WO2015135757A1 - Pet-esterasen und deren verwendung - Google Patents

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WO2015135757A1
WO2015135757A1 PCT/EP2015/053991 EP2015053991W WO2015135757A1 WO 2015135757 A1 WO2015135757 A1 WO 2015135757A1 EP 2015053991 W EP2015053991 W EP 2015053991W WO 2015135757 A1 WO2015135757 A1 WO 2015135757A1
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WO
WIPO (PCT)
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positions
seq
amino acid
esterase
indicated
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/EP2015/053991
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English (en)
French (fr)
Inventor
Thomas Weber
Hendrik Hellmuth
Timothy O'connell
Wolfgang Zimmermann
Ren WEI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henkel AG and Co KGaA
Original Assignee
Henkel AG and Co KGaA
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Publication date
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
    • Y02W30/00—Technologies for solid waste management
    • Y02W30/50—Reuse, recycling or recovery technologies
    • Y02W30/62—Plastics recycling; Rubber recycling

Definitions

  • the invention is in the field of enzyme technology.
  • the invention relates to esterases and in particular their use for the hydrolysis of polyesters and in processes for the treatment and care of linen and textiles, in particular the improvement of comfort and protection against or to reduce or prevent the pilling of polyester-containing textiles and methods for increasing the Hydrophilicity of polyester fibers and degradation of polyester fibers from laundry fibers.
  • the invention also relates to esterases as such, their preparation and compositions containing them.
  • Pilling is the extraction of fine fibrillates from woven or knitted fabrics, which roll up into pills ("pills") and are then connected to the surface of the woven or knitted fabric only by a few individual fibers. With synthetic fibers, the small fiber beads adhere firmly to the surface of the tissues. In addition to the impairment of the look and feel and the concomitant loss of value of the textile, pilling can lead to consequential damage to overlying textile layers due to friction.
  • the use of cellulases for the anti-pilling finish of cotton and other natural fibers or textiles is known. However, the cellulases are little suitable for treating the formation of nodules or globules on synthetic fibers such as polyesters or polyacrylic fibers.
  • Synthetic fiber textiles especially polyester textiles, also have the disadvantage that they have very smooth, hydrophobic surfaces. Due to the associated poor wettability with water, they often show poor perspiration transport and wearing comfort and tend to smell. The hydrophilization of the fibers is very expensive and so far on a household scale, for example in the washing machine, no sufficiently powerful systems available.
  • polyester particles in particular polyethylene terephthalate nanoparticles into the environment.
  • Another source of such particles are beverage bottles and packaging films.
  • Esterases generally represent a group of hydrolytic enzymes with a naturally occurring wide variety of substrates and reaction type. Substrate specificity and activation of the esterases differ from those of the true lipases known to be present through the lipid / water - Activate interface before they hydrolyze water-insoluble substrates with long-chain fatty acid esters. While lipases are used by default for textile treatment and care, suitable esterases that have the properties listed above are barely known. Examples of esterases which can be used in detergents and cleaners are described, for example, in DE 10 2005 037 659 A1. However, these esterases do not show satisfactory activity for PET fibers.
  • the inventors of the present invention have now identified a group of esterases characterized by good activity for the hydrolytic cleavage of polyesters, especially PET.
  • the invention is directed to the use of an esterase or an esterase-containing agent, in particular a laundry and / or textile treatment agent, for the hydrolysis of polyesters, in particular polyethylene terephthalate (PET), the esterase having an amino acid sequence comprising at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, most preferably at least 90% sequence identity to that shown in SEQ ID NO. 1 has indicated amino acid sequence over the entire length.
  • an esterase or an esterase-containing agent in particular a laundry and / or textile treatment agent
  • PET polyethylene terephthalate
  • Another aspect relates to methods for improving the wearing comfort and / or reducing pilling of polyester-containing textiles, in particular PET-containing textiles, by contacting the polyester-containing textiles with an esterase or an agent containing an esterase, in particular a means for laundry and / or textile treatment, wherein the esterase is as defined above.
  • Yet another aspect is directed to methods of hydrophilizing PET fibers and / or degrading PET polymer from textile fibers by contacting the PET with an esterase or an esterase-containing agent, particularly a laundry and laundry detergent or textile treatment, wherein the esterase is as defined above.
  • novel esterases which comprise an amino acid sequence which has at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, of the Preferably at least 90% sequence identity with the in SEQ ID NO. Have 1 indicated amino acid sequence over the entire length and the
  • amino acids R18, S136, V178 and S213 are at the positions corresponding to positions 18, 136, 178 and 213 of SEQ ID NO: 1,
  • washing and cleaning compositions containing them in particular washing and cleaning compositions containing them, corresponding washing and cleaning methods and nucleic acids which encode these esterases, and vectors, host cells and production methods which can be used to obtain such esterases.
  • esterase an enzyme having esterase activity, i. an enzyme which is catalytically active and which results in the hydrolysis of ester bonds by the chemical behavior of the actually active radicals alone or optionally additionally by the action of modifying parts.
  • Active enzymes are also those esterases whose activity is blocked at a given time, for example by an inhibitor. Decisive is their principal suitability for the corresponding esterase reaction.
  • Preferred esterases according to the invention are in particular those enzymes which are able to catalyze the hydrolysis of polyethylene terephthalate (PET).
  • esterase are preferably mature esterases, i. to the catalytically active molecule without signal and / or propeptide (s). Unless otherwise stated, the sequences given in each case refer to mature enzymes.
  • the esterase comprises a
  • Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 1 at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, of their total length.
  • sequence comparison is based on that established in the prior art and commonly used BLAST algorithm (see, for example, Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215: 403-410, and Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J.
  • Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genera Nucleic Acids Res., 25, pp.3389-3402) and is principally accomplished by associating similar sequences of nucleotides or amino acids in the nucleic acid or amino acid sequences. A tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment.
  • Another algorithm available in the prior art is the FASTA algorithm. Sequence comparisons (alignments), in particular multiple sequence comparisons, are created with computer programs.
  • Such a comparison also allows a statement about the similarity of the compared sequences to each other. It is usually given in percent identity, that is, the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions.
  • the broader concept of homology involves conserved amino acid substitutions in the consideration of amino acid sequences, that is, amino acids with similar chemical activity, as these usually perform similar chemical activities within the protein. Therefore, the similarity of the sequences compared may also be stated as percent homology or percent similarity.
  • Identity and / or homology information can be made about whole polypeptides or genes or only over individual regions. Homologous or identical regions of different nucleic acid or amino acid sequences are therefore defined by matches in the sequences. Such areas often have identical functions.
  • nucleic acid or amino acid sequence can be small and comprise only a few nucleotides or amino acids. Often, such small regions exert essential functions for the overall activity of the protein. It may therefore be useful to relate sequence matches only to individual, possibly small areas. Unless otherwise indicated, identity or homology information in the present application, however, refers to the total length of the particular nucleic acid or amino acid sequence indicated.
  • an amino acid position corresponds to a numerically designated position in SEQ ID NO: 1 therefore means that the corresponding position of the numerically designated position in SEQ ID NO: 1 is assigned in an alignment as defined above.
  • esterases described herein may have one or more amino acid changes, particularly amino acid substitutions, insertions or deletions, over the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • esterases are, for example, by targeted genetic modification, i. by mutagenesis, further developed and optimized for specific applications or specific properties (for example, in terms of catalytic activity, stability, etc.).
  • nucleic acids according to the invention can be introduced into recombination mixtures and thus used to generate completely novel esterases or other polypeptides.
  • the aim is to introduce into the known molecules targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions, for example to improve the enzymatic activity of the enzymes described herein.
  • targeted mutations such as substitutions, insertions or deletions
  • the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and thereby their interactions with the substrate can be changed.
  • the net charge of the enzymes can be changed in order to influence the substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners.
  • the stability of the esterase can be increased even further by one or more corresponding mutations, thereby improving its hydrolysis performance.
  • Advantageous properties of individual mutations, e.g. individual substitutions can complement each other.
  • An esterase which has already been optimized with respect to certain properties, for example with respect to its stability, can therefore be further developed within the scope of the invention.
  • amino acid substitutions For the description of substitutions that concern exactly one amino acid position (amino acid substitutions), the following convention is used: first, the naturally occurring amino acid is designated in the form of the international one-letter code, followed by the associated sequence position and finally the inserted amino acid. Several exchanges within the same polypeptide chain are separated by slashes. For insertions, additional amino acids are named after the sequence position. In the case of deletions, the missing amino acid is replaced by a symbol, for example a star or a dash, or a ⁇ is specified in front of the corresponding position.
  • A95G describes the substitution of alanine at position 95 by glycine, A95AG the insertion of glycine after the amino acid alanine at position 95 and A95 * or ⁇ 95 the deletion of alanine at position 95.
  • This nomenclature is known to those skilled in the art of enzyme technology.
  • the invention therefore also provides the uses and processes described herein, which is characterized in that the esterase used (a) from the in SEQ ID NO.1 indicated amino acid sequence or (b) from an esterase having the amino acid sequence given in SEQ ID NO: 1 is available as starting molecule by
  • amino acid substitutions selected from the group A001E, A001F, A001G, A001H, A001K, A001L, A001N, A001R, A001S, A001T, A001V, A001W, A001Y, Y004F, E005A, E005L, N009A, N009E, N009H, N009S, N009T, N009V, T01 1N, D012A, D012H, A013C, A013D, A013E, A013K, A013L, A013M, A013S, A013T, L014F, L014I, L014M, A017G, A017K, A017M, A017Q, A017S, R018A, R018G, R018I, R018N, R018Q, R018S, R018V, R018W, S019A, S019C,
  • the esterases of the invention may comprise (a) an amino acid sequence selected from or consisting of those set forth in SEQ ID NOs: 1-5; or (b) from an esterase comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, as the starting molecule
  • amino acid substitutions selected from the group A001D, A001M, Y004N, N009D, N009L, N009M, N009Q, N009Y, A013F, A013Q, A013Y, S023A, S023E, S023Q, S025A, S025C, S025D, S025E, S025N, E026A, E026C, E026F, E026H, E026I, E026K, E026M, E026Q, E026R, E026S, E026T, E026V, E026W, E026Y, N028I, N028K, N028P, N028Q, N028T, N028Y, S030D, L032A, L032E, L032Q, S033Q, S035E, S035I, S035Q, S035V, Y043R
  • one or more amino acid substitutions selected from the group A001C, A001P, A001Q, Y004W, E005W, N009C, N009F, N009G, N009I, D012V, A013H, A013I, S019G, S019I, S019Q, S019Y, S023R, S023V, V024K, S025F , S025I, L032D, L032V, S033E, S033F, S333I, S033L, S033R, S035A, S035M, Y043W, R046C, R046F, R046H, R046M, E047C, E047H, N048S, N048V, N048W, N049C, T050Q, V054I, T061H, T061 I, T061V, T063S, E064G, E064I
  • amino acid substitutions selected from the group N002A, N002L, P003A, P003E, P003G, P003H, P003I, P003K, P003L, P003M, P003Q, P003S, P003T, P003V, T01 1H, D012E, D012S, A013G, A013P, L014Y, S019E, F022E, F022M, V024C, V024Q, E026P, N028C, N028D, L032F, L032P, S033Y, T041R, I042V, Y043K, E047F, E047L, E047M, E047P, E047S, E047V, E047W, N049E, N049F, N049L, N049Y , T050E, T050V, Y060G,
  • amino acid substitutions selected from the group N009W, D012I, D012L, A013R, A017N, P021D, P021T, P021Y, F022H, F022K, S023N, V024N, S025H, S025Y, E027N, S030C, S030K, R031Q, R031V, S033C, S035C, S035W, I042Q, P045A, P045T, R046P, R046Y, E047Q, A053L, A053V, I056M, S057T, P058G, Y060A, Y060F, Y060S , Y060W, T061C, T061K, T061L, T061N, T061Q, T061R, T061W, G062D, T063E, T063P, E064H
  • the positions 18, 163, 178 and / or 213 can be varied as long as the esterase either
  • the described single or multiple amino acid substitutions may be conservative amino acid substitutions.
  • conservative amino acid substitution means the substitution of one amino acid residue for another amino acid residue, which substitution does not result in a change in polarity or charge at the position of the exchanged amino acid, e.g. Example, the replacement of a nonpolar amino acid residue against another nonpolar amino acid residue.
  • the esterase is obtainable by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis
  • fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis can also be used to lower, for example, the allergenicity of the enzymes in question, thus improving their overall applicability.
  • the enzymes retain their hydrolytic activity even after mutagenesis, i. their hydrolytic activity is at least equal to that of the starting enzyme, i. in a preferred embodiment, the hydrolytic activity is at least 80, preferably at least 90% of the activity of the starting enzyme.
  • Other substitutions can also show beneficial effects. Both single and multiple contiguous amino acids can be substituted for other amino acids.
  • amino acid positions are referred to in the embodiments described herein, that indication refers to the positions in a molecule corresponding to the corresponding positions of the esterase of SEQ ID NO. 1 are assigned in an alignment. Furthermore, the assignment of the positions depends on the mature (mature) protein. This assignment is also to be used in particular if the amino acid sequence of an esterase described herein comprises a higher number of amino acid residues than the esterase according to SEQ ID NO. 1. Based on the above-mentioned positions in the amino acid sequence of the esterase, the change positions in an esterase described herein are those which are just assigned to these positions in an alignment.
  • Advantageous positions for sequence changes, in particular substitutions, of the esterase according to SEQ ID NO: 1, which are preferably transferred to homologous positions of the esterases described herein and which confer advantageous functional properties on the esterase, are in particular the positions indicated above, to be assigned in an alignment with SEQ ID NO. 1 and thus in the count according to SEQ ID NO. 1 .
  • substitutions may also be made at a combination of positions indicated under (i) - (iv).
  • substitutions from the lists given under (v) - (ix) can be arbitrarily combined.
  • esterases which, at the positions corresponding to positions 178 and / or 213 in SEQ ID NO: 1, have the amino acid substitutions 1178V and / or 1213S. It has been found that these two positions are involved in the binding of the substrate PET, so that corresponding substitutions can improve the performance of the esterase in terms of substrate binding and hydrolysis.
  • Particularly preferred embodiments of the invention therefore relate to the above-described esterases which comprise an amino acid sequence which has at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 85%, most preferably at least 90% sequence identity with the sequence shown in SEQ ID NO. 1, and comprising amino acids V178 and S213 at the positions corresponding to positions 178 and 213 of SEQ ID NO: 1. In various embodiments, these esterases additionally contain one or more of the substitutions described above.
  • esterases which are additionally stabilized, in particular by one or more mutations, for example substitutions, or by coupling to a polymer or their use or process for their use. Because an increase in the stability during storage and / or during use, for example during the washing process, causes the enzymatic activity to last longer and thus the performance is improved.
  • all stabilization options described in the prior art and / or appropriate considerations come into consideration. Preference is given to those stabilizations which are achieved by mutations of the enzyme itself, since such stabilization after the recovery of the enzyme does not require any further working steps. Examples of sequence changes suitable for this purpose are mentioned above. Other suitable sequence changes are known from the prior art. For example, esterases can also be stabilized by replacing one or more tyrosine residues with other amino acids.
  • Preferred embodiments are those in which the enzyme is stabilized in several ways, as several stabilizing mutations act additive or synergistic.
  • Another object of the invention is an esterase as described above, which is characterized in that it has at least one chemical modification or their use or method for their use.
  • An esterase with such a change is called a derivative, i. the esterase is derivatized.
  • derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified.
  • derivatizations can be done, for example, in vivo by the host cell expressing the protein.
  • couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy.
  • derivatizations can also be carried out in vitro, for example by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein.
  • another compound may also be another protein which can be synthesized, for example, via bifunctional chemicals. mixing compounds is bound to a protein according to the invention.
  • Derivatization is likewise to be understood as meaning covalent bonding to a macromolecular carrier, or else noncovalent inclusion in suitable macromolecular cage structures.
  • Derivatizations may, for example, affect the substrate specificity or binding strength to the substrate or cause a temporary blockage of the enzymatic activity when the coupled substance is an inhibitor. This can be useful, for example, for the period of storage. Such modifications may further affect stability or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility.
  • couplings with macromolecular compounds for example, polyethylene glycol, can improve the protein in terms of stability and / or skin tolerance.
  • Derivatives of a protein described herein may also broadly be understood to include preparations of these proteins.
  • a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
  • a protein may also have been deliberately added to other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it may be desired that it has no or only low activity during storage, and unfolds its enzymatic function only at the time of use. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances.
  • the joint preparation of esterases with esterase inhibitors is possible in this regard.
  • esterases or esterase variants and / or derivatives described above particular preference is given in the context of the present invention to those whose stability and / or activity are at least those of the esterase according to one of SEQ ID NOs. 1-3, which activity relates to the PET hydrolysis activity, which can be determined as described in the Examples.
  • a further subject of the invention is a nucleic acid which codes for an esterase according to the invention, as well as a vector containing such a nucleic acid, in particular a cloning vector or an expression vector.
  • DNA or RNA molecules may be DNA or RNA molecules. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. Especially in the case of DNA molecules, the sequences of both complementary strands must be taken into account in all three possible reading frames. It should also be taken into account that different codons, ie base triplets, can code for the same amino acids, so that a certain amino acid acid sequence of several different nucleic acids can be encoded. Due to this degeneracy of the genetic code, all nucleic acid sequences are included in this subject of the invention which can encode one of the esterases described above.
  • nucleic acid sequences unequivocally since, despite the degeneracy of the genetic code, individual codons are assigned defined amino acids. Therefore, the person skilled in the art can easily determine nucleic acids coding for this amino acid sequence on the basis of an amino acid sequence.
  • one or more codons may be replaced by synonymous codons.
  • This aspect relates in particular to the heterologous expression of the enzymes according to the invention.
  • each organism for example a host cell of a production strain, has a particular codon usage. Codon usage is understood to mean the translation of the genetic code into amino acids by the particular organism.
  • Bottlenecks in protein biosynthesis can occur if the codons lying on the nucleic acid in the organism face a comparatively small number of loaded tRNA molecules. Although coding for the same amino acid, this results in a codon being translated less efficiently in the organism than a synonymous codon encoding the same amino acid. Due to the presence of a higher number of tRNA molecules for the synonymous codon, it can be more efficiently translated in the organism.
  • a person skilled in the art can use well-known methods such as chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences, the corresponding nucleic acids to complete genes manufacture.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such methods are for example from Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Laboratory Press.
  • vectors are understood as consisting of nucleic acids which contain a nucleic acid according to the invention as a characteristic nucleic acid region. They can establish these in a species or cell line over several generations or cell divisions as a stable genetic element.
  • Vectors especially when used in bacteria, are special plasmids, ie circular genetic elements.
  • a nucleic acid according to the invention is cloned into a vector.
  • the vectors include, for example, those whose origin are bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various origins.
  • vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations. They may be extrachromosomal as separate units or integrated into a chromosome or chromosomal DNA.
  • Expression vectors comprise nucleic acid sequences which enable them to replicate in the host cells containing them, preferably microorganisms, particularly preferably bacteria, and to express a contained nucleic acid there.
  • expression is influenced by the promoter (s) that regulate transcription.
  • the expression may be effected by the natural promoter originally located in front of the nucleic acid to be expressed, but also by a promoter of the host cell provided on the expression vector or also by a modified or completely different promoter of another organism or another host cell.
  • At least one promoter for the expression of a nucleic acid according to the invention is made available and used for its expression.
  • expression vectors can be regulatable, for example by changing the culturing conditions or when a specific cell density of the host cells contained therein is reached or by addition of specific substances, in particular activators of gene expression.
  • An example of such a substance is the galactose derivative isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (IPTG), which is used as activator of the bacterial lactose operon (lac operon).
  • IPTG galactose derivative isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside
  • lac operon lac operon
  • a further subject of the invention is a non-human host cell which contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention or which contains an esterase according to the invention, in particular one which secretes the esterase into the medium surrounding the host cell.
  • a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention is transformed into a microorganism, which then represents a host cell according to the invention.
  • individual components, ie nucleic acid fragments or fragments of a nucleic acid according to the invention can be introduced into a host cell in such a way that the resulting host cell contains a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention.
  • This procedure is particularly suitable when the host cell already contains one or more constituents of a nucleic acid according to the invention or a vector according to the invention and the further constituents are then supplemented accordingly.
  • Methods of transforming cells are well established in the art and well known to those skilled in the art. In principle, all cells, ie prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells. Preference is given to those host cells which can be handled genetically advantageously, for example as regards the transformation with the nucleic acid or the vector and its stable establishment, for example unicellular fungi or bacteria. Furthermore, preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling.
  • Preferred host cells according to the invention secrete the (transgenially) expressed protein into the medium surrounding the host cells.
  • the esterases can be modified by the cells producing them after their production, for example by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such post-translational modifications may functionally affect the esterase.
  • Further preferred embodiments are those host cells which are regulatable in their activity due to genetic regulatory elements which are provided, for example, on the vector, but may also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the culture conditions or when reaching a specific cell density, these can be excited for expression. This enables an economical production of the proteins according to the invention.
  • An example of such a compound is IPTG as described above.
  • Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells. Bacteria are characterized by short generation times and low demands on cultivation conditions. As a result, inexpensive cultivation methods or production methods can be established. In addition, the expert has a wealth of experience in bacteria in fermentation technology. For a specific production, gram-negative or gram-positive bacteria may be suitable for a wide variety of reasons to be determined experimentally in individual cases, such as nutrient sources, product formation rate, time requirement, etc.
  • Gram-negative bacteria such as Escherichia coli
  • Gram-negative bacteria can also be designed such that they eject the expressed proteins not only into the periplasmic space but into the medium surrounding the bacterium.
  • gram-positive bacteria such as Bacilli or Actinomycetes or other representatives of Actinomycetales have no outer membrane, so that secreted proteins are released immediately into the medium surrounding the bacteria, usually the nutrient medium, from which the expressed proteins can be purified. They can be isolated directly from the medium or further processed.
  • Gram-positive bacteria are related or identical to most of the organisms of origin for technically important enzymes and usually form even comparable enzymes, so they have a similar codon use and their protein synthesizer is naturally aligned accordingly.
  • Host cells according to the invention may be altered in their requirements of the culture conditions, have different or additional selection markers or express other or additional proteins. In particular, it may also be those host cells which express several proteins or enzymes transgene.
  • the present invention is applicable in principle to all microorganisms, in particular to all fermentable microorganisms, particularly preferably those of the genus Bacillus, and results in the production of proteins according to the invention by the use of such microorganisms. Such microorganisms then represent host cells in the sense of the invention.
  • the host cell is characterized in that it is a bacterium, preferably one selected from the genera Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas, more preferably one selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus , Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotroph
  • the host cell may also be a eukaryotic cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • a further subject of the invention therefore represents a host cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed. Examples thereof are fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces. This may be particularly advantageous, for example, if the proteins are to undergo specific modifications in the context of their synthesis that enable such systems.
  • Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides. Such oligosaccharide modifications may be desirable, for example, to lower the allergenicity of an expressed protein. Also, coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases or lipases, may be advantageous. Furthermore, for example, thermophilic fungal expression systems may be particularly suitable for the expression of temperature-resistant proteins or variants.
  • the host cells according to the invention are conventionally cultivated and fermented, for example in discontinuous or continuous systems.
  • a suitable nutrient medium is inoculated with the host cells and the product is harvested from the medium after an experimentally determined period of time.
  • Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium, in which over a relatively long period of time cells partly die out but also regrow and at the same time the protein formed can be removed from the medium.
  • Host cells according to the invention are preferably used to produce esterases according to the invention. Another object of the invention is therefore a method for producing an esterase comprising
  • This subject invention preferably comprises fermentation processes. Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example the esterase according to the invention. All fermentation processes which are based on a corresponding process for the preparation of an esterase according to the invention represent embodiments of this subject matter of the invention.
  • Fermentation processes which are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy, come in particular into consideration.
  • the media components consumed by the ongoing cultivation are fed.
  • the fermentation can also be designed so that undesired metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or suitable counterions.
  • the esterase produced can be harvested from the fermentation medium.
  • Such a fermentation process is resistant to isolation of the esterase from the host cell, i. however, requires the provision of suitable host cells or one or more suitable secretion markers or mechanisms and / or transport systems for the host cells to secrete the esterase into the fermentation medium.
  • the isolation of the esterase from the host cell i. a purification of the same from the cell mass, carried out, for example by precipitation with ammonium sulfate or ethanol, or by chromatographic purification.
  • compositions containing an esterase as described above are preferably agents for the treatment and / or cleaning and / or care of textiles or laundry, in particular a detergent, a washing aid or a fabric care agent.
  • This invention includes all conceivable types of detergent, both concentrates and undiluted agents to be used on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing. These include detergents for textiles, carpets, or natural fibers, for which the term detergent is used.
  • Detergents in the context of the invention also include washing aids which are metered into the actual detergent during manual or automatic textile washing in order to achieve a further effect.
  • laundry detergents within the scope of the invention also include textile pre-treatment and post-treatment agents, ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example for dissolving stubborn soiling, and also agents which are in a downstream of the actual textile laundry step give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge.
  • textile pre-treatment and post-treatment agents ie those agents with which the laundry item is brought into contact before the actual laundry, for example for dissolving stubborn soiling
  • agents which are in a downstream of the actual textile laundry step give the laundry further desirable properties such as comfortable grip, crease resistance or low static charge.
  • the fabric softeners are calculated.
  • compositions described and used herein which may be in the form of powdered solids, in densified particulate form, as homogeneous solutions or suspensions, may contain, in addition to an esterase according to the invention, all known ingredients commonly used in such agents, with preferably at least one other ingredient present in the composition ,
  • the agents described and used herein may contain surfactants, builders, peroxygen compounds or bleach activators.
  • they may contain water-miscible organic solvents, further enzymes, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and / or further auxiliaries, such as optical brighteners, grayness inhibitors, foam regulators, as well as dyes and fragrances, and combinations thereof.
  • An agent described or used herein advantageously contains the esterase in an amount of from 2 ⁇ g to 20mg, preferably from 5 ⁇ g to 17.5mg, more preferably from 2C to 15mg and most preferably from 5C to 10mg per g of the agent.
  • the esterase may be included in the composition in an amount of from 1 x 10 -8 to 5 wt%, 1 x 10 -7 to 3 wt%, from 0.00001 to 1 wt%, from 0 , 00005 to 0.5 wt .-%, from 0.0001 to 0.1 wt .-% and from 0.0001 to 0.05 wt .-% based on active protein.
  • esterase contained in the agent, and / or other ingredients of the agent may be coated with a substance impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water, which under application conditions of the agent is permeable to the enzyme becomes.
  • a substance impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water is thus characterized in that the esterase is enveloped with a substance which is impermeable to the esterase at room temperature or in the absence of water.
  • the agent itself can also be packed in a container, preferably an air-permeable container, from which it is released shortly before use or during the washing process.
  • the agent is characterized in that it
  • (A) is in solid form, in particular as a free-flowing powder having a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l, or
  • (b) is in pasty or liquid form, and / or
  • (c) is present as a one-component system, or
  • inventions of the present invention include all solid, powdered, liquid, gelatinous or pasty administration forms of agents described and used herein which, if appropriate, may also consist of several phases and may be present in compressed or uncompressed form.
  • the agent can be present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l.
  • the solid dosage forms of the composition also include extrudates, granules, tablets or pouches.
  • the agent can also be liquid, gelatinous or pasty, for example in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
  • the agent may be present as a one-component system. Such funds consist of one phase.
  • an agent can also consist of several phases. Such an agent is therefore divided into several components.
  • agents described and used herein, especially detergents may contain only an esterase. Alternatively, they may also contain other hydrolytic enzymes or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent. Another embodiment thus represents agents which further comprise one or more further enzymes.
  • Preferred enzymes which can be used as enzymes are all enzymes which can develop a catalytic activity in the agent according to the invention, in particular a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, xyloglucanase, .beta.-glucosidase, pectinase, carrageenase, perhydrolase, Oxidase, oxidoreductase or a lipase, and mixtures thereof.
  • each additional enzyme is in an amount of 1 x 10 -3 ⁇ 7 wt .-%, of 0.00001-1 wt .-%, of 0.00005 to 0.5 wt .-%, from 0.0001 to 0.1% by weight and more preferably from 0.0001 to 0.05% by weight in the agents described and used herein, based on active protein.
  • the enzymes show synergistic effects, for example in the cleaning performance against certain stains or stains, ie the enzymes contained in the middle composition mutually support each other in their performance.
  • Synergistic effects can occur not only between different enzymes, but also between one or more enzymes and other ingredients of the composition according to the invention.
  • a further subject of the invention is a process for the treatment or care of textiles, which is characterized in that at least one process step, a means described herein is applied, or that in at least one process step, an esterase described herein is catalytically active, in particular such that the esterase in an amount of 4C ⁇ g to 4g, preferably from 5C ⁇ g to 3g, more preferably from 10C ⁇ g to 2g and most preferably from 20C ⁇ g to 1g is used.
  • Processes for the treatment, care and / or cleaning of textiles are generally distinguished by the fact that various care or cleaning-active substances are applied to the textile in several process steps and washed off after the reaction time, or that the textile is otherwise treated with such an agent or a solution or dilution of this agent.
  • All conceivable laundry or textile treatment or textile care processes may be enriched in at least one of the process steps for the use of an agent described herein or esterase described herein and then constitute embodiments of the present invention.
  • All of the facts, subjects, and embodiments herein described and used esterases and agents containing them are also applicable to this subject of the invention. Therefore, reference is made at this point expressly to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the above inventive methods and uses.
  • esterases according to the invention naturally already have a hydrolytic activity and also unfold them in media which otherwise have no cleaning power, as for example in In the case of the buffer, a single and / or the sole step of such a process may be that, if desired, the only active component is an esterase according to the invention in contact with a textile or laundry, preferably in a buffer solution or in water. This represents a further embodiment of this subject of the invention.
  • Alternative embodiments of this subject matter of the invention are also processes for the treatment of textile raw materials or for textile care, in which an esterase according to the invention becomes active in at least one process step.
  • methods for textile raw materials, fibers or textiles with synthetic components are preferred, and especially for those with polyesters, in particular PET.
  • the invention also relates to the further aspect of using the esterases described herein for polyester degradation in waste waters or other environments contaminated with polyester, in particular PET in nanoparticle form, such as waters, soils, landfills, etc.
  • esterases described herein in use for the hydrolysis of polyesters, in particular PET, or in methods for improving the wearing comfort and / or reducing pilling of polyester-containing textiles, in particular PET-containing textiles, or in processes for hydrophilizing PET fibers and / or degrading PET polymer from textile fibers in all the formulations described above and / or in all the ways described above. Therefore, reference is made at this point expressly to the disclosure in the appropriate place with the statement that this disclosure also applies to the use according to the invention and the inventive method.
  • an esterase variant of the invention was prepared by site-directed mutagenesis in the esterase-encoding nucleic acid using the "QuickChange® I site-directed mutagenesis kit" (Stratagene). In this case, the codons for the indicated amino acid positions (178, 213) were changed in such a way that during the translation with respect to the amino acid sequence a substitution of the amino acids took place as indicated.
  • the expression of the esterase variant was carried out in a customary manner by transformation of E. coli BL21 (DE3) with a corresponding expression vector and subsequent culture of the transformants expressing the esterase variant. The esterases were by means of
  • Reference Esterase Esterase having an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 .
  • Esterase variant 1178V Esterase with an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 with the amino acid substitution 1178V in the count according to SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO: 2).
  • Esterase variant 1213S Esterase having an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 with the amino acid substitution I213S in the count according to SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 3).
  • the activity of the esterases was determined by two methods. Using a turbidimetric method, the enzymatic hydrolysis of polycaprolactone (PCL) nanoparticles was measured.
  • PCL nanoparticles were prepared by means of a precipitation method. 100 mg PCL were dissolved in 10 mL acetone at 50 ° C and then pipetted dropwise into 100 mL ultrapure H2O with vigorous stirring. The PCL suspension was filtered through a paper filter and the organic solvent removed under the hood.
  • PCL nanoparticles For the determination of the enzymatic degradation of PCL nanoparticles, 100 ⁇ l of a PCL suspension (1 mg / ml) were placed in each well of a microtiter plate and incubated with Tris buffer (0.5 M, pH 8.5) or enzyme solutions in the same Tris Buffer filled up to a total volume of 200 [iL. PCL hydrolysis was determined in the plate reader at 600 nm and 50 ° C over a period of 15 minutes. The linear initial rates of turbidity decrease of the suspension were determined. The results are in FIG. 1 graphically represented (degradation rates of PCL nanoparticles as a function of the amount of enzyme used).
  • the enzymatic degradation rate of PET films was determined gravimetrically.
  • a PET film about 55 mg, 5 mm ⁇ 30 mm
  • the weight losses of the PET films were determined after 48 h incubation.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Esterasen und Esterase-Varianten und deren Anwendung zur Hydrolyse von Polyestern sowie in Verfahren zur Behandlung und Pflege von Wäsche und Textilien, insbesondere dem Verbessern des Tragekomforts und dem Schutz vor oder zur Verminderung bzw. Verhinderung des Pillings bei Polyester enthaltenden Textilien sowie Verfahren zur Erhöhung der Hydrophilizität von Polyesterfasern und Abbau von Polyestern aus Wäschefasern. Ferner betrifft die Erfindung auch die Herstellung der Esterasen und Mittel die diese enthalten

Description

„PET-Esterasen und deren Verwendung"
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der Enzymtechnologie. Die Erfindung betrifft Esterasen und insbesondere deren Anwendung zur Hydrolyse von Polyestern sowie in Verfahren zur Behandlung und Pflege von Wäsche und Textilien, insbesondere dem Verbessern des Tragekomforts und dem Schutz vor oder zur Verminderung bzw. Verhinderung des Pillings bei Polyester enthaltenden Textilien sowie Verfahren zur Erhöhung der Hydrophilizität von Polyesterfasern und Abbau von Polyestern aus Wäschefasern. Schließlich betrifft die Erfindung auch Esterasen als solche, deren Herstellung und Mittel die diese enthalten.
Unter Pilling versteht man das durch Reiben bewirkte Herausziehen feiner Fäserchen aus Geweben oder -gewirken, die sich zu Faserkügelchen ("Pills", "Knötchen") zusammenrollen und dann nur noch durch wenige Einzelfasern mit der Oberfläche der Gewebe oder Gewirke verbundenen sind. Bei Kunstfasern haften die kleinen Faserkügelchen fest auf der Oberfläche der Gewebe. Neben der Beeinträchtigung der Optik und Haptik und dem einhergehenden Wertverlust des Textils kann es durch das Pilling zu Folgeschäden an aufliegenden Textilschichten durch Reibung kommen. Der Einsatz von Cellulasen für die Anti-Pilling-Ausrüstung von Baumwolle und anderen natürlichen Fasern bzw. Textilien ist bekannt. Allerdings sind die Cellulasen nur wenig zur Behandlung der Bildung von Knötchen oder Kügelchen bei Kunstfasern, wie beispielsweise Polyestern oder Polyacrylfasern, geeignet.
Kunstfasertextilien, insbesondere Polyester-Textilien, haben zudem den Nachteil, dass sie sehr glatte, hydrophobe Oberflächen haben. Durch die damit verbundene schlechte Benetzbarkeit mit Wasser zeigen sie oftmals einen schlechten Schweißtransport und Tragekomfort und neigen zur Geruchsbildung. Die Hydrophilierung der Fasern ist sehr aufwendig und bisher sind im Haushaltsmaßstab, beispielsweise in der Waschmaschine, keine ausreichend leistungsfähigen Systeme verfügbar.
Durch den Faserabrieb im Waschprozess der Haushalte kommt es zu einer kontinuierlichen Freisetzung von Polyesterpartikeln, insbesondere Polyethylenterephthalat-Nanopartikeln in die Umwelt. Eine weitere Quelle für derartige Partikel sind Getränkeflaschen und Verpackungsfolien.
Es besteht daher Bedarf an Systemen, die bei Textilien aus Polyester einerseits die bereits entstandene Knötchenbildung vermindern (Depilling) und andererseits einen Schutz der Fasern vor dem Pilling bieten, so dass also die unschöne Knötchenbildung gar nicht erst entsteht. Ferner besteht Bedarf an Systemen, die Polyesterfasern, insbesondere PET-Fasern, hydrophiler machen können und freigesetzte PET-Nanopartikel abbauen können. Da alle diese Erfordernisse den Abbau der Polyester erfordern, insbesondere über Esterolyse, ist die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe die Bereitstellung von Enzymen mit verbesserter PET-Esterolyse.
Esterasen im Allgemeinen stellen eine Gruppe hydrolytischer Enzyme mit einer natürlicherweise vorkommenden breiten Vielfalt hinsichtlich der Substrate und des Reaktionstyps dar. Die Sub- stratspezifität und die Aktivierung der Esterasen unterscheiden sich von denen der echten Lipasen für die bekannt ist, dass sie durch die Lipid/Wasser- Grenzfläche aktiviert werden, bevor sie wasserunlösliche Substrate mit langkettigen Fettsäureestern hydrolysieren. Während für die Textilbehandlung und -pflege Lipasen standardmäßig eingesetzt werden, sind geeignete Esterasen, die die oben aufgelisteten Eigenschaften haben, bisher kaum bekannt. Beispiele für in Wasch- und Reinigungsmitteln einsetzbare Esterasen sind beispielsweise in der DE 10 2005 037 659 A1 beschrieben. Allerdings zeigen diese Esterasen keine zufriedenstellende Aktivität für PET-Fasern.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben nun eine Gruppe von Esterasen identifiziert, die sich durch eine gute Aktivität für die hydrolytische Spaltung von Polyestern, insbesondere PET auszeichnen.
In einem ersten Aspekt richtet sich die Erfindung daher auf die Verwendung einer Esterase oder eines Mittels, das eine Esterase enthält, insbesondere eines Mittels zur Wäsche- und/oder Textilbehandlung, zur Hydrolyse von Polyestern, insbesondere Polyethylenterephthalat (PET), wobei die Esterase eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
Ein weiterer Aspekt betrifft Verfahren zum Verbessern des Tragekomforts und/oder Vermindern von Pilling von Polyester-haltigen Textilien, insbesondere PET-haltigen Textilien, durch das in Kontakt bringen der Polyester-haltigen Textilien mit einer Esterase oder einem Mittel, das eine Esterase enthält, insbesondere einem Mittel zur Wäsche- und/oder Textilbehandlung, wobei die Esterase wie oben definiert ist.
Noch ein weiterer Aspekt richtet sich auf Verfahren zum Hydrophilieren von PET-Fasern und/oder Abbau von PET-Polymer aus Textilfasern durch das in Kontakt bringen des PET mit einer Esterase oder einem Mittel, das eine Esterase enthält, insbesondere einem Mittel zur Wäsche- und/oder Textilbehandlung, wobei die Esterase wie oben definiert ist.
Weitere Aspekte der Erfindung betreffen neue Esterasen, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens 70 % vorzugsweise mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 %, am be- vorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweisen und die
(i) die Aminosäuren R18 und S136 an den Positionen, die den Positionen 18 und 136 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweisen;
(ii) die Aminosäuren R18, S136 und V178 an den Positionen, die den Positionen 18, 136 und 178 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweisent;
(iii) die Aminosäuren R18, S136 und S213 an den Positionen, die den Positionen 18, 136 und 213 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweisen;
(iv) die Aminosäuren V178 und S213 an den Positionen, die den Positionen 178 und 213 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweisen; oder
(v) die Aminosäuren R18, S136, V178 und S213 an den Positionen, die den Positionen 18, 136, 178 und 213 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweisen,
und Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, die diese enthalten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie Nukleinsäuren die diese Esterasen kodieren, und Vektoren, Wirtszellen und Herstellverfahren, die zur Gewinnung derartiger Esterasen genutzt werden können.
Unter dem Begriff einer Esterase wird ein Enzym mit Esteraseaktivität verstanden, d.h. ein Enzym, das katalytisch aktiv ist und bei dem sich durch das chemische Verhalten der eigentlich aktiven Reste allein oder ggf. zusätzlich durch das Einwirken modifizierender Teile eine Hydrolyse von Ester-Bindungen ergibt. Aktive Enzyme sind auch solche Esterasen, deren Aktivität zu einem gegebenen Zeitpunkt, etwa durch einen Inhibitor, blockiert ist. Entscheidend ist ihre prinzipielle Eignung zur entsprechenden Esterase-Reaktion. Bevorzugte Esterasen im Sinne der Erfindung sind insbesondere solche Enzyme, die in der Lage sind, die Hydrolyse von Polyethylenterephthlat (PET) zu katalysieren.
Bei den hierin als Esterase bezeichneten Proteinen handelt es sich vorzugsweise um reife (mature) Esterasen, d.h. um das katalytisch aktive Molekül ohne Signal- und/oder Propeptid(e). Soweit nicht anders angegeben beziehen sich auch die angegebenen Sequenzen jeweils auf reife Enzyme.
In verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung umfasst die Esterase eine
Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91 %, 91 ,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 98,7%, 98,8%, 99,0 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, 99,9 % und 100 % identisch ist.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, DJ. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403- 410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new genera- tion of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31 , 3497-3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205-217) oder Programme, die auf diesen Programmen beziehungsweise Algorithmen basieren. In der vorliegenden Patentanmeldung wurden alle Sequenzvergleiche (A- lignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern erstellt, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben oder in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe oder identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide oder Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- oder Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet die Angabe, dass eine Aminosäureposition einer numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO: 1 entspricht daher, dass die ent- sprechende Position der numerisch bezeichneten Position in SEQ ID NO:1 in einem wie oben definierten Alignment zugeordnet ist.
Die hierin beschriebenen Esterasen können gegenüber der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 angegeben ist, eine oder mehrere Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure- Substitutionen, -Insertionen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Esterasen sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d.h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Esterasen oder anderer Polypeptide genutzt werden.
Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise die enzymatische Aktivität der hierin beschriebenen Enzyme zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität der Esterase noch weiter erhöht und dadurch ihre Hydrolyseleistung verbessert werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Esterase, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich weiterentwickelt sein.
Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt oder vor der entsprechenden Position ein Δ angegeben. Beispielsweise beschreibt A95G die Substitution von Alanin an Position 95 durch Glycin, A95AG die Insertion von Glycin nach der Aminosäure Alanin an Position 95 und A95* oder ΔΑ95 die Deletion von Alanin an Position 95. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher die hierin beschriebenen Verwendungen und Verfahren, die dadurch gekennzeichnet ist, dass die verwendete Esterase (a) aus der in SEQ ID NO.1 angegebenen Aminosäuresequenz besteht oder (b) aus einer Esterase mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Aminosäuresequenz als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch
(i) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 1 , 9, 13, 18, 19, 23, 25, 26, 28, 32, 33, 46, 47, 48, 61, 64, 89, 90, 92, 105, 113, 114, 157, 183, 204, 234, 245, 246, 249, und 253 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(ii) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 3, 12, 24, 30, 35, 49, 60, 63, 65, 72, 73, 87, 95, 98, 108, 109, 110, 112, 117, 121, 122, 131, 142, 151, 163, 165, 174, 175, 177, 182, 187, 194, 195, 212, 213, 232, 238, 248 und 256 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(iii) durch ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 4, 5, 11, 14, 17,21,22,31,43,50,53, 57,62,68, 74,78,82,83,85, 88, 101, 102, 106, 107, 116, 124, 126, 136, 138, 141, 149, 152, 153, 158, 178, 190, 197, 202, 207, 209, 216, 219 und 250 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(iv) durch ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 2, 27, 41, 42, 44, 45, 51, 54, 56, 58, 66, 67, 75, 79, 81, 86, 91, 96, 104, 111, 120, 125, 127, 135, 144, 156, 159, 160, 162, 171, 172, 181, 184, 186, 188, 205, 210, 211, 217, 221, 222, 223, 230, 236, 237, 239, 247, 251, 252 und 254 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(v) durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe
A001D, A001M, Y004N, N009D, N009L, N009M, N009Q, N009Y, A013F, A013Q, A013Y, R018E, R018H, S023A, S023E, S023Q, S025A, S025C, S025D, S025E, S025N, E026A, E026C, E026F, E026H, E026I, E026K, E026M, E026Q, E026R, E026S, E026T, E026V, E026W, E026Y, N028I, N028K, N028P, N028Q, N028T, N028Y, S030D, L032A, L032E, L032Q, S033Q, S035E, S035I, S035Q, S035V, Y043R, R046D, R046I, R046N, R046Q, R046T, S057C, Y060C, T061D, T061M, T061P, G062A, T063C, E064A, E064K, E064Q, E064R, A065G, A065K, A065Y, E072H, R073L, R073Y, T083V, D085E, I087L, T088D, T088E, T089A, T089C, T089D, T089E, T089G, T089L, T089P, T089V, L090E, L090Q, L090S, L090T, Q092D, Q092E, Q092G, Q092H, Q092N, Q092S, Q092Y, S095D, S095E, S095Q, N101E, N105A, N105D, N105E, N105G, N105M, N105Q, N105S, M107L, I108L, I108Y, N109T, R110H, S113C, S113D, S113E, S113H, S113P, T114D, T114E, S117Q, A125S, V126A, M131A, M131F, M131L, S136A, S136V, S141E, P151A, P151C, P151I, P151L, P151S, P151V, L152I, T153C, T153L, H156D, L157A, L157C, L157H, L157I, L157K, L157N, L157Q, L157S, L157T, L157W, L157Y, N158E, N160D, D174A, D174C, D174E, D174G, D174H, D174K, D174M, D174Q, D174R, D174S, D174T, D174V, L175C, L175D, L175E, L175G, L175N, L175Q, T177D, I178L, A182D, A182E, T183D, T183E, T183H, T183Q, T183S, H184Y, P187A, P187E, P187M, P187V, F188M, N190E, S194D, S194E, S197A, E202V, D204A, D204C, D204E, D204F, D204G, D204H, D204I, D204K, D204L, D204M, D204N, D204P, D204Q, D204R, D204S, D204T, D204V, D204W, T207D, T207G, F209C, F209E, A210T, N212I, N212L, N212M, N212T, N212V, I213C, I213E, I213F, I213H, I213K, I213Q, I213R, I213S, I213Y, G219A, N232C, N232M, T234H, R245V, D246A, D246C, D246H, D246P, D246T, L248I, F249G, F249K, F249N, F249P, G250P, E253A, E253C, E253F, E253G, E253H, E253I, E253K, E253L, E253N, E253Q, E253R, E253S, E253T, E253V, E253W, E253Y, R256I und R256L, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 E, A001 F, A001 G, A001 H, A001 K, A001 L, A001 N, A001 R, A001 S, A001T, A001V, A001W, A001Y, Y004F, E005A, E005L, N009A, N009E, N009H, N009S, N009T, N009V, T01 1 N, D012A, D012H, A013C, A013D, A013E, A013K, A013L, A013M, A013S, A013T, L014F, L014I, L014M, A017G, A017K, A017M, A017Q, A017S, R018A, R018G, R018I, R018N, R018Q, R018S, R018V, R018W, S019A, S019C, S019F, S019H, S019K, S019L, S019M, S019N, S019R, S019T, S019V, S019W, P021 L, F022Y, S023C, S023D, S023F, S023G, S023H, S023I, S023K, S023L, S023M, S023P, S023T, S023Y, V024F, V024I, V024L, V024M, V024T, V024W, V024Y, S025G, S025K, S025L, S025M, S025Q, S025R, S025T, S025V, E026G, E026L, E026N, N028A, N028E, N028F, N028G, N028H, N028L, N028M, N028S, N028V, N028W, S030A, S030E, S030N, S030P, S030T, R031 K, L032G, L032H, L032I, L032K, L032M, L032N, L032R, L032S, L032T, L032Y, S033A, S033D, S033H, S033K, S033M, S033N, S033V, S035D, S035H, S035L, S035N, S035R, S035Y, T041 K, Y044F, R046A, R046E, R046K, R046L, R046S, R046V, E047D, N048A, N048C, N048D, N048E, N048G, N048H, N048I, N048K, N048L, N048M, N048P, N048Q, N048R, N048Y, N049A, N049D, N049G, N049M, N049Q, T050L, Y051 F, A053G, S057A, S057V, Y060L, Y060V, T061A, T061 G, T061 S, T061Y, G062T, T063D, T063H, T063K, T063N, E064M, E064V, E064W, E064Y, A065N, A065Q, A065R, A065S, S066D, S066T, I067L, A068Q, E072A, E072L, E072M, E072Q, E072S, I074V, I082F, I082M, T083C, D085N, I087C, I087M, T088N, T088S, T089H, T089I, T089K, T089N, T089Q, T089S, L090A, L090F, L090M, L090W, L090Y, Q092A, Q092L, E098Q, N 101A, N101 D, N101 Q, A102H, L104V, N 105H, H106W, I108C, I 108T, 1108V, N109E, N109F, N 109H, N109K, N109M, N 109S, N109Y, R1 10A, R1 10C, R1 10E, R1 10F, R1 10G, R1 10L, R1 10M, R1 10N, R1 10Q, R1 10S, A1 1 1T, S1 13A, S1 13F, S1 13G, S1 13K, S1 13L, S1 13N, S1 13Q, S1 13T, S1 13V, S1 13Y, T1 14A, T1 14C, T1 14H, T1 141, T1 14K, T1 14M, T1 14N, T1 14Q, T1 14R, T1 14S, T1 14V, R1 16S, S1 17D, S1 17E, S1 17G, Sl 171 , S121A, S122G, S122H, S122K, S122N, R138E, R138Q, S141 Q, Q142E, Q142I, Q142L, Q142M, P144K, P151 G, L152M, L157F, L157M, L157R, L157V, N158H, N160E, S162E, S163E, S163N, S163T, T165K, T165M, T165Q, T165R, T165Y, I 171 F, G172A, L175A, L175H, L175S, T177K, T177R, T177V, V181 P, A182H, A182N, A182Q, A182S, T183A, T183I, T183K, T183R, T183Y, H 184F, K186R, P187K, P187Q, P187T, S195D, S195E, S195H, S195N, S195T, E202G, E202I, E202L, E202Q, G205Q, T207N, F209W, N212A, N212Y, 1213L, 1213M, G219Q, Y221 F, S222C, S222T, V230Q, N232D, N232G, N232K, N232L, T234A, T234D, T234E, T234I, T234Q, T234S, T237N, T237S, R245A, R245C, R245E, R245G, R245H, R245K, R245L, R245M, R245Q, R245S, R245T, D246G, D246I, D246K, D246Q, D246S, D246V, G247K, L248A, L248D, L248E, L248K, L248M, L248Q, L248S, F249C, F249H, F249L, F249M, F249Q, F249R, F249S, F249T, F249V, F249Y, E251 G, V252I, E254C, R256C, R256D, R256E, R256H, R256M, R256Q, R256T, R256V und R256W, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 C, A001 P, A001 Q, Y004W, E005W, N009C, N009F, N009G, N009I, D012V, A013H, A013I, R018F, R018M, R018P, R018T, S019G, S019I, S019Q, S019Y, S023R, S023V, V024K, S025F, S025I, L032D, L032V, S033E, S033F, S033I, S033L, S033R, S035A, S035M, Y043W, R046C, R046F, R046H, R046M, E047C, E047H, N048S, N048V, N048W, N049C, T050Q, V054I, T061 H, T061 I, T061V, T063S, E064G, E064I, E064L, E064N, A065C, A065L, A065M, I067V, A068H, A068K, A068T, E072K, E072N, R073F, T083I, I087Y, T089M, T089W, L090K, L090V, Q092K, Q092M, Q092T, S095C, E098D, E098T, N 101W, A102C, N105Y, M107V, I 108Q, R1 10K, R1 10T, S1 13W, T1 14P, S1 17A, S1 17C, S1 17M, S1 17N, S1 17P, S1 17T, S121 G, S121 K, S121 N, S121 P, S121 R, S121T, S122A, S122C, S122D, S122E, S122R, S122T, M127S, R138T, Q142R, Q142V, A149C, P151T, L157E, L157P, N158V, S163D, S163M, T165L, T165V, D174N, L175K, T177H, T177Q, T177Y, 1178V, V181T, T183C, T183F, T183M, T183N, P187L, P187S, S194M, S194Q, S194T, S195C, S195W, S197E, S197K, E202C, G205N, P21 1V, N212C, I213A, I217T, G219T, N232A, N232E, N232F, N232H, N232Y, T234K, T234L, T234N, T234R, T234V, Q238E, Q238P, Q238R, F239Y, D246E, D246M, D246R, D246W, L248C, L248P, L248V, F249W, G250K, G250R, E253M, E254K und R256K, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe N002A, N002L, P003A, P003E, P003G, P003H, P003I, P003K, P003L, P003M, P003Q, P003S, P003T, P003V, T01 1 H, D012E, D012S, A013G, A013P, L014Y, R018L, S019E, F022E, F022M, V024C, V024Q, E026P, N028C, N028D, L032F, L032P, S033Y, T041 R, I042V, Y043K, E047F, E047L, E047M, E047P, E047S, E047V, E047W, N049E, N049F, N049L, N049Y, T050E, T050V, Y060G, Y060M, G062Q, G062S, T063A, T063G, E064T, A065D, A065E, A065H, A065T, E072D, E072V, E072W, D085C, I087E, T088G, T089Y, L090R, Q092V, N101 S, N105I, N105K, N105L, N105R, H106F, I 108M, I 108N, N 109R, S1 12G, S1 12P, S1 12T, T1 14F, T1 14G, T1 14Y, R1 16I, R1 16K, R1 16T, R1 16V, S1 17H, D120L, S122L, S122Q, S122V, S122Y, L124A, L124M, L124P, M127V, G135A, S136T, R138A, S141A, Q142D, Q142K, Q142N, S163A, S163G, T165H, 1171V, T177M, T177N, A182C, K186L, P187I, N190H, N190Y, S194C, S197Y, F209D, F209N, N212S, 1217V, V223T, V230A, T234G, T234M, T234Y, Y236F, Q238C, Q238D, Q238G, Q238M, Q238S, R245N, R245P, D246Y, G247R, L248R, F249A, F249E und R256N, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(ix) durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe
N009W, D012I, D012L, A013R, A017N, R018Y, P021 D, P021T, P021Y, F022H, F022K, S023N, V024N, S025H, S025Y, E027N, S030C, S030K, R031 Q, R031V, S033C, S035C, S035W, I042Q, P045A, P045T, R046P, R046Y, E047Q, A053L, A053V, I056M, S057T, P058G, Y060A, Y060F, Y060S, Y060W, T061 C, T061 K, T061 L, T061 N, T061 Q, T061 R, T061 W, G062D, T063E, T063P, E064H, E064S, E072F, E072G, E072R, R073I, R073T, R073V, R073W, I074A, I074C, I074G, I074T, A075S, G078A, G078S, F079G, V081 G, I082G, I082K, I082Q, T083M, T083N, D085G, T086G, T086N, I087Q, I087S, I087T, I087W, T088C, L090C, L090D, L090G, L090H, L090N, D091 E, D091Y, Q092C, Q092P, S095A, S095L, S095V, S095Y, R096Y, A102Y, N105C, N105F, N105V, N 105W, M107S, I108K, I108P, N109Q, R1 10Y, S1 12F, S1 12I, S1 12L, S1 12W, S1 12Y, S1 13M, V126T, M131 G, M131 I, M131 S, M131V, S136C, R138D, R138M, Q142A, A149I, T153N, L157D, L157G, N158C, N158D, N158I, N158W, K159T, S163C, T177C, T177E, T177S, I178F, I 178Y, A182G, A182Y, T183L, P187C, N 190S, S195F, S195Q, S195Y, D204Y, A210S, K216N, K216Q, K216Y, G219L, N232R, N232W, R245I, L248F, F249D, G250S, G250T, E251 Q, E253D und E253P, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(x) durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 255, 256, 257, 258, 259 oder 260 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
Die erfindungsgemäßen Esterasen können (a) eine Aminosäuresequenz umfassen, die ausgewählt ist aus denen, die in SEQ ID NOs:1-5 angegeben sind oder daraus besteht; oder (b) aus einer Esterase, die die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:5 umfasst, als Ausgangsmolekül erhältlich sein durch
(i) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 1 , 9, 13, 19, 23, 25, 26, 28, 32, 33, 46, 47, 48, 61 , 64, 89, 90, 92, 105, 1 13, 1 14, 157, 183, 204, 234, 245, 246, 249 und 253 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(ii) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 3, 12, 24, 30, 35, 49, 60, 63, 65, 72, 73, 87, 95, 98, 108, 109, 1 10, 1 12, 1 17, 121 , 122, 131 , 142, 151 , 163, 165, 174, 175, 177, 182, 187, 194, 195, 212, 232, 238, 248 und 256 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 4, 5, 1 1 , 14, 17, 21 , 22, 31 , 43, 50, 53, 57, 62, 68, 74, 78, 82, 83, 85, 88, 101 , 102, 106, 107, 1 16, 124, 126, 138, 141 , 149, 152, 153, 158, 190, 197, 202, 207, 209, 216, 219 und 250 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 2, 27, 41 , 42, 44, 45, 51 , 54, 56, 58, 66, 67, 75, 79, 81 , 86, 91 , 96, 104, 1 1 1 , 120, 125, 127, 135, 144, 156, 159, 160, 162, 171 , 172, 181 , 184, 186, 188, 205, 210, 21 1 , 217, 221 , 222, 223, 230, 236, 237, 239, 247, 251 , 252 und 254 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 D, A001 M, Y004N, N009D, N009L, N009M, N009Q, N009Y, A013F, A013Q, A013Y, S023A, S023E, S023Q, S025A, S025C, S025D, S025E, S025N, E026A, E026C, E026F, E026H, E026I, E026K, E026M, E026Q, E026R, E026S, E026T, E026V, E026W, E026Y, N028I, N028K, N028P, N028Q, N028T, N028Y, S030D, L032A, L032E, L032Q, S033Q, S035E, S035I, S035Q, S035V, Y043R, R046D, R046I, R046N, R046Q, R046T, S057C, Y060C, T061 D, T061 M, T061 P, G062A, T063C, E064A, E064K, E064Q, E064R, A065G, A065K, A065Y, E072H, R073L, R073Y, T083V, D085E, I087L, T088D, T088E, T089A, T089C, T089D, T089E, T089G, T089L, T089P, T089V, L090E, L090Q, L090S, L090T, Q092D, Q092E, Q092G, Q092H, Q092N, Q092S, Q092Y, S095D, S095E, S095Q, N101 E, N105A, N105D, N105E, N105G, N105M, N105Q, N105S, M107L, I 108L, I108Y, N109T, R1 10H, S1 13C, S1 13D, S1 13E, S1 13H, S1 13P, T1 14D, T1 14E, S1 17Q, A125S, V126A, M131A, M131 F, M131 L, S141 E, P151A, P151 C, P151 I, P151 L, P151 S, P151V, L152I, T153C, T153L, H156D, L157A, L157C, L157H, L157I, L157K, L157N, L157Q, L157S, L157T, L157W, L157Y, N158E, N 160D, D174A, D174C, D174E, D174G, D174H, D174K, D174M, D174Q, D174R, D174S, D174T, D174V, L175C, L175D, L175E, L175G, L175N, L175Q, T177D, A182D, A182E, T183D, T183E, T183H, T183Q, T183S, H184Y, P187A, P187E, P187M, P187V, F188M, N190E, S194D, S194E, S197A, E202V, D204A, D204C, D204E, D204F, D204G, D204H, D204I, D204K, D204L, D204M, D204N, D204P, D204Q, D204R, D204S, D204T, D204V, D204W, T207D, T207G, F209C, F209E, A210T, N212I, N212L, N212M, N212T, N212V, G219A, N232C, N232M, T234H, R245V, D246A, D246C, D246H, D246P, D246T, L248I, F249G, F249K, F249N, F249P, G250P, E253A, E253C, E253F, E253G, E253H, E253I, E253K, E253L, E253N, E253Q, E253R, E253S, E253T, E253V, E253W, E253Y, R256I und R256L, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 E, A001 F, A001 G, A001 H, A001 K, A001 L, A001 N, A001 R, A001 S, A001T, A001V, A001W, A001Y, Y004F, E005A, E005L, N009A, N009E, N009H, N009S, N009T, N009V, T01 1 N, D012A, D012H, A013C, A013D, A013E, A013K, A013L, A013M, A013S, A013T, L014F, L014I, L014M, A017G, A017K, A017M, A017Q, A017S, S019A, S019C, S019F, S019H, S019K, S019L, S019M, S019N, S019R, S019T, S019V, S019W, P021 L, F022Y, S023C, S023D, S023F, S023G, S023H, S023I, S023K, S023L, S023M, S023P, S023T, S023Y, V024F, V024I, V024L, V024M, V024T, V024W, V024Y, S025G, S025K, S025L, S025M, S025Q, S025R, S025T, S025V, E026G, E026L, E026N, N028A, N028E, N028F, N028G, N028H, N028L, N028M, N028S, N028V, N028W, S030A, S030E, S030N, S030P, S030T, R031 K, L032G, L032H, L032I, L032K, L032M, L032N, L032R, L032S, L032T, L032Y, S033A, S033D, S033H, S033K, S033M, S033N, S033V, S035D, S035H, S035L, S035N, S035R, S035Y, T041 K, Y044F, R046A, R046E, R046K, R046L, R046S, R046V, E047D, N048A, N048C, N048D, N048E, N048G, N048H, N048I, N048K, N048L, N048M, N048P, N048Q, N048R, N048Y, N049A, N049D, N049G, N049M, N049Q, T050L, Y051 F, A053G, S057A, S057V, Y060L, Y060V, T061A, T061 G, T061 S, T061Y, G062T, T063D, T063H, T063K, T063N, E064M, E064V, E064W, E064Y, A065N, A065Q, A065R, A065S, S066D, S066T, I067L, A068Q, E072A, E072L, E072M, E072Q, E072S, I074V, I082F, I082M, T083C, D085N, I087C, I087M, T088N, T088S, T089H, T089I, T089K, T089N, T089Q, T089S, L090A, L090F, L090M, L090W, L090Y, Q092A, Q092L, E098Q, N 101A, N101 D, N101 Q, A102H, L104V, N 105H, H106W, I108C, I 108T, 1108V, N109E, N109F, N 109H, N109K, N109M, N 109S, N109Y, R1 10A, R1 10C, R1 10E, R1 10F, R1 10G, R1 10L, R1 10M, R1 10N, R1 10Q, R1 10S, A1 1 1T, S1 13A, S1 13F, S1 13G, S1 13K, S1 13L, S1 13N, S1 13Q, S1 13T, S1 13V, S1 13Y, T1 14A, T1 14C, T1 14H, T1 141, T1 14K, T1 14M, T1 14N, T1 14Q, T1 14R, T1 14S, T1 14V, R1 16S, S1 17D, S1 17E, S1 17G, Sl 171 , S121A, S122G, S122H, S122K, S122N, R138E, R138Q, S141 Q, Q142E, Q142I, Q142L, Q142M, P144K, P151 G, L152M, L157F, L157M, L157R, L157V, N158H, N160E, S162E, S163E, S163N, S163T, T165K, T165M, T165Q, T165R, T165Y, I 171 F, G172A, L175A, L175H, L175S, T177K, T177R, T177V, V181 P, A182H, A182N, A182Q, A182S, T183A, T183I, T183K, T183R, T183Y, H 184F, K186R, P187K, P187Q, P187T, S195D, S195E, S195H, S195N, S195T, E202G, E202I, E202L, E202Q, G205Q, T207N, F209W, N212A, N212Y, G219Q, Y221 F, S222C, S222T, V230Q, N232D, N232G, N232K, N232L, T234A, T234D, T234E, T234I, T234Q, T234S, T237N, T237S, R245A, R245C, R245E, R245G, R245H, R245K, R245L, R245M, R245Q, R245S, R245T, D246G, D246I, D246K, D246Q, D246S, D246V, G247K, L248A, L248D, L248E, L248K, L248M, L248Q, L248S, F249C, F249H, F249L, F249M, F249Q, F249R, F249S, F249T, F249V, F249Y, E251 G, V252I, E254C, R256C, R256D, R256E, R256H, R256M, R256Q, R256T, R256V und R256W, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 C, A001 P, A001 Q, Y004W, E005W, N009C, N009F, N009G, N009I, D012V, A013H, A013I, S019G, S019I, S019Q, S019Y, S023R, S023V, V024K, S025F, S025I, L032D, L032V, S033E, S033F, S033I, S033L, S033R, S035A, S035M, Y043W, R046C, R046F, R046H, R046M, E047C, E047H, N048S, N048V, N048W, N049C, T050Q, V054I, T061 H, T061 I, T061V, T063S, E064G, E064I, E064L, E064N, A065C, A065L, A065M, I067V, A068H, A068K, A068T, E072K, E072N, R073F, T083I, I087Y, T089M, T089W, L090K, L090V, Q092K, Q092M, Q092T, S095C, E098D, E098T, N 101W, A102C, N105Y, M107V, I108Q, R1 10K, R1 10T, S1 13W, T1 14P, S1 17A, S1 17C, S1 17M, S1 17N, S1 17P, S1 17T, S121 G, S121 K, S121 N, S121 P, S121 R, S121T, S122A, S122C, S122D, S122E, S122R, S122T, M127S, R138T, Q142R, Q142V, A149C, P151T, L157E, L157P, N158V, S163D, S163M, T165L, T165V, D174N, L175K, T177H, T177Q, T177Y, V181T, T183C, T183F, T183M, T183N, P187L, P187S, S194M, S194Q, S194T, S195C, S195W, S197E, S197K, E202C, G205N, P21 1V, N212C, I217T, G219T, N232A, N232E, N232F, N232H, N232Y, T234K, T234L, T234N, T234R, T234V, Q238E, Q238P, Q238R, F239Y, D246E, D246M, D246R, D246W, L248C, L248P, L248V, F249W, G250K, G250R, E253M, E254K und R256K, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe N002A, N002L, P003A, P003E, P003G, P003H, P003I, P003K, P003L, P003M, P003Q, P003S, P003T, P003V, T01 1 H, D012E, D012S, A013G, A013P, L014Y, S019E, F022E, F022M, V024C, V024Q, E026P, N028C, N028D, L032F, L032P, S033Y, T041 R, I042V, Y043K, E047F, E047L, E047M, E047P, E047S, E047V, E047W, N049E, N049F, N049L, N049Y, T050E, T050V, Y060G, Y060M, G062Q, G062S, T063A, T063G, E064T, A065D, A065E, A065H, A065T, E072D, E072V, E072W, D085C, I087E, T088G, T089Y, L090R, Q092V, N101 S, N105I, N105K, N105L, N105R, H106F, I108M, I 108N, N109R, S1 12G, S1 12P, S1 12T, T1 14F, T1 14G, T1 14Y, R1 16I, R1 16K, R1 16T, R1 16V, S1 17H, D120L, S122L, S122Q, S122V, S122Y, L124A, L124M, L124P, M127V, G135A, R138A, S141A, Q142D, Q142K, Q142N, S163A, S163G, T165H, 1171V, T177M, T177N, A182C, K186L, P187I, N190H, N190Y, S194C, S197Y, F209D, F209N, N212S, 1217V, V223T, V230A, T234G, T234M, T234Y, Y236F, Q238C, Q238D, Q238G, Q238M, Q238S, R245N, R245P, D246Y, G247R, L248R, F249A, F249E und R256N, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe N009W, D012I, D012L, A013R, A017N, P021 D, P021T, P021Y, F022H, F022K, S023N, V024N, S025H, S025Y, E027N, S030C, S030K, R031 Q, R031V, S033C, S035C, S035W, I042Q, P045A, P045T, R046P, R046Y, E047Q, A053L, A053V, I056M, S057T, P058G, Y060A, Y060F, Y060S, Y060W, T061 C, T061 K, T061 L, T061 N, T061 Q, T061 R, T061W, G062D, T063E, T063P, E064H, E064S, E072F, E072G, E072R, R073I, R073T, R073V, R073W, I074A, I074C, I074G, I074T, A075S, G078A, G078S, F079G, V081 G, I082G, I082K, I082Q, T083M, T083N, D085G, T086G, T086N, I087Q, I087S, I087T, I087W, T088C, L090C, L090D, L090G, L090H, L090N, D091 E, D091Y, Q092C, Q092P, S095A, S095L, S095V, S095Y, R096Y, A102Y, N105C, N105F, N105V, N105W, M107S, I 108K, I 108P, N 109Q, R1 10Y, S1 12F, S1 12I, S1 12L, S1 12W, S1 12Y, S1 13M, V126T, M131 G, M131 I, M131 S, M131V, R138D, R138M, Q142A, A149I, T153N, L157D, L157G, N158C, N158D, N158I, N158W, K159T, S163C, T177C, T177E, T177S, A182G, A182Y, T183L, P187C, N190S, S195F, S195Q, S195Y, D204Y, A210S, K216N, K216Q, K216Y, G219L, N232R, N232W, R245I, L248F, F249D, G250S, G250T, E251 Q, E253D und E253P, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder (x) Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 255, 256, 257, 258, 259 oder 260 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Esterase die Aminosäuren R18 und S136 an den Positionen, die den Positionen 18 und 136 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, umfasst.
In verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Esterasen können auch die Positionen 18, 163, 178 und/oder 213 variiert werden, solange die Esterase entweder
(i) die Aminosäuren R18 und S136 an den Positionen, die den Positionen 18 und 136 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweist;
(ii) die Aminosäuren R18, S136 und V178 an den Positionen, die den Positionen 18, 136 und 178 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweist;
(iii) die Aminosäuren R18, S136 und S213 an den Positionen, die den Positionen 18, 136 und 213 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweist; oder
(iv) die Aminosäuren V178 und S213 an den Positionen, die den Positionen 178 und 213 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweist.
Bevorzugte Substitutionen in diesen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Esterasen sind:
(i) ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus R018E, R018H, S136A, S136V, I178L, I213C, I213E, I213F, I213H, I213K, I213Q, I213R, I213S und I213Y; und/oder
(ii) ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus R018A, R018G, R018I, R018N, R018Q, R018S, R018V, R018W, I213L und I213M; und/oder (iii) ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus R018F, R018M, R018P, R018T, 1178V und I213A; und/oder
(iv) ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus R018L und S136T;
und/oder
(v) ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus R018Y, S136C, I 178F und I178Y.
Die beschriebenen ein- oder mehrfachen Aminosäuresubstitutionen können konservative Aminosäuresubstitutionen sein. Der Begriff "konservative Aminosäuresubstitution" bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, l=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T,
G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
In Ausführungsformen in denen die Esterase erhältlich ist durch Fragmentierung, Deletions-, Inser- tions- oder Substitutionsmutagenese, ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die hydrolytische Aktivität verloren oder vermindert wird. Ferner kann durch derartige Fragmentierung, Deletions-, Inser- tions- oder Substitutionsmutagenese beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Mutagenese ihre hydrolytische Aktivität, d.h. ihre hydrolytische Aktivität entspricht mindestens derjenigen des Ausgangsenzyms, d.h. in einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die hydrolytische Aktivität mindestens 80, vorzugsweise mindestens 90 % der Aktivität des Ausgangsenzyms. Auch weitere Substitutionen können vorteilhafte Wirkungen zeigen. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
Sofern in den hierin beschriebenen Ausführungsformen auf Aminosäure-Positionen Bezug genommen wird, bezieht sich diese Angabe auf die Positionen in einem Molekül, die den entsprechenden Positionen der Esterase gemäß SEQ ID NO. 1 in einem Alignment zugeordnet sind. Weiterhin richtet sich die Zuordnung der Positionen nach dem reifen (maturen) Protein. Diese Zuordnung ist insbesondere auch anzuwenden, wenn die Aminosäuresequenz einer hierin beschriebenen Esterase eine höhere Zahl von Aminosäurenresten umfasst als die Esterase gemäß SEQ ID NO. 1. Ausgehend von den genannten Positionen in der Aminosäuresequenz der Esterase sind die Veränderungspositionen in einer hierin beschriebenen Esterase diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment zugeordnet sind. Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, insbesondere Substitutionen, der Esterase gemäß SEQ ID NO:1 , die übertragen auf homologe Positionen der hierin beschriebenen Esterasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Esterase vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, sind insbesondere die oben angegebenen Positionen, zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO. 1 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 .
Besonders bevorzugt sind jeweils Substitutionen an den unter (i) angegebenen Positionen bzw. die unter (v) angegebenen konkreten Substitionen. Als nächstes folgen die Substitutionen an den unter (ii) angegebenen Positionen bzw. die unter (vi) angegebenen konkreten Substitionen. Danach folgen Substitutionen an den unter (iii) angegebenen Positionen bzw. die unter (vii) angegebenen konkreten Substitionen. Schließlich folgen Substitutionen an den unter (iv) angegebenen Positionen bzw. die unter (viii) und (ix) angegebenen konkreten Substitionen. Es können natürlich auch Substitutionen an einer Kombination von Positionen erfolgen, die unter (i)-(iv) angegeben sind. Ebenfalls können Substitutionen aus den unter (v)-(ix) angegebenen Listen beliebig kombiniert werden.
Vorteilhaft sind insbesondere beispielsweise Substitutionen, die denen entsprechen, die in der Internationalen Patentveröffentlichung WO2013/033318 A1 beschrieben sind, sofern die entsprechend homologen Positionen in einer hierin beschriebenen Esterase nicht schon natürlicherweise von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden. Die Gesamtheit der Offenbarung dieser Patentschrift ist hierin durch Bezugnahme eingeschlossen, einschließlich aller Zeichnungen und Sequenzen.
Im Rahmen der Erfindung besonders bevorzugt sind die Esterasen, die an den Positionen, die den Positionen 178 und/oder 213 in SEQ ID NO: 1 entsprechen, die Aminosäuresubstitutionen 1178V und/oder 1213S aufweisen. Es wurde gefunden, dass diese beiden Positionen an der Bindung des Substrats PET beteiligt sind, so dass entsprechende Substitutionen die Leistung der Esterase im Hinblick auf Substratbindung und Hydrolyse verbessern können. Besonders bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung betreffen daher die oben beschriebenen Esterasen, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens 70 % vorzugsweise mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist und die die Aminosäuren V178 und S213 an den Positionen, die den Positionen 178 und 213 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen, aufweisen. In verschiedenen Ausführungsformen enthalten diese Esterasen zusätzlich eine oder mehrere der oben beschriebenen Substitutionen.
Alle Ausführungsformen und Sachverhalte, die oben im Zusammenhang mit den Esterasen, den erfindungsgemäßen Verfahren oder Verwendungen beschrieben wurden, sind auch auf die jeweiligen anderen Aspekte der Erfindung anwendbar. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Esterase, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer bzw. deren Verwendung oder Verfahren zu deren Verwendung. Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Wasch prozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit die Leistung verbessert wird. Grundsätzlich kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Mutationen des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im An- schluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte erfordern. Beispiele für hierfür geeignete Sequenzveränderungen sind vorstehend genannt. Weitere geeignete Sequenzveränderungen sind aus dem Stand der Technik bekannt. So können Esterasen beispielsweise auch dadurch stabilisiert werden, dass einer oder mehrere Tyrosin-Reste gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
Weitere Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:
- Veränderung der Bindung von Metallionen;
- Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf oder an der Oberfläche des Proteins bewirken;
- Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird, da mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Esterase wie vorstehend beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist bzw. deren Verwendung oder Verfahren zu deren Verwendung. Eine Esterase mit einer solchen Veränderung wird als Derivat bezeichnet, d.h. die Esterase ist derivatisiert.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein exprimiert. Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Car- boxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein, das beispielsweise über bifunktionelle che- mische Verbindungen an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden wird. Ebenso ist unter Deriva- tisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität oder die enzymati- sche Aktivität beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergenizität und/oder Immu- nogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern.
Unter Derivaten eines hierin beschriebenen Proteins können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Esterasen mit Esterase-Inhibitoren ist diesbezüglich möglich.
Betreffend alle vorstehend beschriebenen Esterasen beziehungsweise Esterasevarianten und/oder Derivate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung diejenigen besonders bevorzugt, deren Stabilität und/oder Aktivität mindestens derjenigen der Esterase gemäß einer der SEQ ID NOs. 1-3 entspricht, wobei die Aktivität sich auf die PET-Hydrolyse-Aktivität bezieht, die wie in den Beispielen beschrieben bestimmt werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Esterase codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonie- rungsvektor oder ein Expressionsvektor.
Hierbei kann es sich DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Amino- säuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Esterasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Verwendung. Unter Codon-Verwendung wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Ma- niatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laboratory Press, bekannt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachromosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom oder chromosomale DNA integrieren. Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopro- pyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac- Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Esterase beinhaltet, insbesondere eine, die die Esterase in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d.h. Nukleinsäure-Teile o- der -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische o- der eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremdproteine. Bevorzugte erfindungsgemäße Wirtszellen sezernieren das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium. Ferner können die Esterasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zucker- molekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können die Esterase funktionell beeinflussen.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren oder Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.
Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien so ausgestaltet werden, dass sie die exprimierten Proteine nicht nur in den periplasmatischen Raum, sondern in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Verwendung verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist.
Erfindungsgemäße Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren. Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von E- scherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloli- quefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clau- sii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas mal- tophilia.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu proka- ryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen oder Lipasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in üblicher weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann. Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Esterasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Esterase umfassend
a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle; und
b) Isolieren der Esterase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Esterase. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Esterase beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse beziehungsweise Trockenmasse und/oder insbesondere in der Aktivität der interessierenden Esterase erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.
Die hergestellte Esterase kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren ist gegenüber einer Isolation der Esterase aus der Wirtszelle, d.h. einer Produktaufbereitung aus der Zellmasse (Trockenmasse) bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionsmarkern oder -mechanismen und/oder Transportsystemen, damit die Wirtszellen die Esterase in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Esterase aus der Wirtszelle, d.h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung.
Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Esterasen herzustellen.
Die Mittel, die eine Esterase wie vorstehend beschrieben enthalten, sind vorzugsweise Mittel zur Behandlung und/oder Reinigung und/oder Pflege von Textilien oder Wäsche, insbesondere ein Waschmittel, ein Waschhilfsmittel oder ein Textilpflegemittel. Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Waschmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Handwäsche. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Zu den Waschmitteln im Rahmen der Erfindung zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Ferner zählen zu Waschmitteln im Rahmen der Erfindung auch Textilvor- und Nachbehandlungsmittel, also solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, und auch solche Mittel, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u.a. die Weichspüler gerechnet.
Die hierin beschriebenen und verwendeten Mittel, die als pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer erfindungsgemäßen Esterase alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die hierin beschriebenen und verwendeten Mittel können insbesondere Tenside, Builder (Gerüststoffe), Persauerstoffverbindungen oder Bleichaktivatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH- Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
Vorteilhafte Inhaltsstoffe der hierin beschriebenen und verwendeten Mittel sind offenbart in der internationalen Patentanmeldung WO2009/121725, dort beginnend auf Seite 5, vorletzter Absatz, und endend auf Seite 13 nach dem zweiten Absatz. Auf diese Offenbarung wird ausdrücklich Bezug genommen und der dortige Offenbarungsgehalt in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen.
Ein hierin beschriebenes oder verwendetes Mittel enthält die Esterase vorteilhafterweise in einer Menge von 2μg bis 20mg, vorzugsweise von 5μg bis 17,5mg, besonders bevorzugt von 2C^g bis 15mg und ganz besonders bevorzugt von 5C^g bis 10mg pro g des Mittels. In verschiedenen Ausführungsformen kann die Esterase in dem Mittel in einer Menge von 1 x 10~8 bis 5 Gew.-%, 1 x 10~7 bis 3 Gew.-%, von 0,00001 bis 1 Gew.-%, von 0,00005 bis 0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% bezogen auf aktives Protein enthalten sein.
Ferner kann die in dem Mittel enthaltene Esterase, und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels, mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Esterase undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Weiterhin kann auch das Mittel selbst in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es
(a) in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder
(b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt, und/oder
(c) als Einkomponentensystem vorliegt, oder
(d) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.
Diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen hierin beschriebener und verwendeter Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Zu den festen Darreichungsformen des Mittels zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt.
Die hierin beschriebenen und verwendeten Mittel, insbesondere Waschmittel, können ausschließlich eine Esterase enthalten. Alternativ können sie auch weitere hydrolytische Enzyme oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Eine weitere Ausführungsform stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, ß- Glucosidase, Pektinase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie deren Gemische. Weitere Enzyme sind in dem Mittel vorteilhafterweise jeweils in einer Menge von 1 x 10 8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein enthalten. Zunehmend bevorzugt ist jedes weitere Enzym in einer Menge von 1 x 10~7-3 Gew.-%, von 0,00001-1 Gew.-%, von 0,00005-0,5 Gew.-%, von 0,0001 bis 0,1 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,0001 bis 0,05 Gew.-% in hierin beschriebenen und verwendeten Mitteln enthalten, bezogen auf aktives Protein. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte, beispielsweise bei der Reinigungsleistungen gegenüber bestimmten Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Leistung gegenseitig. Ganz besonders bevorzugt liegt ein solches Synergismus vor zwischen der erfindungsgemäß enthaltenen Esterase und einem weiteren Enzym eines erfindungsgemäßen Mittels, darunter insbesondere zwischen der genannten Esterase und und/oder einer Mannanase und/oder einer Cellulase und/oder einer Pektinase. Bevorzugt ist die Kombination einer hierin beschriebenen Esterase mit einer Cellulase in den hierin beschriebenen und verwendeten Mitteln, Verwendungen und Verfahren, da so auf PET/Cellulose-Mischgeweben und/oder gemischten Wäscheposten beide Arten von Faserpflege einwirken können.
Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Behandlung oder Pflege von Textilien, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein hierin beschriebenes Mittel angewendet wird, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine hierin beschriebene Esterase katalytisch aktiv wird, insbesondere derart, dass die Esterase in einer Menge von 4C^g bis 4g, vorzugsweise von 5C^g bis 3g, besonders bevorzugt von 10C^g bis 2g und ganz besonders bevorzugt von 20C^g bis 1g eingesetzt wird.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren bevorzugt sind. Verfahren zur Behandlung, Pflege und/oder Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene pflege- oder reinigungsaktive Substanzen auf das Textil aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Textil in sonstiger Weise mit einem solchen Mittel oder einer Lösung oder Verdünnung dieses Mittels behandelt wird. Alle denkbaren Wasch- oder Textilbehandlungs- oder Textil pfleg everfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines hierin beschriebenen Mittels oder einer hierin beschriebenen Esterase bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für hierin beschriebene und verwendete Esterasen und sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren und Verwendungen gilt.
Da erfindungsgemäße Esterasen natürlicherweise bereits eine hydrolytische Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen wie beispielsweise in blo- ßem Puffer, kann ein einzelner und/oder der einzige Schritt eines solchen Verfahrens darin bestehen, dass gewünschtenfalls als einzige aktive Komponente eine erfindungsgemäße Esterase mit einem Textil oder Wäschestück in Kontakt gebracht wird, bevorzugt in einer Pufferlösung oder in Wasser. Dies stellt eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Esterase aktiv wird. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit synthetischen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Polyestern, insbesondere PET.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch den weiteren Aspekt, die hierin beschriebenen Esterasen zum Polyesterabbau in Abwässern oder anderen mit Polyester, insbesondere PET in Nanopar- tikelform, belasteten Umgebungen, wie Gewässern, Böden, Deponien, etc. einzusetzen.
Generell sind alle oben im Kontext mit Esterasen und den diesen enthaltenden Mitteln beschriebenen Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen auch in den Verfahren und Verwendungen der Erfindung anwendbar. Das bedeutet beispielsweise, dass die Esterasen, die hierin beschrieben werden, bei der Verwendung zur Hydrolyse von Polyestern, insbesondere PET, oder in Verfahren zum Verbessern des Tragekomforts und/oder Vermindern von Pilling von Polyester- haltigen Textilien, insbesondere PET-haltigen Textilien, oder in Verfahren zum Hydrophilieren von PET-Fasern und/oder Abbau von PET-Polymer aus Textilfasern in allen oben beschriebenen Formulierungen und/oder auf alle oben beschrieben Arten verwendet werden können. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die erfindungsgemäße Verwendung bzw. die erfindungsgemäßen Verfahren gilt.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis„Molecular cloning : a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1 : Herstellung der Esterasen
Ausgehend von einer Esterase, die eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 aufwies, wurde eine erfindungsgemäße Esterase-Variante durch ortsgerichtete („site-directed") Mutagenese in der für die Esterase codierenden Nukleinsäure mittels„QuickChange® I I Site-directed- Mutagenese-Kit" (Strategene) hergestellt. Hierbei wurden die Codons für die angegebenen Aminosäurepositionen (178, 213) derart verändert, so dass bei der Translation bezogen auf die Aminosäuresequenz eine Substitution der Aminosäuren wie angegeben erfolgte. Die Expression der Esterase-Variante erfolgte in fachüblicher Art- und Weise durch Transformation von E.coli BL21 (DE3) mit einem entsprechenden Expressionsvektor und nachfolgender Kultur der die Esterase-Variante exprimierenden Transformanden. Die Esterasen wurden mittels
Chromatographie aus den entsprechenden Kulturen aufgereinigt.
Referenz-Esterase: Esterase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 .
Esterase-Variante 1178V: Esterase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO . 1 mit der Aminosäuresubstitution 1178V in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 2).
Esterase-Variante 1213S: Esterase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO . 1 mit der Aminosäuresubstitution I213S in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 (SEQ ID NO. 3).
Beispiel 2: Charakterisierung der hergestellten Esterase(-Varianten)
Die Aktivität der Esterasen wurden mit zwei Methoden bestimmt. Mittels einer turbidimetrischen Methode wurde die enzymatische Hydrolyse von Polycaprolacton (PCL) Nanopartikeln gemessen. Die PCL-Nanopartikel wurden hierzu mittels einer Präzipitationsmethode hergestellt. 100 mg PCL wurden in 10 mL Aceton bei 50°C gelöst und anschließend unter starkem Rühren tröpfchenweise in 100 mL ultrareines H2O pipettiert. Die PCL-Suspension wurde durch einen Papierfilter filtriert und das organische Lösungsmittel unter dem Abzug entfernt. Für die Bestimmung des enzymati- schen Abbaus von PCL Nanopartikeln wurden 100 [iL einer PCL-Suspension (1 mg/mL) in jedem Well einer Mikrotiterplatte vorgelegt und mit Tris-Puffer (0.5 M, pH 8,5) oder Enzymlösungen im selben Tris-Puffer bis zu einer Gesamtvolumen von 200 [iL aufgefüllt. Die PCL Hydrolyse wurde im Plattenleser bei 600 nm und 50°C über einen Zeitraum von 15 min bestimmt. Die linearen initialen Raten der Trübungsabnahme der Suspension wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 graphisch dargestellt (Abbauraten von PCL-Nanopartikeln als funktion der eingesetzten Enzymmengen).
Mit einer weiteren Methode wurde die enzymatische Abbaurate von PET-Folien gravimetrisch bestimmt. Hierzu wurden eine PET-Folie (ca. 55 mg, 5 mm X 30 mm) und ca. 900 μg chromatographisch aufgereinigtes Enzym gelöst in 0.5 M Tris-HCI (pH 8,5) unter starkem Schütteln bei 60°C inkubiert. Die Gewichtverluste der PET-Folien wurden nach 48 h-lnkubation bestimmt.
SEQ ID SEQ ID SEQ ID NO: 1 NO:2 NO:3
Abbaurate (mg/24h) 2,3±0,2 3,2±0,3 2,8±0,2

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer Esterase oder eines Mittels, das eine Esterase enthält, insbesondere eines Mittels zur Wäsche- und/oder Textilbehandlung, zur Hydrolyse von Polyestern, insbesondere Polyethylenterephthalat (PET), dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
2. Verfahren zum Verbessern des Tragekomforts und/oder Vermindern von Pilling von Polyester- haltigen Textilien, insbesondere PET-haltigen Textilien, durch in Kontakt bringen der Polyester- haltigen Textilien mit einer Esterase oder einem Mittel, das eine Esterase enthält, insbesondere einem Mittel zur Wäsche- und/oder Textilbehandlung, dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
3. Verfahren zum Hydrophilieren von PET-Fasern und/oder Abbau von PET-Polymer aus Textil- fasern durch in Kontakt bringen des PET mit einer Esterase oder einem Mittel, das eine Esterase enthält, insbesondere einem Mittel zur Wäsche- und/oder Textilbehandlung, dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 %, vorzugsweise mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist.
4. Ausführungsform nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Esterase (a) aus der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz besteht oder (b) aus der Esterase mit der in in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch
(i) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 1 , 9, 13, 18, 19, 23, 25, 26, 28, 32, 33, 46, 47, 48, 61 , 64, 89, 90, 92, 105, 1 13, 1 14, 157, 183, 204, 234, 245, 246, 249, und 253 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(ii) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 3, 12, 24, 30, 35, 49, 60, 63, 65, 72, 73, 87, 95, 98, 108, 109, 1 10, 1 12, 1 17, 121 , 122, 131 , 142, 151 , 163, 165, 174, 175, 177, 182, 187, 194, 195, 212, 213, 232, 238, 248 und 256 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(iii) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 4, 5, 1 1 , 14, 17, 21 , 22, 31 , 43, 50, 53, 57, 62, 68, 74, 78, 82, 83, 85, 88, 101 , 102, 106, 107, 1 16, 124, 126, 136, 138, 141 , 149, 152, 153, 158, 178, 190, 197, 202, 207, 209, 216, 219 und 250 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(iv) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 2, 27, 41 , 42, 44, 45, 51 , 54, 56, 58, 66, 67, 75, 79, 81 , 86, 91 , 96, 104, 1 1 1 , 120, 125, 127, 135, 144, 156, 159, 160, 162, 171 , 172, 181 , 184, 186, 188, 205, 210, 21 1 , 217, 221 , 222, 223, 230, 236, 237, 239, 247, 251 , 252 und 254 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(v) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 D, A001 M, Y004N, N009D, N009L, N009M, N009Q, N009Y, A013F, A013Q, A013Y, R018E, R018H, S023A, S023E, S023Q, S025A, S025C, S025D, S025E, S025N, E026A, E026C, E026F, E026H, E026I, E026K, E026M, E026Q, E026R, E026S, E026T, E026V, E026W, E026Y, N028I, N028K, N028P, N028Q, N028T, N028Y, S030D, L032A, L032E, L032Q, S033Q, S035E, S035I, S035Q, S035V, Y043R, R046D, R046I, R046N, R046Q, R046T, S057C, Y060C, T061 D, T061 M, T061 P, G062A, T063C, E064A, E064K, E064Q, E064R, A065G, A065K, A065Y, E072H, R073L, R073Y, T083V, D085E, I087L, T088D, T088E, T089A, T089C, T089D, T089E, T089G, T089L, T089P, T089V, L090E, L090Q, L090S, L090T, Q092D, Q092E, Q092G, Q092H, Q092N, Q092S, Q092Y, S095D, S095E, S095Q, N101 E, N105A, N105D, N105E, N105G, N105M, N105Q, N105S, M107L, I 108L, I 108Y, N109T, R1 10H, S1 13C, S1 13D, S1 13E, S1 13H, S1 13P, T1 14D, T1 14E, S1 17Q, A125S, V126A, M131A, M131 F, M131 L, S136A, S136V, S141 E, P151A, P151 C, P151 I, P151 L, P151 S, P151V, L152I, T153C, T153L, H156D, L157A, L157C, L157H, L157I, L157K, L157N, L157Q, L157S, L157T, L157W, L157Y, N158E, N 160D, D174A, D174C, D174E, D174G, D174H, D174K, D174M, D174Q, D174R, D174S, D174T, D174V, L175C, L175D, L175E, L175G, L175N, L175Q, T177D, I178L, A182D, A182E, T183D, T183E, T183H, T183Q, T183S, H184Y, P187A, P187E, P187M, P187V, F188M, N 190E, S194D, S194E, S197A, E202V, D204A, D204C, D204E, D204F, D204G, D204H, D204I, D204K, D204L, D204M, D204N, D204P, D204Q, D204R, D204S, D204T, D204V, D204W, T207D, T207G, F209C, F209E, A210T, N212I, N212L, N212M, N212T, N212V, I213C, I213E, I213F, I213H, I213K, I213Q, I213R, I213S, I213Y, G219A, N232C, N232M, T234H, R245V, D246A, D246C, D246H, D246P, D246T, L248I, F249G, F249K, F249N, F249P, G250P, E253A, E253C, E253F, E253G, E253H, E253I, E253K, E253L, E253N, E253Q, E253R, E253S, E253T, E253V, E253W, E253Y, R256I und R256L, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(vi) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 E, A001 F, A001 G, A001 H, A001 K, A001 L, A001 N, A001 R, A001 S, A001 T, A001V, A001W, A001Y, Y004F, E005A, E005L, N009A, N009E, N009H, N009S, N009T, N009V, T01 1 N, D012A, D012H, A013C, A013D, A013E, A013K, A013L, A013M, A013S, A013T, L014F, L014I, L014M, A017G, A017K, A017M, A017Q, A017S, R018A, R018G, R018I, R018N, R018Q, R018S, R018V, R018W, S019A, S019C, S019F, S019H, S019K, S019L, S019M, S019N, S019R, S019T, S019V, S019W, P021 L, F022Y, S023C, S023D, S023F, S023G, S023H, S023I, S023K, S023L, S023M, S023P, S023T, S023Y, V024F, V024I, V024L, V024M, V024T, V024W, V024Y, S025G, S025K, S025L, S025M, S025Q, S025R, S025T, S025V, E026G, E026L, E026N, N028A, N028E, N028F, N028G, N028H, N028L, N028M, N028S, N028V, N028W, S030A, S030E, S030N, S030P, S030T, R031 K, L032G, L032H, L032I, L032K, L032M, L032N, L032R, L032S, L032T, L032Y, S033A, S033D, S033H, S033K, S033M, S033N, S033V, S035D, S035H, S035L, S035N, S035R, S035Y, T041 K, Y044F, R046A, R046E, R046K, R046L, R046S, R046V, E047D, N048A, N048C, N048D, N048E, N048G, N048H, N048I, N048K, N048L, N048M, N048P, N048Q, N048R, N048Y, N049A, N049D, N049G, N049M, N049Q, T050L, Y051 F, A053G, S057A, S057V, Y060L, Y060V, T061A, T061 G, T061 S, T061Y, G062T, T063D, T063H, T063K, T063N, E064M, E064V, E064W, E064Y, A065N, A065Q, A065R, A065S, S066D, S066T, I067L, A068Q, E072A, E072L, E072M, E072Q, E072S, I074V, I082F, I082M, T083C, D085N, I087C, I087M, T088N, T088S, T089H, T089I, T089K, T089N, T089Q, T089S, L090A, L090F, L090M, L090W, L090Y, Q092A, Q092L, E098Q, N 101A, N101 D, N101 Q, A102H, L104V, N105H, H106W, I 108C, I 108T, 1108V, N109E, N109F, N109H, N109K, N109M, N109S, N109Y, R1 10A, R1 10C, R1 10E, R1 10F, R1 10G, R1 10L, R1 10M, R1 10N, R1 10Q, R1 10S, A1 1 1T, S1 13A, S1 13F, S1 13G, S1 13K, S1 13L, S1 13N, S1 13Q, S1 13T, S1 13V, S1 13Y, T1 14A, T1 14C, T1 14H, T1 14I, T1 14K, T1 14M, T1 14N, T1 14Q, T1 14R, T1 14S, T1 14V, R1 16S, S1 17D, S1 17E, S1 17G, Sl 171 , S121A, S122G, S122H, S122K, S122N, R138E, R138Q, S141 Q, Q142E, Q142I, Q142L, Q142M, P144K, P151 G, L152M, L157F, L157M, L157R, L157V, N158H, N160E, S162E, S163E, S163N, S163T, T165K, T165M, T165Q, T165R, T165Y, I171 F, G172A, L175A, L175H, L175S, T177K, T177R, T177V, V181 P, A182H, A182N, A182Q, A182S, T183A, T183I, T183K, T183R, T183Y, H 184F, K186R, P187K, P187Q, P187T, S195D, S195E, S195H, S195N, S195T, E202G, E202I, E202L, E202Q, G205Q, T207N, F209W, N212A, N212Y, I213L, I213M, G219Q, Y221 F, S222C, S222T, V230Q, N232D, N232G, N232K, N232L, T234A, T234D, T234E, T234I, T234Q, T234S, T237N, T237S, R245A, R245C, R245E, R245G, R245H, R245K, R245L, R245M, R245Q, R245S, R245T, D246G, D246I, D246K, D246Q, D246S, D246V, G247K, L248A, L248D, L248E, L248K, L248M, L248Q, L248S, F249C, F249H, F249L, F249M, F249Q, F249R, F249S, F249T, F249V, F249Y, E251 G, V252I, E254C, R256C, R256D, R256E, R256H, R256M, R256Q, R256T, R256V und R256W, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(vii) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 C, A001 P, A001 Q, Y004W, E005W, N009C, N009F, N009G, N009I, D012V, A013H, A013I, R018F, R018M, R018P, R018T, S019G, S019I, S019Q, S019Y, S023R, S023V, V024K, S025F, S025I, L032D, L032V, S033E, S033F, S033I, S033L, S033R, S035A, S035M, Y043W, R046C, R046F, R046H, R046M, E047C, E047H, N048S, N048V, N048W, N049C, T050Q, V054I, T061 H, T061 I, T061V, T063S, E064G, E064I, E064L, E064N, A065C, A065L, A065M, I067V, A068H, A068K, A068T, E072K, E072N, R073F, T083I, I087Y, T089M, T089W, L090K, L090V, Q092K, Q092M, Q092T, S095C, E098D, E098T, N101W, A102C, N105Y, M107V, I108Q, R1 10K, R1 10T, S1 13W, T1 14P, S1 17A, S1 17C, S1 17M, S1 17N, S1 17P, S1 17T, S121 G, S121 K, S121 N, S121 P, S121 R, S121T, S122A, S122C, S122D, S122E, S122R, S122T, M127S, R138T, Q142R, Q142V, A149C, P151T, L157E, L157P, N158V, S163D, S163M, T165L, T165V, D174N, L175K, T177H, T177Q, T177Y, 1178V, V181 T, T183C, T183F, T183M, T183N, P187L, P187S, S194M, S194Q, S194T, S195C, S195W, S197E, S197K, E202C, G205N, P21 1V, N212C, I213A, I217T, G219T, N232A, N232E, N232F, N232H, N232Y, T234K, T234L, T234N, T234R, T234V, Q238E, Q238P, Q238R, F239Y, D246E, D246M, D246R, D246W, L248C, L248P, L248V, F249W, G250K, G250R, E253M, E254K und R256K, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(viii) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe N002A, N002L, P003A, P003E, P003G, P003H, P003I, P003K, P003L, P003M, P003Q, P003S, P003T, P003V, T01 1 H, D012E, D012S, A013G, A013P, L014Y, R018L, S019E, F022E, F022M, V024C, V024Q, E026P, N028C, N028D, L032F, L032P, S033Y, T041 R, I042V, Y043K, E047F, E047L, E047M, E047P, E047S, E047V, E047W, N049E, N049F, N049L, N049Y, T050E, T050V, Y060G, Y060M, G062Q, G062S, T063A, T063G, E064T, A065D, A065E, A065H, A065T, E072D, E072V, E072W, D085C, I087E, T088G, T089Y, L090R, Q092V, N101 S, N105I, N105K, N105L, N105R, H106F, I108M, I108N, N109R, S1 12G, S1 12P, S1 12T, T1 14F, T1 14G, T1 14Y, R1 161, R1 16K, R1 16T, R1 16V, S1 17H, D120L, S122L, S122Q, S122V, S122Y, L124A, L124M, L124P, M127V, G135A, S136T, R138A, S141A, Q142D, Q142K, Q142N, S163A, S163G, T165H, 1171V, T177M, T177N, A182C, K186L, P187I, N190H, N190Y, S194C, S197Y, F209D, F209N, N212S, 1217V, V223T, V230A, T234G, T234M, T234Y, Y236F, Q238C, Q238D, Q238G, Q238M, Q238S, R245N, R245P, D246Y, G247R, L248R, F249A, F249E und R256N, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(ix) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe N009W, D012I, D012L, A013R, A017N, R018Y, P021 D, P021T, P021Y, F022H, F022K, S023N, V024N, S025H, S025Y, E027N, S030C, S030K, R031 Q, R031V, S033C, S035C, S035W, I042Q, P045A, P045T, R046P, R046Y, E047Q, A053L, A053V, I056M, S057T, P058G, Y060A, Y060F, Y060S, Y060W, T061 C, T061 K, T061 L, T061 N, T061 Q, T061 R, T061W, G062D, T063E, T063P, E064H, E064S, E072F, E072G, E072R, R073I, R073T, R073V, R073W, I074A, I074C, I074G, I074T, A075S, G078A, G078S, F079G, V081 G, I082G, I082K, I082Q, T083M, T083N, D085G, T086G, T086N, I087Q, I087S, I087T, I087W, T088C, L090C, L090D, L090G, L090H, L090N, D091 E, D091Y, Q092C, Q092P, S095A, S095L, S095V, S095Y, R096Y, A102Y, N105C, N105F, N105V, N105W, M107S, I 108K, I 108P, N109Q, R1 10Y, S1 12F, S1 12I, S1 12L, S1 12W, S1 12Y, S1 13M, V126T, M131 G, M131 I, M131 S, M131V, S136C, R138D, R138M, Q142A, A149I, T153N, L157D, L157G, N158C, N158D, N158I, N158W, K159T, S163C, T177C, T177E, T177S, I 178F, I178Y, A182G, A182Y, T183L, P187C, N190S, S195F, S195Q, S195Y, D204Y, A210S, K216N, K216Q, K216Y, G219L, N232R, N232W, R245I, L248F, F249D, G250S, G250T, E251 Q, E253D und E253P, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(x) Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 255, 256, 257, 258, 259 oder 260 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
Esterase, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 70 % vorzugsweise mindestens 80 %, noch bevorzugter mindestens 85 %, am bevorzugtesten mindestens 90 % Sequenzidentität mit der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge aufweist und die
(i) die Aminosäuren R18 und S136 an den Positionen, die den Positionen 18 und 136 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweist;
(ii) die Aminosäuren R18, S136 und V178 an den Positionen, die den Positionen 18, 136 und 178 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweist;
(iii) die Aminosäuren R18, S136 und S213 an den Positionen, die den Positionen 18, 136 und 213 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweist;
(iv) die Aminosäuren V178 und S213 an den Positionen, die den Positionen 178 und 213 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweist; oder
(v) die Aminosäuren R18, S136, V178 und S213 an den Positionen, die den Positionen 18, 136, 178 und 213 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, aufweist.
Esterase nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie (a) eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus denen, die in SEQ ID NOs: 1-5 angegeben sind oder daraus besteht; oder (b) aus einer Esterase, die die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:5 umfasst, als Ausgangsmolekül erhältlich ist durch
(xi) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 1 , 9, 13, 19, 23, 25, 26, 28, 32, 33, 46, 47, 48, 61 , 64, 89, 90, 92, 105, 1 13, 1 14, 157, 183, 204, 234, 245, 246, 249 und 253 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(xii) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 3, 12, 24, 30, 35, 49, 60, 63, 65, 72, 73, 87, 95, 98, 108, 109, 1 10, 1 12, 1 17, 121 , 122, 131 , 142, 151 , 163, 165, 174, 175, 177, 182, 187, 194, 195, 212, 232, 238, 248 und 256 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(xiii) ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 4, 5, 1 1 , 14, 17, 21 , 22, 31 , 43, 50, 53, 57, 62, 68, 74, 78, 82, 83, 85, 88, 101 , 102, 106, 107, 1 16, 124, 126, 138, 141 , 149, 152, 153, 158, 190, 197, 202, 207, 209, 216, 219 und 250 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder ein- oder mehrfache Aminosäuresubstitution an den Positionen, die den Positionen 2, 27, 41 , 42, 44, 45, 51 , 54, 56, 58, 66, 67, 75, 79, 81 , 86, 91 , 96, 104, 1 1 1 , 120, 125, 127, 135, 144, 156, 159, 160, 162, 171 , 172, 181 , 184, 186, 188, 205, 210, 21 1 , 217, 221 , 222, 223, 230, 236, 237, 239, 247, 251 , 252 und 254 gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 D, A001 M, Y004N, N009D, N009L, N009M, N009Q, N009Y, A013F, A013Q, A013Y, S023A, S023E, S023Q, S025A, S025C, S025D, S025E, S025N, E026A, E026C, E026F, E026H, E026I, E026K, E026M, E026Q, E026R, E026S, E026T, E026V, E026W, E026Y, N028I, N028K, N028P, N028Q, N028T, N028Y, S030D, L032A, L032E, L032Q, S033Q, S035E, S035I, S035Q, S035V, Y043R, R046D, R046I, R046N, R046Q, R046T, S057C, Y060C, T061 D, T061 M, T061 P, G062A, T063C, E064A, E064K, E064Q, E064R, A065G, A065K, A065Y, E072H, R073L, R073Y, T083V, D085E, I087L, T088D, T088E, T089A, T089C, T089D, T089E, T089G, T089L, T089P, T089V, L090E, L090Q, L090S, L090T, Q092D, Q092E, Q092G, Q092H, Q092N, Q092S, Q092Y, S095D, S095E, S095Q, N101 E, N105A, N105D, N105E, N105G, N105M, N105Q, N105S, M107L, I 108L, I108Y, N109T, R1 10H, S1 13C, S1 13D, S1 13E, S1 13H, S1 13P, T1 14D, T1 14E, S1 17Q, A125S, V126A, M131A, M131 F, M131 L, S141 E, P151A, P151 C, P151 I, P151 L, P151 S, P151V, L152I, T153C, T153L, H156D, L157A, L157C, L157H, L157I, L157K, L157N, L157Q, L157S, L157T, L157W, L157Y, N158E, N 160D, D174A, D174C, D174E, D174G, D174H, D174K, D174M, D174Q, D174R, D174S, D174T, D174V, L175C, L175D, L175E, L175G, L175N, L175Q, T177D, A182D, A182E, T183D, T183E, T183H, T183Q, T183S, H184Y, P187A, P187E, P187M, P187V, F188M, N190E, S194D, S194E, S197A, E202V, D204A, D204C, D204E, D204F, D204G, D204H, D204I, D204K, D204L, D204M, D204N, D204P, D204Q, D204R, D204S, D204T, D204V, D204W, T207D, T207G, F209C, F209E, A210T, N212I, N212L, N212M, N212T, N212V, G219A, N232C, N232M, T234H, R245V, D246A, D246C, D246H, D246P, D246T, L248I, F249G, F249K, F249N, F249P, G250P, E253A, E253C, E253F, E253G, E253H, E253I, E253K, E253L, E253N, E253Q, E253R, E253S, E253T, E253V, E253W, E253Y, R256I und R256L, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 E, A001 F, A001 G, A001 H, A001 K, A001 L, A001 N, A001 R, A001 S, A001T, A001V, A001W, A001Y, Y004F, E005A, E005L, N009A, N009E, N009H, N009S, N009T, N009V, T01 1 N, D012A, D012H, A013C, A013D, A013E, A013K, A013L, A013M, A013S, A013T, L014F, L014I, L014M, A017G, A017K, A017M, A017Q, A017S, S019A, S019C, S019F, S019H, S019K, S019L, S019M, S019N, S019R, S019T, S019V, S019W, P021 L, F022Y, S023C, S023D, S023F, S023G, S023H, S023I, S023K, S023L, S023M, S023P, S023T, S023Y, V024F, V024I, V024L, V024M, V024T, V024W, V024Y, S025G, S025K, S025L, S025M, S025Q, S025R, S025T, S025V, E026G, E026L, E026N, N028A, N028E, N028F, N028G, N028H, N028L, N028M, N028S, N028V, N028W, S030A, S030E, S030N, S030P, S030T, R031 K, L032G, L032H, L032I, L032K, L032M, L032N, L032R, L032S, L032T, L032Y, S033A, S033D, S033H, S033K, S033M, S033N, S033V, S035D, S035H, S035L, S035N, S035R, S035Y, T041 K, Y044F, R046A, R046E, R046K, R046L, R046S, R046V, E047D, N048A, N048C, N048D, N048E, N048G, N048H, N048I, N048K, N048L, N048M, N048P, N048Q, N048R, N048Y, N049A, N049D, N049G, N049M, N049Q, T050L, Y051 F, A053G, S057A, S057V, Y060L, Y060V, T061A, T061 G, T061 S, T061Y, G062T, T063D, T063H, T063K, T063N, E064M, E064V, E064W, E064Y, A065N, A065Q, A065R, A065S, S066D, S066T, I067L, A068Q, E072A, E072L, E072M, E072Q, E072S, I074V, I082F, I082M, T083C, D085N, I087C, I087M, T088N, T088S, T089H, T089I, T089K, T089N, T089Q, T089S, L090A, L090F, L090M, L090W, L090Y, Q092A, Q092L, E098Q, N 101A, N101 D, N101 Q, A102H, L104V, N 105H, H106W, I108C, I 108T, 1108V, N109E, N109F, N 109H, N109K, N109M, N 109S, N109Y, R1 10A, R1 10C, R1 10E, R1 10F, R1 10G, R1 10L, R1 10M, R1 10N, R1 10Q, R1 10S, A1 1 1T, S1 13A, S1 13F, S1 13G, S1 13K, S1 13L, S1 13N, S1 13Q, S1 13T, S1 13V, S1 13Y, T1 14A, T1 14C, T1 14H, T1 141, T1 14K, T1 14M, T1 14N, T1 14Q, T1 14R, T1 14S, T1 14V, R1 16S, S1 17D, S1 17E, S1 17G, Sl 171 , S121A, S122G, S122H, S122K, S122N, R138E, R138Q, S141 Q, Q142E, Q142I, Q142L, Q142M, P144K, P151 G, L152M, L157F, L157M, L157R, L157V, N158H, N160E, S162E, S163E, S163N, S163T, T165K, T165M, T165Q, T165R, T165Y, I 171 F, G172A, L175A, L175H, L175S, T177K, T177R, T177V, V181 P, A182H, A182N, A182Q, A182S, T183A, T183I, T183K, T183R, T183Y, H 184F, K186R, P187K, P187Q, P187T, S195D, S195E, S195H, S195N, S195T, E202G, E202I, E202L, E202Q, G205Q, T207N, F209W, N212A, N212Y, G219Q, Y221 F, S222C, S222T, V230Q, N232D, N232G, N232K, N232L, T234A, T234D, T234E, T234I, T234Q, T234S, T237N, T237S, R245A, R245C, R245E, R245G, R245H, R245K, R245L, R245M, R245Q, R245S, R245T, D246G, D246I, D246K, D246Q, D246S, D246V, G247K, L248A, L248D, L248E, L248K, L248M, L248Q, L248S, F249C, F249H, F249L, F249M, F249Q, F249R, F249S, F249T, F249V, F249Y, E251 G, V252I, E254C, R256C, R256D, R256E, R256H, R256M, R256Q, R256T, R256V und R256W, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO: 1 entsprechen; und/oder
(xvii) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe A001 C, A001 P, A001 Q, Y004W, E005W, N009C, N009F, N009G, N009I, D012V, A013H, A013I, S019G, S019I, S019Q, S019Y, S023R, S023V, V024K, S025F, S025I, L032D, L032V, S033E, S033F, S033I, S033L, S033R, S035A, S035M, Y043W, R046C, R046F, R046H, R046M, E047C, E047H, N048S, N048V, N048W, N049C, T050Q, V054I, T061 H, T061 I, T061V, T063S, E064G, E064I, E064L, E064N, A065C, A065L, A065M, I067V, A068H, A068K, A068T, E072K, E072N, R073F, T083I, I087Y, T089M, T089W, L090K, L090V, Q092K, Q092M, Q092T, S095C, E098D, E098T, N101W, A102C, N105Y, M107V, I108Q, R1 10K, R1 10T, S1 13W, T1 14P, S1 17A, S1 17C, S1 17M, S1 17N, S1 17P, S1 17T, S121 G, S121 K, S121 N, S121 P, S121 R, S121T, S122A, S122C, S122D, S122E, S122R, S122T, M127S, R138T, Q142R, Q142V, A149C, P151T, L157E, L157P, N158V, S163D, S163M, T165L, T165V, D174N, L175K, T177H, T177Q, T177Y, V181T, T183C, T183F, T183M, T183N, P187L, P187S, S194M, S194Q, S194T, S195C, S195W, S197E, S197K, E202C, G205N, P21 1V, N212C, I217T, G219T, N232A, N232E, N232F, N232H, N232Y, T234K, T234L, T234N, T234R, T234V, Q238E, Q238P, Q238R, F239Y, D246E, D246M, D246R, D246W, L248C, L248P, L248V, F249W, G250K, G250R, E253M, E254K und R256K, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(xviii) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe N002A, N002L, P003A, P003E, P003G, P003H, P003I, P003K, P003L, P003M, P003Q, P003S, P003T, P003V, T01 1 H, D012E, D012S, A013G, A013P, L014Y, S019E, F022E, F022M, V024C, V024Q, E026P, N028C, N028D, L032F, L032P, S033Y, T041 R, I042V, Y043K, E047F, E047L, E047M, E047P, E047S, E047V, E047W, N049E, N049F, N049L, N049Y, T050E, T050V, Y060G, Y060M, G062Q, G062S, T063A, T063G, E064T, A065D, A065E, A065H, A065T, E072D, E072V, E072W, D085C, I087E, T088G, T089Y, L090R, Q092V, N101 S, N105I, N105K, N105L, N105R, H106F, I108M, I 108N, N109R, S1 12G, S1 12P, S1 12T, T1 14F, T1 14G, T1 14Y, R1 16I, R1 16K, R1 16T, R1 16V, S1 17H, D120L, S122L, S122Q, S122V, S122Y, L124A, L124M, L124P, M127V, G135A, R138A, S141A, Q142D, Q142K, Q142N, S163A, S163G, T165H, 1171V, T177M, T177N, A182C, K186L, P187I, N190H, N190Y, S194C, S197Y, F209D, F209N, N212S, 1217V, V223T, V230A, T234G, T234M, T234Y, Y236F, Q238C, Q238D, Q238G, Q238M, Q238S, R245N, R245P, D246Y, G247R, L248R, F249A, F249E und R256N, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder
(xix) eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen ausgewählt aus der Gruppe N009W, D012I, D012L, A013R, A017N, P021 D, P021T, P021Y, F022H, F022K, S023N, V024N, S025H, S025Y, E027N, S030C, S030K, R031 Q, R031V, S033C, S035C, S035W, I042Q, P045A, P045T, R046P, R046Y, E047Q, A053L, A053V, I056M, S057T, P058G, Y060A, Y060F, Y060S, Y060W, T061 C, T061 K, T061 L, T061 N, T061 Q, T061 R, T061W, G062D, T063E, T063P, E064H, E064S, E072F, E072G, E072R, R073I, R073T, R073V, R073W, I074A, I074C, I074G, I074T, A075S, G078A, G078S, F079G, V081 G, I082G, I082K, I082Q, T083M, T083N, D085G, T086G, T086N, I087Q, I087S, I087T, I087W, T088C, L090C, L090D, L090G, L090H, L090N, D091 E, D091Y, Q092C, Q092P, S095A, S095L, S095V, S095Y, R096Y, A102Y, N105C, N105F, N105V, N105W, M107S, I 108K, I 108P, N 109Q, R1 10Y, S1 12F, S1 12I, S1 12L, S1 12W, S1 12Y, S1 13M, V126T, M131 G, M131 I, M131 S, M131V, R138D, R138M, Q142A, A149I, T153N, L157D, L157G, N158C, N158D, N158I, N158W, K159T, S163C, T177C, T177E, T177S, A182G, A182Y, T183L, P187C, N190S, S195F, S195Q, S195Y, D204Y, A210S, K216N, K216Q, K216Y, G219L, N232R, N232W, R245I, L248F, F249D, G250S, G250T, E251 Q, E253D und E253P, wobei die angegebenen Positionen den Positionen gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen; und/oder (xx) Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 255, 256, 257, 258, 259 oder 260 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die Esterase die Aminosäuren R18 und S136 an den Positionen, die den Positionen 18 und 136 gemäß SEQ ID NO:1 entsprechen, umfasst.
7. Nukleinsäure codierend für eine Esterase nach Anspruch 5 oder 6.
8. Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 7, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
9. Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder einen Vektor nach Anspruch 8 beinhaltet, oder die eine Esterase nach Anspruch 5 oder 6 beinhaltet, insbesondere eine, die die Esterase in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert.
10. Verfahren zur Herstellung einer Esterase umfassend
a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 9; und
b) Isolieren der Esterase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
1 1. Mittel, insbesondere ein Mittel zur Wäsche- und/oder Textilbehandlung, vorzugsweise Waschmittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Esterase nach Anspruch 5 oder 6 enthält, insbesondere in einer Menge von 2μg bis 20mg pro g des Mittels.
12. Verfahren zur Reinigung und/oder Pflege von Textilien, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach Anspruch 1 1 angewendet wird.
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