WO2015080629A1 - Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4 - Google Patents

Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4 Download PDF

Info

Publication number
WO2015080629A1
WO2015080629A1 PCT/RU2014/000889 RU2014000889W WO2015080629A1 WO 2015080629 A1 WO2015080629 A1 WO 2015080629A1 RU 2014000889 W RU2014000889 W RU 2014000889W WO 2015080629 A1 WO2015080629 A1 WO 2015080629A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sample
blood
polypeptide
coagulation
product
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/RU2014/000889
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Владимир Николаевич КОЛЯДКО
Фазоил Иноятович АТАУЛЛАХАНОВ
Михаил Александрович ПАНТЕЛЕЕВ
Татьяна Алексеевна ВУЙМО
Рузанна Арменовна ОВСЕПЯН
Степан Сергеевич СУРОВ
Вера Анатольевна КОРНЕЕВА
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OBSCHESTVO S OGRANICHENNOY OTVETSTVENNOSTYU "GEMATOLOGICHESKAYA KORPORATSIYA"
Original Assignee
OBSCHESTVO S OGRANICHENNOY OTVETSTVENNOSTYU "GEMATOLOGICHESKAYA KORPORATSIYA"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OBSCHESTVO S OGRANICHENNOY OTVETSTVENNOSTYU "GEMATOLOGICHESKAYA KORPORATSIYA" filed Critical OBSCHESTVO S OGRANICHENNOY OTVETSTVENNOSTYU "GEMATOLOGICHESKAYA KORPORATSIYA"
Priority to EP14865083.1A priority Critical patent/EP3075742B1/en
Priority to US15/038,819 priority patent/US10006080B2/en
Publication of WO2015080629A1 publication Critical patent/WO2015080629A1/ru
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8135—Kazal type inhibitors, e.g. pancreatic secretory inhibitor, ovomucoid
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96458—Factor XII (3.4.21.38)

Definitions

  • the present invention relates to medicine, in particular, hematology, and can be used, in particular, for diagnostic and research purposes in determining the characteristics of blood coagulation and its components, as well as in biotechnology and basic biological research.
  • Blood coagulation is a protective process of the body; one of the main components of this process is the formation of a fibrin clot.
  • a fibrin clot is formed as a result of activation of an enzymatic cascade of coagulation factors; many of the coagulation factors are serine proteases (Vila, HPa, XIa, 1Xa, Xa, thrombin Pa). Also, activated protein C (APC), a protease that is activated by thrombin and inactivates the coagulation factors Villa and Va, is involved in the work of the enzymatic coagulation cascade.
  • APC activated protein C
  • the activation of the enzymatic cascade occurs along the “external” pathway, for which factor Vila ⁇ VIIa is responsible) and tissue factor (TF, or thromboplastin), or along the “internal” pathway, which begins with contact activation of factor XII (fcp, or Hageman factor) ( Mann et al. 1990, Blood 76: 1-16; Hoffman and Monroe. 2001, Thromb. Haemost. 85: 958-965).
  • Contact activation is a self-activation of fcp upon contact of blood plasma with negatively charged surfaces.
  • PCP is present in the blood plasma in an inactive state, in combination with high molecular weight kininogen (HMW) and plasma pre-kallikrein, it is converted into the active protease factor CPA (fCNA).
  • HMW high molecular weight kininogen
  • fCNA active protease factor CPA
  • fkhPa proteolytically activates prekallikrein in its active form kallikrein, an enzyme, incl. responsible for the activation of the fibrinolysis system, and the factor of the "internal" coagulation pathway XI into its active form factor X1a (fX1a) (Ichinose et al. 1986, J. Biol. Chem. 261: 3486-3489; Schmaier. 2008, J. Clin. Invest. 1 18: 3006-3009).
  • Activation of fHPa occurs when blood is extracted from the vascular bed of the body, for example: 1) when blood is drawn into a tube from the surfaces of the needle, tubes and walls of the tube; 2) during storage of blood plasma in frozen form and subsequent thawing of plasma; or 3) when using an artificial (extracorporeal) blood circulation apparatus, in particular during transfusion of blood or plasma.
  • Contact activation during blood sampling or thawing of frozen plasma may initiate in vitro coagulation, which interferes with sample collection and coagulation studies (Smith et al. 2010, Blood Coagul. Fibrinolysis. 21: 692-702; Suontaka et al. 2005, Vox. Sang. 88: 172-180).
  • the most common way to suppress clotting during blood sampling is to preliminarily add calcium ion chelator (e.g. sodium citrate, EDTA, etc.) to the tube into which the blood is taken. Chelation of calcium ions blocks membrane-dependent reactions of activation of pF and thrombin (Fischer. 2007, Hemodial. Int. 1 1: 178-189).
  • a coagulation activator in particular, TF or a contact path activator
  • the plasma is recalcified (an excess of calcium ions is added), then the parameters of the formation of a fibrin clot are investigated.
  • the method of suppressing coagulation by adding a chelator has several disadvantages.
  • Mann et al. 2007, J. Thromb. Haemost. 5: 2055-2061 it was shown that the chelation of calcium ions during blood sampling and subsequent recalcification of the sample change the dynamics of the formation of a fibrin clot, the production of thrombin and platelet aggregation, compared with samples without the addition of a chelator.
  • the addition of a chelator does not suppress the activation reactions of pX1 and ⁇ , which are initiated by PXP formed during blood sampling and sample storage (Nossel et al. 1968, J. Clin. Invest. 47: 1 172-1 180; Oiler et al. 1976 J. Surg.
  • the contact activation inhibitor used must be highly selective: when the concentration of the inhibitor added to the sample is sufficient to effectively suppress the coagulation contact pathway, the inhibitor does not affect TF-initiated formation of a fibrin clot, i.e. does not inhibit fX1a, f1Xa, fXa and others.
  • a number of inhibitors of fcPa are known, in particular, plasma coagulation inhibitors, for example, C 1 inhibitor, alpha 2-macroglobulin. (Davis et al. 2008, Mol. Immunol. 45: 4057-4063). Also known are protein trypsin inhibitors that inhibit php and have been isolated from various organisms, for example, from the E.coH bacteria (Ulmer et al. 1995, FEBS Lett. 365: 159-163), from plant seeds (Wynn and Laskowski. 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 166: 1406-1410). Inhibitors from plant seeds include corn trypsin inhibitor, or KTI (Hojima et al. 1980, Thromb.
  • Non-protein CKP inhibitors are also known (Woodruff et al. 2013, J. Thromb. Haemost. 1 1: 1364-1373). However, most of the listed inhibitors are non-selective: in addition to fkhPa, they also inhibit other coagulation factors, which makes it impossible to use them in the study of the formation of fibrin clot.
  • CTI The most selective of the existing inhibitors is considered to be CTI. It is known that CTI is used to inhibit contact activation in the study of TF-initiated coagulation in a blood sample or its component (US6,403,381, CL G01N33 / 86, publ. 1 1.06.2002), incl. in global hemostasis tests, for example, in the thrombin generation test. However, there is evidence of insufficient selectivity of CTI, since its effect on the blood coagulation system and other systems interacting with coagulation is known. Thus, CTI delays fibrinolysis, presumably by inhibiting the tissue plasminogen activator (Nielsen. 2009, Blood Coagul. Fibrinolysis 20: 191-196).
  • PCP inhibitor infestin 4 domain 4 of the infestin protein from the stomach of the blood-sucking insect Triatoma infestans
  • PCP inhibitor infestin 4 belongs to the Casal type family of inhibitors (Campos et al. 2004, FEBS Lett. 577: 512-516).
  • the amino acid sequence of infestin 4 (Inf4) and the spatial structure are given in the public Protein Data Bank database (http://www.rcsb.org), record number 2ERW.
  • Infestin 4 is a selective inhibitor of fChPa, blocking the activity of fchPa in an in vivo model of thrombosis and preventing vascular embolism, while it does not change the parameters of hemostasis.
  • the use of infestin 4 in the form of a protein with albumin for the treatment and prevention of diseases associated with thrombosis is disclosed in US patent 8,283,319, cl. A61K 38/16, publ. 10/152012.
  • the drawback of infestin 4 is its inhibitory activity against fXa (Ki 53 nM inhibition constant).
  • Mutl5 including in a kit for the diagnosis of hemorrhagic and thrombolytic diseases by determining the concentration of fChPa in the blood of a patient, is known from patent BRPI 0602496-3, class. A61K 38/36, publ. 02/26/2008, however, this application is not associated with the diagnosis of diseases by measuring coagulation parameters.
  • a highly selective inhibitor of fHPa for blocking contact activation in the study of TF-initiated blood coagulation is not known from the prior art.
  • the objective of the present invention is to provide a highly selective inhibitor of fHPa to block contact activation during studies of coagulation of blood or plasma, in particular, initiated TF, as well as during the collection and storage of blood or plasma.
  • One aspect of the present invention is the creation of a polypeptide for inhibiting contact activation in a test sample of blood or its product, which is characterized the sequence of the mutant infestin 4 MutB (SEQ ID NO: 1) and no substantially corresponds to it, where the specified sequence may have modifications outside the inhibitory loop region, significantly preserving the activity of the specified polypeptide.
  • the mutant Infestin 4 MutB is a highly selective inhibitor of pXP and has an activity and selectivity higher than that of native Infestin 4 and Mutl 5.
  • polypeptide which is characterized by the sequence of mutant Infestin 4 MutB (SEQ ID NO: 1) and essentially corresponds to it, where the specified sequence may have modifications outside the inhibitory loop region, significantly preserving the activity of the specified polypeptide "refers to polypeptides comprising the amino acid sequence of SEQ ID ⁇ : 1, as well as polypeptides with slightly modified amino acid sequence, if these polypeptides significantly retain their inhibitory activity
  • the “ ⁇ modified” polypeptide and these modifications do not affect the Thr9 - Ala 14 loop.
  • such modifications may represent changes in the N- or C-terminus of a sequence, deletion or insertion of one or more amino acid residues, as well as conservative amino acid substitutions, namely, substitutions made within the group of amino acids with similar characteristics, for example, (1) small, (2) acidic, (3) polar, (4) basic, (5) hydrophobic and (6) aromatic amino acids.
  • Such a polypeptide can be obtained by chemical synthesis or in the form of a recombinant protein, including as a fusion protein with a partner protein. Its production as a recombinant protein can be carried out by creating expression plasmid DNA, transforming it into a host cell, expressing a polypeptide that is characterized by the sequence of the mutant infestin 4 MutB and encoded by the specified DNA, isolation and purification of the specified polypeptide.
  • a region of DNA that encodes essentially the same protein can be obtained, in particular, by modifying the nucleotide sequence of the above plasmid DNA, for example, using the site-directed mutagenesis method.
  • inhibitor activity is meant here the functional activity of the inhibition of blood coagulation initiated by the contact path.
  • inhibitor activity can be detected in the coagulometric test “activated partial thromboplastin time (APTT)”.
  • coagulation of inhibition is meant here the property of an FHPa inhibitor consisting in the inhibition of FHPa with high efficiency (an inhibition constant of about 1 nM) and no noticeable inhibition (the inhibition constant is much greater than 1 nM, preferably greater than 1 ⁇ M) of other coagulation proteases, such as factors fX1a, fGHa, fXa, fUPa, thrombin and APC.
  • Native infestin 4 is known to inhibit PKh with a constant of 53 nM (Campos et al. 2004, FEBS Lett. 577: 512-516).
  • the inventive polypeptide which is characterized by the sequence of the mutant infestin 4 MutB, also effectively inhibits phPa as a native inhibitor, but does not inhibit pha.
  • the inventive polypeptide has a high selectivity for fkhPa compared with native infestin 4.
  • a “test sample of blood or blood product” is whole blood or blood products, for example, platelet-rich plasma, platelet-poor plasma, platelet-free plasma. Also, such a product may be fractionated plasma, from which one or more proteins, including using the method affinity chromatography.
  • the sample can be obtained from healthy subjects or from subjects that may or may not suffer from a blood clotting disorder, in particular, subjects with hemorrhages or thromboses having disorders or deficiencies in the hemostasis system.
  • a sample can be obtained from patients during surgical interventions or during the implementation of anticoagulant, procoagulant, antiplatelet, fibrinolytic or antifibrinolytic therapy, etc.
  • the sample may be freshly prepared or may be frozen. Also, the sample may be in lyophilized form.
  • the sample may contain natural or recombinant proteins, as well as other drugs or reagents, including those that have hemostatic or fibrinolytic activity.
  • Another aspect of the invention is the use of said polypeptide for testing coagulation of a test sample, which includes at least one of the following steps, mainly all steps: obtaining a sample, bringing it into contact with the specified polypeptide and incubating the resulting mixture, bringing the coagulation activator into contact blood with a sample containing the specified polypeptide, and measuring coagulation parameters of the sample.
  • Obtaining a sample for coagulation studies includes blood sampling in a test tube containing or not containing an anticoagulant, including sodium citrate, EDTA, thrombin inhibitor, fXa inhibitor and others.
  • the process of obtaining a sample from the blood may include the stage of purification of blood from unwanted cells and cellular components, such as red blood cells, white blood cells, platelets, microvesicles, etc.
  • the cleaning steps may consist of filtration or centrifugation.
  • the resulting sample can be frozen for storage and further thawed before conducting coagulation studies. Also, before the study, the sample can go through the stage of recalcification.
  • a polypeptide that is characterized by the infestin 4 MutB mutant sequence may be contacted with a test sample of blood or its product in a test tube, in particular in a blood collection tube, or in an analytical cuvette.
  • the specified polypeptide can be in dissolved form, in dried or lyophilized form, also the specified polypeptide can be adsorbed on surfaces with which the blood or plasma of the subject is contacted during blood sampling, when preparing or conducting coagulation studies of the test sample.
  • the polypeptide can be pre-dissolved in a solution that contains a salt, a buffer substance, in particular 4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), an excipient or stabilizer, in particular polyvinylpyrrolidone (PVP).
  • a salt e.g., 4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)
  • HEPPS 4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic acid
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the resulting mixture of the sample and the polypeptide can be incubated at a temperature of + 20 ° C to + 40 ° C, mainly at + 37 ° C, for a period of more than 3 minutes, mainly more than 10 minutes.
  • a sufficient amount of the indicated polypeptide can be determined by measuring the activity of the polypeptide in a sample obtained from a healthy donor, for example, using the APTT test. So, a polypeptide amount in which the APTT is more than 2 times, mainly more than 3 times, compared with the APTT sample without the polypeptide will be sufficient to effectively inhibit contact activation. Also, a sufficient amount of the indicated polypeptide can be determined using the laboratory diagnostic system "T-2 Thrombodynamics Recorder" [RU 123166 B of 08.16.2012 class G01N33 / 86; USPTO Pat. arr. No. 2010026121 1], in particular, by the absence of clots away from the coagulation activator in a sample obtained from a healthy donor for more than 15 minutes, preferably more than 30 minutes, after activation.
  • the coagulation activator can be brought into contact with a blood sample or its product containing the indicated polypeptide, can be carried out by adding a solution containing the coagulation activator to the specified sample, or by layering the specified solution on the sample without mixing. Also, the sample can be brought into contact with the surface on which the coagulation activator is immobilized, while the sample is not mixed with the activator (Fadeeva et al. 2010, Biochemistry 75: 827-838).
  • the coagulation activator may be a tissue factor, in particular, a re-lipidated tissue factor.
  • Tissue factor can be obtained in the form of a recombinant protein or by isolation from organs or tissues, such as the brain, placenta, lungs, some mammals, for example, human, bull, rabbit.
  • one of the coagulation factors such as Vila, Xa, Pa, IXa, X1a, XIA, can be an activator.
  • the coagulation parameters of a test sample of blood or its product can be measured, in particular, by a thrombin generation test, a thromboelastography test known in the art, or a laboratory diagnostic system “T-2 Thrombodynamics Recorder”.
  • the following coagulation parameters can be determined: the delay time for the beginning of coagulation, the coagulation time, and the delay time for the production of thrombin, the time for reaching the maximum of thrombin, the maximum concentration of thrombin, the angle of the thromboelastogram, the growth rate of the clot, the size of the clot at a fixed time, the presence of clots from coagulation activator, clot lysis rate and others.
  • Another aspect of the invention is the use of a polypeptide, which is characterized by the infestin 4 MutB mutant sequence, as an anticoagulant blocking contact activation by contacting a blood sample or its product with a specified polypeptide for collection and increasing the storage time of the sample.
  • the polypeptide which is characterized by the sequence of the mutant infestin 4 MutB, can be brought into contact with a sample of blood or its product in a test tube, in particular in a blood collection tube.
  • the specified polypeptide can be in dissolved form, in dried or lyophilized form, also the specified polypeptide can be adsorbed on surfaces with which the blood or plasma of the subject is in contact during blood sampling or sample preparation.
  • the polypeptide can be pre-dissolved in a solution that contains a salt, a buffer substance, in particular 4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), an excipient or stabilizer, in particular polyvinylpyrrolidone (PVP).
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) 1-piperazineethanesulfonic acid
  • PVP polyvinylpyrrolidone
  • the resulting mixture of sample and polypeptide can be incubated at a temperature of + 20 ° C to + 40 ° C, mainly at + 37 ° C, for a period of more than 3 minutes, mainly more than 10 minutes.
  • a sufficient amount of the indicated polypeptide can be determined by measuring the activity of the polypeptide in a sample obtained from a healthy donor, for example, using the APTT test. So, a polypeptide amount in which the APTT is more than 2 times, mainly more than 3 times, compared with the APTT sample without the polypeptide will be sufficient to effectively inhibit contact activation.
  • polypeptide can be determined using the laboratory diagnostic system “T-2 Thrombodynamics Recorder”, in particular, by the absence of clots away from the coagulation activator in a sample obtained from a healthy donor, for more than 15 minutes, mainly more than 30 minutes, after activation .
  • Blood sampling can be carried out in a test tube, additionally containing or not containing an anticoagulant, including sodium citrate, EDTA, thrombin inhibitor, fXa inhibitor and others.
  • an anticoagulant including sodium citrate, EDTA, thrombin inhibitor, fXa inhibitor and others.
  • Obtaining a sample from the blood may include the stage of purification of blood from unwanted cells and cellular components.
  • Storage of a blood sample or its product can be carried out frozen at negative temperatures below 0 ° C, mainly below -50 ° C, or in liquid form at a positive temperature near 0 ° C or at a temperature of + 20 ° C to + 40 ° C .
  • the storage process may include one or more stages of freezing and thawing of the sample.
  • the storage time of the sample can be from 10 minutes or more, in particular, from one day or more, mainly more than one week.
  • Figure 2 illustrates fibrin clots formed from the activator and from the walls of the cell obtained 30 minutes after activation of normal frozen plasma without the addition of a contact activation inhibitor.
  • Fig. 3 illustrates fibrin clots obtained 30 minutes after activation of normal frozen plasma samples with the addition of MutB (20 ⁇ M), CTI (15 ⁇ M) and without the addition of a contact activation inhibitor (4 repetitions for each sample).
  • Figure 4 presents a graph of the time (min.) Of the area away from the activator occupied by fibrin clots in normal frozen plasma with the addition of MutB (20 ⁇ M), CTI (15 ⁇ M) and without the addition of a contact activation inhibitor (% of the cell area) (4 repetitions for each sample).
  • Figure 5 presents a graph of time versus time (min.) Of the area away from the activator occupied by fibrin clots in hypercoagulation plasma with the addition of MutB (20 ⁇ M), CTI (15 ⁇ M) and without the addition of a contact activation inhibitor (% of the cell area) (4 repetitions for each sample).
  • FIG. 6 A-D illustrate the effect of contact activation inhibitors MutB (20 ⁇ M) and CTI (15 ⁇ M) on the growth of a fibrin clot from the activator in normal frozen and hypocoagulation plasma.
  • Figure 7 presents data on the coagulation time (sec.) Of whole blood that was taken from 3 healthy donors in a test tube containing MutB (10 ⁇ M), CTI (5 ⁇ M) or not containing a contact activation inhibitor (2-4 repetitions for each donor).
  • the inventive polypeptide which is characterized by the sequence of the mutant infestin 4 MutB, is a highly selective contact activation inhibitor.
  • Amino Acid Sequence MutB is represented in the list of sequences under the number SEQ ID ⁇ : 1.
  • the mechanism of inhibition of fChPa is assumed to be competitive; it consists in the fact that MutB interacts with the active center of fchPa through an inhibitory loop, which includes a portion of the Thr9 - Ala 14 inhibitor, the amino acid sequence of which is shown in Table 1.
  • Table 1 Also in Table 1 are the corresponding sequences of native infestin 4 (Inf4) and the known mutant infestin 4 (Mutl5).
  • ArglO - Asnl l reactive site Inside the indicated portion of the inhibitory loop is the ArglO - Asnl l reactive site, which is cleaved in the active center of fPPa.
  • Table 1 the amino acid residues that make up this site are numbered according to their position relative to the reactive site.
  • MutB was created by introducing the following amino acid substitutions in the inhibitory loop region of native infestin 4: Thr9Phe, Phel2Tyr, and A1a14Pgo.
  • KTI native infestin 4 and its mutants equally effectively inhibit the activity of fChPa protease in a buffer solution. It was found that in high concentrations, on the order of tens of micromoles per liter, KTI possesses inhibitory activity for ⁇ X1a and APC, i.e. It is not a highly selective inhibitor of fChPa. Native infestin 4 and its mutants MutB and Mutl5 do not inhibit fX1a. Also, the infestin 4 mutants MutB and Mutl 5 do not inhibit pXA, in contrast to the native infestin 4. However, Mutl 5, like CTI, has inhibitory activity against APC, i.e. also is not highly selective.
  • MutB has the highest selectivity for inhibiting fHPa, since it does not have inhibitory activity to other indicated factors. Evaluation of the inhibitory activity of a new inhibitor for the suppression of contact activation in blood plasma
  • the possibility of using the indicated polypeptide as an inhibitor of the contact pathway was shown during the blood plasma coagulation test by means of the laboratory diagnostic system T-2 Thrombodynamics Recorder.
  • the test included the following steps: thawing the frozen PFP sample, adding a contact activation inhibitor to it and incubating the resulting mixture, recalcifying the sample and placing it in the channel of the measuring cell, bringing it into contact with the TF immobilized at the end of the special activator insert, and recording the emergence and growth of fibrin clots in sequential photography.
  • a frozen PFP sample was preliminarily obtained by blood sampling in tubes with sodium citrate from several (at least five) healthy donors, the following two stages of centrifugation and freezing of the obtained plasma at -80 ° C.
  • Clots in the region of the cuvette far from the activator may be the result of the hypercoagulable state of the sample or artifacts of contact activation of the sample with the walls of the cuvette (artifact clots), which must be suppressed in order for this test to distinguish between the normal and hypercoagulation state of the coagulation system.
  • a contact activation inhibitor was added to the sample, in our case, it is a polypeptide that is characterized by the infestin 4 MutB mutant sequence.
  • a contact activation inhibitor of the prior art known in the art, these inhibitors were added to two separate samples of normal frozen PFP. The concentrations of these inhibitors were used at which the APTT increased by about 4 times: 20 ⁇ M in the case of MutB and 15 ⁇ M in the case of CTI.
  • no contact activation inhibitor was added to the third plasma sample. For each sample, 4 repeated studies were performed.
  • FIG. 3 it can be seen that the addition of either the polypeptide that is characterized by the sequence of the mutant infestin 4 MutB, or CTI, leads to almost complete suppression of contact activation and prevents the occurrence of artifact clots.
  • Figure 5 shows that in hypercoagulant plasma samples without the addition of a contact activation inhibitor and with the addition of MutB, clots far from the activator appear approximately 5-8 minutes after activation, while in the sample with CTI they appear 10-15 minutes later.
  • MutB or CTI leads to almost complete suppression of contact activation and prevents the appearance of artifact clots in normal plasma.
  • the addition of MutB does not affect the appearance of clots far from the activator, which occur independently of phpPa, while the addition of CTI delays the appearance of clots far from the activator, presumably due to inhibition of phX1a, and can reduce the sensitivity of the diagnostic system to hypercoagulation.
  • the polypeptide which is characterized by the sequence of the mutant infestin 4 MutB, can be used to effectively block contact activation and coagulation of blood or its product along the contact path.
  • the effect of contact activation inhibitors on coagulation dynamics can be shown by the example of the growth of a fibrin clot from a surface with immobilized TF.
  • the growth dynamics of a fibrin clot from the activator can be characterized by the following parameters: delayed clot formation after plasma contact with tissue factor — lag time (Tlag, min); the average clot growth rate in the range of 2-6 minutes after the start of coagulation - the initial speed (Vin, ⁇ m / min); and the average clot growth rate in the range of 15-25 minutes after the start of coagulation is the stationary rate (Vst, ⁇ m / min) (Balandina et al. 201 1, Biophys. J.
  • hypocoagulation states of various nature deficiencies of factors VII, V, X, thrombin, hemophilia A, B and C, during therapy with anticoagulants, such as unfractionated and low molecular weight heparin, vitamin K antagonists, antithrombin III
  • anticoagulants such as unfractionated and low molecular weight heparin, vitamin K antagonists, antithrombin III
  • the lag time is increased, and the initial and / or stationary clot growth rates are reduced relative to normal values for healthy donors (Parunov et al. 2011, J. Thromb. Haemost. 9: 1825-1834).
  • hypercoagulable conditions of various nature clots appear in the region of the cell far from the activator, and the initial and / or stationary velocities are increased relative to normal values.
  • an inhibitor is preferred that does not affect the occurrence of clots far from the activator in a sample of hypercoagulable plasma and does not affect the growth dynamics of a fibrin clot from the activator in
  • MutB (20 ⁇ M) and CTI (15 ⁇ M) were added to two samples of normal frozen PFP and two samples of hypocoagulation PFP.
  • Hypocoagulation PFP was prepared from normal frozen PFP by adding 0.1 IU / ml unfractionated heparin.
  • Fig. 6A shows the time-dependent (min.) Time dependences of the size of the fibrin clot along its growth direction ( ⁇ m), averaged over 4 repeated experiments, for samples of hypocoagulation and normal plasma with added MutB and KTI inhibitors.
  • the bar graphs show the mean values +/- standard deviation (SD) for 4 repeated experiments for clot growth parameters: lag time (Fig. BV), initial speed (Fig. BS) and stationary speed (Fig. bO).
  • SD standard deviation
  • Fig. BV lag time
  • Fig. BS initial speed
  • Fig. bO stationary speed
  • Student's criterion was used. The statistical significance of differences in clot growth parameters in hypocoagulation and normal plasma is indicated by "p ⁇ 0.001". Insignificant differences are indicated by "p>0.5".
  • the measurement results are shown by icons corresponding to each measurement; the line or rectangle shows the position regions of the medians of the obtained values of the clotting times. 7 shows that the use of a contact activation inhibitor MutB or CTI with blood sampling without a chelator of calcium ions it allows to increase the storage time of whole blood in a test tube by about 2-3 times.
  • Example 1 The selectivity of MutB in relation to pChPa in a buffer solution.
  • a chromogenic test was used: a mixture of protease and an inhibitor the wells of the plate were incubated for 15 minutes at a temperature of + 37 ° C, then a solution of a chromogenic substrate of the indicated protease was added to the mixture, and the protease activity was measured by the rate of formation of a chromogenic product at + 37 ° C.
  • Table 3 shows the names and concentrations of chromogenic substrates and the corresponding proteases.
  • Chromogenic substrates included a p-nitroanilide group, which was cleaved by appropriate proteases. After the r-nitroanilide group is cleaved from the substrate molecule, the absorption spectrum of the group changes, and a change in the concentration of such a product over time can be detected at a wavelength of light of 405 nm using a plate spectrophotometer. To plot the protease activity versus inhibitor concentration, different inhibitor concentrations were added to several samples with the same protease concentration. Next, the inhibitor concentration was determined, which reduces the protease activity by 50% (1C 5 yer).
  • Kj IC 5 o / (l + S / K M )
  • S the initial concentration of the substrate
  • K m the constant Michaelis-Menten substrate in relation to protease.
  • E. coli thioredoxin I and polyhistidine clusters are auxiliary sections of the polypeptide that do not affect activity, which are well known in the art and are used to increase the level of expression of target proteins in soluble form and their purification, respectively.
  • KTI was a protein isolated from corn kernels and purified chromatographically.
  • LCTI-III was obtained by chemical synthesis. The cleavage reaction of the substrate was carried out in a buffer of 50 mm Tris-HCl, 130 mm NaCl, 0.5% bovine serum albumin, pH 8.3.
  • Example 2 Evaluation of the inhibitory activity of MutB in suppressing contact activation in blood plasma.
  • the blood plasma of healthy donors was prepared in accordance with the standard rules for blood sampling for coagulological tests (Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline Fifth Edition by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) H21-A5 Vol. 28 No.5). To block ions, 0.38% sodium citrate was added to the blood.
  • the APTT test was carried out using Coagulo-test reagents (NPO Renam, Moscow, Russia) and various concentrations of contact activation inhibitors: native infestin 4, MutB and Mutl5. To do this, 50 ⁇ l of healthy person's blood plasma was mixed with 5.6 ⁇ l of a ten-fold inhibitor solution in different concentrations and incubated for 15 minutes at + 37 ° C. Further, according to the manual Coagulo test, 25 ⁇ l of the mixture was transferred to a cuvette of the He1epa-C2 coagulometer, and 25 ⁇ l of a kaolin-mullet-kefalin mixture that activates fcP in blood plasma was added. After incubation at + 37 ° C for 3 minutes, 25 ⁇ l of a calcium chloride solution was added at an initial concentration of 25 mM, and the formation time of a fibrin clot in the coagulometer cell was photometrically determined.
  • Example 3 The effect of MutB on the appearance of artifact clots due to contact activation and growth dynamics of a fibrin clot initiated by TF.
  • the indicated polypeptide was previously proteolytically cleaved and chromatographically purified from thioredoxin (Thx).
  • Example 4 The increase in the storage time of whole blood during sampling without calcium chelator using MutB.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности, гематологии, и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов, а также в биотехнологии и в фундаментальных биологических исследованиях. Одним из аспектов настоящего изобретения является создание полипептида, для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB (SEQ ID NO: 1) и по существу соответствует ей, где указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида, являющийся высокоселективным ингибитором фХIIа, селективность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15, или активность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15. Другим аспектом изобретения является применение указанного полипептида для исследования свертывания тестируемого образца крови или ее продукта, которое включает, по крайней мере, один из следующих шагов, преимущественно, все шаги: получение образца, приведение его в контакт с указанным полипептидом и инкубацию полученной смеси, приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом, содержащим указанный полипептид, и измерение параметров свертывания образца. Еще одним аспектом изобретения является применение полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, в качестве антикоагулянта, блокирующего контактную активацию, путем приведения в контакт с указанным полипептидом образца для забора и увеличения времени хранения образца.

Description

ВЫСОКОСЕЛЕКТИВНЫЙ ИНГИБИТОР КОНТАКТНОЙ АКТИВАЦИИ НА ОСНОВЕ ИНФЕСТИНА 4
Область техники
Настоящее изобретение относится к медицине, в частности, гематологии, и может быть использовано, в частности, для диагностических и исследовательских целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов, а также в биотехнологии и в фундаментальных биологических исследованиях.
Предшествующий уровень техники
Плазменное свертывание крови
Свертывание крови - защитный процесс организма; одна из основных составляющих этого процесса - образование фибринового сгустка. Фибриновый сгусток образуется в результате активации ферментативного каскада факторов свертывания; многие из факторов свертывания являются сериновыми протеазами (Vila, ХПа, XIa, 1Ха, Ха, тромбин Па). Также в работе ферментативного каскада свертывания участвует активированный протеин С (аРС) - протеаза, которая активируется тромбином и инактивирует кофакторы свертывания Villa и Va. Активация ферментативного каскада происходит по «внешнему» пути, за который отвечает фактор Vila ^VIIa) и тканевый фактор (ТФ, или тромбопластин), или по «внутреннему» пути, который начинается с контактной активации фактора XII (фХП, или фактора Хагемана) (Mann et al. 1990, Blood 76: 1-16; Hoffman и Monroe. 2001, Thromb. Haemost. 85:958-965). Контактная активация представляет собой само-активацию фХП при контакте плазмы крови с отрицательно заряженными поверхностями. фХП присутствует в плазме крови в неактивном состоянии, в комплексе с высоко- молекулярным кининогеном (HMW ) и плазменным пре-калликреином он превращается в активную протеазу фактор ХПа (фХНа). Поверхностями, приводящими к активации фХП, могут быть любые чужеродные поверхности, в т.ч. стенки пластиковых или стеклянных пробирок, поверхности стентов, катетеров и т.д. фХПа протеолитически активирует прекалликреин в его активную форму калликреин, фермент, в т.ч. отвечающий за активацию системы фибринолиза, и фактор «внутреннего» пути свертывания XI в его активную форму фактор Х1а (фХ1а) (Ichinose et al. 1986, J. Biol. Chem. 261 :3486-3489; Schmaier. 2008, J. Clin. Invest. 1 18:3006-3009).
Подавление контактной активации
Важной проблемой является подавление свертывания по контактному пути, которое возникает при контакте образца крови или плазмы (цельной крови или плазмы крови, в том числе богатой, бедной или освобожденной от тромбоцитов плазмы) с чужеродной поверхностью и препятствует использованию образца для хранения, трансфузии и исследования (Sperling et al. 2009, Biomaterials 30:4447-4456; Streller et al. 2003, J. Biomed. Mater. Res. В Appl. Biomater. 66:379-390). Активация фХПа происходит при извлечении крови из сосудистого русла организма, например: 1) при заборе крови в пробирку от поверхностей иглы, трубочек и стенок пробирки; 2) при хранении плазмы крови в замороженном виде и последующем оттаивании плазмы; или 3) при использовании аппарата искусственного (экстракорпорального) кровообращения, в частности, при трансфузии крови или плазмы. Контактная активация при заборе крови или оттаивании замороженной плазмы может инициировать свертывание в пробирке, которое препятствует получению образца и исследованию свертывания (Smith et al. 2010, Blood Coagul. Fibrinolysis. 21 :692-702; Suontaka et al. 2005, Vox. Sang. 88: 172-180). При аутотрансфузии или повторном вливании крови активация контактного пути приводит к увеличению риска тромбозов. Для блокирования свертывания крови при использовании аппарата искусственного кровообращения трубочки и другие поверхности аппарата покрываются ингибиторами фХа и тромбина, такими как гепарин, бензамидин и т.д. (Hsu. 2001 , Perfusion 16:417-428; Gouzy et al. 2006, Biointerphases 1 : 146- 155). Недостаток такого способа блокирования свертывания заключается в том, что добавление ингибиторов фХа и тромбина не препятствует наработке фХПа, который может инициировать свертывание после вливания крови или плазмы в сосудистое русло организма.
Наиболее распространенным способом подавления свертывания при заборе крови служит предварительное добавление в пробирку, в которую забирается кровь, хелатора ионов кальция (например, цитрата натрия, ЭДТА и т.д.). Хелатирование ионов кальция блокирует мембранно- зависимые реакции активации фХ и тромбина (Fischer. 2007, Hemodial. Int. 1 1 : 178-189). При проведении исследования свертывания в исследуемый образец, содержащий хелатор, добавляется активатор свертывания (в частности, ТФ или активатор контактного пути) и плазма рекальцифицируется (добавляется избыток ионов кальция), далее исследуются параметры образования фибринового сгустка. Способ подавления свертывания путем добавления хелатора обладает некоторыми недостатками. В работе Mann et al. 2007, J. Thromb. Haemost. 5:2055-2061 было показано, что хелатирование ионов кальция при заборе крови и последующая рекальцификация образца изменяют динамику образования фибринового сгустка, наработки тромбина и агрегации тромбоцитов, по сравнению с образцами без добавления хелатора. Добавление хелатора не приводит к подавлению реакций активации фХ1 и φΙΧ, которые инициируются фХПа, образующимся при проведении забора крови и хранении образца (Nossel et al. 1968, J. Clin. Invest. 47: 1 172-1 180; Oiler et al. 1976, J. Surg. Res. 20:333-340). Поэтому, при исследовании свертывания, в частности, ТФ-инициированного свертывания по «внешнему» пути (который считается физиологическим и отвечающим за свертывание в нормальном состоянии организма), из-за образовавшегося фХПа также происходит свертывание по контактному пути, которое вносит нежелательные искажения в результаты исследования. Свертывание по контактному пути в таком исследовании является артефактом, который может препятствовать адекватной оценке эффектов физиологического свертывания, приводить к увеличению ошибки и несоответствию результатов исследования, а также к потере чувствительности в отношении патологических состояний свертывания. Чтобы подавить контактную активацию, избежать появления артефактов и улучшить качество исследования свертывания, необходимо использовать ингибитор фХИа при заборе крови или подготовке плазмы (Luddington и Baglin. 2004, J. Thromb. Haemost. 2: 1954-1959). Используемый ингибитор контактной активации должен быть высокоселективным: когда концентрация добавленного к образцу ингибитора достаточна для эффективного подавления контактного пути свертывания, ингибитор не оказывает влияния на ТФ- инициированное образование фибринового сгустка, т.е. не ингибирует фХ1а, ф1Ха, фХа и другие.
Известные ингибиторы контактной активации
Известен ряд ингибиторов фХПа, в частности, плазменные ингибиторы свертывания, например, С 1 -ингибитор, альфа2-макроглобулин. (Davis et al. 2008, Mol. Immunol. 45:4057-4063). Также известны белковые ингибиторы трипсина, которые ингибируют фХПа и были выделены из различных организмов, например, из бактерии Е.соН (Ulmer et al. 1995, FEBS Lett. 365: 159-163), из семян растений (Wynn и Laskowski. 1990, Biochem. Biophys. Res. Commun. 166: 1406-1410). К числу ингибиторов из семян растений относится кукурузный ингибитор трипсина, или КТИ (Hojima et al. 1980, Thromb. Res. 20: 149-162), а также ингибиторы из семейства тыквенных: Cucurbita maxima trypsin inhibitor, CMTI-III (Krishnamoorthi et al. 1990, FEBS Lett. 273: 163-167), Luffa cylindrica trypsin inhibitor, LCTI-III (Ling et al. 1993, J. Biol. Chem. 268:810-814), и другие. Известны также небелковые ингибиторы фХПа (Woodruff et al. 2013, J. Thromb. Haemost. 1 1 : 1364-1373). Однако большинство из перечисленных ингибиторов являются неселективными: кроме фХПа, они ингибируют также другие факторы свертывания, что делает невозможным их применение при исследовании образования фибринового сгустка.
Наиболее селективным из существующих ингибиторов считается КТИ. Известно применение КТИ для ингибирования контактной активации при исследовании ТФ-инициированного свертывания в образце крови или ее компонента (US6,403,381 , кл. G01N33/86, опубл. 1 1.06.2002), в т.ч. в глобальных тестах гемостаза, например, в тесте генерации тромбина. Однако, существуют данные о недостаточной селективности КТИ, так как известно его влияние на систему свертывания крови и другие системы, взаимодействующие со свертыванием. Так, КТИ задерживает фибринолиз, предположительно, путем ингибирования тканевого активатора плазминогена (Nielsen. 2009, Blood Coagul. Fibrinolysis 20: 191-196).
Известен также ингибитор фХПа инфестин 4 (домен 4 белка инфестин из желудка кровососущего насекомого Triatoma infestans), он относится к семейству ингибиторов типа Казаля (Campos et al. 2004, FEBS Lett. 577:512-516). Аминокислотная последовательность инфестина 4 (Inf4) и пространственная структура приведены в публичной базе данных Protein Data Bank (http://www.rcsb.org), номер записи 2ERW.
Известные применения инфестина 4 и недостатки существующих вариантов инфестина 4
В работе Hagedorn, Schmidbauer et al. 2010, Circulation 121 : 1510-1517 было показано, что инфестин 4 является селективным ингибитором фХПа, блокирующим активность фХПа в модели тромбоза in vivo и предотвращающим эмболию сосудов, при этом он не изменяет параметры гемостаза. Применение инфестина 4 в виде слитого белка с альбумином для лечения и профилактики болезней, связанных с тромбозами, раскрыто в патенте US 8,283,319, кл. А61К 38/16, опубл. 09.10.2012. Однако недостатком инфестина 4 является его ингибирующая активность по отношению к фХа (константа ингибирования Ki 53 нМ).
Известен мутант инфестина 4 Inf4Mutl 5 (Mutl5), который обладает повышенной селективностью к фХПа, т.к. не ингибирует фХа (Campos, Souza et al. 2012, Acta Cryst. D68:695-702). Упомянутый мутант был выбран ближайшим аналогом заявляемого решения. Из уровня техники неизвестна селективность ингибирования указанным мутантом фХПа, т.е. неизвестно, обладает ли он ингибирующей активностью к фХ1а, ф1Ха, фУПа, тромбину и аРС. Применение Mutl5, в том числе, в наборе для диагностики геморрагических и тромболитических заболеваний путем определения концентрации фХПа в крови пациента, известно из патента BRPI 0602496-3, кл. А61К 38/36, опубл. 26.02.2008, однако указанное применение не связано с диагностикой заболеваний путем измерения параметров свертывания. Таким образом, из уровня техники не известен высокоселективный ингибитор фХПа для блокирования контактной активации при исследовании ТФ-инициированного свертывания крови.
Задачей настоящего изобретения является создание высокоселективного ингибитора фХПа для блокирования контактной активации при проведении исследований свертывания крови или плазмы, в частности, инициированного ТФ, а также при заборе и хранении крови или плазмы.
Сущность изобретения
Одним из аспектов настоящего изобретения является создание полипептида для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB (SEQ ID NO: 1) и no существу соответствует ей, где указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида. Мутант инфестина 4 MutB является высокоселективным ингибитором фХПа и обладает активностью и селективностью, выше, чем у нативного инфестина 4 и Mutl 5. Под определением «полипептид, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB (SEQ ID NO: 1) и по существу соответствует ей, где указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида» подразумеваются полипептиды, включающие аминокислотную последовательность SEQ ID ΝΟ: 1 , а также полипептиды с незначительно модифицированной аминокислотной последовательностью, если эти полипептиды существенно сохраняют ингибирующую активность
«^модифицированного» полипептида и эти модификации не затрагивают петлю Thr9 - Ala 14. Например, такие модификации могут представлять собой изменения N- или С-концов последовательности, делеции или вставки одного или нескольких аминокислотных остатков, а также консервативные аминокислотные замены, а именно, замены, выполненные в пределах группы аминокислот с аналогичными характеристиками, например, (1) малых, (2) кислых, (3) полярных, (4) основных, (5) гидрофобных и (6) ароматических аминокислот.
Такой полипептид может быть получен путем химического синтеза или в виде рекомбинантного белка, в том числе в виде слитого белка с белком- партнером. Его получение в виде рекомбинантного белка может быть осуществлено путем создания экспрессионной плазмидной ДНК, трансформации ее в клетку-хозяина, экспрессии полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB и кодируется указанной ДНК, выделения и очистки указанного полипептида. Участок ДНК, который кодирует, по существу, тот же белок, может быть получен, в частности, путем модификации нуклеотидной последовательности указанной выше плазмидной ДНК, например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза.
Под «активностью ингибитора» здесь следует понимать функциональную активность ингибирования свертывания крови, инициированного по контактному пути. Так, например, активность ингибитора можно детектировать в коагулометрическом тесте «активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)».
Под «селективностью ингибирования» здесь следует понимать свойство ингибитора фХПа, заключающееся в ингибировании фХПа с высокой эффективностью (константой ингибирования порядка 1 нМ) и отсутствии заметного ингибирования (константа ингибирования намного больше 1 нМ, предпочтительно больше 1 мкМ) других протеаз свертывания, таких как факторы фХ1а, фГХа, фХа, фУПа, тромбин и аРС. Известно, что нативный инфестин 4 ингибирует фХа с константой 53 нМ (Campos et al. 2004, FEBS Lett. 577:512-516). При этом заявляемый полипептид, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, так же эффективно ингибирует фХПа, как и нативный ингибитор, но не ингибирует фХа. Таким образом, заявляемый полипептид обладает повышенной селективностью к фХПа по сравнению с нативным инфестином 4.
«Тестируемый образец крови или ее продукта» представляет собой цельную кровь или ее продукты, например, богатую тромбоцитами плазму, бедную тромбоцитами плазму, освобожденную от тромбоцитов плазму. Также таким продуктом может быть фракционированная плазма, из которой удален один или несколько белков, в т.ч. при помощи метода аффинной хроматографии. Образец может быть получен от здоровых субъектов или от субъектов, которые могут страдать или страдают от нарушения свертывания крови, в частности, субъектов с геморрагиями или тромбозами, имеющих нарушения или дефициты системы гемостаза. Также образец может быть получен у пациентов при хирургических вмешательствах или при осуществлении антикоагулянтной, прокоагулянтной, антиагрегантной, фибринолитической или антифибринолитической терапии и т.д. Образец может быть свежеполученным или может находиться в замороженном состоянии. Также образец может находиться в лиофилизованной форме. Образец может содержать природные или рекомбинантные белки, а также другие препараты или реагенты, в том числе такие, которые обладают гемостатической или фибринолитической активностью.
Другим аспектом изобретения является применение указанного полипептида для исследования свертывания тестируемого образца, которое включает, по крайней мере, один из следующих шагов, преимущественно, все шаги: получение образца, приведение его в контакт с указанным полипептидом и инкубацию полученной смеси, приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом, содержащим указанный полипептид, и измерение параметров свертывания образца.
Получение образца для исследования свертывания включает забор крови в пробирку, содержащую или не содержащую антикоагулянт, в т.ч. цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина, ингибитор фХа и другие. Процесс получения образца из крови может включать стадии очистки крови от нежелательных клеток и клеточных компонентов, таких как эритроциты, лейкоциты, тромбоциты, микровезикулы и т.д. Стадии очистки могут состоять из фильтрации или центрифугирования. Полученный образец может быть заморожен для хранения и далее разморожен перед проведением исследования свертывания. Также перед проведением исследования образец может пройти стадию рекальцификации.
Полипептид, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, может приводиться в контакт с тестируемым образцом крови или ее продукта в пробирке, в частности, в пробирке для забора крови, или в аналитической кювете. Указанный полипептид может быть в растворенной форме, в высушенной или лиофилизованной форме, также указанный полипептид может быть адсорбирован на поверхностях, с которыми кровь или плазма субъекта контактирует при заборе крови, при приготовлении или проведении исследования свертывания тестируемого образца. Кроме того, полипептид может быть предварительно растворен в растворе, который содержит соль, буферное вещество, в частности, 4-(2- оксиэтил) 1 -пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), экципиент или стабилизатор, в частности, поливинилпирролидон (ПВП). Для эффективного растворения указанного полипептида в образце, полученная смесь образца и полипептида может инкубироваться при температуре от +20°С до +40°С, преимущественно, при +37°С, в течение времени, более чем 3 минуты, преимущественно более 10 минут. Для эффективного ингибирования контактной активации свертывания достаточное количество указанного полипептида может быть определено посредством измерения активности полипептида в образце, полученном от здорового донора, например, при помощи теста АЧТВ. Так, достаточным для эффективного ингибирования контактной активации будет такое количество полипептида, при котором АЧТВ увеличено более чем в 2 раза, преимущественно, более чем в 3 раза, по сравнению с АЧТВ образца без полипептида. Также достаточное количество указанного полипептида может быть определено при помощи лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2» [RU 123166 В от 16.08.2012 класс G01N33/86; USPTO Pat. арр. No. 2010026121 1], в частности, по отсутствию сгустков вдали от активатора свертывания в образце, полученном от здорового донора, в течение более чем 15 минут, преимущественно более чем 30 минут, после активации.
Приведение в контакт активатора свертывания с образцом крови или ее продукта, содержащим указанный полипептид, может осуществляться путем добавления в указанный образец раствора, содержащего активатор свертывания, или путем наслоения указанного раствора на образец без перемешивания. Также образец может быть приведен в контакт с поверхностью, на которой иммобилизован активатор свертывания, при этом образец не перемешивается с активатором (Фадеева и др. 2010, Биохимия 75:827-838). Активатором свертывания может являться тканевый фактор, в частности, ре-липидированный тканевый фактор. Тканевый фактор может быть получен в виде рекомбинантного белка или путем выделения из органов или тканей, таких как мозг, плацента, легкие, некоторых млекопитающих, например, человека, быка, кролика. Также активатором может являться один из факторов свертывания, таких как Vila, Ха, Па, IXa, Х1а, ХИа.
Измерение параметров свертывания тестируемого образца крови или ее продукта может осуществляться, в частности, посредством теста генерации тромбина, теста тромбоэластографии, известных из уровня техники, или лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т- 2». В качестве указанных параметров свертывания могут быть определены: время задержки начала свертывания, время свертывания, и время задержки наработки тромбина, время достижения максимума тромбина, максимальная концентрация тромбина, угол наклона тромбоэластограммы, скорость роста сгустка, размер сгустка в фиксированный момент времени, наличие сгустков вдали от активатора свертывания, скорость лизиса сгустка и другие. Другим аспектом изобретения является применение полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, в качестве антикоагулянта, блокирующего контактную активацию, путем приведения в контакт с указанным полипептидом образца крови или ее продукта для забора и увеличения времени хранения образца.
Полипептид, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, может приводиться в контакт с образцом крови или ее продукта в пробирке, в частности, в пробирке для забора крови. Указанный полипептид может быть в растворенной форме, в высушенной или лиофилизованной форме, также указанный полипептид может быть адсорбирован на поверхностях, с которыми кровь или плазма субъекта контактирует при заборе крови или при приготовлении образца. Кроме того, полипептид может быть предварительно растворен в растворе, который содержит соль, буферное вещество, в частности, 4-(2-оксиэтил)1- пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), экципиент или стабилизатор, в частности, поливинилпирролидон (ПВП).
Для эффективного растворения указанного полипептида в образце крови или ее продукта, полученная смесь образца и полипептида может инкубироваться при температуре от +20°С до +40°С, преимущественно, при +37°С, в течение времени, более чем 3 минуты, преимущественно более 10 минут. Для эффективного ингибирования контактной активации свертывания достаточное количество указанного полипептида может быть определено посредством измерения активности полипептида в образце, полученном от здорового донора, например, при помощи теста АЧТВ. Так, достаточным для эффективного ингибирования контактной активации будет такое количество полипептида, при котором АЧТВ увеличено более чем в 2 раза, преимущественно, более чем в 3 раза, по сравнению с АЧТВ образца без полипептида. Также достаточное количество указанного полипептида может быть определено при помощи лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2», в частности, по отсутствию сгустков вдали от активатора свертывания в образце, полученном от здорового донора, в течение более чем 15 минут, преимущественно более чем 30 минут, после активации.
Забор крови может производиться в пробирку, дополнительно содержащую или не содержащую антикоагулянт, в т.ч. цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина, ингибитор фХа и другие. Получение образца из крови может включать стадии очистки крови от нежелательных клеток и клеточных компонентов.
Хранение образца крови или ее продукта может производиться в замороженном виде при отрицательных температурах ниже 0°С, преимущественно ниже -50°С, или в жидком виде при положительной температуре вблизи 0°С или при температуре от +20°С до +40°С. Также процесс хранения может включать одну или более стадий замораживания и размораживания образца. Время хранения образца может составлять от 10 минут и более, в частности, от одного дня и более, преимущественно, более одной недели.
Краткое описание фигур
На Фиг.1 представлен график зависимости АЧТВ (сек.), от концентрации ингибитора (мкМ), MutB, Mutl5 или Inf4, в плазме крови. Приведены средние значения и стандартные отклонения. Для MutB и Inf4 число повторов п = 4; для Mutl5 п = 2.
Фиг.2 иллюстрирует фибриновые сгустки, образованные от активатора и от стенок кюветы, полученные через 30 минут после активации нормальной замороженной плазмы без добавления ингибитора контактной активации. Фиг.З иллюстрирует фибриновые сгустки, полученные через 30 минут после активации образцов нормальной замороженной плазмы с добавлением MutB (20 мкМ), КТИ (15 мкМ) и без добавления ингибитора контактной активации (4 повтора для каждого образца).
На Фиг.4 представлен график зависимости от времени (мин.) площади вдали от активатора, занимаемой фибриновыми сгустками в нормальной замороженной плазме с добавлением MutB (20 мкМ), КТИ (15 мкМ) и без добавления ингибитора контактной активации (% от площади кюветы) (4 повтора для каждого образца).
На Фиг.5 представлен график зависимости от времени (мин.) площади вдали от активатора, занимаемой фибриновыми сгустками в гиперкоагуляционной плазме, с добавлением MutB (20 мкМ), КТИ (15 мкМ) и без добавления ингибитора контактной активации (% от площади кюветы) (4 повтора для каждого образца).
Фиг.6 A-D иллюстрируют влияние ингибиторов контактной активации MutB (20 мкМ) и КТИ (15 мкМ) на рост фибринового сгустка от активатора в нормальной замороженной и гипокоагуляционной плазме.
На Фиг.7 представлены данные о времени свертывания (сек.) цельной крови, которая была взята у 3 здоровых доноров в пробирку, содержавшую MutB (10 мкМ), КТИ (5 мкМ) или не содержавшую ингибитор контактной активации (2 - 4 повтора для каждого донора).
Подробное описание изобретения
Описание нового высокоселективного ингибитора контактной активации
Заявляемый полипептид, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, представляет собой высокоселективный ингибитор контактной активации. Аминокислотная последовательность MutB представлена в перечне последовательностей под номером SEQ ID ΝΟ: 1. Механизм ингибирования фХПа предполагается конкурентным, он состоит в том, что MutB взаимодействует с активным центром фХПа посредством ингибирующей петли, в которую входит участок ингибитора Thr9 - Ala 14, аминокислотная последовательность которого приведена в Таблице 1. Также в Таблице 1 приведены соответствующие последовательности нативного инфестина 4 (Inf4) и известного мутанта инфестина 4 (Mutl5). Внутри указанного участка ингибирующей петли находится реактивный сайт ArglO - Asnl l , который расщепляется в активном центре фХПа. В Таблице 1 аминокислотные остатки, входящие в состав этого участка, пронумерованы в соответствии с их положением относительно реактивного сайта. MutB был создан путем введения следующих аминокислотных замен в участке ингибирующей петли нативного инфестина 4: Thr9Phe, Phel2Tyr и А1а14Рго.
Таблица 1.
Figure imgf000017_0001
Селективность нового ингибитора по отношению к фХПа
Для оценки селективности ингибирования фХПа полипептидом, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, была определена его ингибирующая активность в буферном растворе по отношению к очищенным факторам свертывания. Для сравнения с полипептидом были взяты известные ингибиторы фХПа: КТИ, инфестин 4, мутант на основе инфестина 4 Mutl5, LCTI-III. В Таблице 2 приведены средние значения констант ингибирования (Kj) указанными белками некоторых очищенных протеаз свертывания (фХИа, фХ1а, фХа и аРС). Стандартное отклонение составило около 50% от среднего значения; для каждого значения проведено 2-3 повтора.
Таблица 2.
Figure imgf000018_0001
где «Ν.Ι.» ( - от «not inhibit))) - не ингибирует активность фермента.
Из данных Таблицы 2 следует, что КТИ, нативный инфестин 4 и его мутанты одинаково эффективно ингибируют активность протеазы фХПа в буферном растворе. Было установлено, что в высоких концентрациях, порядка десятков микромоль на литр, КТИ обладает ингибирующей активностью к фХ1а и аРС, т.е. не является высокоселективным ингибитором фХПа. Нативный инфестин 4 и его мутанты MutB и Mutl5 не ингибируют фХ1а. Также, мутанты инфестина 4 MutB и Mutl 5 не ингибируют фХа, в отличие от нативного инфестина 4. Однако Mutl 5, как и КТИ, обладает ингибирующей активностью по отношению к аРС, т.е. тоже не является высокоселективным. Из приведенной выше Таблицы 2 видно, что, из всех указанных ингибиторов фХПа, MutB обладает наибольшей селективностью ингибирования фХПа, поскольку не обладает ингибирующей активностью к другим указанным факторам. Оценка ингибирующей активности нового ингибитора по подавлению контактной активации в плазме крови
Оценка активности полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, по ингибированию контактной активации свертывания, рассматривается далее со ссылкой на фиг.1. В три отдельных образца свободной от тромбоцитов плазмы (PFP) здорового донора добавлялись, соответственно, нативный инфестин 4, мутанты MutB и Mutl5, и измерялось время свертывания при активации по контактному пути посредством теста АЧТВ. По результатам тестов были построены графики зависимостей АЧТВ (сек) от концентрации добавленного ингибитора (мкМ), из которых следует, что АЧТВ увеличилось до 120 секунд при добавлении в образец 10 мкМ MutB, 10 мкМ нативного инфестина 4 или 20 мкМ Mutl5, при этом без добавления ингибитора контактной активации АЧТВ составило 45 сек. Таким образом, было установлено, что MutB обладает примерно в 2 раза большей активностью в плазме крови, чем Mutl5.
Применение нового ингибитора для подавления контактной активации при проведении исследования ТФ-инициированного свертывания
Возможность применения указанного полипептида в качестве ингибитора контактного пути была показана при проведении теста свертывания плазмы крови посредством лабораторной диагностической системой «Регистратор тромбодинамики Т-2». При этом тест включал следующие шаги: оттаивание замороженного образца PFP, добавление в него ингибитора контактной активации и инкубацию полученной смеси, рекальцификация образца и размещение его в канале измерительной кюветы, приведение его в контакт с ТФ, иммобилизованном на торце специальной вставки-активатора, и регистрация возникновения и роста фибриновых сгустков в режиме последовательной фотосъемки. Замороженный образец PFP был получен предварительно путем забора крови в пробирки с цитратом натрия у нескольких (по меньшей мере, пяти) здоровых доноров, последующих двух стадий центрифугирования и заморозки полученной плазмы при -80°С. При проведении теста происходил рост фибринового сгустка от вставки-активатора, а также было возможно появление дополнительных сгустков в области кюветы вдали от активатора, как показано на фиг.2. Сгустки в области кюветы вдали от активатора могут быть следствием гиперкоагуляционного состояния образца либо артефактами контактной активации образца со стенками кюветы (артефактные сгустки), которые необходимо подавить, чтобы указанный тест позволял различать нормальное и гиперкоагуляционное состояние системы свертывания. Для этого, перед активацией образца путем приведением его в контакт с ТФ, в образец добавляли эффективное количество ингибитора контактной активации, в нашем случае это полипептид, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB. Для сравнения эффективности действия заявляемого полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, с известным из уровня техники ингибитором контактной активации КТИ, в два отдельных образца нормальной замороженной PFP добавлялись указанные ингибиторы. Использовались такие концентрации данных ингибиторов, при которых АЧТВ увеличивается примерно в 4 раза: 20 мкМ в случае MutB и 15 мкМ в случае КТИ. В качестве отрицательного контроля, в третий образец плазмы не добавляли никакого ингибитора контактной активации. Для каждого образца проводили 4 повторные исследования. Через 30 минут после начала исследования были получены изображения фибринового сгустка в измерительных кюветах, по 4 кюветы для каждого образца, показанные на фиг. 3. На фиг.З видно, что добавление или полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, или КТИ, приводит практически к полному подавлению контактной активации и предотвращает возникновение артефактных сгустков.
По 4 повторным экспериментам для каждого ингибитора были определены площади кюветы, занятые артефактными сгустками (в % от общей площади кюветы), для трех образцов нормальной замороженной плазмы в отдельные моменты времени и были построены графики зависимости указанной площади от времени (фиг. 4, усредненные значения в каждый момент времени). Без добавления ингибитора контактной активации артефактные сгустки в области кюветы вдали от активатора появляются примерно через 15 минут после активации и полностью занимают всю площадь кюветы через 30 минут. Однако при добавлении КТИ или MutB такие сгустки занимают не более 15% площади кюветы через 30 минут после активации.
Для того чтобы оценить влияние ингибиторов контактной активации на появление сгустков вдали от активатора, вызванных гиперкоагуляцией, а не контактной активацией образца со стенками кюветы, в два отдельных образца гиперкоагуляционной PFP добавлялись MutB (20 мкМ) и КТИ (15 мкМ). Гиперкоагуляционная PFP была приготовлена из нормальной замороженной PFP путем добавления 100 пМ фХ1а. В качестве отрицательного контроля, в третий образец плазмы не добавляли никакого ингибитора контактной активации. На фиг.5 показаны усредненные по 4 повторным экспериментам, временные зависимости площади кюветы, занятой сгустками вдали от активатора (в % от общей площади кюветы), для трех образцов плазмы. На фиг.5 видно, что в образцах гиперкоагуляционной плазмы без добавления ингибитора контактной активации и с добавлением MutB сгустки вдали от активатора возникают примерно через 5-8 минут после активации, в то время как в образце с КТИ они возникают через 10-15 минут. Таким образом, авторами было установлено, что добавление MutB или КТИ приводит практически к полному подавлению контактной активации и предотвращает возникновение артефактных сгустков в нормальной плазме. Однако в гиперкоагуляционной плазме добавление MutB не влияет на появление сгустков вдали от активатора, которые возникают независимо от фХПа, в то время как добавление КТИ задерживает появление сгустков вдали от активатора, предположительно, вследствие ингибирования фХ1а, и может уменьшить чувствительность диагностической системы к гиперкоагуляции.
Следовательно, полипептид, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, возможно применять для эффективного блокирования контактной активации и свертывания крови или ее продукта по контактному пути.
Влияние ингибиторов контактной активации на динамику образования фибринового сгустка, инициированного ТФ
Влияние ингибиторов контактной активации на динамику свертывания может быть показано на примере роста фибринового сгустка от поверхности с иммобилизованным ТФ. Динамика роста фибринового сгустка от активатора может быть охарактеризована следующими параметрами: время задержки образования сгустка после контакта плазмы с тканевым фактором - лаг-тайм (Tlag, мин); средняя скорость роста сгустка в диапазоне 2-6 минут после начала свертывания - начальная скорость (Vin, мкм/мин); и средняя скорость роста сгустка в диапазоне 15- 25 минут после начала свертывания - стационарная скорость (Vst, мкм/мин) (Balandina et al. 201 1 , Biophys. J. 101 : 1816-1824; Dashkevich et al. 2012, Biophys. J. 103:2233-2240). По указанным параметрам можно определить состояние свертывания крови у субъектов, у которых был взят тестируемый образец («Практическая коагулология» Пантелеев М.А., Васильев C.A., Синауридзе Е.И. с соавт.-Под ред. А.И. Воробьева. М. Изд. «Практическая медицина», 201 1 , 192 стр., ISBN: 978-5-9881 1-165-8). Так при гипокоагуляционных состояниях различной природы (дефициты факторов VII, V, X, тромбина, гемофилии А, В и С, при терапии антикоагулянтами, такими как нефракционированный и низкомолекулярный гепарин, антагонисты витамина К, антитромбин III) лаг-тайм увеличен, а начальная и/или стационарная скорости роста сгустка уменьшены относительно значений нормы для здоровых доноров (Parunov et al. 2011, J. Thromb. Haemost. 9: 1825-1834). При гиперкоагуляционных состояниях различной природы возникают сгустки в области кюветы вдали от активатора, а также увеличены начальная и/или стационарная скорости относительно значений нормы. При использовании ингибитора контактной активации предпочтительным является такой ингибитор, который не оказывает влияния на возникновение сгустков вдали от активатора в образце гиперкоагуляционной плазмы и не влияет на динамику роста фибринового сгустка от активатора в любом образце плазмы.
Для сравнения влияния ингибиторов контактной активации MutB и КТИ на чувствительность к гипокоагуляции параметров роста фибринового сгустка от активатора, в два образца нормальной замороженной PFP и в два образца гипокоагуляционной PFP добавлялись MutB (20 мкМ) и КТИ (15 мкМ). Гипокоагуляционная PFP была приготовлена из нормальной замороженной PFP путем добавления 0,1 МЕ/мл нефракционированного гепарина. На фиг.6 А показаны усредненные по 4 повторным экспериментам, зависимости от времени (мин.) размера фибринового сгустка вдоль направления его роста (мкм), для образцов гипокоагуляционной и нормальной плазмы с добавленными ингибиторами MutB и КТИ. Также на столбчатых диаграммах показаны средние значения +/- стандартное отклонение (S.D.) по 4 повторным экспериментам для параметров роста сгустка: лаг-тайм (фиг.бВ), начальная скорость (фиг.бС) и стационарная скорость (фиг.бО). Для статистического сравнения был использован критерий Стьюдента. Статистическая значимость отличий параметров роста сгустка в гипокоагуляционной и нормальной плазме обозначена «р<0.001». Незначимые отличия обозначены «р>0.5».
На фиг.бА видно, что в образцах гипокоагуляционной и нормальной плазмы динамика роста фибринового сгустка сильно отличается друг от друга, при этом добавление MutB или КТИ не влияет на это различие. Параметр лаг-тайм (Tlag) не изменяется при добавлении в плазму гепарина (фиг.бВ), однако при этом скорости роста сгустка уменьшаются примерно в два раза (фиг.6 C,D).
Применение нового ингибитора в качестве антикоагулянта для забора и хранения цельной крови
Возможность применения полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, в качестве антикоагулянта при заборе и хранении образца цельной крови была показана путем измерения времени спонтанного свертывания крови в пробирке, содержавшей MutB (10 мкМ), КТИ (5 мкМ) или не содержавшей ингибитор контактной активации. Были использованы такие концентрации ингибиторов контактной активации, которые приводят к увеличению АЧТВ в нормальной плазме в 2,5 раза. Забор цельной крови производился у 3 здоровых доноров без добавления антикоагулянта, например, цитрата, кроме указанных ингибиторов контактной активации. Кровь, смешанная с указанными ингибиторами, перемешивалась при помощи ротатора при температуре +22°С, и измерялось время образования сгустков в крови.
На фиг.7 результаты измерения показаны значками, соответствующими каждому измерению; линией или прямоугольником показаны области положения медиан полученных значений времен свертывания. На фиг.7 видно, что применение ингибитора контактной активации MutB или КТИ при заборе крови без хелатора ионов кальция позволяет увеличить время хранения цельной крови в пробирке примерно в 2-3 раза.
Таким образом, было показано преимущество применения полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, нового высокоселективного ингибитора контактной активации, для предотвращения свертывания по контактному пути в образце плазмы и для увеличения чувствительности диагностической системы к отклонениям системы гемостаза от нормального состояния.
Аспекты настоящего изобретения описаны в следующих примерах, которые
представлены только, чтобы проиллюстрировать настоящее изобретение и помочь обычному специалисту в данной области в его осуществлении и использовании. Примеры никаким образом не предназначены, чтобы в других случаях ограничивать объем изобретения.
Примеры
Здесь и далее настоящее изобретение иллюстрируют, но не ограничивают, посредством следующих примеров. Однако, материалы, способы и т.п., описанные в настоящем описании, только иллюстрируют аспекты изобретения и никаким образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. В силу этого, материалы, методы и т.п., подобные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать для практического осуществления или тестирования настоящего изобретения.
Пример 1. Селективность MutB по отношению к фХПа в буферном растворе.
Для определения ингибирующей активности белков MutB, КТИ, Inf4, Mutl5 и LCTI-III по отношению к различным протеазам свертывания в буфере использовался хромогенный тест: смесь протеазы и ингибитора в лунках планшета инкубировалась в течение 15 минут при температуре +37°С, далее в смесь добавлялся раствор хромогенного субстрата указанной протеазы, и активность протеазы измерялась по скорости образования хромогенного продукта при +37°С. В Таблице 3 приведены названия и концентрации хромогенных субстратов и соответствующих протеаз.
Таблица 3.
Хромогенные субстраты включали р-нитроанилидную группу, которая отщеплялась соответствующими протеазами. После отщепления р- нитроанилидной группы от молекулы субстрата у группы меняется спектр поглощения, и изменение концентрации такого продукта во времени можно детектировать на длине волны света 405 нм при помощи планшетного спектрофотометра. Для построения зависимости активности протеазы от концентрации ингибитора, в несколько образцов с одинаковой концентрацией протеазы добавляли разные концентрации ингибитора. Далее определяли величину концентрации ингибитора, снижающую активность протеазы на 50% (1С5о). Константа ингибирования Kj вычислялась по уравнению Ченга-Прусоффа (Kj = IC5o/(l+S/KM)), в котором S - начальная концентрация субстрата, Км - константа Михаэлиса-Ментен субстрата по отношению к протеазе. Результаты вычисления Kj приведены в Таблице 2.
Нативный инфестин 4 и его мутанты MutB и Mutl 5 были в виде слитых белков с тиоредоксином I E.coli, содержащих полигистидиновые кластеры. При этом тиоредоксин I E.coli и полигистидиновые кластеры являются вспомогательными участками полипептида, не влияющими на активность, которые хорошо известны из уровня техники и используются для увеличения уровня экспрессии целевых белков в растворимой форме и их очистки, соответственно. КТИ представлял собой белок, выделенный из зерен кукурузы и очищенный хроматографически. LCTI-III был получен путем химического синтеза. Реакция расщепления субстрата проводилась в буфере 50 мМ Tris-HCl, 130 мМ NaCl, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, рН 8,3.
Пример 2. Оценка ингибирующей активности MutB по подавлению контактной активации в плазме крови.
Плазму крови здоровых доноров готовили в соответствии со стандартными правилами забора крови для коагулологических тестов (Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline Fifth Edition by Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) H21-A5 Vol.28 No.5). Для блокирования ионов в кровь добавили 0,38% цитрата натрия.
Проведение теста АЧТВ осуществлялось с использованием реагентов Коагуло-тест (НПО «Ренам», Москва, Россия) и различных концентраций ингибиторов контактной активации: нативный инфестин 4, MutB и Mutl5. Для этого 50 мкл плазмы крови здорового человека смешивали с 5,6 мкл десятикратного раствора ингибитора в разных концентрациях и инкубировали 15 минут при +37°С. Далее, в соответствии с руководством Коагуло-тест, 25 мкл смеси перемещали в кювету коагулометра Не1епа-С2 и добавляли 25 мкл каолин-кефалиновой смеси, активирующей фХП в плазме крови. После инкубации при +37°С в течение 3 минут добавляли 25 мкл раствора хлорида кальция в начальной концентрации 25 мМ, и фотометрически определяли время образования фибринового сгустка в кювете коагулометра.
Зависимости АЧТВ от концентрации нативного инфестина 4, MutB и Mutl5, полученных как в Примере 1 , представлены на фиг.1. Было установлено, что мутант инфестина 4 MutB обладает повышенной активностью в плазме крови, по сравнению с Mutl 5 и нативным инфестином 4.
Пример 3. Влияние MutB на появление артефактных сгустков вследствие контактной активации и динамику роста фибринового сгустка, инициированного ТФ.
Влияние полипептида, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB, на рост фибриновых сгустков в образцах гипокоагуляционной, нормальной и гиперкоагуляционной плазмы крови, исследовалось при помощи лабораторной диагностической системы «Регистратор тромбодинамики Т-2» и «Диагностического набора для исследования тромбодинамики в плазме крови» (ООО «Гемакор», Москва, Россия) в соответствии с руководством к «Диагностическому набору для исследования тромбодинамики в плазме крови» (ООО «Гемакор», Москва, Россия). Здесь указанный полипептид был предварительно протеолитически отщеплен и хроматографически очищен от тиоредоксина (Тгх). За 15 минут до проведения исследования измерительная кювета, вставка- активатор с иммобилизованным ТФ и реагенты, выдерживались при +37°С. Стандартная температура проведения исследования +37°С. За 15 минут до проведения исследования 120 мкл плазмы смешивались с исследуемыми веществами, MutB или КТИ для сравнения, и помещались в микропробирку. Производилось перемешивание плазмы с веществами, и после этого пробирка с плазмой помещалась на 15 минут в термостат при +37°С. Непосредственно перед проведением исследования проводилось рекальцифицирование плазмы: отбиралось 120 мкл смеси плазмы с исследуемыми веществами, добавлялось в микропробирку с Реагентом II (лиофильно высушенным раствором кальция ацетата с добавкой) и перемешивалось до полного растворения Реагента П. Далее 120 мкл смеси из микропробирки с Реагентом II немедленно переносилось в измерительную кювету. Далее вставка-активатор аккуратно опускалась в кювету так, чтобы поверхность с иммобилизованным тканевым фактором приходила в контакт с плазмой. Непосредственно после приведения в контакт активатора свертывания с плазмой крови запускалась фотосъемка процесса роста фибринового сгустка в плазме, помещенной в кювету. Вставка-активатор представляла собой пластину, на нижней торцевой поверхности которой иммобилизован активатор свертывания тканевой фактор (Фадеева и др. 2010, Биохимия 75:827-838). Расчет результатов исследования выполнялся автоматически программным обеспечением (руководство пользователя «Программное обеспечение системы диагностической лабораторной «Регистратор тромбодинамики Т-2», ООО «Гемакор», Москва, Россия).
Пример 4. Увеличение времени хранения цельной крови при заборе без хелатора кальция с использованием MutB.
Забор крови производился из срединной вены локтя левой руки в стерильный шприц Master UN РЕ объемом 10мл, с иглой 21G х 1 V2"; 0,8x40 мм (ФармЛайн, США). В кровь не добавляли хелатор кальция или другой антикоагулянт, кроме ингибиторов контактной активации MutB или КТИ. Здесь MutB также не содержал тиоредоксин. Взятую кровь переливали в пробирку объемом 15 мл, перемешивали переворачиванием 2 раза и помещали по 0,7 мл крови в полипропиленовые микроцентрифужные пробирки MaxyClear Snaplock (Axygen, США) объемом 1,5 мл, непосредственно после чего начинали отсчет времени при помощи секундомера. В указанные пробирки было предварительно добавлено по 78 мкл раствора MutB с концентрацией 100 мкМ, раствора КТИ с концентрацией 50 мкМ или раствора буфера 30 мМ Hepes рН=7,4. Пробирки, содержащие смесь цельной крови и указанных растворов, фиксировались в ротаторе и перемешивались переворачиванием со скоростью вращения 10 об/мин. Фиксировалось время появления сгустков или фибриновых нитей в цельной крови при перемешивании.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта, который характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB (SEQ ID NO: 1) и по существу соответствует ей, где указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида, являющийся высокоселективным ингибитором фХПа, селективность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mutl5, или активность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mutl 5.
2. Полипептид по п.1, где модификации аминокислотной последовательности вне участка ингибирующей петли представляют собой изменения N- или С-концов последовательности SEQ ID ΝΟ: 1, делеции или вставки одного или нескольких аминокислотных остатков, а также консервативные аминокислотные замены.
3. Применение полипептида по п.1 для исследования свертывания в тестируемом образце крови или ее продукта, которое включает a) получение образца для исследования свертывания, b) подавление контактной активации свертывания в образце посредством приведения образца в контакт с указанным полипептидом и инкубация полученной смеси, c) приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом, подготовленным на стадии Ь); и d) измерение параметров свертывания в образце.
4. Применение по п.З, где получение тестируемого образца крови или ее продукта включает забор крови в пробирку, содержащую антикоагулянт, выбранный из группы: цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина или ингибитор фХа, и последующее блокирование антикоагулянта, в частности, рекальцификация образца.
5. Применение по п. 4, где получение образца крови или ее продукта дополнительно включает очистку крови от нежелательных клеток и клеточных компонентов, в частности, путем фильтрации или центрифугирования.
6. Применение по п. 3, где образец крови или ее продукта является свежеполученным, находится в лиофилизованной или замороженной форме, которую переводят в жидкую форму перед проведением исследования.
7. Применение по п.6, где образец крови или ее продукта представляет собой цельную кровь или ее продукты, такие как богатая тромбоцитами плазма, бедная тромбоцитами плазма, освобожденная от тромбоцитов плазма, фракционированная плазма.
8. Применение по п.З, где образец крови или ее продукта получен от здорового субъекта или от субъекта, который страдает нарушением свертывания крови, в частности, от субъекта с геморрагиями или тромбозами.
9. Применение по п.З, где образец крови или ее продукта получен от пациента при хирургических вмешательствах или при осуществлении терапии.
10. Применение по п.З, где образец крови или ее продукта содержит природные или рекомбинантные белки или другие препараты, которые обладают гемостатической или фибринолитической активностью.
1 1. Применение по п.З, где указанный полипептид находится в высушенной форме, или лиофилизованной форме, или адсорбирован на поверхности, с которой контактирует образец крови или ее продукта, или предварительно растворен в растворе, содержащем соль, буферное вещество, экципиент или стабилизатор.
12. Применение по п.З, где смесь, полученная на стадии Ь), инкубируется при температуре от +20°С до +40°С, предпочтительно, при +37°С, в течение времени, по меньшей мере, 3 минуты.
13. Применение по п.З, где указанный полипептид берут в количестве, достаточном для эффективного блокирования контактной активации.
14. Применение по п.13, где достаточным является количество указанного полипептида, при котором АЧТВ нормальной плазмы увеличено более чем в 2 раза, преимущественно более чем в 3 раза, по сравнению с АЧТВ плазмы без полипептида.
15. Применение по п.14, где достаточным является количество указанного полипептида, при котором отсутствуют артефактные сгустки вдали от активатора свертывания в образце нормальной замороженной плазмы, в течение более чем 15 минут, преимущественно более чем 30 минут, после активации.
16. Применение по п.З, где приведение в контакт активатора свертывания крови с образцом крови или ее продукта на этапе с) осуществляют путем добавления в указанный образец и последующего перемешивания активатора свертывания в растворенной форме.
17. Применение по п.З, где активатор свертывания в растворенной форме наслаивают на образец крови или ее продукта без перемешивания, или образец приводят в контакт с активатором, который иммобилизован на поверхности.
18. Применение по п.З, где активатор свертывания является тканевым фактором или одной из протеаз свертывания: Vila, Ха, Иа, IXa, Х1а, ХПа.
19. Применение по п.З, где параметрами свертывания являются: время задержки начала свертывания, время свертывания, время задержки наработки тромбина, время достижения максимума тромбина, максимальная концентрация тромбина, угол наклона тромбоэластограммы, скорость роста сгустка, размер сгустка в фиксированный момент времени, наличие сгустков вдали от активатора свертывания, скорость лизиса сгустка.
20. Применение полипептида по п.1 в качестве антикоагулянта, блокирующего контактную активацию, путем приведения в контакт с указанным полипептидом образца крови или ее продукта, для забора и увеличения времени хранения образца.
21. Применение по п.20, где указанный полипептид находится в высушенной форме, или лиофилизованной форме, или адсорбирован на поверхности, с которой контактирует образец, или предварительно растворен в растворе, содержащем соль, буферное вещество, экципиент или стабилизатор.
22. Применение по п.20, где забор крови осуществляется в пробирку, содержащую антикоагулянт, выбранный из группы: цитрат натрия, ЭДТА, ингибитор тромбина или ингибитор фХа.
23. Применение по п.20, где хранение образца крови или ее продукта производится в замороженном виде при отрицательных температурах ниже 0°С, преимущественно ниже -50°С, или в жидком виде при положительной температуре более 0°С, преимущественно от +20°С до +40°С.
24. Применение по п.20, где время хранения составляет более 10 минут, преимущественно, от одного дня и более, преимущественно, более одной недели.
25. Применение по п.20, где образец крови или ее продукта получен от субъекта, не имеющего нарушений свертывания крови, или от субъекта, который страдает нарушением свертывания крови, в частности, от субъекта с геморрагиями или тромбозами, или от субъекта при хирургических вмешательствах или при осуществлении терапии.
PCT/RU2014/000889 2013-11-28 2014-11-25 Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4 Ceased WO2015080629A1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14865083.1A EP3075742B1 (en) 2013-11-28 2014-11-25 High-selectivity contact activation inhibitor based on infestin-4
US15/038,819 US10006080B2 (en) 2013-11-28 2014-11-25 High-selectivity contact activation inhibitor based on infestin-4

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013152864/10A RU2556116C2 (ru) 2013-11-28 2013-11-28 Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4
RU2013152864 2013-11-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015080629A1 true WO2015080629A1 (ru) 2015-06-04

Family

ID=53199446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2014/000889 Ceased WO2015080629A1 (ru) 2013-11-28 2014-11-25 Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10006080B2 (ru)
EP (1) EP3075742B1 (ru)
RU (1) RU2556116C2 (ru)
WO (1) WO2015080629A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019066685A1 (ru) * 2017-09-26 2019-04-04 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Национальный Медицинский Исследовательский Центр Профилактической Медицины" Министерства Здравоохранения Российской Федерации Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6883899B1 (ja) * 2020-12-07 2021-06-09 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 血液凝固検査試薬、および血液凝固検査方法
JP7152084B1 (ja) * 2022-02-22 2022-10-12 株式会社血栓トランスレーショナルリサーチラボ 組織因子経路インヒビターの抗凝固活性の検査試薬、検査試薬セット、および検査方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6403381B1 (en) 1998-06-08 2002-06-11 University Of Vermont And State Agriculture College Inhibition of coagulation in blood and blood products
BRPI0602496A (pt) 2006-07-03 2008-02-26 Fundacao De Amparo A Pesquisa uso de inibidores de proteases isolados do triatoma infestans
US20100261211A1 (en) 2007-11-02 2010-10-14 MEDPLAST S.A. c/o FIDUCIAIRE FIDAG S.A., succursale de Sion Method and apparatus for monitoring spatial fibrin clot formation
US20100279923A1 (en) * 2007-02-12 2010-11-04 Stefan Schulte Therapeutic application of kazal-type serine protease inhibitors
RU123166U1 (ru) 2012-08-16 2012-12-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация" Устройство мониторинга постранственного свертывания крови и ее компонентов
RU2011149982A (ru) * 2011-12-08 2013-11-20 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН (ЦТП ФХФ РАН) ПРОДУЦЕНТ СЛИТНОГО БЕЛКА ТИОРЕДОКСИНА И ДОМЕНА 4 ИНФЕСТИНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-Inf4, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТНЫЙ БЕЛОК

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0607515D0 (en) * 2006-04-13 2006-05-24 Axis Shield Diagnostics Ltd Anti-factor xlla therapy

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6403381B1 (en) 1998-06-08 2002-06-11 University Of Vermont And State Agriculture College Inhibition of coagulation in blood and blood products
BRPI0602496A (pt) 2006-07-03 2008-02-26 Fundacao De Amparo A Pesquisa uso de inibidores de proteases isolados do triatoma infestans
US20100279923A1 (en) * 2007-02-12 2010-11-04 Stefan Schulte Therapeutic application of kazal-type serine protease inhibitors
US8283319B2 (en) 2007-02-12 2012-10-09 Csl Behring Gmbh Therapeutic application of Kazal-type serine protease inhibitors
US20100261211A1 (en) 2007-11-02 2010-10-14 MEDPLAST S.A. c/o FIDUCIAIRE FIDAG S.A., succursale de Sion Method and apparatus for monitoring spatial fibrin clot formation
RU2011149982A (ru) * 2011-12-08 2013-11-20 Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН (ЦТП ФХФ РАН) ПРОДУЦЕНТ СЛИТНОГО БЕЛКА ТИОРЕДОКСИНА И ДОМЕНА 4 ИНФЕСТИНА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ЭКСПРЕССИОННАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-Inf4, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТНЫЙ БЕЛОК
RU123166U1 (ru) 2012-08-16 2012-12-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация" Устройство мониторинга постранственного свертывания крови и ее компонентов

Non-Patent Citations (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BALANDINA ET AL., BIOPHYS. J., vol. 101, 2011, pages 1816 - 1824
CAMPOS ET AL., FEBS LETT., vol. 577, 2004, pages 512 - 516
CAMPOS I.T. ET AL.: "The Kazal-type inhibitors infestins 1 and 4 differ in specificity but are similar in three-dimensional structure", ACTA CRYSTALLOGR. D BIOL. CRYSTALLOGR., vol. 68, 2012, pages 695 - 702, XP055346015 *
CAMPOS, SOUZA ET AL., ACTA CRYST., vol. D68, 2012, pages 695 - 702
CLINICAL AND LABORATORY STANDARDS INSTITUTE: "Collection, Transport, and Processing of Blood Specimens for Testing Plasma-Based Coagulation Assays and Molecular Hemostasis Assays; Approved Guideline Fifth Edition", (CLSI) H21-A5, vol. 28, no. 5
DASHKEVICH ET AL., BIOPHYS. J., vol. 103, 2012, pages 2233 - 2240
DAVIS ET AL., MOL. IMMUNOL., vol. 45, 2008, pages 4057 - 4063
FADEEVA ET AL., BIOCHEMISTRY (MOSCOW, vol. 75, 2010, pages 827 - 838
FISCHER, HEMODIAL. INT., vol. 11, 2007, pages 178 - 189
FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA ET AL., BRPI 0602496 A, 26 February 2008 (2008-02-26) *
GOUZY ET AL., BIOINTERPHASES, vol. 1, 2006, pages 146 - 155
HAGEDORN; SCHMIDBAUER ET AL., CIRCULATION, vol. 121, 2010, pages 1510 - 1517
HOFFMAN; MONROE, THROMB. HAEMOST., vol. 85, 2001, pages 958 - 965
HOJIMA ET AL., THROMB. RES., vol. 20, 1980, pages 149 - 162
HSU, PERFUSION, vol. 16, 2001, pages 417 - 428
ICHINOSE ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 261, 1986, pages 3486 - 3489
KRISHNAMOORTHI ET AL., FEBS LETT., vol. 273, 1990, pages 163 - 167
LING ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 268, 1993, pages 810 - 814
LUDDINGTON; BAGLIN, J. THROMB. HAEMOST., vol. 2, 2004, pages 1954 - 1959
MA PANTELEEV, ET AL.,: "Practical coagulology", 2011, PRACTICAL MEDICINE, ISBN: 978-5-98811-1
MANN E, BLOOD, vol. 76, 1990, pages 1 - 16
MANN ET AL., J. THROMB. HAEMOST., vol. 5, 2007, pages 2055 - 2061
NIELSEN, BLOOD COAGUL. FIBRINOLYSIS, vol. 20, 2009, pages 191 - 196
NOSSEL E, J. CLIN. INVEST., vol. 47, 1968, pages 1172 - 1180
OLLER ET AL., J. SURG. RES., vol. 20, 1976, pages 333 - 340
PARUNOV ET AL., J. THROMB. HAEMOST., vol. 9, 2011, pages 1825 - 1834
SCHMAIER, J. CLIN. INVEST., vol. 118, 2008, pages 3006 - 3009
SMITH ET AL., BLOOD COAGUL. FIBRINOLYSIS, vol. 21, 2010, pages 692 - 702
SPERLING ET AL., BIOMATERIALS, vol. 30, 2009, pages 4447 - 4456
STRELLER ET AL., J. BIOMED. MATER. RES. B APPL. BIOMATER., vol. 66, 2003, pages 379 - 390
SUONTAKA ET AL., VOX. SANG., vol. 88, 2005, pages 172 - 180
ULMER ET AL., FEBS LETT., vol. 365, 1995, pages 159 - 163
WOODRUFF ET AL., J. THROMB. HAEMOST., vol. 11, 2013, pages 1364 - 1373
WYNN; LASKOWSKI, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN., vol. 166, 1990, pages 1406 - 1410

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019066685A1 (ru) * 2017-09-26 2019-04-04 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Национальный Медицинский Исследовательский Центр Профилактической Медицины" Министерства Здравоохранения Российской Федерации Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк)
EA037879B1 (ru) * 2017-09-26 2021-05-31 Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение "Национальный Медицинский Исследовательский Центр Профилактической Медицины" Министерства Здравоохранения Российской Федерации Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк)

Also Published As

Publication number Publication date
EP3075742B1 (en) 2019-04-17
RU2013152864A (ru) 2015-06-10
US20160376634A1 (en) 2016-12-29
US10006080B2 (en) 2018-06-26
EP3075742A4 (en) 2017-04-26
EP3075742A1 (en) 2016-10-05
RU2556116C2 (ru) 2015-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schmaier et al. Factor XII–What's important but not commonly thought about
Smith et al. How it all starts: Initiation of the clotting cascade
Mammen Coagulation abnormalities in liver disease
Papadopoulos et al. Haemostasis impairment in patients with obstructive jaundice
Wallisch et al. Antibody inhibition of contact factor XII reduces platelet deposition in a model of extracorporeal membrane oxygenator perfusion in nonhuman primates
JP6877340B2 (ja) 血栓溶解剤の存在下における粘弾性解析を用いた新規病態の確認
CN107870246B (zh) 血清制备
Schols et al. Impaired thrombin generation and fibrin clot formation in patients with dilutional coagulopathy during major surgery
Mannucci et al. Patients with localized and disseminated tumors have reduced but measurable levels of ADAMTS-13 (von Willebrand factor cleaving protease)
Kumada et al. Comparative study on heparin and a synthetic thrombin inhibitor No. 805 (MD-805) in experimental antithrombin III-deficient animals
De Maat et al. Tracking down contact activation–from coagulation in vitro to inflammation in vivo
Warr et al. Human plasma extrinsic pathway inhibitor activity: II. Plasma levels in disseminated intravascular coagulation and hepatocellular disease
JP2002519703A (ja) Ｐｔ、及び、ａｐｔｔ分析のための血液凝固コントロール
Shamanaev et al. Factor XII structure–function relationships
Flight et al. Comparison of textilinin-1 with aprotinin as serine protease inhibitors and as antifibrinolytic agents
Danese et al. Factor XII in hemostasis and thrombosis: active player or (innocent) bystander?
Aasen et al. Plasma kallikrein-kinin system in septicemia
RU2556116C2 (ru) Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4
Felfernig et al. Effects of temperature on partial thromboplastin time in heparinized plasma in vitro
JP7478149B2 (ja) 治療用第ｘｉｉ因子抗体
Lucking et al. Effect of the small molecule plasminogen activator inhibitor‐1 (PAI‐1) inhibitor, PAI‐749, in clinical models of fibrinolysis
JP2017508806A (ja) 出血性疾患の治療における止血を改善するためのヒトプロトロンビン及び活性化第ｘ因子の組成物
Matrane et al. Congenital Alpha-2 Antiplasmin Deficiency: a Literature Survey and Analysis of 123 Cases.
CA2757585A1 (en) Enhanced cleavage of von willebrand factor by adamts13
Marchi et al. Dysregulated coagulation associated with hypofibrinogenaemia and plasma hypercoagulability: implications for identifying coagulopathic mechanisms in humans

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14865083

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15038819

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014865083

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014865083

Country of ref document: EP