能性幹細胞を培養する方法や、ストローマ細胞との共培養による分化誘導法（ＳＤＩＡ法）など自体公知の方法を利用することができる。
　本発明の製造方法で使用される神経前駆細胞は、分化後にドパミン神経細胞を生成することができる限りいずれの細胞であってもよいが、底板細胞を出発細胞として使用することが最も好ましい。従って、以下に、幹細胞を底板細胞に分化させる方法を具体的に記載する。
１−１．幹細胞を底板細胞に分化させる方法
　本分化方法は、底板細胞分化誘導因子を含む培地で幹細胞を培養する工程を含む。
　本分化方法（分化誘導方法）において幹細胞は、通常培養器上で培養される。ここで用いられる培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。好ましくは、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレートなどである。培養器は、幹細胞を維持・培養するのに適するようなコーティングが施されていることが好ましい。具体的にはフィーダー細胞や、細胞外基質成分でコーティングされた培養器を用いることが好ましい。フィーダー細胞としては、特に限定されないが、例えば、線維芽細胞（マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）、マウス線維芽細胞（ＳＴＯ）など）が挙げられる。フィーダー細胞は自体公知の方法、例えば放射線（ガンマ線など）照射や抗癌剤（マイトマイシンＣなど）処理などで不活化されていることが好ましい。細胞外基質成分としては、ゼラチン、コラーゲン、エラスチンなどの繊維性タンパク質、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などのグルコサミノグリカンやプロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンなどの細胞接着性タンパク質、あるいはマトリゲルなどの基底膜成分などが挙げられる。
　本分化方法で使用される底板細胞分化誘導因子は、底板細胞への分化を誘導する物質であれば特に限定されず、底板細胞分化誘導因子として公知のいかなる物質をも使用することができる。ここで、物質には、低分子化合物、ペプチド、タンパク質などが含まれる。底板細胞分化誘導因子の例としては、ＢＭＰ阻害剤、例えば、Ｎｏｇｇｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９（４‐（６‐（４‐（ピペラジン‐１‐イル）フェニル）ピラゾロ［１，５‐ａ］ピリミジン‐３‐イル）キノリン塩酸塩）、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（６−［４−（２−ピペリジン−１−イルエトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イルピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン）など；ＴＧＦβファミリー阻害剤、例えば、ＳＢ４３１５４２（４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミド）、Ａ−８３−０１（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１−フェニルチオカルバモイル−４−キノリン−４−イルピラゾール）など；ＧＳＫ３β阻害剤、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１（６−［［２−［［４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］−３−ピリジンカルボニトリル）、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）など；Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ　ａｇｏｎｉｓｔ、例えば、プルモルファミン（Ｎ−（４−モルフォリノフェニル）−２−（１−ナフチルオキシ）−９−シクロヘキシル−９Ｈ−プリン−６−アミン）、ＳＡＧ（Ｎ−メチル−Ｎ’−（３−ピリジニルベンジル）−Ｎ’−（３−クロロベンゾ［ｂ］チオフェン−２−カルボニル）−１，４−ジアミノシクロヘキサン）など；成長因子、例えば、Ｓｏｎｉｃ　ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、線維芽細胞増殖因子−８（ＦＧＦ８）などが挙げられる。これらはＡｘｏｎ　Ｍｅｄｃｈｅｍ　ＢＶ社、和光純薬工業社、Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｍｅｒｃｋ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｔｏｃｒｉｓ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｓｉｇｍａ社、Ｒ＆Ｄ社、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一の商品名であれば、同一の物質を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
　本発明者らは、本分化方法において、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１（任意選択でＳＨＨを含んでもよい）を含む培地で３~５日間一次培養した後、ＬＤＮ１９３１８９およびＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で５~８日間二次培養することにより、より効率的に幹細胞を底板細胞へと分化誘導することができることを見出した。
　従って、上記底板細胞分化誘導因子としてＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１を組み合わせて用いることにより、ＳＨＨなどのタンパク成分を培地に添加しなくとも、効率的に幹細胞を底板細胞へと分化誘導することができ、従来よりも安価に底板細胞、ひいてはドパミン神経細胞を製造することが可能となる。
　本分化方法における培地中の底板細胞分化誘導因子の濃度は、用いる因子の種類によって適宜設定されるが、例えば、底板細胞分化誘導因子としてＬＤＮ１９３１８９、プルモルファミン、ＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、それぞれ、通常０．０５~１０μＭ、好ましくは０．１~５μＭである。底板細胞分化誘導因子としてＳＢ４３１５４２を使用する場合の濃度は、通常１~２０μＭ、好ましくは５~１５μＭである。底板細胞分化誘導因子としてＳＨＨを使用する場合の濃度は、通常１０~５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００~３００ｎｇ／ｍｌである。
　本分化方法で用いる培地は、上記底板細胞分化誘導因子を含有している限り特に限定されず、通常、幹細胞を培養するのに用いられる培地（以下では、基礎培地と称することもある）に底板細胞分化誘導因子を添加してなるものである。
　上記基礎培地は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地、Ｎｅｕｒａｌ　Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　Ｂａｓａｌ培地、ＮＳ−Ａ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ　１０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ　ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　ＺｉｎｃＯｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ　ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。これらの基礎培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の培地であれば培地の組成は製造元によらず同等である。底板細胞への分化誘導がより効率的に行えるという点で、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地、およびこれらの混合培地が基礎培地として好適に用いられる。
　本分化方法で用いられる培地は、血清含有培地であっても無血清培地であってもよい。ここで、無血清培地とは、無調整または未精製の血清を含まない基礎培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、成長因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。本分化方法で用いられる培地が血清含有培地である場合、該血清としてはウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）などの哺乳動物の血清が使用できる。該血清の培地中の濃度は通常０．０１~２０重量％、好ましくは０．１~１０重量％である。
　本分化方法で用いられる培地はまた、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン）、Ｂ−２７サプリメント、Ｎ２サプリメント、ノックアウトシーラムリプレースメント、２−メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール、またはこれらの均等物が挙げられる。これらの培地中の濃度は、前記した血清の培地中の濃度と同様である。
　本分化方法では、血清代替物としてＮ２サプリメントやＢ−２７サプリメント（Ｂｒｅｗｅｒ　Ｇ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．（１９９３）３５，５６７）が好適に培地中に添加され得る。
　その場合、培地中のＮ２サプリメントの濃度は、０．１~１０重量％が好ましく、より好ましくは０．５~２重量％であり、Ｂ−２７サプリメントの濃度は、０．１~１０重量％が好ましく、より好ましくは１~５重量％である。
　ノックアウトシーラムリプレースメントはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入可能である。その他の血清代替物については、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＳＩＧＭＡ社、和光純薬工業社、大日本住友製薬社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一商品名の試薬あるいは添加物であれば組成は製造元によらず同等である。
　本分化方法で用いられる培地はまた、脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、抗生物質（例えばペニシリンやストレプトマイシン）または抗菌剤（例えばアンホテリシンＢ）などを含有してもよい。これらの培地中の濃度は、前記した血清の培地中の濃度と同様である。
　培養温度、ＣＯ２濃度などの他の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、特に限定されるものではないが、例えば約３０~４０℃、好ましくは約３７℃である。また、ＣＯ２濃度は、例えば約１~１０％、好ましくは約５％である。
　本分化方法において、幹細胞が底板細胞に分化したことの確認は、底板細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（本明細書において、上記タンパク質や遺伝子を底板細胞マーカーと称することがある）の発現変動を評価することによって行うことができる。上記底板細胞マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現評価方法などによって行なうことができる。中脳に分化する上記底板細胞マーカーの例としては、ＦＯＸＡ２やＬＭＸ１Ａ遺伝子／タンパク質が挙げられる。
１−２．神経前駆細胞からドパミン神経細胞を製造する方法（本発明の製造方法）
　上記分化方法により得られた底板細胞などの神経前駆細胞は、（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程により、ドパミン神経細胞へとさらに分化させることができる。神経前駆細胞として底板細胞を使用する場合、本発明の製造方法によれば、底板細胞からドパミン神経細胞への分化誘導時に通常使用される脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）やグリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などの神経栄養因子の培地への添加は必須ではない。
　本発明の製造方法で使用されるｃＡＭＰアナログは、細胞との接触時に細胞内ｃＡＭＰ濃度を上昇させることが可能な、ｃＡＭＰに類似した構造を有する化合物であれば特に限定されない。
　上記ｃＡＭＰアナログの例としては、８−ブロモｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、Ｎ６−ベンゾイルｃＡＭＰ、８−チオメチルｃＡＭＰなどが挙げられる。これらは、Ｓｉｇｍａ社、Ｍｅｒｃｋ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、和光純薬工業社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一の商品名であれば、同一の物質を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
　本発明の製造方法において使用されるｃＡＭＰアナログとしては、ジブチリルｃＡＭＰが好ましい。
　ｃＡＭＰアナログの培地中の濃度は、用いるｃＡＭＰアナログの種類によって適宜設定されるが、ｃＡＭＰアナログとしてジブチリルｃＡＭＰを用いる場合の濃度は、通常０．０１~５ｍＭ、好ましくは０．１~１ｍＭである。
　本発明の製造方法で使用されるＭＥＫ阻害剤は、ＭＡＰキナーゼキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ／ＥＲＫ　Ｋｉｎａｓｅ；ＭＥＫ）阻害活性を有する物質を指し、ＭＥＫの働きを阻害する限り、ＭＥＫシグナル伝達経路の上流因子に対する阻害剤（例えば、ＦＧＦレセプター阻害剤）も本発明のＭＥＫ阻害剤に含まれる。
　上記ＭＥＫ阻害剤の例としては、ＰＤ０３２５９０１（Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−イオドフェニル）アミノ］−ベンズアミド）、ＰＤ１８４３５２（２−（２−クロロ−４−イオドフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド）、ＳＵ５４０２（３−［４−メチル−２−（２−オキソ−１，２−ジヒドロ−インドール−３−イリデンメチル）−１Ｈ−ピロール−３−イル］−プロパン酸）、ＰＤ１７３０７４（Ｎ−［２−［［４−（ジエチルアミノ）ブチル］アミノ−６−（３，５−ジメトキシフェニル）ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル］−Ｎ′−（１，１−ジメチル）尿素）などが挙げられる。これらは、Ａｘｏｎ　Ｍｅｄｃｈｅｍ　ＢＶ社、和光純薬工業社、Ｅｎｚｏ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．社、Ｍｅｒｃｋ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｔｏｃｒｉｓ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社、Ｓｉｇｍａ社などから購入可能であり、同一名称あるいは同一の商品名であれば、同一の物質を指し、構造ならびに物性は製造元によらず同等である。また、市販品として入手できない場合であっても、当業者であれば既知文献に従って調製することもできる。
　また、ＭＥＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡなどもＭＥＫ阻害剤として使用することができる。これらはいずれも商業的に入手可能であるか既報に従って合成することができる。
　本発明の製造方法において使用されるＭＥＫ阻害剤としては、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２またはＳＵ５４０２が好ましい。
　ＭＥＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＭＥＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、ＭＥＫ阻害剤としてＰＤ０３２５９０１またはＰＤ１８４３５２を使用する場合の濃度は、通常０．１~１０μＭ、好ましくは１~５μＭである。ＭＥＫ阻害剤としてＳＵ５４０２を使用する場合の濃度は、通常０．１~２０μＭ、好ましくは５~１５μＭである。
　本発明の製造方法において、ｃＡＭＰアナログとＭＥＫ阻害剤とは、培地中に同時に添加されてもよく、また、神経前駆細胞からドパミン神経細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。ｃＡＭＰアナログとＭＥＫ阻害剤とは、培地中に同時に添加されることが簡便であり、また好ましい。
　本発明の製造方法で用いる培地は、上記１−１．の分化方法で例示した基礎培地（所望により前記で例示した各種添加物、血清または血清代替物を含有していてもよい）にｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤を添加することにより作製される。
　本発明の製造方法で用いられる培地は、前記の底板細胞の製造方法にて用いた基礎培地と同種の基礎培地を用いて作製されたものであっても、異種の基礎培地を用いて作製されたものであってもよいが、同種の基礎培地を用いて作製されたものであることが好ましい。
　本発明の製造方法で用いる培地に、上記のｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤に加えて、アスコルビン酸またはその塩を加えることにより、さらに効率的に高品質のドパミン神経細胞を製造することができる。
　本発明の製造方法で使用され得るアスコルビン酸塩の例としては、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カリウム、アスコルビン酸カルシウムなどが挙げられるが、これらに限定されない。
　アスコルビン酸またはその塩が培地に添加される場合の濃度は、通常０．０１~１０ｍＭ、好ましくは０．０５~１ｍＭである。
　アスコルビン酸またはその塩は、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地に添加されてもよく、また、神経前駆細胞からドパミン神経細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。アスコルビン酸またはその塩は、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地中に添加されることが簡便であり、また好ましい。
　本発明の製造方法においては、上記のｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤に加えて、アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を培地に添加して神経前駆細胞を培養することにより、さらに効率的に高品質のドパミン神経細胞を製造することができるばかりでなく、ドパミン神経細胞への分化誘導期間も短縮することができる。アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としては、アクチビン受容体様キナーゼ−４及び／又はアクチビン受容体様キナーゼ−７を活性化する限り特に限定されないが、例えば、ｎｏｄａｌ、ＧＤＦ−１、Ｖｇ１、アクチビンなどが挙げられる。好ましくはアクチビン（特に、アクチビンＡ）である。
　アクチビンはＴＧＦβ（トランスフォーミング増殖因子β）ファミリーに属する大きさ２４ｋＤのペプチド性細胞増殖、分化因子であり、２個のβサブユニットがＳＳ結合を介して２量体を構成している（Ｌｉｎｇ，Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１，７７９−７８２；Ｖａｌｅ，Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１，７７６−７７９）。アクチビンには、アクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＡＢが知られているが、本発明の製造方法においてはアクチビンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＡＢのいずれのアクチビンも使用することができる。本発明の製造方法でアクチビンを使用する場合には、アクチビンとしては特にアクチビンＡが好適に用いられる。また、該アクチビンとしてはヒト、マウスなどいずれの哺乳動物由来のアクチビンをも使用することができる。本発明の製造方法にてアクチビンを使用する場合には、用いる神経前駆細胞と同一の動物種由来のアクチビンを用いることが好ましく、例えばヒト由来の神経前駆細胞を出発原料とする場合、ヒト由来のアクチビンを用いることが好ましい。これらのアクチビンは商業的に入手可能である。
　本発明の製造方法における培地中のアクチビンの濃度は、用いるアクチビンの種類によって適宜設定されるが、アクチビンとしてアクチビンＡを使用する場合の濃度は、通常０．１~２００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５~１５０ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０~１００ｎｇ／ｍｌである。
　アクチビンは、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地に添加されてもよく、また、神経前駆細胞からドパミン神経細胞への分化を誘導し得る限り、別個に時間差を設けて培地中に添加されてもよい。アクチビンは、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤と同時に培地中に添加されることが簡便であり、また好ましい。
　本発明の製造方法は、神経前駆細胞の培養に適した培養温度（通常３０~４０℃、好ましくは３７℃程度）で、１~１０％（好ましくは５％）の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーター内にて培養することによって実施される。
　本発明の製造方法において、神経前駆細胞がドパミン神経細胞に分化したことの確認は、ドパミン神経細胞特異的に発現するタンパク質や遺伝子（本明細書において、上記タンパク質や遺伝子をドパミン神経細胞マーカーと称することがある）の発現変動を評価することによって行うことができる。上記ドパミン神経細胞マーカーの発現変動の評価は、例えば、抗原抗体反応を利用したタンパク質の発現評価方法、定量ＲＴ−ＰＣＲを利用した遺伝子発現評価方法などによって行なうことができる。中脳に存在する上記ドパミン神経細胞マーカーの例としては、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、ＦＯＸＡ２、ＬＭＸ１Ａ、ＮＵＲＲ１遺伝子／タンパク質が挙げられる。
　また、本発明の製造方法により得られたドパミン神経細胞が、インビボにおけるドパミン神経細胞と同質の機能を有することの確認は、ドパミンの放出、酸化ストレスや薬剤刺激への応答性を評価することによって行うことができる。
　本発明の製造方法を用いれば、上記１−１．の分化方法により得られた底板細胞以外の底板細胞または神経前駆細胞を出発材料として、高品質のドパミン神経細胞を効率良く製造することもできる。
　本発明の製造方法では、神経前駆細胞をドパミン神経細胞へと効率的に分化誘導することにより、高品質のドパミン神経細胞を大量に製造することができる。このドパミン神経細胞は、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有することから、ドパミンの産生（放出）の低下に起因する疾患、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患を治療するための細胞移植療法において医薬として利用すれば、高い生着率を達成できる。また、当該疾患の治療薬を開発するためのツールとしても有用である。
　本発明の製造方法の過程で得られる細胞及び本発明のドパミン神経細胞は、凍結保存及び解凍することができる。細胞の凍結及び解凍方法は、当該分野において公知であり、細胞の分化能、生存能、ドパミン産生能等に影響しない限り、特に限定されない。例えば、本発明のドパミン神経細胞は、ＰＢＳで洗浄後、細胞分散液（例、Ａｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により細胞を培養皿から剥離させた後、細胞分散液を除き、凍結保存液（例、セルバンカー２（株式会社ＬＳＩメディエンス））に懸濁して、−８０℃で保存することができる。また、解凍方法としては、例えば、３７℃の恒温槽中で解凍し、凍結保存液を遠心洗浄後、培地に懸濁させて用いる方法等が挙げられる。本発明の製造方法の過程で得られる細胞を凍結及び融解した場合、融解後の細胞からも、Ｎｕｒｒ１陽性ドパミン神経を誘導することが可能である。
２．ドパミン神経細胞を含む医薬
　本発明は、上記した本発明の製造方法により製造されたドパミン神経細胞を含む医薬（本明細書中、本発明の医薬と略記する場合がある）を提供する。
　ここでドパミン神経細胞は、上記した本発明の製造方法により得られた細胞であれば特に限定されない。
　該医薬において、ドパミン神経細胞はそのまま、もしくはフィルター濾過などにより濃縮したペレットなどの細胞塊などとして用いられる。さらに、該医薬は、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などの保護剤を加え、凍結保存することもできる。該医薬は、医薬として、より安全に利用するために、加熱処理、放射線処理など、ドパミン神経細胞としての機能を残しつつ、病原体のタンパク質が変性する程度の条件下での処理に付してもよい。また、ドパミン神経細胞が必要量以上に増殖することを防止するために、上記処理と組み合わせて、マイトマイシンＣ前処理などによる増殖の抑制や、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を当該細胞に導入して、その後、必要に応じて未活性型の薬を投与し、哺乳類が自然には持っていない代謝酵素の遺伝子を導入した細胞の中だけでその薬を毒物に変化させて細胞を死滅させる方法（自殺遺伝子療法）などの処理に付してもよい。
　本発明の医薬は、安全で低毒性であり、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ブタ、サル）に投与することができる。
　本発明の医薬のヒトへの投与形態（移植方法）としては、例えば、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２，１１３７（１９９９）もしくはＮ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ．；３４４：７１０−９（２００１）に記載されるような手法が挙げられる。好ましくは、本発明の医薬は、脳のドパミン欠乏領域へと投与（移植）される。
　本発明の医薬において、患者本人の細胞あるいは組織適合型が許容範囲のドナーの細胞を用いて作製されたドパミン神経細胞を用いることが好ましいが、年齢や体質などの理由から充分な細胞が得られない場合には、ポリエチレングリコールやシリコンのようなカプセル、多孔性の容器などに包埋して拒絶反応を回避した状態で移植することも可能である。また、本発明の医薬の投与量（移植量）および投与回数（移植回数）は、投与される患者の年齢、体重、症状などによって適宜決定することができる。
　本発明のドパミン神経細胞を含む医薬は、それ自体の投与（移植）により、患者体内に効率的に生着でき、その結果、患者体内での効率的なドパミンの産生（放出）が可能となる。従って、本発明の医薬は、ドパミンの産生（放出）低下に起因する疾患、例えば、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、てんかんおよび統合失調症などの神経変性疾患の治療に有用である。
３．その他の用途
　本発明のドパミン神経細胞は、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有するため、医薬化合物、好ましくは神経変性疾患治療用化合物のスクリーニングに有用である。例えば、試験化合物を単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、本発明のドパミン神経細胞に加え、当該細胞の形態または機能的な変化を測定することにより、当該試験化合物が医薬として有用であるか否かを評価することができる。機能的な変化の例としては、当該細胞から産生または放出されるドパミン量を計測することにより行うことができる。ここで、ドパミン神経細胞は、治療対象となる疾患と同様の表現型を呈する細胞が好ましく、特に好ましくは、疾患由来の体細胞から作製された幹細胞を分化誘導することにより製造されたドパミン神経細胞である。
　試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられる。ここで試験化合物は塩を形成していてもよい。該塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アルミニウム塩）などとの塩が用いられ、この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、または有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アルミニウム塩が用いられ得る。
　上記スクリーニングを用いて得られる医薬は、生理学的に許容し得る添加剤を用いて、公知の方法に従って製剤化することができる。
　このようにして得られる製剤の剤形としては、例えば、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などの経口剤；注射剤などの非経口剤が挙げられる。これら製剤における有効成分（上記スクリーニング方法により選択された化合物）の含量は例えば、０．１~９０重量％である。
　前記添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムなどの結合剤；結晶性セルロースなどの賦形剤；コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などの膨化剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、アカモノ油、チェリーなどの香味剤；油脂、注射用水、植物油（例えば、ゴマ油、ヤシ油、大豆油）、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）などの液状担体；溶解補助剤（例えば、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）；非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ−５０）；溶解補助剤（例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール）；無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン）；安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール）；保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノール）；酸化防止剤が挙げられる。
　前記注射用水としては、例えば、生理食塩水；ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどを含む等張液があげられる。
　上記スクリーニングによって得られる医薬（好ましくは、神経変性疾患治療薬）は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー）に対して経口的または非経口的に投与することができる。
　該医薬の投与量および投与回数は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより適宜設定される。
　本発明のドパミン神経細胞は、化合物の毒性評価に用いることもできる。例えば、試験化合物を単独でまたは他の薬剤と組み合わせて、本発明のドパミン神経細胞に加え、当該細胞の形態または機能的な変化を測定することにより、当該試験化合物が毒性を有するか否かを評価することができる。機能的な変化の例としては、当該細胞から産生または放出されるドパミンの量を計測することにより行うことができる。
　試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿が挙げられる。ここで試験化合物は、上記スクリーニングに記載したような塩を形成していてもよい。
　本発明の製造方法により得られたドパミン神経細胞は、さらに、創薬ターゲットの検証や疾患メカニズムの解析などにも使用することができる。
　別の実施態様において、本発明は、（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、神経前駆細胞からドパミン神経細胞を製造するための試薬およびキットも提供する。
　上記試薬およびキットは、さらに（１）アスコルビン酸またはその塩および／または（２）アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含んでいてもよい。
　上記ｃＡＭＰアナログ、ＭＥＫ阻害剤およびアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤としては、本発明の製造方法に使用可能であるものが挙げられる。
　本明細書中で挙げられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
　以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
［参考例１］
未分化ヒトｉＰＳ細胞の維持培養
　ヒトｉＰＳ細胞としては２５３Ｇ１株（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２００８；２６：１０１−１０６）または２０１Ｂ７株（Ｃｅｌｌ．２００７；１３１：８６１−８７２）を使用した。
　未分化状態のｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１株または２０１Ｂ７株）の維持培養は、（ｉ）フィーダー細胞を使用する方法、または（ｉｉ）使用しない方法の２通りで行った。
（ｉ）フィーダー細胞を使用する方法
　フィーダー細胞としてマイトマイシンＣ（和光純薬）処理により増殖不活性化したマウス線維芽細胞（ＭＥＦｓ、北山ラベス社）をゼラチンコートしたプレート上に播種したものを使用した。本方法では、培地として４ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）と０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地（リプロセル社）を用い、３７℃、５％ＣＯ２下で培養を行った。培地交換は毎日行い、６~７日ごとに継代を行った。上記継代は、霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液（リプロセル社製）を用いて細胞塊の状態でｉＰＳ細胞をプレートから剥離させた後、剥離させたｉＰＳ細胞を新しいフィーダー細胞上に播種することにより行った。
（ｉｉ）フィーダー細胞を使用しない方法
　フィーダー細胞を使用しない方法では、ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をコートしたプレートを用いた。本方法では、培地として０．５×Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（和光純薬）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）用い、３７℃、５％ＣＯ２下で培養を行った。培地交換は毎日行い、６~７日ごとに継代を行った。上記継代は、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＰＢＳを用いて細胞塊の状態でｉＰＳ細胞をプレートから剥離させた後、剥離させたｉＰＳ細胞を、ビトロネクチンをコートした新しいプレート上に播種することにより行った。
［参考例２］
ヒトｉＰＳ細胞の前培養
　底板細胞への分化誘導の前培養として、上記参考例１に記載の（ｉ）または（ｉｉ）の方法で維持培養した未分化ヒトｉＰＳ細胞を９６穴プレートに播種した。
（ｉ）フィーダー細胞上で維持したｉＰＳ細胞を使用する場合
　まず細胞塊の状態で維持していたｉＰＳ細胞を霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液で１０秒間処理し、軽くピペッティングしてＭＥＦｓをある程度除去した。続いて、ＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３７℃で５分間処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞を９６穴プレートに１穴あたり１．５~２×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養（前培養）した。播種時の培養液としては、１０μＭのＹ２７６３２（（Ｒ）−（＋）−ｔｒａｎｓ−４−（１−アミノエチル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサンカルボキサミド）（和光純薬）を添加した霊長類ＥＳ細胞用培地を用いた。
（ｉｉ）フィーダー細胞を使用しない方法で維持したｉＰＳ細胞を使用する場合
　まず細胞塊の状態で維持していたｉＰＳ細胞を０．５ｍＭ　ＥＤＴＡを添加したＰＢＳを用いて３７℃で１０分間処理し、単一細胞になるまで解離させた。続いて、培地に分散させたｉＰＳ細胞を９６穴プレートに１穴あたり１．５~２×１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１日間培養（前培養）した。播種時の培養液としては、１０μＭのＹ２７６３２（和光純薬）を添加したＥｓｓｅｎｔｉａｌ　８を使用した。上記９６穴プレートとしては、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ社）をＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１／３０~１／４０希釈したものを添加して、３７℃で一晩コーティングしたものを用いた。
［参考例３］
ヒトｉＰＳ細胞から底板細胞への分化誘導
　ヒトｉＰＳ細胞から底板細胞への分化誘導は次の方法で行った。
　上記参考例２に記載した前培養後の培地を、底板細胞への分化誘導因子（ＬＤＮ１９３１８９（０．５μＭ、Ａｘｏｎ　ＭｅｄＣｈｅｍ社）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ、和光純薬）、プルモルファミン（０．５μＭ、Ｍｅｒｃｋ社）、ＳＨＨ（２００ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＣＨＩＲ９９０２１（１μＭ、Ａｘｏｎ　ＭｅｄＣｈｅｍ社））を含む分化誘導培地に交換し（培養０日目）、３７℃、５％ＣＯ２下で５日間培養した。その後、培地を、０．５μＭ　ＬＤＮ１９３１８９および１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を含む分化誘導培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２下で５~８日間培養した（計１０~１３日間）。ここで、上記分化誘導培地としては、（ａ）２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と２ｍＭ　ＧｌｕｔａＭａｘＩ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、以下、Ｎｅｕｒｏ／Ｂ２７と記載）、または（ｂ）１％Ｎ２（和光純薬）と２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（以下、Ｎ２Ｂ２７と記載）を用いた。なお、これらの培養期間中、培地交換は３~４日毎に行った。
　各底板細胞への分化誘導因子（ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、プルモルファミン、ＳＨＨおよびＣＨＩＲ９９０２１）の有無による底板細胞マーカーの発現変動を調べるため、培養１３日目の細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて全ＲＮＡ画分を精製した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｋｉｔ（タカラバイオ社）を用いてｃＤＮＡを合成した後、定量ＲＴ−ＰＣＲを実施して、底板細胞マーカーであるＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａの遺伝子発現量を測定した。結果を図１に示す。ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１の５種類すべてを添加した場合（図１中、Ａｌｌ）でＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａが共に高い発現を示したことから、上記５種類すべてを添加した場合に効率的に底板細胞を誘導できることが判った。また、上記５種類からＳＨＨを除いた場合（図中、−ＳＨＨ）でも、ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの発現はある程度上昇したことから、ＳＨＨを使用しない、すなわち分化誘導因子として化合物のみを添加する場合でも底板細胞を誘導できると考えられた。また、上記５種類に加え、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞から分化させた神経外胚葉を中脳領域の方向へ誘導する因子として広く用いられているＦＧＦ８を添加しても、ＦＯＸＡ２とＬＭＸ１Ａの発現はほとんど変化しなかったことから（図１中、Ａｌｌ＋ＦＧＦ８）、本系ではＦＧＦ８は必須ではないと考えられた。
　次に、培養１３日目のＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａタンパク質の発現を調べるため、抗ＦＯＸＡ２抗体および抗ＬＭＸ１Ａ抗体を用いた免疫蛍光染色を実施した。ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１の５種類すべてを使用して１３日目まで培養した後、４％パラホルムアルデヒド（和光純薬）を添加して室温で３０分間インキュベートし、細胞の固定を行った。１次抗体として抗ＦＯＸＡ２抗体（ｓｃ−６５４４、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）および抗ＬＭＸ１Ａ抗体（ＡＢ１０５３３、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）と反応させ、さらに２次抗体として１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図２に示す。分化誘導培地として前記（ａ）または（ｂ）のいずれを使用した場合にも、大部分の細胞がＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａタンパク質を共に発現している様子が観察された。
　以上の結果から、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＳＨＨ、プルモルファミンおよびＣＨＩＲ９９０２１を添加した分化誘導培地で５日間、その後ＬＤＮ１９３１８９およびＣＨＩＲ９９０２１を添加した分化誘導培地で５~８日間培養することにより、効率的に底板細胞を誘導できることが明らかとなった。
［実施例１］
底板細胞からドパミン神経への分化誘導
　参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目に培地を（Ａ）０．１ｍＭ　アスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ社）、０．５ｍＭ　ジブチリルｃＡＭＰ（ＳＩＧＭＡ社、以下、ｄｂｃＡＭＰと記載）および３μＭ　ＰＤ０３２５９０１の３因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、または（Ｂ）０．１ｍＭ　アスコルビン酸および０．５ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰの２因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、３７℃、５％ＣＯ２下で３０日以上培養した。なお、上記培養期間中、３~４日毎に培地交換を行った。
［試験例１］
ドパミン神経細胞分化誘導後の中脳ドパミン神経細胞マーカー遺伝子およびマーカータンパク質の発現解析
　培養４５日目に細胞を回収し、中脳ドパミン神経細胞の分化、成熟化および機能維持に極めて重要な転写因子として知られるＮＵＲＲ１の発現変動を調べた。その結果を図３に示す。アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子を添加して分化誘導することでＮＵＲＲ１の発現は上昇したが、この２因子に加えＰＤ０３２５９０１を添加することによって発現がさらに大きく上昇した。
　次に、中脳ドパミン神経細胞マーカーであるＴＨ、ＮＵＲＲ１およびＦＯＸＡ２タンパク質の発現を、抗ＴＨ抗体、抗ＮＵＲＲ１抗体および抗ＦＯＸＡ２抗体を用いた免疫蛍光染色で調べた。参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目から（Ａ）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１の３因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、または（Ｂ）アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換して分化誘導を進め、培養４５~５２日目に４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間の固定を行った。１次抗体として抗ＴＨ抗体（ＡＢ１５２、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）、抗ＮＵＲＲ１抗体（ＰＰ−Ｎ１４０４−００、Ｐｅｒｓｅｕｓ　Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ社）および抗ＦＯＸＡ２抗体（ｓｃ−６５４４、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ社）と反応させ、さらに２次抗体として１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体、Ａｌｅｘａ５６８標識２次抗体およびＡｌｅｘａ６４７標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図４、図５および図６に示す。いずれの条件においてもＴＨタンパク質を発現する細胞が同じように観察されたが、ＰＤ０３２５９０１を添加（実施例１、（Ａ））することによってＮＵＲＲ１タンパク質の染色が明らかに強陽性となり（図４）、また、ＴＨ、ＮＵＲＲ１およびＦＯＸＡ２タンパク質を同時に発現する細胞が多数観察された（図５）。図６は、高倍率で観察したときの染色像を示す。以上の結果は、２５３Ｇ１および２０１Ｂ７株でほぼ同様に得られた。
　これらのことから、底板細胞を前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導することにより、ｃＡＭＰアナログおよびＭＥＫ阻害剤を加えない場合に比して、数十倍も効率的に中脳ドパミン神経細胞を誘導できることが判明した。
［試験例２］
ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１を添加した培地で誘導したドパミン神経細胞の機能評価
　参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目から（Ａ）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１の３因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、または（Ｂ）アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換して分化誘導を進め、培養５０日目に高ＫＣｌ刺激によるドパミンの放出能を評価した。
　上記評価は次のように行った。分化誘導した細胞の培地をＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、一晩培養した。翌日ＨＢＳＳ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カルシウムおよびマグネシウム含有）中で３７℃、５％ＣＯ２下で１時間インキュベートを行い、ＨＢＳＳ（コントロール）または５５ｍＭ　ＫＣｌを添加したＨＢＳＳに交換して、３７℃、５％ＣＯ２下で１５~３０分インキュベートした。インキュベート後、上清を回収してフィルターろ過（ＵＦＣ３０ＨＶＮＢ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）した後、０．０１Ｎ　ＨＣｌおよび１００μＭ　ＥＤＴＡを添加し、得られた試料は分析まで−８０℃で保存した。分析には微量生体試料分析システムおよびＨＴＥＣ５００（エイコム社）、電気化学検出器ＥＰＣ−５００（エイコム社）を使用し、エイコム社のマニュアル（エイコム情報　Ｎｏ．２５）に従って、試料中に含まれるドパミン量の測定を行った。結果を図７に示す。前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導することにより、高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加を明確に検出することができるようになった。前記（Ｂ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導した場合には、ロットによってドパミン放出が認められない場合があったが、前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いて分化誘導した場合には、高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加は、異なるロットでも再現よく検出できた。このことから、ＰＤ０３２５９０１によって分化系が安定化したことが示唆された。また、２５３Ｇ１および２０１Ｂ７株で若干の応答の違いが認められたが、ＰＤ０３２５９０１を添加した場合では、高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加が安定して検出され、異なる細胞株間において高ＫＣｌ刺激によるドパミン放出量の増加が確認された。
［実施例２］
各種ＭＥＫ阻害剤（ＦＧＦＲ阻害剤を含む）の検討
　前記（Ａ）のＮｅｕｒｏ／Ｂ２７におけるＰＤ０３２５９０１に代えて、ＰＤ１８４３５２（Ａｘｏｎ　ＭｅｄＣｈｅｍ社）、ＳＵ５４０２（ＦＧＦレセプター（ＦＧＦＲ）阻害剤、和光純薬）またはＰＤ１７３０７４（ＦＧＦＲ阻害剤、Ａｘｏｎ　ＭｅｄＣｈｅｍ社）のいずれかを含む培地により中脳ドパミン神経細胞を誘導できるか否かについて検討を行った。
　参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１３日目から（１）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１の３因子、（２）アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰの２因子、（３）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよび３μＭ　ＰＤ１８４３５２、（４）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよび１０μＭ　ＳＵ５４０２、または（５）アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよび０．１μＭ　ＰＤ１７３０７４を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、３７℃、５％ＣＯ２下で３０日以上培養した。なお、上記培養期間中、３~４日毎に培地交換を行った。培養４５日目に細胞を回収し、ＮＵＲＲ１の発現変動を調べた結果を図８に示す。２５３Ｇ１株では、ＰＤ０３２５９０１、ＰＤ１８４３５２またはＳＵ５４０２の添加でＮＵＲＲ１の発現が上昇し、２０１Ｂ７株では４種類すべてでＮＵＲＲ１の発現が上昇した。一方、ＭＥＫパスウェイを活性化することが知られているＰＬＸ４０３２は効果が認められなかった。
　以上の結果から、ＮＵＲＲ１の発現上昇はＭＥＫ（または上流のＦＧＦＲ）阻害作用に起因していることが示唆された。
［試験例３］
分化誘導過程における各分化マーカーの発現変動
　上記参考例、実施例および試験例の結果を元に、図９に示した３つの工程からなるドパミン神経分化系を設定し、未分化ｉＰＳ細胞からの分化誘導過程における各種分化マーカーの発現を調べた。
　工程１では、０．５μＭ　ＬＤＮ１９３１８９、１０μＭ　ＳＢ４３１５４２、０．５μＭ　プルモルファミン、２００ｎｇ／ｍｌ　ＳＨＨおよび１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７で５日間培養した。工程２では０．５μＭ　ＬＤＮ１９３１８９および１μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７で８日間培養した（計１３日間）。工程３では、０．１ｍＭ　アスコルビン酸、０．５ｍＭ　ｄｂｃＡＭおよび３μＭ　ＰＤ０３２５９０１を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７で３２日間培養した（計４５日間）。培養後、各種分化マーカーの経時的な発現変動を、参考例３と同様の方法を用いて測定した。発現解析の結果を図１０に示す。
　対照として、分化誘導因子を添加しない条件（図中、−）、ＳＨＨのみを除いた条件（図中、−ＳＨＨ）またはプルモルファミンのみを除いた条件（図中、−Ｐｕｒ）で培養し、工程２以降はすべて図９に示した条件で分化誘導した群の検討も行った。
　すべて添加した条件（図中、Ａｌｌ）では、底板細胞マーカーであるＦＯＸＡ２の発現は分化誘導７日目まで上昇し、分化誘導の終了までその発現量が維持されていた。中脳に分化する底板細胞マーカーであるＬＭＸ１Ａの発現は、分化誘導に伴い経時的に上昇し続けた。ドパミン神経細胞マーカーであるＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現は培養２０日目から急激に増加した。一方、ＳＨＨのみを除いた条件（図中、−ＳＨＨ）においても、すべて添加した条件（図中、Ａｌｌ）と同様の発現パターンを示したことから、ＳＨＨは必須ではないことが示唆された。しかしながら、プルモルファミンのみを除いた条件（図中、−Ｐｕｒ）ではＦＯＸＡ２の発現が低い状態であったことから、底板細胞の誘導にはプルモルファミンの添加が必須であると考えられた。
［実施例３］
底板細胞からドパミン神経細胞への分化誘導の効率化
　ＰＤ０３２５９０１に加え、工程３においてドパミン神経細胞への分化を促進させる因子を探索した。その結果、アクチビンＡを工程３において添加した場合に、ドパミン神経細胞への分化効率が上昇することが見出された。
　参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１ｍＭ　アスコルビン酸、０．５ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ、３μＭＰＤ０３２５９０１、２０ｎｇ／ｍｌ　アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ社）のうちの一種類以上を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、もしくはコントロールとしてアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１、およびアクチビンＡを添加していないＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換してさらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後の細胞を回収し、ＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現変動を参考例３と同様の方法で調べた結果を図１１に示す。アクチビンＡのみを添加した場合、ＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現はほとんど上昇しなかった。しかしながら、アスコルビン酸およびｄｂｃＡＭＰとともにアクチビンＡを添加した場合はＴＨおよびＮＵＲＲ１の発現が顕著に増加し、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびアクチビンＡとともにＰＤ０３２５９０１を添加した場合はさらに大きく上昇した。一方で、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびＰＤ０３２５９０１を添加した場合は、培養２６日目の時点ではアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰおよびアクチビンＡを添加した場合よりも低いレベルであった。
　次に、ドパミン神経細胞マーカーであるＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質の発現を、抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色で調べた。底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１ｍＭ　アスコルビン酸、０．５ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ、３μＭ　ＰＤ０３２５９０１、２０ｎｇ／ｍｌ　アクチビンＡのうちの一種類以上を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、もしくはコントロールとして分化誘導因子を添加していないＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換してさらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間の固定を行った。１次抗体として抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体と反応させ、さらに２次抗体として１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体およびＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１２に示す。アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、アクチビンＡおよびＰＤ０３２５９０１を同時に添加することで、ＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質の発現する細胞が顕著に増加している様子が観察された。これらの結果は、ＴＨおよびＮＵＲＲ１遺伝子の発現変動の結果とよく一致するものであった。
　以上の結果から、底板細胞の誘導後アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１およびアクチビンＡを添加することで、従来よりも短い分化誘導期間（計２６日間）で、効率よく中脳ドパミン神経細胞を誘導できることが明らかとなった。
［試験例４］
分化誘導２６日目における凍結保存
　参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で中脳底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１　ｍＭ　アスコルビン酸、０．５　ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ、３　μＭ　ＰＤ０３２５９０１、２０　ｎｇ／ｍｌ　アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ社）を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換し、さらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて３７℃、２０−３０分間処理して分散させた。遠心洗浄後、約２ｘ　１０６　ｃｅｌｌｓ／ｍｌ／ｔｕｂｅの濃度で細胞をセルバンカー２（十慈フィールド）に懸濁し、−８０℃で凍結保存した。
　凍結保存した細胞を３７℃の恒温槽に浸して解凍し、遠心洗浄を行った後、９６穴プレートに１穴あたり２ｘ１０４個の密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で２週間培養した。上記９６穴プレートとしては、ＭａｔｒｉｇｅｌをＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で１／３０−１／４０希釈したもの、またはＬａｍｉｎｉｎ（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ社）をＤＭＥＭ／Ｆ１２で１０　μｇ／ｍｌの濃度に希釈したものを添加して、３７℃で一晩コーティングしたものを用いた。培養液としては、０．１　ｍＭ　Ａｓｃｏｒｂｉｃ　ａｃｉｄ、０．５　ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ、３　μＭ　ＰＤ０３２５９０１、２０　ｎｇ／ｍｌ　アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ社）のうちの一種類以上を添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７、もしくはコントロールとしてアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、　ＰＤ０３２５９０１、およびアクチビンＡを添加していないＮｅｕｒｏ／Ｂ２７を用いた。
　解凍後２週間培養した細胞を回収し、ドパミン神経マーカーであるＴＨ、ＮＵＲＲ１、ＦＯＸＡ２およびＬＭＸ１Ａの発現変動を参考例３と同様の方法で調べた結果を図１３に示す。アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、アクチビンＡおよびＰＤ０３２５９０１を同時に添加することで、各分化マーカーは最も高い発現を示した。これらの因子を添加しない場合（図中、−）では、分化マーカーの発現レベルは低かったことから、解凍後は分化因子が必須であることがわかった。またこのときＹ２７６３２（１０　μＭ）の有無について検討を行ったが、マーカーの発現レベルにほとんど差は認められなかった。
　次に、ＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質の発現を、抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体を用いた免疫蛍光染色で調べた。解凍後２週間培養した細胞に４％ＰＦＡを添加して室温で３０分間固定した後、１次抗体として抗ＴＨ抗体および抗ＮＵＲＲ１抗体と反応させ、さらに１次抗体の免疫動物に合わせたＡｌｅｘａ４８８標識２次抗体およびＡｌｅｘａ５６８標識２次抗体と順次反応させた後、蛍光顕微鏡で観察した。結果を図１４に示す。
　以上の結果から、分化誘導２６日目の細胞が凍結保存可能であること、さらに解凍後、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、アクチビンＡおよびＰＤ０３２５９０１を添加して培養することにより、ＴＨおよびＮＵＲＲ１タンパク質を発現する中脳ドパミン神経を効率よく誘導できることが明らかとなった。
［試験例５］
移植実験
　参考例１ないし３に記載した方法と同様の方法で中脳底板細胞を誘導し、培養１２日目に０．１　ｍＭ　アスコルビン酸、０．５　ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ、３　μＭ　ＰＤ０３２５９０１または０．１　ｍＭアスコルビン酸、０．５ｍＭ　ｄｂｃＡＭＰ、３　μＭ　ＰＤ０３２５９０１、２０　ｎｇ／ｍｌ　アクチビンＡを添加したＮｅｕｒｏ／Ｂ２７に交換して、さらに１４日間培養した（計２６日間）。培養後、細胞をＰＢＳで洗浄しＴｒｙｐＬＥ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で３７℃、１０分間処理して分散させ、Ｎｅｕｒｏ／Ｂ２７培地で細胞濃度を１ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ／μｌに調整し、移植まで氷上で保持した。
　マウス線条体への移植実験は以下のように行った。１２匹８週齢の雄性ＮＯＤ　ＳＣＩＤマウス（日本チャールズリバー）をＣｏｎｔｒｏｌ群とアクチビンＡ群（各群６匹）に分けた。Ｃｏｎｔｒｏｌ群への移植はアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１を添加して培養した細胞を用い、アクチビンＡ群への移植はアスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１、アクチビンＡを添加して培養した細胞を用いた。マウスはペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）麻酔下で頭部術野の毛を剃り、イソジンを塗布した。数分後に０．１％オスバン水溶液を浸したメンバンにてイソジンを拭取って皮膚を消毒し、脳定位固定装置（デビット・コフ、米国Ｄａｖｉｄ　Ｋｏｐｆ社）に固定した。頭皮を正中から切開して、骨膜を剥離し、マウスのＢｒｅｇｍａおよびＬａｍｂｄａを暴露した。線条体の座標（ＡＰ：　＋０．５　ｍｍ；ＭＬ：　＋１．８ｍｍ）は「Ｔｈｅ　ｍｏｕｓｅ　ｂｒａｉｎ　ｉｎ　ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ　ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ」を参照し、電動ドリル（φ０．５ｍｍ）を用いて頭蓋骨に穴を開け、ハミルトンシリンジを頭蓋骨表面から深さＤＶ：−３．５　ｍｍに挿入し、細胞（１ｘ１０５　ｃｅｌｌｓ／μｌ、２μｌ）を１０分間かけて移植した。移植後、頭部の切り口を縫合し回復させた。移植して４週、８週および１２週後に各群から２匹ずつサンプリングを行った。マウスをイソフルラン吸引麻酔後断頭放血し、頭部を４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、頭蓋骨を剥いた後３０％のサッカロース液にて２４時間脱水を行った。その後、脳を凍結包埋し、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ　ＣＭ３０５０Ｓ）を用いて凍結切片（４０　μｍ）を作製した。ドパミン神経の組織染色は抗ＴＨ抗体と抗ヒト特異的Ｎｕｃｌｅｉ抗体（ＭＡＢ１２８１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）（ｈＮｕｃ）を用いて行った。
　移植４週後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群のマウス線条体からＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞がわずかに（５％以下）観察された程度であったが（図１５左）、アクチビンＡ群ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞が多数観察された（４０％以上、図１５右）。移植８週後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の脳切片ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は４週後に比べ増えたが、アクチビンＡ群ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は４週に比べさらに増加し、５０％以上であった（図１６）。移植１２週後、Ｃｏｎｔｒｏｌ群の脳切片ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は８週後よりさらに増加したが、１０％未満であった。アクチビンＡ群ではＴＨ／ｈＮｕｃ両陽性細胞は８週に比べ、顕著な増加は認められなかった（図１７）。
　以上の結果から、中脳底板細胞に誘導した後、アスコルビン酸、ｄｂｃＡＭＰ、ＰＤ０３２５９０１およびアクチビンＡを添加した培地で培養した細胞は、マウス線条体でドパミン神経に効率よく分化し、３ヶ月以上定着し続けることが明らかとなった。
　本出願は、日本で出願された特願２０１３−１６３０６２（出願日：２０１３年８月６日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
　本発明によれば、神経前駆細胞から高品質のドパミン神経細胞をより効率的に製造することができる。本発明により製造されたドパミン神経細胞は、従来の方法により製造されたドパミン神経細胞では観察されなかった酸化ストレスや薬剤刺激への応答性が観察されるなど、生体内のドパミン神経細胞と同様の表現形質及び機能を有する。従って、本発明により製造されたドパミン神経細胞は、ドパミンの産生（放出）の低下に起因する疾患、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患を治療するための細胞移植療法において、高い生着率を達成でき、極めて有用であるだけでなく、当該疾患の予防および／または治療に有用な化合物のスクリーニング、化合物の毒性評価、創薬ターゲットの検証、疾患メカニズムの解析など様々な用途に使用することができる。

Claims (11)

  1. 　底板細胞を、以下の工程（１）に付すことを特徴とする、ドパミン神経細胞の製造方法：
    （１）（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む培地で培養する工程。
  2. 　培地が、さらにアスコルビン酸またはその塩を含む培地である、請求項１記載の製造方法。
  3. 　培地が、さらにアクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤を含む培地である、請求項２記載の製造方法。
  4. 　ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰである、請求項１記載の製造方法。
  5. 　ＭＥＫ阻害剤が
    （ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド、
    （ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド、または
    （ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸
    である、請求項１記載の製造方法。
  6. 　アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、請求項３記載の製造方法。
  7. 　ｃＡＭＰアナログがジブチリルｃＡＭＰであり、
    ＭＥＫ阻害剤が
    （ｉ）Ｎ−［（２Ｒ）−２，３−ジヒドロキシプロポキシ］−３，４−ジフルオロ−２−［（２−フルオロ−４−ヨード−フェニル）アミノ］ベンズアミド、
    （ｉｉ）２−（２−クロロ−４−ヨードフェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロベンズアミド、または
    （ｉｉｉ）２−［（１，２−ジヒドロ−２−オキソ−３Ｈ−インドール−３−イリデン）メチル］−４−メチル−１Ｈ−ピロール−３−プロパン酸
    であり、
    アクチビン受容体様キナーゼ−４，７の活性化剤がアクチビンである、請求項３記載の製造方法。
  8. 　請求項１記載の製造方法で得られたドパミン神経細胞を含む、医薬。
  9. 　（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための試薬。
  10. 　（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤を含む、底板細胞からドパミン神経細胞を製造するためのキット。
  11. 　底板細胞からドパミン神経細胞を製造するための（ｉ）ｃＡＭＰアナログおよび（ｉｉ）ＭＥＫ阻害剤の使用。
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CN201480044581.7A CN105658788B (zh) 2013-08-06 2014-08-06 多巴胺能神经元的制备方法
KR1020167005862A KR102215373B1 (ko) 2013-08-06 2014-08-06 도파민 뉴런의 제조 방법

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Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20180014743A (ko) * 2015-06-01 2018-02-09 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 중간뇌 도파민(mda) 뉴런의 시험관내 분화 방법
KR101833412B1 (ko) * 2017-07-24 2018-02-28 연세대학교 산학협력단 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 이를 이용하여 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로 분화시키는 방법
KR101862548B1 (ko) * 2017-07-24 2018-05-30 연세대학교 산학협력단 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 이를 이용하여 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로 분화시키는 방법
WO2018193949A1 (ja) 2017-04-19 2018-10-25 国立大学法人名古屋大学 ドパミン神経細胞の調製方法
US10179132B2 (en) 2015-05-26 2019-01-15 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Composition for inducing differentiation of multipotent neural stem cells into dopaminergic neurons and method for inducing differentiation of multipotent neural stem cells into dopaminergic neurons by using the same
KR20190071930A (ko) * 2017-12-15 2019-06-25 한양대학교 산학협력단 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법
JP2019106895A (ja) * 2017-12-15 2019-07-04 インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法
US10485802B2 (en) 2016-11-25 2019-11-26 Genuv Inc. Composition for inducing differentiation and protection of neural stem cells and method for inducing neuro-regeneration using the same composition
WO2020204149A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 公立大学法人横浜市立大学 スクリーニング方法および毒性評価法
JP2021519103A (ja) * 2018-04-04 2021-08-10 ジョージアン フゥオデ バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド 機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法
JP2023510823A (ja) * 2020-01-13 2023-03-15 コアステム カンパニー リミテッド ヒト多能性幹細胞から調製された３ｄオルガノイドをチョッピングして大量の細胞を獲得する分化方法
JP2023534625A (ja) * 2020-06-26 2023-08-10 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを導出する方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US12209253B2 (en) * 2016-08-29 2025-01-28 EMULATE, Inc. Development of spinal cord on a microfluidic chip
US20190018000A1 (en) 2016-01-12 2019-01-17 Cedars-Sinai Medical Center A method of non destructive monitoring of biological processes in microfluidic tissue culture systems
EP3411470A4 (en) 2016-02-01 2019-10-09 Emulate, Inc. SYSTEMS AND METHOD FOR BREEDING DARM CELLS IN MICROFLUIDIC DEVICES
KR101870240B1 (ko) * 2016-04-12 2018-06-22 서울대학교산학협력단 지방줄기세포에서 신경줄기세포, 신경세포 및 가바성 신경세포로의 분화 유도 방법
KR102625865B1 (ko) 2016-08-16 2024-01-16 후지필름 셀룰러 다이내믹스, 인코포레이티드 만능 세포를 분화시키는 방법
US11913022B2 (en) 2017-01-25 2024-02-27 Cedars-Sinai Medical Center In vitro induction of mammary-like differentiation from human pluripotent stem cells
US11767513B2 (en) 2017-03-14 2023-09-26 Cedars-Sinai Medical Center Neuromuscular junction
WO2018176001A2 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for production of fallopian tube epithelium
EP4700387A2 (en) 2018-03-23 2026-02-25 Cedars-Sinai Medical Center Methods of use of islet cells
WO2019195798A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Cedars-Sinai Medical Center Human pluripotent stem cell derived neurodegenerative disease models on a microfluidic chip
WO2019195800A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Cedars-Sinai Medical Center Novel differentiation technique to generate dopaminergic neurons from induced pluripotent stem cells
EP3787613B1 (en) 2018-04-30 2026-03-11 Cedars-Sinai Medical Center Pkc activation for use in treating early onset sporadic parkinson's disease
US11130937B2 (en) * 2018-05-24 2021-09-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods for long-term in vitro culture of the syphilis spirochete
KR20230044539A (ko) * 2020-08-17 2023-04-04 인스티튜트 오브 주올로지, 차이니즈 아카데미 오브 사이언스 신경 세포를 위한 확장 배양 배지 및 배양 방법
AU2022247250A1 (en) 2021-03-30 2023-11-09 Trailhead Biosystems Inc. Methods and compositions for generating oligodendrocyte progenitor cells
WO2022216911A1 (en) 2021-04-07 2022-10-13 FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc. Dopaminergic precursor cells and methods of use
CN115572712A (zh) * 2021-06-21 2023-01-06 香港再生医学有限公司 促使iPSC分化为中枢神经元细胞的方法及培养基和系统
US20230027059A1 (en) * 2021-07-19 2023-01-26 Trallhead Biosystems Inc. Methods and compositions for generating human midbrain neural progenitor cells
CN115521903B (zh) * 2022-09-30 2024-05-17 中国科学院生态环境研究中心 体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法
CN118530944A (zh) * 2023-02-21 2024-08-23 士泽生物医药（苏州）有限公司 一种诱导干细胞分化为多巴胺能神经前体细胞和/或多巴胺神经元的试剂盒及其应用
WO2026006245A1 (en) 2024-06-25 2026-01-02 Bluerock Therapeutics Lp Three-dimensional culturing of pluripotent stem cells for improved differentiability

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081172A2 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Derivation of terminally differentiated dopaminergic neurons from human embryonic stem cells
US20120094381A1 (en) 2009-02-17 2012-04-19 Stuart Chambers Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
WO2013067362A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
JP2013163062A (ja) 2013-05-23 2013-08-22 Sanyo Product Co Ltd 遊技機

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7250294B2 (en) 2000-05-17 2007-07-31 Geron Corporation Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells
US20040214324A1 (en) 2002-12-09 2004-10-28 Ole Isacson Dopaminergic neurons differentiated from embryonic cells for treating neurodegenerative diseases
DE102004028899B4 (de) * 2004-06-09 2009-09-03 Technische Universität Dresden Verwendung einer Kombination zur präventiven und/oder therapeutischen Behandlung von bakteriell bedingten Infektionserkrankungen oder der Sepsis
EP1791949A2 (en) 2004-09-02 2007-06-06 Neuro Therapeutics AB Methods and materials relating to enhanced production of dopamine neurons
KR100952200B1 (ko) * 2007-10-31 2010-04-09 한양대학교 산학협력단 신경전구세포 확장방법 및 확장된 신경전구세포 집단을사용한 도파민 뉴런 생산방법
WO2010108008A2 (en) * 2009-03-18 2010-09-23 University Of Georgia Research Foundation Bsc cell differentiation and use in therapy
WO2011130675A2 (en) 2010-04-16 2011-10-20 The Mclean Hospital Corporation Dopaminergic neurons differentiated from pluripotent stem cells and uses of thereof
KR101106020B1 (ko) 2010-06-14 2012-01-17 차의과학대학교 산학협력단 인간 신경전구세포의 도파민 뉴우런으로의 분화방법 및 분화용 배지
WO2013187416A1 (ja) 2012-06-12 2013-12-19 学校法人 慶應義塾 神経系分化に適したiPS細胞の増幅方法、及び神経幹細胞の誘導方法
KR20210018540A (ko) * 2013-02-18 2021-02-17 유니버시티 헬스 네트워크 다능성 줄기세포로부터 간세포 및 담관세포의 생성 방법

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081172A2 (en) * 2003-03-12 2004-09-23 Reliance Life Sciences Pvt. Ltd. Derivation of terminally differentiated dopaminergic neurons from human embryonic stem cells
US20120094381A1 (en) 2009-02-17 2012-04-19 Stuart Chambers Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
WO2013067362A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
JP2013163062A (ja) 2013-05-23 2013-08-22 Sanyo Product Co Ltd 遊技機

Non-Patent Citations (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BREWER G.J. ET AL., J. NEUROSCI. RES., vol. 35, 1993, pages 567
CELL STEM CELL, vol. 4, no. 1, 9 January 2009 (2009-01-09), pages 16 - 9
CELL STEM CELL., vol. 4, no. 5, 8 May 2009 (2009-05-08), pages 381 - 4
CELL STEM CELL., vol. 5, no. 5, 6 November 2009 (2009-11-06), pages 491 - 503
CELL., vol. 131, 2007, pages 861 - 872
DENHAM ET AL., STEM CELLS, vol. 30, 2012, pages 2400 - 2411
DENHAM M. ET AL.: "Glycogen synthase kinase 3beta and activin/nodal inhibition in human embryonic stem cells induces a pre-neuroepithelial state that is required for specification to a floor plate cell lineage", STEM CELLS, vol. 30, no. 11, November 2012 (2012-11-01), pages 2400 - 2411, XP055314359 *
EG CELL: PROC NATL ACAD SCI U S A., vol. 95, 1998, pages 13726 - 31
EVANS ET AL., NATURE, vol. 292, 1981, pages 154 - 6
FASANO ET AL., CELL STEM CELL, vol. 6, 2010, pages 336 - 347
GS CELL: NATURE, vol. 456, 2008, pages 344 - 9
HWANG D.Y. ET AL.: "Human ES and iPS cells as cell sources for the treatment of Parkinson's disease: current state and problems", J. CELL . BIOCHEM., vol. 109, no. 2, pages 292 - 301, XP055314361 *
JAEGER I. ET AL.: "Temporally controlled modulation of FGF/ERK signaling directs midbrain dopaminergic neural progenitor fate in mouse and human pluripotent stem cells", DEVELOPMENT, vol. 138, no. 20, October 2011 (2011-10-01), pages 4363 - 4374, XP055314360 *
KIRKEBY ET AL., CELL REPORTS, vol. 1, 2012, pages 703 - 714
KRIKS ET AL., NATURE, vol. 480, 2011, pages 547 - 553
KRIKS S. ET AL.: "Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease", NATURE, vol. 480, no. 7378, pages 547 - 551, XP055271235 *
KUPERSHMIDT L. ET AL.: "The neuroprotective effect of Activin A and B: implication for neurodegenerative diseases", J. NEUROCHEM., vol. 103, no. 3, November 2007 (2007-11-01), pages 962 - 971, XP055139439 *
LING, N. ET AL., NATURE, vol. 321, 1986, pages 779 - 782
MARTIN GR ET AL., PROC NATL ACAD SCI, vol. 78, 1981, pages 7634 - 8
N ENGL J MED., vol. 344, 2001, pages 710 - 9
NAT BIOTECHNOL, vol. 26, 2008, pages 101 - 106
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 26, 2008, pages 101 - 106
NATURE NEUROSCIENCE, vol. 2, 1999, pages 1137
NATURE, vol. 454, no. 7204, 31 July 2008 (2008-07-31), pages 646 - 50
See also references of EP3031908A4
SUZUKI K. ET AL.: "Activin A induces neuronal differentiation and survival via ALK4 in a SMAD-independent manner in a subpopulation of human neuroblastomas", BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 394, no. 3, 9 April 2010 (2010-04-09), pages 639 - 645, XP055314358 *
THOMSON ET AL., SCIENCE, vol. 282, 1998, pages 1145 - 7
VALE, W. ET AL., NATURE, vol. 321, 1986, pages 776 - 779
XI ET AL., STEM CELLS, vol. 30, 2012, pages 1655 - 1663

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10179132B2 (en) 2015-05-26 2019-01-15 Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University Composition for inducing differentiation of multipotent neural stem cells into dopaminergic neurons and method for inducing differentiation of multipotent neural stem cells into dopaminergic neurons by using the same
KR102679619B1 (ko) 2015-06-01 2024-07-01 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 중간뇌 도파민(mda) 뉴런의 시험관내 분화 방법
KR20220020416A (ko) * 2015-06-01 2022-02-18 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 중간뇌 도파민(mda) 뉴런의 시험관내 분화 방법
KR102358878B1 (ko) 2015-06-01 2022-02-08 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 중간뇌 도파민(mda) 뉴런의 시험관내 분화 방법
KR20180014743A (ko) * 2015-06-01 2018-02-09 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 중간뇌 도파민(mda) 뉴런의 시험관내 분화 방법
KR102519796B1 (ko) 2016-11-25 2023-04-11 주식회사 지뉴브 신경줄기세포의 분화 촉진 및 보호용 조성물 및 이를 이용하여 신경재생을 유도하는 방법
US10485802B2 (en) 2016-11-25 2019-11-26 Genuv Inc. Composition for inducing differentiation and protection of neural stem cells and method for inducing neuro-regeneration using the same composition
US11701360B2 (en) 2016-11-25 2023-07-18 Genuv Inc. Composition for inducing differentiation and protection of neural stem cells and method for inducing neuro-regeneration using the same composition
KR20210095748A (ko) * 2016-11-25 2021-08-02 주식회사 지뉴브 신경줄기세포의 분화 촉진 및 보호용 조성물 및 이를 이용하여 신경재생을 유도하는 방법
US11147816B2 (en) 2016-11-25 2021-10-19 Genuv Inc. Composition for inducing differentiation and protection of neural stem cells and method for inducing neuro-regeneration using the same composition
WO2018193949A1 (ja) 2017-04-19 2018-10-25 国立大学法人名古屋大学 ドパミン神経細胞の調製方法
KR101862548B1 (ko) * 2017-07-24 2018-05-30 연세대학교 산학협력단 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 이를 이용하여 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로 분화시키는 방법
KR101833412B1 (ko) * 2017-07-24 2018-02-28 연세대학교 산학협력단 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 이를 이용하여 신경줄기세포로부터 도파민 신경세포로 분화시키는 방법
JP2019106895A (ja) * 2017-12-15 2019-07-04 インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法
JP2022107819A (ja) * 2017-12-15 2022-07-22 インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法
KR102206657B1 (ko) * 2017-12-15 2021-01-22 한양대학교 산학협력단 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법
JP7435942B2 (ja) 2017-12-15 2024-02-21 インダストリー‐ユニバーシティー コーぺレーション ファンデーション ハンヤン ユニバーシティ 神経幹細胞または神経前駆細胞からドーパミン神経細胞への分化方法
KR20190071930A (ko) * 2017-12-15 2019-06-25 한양대학교 산학협력단 신경줄기세포 또는 신경전구세포에서 도파민 신경세포로의 분화방법
JP2021519103A (ja) * 2018-04-04 2021-08-10 ジョージアン フゥオデ バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド 機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法
JP7223448B2 (ja) 2018-04-04 2023-02-16 ジョージアン フゥオデ バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド 機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法
JP2023027243A (ja) * 2018-04-04 2023-03-01 ジョージアン フゥオデ バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド 機能性大脳皮質細胞への分化を誘導するための方法
WO2020204149A1 (ja) 2019-03-29 2020-10-08 公立大学法人横浜市立大学 スクリーニング方法および毒性評価法
JP2023510823A (ja) * 2020-01-13 2023-03-15 コアステム カンパニー リミテッド ヒト多能性幹細胞から調製された３ｄオルガノイドをチョッピングして大量の細胞を獲得する分化方法
JP7587584B2 (ja) 2020-01-13 2024-11-20 コアステムケモン インコーポレイテッド ヒト多能性幹細胞から調製された３ｄオルガノイドをチョッピングして大量の細胞を獲得する分化方法
JP2023534625A (ja) * 2020-06-26 2023-08-10 ミネルバ バイオテクノロジーズ コーポレーション 多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンを導出する方法
EP4171592A4 (en) * 2020-06-26 2024-07-31 Minerva Biotechnologies Corporation Methods for deriving dopaminergic neurons from pluripotent stem cells

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