ES2712878T3

ES2712878T3 - Método para producir neuronas dopaminérgicas

Info

Publication number: ES2712878T3
Application number: ES14834874T
Authority: ES
Inventors: Masanobu Shoji
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2013-08-06
Filing date: 2014-08-06
Publication date: 2019-05-16
Anticipated expiration: 2034-08-06
Also published as: CA2920287C; NZ716812A; AU2014303330A1; AU2014303330B2; KR102215373B1; EP3031908A1; EP3031908B1; SG11201600777WA; KR20160040286A; EP3031908A4; CA2920287A1; JPWO2015020234A1; US10017734B2; JP6419073B2; WO2015020234A1; CN105658788B; US20160177260A1; CN105658788A

Abstract

Un método de producción de una neurona(s) dopaminérgica, que comprende someter las células de la placa del suelo a la siguiente etapa (1): (1) una etapa de cultivo en un medio que contiene (i) un análogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibidora 5 del receptor de FGF.

Description

DESCRIPCION

Metodo para producir neuronas dopaminergicas

Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un metodo de produccion de una neurona dopaminergica. Ademas, la presente invencion proporciona tambien un reactivo y un equipo de reactivos para utilizarse para el metodo.

Antecedentes de la invencion

La dopamina (3,4-dihidroxifeniletilamina) es una molecula biologica que tiene una variedad de acciones, y funciona principalmente como un neurotransmisor en el sistema nervioso central. En el cuerpo, la dopamina se biosintetiza intracelularmente mediante la accion de dos enzimas de la tirosina hidroxilasa y la DOPA descarboxilasa con el aminoacido tirosina como origen.

La neurona dopaminergica es una neurona que sintetiza y libera dopamina como un neurotransmisor. En el cerebro, esta presente principalmente en el cerebro medio, y en parte en el hipotalamo. La neurona dopaminergica presente en el cerebro medio juega un papel importante en la motilidad y el control emocional. Cuando la neurona dopaminergica del cerebro medio se degenera o deja de existir, por ejemplo, se pueden inducir enfermedades neurodegenerativas graves tales como la enfermedad de Parkinson y similares. Uno de los enfoques terapeuticos mas esperados para tratar dicha enfermedad neurodegenerativa es una terapia de trasplante celular que incluye el trasplante de una neurona dopaminergica al objetivo.

Como un metodo para obtener una neurona dopaminergica, se conoce actualmente un metodo que incluye la diferenciacion de celulas madre tales como celulas madre embrionarias (algunas veces se referiran como celulas ES en la presente memoria descriptiva), celulas madre pluripotentes inducidas (algunas veces se referiran como celulas iPS en la presente memoria descriptiva) y similares en el neuroectodermo, y que inducen ademas la diferenciacion en la neurona dopaminergica.

Recientemente, se ha reportado que una neurona dopaminergica del cerebro medio se produce a partir de celulas de la placa del suelo. Ademas, se ha reportado sucesivamente un metodo que incluye la diferenciacion de celulas madres en celulas de la placa del suelo mediante el uso de dos tipos de inhibidores de la senalizacion de SMAD (Small Mothers Against Decapentaplegic) para obtener una neurona dopaminergica del cerebro medio (documento de Patente 1, documento de no-Patente 1), un metodo para inducir una neurona dopaminergica del cerebro medio mediante la induccion de las celulas de la placa del suelo a partir de celulas madre humanas y cultivar las celulas de la placa del suelo junto con un factor neurotrofico (documento de Patente 2, documentos de no-Patentes 2-4), y un metodo para inducir eficazmente las celulas de la placa del suelo mediante la reaccion de celulas ES humanas con un inhibidor GSK3 beta y un inhibidor de activina/Nodal (documento de no-Patente 5).

Sin embargo, la eficacia de produccion de las neuronas dopaminergicas obtenidas mediante estos metodos sigue siendo baja, y tambien, las celulas son funcionalmente insuficientes ya que no pueden reproducir, in vitro, la capacidad de respuesta al estres oxidativo y la estimulacion farmacologica, y similares. Por lo tanto, aun se desea el desarrollo de un metodo para obtener de manera eficaz una neurona dopaminergica de alta calidad.

Lista de documentos

Documentos de Patente

[Documento de Patente 1] US-B-2012/0094381

[Documento de Patente 2] WO 2013/067362

Documentos de no-Patente

[Documento de no-Patente 1] Fasano et al., Cell Stem Cell 6 (2010) 336-347

[Documento de no-Patente 2] Kriks et al., Nature 480 (2011) 547-553

[Documento de no-Patente 3] Kirkeby et al., Cell Reports 1 (2012) 703-714

[Documento de no-Patente 4] Xi et al., Stem Cells 30 (2012) 1655-1663

[Documento de no-Patente 5] Denham et al., Stems Cells 30 (2012) 2400-2411

Compendio de la invencion

Problemas a resolver por la invencion

Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un metodo para producir mas efectivamente una neurona dopaminergica de alta calidad. La presente invencion pretende ademas proporcionar un reactivo y un equipo de reactivos para ser utilizados para el metodo.

Metodos para resolver los problemas

En vista de los problemas anteriormente mencionados, los presentes inventores han realizado estudios intensivos y han encontrado que una neurona dopaminergica se puede producir a una elevada densidad y con buena reproducibilidad mediante el cultivo de celulas progenitoras neurales en un medio que contiene (i) un analogo estructural del cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibitoria del receptor de FGF. Ademas, han confirmado que la neurona dopaminergica obtenida es una neurona dopaminergica de alta calidad que tiene las mismas caractensticas y funciones fenotfpicas que las de una neurona dopaminergica in vivo y similares, lo que dio como resultado la finalizacion de la presente invencion.

Por consiguiente, la presente invencion proporciona lo siguiente.

[1] Un metodo de produccion de una neurona(s) dopaminergica, que comprende someter las celulas de la placa del suelo a la siguiente etapa (1):

(1) una etapa de cultivo en un medio que contiene (i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibitoria del receptor de FGF;

[2] El metodo de produccion segun [1] mencionado anteriormente, en donde el medio es un medio que contiene ademas acido ascorbico o una sal del mismo;

[3] El metodo de produccion segun [2], en donde el medio es un medio que contiene ademas un activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina;

[4] El metodo de produccion segun [1], en donde el analogo de cAMP es dibutiril-cAMP;

[5] El metodo de produccion segun [1], en donde el inhibidor de MEK o del receptor de FGF es

(i) N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodo-fenil)amino]benzamida (PD0325901), (ii) 2-(2-cloro-4-iodofenilamino)-N-ciclopropilmetoxi-3,4-difluorobenzamida (PD184352), o

(iii) acido 2-[(1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-iliden)metil]-4-metil-1H-pirrol-3-propanoico (SU5402);

[6] El metodo de produccion segun [1], en donde la sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o del receptor de FGF es un oligonucleotido antisentido o siRNA para el mRNA del MEK o del receptor de FGF.

[7] El metodo de produccion segun [3], en donde el activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina es activina;

[8] El metodo de produccion segun [3], en donde el analogo de cAMP es dibutiril-cAMP, el inhibidor de MEK es

(i) N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodo-fenil)amino]benzamida (PD0325901) (ii) 2-(2-cloro-4-iodofenilamino)-N-ciclopropilmetoxi-3,4-difluorobenzamida (PD184352), o el inhibidor del receptor de FGF es

(iii) acido 2-[(1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-iliden)metil]-4-metil-1H-pirrol-3-propanoico (SU5402), y el activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de activina es activina,

[9] Un reactivo para producir una neurona(s) dopaminergica a partir de las celulas de la placa del suelo, que comprende

(i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibitoria del receptor de FGF; con la condicion de que el reactivo no sea un reactivo que consiste en un medio de cultivo de hepatocitos sin EGF, 8-Br-cAMP 10 mM, XAV 9391 pM y PD0325901pM.

[10] Un equipo de reactivos para producir una neurona(s) dopaminergica a partir de las celulas de la placa del suelo, que comprende (i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibitoria del receptor ^fGF; con la condicion de que el reactivo no sea un reactivo que consiste en un medio de cultivo de hepatocitos sin EGF, 8-Br-cAMP 10 mM, XAV 9391 pM y PD0325901 pM.

[11] El uso de (i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibitoria del receptor de FGF para producir una neurona(s) dopaminergica a partir de las celulas de la placa del suelo.

Efecto de la invencion

Segun la presente invencion, una neurona dopaminergica de alta calidad se puede producir de manera mas eficiente a partir de celulas progenitoras neurales. La neurona dopaminergica producida por la presente invencion tiene las caractensticas y funciones fenotfpicas similares a las de las neuronas dopaminergicas in vivo, ya que muestra una respuesta al estres oxidativo y estimulacion farmacologica que no se ha observado en neuronas dopaminergicas producidas por metodos convencionales, y similares. Por lo tanto, la neurona dopaminergica producida por la presente invencion puede lograr una alta tasa de injerto y es extremadamente util para una terapia de trasplante de celulas para tratar una enfermedad provocada por la produccion (liberacion) disminuida de dopamina, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y similares, asf como se puede utilizar para diversas aplicaciones tales como la seleccion de un compuesto util para la profilaxis y/o tratamiento de dichas enfermedades, evaluacion de la toxicidad de los compuestos, verificacion de los objetivos de descubrimiento de farmacos, analisis del mecanismo de la enfermedad y similares.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra los resultados de la variacion de expresion de un marcador de las celulas de la placa del suelo, que se obtuvieron al inducir una diferenciacion de las celulas de la placa del suelo utilizando Neuro/B27 anadido con varias combinaciones de factores que inducen la diferenciacion y examinando la variacion de la expresion mediante RT-PCR cuantitativa en el dfa 13 del cultivo. [-] muestra la no adicion de cada factor que induce la diferenciacion, [Todos] muestra las condiciones que utilizan los 5 tipos de LDN193189 (LDN), SB431542 (SB), Sonic Hedgehog (SHH), purmorfamina (Pur) y CHIR99021 (CHIR). [-nombre del factor] muestra las condiciones sin cada factor. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y 201B7. El valor del eje Y muestra el numero de copias de cada gen normalizado con el numero de copias de GAPDH, y las barras de errores muestran la desviacion estandar.

La Figura 2 muestra los resultados de la tincion inmunofluorescente de las celulas de la placa del suelo inducidas con el anticuerpo anti-FOXA2 y el anticuerpo anti-LMX1A en el dfa 13 del cultivo. Como lmea celular, se utilizo la cepa 253G1. El rojo muestra el nucleo de las celulas positivas FOXA2, el verde muestra el nucleo de las celulas positivas LMX1A, y el azul (tincion con DAPI) muestra el nucleo celular.

La Figura 3 muestra los resultados de la variacion de expresion de NURR1, que se obtuvieron mediante la induccion de la diferenciacion de las celulas de las placas del suelo, cultivando las celulas mediante la adicion de varias combinaciones de acido ascorbico (AA), dibutiril-cAMP (dbcAMP) y PD0325901 (PD) a partir de 13 dfas despues de la induccion, y examinando la variacion de la expresion mediante RT-PCR cuantitativa en el dfa 45. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El valor del eje Y muestra el numero de copias de cada gen normalizado con el numero de copias de GAPDH, y las barras de errores muestra la desviacion estandar.

La Figura 4 muestra los resultados de la tincion inmunofluorescente utilizando el anticuerpo anti-TH y el anticuerpo anti-NURR1 en el dfa 45 del cultivo, despues de la induccion de la diferenciacion de la misma manera que en la Figura 3. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, y el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas NURR1.

La Figura 5 muestra los resultados de la tincion inmunofluorescente, que se obtuvieron mediante la induccion de la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo, cultivando las celulas mediante la adicion de acido ascorbico (AA), dibutiril-cAMP (dbcAMP) y PD0325901 (PD) a partir de 13 dfas despues de la induccion, y realizando la tincion inmunofluorescente utilizando el anticuerpo anti-TH, anticuerpo anti-NURR1 y anticuerpo anti-FOXA2 en el dfa 45 (cepa 253G1) o dfa 52 (cepa 201B7). Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas NURR1, el magenta muestra el nucleo de las celulas positivas FOXA2, y el azul (tincion con DAPI) muestra el nucleo celular. La Figura 6 muestra la observacion de los resultados obtenidos utilizando la cepa 253G1 en la Figura 5 a gran aumento. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas NURR1, y el azul (tincion con DAPI) muestra el nucleo celular.

La Figura 7 muestra los resultados de la evaluacion de una capacidad para liberar dopamina mediante la estimulacion con KCl alto en el dfa 50 del cultivo, despues de la induccion de la diferenciacion de la misma manera que en la Figura 5. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7, y se muestran los resultados de dos experimentos independientes. Ctrl muestra las condiciones de estimulacion con HBSS, y KCL muestra las condiciones de estimulacion con HBSS que contiene KCl 55 mM. El valor del eje Y muestra el valor relativo cuando la cantidad de dopamina liberada en el grupo de control es 1, y la barra de error muestra la desviacion estandar. La Figura 8 muestra los resultados de la variacion de expresion de NURR1, que se obtuvieron mediante la induccion de la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo, cultivando las celulas mediante la adicion de varios inhibidores de MEK (incluyendo inhibidores de FGFR) ademas de acido ascorbico (AA) y dibutiril-cAMP (dbcAMP) a partir de 13 dfas despues de la induccion, y examinando la variacion de la expresion mediante RT-PCR cuantitativa en el dfa 45. Como lmea celular, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El valor del eje Y muestra el numero de copias de cada gen normalizado con el numero de copias de GAPDH, y la barra de error muestra la desviacion estandar.

La Figura 9 muestra un dibujo esquematico de un metodo para inducir la diferenciacion de celulas iPS humanas en las celulas de la placa del suelo y neuronas dopaminergicas.

La Figura 10 muestra los resultados de la variacion de expresion en el transcurso del tiempo de varios marcadores de diferenciacion como se examino mediante RT-PCR cuantitativa, cuando la induccion de la diferenciacion se realizo segun el metodo de la Figura 9. [Todos], [-], [-SHH], y [-Pur] muestran que la induccion de la diferenciacion se realizo segun la Figura 9, excluyendo CHIR99o2l, LDN193189, SB431542, SHH y purmorfamina, excluyendo SHH solo, y excluyendo purmorfamina sola, respectivamente. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El valor del eje Y muestra el numero de copias de cada gen normalizado con el numero de copias de GAPDH, y la barra de error muestra la desviacion estandar.

La Figura 11 muestra los resultados de la variacion de expresion de los marcadores de neuronas dopaminergicas, que se obtuvieron mediante la induccion de la diferenciacion, en la etapa 3 mostrada en la Figura 9, mediante la adicion de varias combinaciones de acido ascorbico (AA), dibutiril-cAMP (dbcAMP), PD0325901 (PD) y activina A (Act) y examinando la variacion de expresion de los marcadores de neuronas dopaminergicas mediante RT-PCR cuantitativa en el dfa 26 del cultivo. [-] muestra la no adicion de cada factor que induce la diferenciacion. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El valor del eje Y muestra el numero de copias de cada gen normalizado con el numero de copias de GAPDH, y la barra de error muestra la desviacion estandar. La Figura 12 muestra los resultados de la tincion inmunofluorescente utilizando un anticuerpo anti-TH y un anticuerpo anti-NURR1 en el dfa 26 del cultivo, despues de la induccion de la diferenciacion de la misma manera que en la Figura 11. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, y el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas NURR1.

La Figura 13 muestra los resultados de la variacion de expresion de los marcadores de neuronas dopaminergicas, que se obtuvieron mediante la induccion de la diferenciacion, en la etapa 3 mostrada en la Figura 9, mediante la adicion de varias combinaciones de acido ascorbico (AA), dibutiril-cAMP (dbcAMP), PD0325901 (PD) y activina A (Act), crioconservando las celulas en el dfa 26 de cultivo, descongelando las celulas, cultivando las celulas durante 2 semanas mediante la adicion de varias combinaciones de AA, dbcAMP, PD y ACT, y examinando la variacion de expresion de los marcadores de neuronas dopaminergicas mediante RT-PCR cuantitativa en el dfa 26 de cultivo. [-] muestra la no adicion de cada factor que induce diferenciacion. Como lmeas celulares, se utilizaron la cepa 253G1 y la cepa 201B7. El valor del eje Y muestra el numero de copias de cada gen normalizado con el numero de copias de GAPDH, y la barra de error muestra la desviacion estandar.

La Figura 14 muestra los resultados de la tincion inmunofluorescente, que se obtuvieron mediante descongelacion de las celulas crioconservadas de la misma manera que en la Figura 13, cultivando las celulas durante 2 semanas mediante la adicion de AA, dbcAMP, PD y ACT, y realizando la tincion inmunofluorescente utilizando un anticuerpo anti-TH y un anticuerpo anti-NURR1. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas NURR1, y el azul (tincion con DAPI) muestra el nucleo celular.

La Figura 15 muestra los resultados de la tincion de tejidos, que se obtuvieron mediante la induccion de la diferenciacion, en la etapa 3 mostrada en la Figura 9, mediante la adicion de acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901 (grupo de control; cuatro piezas de paneles en el lado izquierdo) o acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901 y activina A (grupo de activina A; cuatro piezas de paneles en el lado derecho), recuperando las celulas en el dfa 26 del cultivo, trasplantando las celulas al estriado del raton, y realizando la tincion de los tejidos 4 semanas despues del trasplante. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas hNuc, y el azul (tincion con DAPI) muestra el nucleo celular.

La Figura 16 muestra los resultados de la tincion de los tejidos despues del trasplante de la misma manera que en la Figura 15 y a 8 semanas despues del trasplante. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas hNuc, y el azul (tincion con DAPI) muestra el nucleo celular.

La Figura 17 muestra los resultados de la tincion de los tejidos despues del trasplante de la misma manera que en la Figura 15 y a 12 semanas despues del trasplante. El verde muestra el cuerpo celular de las celulas positivas TH, el rojo muestra el nucleo de las celulas positivas hNuc, y el azul (tincion con DAPI) muestra el nucleo celular.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se explica a continuacion. Los terminos utilizados en la presente memoria descriptiva tienen los mismos significados que los que se utilizan generalmente en el campo pertinente, a menos que se indique particularmente.

En la presente memoria descriptiva, la “neurona dopaminergica” significa una neurona que tiene la capacidad para producir dopamina (3,4-dihidroxifeniletilamina). La neurona dopaminergica no necesita producir dopamina todo el tiempo, sino que solo necesita tener la capacidad de producir dopamina. La cantidad de dopamina que se va a producir no esta particularmente limitada.

De las neuronas dopaminergicas in vivo, particularmente las neuronas dopaminergicas presentes en el cerebro medio tales como la parte compacta de la sustancia negra, el area tegmental ventral y similares se pueden caracterizar por la expresion de un marcador celular particular in vitro, tal como la tirosina hidroxilasa (TH), FOXA2 (forkhead box A2), NURR1 (relacionado con el receptor nuclear 1) gen/protema y similares. Ademas, las neuronas dopaminergicas anteriormente mencionadas presentes en el cerebro medio pueden caracterizarse tambien mediante la expresion de un marcador celular particular in vitro, tal como TH, FOXA2, LMX1A (factor de transcripcion homeobox 1 alfa LIM), NURR1 gen/protema y similares.

La “neurona dopaminergica” obtenida al someter las celulas de la placa del suelo al metodo de produccion de la presente invencion es una neurona dopaminergica presente en el cerebro medio (es decir, una neurona dopaminergica del cerebro medio).

En la presente memoria descriptiva, la “celula progenitora neural” se refiere a una celula capaz de producir una neurona dopaminergica despues de la diferenciacion, que es espedficamente, por ejemplo, celulas de la placa del suelo, una celula del neuroectodermo caracterizada por un marcador de expresion, tal como la protema de filamento intermedio Nestina y similares, lo mas preferible una celula de la placa del suelo.

En la presente memoria descriptiva, la “celula de la placa del suelo” significa una celula organizadora morfologicamente especializada localizada desde la medula espinal hasta el diencefalo, en la lmea media ventral del tubo neural. De las celulas de la placa del suelo, particularmente una localizada en el cerebro medio ventral se puede caracterizar in vitro mediante la expresion de un marcador celular particular tal como FOXA2, gen/protema LMX1A y similares.

En la presente memoria descriptiva, la “celula madre” se refiere a una celula que se puede cultivar in vitro y puede diferenciarse en celulas de linajes plurales que constituyen el cuerpo. Incluyen espedficamente celulas ES, celulas madre pluripotentes derivadas de celulas germinales primordiales fetales (celulas EG: Proc Natl Acad Sci USA .

1998, 95: 13726-31), celulas madre pluripotentes derivadas de testmulos (celulas GS: Nature. 2008, 456: 344-9), celulas madre pluripotentes inducidas derivadas de celulas somaticas (celulas madre pluripotentes inducidas: celulas iPS), y celulas madre somaticas pluripotentes humanas (celulas madre neurales), preferiblemente celulas iPS y celulas ES, mas preferiblemente celulas iPS.

Como celulas ES, se puede utilizar una celula ES derivada de cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente un mamffero. Los ejemplos de mairnferos incluyen ratones, ratas, cobayas, hamster, conejos, gatos, perros, ovejas, cerdos, bovinos, caballos, cabras, monos y humanos. Los ejemplos preferidos de las celulas ES incluyen celulas ES derivadas de humanos.

Los ejemplos espedficos de las celulas ES incluyen una celula ES de un mamffero y similares, que se ha establecido mediante el cultivo de un embrion temprano antes de la implantacion, una celula ES establecida mediante el cultivo de un embrion temprano preparado por trasplante del nucleo del nucleo de una celula somatica, y una celula ES obtenida por alteracion de un gen en los cromosomas de estas celulas ES mediante un metodo de ingeniena genetica.

Cada celula ES se puede preparar segun un metodo realizado generalmente en el campo pertinente, o un documento conocido.

La celula ES del raton se establecio en 1981 por Evans et al (1981, Nature 292: 154-6) y Martin GR. et al (1981, Proc Natl Acad Sci 78: 7634-8) y puede adquirirse en, por ejemplo, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. (Osaka, Japan) y similares.

La celula humana ES se establecio en 1998 por Thomson et al (Science, 1998, 282: 1145-7), y esta disponible en WiCell Research Institute. (sitio web: http://www.wicell.org/, Madison, Wisconsin, USA), US National Institute of Health, Kyoto University y similares y se puede adquirir en, por ejemplo, Cellartis (sitio web:http//www.cellartis.com/, Sweden) y similares.

Como una celula iPS, se puede utilizar una celula iPS derivada de cualquier animal de sangre caliente, preferiblemente mamffero. Los ejemplos de mamffero incluyen raton, rata, cobaya, hamster, conejo, gato, perro, oveja, cerdo, bovinos, caballo, cabras, monos y humanos. Los ejemplos preferidos de las celulas iPS incluyen celulas iPS derivadas de humanos.

Los ejemplos espedficos de las celulas iPS incluyen una celula que adquirio multipotencia como en la celula ES, que puede obtenerse introduciendo genes plurales en una celula somatica tal como celulas de la piel y similares. Por ejemplo, una celula iPS obtenida introduciendo el gen Oct 3/4, gen Klf4, gen c-Myc y gen Sox2, y una celula iPS obtenida introduciendo el gen Oct 3/4, gen Klf4 y gen Sox2 (Nat Biotechnol 2008; 26: 101-106). Ademas de estos, un metodo para disminuir mas el transgen (Nature. 2008 Jul 31; 454 (7204): 646-50), un metodo que utiliza un compuesto de bajo peso molecular (Cell Stem Cell. 2009 Jan 9; 4(1): 16-9, Cell Stem Cell. 2009 Nov 6; 5(5): 491 503), un metodo que utiliza una protema de factor de transcripcion en lugar de un gen (Cell Stem Cell. 2009 May 8; 4(5): 381-4) y similares.

La celula iPS producida puede utilizarse para la presente invencion independientemente del metodo de produccion de la misma.

Los ejemplos de la lmea celular iPS humana incluyen, espedficamente, la cepa 253G1 (lmea celular iPS preparada mediante la expresion de OCT4/SOX2/KLF4 en el fibroblasto de la piel de hembras de 36 anos), la cepa 201B7 (lmea celular iPS preparada mediante la expresion de OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC en el fibroblasto de la piel de hembras de 36 anos), 1503-iPS (297A1) (lmea celular iPS preparada mediante la expresion de OCT4/SOX2/K^lF4/^c-MYC en el fibroblasto de la piel de hembras de 73 anos), 1392-iPS (297F1) (lmea celular iPS preparada mediante la expresion de OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC en el fibroblasto de la piel de machos de 56 anos), NHDF-iPS (297L1 (lmea celular iPS preparada mediante la expresion de OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC en el fibroblasto de la piel de ninos recien nacidos) y similares.

1. Metodo de produccion de neuronas dopaminergicas

La presente invencion proporciona un metodo de produccion de una neurona dopaminergica, que comprende someter las celulas de la placa del suelo a la siguiente etapa (1):

(1) una etapa de cultivo en un medio que contiene (i) un analogo estructural de cAMP (adenosin monofosfato dclico) y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibidora del receptor de FGF (en lo sucesivo, se denomina metodo de produccion de la presente invencion). Un metodo para obtener una celula progenitora neural para utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion no esta particularmente limitado, y la celula puede recuperarse directamente del embrion del animal objetivo. Para obtener una gran cantidad de celulas progenitoras neurales, se produce preferiblemente a partir de una celula madre como material de partida.

Un metodo para obtener una celula progenitora neural a partir de una celula madre no esta particularmente limitado, y se puede utilizar un metodo conocido per se, tal como un metodo que incluye el cultivo de celulas madre pluripotentes en presencia de un inhibidor de BMP de bajo peso molecular, un metodo de induccion de la diferenciacion mediante un co-cultivo con celulas estromales (metodo SDIA) y similares.

Si bien la celula progenitora neural que se utilizara en el metodo de produccion de la presente invencion puede ser cualquiera siempre y cuando se pueda producir una neurona dopaminergica despues de la diferenciacion, una celula de la placa del suelo se utiliza mas preferiblemente como celula de partida. Por lo tanto, a continuacion, se describe espedficamente un metodo para diferenciar una celula madre en una celula de la placa del suelo.

1.1 Metodo de diferenciacion de la celula madre en las celulas de la placa del suelo.

Este metodo de diferenciacion incluye una etapa de cultivo de celulas madre en un medio que contiene un factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo.

En el presente metodo de diferenciacion (metodo de induccion de la diferenciacion), la celula madre generalmente se cultiva en un recipiente de cultivo. Los ejemplos del recipiente de cultivo que se van a utilizar aqrn incluyen matraz, matraz de cultivo de tejidos, plato, plato Petri, plato de cultivo de tejidos, multiplatos, microplaca, placa de micropocillos, multiplaca, placa de multiples pocillos, portaobjetos, placa de Petri, tubo, bandeja, bolsa de cultivo, y botella de rodillo. Se prefieren platos, plato Petri, plato de cultivo de tejidos, multiplatos, microplacas, placa de micropocillos, multiplaca, placa de multiples pocillos y similares. El recipiente de cultivo se aplica preferiblemente con un recubrimiento adecuado para el mantenimiento y cultivo de las celulas madre. Espedficamente, se utiliza preferiblemente un recipiente de cultivo recubierto con una celula de alimentacion o un componente de sustrato extracelular. Si bien la celula de alimentacion no esta particularmente limitada, por ejemplo, se pueden mencionar los fibroblastos (fibroblasto embrionario de raton (^mE^f), fibroblasto de raton (STO) y similares). La celula de alimentacion se inactiva preferiblemente mediante un metodo conocido per se, por ejemplo, irradiacion de radiacion (rayos gamma y similares), un tratamiento con un agente anticancengeno (mitomicina C y similares) y similares. Los ejemplos del componente de sustrato extracelular incluyen protemas fibrosas tales como gelatina, colageno, elastina y similares, glucosaminoglicanos y proteoglicanos tales como acido hialuronico, sulfato de condroitina y similares, protemas de adhesion celular tales como fibronectina, vitronectina, laminina y similares, componentes de laminas basales tales como Matrigel y similares, y similares.

El factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo que se utiliza en el metodo de diferenciacion no esta particularmente limitado siempre que sea una sustancia que se induzca la diferenciacion en una celula de la placa del suelo, y se puede utilizar cualquier sustancia conocida como factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo. La sustancia incluye compuestos de bajo peso molecular, peptidos, protemas y similares. Los ejemplos de factores que inducen la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo incluyen inhibidores de BMP tales como Noggin, LDN-193189 (clorhidrato de 4-(6-(4-(piperazin-1il)fenil)pirazol[1,5-a]pirimidin-3-il)quinolina), dorsomofina (6-[4-(2-piperidin-1-iletoxi)fenil]-3-piridin-4-ilpirazolo[1,5-a]pirimidina) y similares; inhibidores de la familia TGFp tales como SB431542 (4-[4-(1,3-benzodioxol-5-il)-5-(2-piridinil)-1H-imidazol-2-il]-benzamida), A-83-01 (3-(6-metilpiridin-2-il)-1-feniltiocarbamoil-4-quinolin-4-ilpirazol) y similares; inhibidores de GSK3p tales como CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-diclorofenil)-5-(5-metil-1H-imidazol-2-il)-2-pirimidinil]amino]etil]amino]-3-piridincarbonitrilo, BIO (6-bromo-indirubin-3'-oxima) y similares; agonistas alisados tales como purmorfamina (N-(4-morfolinofenil)-2-(1-naftiloxi)-9-ciclohexil-9H-purin-6-amina), SAG (N-metil-N'-(3-piridinilbencil)-N'-(3-clorobenzo[b]tiofen-2-carbonil)-1,4-diaminociclohexano y similares; y factores de crecimiento tales como Sonic hedgehog (SHh ), factor 8 de crecimiento de fibroblastos (FGF8) y similares. Estos se pueden adquirir de Axon Medchem BV, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Enzo Life Sciences, Inc., Merck Bioscience, Tocris bioscience, Stemgent, Inc, Sigma, R&D, PeproTech, Inc. y similares, y el mismo nombre o el mismo nombre comercial indica la misma sustancia, y la estructura y las propiedades son iguales independientemente de los fabricantes. Incluso cuando no estan disponibles comercialmente como productos, los expertos ordinarios en la tecnica tambien pueden prepararlos segun documentos conocidos.

Los presentes inventores han encontrado que la diferenciacion de una celula madre en una celula de la placa del suelo puede ser inducida mas eficientemente por este metodo de diferenciacion al realizar un cultivo primario durante 3-5 dfas en un medio que contiene LDN193189, SB431542, purmorfamina y CHIR99021 (s Hh esta opcionalmente contenido), seguido por un cultivo secundario en un medio que contiene LDN193189 y CHIR99021 durante 5-8 dfas.

Por lo tanto, una celula madre se puede inducir de manera eficiente para diferenciarse en una celula de la placa del suelo mediante un uso combinado de LDN193189, SB431542, purmorfamina y CHIR99021 como el factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo anteriormente mencionado, incluso sin anadir un componente proteico tal como SHH y similares al medio, y una celula de la placa del suelo, y ademas, una neurona dopaminergica, se puede producir a un coste menor que antes.

Si bien la concentracion del factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo en el medio en este metodo de diferenciacion se determina apropiadamente segun el tipo de factor que se va a utilizar, por ejemplo, la concentracion de LDN193189, purmorfamina y CHIR99021 cuando se utilizan como un factor que induce la ^{diferenciacion de las celulas de la placa del suelo es generalmente de 0,05-10} |j ^{M, preferiblemente 0,1-5} |j ^{M, para}cada una de ellas. La concentracion cuando se utiliza SB431542 como un factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo es generalmente 1-20 j M, preferiblemente 5-15 j M. La concentracion cuando se utiliza SHH como un factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo es generalmente 10-500 ng/ml, preferiblemente 100-300 ng/ml.

Un medio que se va a utilizar para este metodo de diferenciacion no esta particularmente limitado siempre y cuando el factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo este contenido y sea generalmente un medio utilizado para el cultivo de celulas madre (de aqu en adelante a veces se denominara tambien medio basal) anadido con un factor que induce la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo.

El medio basal anteriormente mencionado no esta particularmente limitado siempre y cuando se pueda utilizar para el cultivo de celulas animales, tales como medio Neurobasal, medio Neurobasal-A, medio basal progenitor neural, medio NS-A, medio BME, medio BGJb, medio CMRL 1066, medio MEM de Glasgow, medio ^mE^mmejorado con opcion de Zinc, medio IMDM, medio Medium 199, medio MEM de Eagle, medio aMEM, medio Dm Em , medio DMEM/F12, medio de ham, medio RPMI 1640, medio de Fischer, y un medio de mezcla de los mismos y similares. Estos medios basales se pueden adquirir en Invitrogen, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. y similares, y el mismo nombre o el mismo nombre comercial de un medio indica la misma composicion del medio, independientemente de los fabricantes. Dado que la induccion de la diferenciacion en las celulas de la placa del suelo se puede realizar de manera mas eficiente, el medio DMDM/F12, el medio Neurobasal, y un medio mezcla de los mismos se utiliza preferiblemente como medio basal.

El medio que se va a utilizar en este metodo de diferenciacion puede ser un medio que contiene suero o un medio libre de suero. Como se utiliza en la presente memoria, el medio libre de suero significa un medio basal libre de un suero no ajustado o no purificado, y un medio que contiene componentes derivados de la sangre purificados y componentes derivados de tejidos animales (por ejemplo, factor de crecimiento) corresponde a un medio libre de suero. Cuando el metodo que se va a utilizar en este metodo de diferenciacion es un medio que contiene suero, y como suero se puede utilizar suero de un mamffero tal como suero fetal bovino y similares. La concentracion del suero en el medio es generalmente 0,01-20 % en peso, preferiblemente 0,1-10 % en peso.

El medio que se va a utilizar en este metodo de diferenciacion puede contener tambien un sustituto del suero. Los ejemplos de sustitutos del suero incluyen albumina (por ejemplo, albumina rica en lfpidos), transferrina, acidos grasos, precursor del colageno, oligoelementos (por ejemplo, zinc, selenio), suplemento de B-27, suplemento de N2, sustituto de suero knockout, 2-mercaptoetanol, 3'-tioglicerol, y equivalentes de los mismos. La concentracion de estos en el medio es la misma que la concentracion del suero anteriormente mencionado en el medio.

En este metodo de diferenciacion, el suplemento N2 y el suplemento B-27 (Brewer G.J. et al., J. Neurosci. Res. (1993) 35, 567) se anaden preferiblemente al medio como un sustituto del suero.

En este caso, la concentracion del suplemento N2 en el medio es preferiblemente 0,1-10% en peso, mas preferiblemente 0,5-2% en peso, y la concentracion del suplemento B-27 es preferiblemente 0,1-10% en peso, mas preferiblemente 1-5% en peso.

El sustituto de suero knockout se puede adquirir de Invitrogen. Otros sustitutos del suero se pueden adquirir de Invitrogen, SIGMA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. y similares, y el mismo nombre o el mismo nombre comercial de un reactivo o aditivo indica la misma composicion independientemente de los fabricantes.

El medio que se va a utilizar en este metodo de diferenciacion puede contener tambien un lfpido, aminoacido (por ejemplo, un aminoacido no esencial), vitamina, factor de crecimiento, citoquina, antioxidante, 2-mercaptoetanol, acido piruvico, agente tamponante, sal inorganica, antibiotico (por ejemplo, penicilina y estreptomicina) o agente antibacteriano (por ejemplo, anfotericina B) y similares. La concentracion de estos en el medio es la misma que la concentracion del suero mencionado anteriormente en el medio.

Otras condiciones de cultivo tales como temperatura de cultivo, concentracion de CO2 y similares se pueden determinar apropiadamente. Si bien la temperatura de cultivo no esta particularmente limitada, es, por ejemplo, aproximadamente 30-40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C. La concentracion de CO2 es, por ejemplo, aproximadamente 1-10%, preferiblemente aproximadamente 5%.

En este metodo de diferenciacion, la diferenciacion de una celula madre en una celula de la placa del suelo se puede confirmar mediante la evaluacion de la variacion de la expresion de protemas y genes que se expresan espedficamente por las celulas de la placa del suelo (en la presente memoria descriptiva, las protemas y genes anteriormente mencionados se denominan a veces como marcadores de celulas de la placa del suelo). La evaluacion de la variacion de la expresion de los marcadores de las celulas de la placa del suelo anteriormente mencionada se puede realizar mediante, por ejemplo, un metodo de evaluacion de la expresion de protemas utilizando una reaccion antigeno-anticuerpo, un metodo de evaluacion de la expresion genica utilizando RT-PCR cuantitativa, y similares. Los ejemplos de los marcadores de celulas de la placa del suelo anteriormente mencionados, que se diferencian en el cerebro medio, incluyen FOXA2 y el gen/protema de LMX1A.

1-2. Metodo para producir una neurona dopaminergica a partir de una celula progenitora neural (el metodo de produccion de la presente invencion)

Las celulas progenitoras neurales tales como las celulas de la placa del suelo obtenidas por el metodo de diferenciacion anteriormente mencionado, y similares, se pueden diferenciar ademas en una neurona dopaminergica mediante una etapa de cultivo en un medio que contiene (i) un analogo estructura de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibitoria del receptor de fGf . Cuando se utiliza una celula de la placa del suelo como una celula progenitora neural, la adicion de factores neurotroficos tales como factor neurotrofico derivado del cerebro (BDNF), factor neurotrofico derivado de la lmea celular glial (GDNF) y similares a un medio, que generalmente se utiliza para la induccion de la diferenciacion de una celula de la placa del suelo en una neurona dopaminergica, no es esencial en el metodo de produccion de la presente invencion.

El analogo de cAMP que se va a utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion no esta particularmente limitado siempre y cuando sea un compuesto que tenga una estructura similar a la de cAMP y sea capaz de elevar la concentracion de cAMP intacelular en contacto con la celula.

Los ejemplos del analogo de cAMP anteriormente mencionado incluyen 8-bromo-cAMP, dibutiril-cAMP, N6-benzoilcAMP, 8-tiometil-cAMP y similares. Estos se pueden adquirir en Sigma, Merck Bioscience, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. y similares, y el mismo nombre o el mismo nombre comercial indica la misma sustancia y la estructura y propiedades son iguales independientemente de los fabricantes. Incluso cuando no estan disponibles comercialmente como productos, los expertos ordinarios en la tecnica pueden tambien prepararlos segun documentos conocidos.

Como el analogo de cAMP que se va a utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion, se prefiere el dibutiril-cAMP.

Si bien la concentracion del analogo de cAMP en el medio se determina apropiadamente segun la clase de analogo de cAMP que se va a utilizar, la concentracion de dibutiril-cAMP como un analogo de cAMP es generalmente 0,01-5 mM, preferiblemente 0,1-1 mM.

El inhibidor de MEK que se va a utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion se refiere a una sustancia que tiene una actividad inhibidora de MAP quinasa (protema quinasa activada por el mitogeno/quinasa ERK; MEK). Un inhibidor del receptor de FGF que es un factor anterior de la via de transduccion de la senal de MEK se incluye tambien en la presente invencion.

Los ejemplos de los inhibidores de MEK y del receptor de FGF anteriormente mencionados incluyen PD0325901 (N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodofenil)amino]-benzamida), PD184352 (2-(2-cloro-4 iodofenilamino)-N-ciclopropilmetoxi-3,4-difluorobenzamida), SU5402 (acido 3-[4-metil-2-(2-oxo-1,2-dihidro-indol-3-ilidenmetil)-1H-pirrol-3-il]-propanoico, PD173074 (N-[2-[[4-(dietilamino)butil]amino-6-(3,5-dimetoxifenil)pirido[2,3-d]pirimidin-7-il]-N'-(1,1-dimetil)urea) y similares. Estos se pueden adquirir en Axon Medchem BV, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Enzo Life Sciences, Inc., Merck Bioscience, Tocris bioscience, Stemgent, Sigma y similares, y el mismo nombre o el mismo nombre comercial indica la misma sustancia y la estructura y propiedades son iguales independientemente de los fabricantes. Incluso cuando no esten comercialmente disponibles como productos, los expertos ordinarios en la tecnica pueden tambien prepararlos segun documentos conocidos.

Ademas, tambien se pueden utilizar oligonucleotidos antisentido, siRNA y similares para el mRNA del MEK o del receptor de FGF como un inhibidor de MEK y del receptor de FGF, respectivamente. Estan comercialmente disponibles o se pueden sintetizar segun publicaciones anteriores.

Como un inhibidor de MEK o del receptor de FGF que se va a utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion, se prefiere PD0325901, PD184352 o SU5402.

Si bien la concentracion del inhibidor de MEK en el medio se determina apropiadamente segun la clase de inhibidor de MEK que se va a utilizar, la concentracion de PD0325901 o PD184352 utilizada como inhibidor de MEK es generalmente 0,1-10 pM, preferiblemente 1-5 pM. La concentracion de SU5402 utilizada como un inhibidor del receptor de FGF es generalmente 0,1-20 pM, preferiblemente 5-15 pM.

En el metodo de produccion de la presente invencion, el analogo de cAMP y el inhibidor de MEK y del receptor de FGF se pueden anadir simultaneamente al medio, o anadirse al medio de manera escalonada siempre y cuando puedan inducir la diferenciacion de las celulas progenitoras neurales en una neurona dopaminergica. El analogo de cAMP y el inhibidor de MEK y del receptor de FGF se anaden convenientemente y preferiblemente de manera simultanea al medio.

El medio que se va a utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion se produce anadiendo un analogo de cAMP y un inhibidor de MEK o del receptor de FGF al medio basal ejemplificado como el metodo de diferenciacion del 1-1 anteriormente mencionado (conteniendo opcionalmente varios aditivos ejemplificados anteriormente, suero o sustituto de suero cuando se desee).

El medio que se va a utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion se puede producir utilizando un medio basal del mismo tipo que el medio basal utilizado para el metodo de produccion anteriormente mencionado de las celulas de la placa del suelo, o se puede producir utilizando un tipo diferente de medio basal. Sin embargo, se produce preferiblemente utilizando el mismo tipo de medio basal.

Una neurona dopaminergica de alta calidad se puede producir de manera mas efectiva anadiendo, ademas del analogo de cAMP y del inhibidor de MEK o del receptor de FGF anteriormente mencionados, acido ascorbico o una sal del mismo al medio que se va a utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion.

Los ejemplos de sales de acido ascorbico que se pueden utilizar en el metodo de produccion de la presente invencion incluyen, pero no se limitan a, ascorbato de sodio, ascorbato de potasio, ascorbato de calcio y similares. La concentracion de acido ascorbico o una sal del mismo que se va a anadir al medio es generalmente 0,01-10 mM, preferiblemente 0,05-1 mM.

El acido ascorbico o una sal del mismo se puede anadir al medio de manera simultanea con el analogo de cAMP y el inhibidor de MEK o del receptor de FGF, o se puede anadir de manera separada al medio de una forma escalonada siempre y cuando se pueda inducir la diferenciacion de las celulas progenitoras neurales en una neurona dopaminergica. El acido ascorbico o una sal del mismo se anade convenientemente y preferiblemente al medio de manera simultanea con el analogo de cAMP y el inhibidor de MEK o del receptor de FGF.

En el metodo de produccion de la presente invencion, una neurona dopaminergica de alta calidad se puede producir de manera mas efectiva cultivando las celulas progenitoras neurales en el medio anadido con un activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina ademas del analogo de cAMP y el inhibidor de MEK o del receptor de FGF anteriormente mencionados, asf como el penodo de induccion de la diferenciacion en una neurona dopaminergica tambien puede reducirse. Si bien el activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina no esta particularmente limitado siempre y cuando active la quinasa-4 similar al receptor de la activina y/o la quinasa-7 similar al receptor de la activina, se pueden mencionar, por ejemplo, nodal, GDF-1, Vg1, activina y similares. Se prefiere la activina (particularmente, activina A).

La activina es un factor de proliferacion y diferenciacion de celulas peptfdicas 24kD perteneciente a la familia TGFp (factor de crecimiento transformante p), en donde dos subunidades p constituyen un dfmero a traves de un enlace SS (Ling, N., et al., (1986) Nature 321, 779-782; Vale, W., et al., (1986) Nature 321 (776-779). Se sabe que la activina incluye activina A, B, C, D y AB. En el metodo de produccion de la presente invencion, se puede utilizar cualquiera de las activina A, B, C, D, AB. Cuando se va a utilizar activina en el metodo de produccion de la presente invencion, la activina A se utiliza particularmente preferiblemente como activina. Como activina, se puede utilizar activina derivada de cualquier mairnfero tal como humano, raton y similares. Cuando se utiliza activina en el metodo de produccion de la presente invencion, se utiliza preferiblemente activina derivada de la misma especie animal que la celula progenitora neural que se va a utilizar. Por ejemplo, cuando se utiliza una celula progenitora neural derivada de humano como material de partida, se utiliza preferiblemente activina derivada de humano. Estas activinas estan disponibles comercialmente.

Si bien la concentracion de la activina en el medio en el metodo de produccion de la presente invencion se determina apropiadamente segun el tipo de activina que se va a utilizar, la concentracion de la activina A utilizada como activina es generalmente 0,1-200 ng/ml, preferiblemente 5-150 ng/ml, particularmente preferiblemente 10-100 ng/ml.

La activina se puede anadir al medio de manera simultanea con el analogo de cAMP y el inhibidor de MEK o del receptor de FGF, o se puede anadir de manera separada al medio de una manera escalonada siempre y cuando se pueda inducir la diferenciacion de las celulas progenitoras neurales en neuronas dopaminergicas. La activina se anade convenientemente y preferiblemente al medio de manera simultanea con el analogo de cAMP y el inhibidor de MEK y del receptor de FGF.

El metodo de produccion de la presente invencion se realiza cultivando en una incubadora de CO2 aireada con 1 10% (preferiblemente 5%) de dioxido de carbono a una temperatura de cultivo (generalmente 30-40°C, preferiblemente aproximadamente 37°C) adecuada para el cultivo de las celulas progenitoras neurales.

En el metodo de produccion de la presente invencion, la diferenciacion de las celulas progenitoras neurales en una neurona dopaminergica se puede confirmar mediante la evaluacion de la variacion de expresion de protemas y genes que se expresan espedficamente por la neurona dopaminergica (en la presente memoria descriptiva, las protemas y genes anteriormente mencionados se refieren a veces como marcadores de neuronas dopaminergicas). La evaluacion de la variacion de la expresion de los marcadores de celulas neuronales dopaminergicos anteriormente mencionada puede realizarse, por ejemplo, mediante un metodo de evaluacion de la expresion de protemas utilizando una reaccion antfgeno-anticuerpo, un metodo de evaluacion de la expresion genica utilizando una RT-PCR cuantitativa y similares. Los ejemplos de los marcadores de celulas neuronales dopaminergicas anteriormente mencionados, que estan presentes en el cerebro medio, incluyen tirosina hidroxilasa (TH), FOXA2, LMX1A, y gen/protema de Nu Rr 1.

Ademas, si la neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion tiene funciones equivalentes a las de la neurona dopaminergica in vivo, se puede confirmar evaluando la liberacion de dopamina, y las respuestas al estres oxidativo y la estimulacion farmacologica.

Utilizando el metodo de produccion de la presente invencion, una neurona dopaminergica de alta calidad se puede producir tambien de manera efectiva utilizando, como material de partida, una celula de la placa del suelo o una celula progenitora neural distinta de la celula de placa del suelo obtenida por el metodo de diferenciacion del 1-1 anteriormente mencionado.

En el metodo de produccion de la presente invencion, una neurona dopaminergica de alta calidad se puede producir en una gran cantidad al inducir de manera eficiente la diferenciacion de las celulas progenitoras neurales en una neurona dopaminergica. Ya que las neuronas dopaminergicas tienen caractensticas y funciones similares a las de las neuronas dopaminergicas in vivo, pueden lograr una alta tasa de implante cuando se utiliza como medicamento en una terapia de trasplante celular para tratar una enfermedad provocada por la produccion disminuida (liberada) de dopamina, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson y similares. Ademas, es util como una herramienta para el desarrollo de un farmaco terapeutico para la enfermedad.

Las celulas obtenidas durante los procesos del metodo de produccion de la presente invencion y la neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion se pueden crioconservar y descongelar. Los metodos de congelacion y descongelacion de las celulas son conocidos en el campo pertinente, y no estan particularmente limitados siempre y cuando no influyan en la potencia de diferenciacion, la viabilidad, la capacidad de produccion de dopamina y similares de las celulas. Por ejemplo, la neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion se puede conservar a -80°C lavando las celulas con PBS, separandolas de una placa de cultivo con una disolucion de dispersion celular (por ejemplo, Accutase (marca comercial registrada) Innovative Cell Technologies), eliminando la disolucion de dispersion celular, y suspendiendo las celulas en una disolucion de crioconservacion (por ejemplo, banco de celulas 2 (LSI Medience Corporation)). Los ejemplos del metodo de descongelacion incluyen un metodo que comprende descongelar en un tanque termostatico a 37°C, lavar una disolucion de crioconservacion por centrifugacion, y suspender en un medio para su uso, y similares. Cuando las celulas obtenidas durante los procesos del metodo de produccion de la presente invencion se congelan y descongelan, la neurona dopaminergica positiva Nurr1 tambien puede ser inducida a partir de las celulas despues de la descongelacion.

2. Medicamento que contiene la neurona dopaminergica

La presente descripcion proporciona un medicamento que contiene una neurona dopaminergica producida por el metodo de produccion de la presente invencion anteriormente mencionado (a veces se abreviara como el medicamente de la presente descripcion en la presente memoria descriptiva).

Como se utiliza en la presente memoria, la neurona dopaminergica no esta particularmente limitada siempre y cuando sea una celula obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion anteriormente mencionado. En este medicamento, una neurona dopaminergica se utiliza como tal, o como un agregado celular obtenido por concentracion al pasar a traves de un filtro y similares, tal como bolitas y similares, y similares. Ademas, el medicamento se puede anadir tambien con un protector tal como DMSO (dimetilsulfoxido) y similares y crioconservarlo. Para una utilizacion mas segura el medicamento, el medicamento se puede someter a un tratamiento en condiciones tales que mantenga las funciones como una neurona dopaminergica y protema patogena desnaturalizada, por ejemplo, tratamiento termico, tratamiento de radiacion y similares. Ademas, para prevenir el crecimiento de la neurona dopaminergica en una cantidad mayor de la necesaria, el medicamento puede someterse, en combinacion con los tratamientos mencionados anteriormente, a la supresion del crecimiento mediante el tratamiento previo con mitomicina C y similares, y un tratamiento mediante un metodo que incluye introducir un gen de una enzima metabolica naturalmente ausente en los mairnferos en las neuronas, administrando un agente en una forma inactivada segun sea necesario para permitir que el agente se convierta en un toxico solo en las neuronas, en las que el gen de una enzima metabolica naturalmente ausente en marnfferos se ha introducido, lo que conduce a las celulas a la erradicacion (terapia genica suicida) y similares.

Ya que el medicamento de la presente descripcion es seguro y tiene baja toxicidad, se puede administrar a un mamnfero (por ejemplo, humano, raton, rata, cobaya, cerdo, mono).

Como la forma de administracion (metodo de trasplante) del medicamento de la presente invencion a humanos, se puede mencionar un metodo descrito en Nature Neuroscience, 2, 1137 (1999) o N Engl J Med.; 344: 710-9 (2001). Preferiblemente, el medicamento de la presente descripcion se administra (trasplanta) a una region deficiente de dopamina en el cerebro.

Una neurona dopaminergica preparada utilizando la propia celula del paciente o una celula de un donante que tiene un tipo de histocompatibilidad en un intervalo tolerable se utiliza preferiblemente para el medicamento de la presente invencion. Cuando no se pueden obtener celulas suficientes debido a la edad, constitucion y similares, las celulas embebidas con una capsula de polietilenglicol o silicio, un recipiente poroso y similares se pueden trasplantar tambien para evitar el rechazo. La dosis (cantidad a trasplantar) y la frecuencia de administracion (numero de veces a trasplantar) del medicamento de la presente invencion se pueden determinar apropiadamente segun la edad, peso corporal, los smtomas y similares de los pacientes que reciben la administracion.

Un medicamento que contiene la neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion puede implantarse de manera efectiva en el cuerpo de los pacientes por administracion (trasplante) del mismo, lo que a su vez permite la produccion (liberacion) eficiente de dopamina en el cuerpo de los pacientes. Por lo tanto, el medicamento de la presente descripcion es util para el tratamiento de enfermedades provocadas por la produccion (liberacion) disminuida de dopamina, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Parkinson, corea de Huntington, enfermedad de Alzheimer, epilepsia y esquizofrenia y similares. 3. Otros usos

Dado que la neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion tiene caractensticas y funciones fenotfpicas similares a las de la neurona dopaminergica in vivo, es util para la seleccion de un compuesto farmacologico, preferiblemente un compuesto para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, si el compuesto de prueba es util como medicamento se puede evaluar anadiendo el compuesto de prueba solo o en combinacion con otros medicamentos a la neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion, y midiendo el cambio morfologico o funcional de la neurona. Como un ejemplo del cambio funcional, se mide la cantidad de dopamina producida o liberada de la neurona. Como se utiliza en la presente memoria, la neurona dopaminergica es preferiblemente una celula que muestra el mismo fenotipo que la enfermedad que es objetivo del tratamiento, y se prefiere particularmente una neurona dopaminergica producida al inducir la diferenciacion de una celula madre producida a partir de una celula somatica derivada de la enfermedad.

Los ejemplos del compuesto de prueba incluyen peptidos, protemas, anticuerpos, compuestos no peptfdicos, compuestos sinteticos, productos de fermentacion, extracto celulares, extractos de plantas, extractos de tejidos animales, plasma y similares. Como se utiliza en la presente memoria, el compuesto de prueba puede formar una sal. Como la sal, se utiliza una sal con un acido fisiologicamente aceptable (por ejemplo, acido inorganico, acido organico), una base (por ejemplo, una sal de un metal alcalino, sal de un metal alcalinoterreo, sal de aluminio) y similares, y los ejemplos de dichas sales incluyen una sal con un acido inorganico (por ejemplo, acido clortudrico, acido fosforico, acido bromhidrico, acido sulfurico), una sal con un acido organico (por ejemplo, acido acetico, acido formico, acido propionico, acido fumarico, acido maleico, acido succmico, acido tartarico, acido dtrico, acido malico, acido oxalico, acido benzoico, acido metanosulfonico, acido bencenosulfonico), sal de sodio, sal de potasio, sal de calcio, sal de magnesio, sal de bario, y sal de aluminio se pueden utilizar.

El medicamento obtenido utilizando la seleccion mencionada anteriormente se puede formular utilizando un aditivo fisiologicamente aceptable y segun un metodo conocido.

Los ejemplos de la forma de dosificacion de la preparacion obtenida de este modo incluyen preparaciones orales tales como comprimidos aplicados con recubrimiento de azucar segun sea necesario, capsulas, elixir, microcapsulas y similares; y agentes parenterales tales como inyeccion y similares. El contenido del ingrediente activo (compuesto seleccionado por el metodo de seleccion anteriormente mencionado) en la preparacion es, por ejemplo, 0,1-90% en peso.

Los ejemplos del aditivo anteriormente indicado incluyen aglutinantes tales como gelatina, almidon de mafz, tragacanto, goma arabiga y similares; excipientes tales como celulosa cristalina; agentes de hinchamiento tales como almidon de mafz, gelatina, acido algmico y similares; lubricantes tales como estearato de magnesio, y similares; agentes edulcorantes tales como sacarosa, lactosa, sacarina y similares; condimentos tales como menta, aceite de Gaultheria adenothrix, cereza y similares; portadores lfquidos tales como grasas y aceites, agua para inyeccion, aceites vegetales (por ejemplo, aceite de sesamo, aceite de coco, aceite de soja), agentes de tamponamiento (por ejemplo, tampon fosfato, tampon acetato de sodio) y similares; agentes solubilizantes (por ejemplo, etanol, propilenglicol, polietilenglicol); tensioactivos no ionicos (por ejemplo, polisorbato80TM, HCO-50); agentes solubilizantes (por ejemplo, benzoato de bencilo, alcohol bendlico); agentes calmantes (por ejemplo, cloruro de benzalconio, clorhidrato de procama); estabilizantes (por ejemplo, albumina de suero humano, polietilenglicol); conservantes (por ejemplo, alcohol bendlico, fenol); y antioxidantes.

Los ejemplos del agua para inyeccion anteriormente mencionada incluyen disolucion salina; y soluciones isotonicas que contienen glucosa, D-sorbitol, D-manitol, cloruro de sodio y similares.

Dado que un medicamento (preferiblemente, un farmaco terapeutico para la enfermedad neurodegenerativa) obtenido mediante la seleccion mencionada anteriormente es seguro y poco toxico, puede administrarse por via oral o parenteral a, por ejemplo, mairnferos (por ejemplo, humanos, raton, rata, conejo, oveja, cerdos, bovinos, caballos, perros, gatos, monos, chimpances).

La dosificacion y frecuencia de administracion del medicamento se puede determinar apropiadamente segun la accion de los mismos, la enfermedad objetivo, el sujeto de administracion, la via de administracion y similares. La neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion se puede utilizar tambien para la evaluacion de la toxicidad de un compuesto. Por ejemplo, si el compuesto de prueba tiene toxicidad se puede evaluar anadiendo el compuesto de prueba solo o en combinacion con otros medicamentos a la neurona dopaminergica de la presente invencion, y midiendo el cambio morfologico o funcional de la neurona. Como un ejemplo del cambio funcional, se mide la cantidad de dopamina producida o liberada de la neurona.

Los ejemplos del compuesto de prueba incluyen peptidos, protemas, anticuerpos, compuestos no peptfdicos, compuestos sinteticos, productos de fermentacion, extracto celular, extracto de plantas, extracto de tejidos animales, y plasma. El compuesto de prueba de la presente memoria puede formar una sal tal como las descritas en la seleccion anteriormente mencionada.

La neurona dopaminergica obtenida por el metodo de produccion de la presente invencion se puede utilizar tambien para la verificacion del objetivo de descubrimiento de farmacos y el analisis del mecanismo de la enfermedad y similares.

En otra realizacion, la presente invencion proporciona tambien un reactivo y un equipo de reactivos para producir una neurona dopaminergica a partir de celulas progenitoras neurales, que contienen (i) una analogo estructura de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibitoria de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibitoria del receptor de FGF; con la condicion de que el reactivo no sea un reactivo que consiste en un medio de ^{cultivo de hepatocito sin EGF, 8-Br-cAMP 10 mM, XAV 939 1} |j ^{M y PD032590 1} |j ^M.

El reactivo o equipo de reactivos anteriormente mencionados pueden contener ademas (1) acido ascorbico o una sal del mismo y/o (2) un activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de activina.

Como analogo de cAMP, inhibidor de MEK o del receptor de FGF y activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de activina anteriormente mencionados, se pueden mencionar aquellos utiles para el metodo de produccion de la presente invencion.

Aunque la presente invencion se explica con mas detalle a continuacion haciendo referencia a los ejemplos, la presente invencion no esta limitada de ninguna manera por los ejemplos que se muestran a continuacion.

Ejemplos

Ejemplo de Referencia 1

Mantenimiento y cultivo de celulas iPS humanas indiferenciadas

Como celulas iPS humanas, se utilizo la cepa 253G1 (Nature Biotechology 2008; 26: 101-106) o la cepa 201B7 (Cell. 2007; 131: 861-872).

Las celulas iPS (cepa 253G1 o cepa 201B7) en un estado indiferenciado se mantuvieron y cultivaron de dos maneras mediante (i) un metodo que utiliza una celula de alimentacion y (ii) un metodo sin la utilizacion de una celula de alimentacion.

(i) Metodo utilizando una celula de alimentacion

Como una celula de alimentacion, se utilizaron fibroblastos de raton (MEFs, KITAYAMA LABES Co., Ltd) que se sometieron a un tratamiento con mitomicina C (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) para inactivar el crecimiento de los mismos y se sembraron en una placa recubierta de gelatina. En este metodo, se utilizo un medio para celulas ES de primate (ReproCELL Incorporated) anadido con 4 ng/ml de bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos basico) (PeproTech) y 0,5xpenicilina-estreptomicina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como un medio, y las celulas se cultivaron a 37°C bajo 5% de CO2. El medio se intercambio todos los dfas y las celulas se pasaron cada 6-7 dfas. Para el pasaje anteriormente mencionado, las celulas iPS en forma de un agregado celular se separaron de la placa utilizando una disolucion de desprendimiento de celulas para celulas ES de primate (fabricada por Reprocell Inc.), y las celulas iPS desprendidas se sembraron en nuevas celulas de alimentacion.

(ii) Metodo sin la utilizacion de una celula de alimentacion

En el metodo sin la utilizacion de una celula de alimentacion, se utilizo una placa recubierta con vitronectina (Life Technologies). En este metodo, se utilizo Essential 8 (Life Technologies) anadido con 0,5xpenicilina-estreptomicina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) como un medio, y las celulas se cultivaron a 37°C bajo 5% de CO2. El medio se cambio todos los dfas y las celulas se pasaron cada 6-7 dfas. Para el pasaje anteriormente mencionado, las celulas iPS en la forma de un agregado celular se separaron de la placa utilizando PBS anadido con EDTA 0,5 mM, y las celulas iPS desprendidas se sembraron en una nueva placa recubierta con vitronectina.

Ejemplo de Referencia 2

Precultivo de celulas iPS humanas

Para el precultivo de la induccion de la diferenciacion en una celula de placa de suelo, las celulas iPS humanas indiferenciadas mantenidas mediante el cultivo por el metodo (i) o (ii) descrito en el Ejemplo de Referencia 1 mencionado anteriormente se sembraron en una placa de 96 pocillos.

(i) Cuando se utilizan celulas iPS mantenidas en celulas de alimentacion

Las celulas iPS mantenidas en la forma de un agregado celular se trataron durante 10 segundos con una disolucion de desprendimiento de celulas para celulas ES de primates, y se pipetearon suavemente para eliminar los MEF hasta cierto punto. Despues, las celulas se lavaron con PBS, se trataron con Accutase (Innovative Cell Technologies) a 37°C durante 5 minutos, y se disociaron hasta que se obtuvieron celulas individuales. Despues, las celulas iPS dispersadas en un medio se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1,5-2xl04 celulas por pocillo, y se cultivaron (precultivaron) a 37°C bajo 5% de CO2 durante un dfa. Como el medio de cultivo utilizado para la siembra, se utilizo un medio para la celula ES de primate anadido con Y27632 ((R)-(+)-trans-4-(1-aminoetil)-N-(4-piridil)ciclohexanocarboxamida) 10 pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd).

(ii) Cuando se utilizan celulas iPS mantenidas sin utilizar celulas de alimentacion

Las celulas iPS mantenidas en la forma de un agregado celular se trataron durante 10 minutos con PBS anadido con EDTA 0,5 mM, y se disociaron hasta obtener celulas individuales. Despues, las celulas iPS dispersadas en un medio se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 1,5-2x104 celulas por pocillo, y se cultivaron (precultivaron) a 37°C bajo 5% de CO2 durante un dfa. Como el medio de cultivo utilizado para la siembra, se utilizo Essential 8 anadido con Y27632 10pM (Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Como la placa de 96 pocillos mencionada anteriormente, se utilizo una recubierta a 37°C durante una noche con Matrigel (BD) diluido 1/30-1/40 con DMEM/F12 (Life Technologies Corporation).

Ejemplo de Referencia 3

Induccion de la diferenciacion de las celulas iPS humanas en las celulas de la placa del suelo

La diferenciacion de las celulas iPS humanas en las celulas de la placa del suelo se indujo por el siguiente metodo. El medio despues del precultivo como se describio en el Ejemplo de Referencia 2 mencionado anteriormente se intercambio con un medio de induccion de la diferenciacion que contiene factores que inducen la diferenciacion en las celulas de la placa del suelo (LDN193189 (0,5 pM, Axon MedChem B.V.), SB431542 (10 pM, Wako Pure Chemical Industries, Ltd), purmorfamina (0,5 pM, Merck), SHH (200 ng/ml, R&D systems) y CHIR99021 (1 pM, Axon MedChem)) (dfa 0 de cultivo), y las celulas se cultivaron a 37°C bajo 5% de CO2 durante 5 dfas. Despues, el medio se intercambio con un medio de induccion de la diferenciacion que contiene LDN1931890,5 pM y CHIR99021 1 pM, y las celulas se cultivaron a 37°C bajo 5% de CO2 durante 5-8 dfas (total 10-13 dfas). En la presente memoria, se utilizo como el medio de induccion de la diferenciacion anteriormente mencionado, (a) Neurobasal (Life Technologies) que contiene 2% de B27 (Life Technologies corporation) y GlutaMax 2 mM (Life Technologies corporation) (de aqu en adelante se indicara como Neuro/B27), o (b) DMEM/F12 que contiene 1% de N2 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) y 2% de B27 (Life Technologies corporation) (de aqu en adelante se indicara como N2B27). El medio se intercambio cada 3-4 dfas durante estos periodos de cultivo.

Para examinar la variacion de la expresion del marcador de las celulas de la placa del suelo debido a la presencia o ausencia de los factores que inducen la diferenciacion en las celulas de la placa del suelo (LDN193189, SB431542, purmorfamina, SHH y CHIR99021), las celulas en el dfa 13 del cultivo se recuperaron, y la fraccion de RNA total se purifico utilizando RNeasy (Qiagen). Utilizando el equipo de reactivos PrimeScript RT (Takara Bio Inc.), se sintetizo cDNA, se realizo una RT-PCR cuantitativa, y se midieron los niveles de expresion genica de los marcadores de las celulas de la placa del suelo FOXA2 y LMX1A. Los resultados se muestran en la Figura 1. Cuando se anadieron los 5 tipos de lDn 193189, SB431542, Sh H, purmorfamina y CHIR99021 (Todos en la Figura 1), tanto FOXA2 como LMX1A mostraron una alta expresion. De este modo, se aclaro que las celulas de la placa del suelo se podfan inducir de manera eficiente al anadir todos los 5 tipos anteriormente mencionados. Incluso cuando SHH se excluyo de los 5 tipos mencionados anteriormente (-SHH en la Figura), la expresion de FOXA2 y LMX1A se elevo en cierto grado. Por lo tanto, se considero que las celulas de la placa del suelo se podfan inducir incluso cuando no se utilizo SHH, es decir, cuando nada mas que estos compuestos se anadieron como factores que inducen la diferenciacion. Ademas, incluso cuando FGF8 se utilizo ampliamente como un factor para la induccion del neuroectodermo diferenciado de celulas ES/iPS humanas en la direccion de la region del cerebro medio, se anadio ademas de los 5 tipos mencionados anteriormente, la expresion de FOXA2 y LMX1A apenas cambio (Todos+FGF8 en la Figura 1). Por lo tanto, FGF8 se considera que no es esencial para este sistema.

Despues, para examinar la expresion de las protemas FOXA2 y LMX1A en el dfa 13 del cultivo, se llevo a cabo la tincion inmunofluorescente utilizando el anticuerpo anti-FOXA2 y el anticuerpo anti-LMX1A. Las celulas se cultivaron hasta el dfa 13 utilizando los 5 tipos de LDN193189, SB431542, SHH, purmorfamina y CHIR99021, se anadio 4% de para-formaldefndo (Wako Pure Chemical Industries, Ltd), y las celulas se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos para fijar las celulas. Las celulas se hicieron reaccionar con el anticuerpo anti-FOXA2 (sc-6544, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) y el anticuerpo anti-LMX1A (AB10533, Nihon Millipore K.K.) como anticuerpos primarios, y se hicieron reaccionar secuencialmente con el anticuerpo secundario marcado con Alexa488 (Invitrogen) y el anticuerpo secundario marcado con Alexa568, correspondiente al animal inmunizado del anticuerpo primario, como los anticuerpos secundarios, y observados bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 2. Incluso cuando se utilizo cualquiera de los anteriormente mencionados (a) y (b) como medio de induccion de la diferenciacion, se observo que la mayona de las celulas expresaban tanto las protemas FOXA2 como LMX1A. A partir de los resultados anteriores, se aclaro que las celulas de la placa del suelo se podfan inducir de manera eficiente cultivando en un medio de induccion de la diferenciacion anadido con LDN193189, SB431542, SHH, purmorfamina y CHIR99021 durante 5 dfas, y despues en un medio de induccion de la diferenciacion anadido con LDN193189 y CHIR99021 durante 5-8 dfas.

Ejemplo 1

Induccion de la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo en una neurona dopaminergica

Las celulas de la placa del suelo se indujeron mediante un metodo similar a los metodos descritos en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, el medio se intercambio con (A) Neuro/B27 anadido con 3 factores de acido ascorbico 0,1 mM (SIGMA), dibutiril-cAMP 0,5 mM (SIGMA, de aqrn en adelante se indicara como dbcAMP) y PD0325901 3 pM, o (B) Neuro/B27 anadido con 2 factores de acido ascorbico 0,1 mM y dbcAMP 0,5 mM en el dfa 13 del cultivo, y las celulas se cultivaron a 37°C bajo 5% de CO2 durante no menos de 30 dfas. El medio se intercambio cada 3-4 dfas durante los periodos de cultivo anteriormente indicados.

Ejemplo Experimental 1

Analisis de la expresion del gen marcador y la protema marcadora de la neurona dopaminergica del cerebro medio despues de la induccion de la diferenciacion de la neurona dopaminergica

En el dfa 45 del cultivo, se recuperaron las celulas, y se examino la variacion de la expresion de la NURR1 conocida como un factor de transcripcion extremadamente importante para la diferenciacion, maduracion y mantenimiento de las funciones de la neurona dopaminergica del cerebro medio. Los resultados de los mismos se muestran en la Figura 3. La expresion de NURR1 se elevo mediante la induccion de la diferenciacion con la adicion de 2 factores de acido ascorbico y dbcAMP, y la expresion se elevo aun mas altamente al anadir PD0325901 ademas de los dos factores.

Despues, la expresion de los marcadores de la neurona dopaminergica del cerebro medio de las protemas TH, NURR1 y FOXA2 se examino mediante tincion inmunofluorescente utilizando anticuerpos anti-TH, anticuerpos anti-NURR1 y anticuerpos anti-FOXA2. Las celulas de la placa del suelo se indujeron mediante un metodo similar a los metodos descritos en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, la induccion de la diferenciacion se llevo a cabo mediante el intercambio del medio con (A) Neuro/B27 anadido con 3 factores de acido ascorbico, dbcAMP y PD0325901, o (B) Neuro/B27 anadido con 2 factores de acido ascorbico y dbcAMP a partir del dfa 13 del cultivo, 4% de PFA se anadio en los dfas 45-52 del cultivo, y las celulas se fijaron a temperatura ambiente durante 30 minutes. Las celulas se hicieron reaccionar con anticuerpos anti-TH (AB152, Nihon Millipore K.K.), anticuerpos anti-NURR1 (PP-N1404-00, Perseus Proteomics) y anticuerpos anti-FOXA2 (sc-6544, Santa Cruz) como anticuerpos primarios, y se hicieron reaccionar secuencialmente con el anticuerpo secundario marcado con Alexa488, anticuerpo secundario marcado con Alexa568 y anticuerpo secundario marcado con Alexa647, que corresponden al animal inmunizado del anticuerpo primario, como los anticuerpos secundarios, y se observo bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 4, Figura 5 y Figura 6. En ambas condiciones, las celulas que expresan la protema TH se observan de manera similar, y la tincion con la protema NURR1 se volvio claramente positiva por la adicion de PD0325901 (Ejemplo 1, (A)) (Figura 4), y se observaron muchas celulas que expresan simultaneamente las protemas TH, NURR1 y FOXA2 (Figura 5). La Figura 6 muestra imagenes tenidas cuando se observan a gran aumento. Los resultados anteriores se obtuvieron casi de manera similar con las cepas 253G1 y 201B7.

De ello se aclaro que una neurona dopaminergica del cerebro medio puede inducirse varias docenas de veces mas eficientemente induciendo la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo utilizando el Neuro/B27 (A) mencionado anteriormente, en comparacion con la no adicion del analogo de cAMP y el inhibidor de MEK.

Ejemplo Experimental 2

Evaluacion de la funcion de la neurona dopaminergica inducida en un medio anadido con dbcAMP y PD0325901. Las celulas de la placa del suelo se indujeron por un metodo similar al de los metodos descritos en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, la induccion de la diferenciacion se llevo a cabo mediante el intercambio del medio con (A) Neuro/B27 anadido con 3 factores de acido ascorbico, dbcAMP y PD0325901, o (B) Neuro/B27 anadido con 2 factores de acido ascorbico y dbcAMP a partir del dfa 13 de cultivo, y se evaluo una capacidad para liberar dopamina por estimulacion con KCl alto en el dfa 50 del cultivo.

La evaluacion anteriormente mencionada se llevo a cabo como sigue. El medio de las celulas despues de la induccion de la diferenciacion se intercambio con Neuro/B27, y las celulas se cultivaron durante una noche. Las celulas se incubaron el dfa siguiente en HBSS (Life Technologies, que contiene calcio y magnesio) a 37°C bajo 5% de CO2 durante 1 hora, el medio se intercambio con HBSS (control) o HBSS anadido con KCl 55 mM, y las celulas se incubaron a 37°C bajo 5% de CO2 durante 15-30 minutos. Despues de la incubacion, el sobrenadante se recupero y se paso a traves de un filtro (UFC30HVNB, Nihon Millipore K.K.). Se anadieron HCl 0,01N y EDTA 100 |jM, y la muestra obtenida se conservo a -80°C hasta el analisis. Para el analisis, se utilizaron un sistema de analisis de trazas de muestras biologicas y HTEC500 (Eicom Corporation), un detector electroqmmico EPC-500 (Eicom Corporation), y la cantidad de dopamina contenida en la muestra se midio segun el manual de Eicom Corporation (Eicom information No. 25). Los resultados se muestran en la Figura 7. Mediante la induccion de la diferenciacion utilizando el Neuro/B27 (A) anteriormente mencionado, un aumento en la cantidad de dopamina liberada por estimulacion con KCl alto se pudo detectar claramente. Cuando se indujo la diferenciacion utilizando el Neuro/B27 (B) mencionado anteriormente, la liberacion de dopamina no se observo dependiendo del lote. Sin embargo, cuando la diferenciacion se indujo utilizando el Neuro/B27 (A) anteriormente mencionado, un aumento en la cantidad de dopamina liberada mediante la estimulacion con KCl alto se puedo detectar con buena reproducibilidad incluso en un lote diferente. Esto sugiere que PD0325901 estabilizo el sistema de diferenciacion. Si bien la respuesta fue algo diferente entre las cepas 253G1 y 201B7, cuando se anadio PD0325901, se detecto de manera estable un aumento en la cantidad de dopamina liberada mediante estimulacion con KCl alto, por lo que se confirmo un aumento en la cantidad de dopamina liberada mediante la estimulacion con KCl alto entre las diferentes lmeas celulares.

Ejemplo 2

Estudio de varios inhibidores de MEK (incluyendo inhibidores de FGFR)

Se estudio si una neurona dopaminergica del cerebro medio se puede inducir en un medio que contiene cualquiera de PD184352 (Axon MedChem), SU5402 (inhibidor del receptor de FGF (FGFR), Wako Pure Chemical Industries, Ltd) y PD173074 (inhibidor de Fg FR, Axon MedChem) en vez de PD0325901 en el Neuro/B27 (A) anteriormente mencionado.

Las celulas de la placa del suelo se indujeron por un metodo similar a los metodos descritos en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, el medio se intercambio con Neuro/B27 anadido con (1) 3 factores de acido ascorbico, dbcAMP y PD0325901, (2) 2 factores de acido ascorbico y dcbAMP, (3) acido ascorbico, dbcAMP y PD1843523 jM , (4) acido ascorbico, dbcAMP y SU5402 10 jM, o (5) acido ascorbico, dbcAMP y PD1730740,1 jM en el dfa 13 del cultivo, y las celulas se incubaron a 37°C bajo 5% de CO2 durante no menos de 30 dfas. El medio se intercambio cada 3-4 dfas durante los periodos de cultivo anteriormente mencionados. En el dfa 45 del cultivo, se recuperaron las celulas, y se examino la variacion de la expresion de NURR1. Los resultados se muestran en la Figura 8. En la cepa 253G1, la expresion de NURR1 se elevo mediante la adicion de PD0325901, PD184352 o SU5402 y, en la cepa 201B7, la expresion de NURR1 se elevo mediante la adicion de todos los 4 tipos. Por otro lado, PLX4032 conocido por activar la ruta MEK no mostro ningun efecto.

A partir de los resultados anteriores, se sugirio que la expresion elevada de NURR1 es provocada por la accion inhibitoria de MEK (o en el FGFR anterior).

Ejemplo Experimental 3

Variacion de la expresion de cada marcador de diferenciacion en el proceso de induccion de la diferenciacion Sobre la base de los resultados de los Ejemplos de Referencia, los Ejemplos y los Ejemplos Experimentales mencionados anteriormente, se establecio un sistema de diferenciacion de una neurona dopaminergica que consiste en las tres etapas mostradas en la Figura 9, y se examino la expresion de varios marcadores de diferenciacion en el proceso de induccion de la diferenciacion de celulas iPS indiferenciadas.

En la etapa 1, las celulas se incubaron en Neuro/B27 anadido con LDN193189 0,5 ^jM, SB431542 10 ^jM, purmorfamina 0,5 j M, SHH 200 ng/ml y CHIR99021 1 j M durante 5 dfas. En la etapa 2, las celulas se incubaron en Neuro/B27 anadido con LDN193189 0,5 j M y CHIR99021 1 j M durante 8 dfas (total 13 dfas). En la etapa 3, las celulas se incubaron en Neuro/B27 anadido con acido ascorbico 0,1 mM, dbcAM 0,5 mM y PD0325901 3 ^jM durante 32 d^as (total 45 dfas). Despues del cultivo, se midio la variacion de la expresion en el curso del tiempo de varios marcadores de diferenciacion mediante un metodo similar al del Ejemplo de Referencia 3. Los resultados del analisis de la expresion se muestran en la Figura 10.

Como control, las celulas se cultivaron en condiciones sin la adicion de un factor inductor de la diferenciacion (- en la Figura), condiciones que excluyen solo SHH (-SHH en la Figura) o condiciones que excluyen solo purmorfamina ( Pur en la Figura). Ademas, se estudio el grupo sometido a la induccion de la diferenciacion bajo las condiciones mostradas en la Figura 9 a partir de la etapa 2 en adelante.

Bajo condiciones anadida con todos (Todos en la Figura), la expresion del marcador de las celulas de la placa del suelo FOXA2 se elevo hasta el dfa 7 de la induccion de la diferenciacion, y el nivel de expresion se mantuvo hasta completar la induccion de la diferenciacion. La expresion del marcador de las celulas de la placa del suelo LMX1A para la diferenciacion en el cerebro medio continuo elevandose con el tiempo junto con la induccion de la diferenciacion. La expresion de los marcadores neuronales dopaminergicos TH y NURR1 aumento drasticamente desde el dfa 20 de cultivo. Por otro lado, se observo tambien un patron de expresion similar al de las condiciones con todo anadido (Todo en la Figura) en condiciones que excluyen solo SHH (-SHH en la Figura), lo que sugiere que SHH no es esencial. Sin embargo, dado que la expresion de FOXA2 fue baja en condiciones que excluyen solo la purmorfamina (-Pur en la Figura), la adicion de purmorfamina se considera esencial para la induccion de las celulas de la placa del suelo.

Ejemplo 3

Eficiencia de la induccion de la diferenciacion de las celulas de la placa del suelo en la neurona dopaminergica Se busco un factor que promueva la diferenciacion en una neurona dopaminergica en la etapa 3 ademas de PD0325901. Como resultado, se encontro que la eficiencia de la diferenciacion en una neurona dopaminergica se eleva cuando se anade activina A en la etapa 3.

Las celulas de la placa del suelo se indujeron por un metodo similar a los metodos descritos en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, el medio se intercambio con Neuro/B27 anadido con uno o mas tipos de acido ascorbico 0,1 mM, dbcAMP 0,5 mM, PD0325901 3 j M, y activina A 20 ng/ml (R&D), o Neuro/B27 sin la adicion de acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901, y activina A como un control en el dfa 12 del cultivo, y las celulas se incubaron durante 14 dfas mas (total 26 dfas). Las celulas despues del cultivo se recuperaron, y la variacion de la expresion de TH y NURR1 se examino por un metodo similar al Ejemplo de Referencia 3. Los resultados se muestran en la Figura 11. Cuando la activina A se anadio sola, la expresion de TH y NURR1 apenas se elevo. Sin embargo, cuando se anadio activina A junto con acido ascorbico y dcbAMP, la expresion de TH y NURR1 aumento notablemente, y cuando se anadio PD0325901 junto con acido ascorbico, dbcAMP y activina A, la expresion se elevo aun mas. Por otro lado, cuando se agregaron acido ascorbico, dbcAMP y PD0325901, el nivel de expresion fue menor en el momento del dfa 26 de cultivo que la adicion de acido ascorbico, dbcAMP y activina A.

A continuacion, se examino la expresion de los marcadores neuronales dopaminergicos de las protemas TH y NURR1 mediante la tincion inmunofluorescente utilizando anticuerpos anti-TH y anticuerpos anti-NURR1. Las celulas de la placa del suelo se indujeron, el medio se intercambio con Neuro/B27 anadido con uno o mas tipos de acido ascorbico 0,1 mM, dbcAMP 0,5 mM, PD0325901 3 ^jM, y activina A 20 ng/ml, o Neuro/B27 sin la adicion de un factor que induce la diferenciacion como un control en el dfa 12 del cultivo, y las celulas se cultivaron durante 14 dfas mas (total 26 dfas). Despues del cultivo, se anadio 4% de PFA, y las celulas se fijaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las celulas se hicieron reaccionar con anticuerpos anti-TH y anticuerpos anti-NURR1 como anticuerpos primarios, y se hicieron reaccionar secuencialmente con un anticuerpo secundario marcado con Alexa488 y un anticuerpo secundario marcado Alexa568, que corresponde al animal inmunizado del anticuerpo primario, como los anticuerpos secundarios, y se observo bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 12. Se observo que la adicion simultanea de acido ascorbico, dbcAMP, activina A y PD0325901 aumentaba notablemente las celulas que expresaban las protemas TH y NURR1. Estos resultados coincidieron bien con los resultados de la variacion de la expresion de los genes TH y NURR1.

A partir de los resultados anteriores, se aclaro que la neurona dopaminergica del cerebro medio puede inducirse de manera efectiva en un periodo de induccion de la diferenciacion mas corto (26 d^as en total) de lo habitual mediante la adicion de acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901 y activina A despues de la induccion de las celulas de la placa del suelo.

Ejemplo Experimental 4

Crioconservacion en el d^ a 26 de la induccion de la diferenciacion

Las celulas de la placa del suelo del cerebro medio se indujeron mediante un metodo similar a los metodos descritos en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, el medio se intercambio con Neuro/B27 anadido con acido ascorbico 0,1 mM, ^{dbcAMP 0,5 mM, PD0325901 3} |j ^{M, y activina A 20 ng/ml (R&D) en el dfa 12 del cultivo, y las celulas se cultivaron}durante 14 dfas mas (total 26 dfas). Despues del cultivo, las celulas se lavaron con p Bs , y se dispersaron por tratamiento con Accutase (Innovative Cell Technologies) a 37°C durante 20-30 minutos. Despues del lavado centnfugo, las celulas se suspendieron en un banco de celulas 2 (Juji Field Inc.) a una concentracion de aproximadamente 2x106 celulas/ml/tubo, y se crioconservaron a -80°C.

Las celulas crioconservadas se descongelaron por inmersion en un tanque termostatico a 37°C y, despues del lavado centnfugo, se sembraron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 2x104 celulas por pocillo, y se cultivaron a 37°C bajo 5% de CO2 durante 2 semanas. Como la placa de 96 pocillos mencionada anteriormente, se utilizo una recubierta a 37°C durante una noche con Matrigel diluido 1/30-1/40 con DMEM/F12 (Life Technologies Corporation) o Laminina (Trevigen Inc.) diluida con DMEM/F12 a una concentracion de 10 jg/ml. Como el medio de cultivo, se utilizo Neuro/B27 anadido con uno o mas tipos de acido ascorbico 0,1 mM, dbcAMP 0,5 mM, PD0325901 3 jM, y activina A 20 ng/ml, o Neuro/B27 sin la adicion de acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901, y activina A como un control.

Las celulas cultivadas durante 2 semanas despues de descongelar se recuperaron, y la variacion de la expresion de los marcadores neuronales dopaminergicos Th , NURR1, FOXA2 y LMX1A se examinaron mediante un metodo similar al Ejemplo de Referencia 3. Los resultados se muestran en la Figura 13. Cada marcador de diferenciacion mostro la mayor expresion cuando se anadieron simultaneamente acido ascorbico, dbcAMP, activina A y PD0325901. Cuando no se anadieron estos factores (- en la Figura), los niveles de expresion de los marcadores de diferenciacion fueron bajos, lo que indica que un factor de diferenciacion es esencial despues de la descongelacion. Tambien se estudio la presencia o ausencia de Y27632 (10 jM ) en este caso, y los niveles de expresion de los marcadores fueron apenas diferentes.

A continuacion, se examino la expresion de las protemas TH y NURR1 mediante la tincion inmunofluorescente utilizando anticuerpos anti-TH y anticuerpos anti-NURR1. Se anadio 4% de PFA a las celulas cultivadas durante dos semanas despues de la descongelacion, y las celulas se fijaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las celulas se hicieron reaccionar con anticuerpos anti-TH y anticuerpos anti-NURR1 como los anticuerpos primarios, y se hicieron reaccionar secuencialmente con anticuerpos secundarios marcados con Alexa488 y anticuerpos secundarios marcados con Alexa568, que corresponden al animal inmunizado del anticuerpo primario, y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 14.

A partir de los resultados anteriores, se aclaro que las celulas en el dfa 26 de la induccion de la diferenciacion se pueden crioconservar, y que una neurona dopaminergica del cerebro medio que expresa las protemas TH y NURR1 se puede inducir de manera eficiente mediante el cultivo con la adicion de acido ascorbico, dbcAMP, activina A y PD0325901 despues de la descongelacion.

Ejemplo Experimental 5

Experimento de trasplante

Las celulas de la placa de suelo del cerebro medio se indujeron por un metodo similar a los metodos descritos en los Ejemplos de Referencia 1 a 3, el medio se intercambio con Neuro/B27 anadido con acido ascorbico 0,1 mM, dbcAMP 0,5 mM, PD0325901 3 jM o acido ascorbico 0,1 mM, dbcAMP 0,5 mM, PD0325901 3 jM, activina A 20 ng/ml en el dfa 12 del cultivo, y las celulas se cultivaron durante 14 dfas mas (total 26 dfas). Despues del cultivo, las celulas se lavaron con PBS, y se dispersaron por tratamiento con TrypLE Express (Life Technologies) a 37°C durante 10 minutos. La concentracion celular se ajusto a 1x105 celulas/jl con un medio Neuro/B27, y las celulas se mantuvieron en hielo hasta el trasplante.

Se realizo un experimento de trasplante al estriado de raton como sigue. Doce ratones NOD SCID machos de 8 semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc.) se dividieron en un grupo de control y un grupo de activina A (6 ratones por cada grupo). Las celulas cultivadas con la adicion de acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901 se utilizaron para el trasplante al grupo de control, y las celulas cultivadas con la adicion de acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901, activina A se utilizaron para el trasplante al grupo de activina A. El pelo del campo quirurgico de la cabeza de los ratones se rasuro bajo anestesia pentobarbital (50 mg/Kg, ip), y se aplico isodina. Varios minutos despues, la piel se desinfecto limpiando con isodina con Menban sumergido en una disolucion acuosa de Osvan al 0,1 %, y los ratones se fijaron en un aparato de estereotaxis cerebral (David Kopf, David Kopf Instruments en USA). Se hizo una incision en el cuero cabelludo desde la lmea media, se separo el periostio y se expuso Bregma y Lambda de los ratones. Se hizo referencia al “cerebro del raton en coordenadas estereotaxicas” para la coordenada del estriada (AP: 0,5 mm; ML: 1,8 mm), se hizo un orificio en el hueso craneal con un taladro electrico (00,5 mm), la jeringa Hamilton se inserto desde la superficie del hueso craneal hasta la profundidad DV: -3,5 mm, y las celulas (1 x 105 celulas/jl, 2 jl) se trasplantaron durante 10 minutos. Despues del trasplante, se suturo la incision en la cabeza y los ratones se dejaron recuperar. A las 4 semanas, 8 semanas y 12 semanas despues del trasplante, se tomaron muestras de dos ratones de cada grupo. Bajo anestesia por inhalacion de isoflurano, los ratones se desangraron por decapitacion y la cabeza se fijo con un 4% de paraformaldehudo durante 24 horas. Despues de que se retiro el hueso craneal, el cerebro se deshidrato con una disolucion de sacarosa al 30% durante 24 horas. Posteriormente, el cerebro se incorporo por congelacion y se preparo una seccion congelada (40 jm ) utilizando un criostato (Leica CM3050S). La tincion del tejido de la neurona dopaminergica se llevo a cabo utilizando anticuerpos anti-TH y anticuerpos Nuclei espedficos antihumano (MAB 1281, Nihon Millipore K.K.) (hNuc).

Despues de 4 semanas desde el trasplante, se observaron levemente (no mas de 5%) celulas TH/hNuc en el cuerpo estriado del raton del grupo de control (Figura 15, izquierda), mientras que muchas celulas dobles positivas TH/hNuc (no menos del 40%, Figura 15, derecha) se observaron en el grupo de la activina A. Despues de 8 semanas desde el trasplante, las celulas TH/hNuc dobles positivas aumentaron en la seccion cerebral del grupo de control en comparacion con la de 4 semanas, y las celulas TH/hNuc dobles positivas aumentaron aun mas a no menos del 50% en el grupo de la activina A en comparacion con la de 4 semanas (Figura 16). Despues de 12 semanas desde el trasplante, las celulas TH/hNuc dobles positivas aumentaron aun mas a menos del 10% en la seccion del cerebro del grupo de control en comparacion con la de 8 semanas. En el grupo de activina A, las celulas TH/hNuc dobles positivas no mostraron un aumento notable en comparacion con las 8 semanas (Figura 17).

De los resultados anteriores, se aclaro que las celulas de la placa del suelo del cerebro medio cultivadas, despues de la induccion, en un medio anadido con acido ascorbico, dbcAMP, PD0325901, y activina A se diferencian eficazmente en una neurona dopaminergica en el estriado del raton y continuan colonizandose durante no menos de 3 meses.

Esta solicitud se basa en la solicitud de Patente No. 2013-163062 presentada en Japon (fecha de presentacion: 6 de Agosto de 2013), cuyo contenido se incluye en su totalidad en la presente memoria.

Aplicabilidad industrial

Segun la presente invencion, una neurona dopaminergica de alta calidad se puede producir de manera mas eficiente a partir de celulas progenitoras neurales. La neurona dopaminergica producida por la presente invencion tiene caractensticas y funciones fenotfpicas similares a las de las neuronas dopaminergicas in vivo, ya que muestra una respuesta al estres oxidativo y estimulacion farmacologica que no se ha observado en las neuronas dopaminergicas producidas por metodos convencionales, y similares. Por lo tanto, la neurona dopaminergica producida por la presente invencion puede lograr una alta tasa de implante y es extremadamente util para una terapia de trasplante de celulas para tratar una enfermedad provocada por la produccion (liberacion) disminuida de dopamina, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y similares, asf como tambien puede utilizarse para varias aplicaciones tales como la seleccion de un compuesto util para la profilaxis y/o el tratamiento de dichas enfermedades, la evaluacion de la toxicidad de los compuestos, la verificacion de los objetivos de descubrimiento de farmacos, el analisis del mecanismos de la enfermedad y similares.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un metodo de produccion de una neurona(s) dopaminergica, que comprende someter las celulas de la placa del suelo a la siguiente etapa (1):

(1) una etapa de cultivo en un medio que contiene (i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibidora del receptor de FGF.

2. El metodo de produccion segun la reivindicacion 1, en donde el medio contiene ademas acido ascorbico o una sal del mismo.

3. El metodo de produccion segun la reivindicacion 2, en donde el medio contiene ademas un activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina.

4. El metodo de produccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el analogo estructural de cAMP es dibutiril-cAMP.

5. El metodo de produccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK es

(i) N-[(2R)-2,3-dihidroxipropoxi]-3,4-difluoro-2-[(2-fluoro-4-iodo-fenil)amino]benzamida, o

(ii) 2-(2-cloro-4-iodofenilamino)-N-ciclopropilmetoxi-3,4-difluorobenzamida, o en donde la sustancia que tiene una actividad inhibidora del receptor de FGF es (iii) acido 2-[(1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-iliden)metil]-4-metil-1 H-pirrol-3-propanoico.

6. El metodo de produccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK o del receptor de FGF es un oligonucleotido antisentido o siRNA para el mRNA del MEK o del receptor de FGF.

7. El metodo de produccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en donde el activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina es activina.

8. El metodo de produccion segun la reivindicacion 3, en donde el analogo estructural de cAMP es dibutiril-cAMP, y el activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina es activina, y la sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEk es

(ii) 2-(2-cloro-4-iodofenilamino)-N-ciclopropilmetoxi-3,4-difluorobenzamida, o

la sustancia que tiene una actividad inhibidora del receptor de FGF es

(iii) acido 2-[(1,2-dihidro-2-oxo-3H-indol-3-iliden)metil]-4-metil-1H-pirrol-3-propanoico.

9. Un reactivo para producir una neurona(s) dopaminergica a partir de celulas de la placa del suelo, que comprende (i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibidora del receptor de FGF, con la condicion de que el reactivo no sea un reactivo que consiste en un medio de cultivo de hepatocito sin EGF, 8-Br-cAMP 10 mM, XAV 9391 pM y PD0325901pM.

10. El reactivo segun la reivindicacion 9, que comprende ademas (iii) acido ascorbico o una sal del mismo y/o (iv) un activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina.

11. Un equipo de reactivos para producir una neurona(s) dopaminergica a partir de las celulas de la placa del suelo, que comprende (i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibidora del receptor de FGF, con la condicion de que el equipo de reactivos no sea un equipo de reactivos que consista en un medio de cultivo de hepatocito sin EGF, 8-Br-cAMP 10 mM, XAV 9391 pM y PD0325901pM.

12. El equipo de reactivos segun la reivindicacion 11, que comprende ademas (iii) acido ascorbico o una sal del mismo y/o (iv) un activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina.

13. Un uso in vitro de (i) un analogo estructural de cAMP y (ii) una sustancia que tiene una actividad inhibidora de MEK o una sustancia que tiene una actividad inhibidora del receptor de FGF para producir una neurona(s) dopaminergica a partir de las celulas de la placa del suelo.

14. El uso segun la reivindicacion 13, que comprende ademas el uso de (iii) acido ascorbico o una sal del mismo y/o (iv) un activador de la quinasa-4,7 similar al receptor de la activina.