WO2016006782A1 - 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a composition capable of improving the storage stability of stem cells, and more particularly to a composition for improving the storage stability of stem cells containing serum or plasma.
  • Stem cells are cells that have the ability to self-replicate and differentiate into two or more cells.
  • Totipotent stem cells pluripotent stem cells, and multipotent stem cells ( multipotent stem cells).
  • Pluripotent stem cells are pluripotent cells that can develop into a complete individual. Cells up to 8 cell stages after fertilization of eggs and sperm have these properties. If you transplant it into a single, complete entity. Pluripotent stem cells are cells that can develop into a variety of cells and tissues derived from ectoderm, mesoderm, and endodermal layer. The inner cell mass inside the blastocyst appears 4-5 days after fertilization. It is called embryonic stem cells and differentiates into a variety of other tissue cells but does not form new life. Multipotent stem cells are stem cells that can only differentiate into cells specific to the tissues and organs that contain them.
  • Multipotent stem cells were first isolated from adult bone marrow (Y. Jiang et al., Nature , 418: 41, 2002) and subsequently identified in other adult tissues (CM Verfaillie et al., Trends Cell Biol. 12: 502, 2002).
  • stem cells in adult tissues such as bone marrow are very rare and these cells are difficult to culture without induction of differentiation, making them difficult to culture without specifically screened media. That is, it is very difficult to separate stem cells and preserve them in vitro.
  • adipose tissue has been found to be a new source of pluripotent stem cells (B. Cousin et al., BBRC, 301: 1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110: 349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol . 189: 54, 2001; MJ Seo et al., BBRC, 328: 258, 2005), and human adipose tissue obtained by liposuction (liposuction) contained undifferentiated cell populations.
  • liposuction liposuction
  • adipose tissue-derived cells have the ability to promote muscle regeneration and neurovascular differentiation. These adipose tissues have the advantage of being able to be extracted in large quantities, attracting attention as a source of new stem cells to supplement the existing disadvantages.
  • Stem cells which can be obtained in large quantities, are increasingly being used as cell therapeutics for injecting stem cells themselves for the medical field including treatment of intractable diseases and cosmetics and cosmetics.
  • Stem cells for use in cell therapy are not a problem when the patient can be treated immediately after the culture, but if the control of the stem cell treatment timing is necessary according to the condition of the patient, long-term preservation is required after the stem cell culture.
  • stable supply of stem cells is essential even when long distance transportation is required to the place where the stem cells are cultured.
  • the cell freezing method significantly lowers the cell viability at the time of thawing, and there are problems such as stem cell function from a biological point of view.
  • there is a disadvantage that the transport in the frozen state is more difficult than the refrigerated transport.
  • Conventional techniques for preserving stem cells in a refrigerated state currently include a technique for storing human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells suspended in physiological saline under refrigerated conditions. It is hard to bet. In order to improve this, when the addition of sucrose or albumin shows a survival rate of 70% or more until 48 hours to 72 hours, it has been confirmed that the storage stability is improved (Korean Patent No. 2008-0103637). However, since the survival rate sharply decreases after 72 hours, it is necessary to develop a composition for enhancing storage stability that maintains the survival rate of stem cells included in the cell therapy in a refrigerated condition (4 ° C.) for a long time stably.
  • the present inventors have made diligent efforts to maintain high survival rate of stem cells even during long-term refrigeration, as a result of confirming that the survival rate of stem cells in the refrigerated state is maintained at least 9 days or more when containing serum or plasma. It was completed.
  • human serum is used as a medium composition for cell culture (Korean Patent No. 10-0394430), there is no disclosure about a composition for enhancing storage stability of stem cells containing human serum or plasma.
  • An object of the present invention to provide a composition for improving the stability of cold storage of stem cells containing 5 ⁇ 80% (v / v) content of serum or plasma.
  • Another object of the present invention to provide a cell therapy injection product containing the composition.
  • the present invention provides a composition for improving the stability of cold storage of stem cells containing a serum or plasma content of 5 ⁇ 80% (v / v).
  • the present invention also provides a cell therapy injection product containing the composition.
  • the control group used a preservative containing 0.3% albumin.
  • Figure 2 shows the survival rate of stem cells according to the retention time from 0 to 144 hours by refrigeration of 1.0 ⁇ 10 7 stem cells with preservatives containing autologous serum and 0.3% albumin at different concentrations (10, 20, 30%) It is a comparison.
  • the control group used a preservative containing 0.3% albumin.
  • Figure 3 shows the survival rate of stem cells according to the retention time from 0 to 144 hours by refrigerated 0.5 ⁇ 10 7 stem cells with preservatives containing different concentrations (10, 20, 30%) of taga serum and 0.3% albumin It is a comparison.
  • the control group used a preservative containing 0.3% albumin.
  • Figure 4 shows the survival rate of stem cells according to the retention time from 0 to 144 hours by refrigeration of 1.0 ⁇ 10 7 stem cells with preservatives containing different concentrations (10, 20, 30%) of taga serum and 0.3% albumin It is a comparison.
  • the control group used a preservative containing 0.3% albumin.
  • Figure 5 is a result of comparing the change in cell number, survival rate and cell size of the control group (saline / 0.3% albumin) of the stem cell # 1 and the composition experimental group (1-6) for enhancing the storage stability of each other conditions.
  • Figure 6 is a result of comparing the change in cell number, viability and cell size of the control group (saline / 0.3% albumin) of the stem cell # 2 and the composition experimental group (1-6) for enhancing the storage stability of each other conditions.
  • the stem cell preservative containing serum or plasma maintains the survival rate of the stem cells in the refrigerated state at least 95%, thereby improving the storage stability of the stem cells.
  • the stem cell preservative containing serum or plasma of the present invention can maintain a high survival rate of stem cells in a refrigerated state for 9 days or more, and is useful for stable supply of stem cells for cell therapy.
  • cell therapeutic injection product or “cell therapeutic agent” refers to a parenteral administration containing stem cells for injection of a defect of a tissue, that is, injected into or near a defect in the form of an injection to correct a defect. It means a pharmaceutical composition that can be.
  • excipient means a substance which is added to maintain the form of a liquid or the like, in addition to an active ingredient exhibiting pharmacological properties of the pharmaceutical composition, for the purpose of facilitating handling by a given dose and weight.
  • excipient for the liquid form, saline (Saline), Hartmann-D solution, PBS (Phosphate Buffered Saline), etc. are used, but it means a substance which may include various other compositions.
  • fat tissue-derived stem cell is an undifferentiated stem cell isolated from adipose tissue, and the separation method may be as follows.
  • Adipose tissue-derived stem cells may be isolated by culturing a suspension containing fat suspended in saline obtained by liposuction and then recovering the stem cell layer attached to the culture vessel by trypsin treatment or by scraping with a scraper.
  • stem cells of the present invention it can be obtained by the following method.
  • human adipose tissue obtained from abdominal fat by liposuction is isolated and washed with PBS, and then the tissue is chopped and digested with DMEM medium containing collagen degrading enzyme, washed with PBS and centrifuged. do. The supernatant was removed and the pellet was washed with PBS and then centrifuged again to remove suspended matter using a 100 ⁇ m mesh, followed by washing with PBS.
  • DMEM fetal bovine serum
  • keratinocyte-SFM FBS, NAC, Ascorbic Acid, Calcium, rEGF, insulin, bFGF and hydrocortisone
  • human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells containing 10-50% (v / v) of autologous or other human serum and 0.3% albumin or a composition containing human plasma and 0.3% albumin The cells were suspended in the composition and analyzed for cell size, appearance, cell number, and viability over time in a refrigerated (4 ° C) state.
  • the present invention relates to a composition for enhancing the storage stability of stem cells containing 5 to 80% (v / v) serum or plasma.
  • the content of the serum is preferably 10 to 50% (v / v), the plasma content is preferably 5 to 50% (v / v), but is not limited thereto.
  • Serum of the present invention may be characterized in that the serum or plasma derived from mammals, including humans. It is also preferred to be allogeneically derived serum or plasma, and there is no limitation on the use of autologous or titer serum or plasma.
  • the refrigerated storage is preferably in the temperature range of 0.1 ⁇ 10 °C, but is not limited thereto.
  • the present invention may be further characterized by containing albumin and excipients
  • the content of the albumin is preferably 0.1 ⁇ 1% (v / v), it is 0.2 ⁇ 0.5% (v / v) More preferably, it is not limited thereto.
  • the excipient is preferably any one or more selected from the group consisting of saline, Hartman-D solution and PBS, but is not limited thereto.
  • V / v means that 1 to 80% of serum and 0.1 to 1% of albumin are added to the volume (volume percentage) of the stem cells suspended in saline solution so that the total dose (volume percentage) becomes 100%. do.
  • the concentration of the stem cells is preferably 1.0 ⁇ 10 5 ⁇ 1.0 ⁇ 10 9 cells / ml, more preferably 1.0 ⁇ 10 6 ⁇ 1.0 ⁇ 10 8 cells / ml, but is not limited thereto It is not.
  • the stem cells are preferably selected from the group consisting of fat, umbilical cord blood, bone marrow, muscle, placenta and skin, and most preferably those derived from adipose tissue, but are not limited thereto.
  • the stem cells may be characterized in that the stem cells derived from mammals, including humans.
  • the present invention relates to a cell therapeutic injection product containing a composition for enhancing the stability of cold storage of stem cells containing serum or plasma.
  • Injectable products according to the invention can be prepared in the form of filled injections, taking the amounts commonly known in the art, depending on the constitution and type of defect of the patient.
  • Injectable products according to the present invention can be used by injection in the region adjacent to the defect to be treated or defects, defects that can be corrected in this way are wrinkles, stretch marks, scars, skin depression, lip insufficiency, periodontal defects, Soft tissue defects, bone defects, burns, skin ulcers, etc., but is not limited thereto.
  • the cell therapeutic injection product may further contain a suspension, a dissolution aid, a stabilizer, a tonicity agent, a preservative, an adsorption agent, a surfactant, a diluent, a pH adjuster, a pain-free agent, a buffer, a sulfur-reducing agent, and an oxidation if necessary.
  • An inhibitor etc. can be added suitably.
  • Human adipose tissue obtained from abdominal fat by liposuction was isolated and washed with PBS. After cutting the tissue finely, the tissue was digested at 37 ° C. for 2 hours using DMEM media to which collagenase type 1 (1 mg / ml) was added. The collagenase treated tissues were washed with PBS, centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant was removed, the pellet was washed with PBS and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes.
  • Example 2 Four different adipose stem cells isolated by the method of Example 1 were refrigerated at 4 ° C to analyze the survival rate of the stem cells used in the injectable product for a cold cell type therapeutic.
  • the four isolated adipose stem cells constituted the experimental group as shown in Table 1.
  • Stem cell control group containing 0.3% albumin
  • experimental group containing 0.3% albumin + 10% autologous serum experimental group containing 0.3% albumin + 10% taga serum
  • experimental group containing 0.3% albumin + 20% autologous serum 0.3
  • the survival rate was analyzed by including an experimental group containing% albumin + 20% taga serum, an experimental group containing 0.3% albumin + 30% autologous serum, and an experimental group containing 0.3% albumin + 30% taga serum.
  • pH is a numerical value of hydrogen ion concentration, and the general pH range is about 5.5 ⁇ 8.0 for saline, so the change of pH when albumin and human serum were added to saline was compared with PBS. .
  • Normal healthy pH is when cells, blood, and body fluids maintain weak alkalinity.
  • Thermo Scientific's Orion Star A111 was used to analyze the pH change by albumin and human serum included in the composition for enhancing stem cell storage stability. In addition, since pH is affected by the measurement temperature, it was measured at room temperature in the range of 20 ⁇ 24 °C.
  • Example 3 the stem cell control suspended in saline containing 0.3% albumin and the saline containing 10, 20, 30% autologous human serum and 0.3% albumin, respectively. Viability analysis was performed with the stem cell experimental group and the stem cell experimental group suspended in saline containing 10, 20, and 30% taga human serum and 0.3% albumin, respectively.
  • Adipocytes isolated by the method of Example 1 were washed with PBS, suspended in saline containing 0.3% albumin and added with 10, 20, and 30% autologous and other human serum, respectively. It consisted of 2 control group and the experimental group.
  • Stem cells in each experimental group were filled into 3cc syringes at a concentration of 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml, then refrigerated at 4 ° C., and then injected into a cold cell-type cell therapeutic product after 0, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 hours.
  • the size and shape of stem cells used in the study were analyzed.
  • Cell 1 was suspended in saline containing 0.5 ⁇ 10 7 stem cells in saline containing 0.3% albumin and saline containing 10, 20, 30% autologous serum / 0.3% albumin, respectively.
  • Three stem cell experimental groups were prepared.
  • Cell 2 is a control group in which 1.0 ⁇ 10 7 stem cells are suspended in saline containing 0.3% albumin, and stem cells suspended in saline containing 10, 20, 30% autologous serum / 0.3% albumin, respectively. Three experimental groups were prepared.
  • control group of cell 1, the control group of 3 and the control group of cell 2, and the control group of 3 were all filled with stem cells in a 3cc syringe, and then refrigerated at 4 ° C and after 0, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 hours.
  • the size, appearance and total cell number of were analyzed.
  • the cell number and size of stem cells were analyzed using Invitrogen's Countess TM Automated Cell Counter, and the characterization was visually confirmed.
  • Table 3 cell number of cells 1
  • Table 4 size of cells 1
  • Table 5 cell numbers of cells 2
  • Table 6 size of cells 2).
  • the change in cell size of the control group was reduced by about 15-25%, whereas the change in cell size of the experimental group containing autologous human serum was not significantly changed by about 3-10%.
  • no change was observed in the appearance of the cells in the control group and the experimental group, and the total number of cells was not different between the control group and the experimental group.
  • Cell 3 was a control group in which 0.5 ⁇ 10 7 stem cells were suspended in saline containing 0.3% albumin and saline containing 10, 20, 30% taga serum / 0.3% albumin, respectively. Three stem cell experimental groups were prepared.
  • Cell 4 was suspended in saline containing 1.0 ⁇ 10 7 stem cells in saline containing 0.3% albumin and saline containing 10, 20, 30% taga serum / 0.3% albumin, respectively.
  • Three stem cell experimental groups were prepared.
  • the control group of cell 3, the control group of 3 and the control group of cell 4, and the control group of cell 4 all filled the stem cells in a 3cc syringe, and then stored at 4 ° C and stored at 0, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 hours.
  • the size, appearance and total cell number of were analyzed.
  • the cell number and size of stem cells were analyzed using Invitrogen's Countess TM Automated Cell Counter, and the characterization was visually confirmed.
  • Table 7 cell number of cells 3
  • Table 8 size of cells 3
  • Table 9 cell numbers of cells 4
  • Table 10 size of cells 4
  • the change in cell size of the control group was reduced by about 20%, whereas the change in cell size of the experimental group containing other human serum was not significantly changed by about 3 to 10%.
  • no change was observed in the appearance of the cells in the control group and the experimental group, and the total number of cells was not different between the control group and the experimental group.
  • the isolated adipose stem cells were washed with PBS, suspended in saline containing 0.3% albumin, and added with 10, 20, and 30% autologous and other human serum, respectively. .
  • Stem cells in each experimental group were filled into 3cc syringes at a concentration of 1.0 ⁇ 10 7 cells / ml, then refrigerated at 4 ° C., and then injected into a cold cell-type cell therapeutic product after 0, 24, 48, 72, 96, 120 and 144 hours.
  • the survival rate of stem cells used for the analysis was analyzed. Stem cell viability was measured using a 1: 1 1: 1 mixture of cells and trypan blue solution using Invitrogen's Countess TM Automated Cell Counter.
  • the composition containing human serum showed high survival rate without significant change in cell number compared to the control group containing only 0.3% albumin.
  • the experimental group 3 which is 30% serum-containing stem cells, maintained a very high cell viability of 98% or more until 144 hours, and it was confirmed that even in the 10-20% serum-containing experimental group, the survival rate was 90% or more until 72 hours later.
  • the effect of survival rate according to the retention time of cells there was no difference in the effect of survival rate according to the retention time of cells between the autologous serum test groups (FIGS. 1 and 2) and the taga serum test groups (FIGS. 3 and 4).
  • SA Saline + 0.3% Albumine
  • PRP plasma
  • Example 2 Two different adipose stem cells separated by the method of Example 1 were refrigerated at 4 ° C to analyze the survival rate of the stem cells used in the injectable product for a refrigerated cell therapy product.
  • 4.9 ⁇ 10 8 cells (1.0 ⁇ 10 7 cells / ml 49 preparations) were prepared for each cell. Thaw two passages (6.0 ⁇ 10 6 cells in five T175 flasks) and culture (4.9 ⁇ 10 7 cells in 49 T175 flasks in three passages), then recover the fourth passage (4.9 ⁇ 10 8 cells) and then filled and tested.
  • the cells recovered in the fourth passage were divided into 7 tubes with 7.0 ⁇ 10 7 cells, mixed with 7 ml of 7 preservatives in Table 11, and then hourly (0, 1, 2, 3, 5, 7, 9 per preservative). 1) was filled into 7 3cc syringes. Day 0 samples were immediately measured cell number, viability, and cell size, and the rest of the samples were stored refrigerated for 1, 2, 3, 5, 7, 9 days, and then cell number, viability, and cell size using Cedex. Measured.
  • Plasma was injected into a 20cc syringe with 2cc of anticoagulant, and after blood collection, the plasma and erythrocytes were firstly separated by Dr. PRP kit, followed by centrifugation at 3200rpm for 6 minutes to condense platelets and secondary separation. After the second separation, in the state where PRP (platelet-containing plasma) and PPP (platelet-free plasma) were separated, 4 ml of PPP in the upper layer was slowly removed with a 10cc syringe, and the remaining PRP 4ml was mixed well.
  • Example 2-2 the pH of the excipients of the composition for enhancing stem cell storage stability of each experimental group was analyzed.
  • Thermo Scientific's Orion Star A111 was used to analyze the pH change by albumin and human serum included in the composition for enhancing stem cell storage stability.
  • NaHCO 3 sodium bicarbonate
  • Adipocytes isolated by the method of Example 1 were washed with PBS, and then cells were prepared by the method of Example 5-1. As shown in Table 11, two kinds of stem cells were composed of a control group and six experimental groups, and cell number, viability and cell size were examined up to 9 days.
  • control group SA: Saline + 0.3% albumin
  • experimental group containing 10% plasma or 10% serum was up to 50% higher than the control group.
  • the effect of increasing the survival rate of more than% was confirmed (Figs. 5 and 6).
  • Serum concentration of 50% showed the highest cell viability, but it was confirmed that the experimental group containing 30% serum also showed cell viability of 90% or more until 9 days (Figs. 5 and 6).
  • stem cells when preserving stem cells using a preservative including serum or plasma, it was confirmed that the stem cells can be stored for a long time without change in cell number, viability and cell size by enhancing the storage stability of stem cells.
  • the storage stability of stem cells was compared by increasing the concentration of serum as a method to enhance the effect of the storage stabilizer.
  • serum / SA serum + 0.3% albumin
  • the survival rate was increased after increasing the serum concentration to 10, 30, and 50%.
  • the stabilizer containing 50% serum showed the highest survival rate.
  • the stabilizing agent containing 10% serum maintained a survival rate of 80% or more for 7 days, and the stabilizer containing 30% serum showed a very high survival rate of 90% or more for 9 days (FIG. 10). This indicates that serum plays a large role in maintaining the survival rate of refrigerated cells.
  • composition for enhancing the storage stability of stem cells according to the present invention can maintain a survival rate of at least 90% or more without changing the properties, number and size of the stem cells for more than 9 days, long-term transport and effect of stem cells for cell therapy It is also useful for the manufacture of superior cell therapeutic injection products.

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 보관 안정성을 증진시킬 수 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물은, 줄기세포의 성상, 세포수 및 크기의 변화 없이 90% 이상의 생존율을 9일 이상 유지할 수 있으므로, 세포치료용 줄기세포의 장기간 운송 및 효과가 우수한 세포치료제 주사제품의 제조에도 유용하다.

Description

줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물
본 발명은 줄기세포의 보관 안정성을 증진시킬 수 있는 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포로, 만능줄기세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cells)로 분류할 수 있다.
만능 줄기세포(totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다. 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells)는 외배엽, 중배엽, 내배엽층 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로, 수정 4-5일 후 나타나는 배반포(blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴(inner cell mass)에서 유래하며 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다. 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포이다.
다분화능 줄기세포는 성체 골수에서 최초로 분리되었고(Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그 후 다른 여러 성체 조직에서도 확인되었다(C.M. Verfaillie et al., Trends Cell Biol. 12:502, 2002). 그러나, 골수와 같은 성체 조직내의 줄기세포는 매우 드물게 존재하고, 이러한 세포들은 분화유도 하지 않고 배양하기 어려워서, 특이적으로 스크린 된 배지들이 없으면 그 세포들을 배양하기 어렵다. 즉, 줄기 세포들을 분리하여 체외에서 보존하기가 매우 어렵다는 단점이 있다.
최근, 지방 조직이 다분화능 줄기세포의 새로운 소스임이 밝혀졌으며(B. Cousin et al., BBRC, 301:1016, 2003; A. Miranville et al., Circulation, 110:349, 2004; S. Gronthos et al., J. Cell Physiol. 189:54, 2001; M.J. Seo et al., BBRC, 328:258, 2005), 지방추출(지방흡입술(liposuction))에 의해 얻어진 인간 지방조직에 미분화 세포군이 포함되어 있고, 이것이 in vitro상에서 지방세포, 골 형성세포, 근원세포 및 연골모세포로의 분화능을 갖는다는 것이 보고되었다(P.A. Zuk et al., Tissue Eng. 7:211, 2001; A.M. Rodriguez et al., BBRC, 315:255, 2004). 아울러 지방 조직 유래 세포가 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있다는 것이 동물 모델 실험을 통하여 알려진 바 있다. 이러한 지방 조직은 대량으로 추출할 수 있다는 장점이 있어, 기존의 단점을 보완하는 새로운 줄기세포의 소스로 주목 받고 있다.
대량으로 획득이 가능해진 줄기세포는 주로 난치병 등의 치료를 포함한 의학 분야 및 미용, 성형 등의 목적으로 줄기세포 자체를 주사하는 세포치료제로서의 이용이 늘어나고 있는 추세이다.
세포치료제 용도의 줄기세포는 배양 후 바로 환자에 시술이 가능할 경우에는 문제가 없으나, 환자의 상태에 따라 줄기세포 시술 시기의 조절이 필요한 경우에는 줄기세포 배양 후 장기간 보존이 필요하다. 또한, 배양한 줄기세포를 시술할 장소까지 장거리 운송이 필요한 경우에도 줄기세포의 안정적인 공급이 필수적이다. 이를 위해, 5~10일 정도의 장기간 동안 줄기세포의 높은 생존율을 유지하는 것이 필요하며, 현재 세포를 동결하지 않고 장기간 유지할 경우, 세포 생존율이 현저하게 낮아지는 문제가 있다. 그러나, 세포 동결법은 해동 당시의 세포 생존율이 현저히 떨어지며, 생물학적 관점에서 줄기세포로서의 기능성 등의 문제가 있다. 또한, 동결 상태로의 운송은 냉장 운송보다 힘들다는 단점이 있다.
현재 냉장상태로 줄기세포를 보존하는 종래 기술로는, 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 냉장조건에서 생리식염수에 부유하여 보관하는 기술이 있으나, 이 경우 48시간 이상 보관 시 70% 이상의 생존율을 나타내기 어렵다. 이를 개선하기 위해 슈크로오스나 알부민을 첨가하는 경우 48시간 내지 72시간까지는 생존율이 70% 이상을 나타내며, 보관 안정성이 향상되는 것을 확인된 바 있다(대한민국 특허 제2008-0103637호). 하지만, 72시간 이후 생존율이 급격히 감소하므로, 냉장조건(4℃)에서 세포치료제에 포함된 줄기세포의 생존율을 장기간 안정적으로 높게 유지해 주는 보관 안정성 증진용 조성물의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 장시간 냉장 보관 시에도 줄기세포의 생존율을 높게 유지시키기 위해 예의 노력한 결과, 혈청 또는 혈장을 함유하는 경우 냉장 상태에서 줄기세포의 생존율이 9일 이상 높게 유지되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다. 인간혈청을 세포 배양을 위한 배지 조성물로 사용한 경우는 있으나(대한민국 특허 제10-0394430호), 인간 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 보관 안정성 증진용 조성물에 대하여는 개시된 바가 없다.
발명의 요약
본 발명의 목적은, 5~80%(v/v) 함량의 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 5~80%(v/v) 함량의 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품을 제공한다.
도 1은 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 자가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 0.5×107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
도 2는 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 자가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 1.0×107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
도 3은 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 타가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 0.5×107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
도 4는 서로 다른 농도(10, 20, 30%)의 타가혈청 및 0.3% 알부민을 함유한 보존제로 1.0×107 줄기세포를 냉장 보관하여 0~144 시간까지 보존 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 비교한 것이다. 대조군은 0.3% 알부민을 함유한 보존제를 사용하였다.
도 5는 줄기세포 ＃1의 대조군(saline/ 0.3% 알부민) 및 각각의 다른 조건의 보관 안정성 증진용 조성물 실험군(1~6)의 세포수, 생존율 및 세포 크기의 변화를 비교한 결과이다.
도 6은 줄기세포 ＃2의 대조군(saline/ 0.3% 알부민) 및 각각의 다른 조건의 보관 안정성 증진용 조성물 실험군(1~6)의 세포수, 생존율 및 세포 크기의 변화를 비교한 결과이다.
도 7은 세포 생존율에 대한 보존제 pH의 영향을 확인한 결과이다.
도 8은 세포 생존율에 대한 혈청 및 혈장의 효과를 비교한 결과이다.
도 9는 세포 생존율에 대한 알부민의 영향을 확인한 결과이다.
도 10은 세포 생존율에 대한 혈청 농도의 효과를 비교한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포 보존제가 냉장상태의 줄기세포의 생존율을 95% 이상 유지함으로써, 줄기세포의 보관 안정성이 증진되는 것을 밝혔다. 본 발명의 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포 보존제는 냉장상태의 줄기세포 생존율을 9일 이상 높게 유지 가능함으로, 세포치료용 줄기세포의 안정적인 공급에 유용하다.
본 발명에서 용어 "세포치료제 주사제품" 또는 "세포치료제"란 조직의 결함을 치료하기 위해 줄기세포를 함유하여 비경구투여, 즉 주사의 형태로 결함부위 또는 그 인접부위에 주사되어, 결함을 교정할 수 있는 약학 조성물을 의미한다.
본 발명에서 용어 "부형제"란 약학 조성물의 약리학적 특성을 나타내는 유효성분 외, 일정 용량, 중량을 주어 취급을 용이하게 할 목적으로 첨가되거나 액체의 형태 등 형태를 유지하기 위하여 부가하는 물질을 의미하는 것으로, 일반적으로는 액체 형태를 위한 부형제로 생리식염수(Saline), 하트만-D 용액, PBS(Phosphate Buffered Saline) 등을 이용하고 있으나, 그 외 여러 가지 조성을 포함할 수 있는 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어 "지방조직 유래 줄기세포"란 지방조직에서 분리해 낸 미분화 줄기세포로, 그 분리 방법은 다음과 같을 수 있다. 지방흡입술로 얻어지는 생리식염수에 부유된 지방 함유 suspension을 배양한 다음, 배양용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신 처리하여 회수하거나 스크래퍼로 긁어 회수하는 방법을 통해 지방조직 유래 줄기세포를 분리할 수 있다.
본 발명의 줄기세포를 얻기 위해, 하기와 같은 방법으로 획득할 수 있다.
우선, 지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척한 다음, 조직을 잘게 자른 후 콜라겐 분해 효소를 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 분해후, PBS로 세척하고 원심분리 한다. 상층액은 제거하고 펠렛은 PBS로 세척한 후 다시 원심분리하여, 100㎛ 매쉬를 이용하여 부유물을 제거한 다음, PBS로 세척하였다. DMEM(10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM 아스코브산) 배지에서 배양하고, 하룻밤 지난 후 배양용기에 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 케라티노사이트-SFM(FBS, NAC, 아스코브산, 칼슘, rEGF, 인슐린, bFGF 및 하이드로코티손) 배지를 2일마다 교체하면서 계대배양하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다. 이 외에도, 당업계에 이미 공지된 방법으로 줄기세포를 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 10~50%(v/v)의 자가 또는 타가 인간혈청 및 0.3% 알부민이 포함된 조성물 또는 인간혈장 및 0.3% 알부민이 포함된 조성물에 부유시켜 냉장(4℃) 상태에서 시간에 따른 세포의 크기, 성상, 세포수 및 생존율을 분석하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 5~80%(v/v) 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 혈청의 함량은 10~50%(v/v)인 것이 바람직하고, 혈장의 함량은 5~50%(v/v)인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 혈청은 인간을 포함하는 포유류 유래 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 동종유래의 혈청 또는 혈장인 것이 바람직하며, 자가 또는 타가혈청 또는 혈장의 사용에 제한이 없다.
본 발명에 있어서, 상기 냉장보관은 0.1~10℃ 온도범위인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 추가로 알부민 및 부형제를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 알부민의 함량은 0.1~1%(v/v)인 것이 바람직하고, 0.2~0.5%(v/v)인 것이 더욱 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 부형제는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 "v/v"은 생리식염수에 부유시킨 줄기세포의 용량(부피 퍼센트)에 1~80%의 혈청 및 0.1~1%의 알부민이 첨가되어 전체 용량(부피 퍼센트)이 100%가 되는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포의 농도는 1.0×105~1.0×109 cell/ml인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1.0×106~1.0×108 cell/ml인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 지방, 제대혈, 골수, 근육, 태반 및 피부로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 지방조직 유래인 것이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 줄기세포는 인간을 포함하는 포유류 유래 줄기세포인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품에 관한 것이다.
본 발명에 따른 주사제품은 환자의 체질 및 결함의 종류에 따라 당업계에 통상적으로 알려진 분량을 취하여 충진된 주사의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제품은 치료하고자 하는 결함에 인접한 부위 또는 결함부위에 주사되어 이용될 수 있으며, 이러한 방법으로 교정될 수 있는 결함은 주름, 튼살, 흉터, 피부함몰, 입술성형부전, 치주 결함, 연부조직 결함, 뼈 결함, 화상, 피부궤양 등 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포치료제 주사제품은 필요한 경우, 추가로 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성제, 희석제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황환원제, 산화방지제 등을 적절히 첨가할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양
지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척하였다. 조직을 잘게 자른 후 collagenase type1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM media를 이용해 37℃에서 2시간 동안 조직을 분해시켰다. 콜라게나아제 처리된 조직을 PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하여, 상층액을 제거하고, 펠렛을 PBS로 세척한 후 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎛ mesh에 필터링하여 부유물을 제거한 후 PBS로 세척하고, 10% FBS, 2mM NAC(N-acetyl-Lcysteine), 0.2mM ascorbic acid가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 하룻밤 지난 후 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5ng/ml rEGF, 5㎍/ml 인슐린, 10ng/ml bFGF 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM media을 2일마다 교체하면서 계대배양하여 지방조직 유래 중간엽 줄기세포를 분리하였다.
실시예 2: 실험군 구성 및 부형제별 pH 측정
2-1: 실험군의 구성
실시예 1의 방법으로 분리된 각각 다른 4가지 지방 줄기세포를 4℃에서 냉장보관하여, 냉장제형 세포치료제 주사제품에 사용되는 줄기세포의 생존율을 분석하였다.
표 1
Figure PCTKR2015000595-appb-T000001
분리된 4가지 지방줄기세포는 표 1과 같이 실험군을 구성하였다. 0.3% 알부민이 포함된 줄기세포 대조군, 0.3% 알부민 ＋ 10% 자가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 + 10% 타가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 ＋ 20% 자가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 + 20% 타가혈청이 포함된 실험군, 0.3% 알부민 ＋ 30% 자가혈청이 포함된 실험군 및 0.3% 알부민 ＋ 30% 타가혈청이 포함된 실험군으로 구성하여 생존율을 분석하였다.
2-2: 부형제 별 pH 값
본 실시예에서는 줄기세포 보관 안정성 증진용 조성물의 부형제에 대한 pH를 분석하였다.
pH는 수소이온 농도를 수치화한 것이며, 일반적인 생리식염수(Saline)의 경우 pH 범위가 약 5.5~8.0으로 넓게 나타나므로, 생리식염수에 알부민 및 인간혈청이 첨가되었을 때의 pH 변화를 PBS와 함께 비교하였다. 정상적인 건강한 상태의 pH는 세포, 혈액, 체액 등이 약알칼리성을 유지하는 경우이다.
pH 분석은 Thermo Scientific사(社)의 Orion Star A111를 사용하여, 줄기세포 보관 안정성 증진용 조성물에 포함되는 알부민과 인간혈청에 의한 pH 변화를 분석하였다. 또한 pH는 측정 온도에 의해 영향을 받으므로 20~24℃ 범위의 상온에서 측정하였다.
표 2
Figure PCTKR2015000595-appb-T000002
그 결과, 표 2에 나타난 것과 같이, 알부민만 첨가된 경우에 약간 상승한 pH는 인간혈청이 첨가되어 약알칼리성 pH를 유지하는 것을 확인할 수 있었다.
이에, 이후 실시예 3에서는 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유된 줄기세포 대조군 및 각각 10, 20, 30% 자가 인간 혈청과 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유된 줄기세포 실험군과 각각 10, 20, 30% 타가 인간 혈청과 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유된 줄기세포 실험군으로 생존력 분석을 실시하였다.
실시예 3: 시간에 따른 줄기세포 크기 및 성상 분석
실시예 1의 방법으로 분리된 지방줄기세포는 PBS로 세척 후, 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시켜 각각 10, 20, 30%의 자가 및 타가 인간혈청을 첨가하여, 실시예 2의 대조군 및 실험군으로 구성하였다.
각 실험 군당 줄기세포를 1.0×107세포/ml의 농도로 3cc 주사기에 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 냉장제형 세포치료제 주사제품에 사용되는 줄기세포의 크기 및 성상을 분석하였다.
3-1: 자가혈청 실험군
세포 1은 0.5×107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 자가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 2는 1.0x107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 자가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 1의 대조군, 실험군 3개 및 세포 2의 대조군, 실험군 3개 모두 3cc 시린지에 줄기세포를 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 세포의 크기, 성상 및 총 세포수를 분석하였다. 줄기세포의 세포의 세포수 및 크기는 Invitrogen사(社)의 Countess™ Automated Cell Counter를 사용하여 분석하였으며, 성상 분석은 육안으로 확인하였다.
표 3
Figure PCTKR2015000595-appb-T000003
표 4
Figure PCTKR2015000595-appb-T000004
표 5
Figure PCTKR2015000595-appb-T000005
표 6
Figure PCTKR2015000595-appb-T000006
결과는 표 3(세포 1의 세포수), 표 4(세포 1의 크기), 표 5(세포 2의 세포수) 및 표 6(세포 2의 크기)에 나타냈다.
표 3~6에 나타난 바와 같이, 대조군의 세포 크기의 변화는 약 15~25% 정도 감소한 반면, 자가 인간혈청이 함유된 실험군의 세포 크기의 변화는 약 3~10% 정도로 크게 변화가 나타나지 않았다. 반면, 세포의 성상은 대조군과 실험군 모두 변화가 관찰되지 않았으며, 총 세포수 또한 대조군과 실험군에서 차이가 없었다.
3-2: 타가혈청 실험군
세포 3은 0.5×107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 타가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 4는 1.0×107 줄기세포를 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 대조군 및 각각 10, 20, 30% 타가혈청/0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시킨 줄기세포 실험군 3개를 준비하였다.
세포 3의 대조군, 실험군 3개 및 세포 4의 대조군, 실험군 3개 모두 3cc 시린지에 줄기세포를 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 세포의 크기, 성상 및 총 세포수를 분석하였다. 줄기세포의 세포의 세포수 및 크기는 Invitrogen사(社)의 Countess™ Automated Cell Counter를 사용하여 분석하였으며, 성상 분석은 육안으로 확인하였다.
표 7
Figure PCTKR2015000595-appb-T000007
표 8
Figure PCTKR2015000595-appb-T000008
표 9
Figure PCTKR2015000595-appb-T000009
표 10
Figure PCTKR2015000595-appb-T000010
결과는 표 7(세포 3의 세포수), 표 8(세포 3의 크기), 표 9(세포 4의 세포수) 및 표 10(세포 4의 크기)에 나타냈다.
표 7~10에 나타난 바와 같이, 대조군의 세포 크기의 변화는 약 20% 정도 감소한 반면, 타가 인간혈청이 함유된 실험군의 세포 크기의 변화는 약 3~10% 정도로 크게 변화가 나타나지 않았다. 반면, 세포의 성상은 대조군과 실험군 모두 변화가 관찰되지 않았으며, 총 세포수 또한 대조군과 실험군에서 차이가 없었다.
실시예 4: 시간에 따른 줄기세포 생존율 분석
실시예 3과 같은 조건으로 시간에 따른 줄기세포의 생존율을 분석하였다.
분리된 지방줄기세포는 PBS로 세척 후, 0.3% 알부민이 포함된 생리식염수(saline)에 부유시켜 각각 10, 20, 30%의 자가 및 타가 인간혈청을 첨가하여, 각각의 대조군 및 실험군으로 구성하였다. 각 실험 군당 줄기세포를 1.0×107세포/ml의 농도로 3cc 주사기에 충진한 후, 4℃에 냉장보관하고 0, 24, 48, 72, 96, 120 및 144시간 후에 냉장제형 세포치료제 주사제품에 사용되는 줄기세포의 생존율을 분석하였다. 줄기세포의 생존율 측정은 세포와 트립판 블루 용액을 1:1로 혼합하여 Invitrogen사(社)의 Countess™ Automated Cell Counter를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 인간혈청을 함유한 조성물은 0.3% 알부민만 함유한 대조군에 비해, 세포수의 큰 변화 없이 생존율이 높게 나타났으며, 혈청농도가 높을수록 생존율이 더 높고 세포의 안정성 유지 기간도 길어지는 것을 확인하였다(도 1, 2, 3 및 4).
특히, 30% 혈청 함유 줄기세포인 실험군 3은 144시간까지 98% 이상의 매우 높은 세포 생존율을 유지하였으며, 10~20% 혈청 함유 실험군에서도 72시간 이후까지 90% 이상의 생존율을 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 자가혈청 실험군(도 1 및 2)과 타가혈청 실험군(도 3 및 4) 간에 세포의 보존 시간에 따른 생존율의 효과 차이는 없는 것으로 나타났다.
따라서, 인간 혈청에 의한 줄기세포의 보관 안정성 증진은 144시간 이상의 장시간 생존율 유지가 가능하며, 자가혈청과 타가혈청의 효과에는 차이가 없음을 확인하였다.
실시예 5: 새로운 실험군 구성
상기 실시예에서 자가 및 타가 혈청간에 효과의 차이가 없음을 확인한 후, 혈청 농도별 및 혈장에 의한 세포 안정성 효과를 조사하기 위한 실험군을 구성하였다.
대조군 (SA : Saline ＋ 0.3 % Albumine)과 다양한 혈청 농도(10~50%) 또는 혈장(PRP)으로 구성된 6가지 실험군은 표 11에 나타냈으며, 9일까지 세포 냉장보존 안정성을 측정하였다.
표 11
Figure PCTKR2015000595-appb-T000011
5-1: 줄기세포
실시예 1의 방법으로 분리된 각각 다른 2가지 지방 줄기세포를 4℃에서 냉장보관하여, 냉장제형 세포치료제 주사제품에 사용되는 줄기세포의 생존율을 분석하였다.
각 세포당 4.9 × 108 cells (1.0 × 107 cells/ml 49개 준비)을 준비하였다. 2 계대 세포를 해동하여(6.0 × 106 cells을 T175 플라스크 5개에 해동) 배양(3 계대에 4.9 × 107 cells을 T175 플라스크 49개에 배양) 한 후, 4 계대째 회수(4.9 × 108 cells)후 충진하여 실험하였다.
4 계대째 회수된 세포는 7개의 튜브에 7.0 × 107 cells씩 나누어 표 11의 7가지 보존제 7ml과 혼합한 후, 실험군(보존제)당 시간별(0, 1, 2, 3, 5, 7, 9일)로 7개의 3cc 주사기에 1ml씩 충진하였다. 0일째 샘플은 바로 세포수, 생존율, 세포크기를 측정하였으며, 나머지 샘플은 1, 2, 3, 5, 7, 9일 동안 냉장상태로 보관한 후, 세포수, 생존율, 세포크기 Cedex를 이용하여 측정하였다.
5-2: 혈청 및 혈장
혈청을 분리하기 위해, 항응고제가 들어있지 않은 채혈튜브를 이용하여 혈액 10ml을 채취한 후, 냉장에 10분간 세워두었다. 1000RCF에서 15분간 원심분리(브레이크 0)하여 피브린을 제거하고, 분리된 상층액인 혈청을 회수하였다. 회수된 혈청은 1700rpm으로 5분간 원심분리(브레이크 0)한 후, 상등액을 수거하여 0.2㎛ 주사기필터를 사용하여 멸균하여 준비하였다.
혈장은 20cc 주사기에 항응고제 2cc를 넣고 채혈 후, Dr.PRP kit로 혈장과 적혈구를 1차 분리한 뒤 3200rpm으로 6분 동안 원심분리하여 혈소판을 응축하여 2차 분리하였다. 2차 분리 후 PRP(혈소판이 포함된 혈장)와 PPP(혈소판이 포함되지 않은 혈장)가 분리된 상태에서 10cc 주사기로 위층의 PPP 4ml을 천천히 제거하고 남은 PRP 4ml을 잘 혼합하여 사용하였다.
5-3: 부형제의 pH
실시예 2-2에서와 같이, 각각 실험군별 줄기세포 보관 안정성 증진용 조성물의 부형제에 대한 pH를 분석하였다.
pH 분석은 Thermo Scientific사(社)의 Orion Star A111를 사용하여, 줄기세포 보관 안정성 증진용 조성물에 포함되는 알부민과 인간혈청에 의한 pH 변화를 분석하였다.
표 12
Figure PCTKR2015000595-appb-T000012
그 결과, 혈청 첨가 줄기세포 보관 안정제의 평균 pH 값이 8.2로 측정되어, saline(pH=7.3)에 8.4% 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 pH buffer로 사용하여 pH를 8.2로 설정하였으며, 혈장의 경우에는 양이 매우 적어 pH 측정이 불가능하였다.
실시예 6: 시간에 따른 줄기세포의 세포수, 생존율 및 크기 변화
실시예 1의 방법으로 분리된 지방줄기세포는 PBS로 세척 후, 실시예 5-1의 방법으로 세포를 준비하였다. 2가지 종류의 줄기세포에 대해 표 11과 같이, 대조군 및 6개의 실험군으로 구성하여 9일까지 세포수, 생존율 및 세포 크기를 조사하였다.
그 결과, 혈청 또는 혈장이 포함되지 않은 대조군 (SA : Saline + 0.3 % 알부민)은 최대 3일까지 80% 정도의 생존율을 유지하였으나, 10% 혈장 또는 10% 혈청이 포함된 실험군은 대조군보다 최대 50% 이상 생존율이 증가하는 효과를 확인하였다(도 5 및 도 6).
혈청의 농도는 50%에서 세포 생존율이 가장 높게 나타났으나, 30% 혈청이 포함된 실험군도 9일까지 90% 이상의 세포 생존율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 5 및 도 6).
따라서, 혈청 또는 혈장이 포함된 보존제를 사용하여 줄기세포를 냉장보관할 경우, 줄기세포의 보관 안정성을 증진시켜 세포수, 생존율 및 세포 크기에 변화 없이 줄기세포를 장기간 보관할 수 있음을 확인하였다.
실시예 7: 줄기세포 보관 안정제 비교
실시예 6에서 줄기세포 ＃1(도 5) 및 줄기세포 #2(도 6)의 생존율을 분석한 결과, 세포 1과 세포 2의 차이가 거의 없는 것으로 나타났으므로, 본 실시예에서는 세포 1에 대한 안정제 별 효과를 비교하였다.
줄기세포 보관 안정제의 영향 요소 중 pH의 영향을 조사하기 위해, 탄산수소나트륨(NaHCO3)을 pH buffer로 사용하였으며 안정제의 pH 값은 8.2로 설정하였다. 그 결과, 대조군(SA : Saline ＋ 0.3 % 알부민)에서 세포 생존기간은 최대 1일 정도로 나타났다(도 7). 따라서, pH값을 8.2로 설정한 안정제는 세포의 안정성 증진에는 효과가 없는 것으로 나타났다.
다음으로, 혈청과 혈장의 효과를 비교하였다. 10% 혈청 또는 10% 혈장이 포함된 안정제의 경우, 대조군에 비해 최대 50% 이상 생존율이 증가된 것을 알 수 잇었으며, 혈청과 혈장의 차이는 크지 않고 비슷한 추세의 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다(도 8).
안정제에 포함된 알부민의 효과를 알아보기 위하여, 30% 혈청 /saline과 30% 혈청 /SA (saline ＋ 0.3% 알부민)을 사용한 줄기세포 보관 안정성을 조사하였다. 그 결과 0.3% 알부민이 포함된 경우, 세포 안정성이 좀 더 높게 나타나는 것을 확인하였다(도 9). 그러나, 9일까지 두 실험군의 차이가 미비하여 혈청과 알부민의 혼합이 안정제의 효과에 크게 영향을 미치지는 않는 것을 알 수 있었다.
따라서, 보관 안정제의 효과를 증진시키기 위한 방법으로 혈청의 농도를 증가시켜 줄기세포의 보관 안정성을 비교하였다. 혈청 /SA (saline ＋ 0.3% 알부민) 실험군에서 혈청의 농도를 10, 30, 50%로 증가시킨 후 생존율을 측정한 결과, 50% 혈청이 포함된 안정제가 가장 높은 생존율을 나타냈다. 또한, 10% 혈청이 포함된 안정제에서도 7일간 80% 이상의 생존율을 유지하였으며, 30% 혈청이 포함된 안정제도 9일간 90% 이상의 매우 높은 생존율을 나타내는 것을 확인하였다(도 10). 이는, 혈청이 냉장상태 세포의 생존율을 유지하는데 큰 역할을 한다는 것을 나타낸다.
본 발명에 따른 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물은, 줄기세포의 성상, 세포수 및 크기의 변화 없이 90% 이상의 생존율을 9일 이상 유지할 수 있으므로, 세포치료용 줄기세포의 장기간 운송 및 효과가 우수한 세포치료제 주사제품의 제조에도 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

  1. 5~80%(v/v) 함량의 혈청 또는 혈장을 함유하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈청의 함량은 10~50%(v/v)인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 혈장의 함량은 5~50%(v/v)인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 냉장보관 온도는 0.1~10℃ 인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 알부민 및 부형제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 알부민의 함량은 0.1~1%(v/v)인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 알부민의 함량은 0.2~0.5%(v/v)인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 부형제는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포의 농도는 1.0×105 ~ 1.0×109 cells/ml인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 지방, 제대혈, 골수, 근육, 태반 및 피부로 구성된 군에서 선택된 조직 유래인 것을 특징으로 하는 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 줄기세포의 냉장보관 안정성 증진용 조성물을 함유하는 세포치료제 주사제품.
  12. 제11항에 있어서, 현탁제, 용해보조제, 안정화제, 등장화제, 보존제, 흡착방지제, 계면활성제, 희석제, pH 조정제, 무통화제, 완충제, 함황환원제, 산화방지제로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 세포치료제 주사제품.
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