WO2016047230A1 - 人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法 - Google Patents

人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法 Download PDF

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雄矢 森本
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Definitions

  • the present invention relates to an artificial three-dimensional tissue and a manufacturing method thereof, an artificial three-dimensional tissue perfusion device, and a drug evaluation method using the artificial three-dimensional tissue.
  • Patent Document 1 discloses that a coated cell having a cell surface coated with a coating containing an extracellular matrix component is cultured to form a dermal tissue layer in which the coated cell is laminated, and an epidermal cell is formed on the dermal tissue layer.
  • a technique for manufacturing an artificial skin model by arranging and forming an epidermis layer is disclosed.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and aims to provide a high-quality artificial three-dimensional tissue and a manufacturing method thereof, an artificial three-dimensional tissue perfusion device, and a drug evaluation method using the artificial three-dimensional tissue. To do.
  • a method for producing an artificial three-dimensional tissue extending in a predetermined direction, a culture vessel having a culture space surrounded by side walls, and penetrating the opposing side walls into the culture space.
  • a method for producing an artificial three-dimensional tissue comprising: removing the flow channel forming member from the artificial three-dimensional tissue to form a perfusion channel that penetrates the artificial three-dimensional tissue. Is done.
  • the artificial three-dimensional tissue is manufactured by the manufacturing method of the first aspect of the present invention, the drug is brought into contact with the artificial three-dimensional tissue, and the drug is contacted. Measuring a response of the artificial three-dimensional tissue to a stimulus, and providing a method for evaluating a drug using the artificial three-dimensional tissue.
  • an artificial three-dimensional tissue perfusion device in which perfusion is performed on an artificial three-dimensional tissue extending in a predetermined direction, the culture tank having a culture space surrounded by a side wall, and facing the culture tank
  • An artificial body comprising a support portion that attaches and detachably supports a flow path forming member suspended along the predetermined direction in a region through which the artificial three-dimensional tissue is disposed in the culture space through the side wall.
  • a three-dimensional tissue perfusion device is provided.
  • an artificial three-dimensional tissue extending in a predetermined direction, wherein the artificial three-dimensional tissue has a perfusion channel that penetrates the inside and extends in the predetermined direction.
  • the present invention it is possible to provide a high-quality artificial three-dimensional tissue and a manufacturing method thereof, an artificial three-dimensional tissue perfusion device, and a drug evaluation method using the artificial three-dimensional tissue.
  • FIG. 1 is a perspective sectional view schematically showing an artificial skin tissue 1 according to an embodiment of the present invention.
  • 1 is a schematic configuration diagram of an artificial skin tissue manufacturing system 30.
  • FIG. 1 is an external perspective view of a first embodiment of a perfusion device 40.
  • FIG. It is the front view which looked at the engaging part 42c in the axial direction.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG. 4. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue.
  • FIG. 3 is a view in which droplets are applied to the surface of the skin layer 20.
  • FIG. 3 is a view in which droplets are applied to the surface of the skin layer 20.
  • FIG. 3 is a view in which droplets are applied to the surface of the skin layer 20.
  • FIG. 3 is a figure which shows the artificial skin tissue 1 cut in the vertical direction. It is the figure which observed a mode that a bubble moved through perfusion channel.
  • FIG. It is a figure which shows the sealing success rate with respect to the thickness of a sealing material, and the average amount of the extracellular matrix component 11 which leaks from the clearance gap between the attaching parts of the baseplate 47.
  • FIG. It is a schematic perspective view of the perfusion device 40A of 2nd Embodiment. 3 is a cross-sectional view taken along a vertical plane including a length direction of a biological model F.
  • FIG. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue 1 which concerns on 2nd Embodiment. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue 1 which concerns on 2nd Embodiment. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue 1 which concerns on 2nd Embodiment. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue 1 which concerns on 2nd Embodiment. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin tissue 1 which concerns on 2nd Embodiment. It is a figure which shows the manufacture procedure of the artificial skin
  • an embodiment of an artificial three-dimensional tissue and a manufacturing method thereof, an artificial three-dimensional tissue perfusion device, and a drug evaluation method using the artificial three-dimensional tissue of the present invention will be described with reference to FIGS.
  • an example in which an artificial skin tissue is manufactured as an artificial three-dimensional tissue will be described.
  • the following embodiment shows one aspect of the present invention and does not limit the present invention, and can be arbitrarily changed within the scope of the technical idea of the present invention.
  • the actual structure is different from the scale and number of each structure.
  • FIG. 1 is a perspective sectional view schematically showing an artificial skin tissue 1 which is an artificial three-dimensional tissue.
  • the artificial skin tissue 1 includes a dermis tissue layer 10 and an epidermis layer 20.
  • the artificial skin tissue 1 has a predetermined direction (horizontal direction in FIG. 1) along a plane orthogonal to the direction in which the dermis tissue layer 10 and the epidermis layer 20 are laminated (vertical direction in FIG. 1, hereinafter referred to as a lamination direction). Hereinafter, it is formed to extend in the first direction).
  • the epidermal layer 20 is formed by seeding and culturing epidermal cells 21 on the dermis tissue layer 10.
  • epidermal cells 21 for example, epidermal keratinocytes can be used.
  • epidermal cells include cells derived from mammals such as humans, mice, and rats, and human-derived epidermal cells are preferred.
  • human-derived epidermal cells include epidermal keratinocytes and epidermal melanocytes, with epidermal keratinocytes being preferred.
  • epidermal keratinocytes include normal human epidermal keratinocytes (NHEK).
  • epidermal melanocytes include normal human epidermal melanocytes (NHEM).
  • the dermal tissue layer 10 is formed by culturing dermal cells 12 in the extracellular matrix component 11.
  • the extracellular matrix component 11 is not particularly limited.
  • collagen type I, type II, type III, type V, type XI, etc.
  • mouse EHS tumor extract type IV collagen, laminin, heparan sulfate proteoglycan, etc.
  • a base membrane component trade name: Matrigel
  • gelatin agar, agarose, fibrin, glycosaminoglycan, hyaluronic acid, proteoglycan, etc.
  • fibroblasts can be used as the dermal cells 12, for example.
  • fibroblasts include cells derived from mammals such as humans, mice and rats, and human-derived fibroblasts are preferred.
  • Human-derived fibroblasts include human skin fibroblasts (Normal Human Dermal Fibroblasts: NHDF), human lung fibroblasts: Human Pulmonary Fibroblasts (HPF), human cardiac fibroblasts: Human Cardiac Fibroblasts (HCF), human aorta Outer membrane fibroblasts: Human Aortic vent Adventitial Fibroblasts (HAoAF), human uterine fibroblasts: Human Uterine Fibroblasts (HUF), human chorionic mesenchymal fibroblasts: Human Villous Mesenchymal Fibroblasts (HVMF) Fibroblasts (NHDF) are preferred.
  • the dermis tissue layer 10 has a perfusion channel 13 that extends through the inside of the dermis tissue layer 10 in the first direction.
  • the perfusion channel 13 is a channel through which a medium (details will be described later) is perfused when the epidermal cells 21 are cultured.
  • a lumen layer 15 formed using vascular cells 14 is provided on the surface of the perfusion channel 13.
  • the vascular cells 14 for example, endothelial cells can be used.
  • vascular cells examples include vascular epithelial cells and vascular endothelial cells, and vascular endothelial cells are preferred.
  • vascular endothelial cells examples include cells derived from mammals such as humans, mice and rats, and human-derived vascular endothelial cells are preferred.
  • Human-derived vascular endothelial cells include human umbilical vein endothelial cells (Human Umbilical Vein Endothelial Cells: HUVEC), human umbilical artery endothelial cells (Human Umbilical Artery Endothelial Cells: HUAEC), human coronary artery endothelial cells (Human Coronary Artery Cellous: HCAEC), human saphenous vein endothelial cells (Human Saphenous Vein Endothelial Cells: HSaVEC), human human pulmonary artery endothelial cells (Human Pulmonary Artery Endothelial Cells: HPAEC), human human aortic endothelial cells (Human Aortic ⁇ Endothelial Cells: HAoEC) Endothelial cells (Human Dermal Endothelial : Cells: HDMEC), Human skin vascular endothelial cells (Human Dermal H Blood Endothelial Cells: HDBEC), Human skin
  • FIG. 2 is a schematic configuration diagram of the artificial skin tissue manufacturing apparatus 30.
  • the artificial skin tissue manufacturing apparatus 30 includes a perfusion device (artificial three-dimensional tissue perfusion device) 40, a culture dish 50, and a pump 60.
  • a perfusion device artificial three-dimensional tissue perfusion device
  • the pump 60 supplies the culture medium to the perfusion device 40 via the pipe 61.
  • the pump 60 collects the medium M discharged into the culture dish 50 via the perfusion device 40 via the pipe 62.
  • FIG. 3 is an external perspective view of the first embodiment of the perfusion device 40.
  • the perfusion device 40 includes a culture tank 41, a connector (support part) 42, and a wire (linear member, flow path forming member) 43.
  • the culture tank 41 includes a culture space 45 that is open at the top surrounded by a side wall 44, and a bottom plate 47 provided on a bottom wall (bottom part) 46.
  • the side wall 44 is provided in a rectangular shape in plan view.
  • the bottom wall 46 has an opening 46a penetrating in the vertical direction and a groove 46c provided in the bottom surface 46b.
  • the groove 46c extends in the first direction and opens into the internal space of the culture dish 50 at both ends.
  • the bottom plate 47 can be attached to and detached from the culture tank 41.
  • the bottom plate 47 closes the opening 46 a when attached to the bottom wall 46 of the culture tank 41.
  • the connector 42 has a mounting part (cylinder part) 42a, a connecting part 42b, an engaging part 42c, and a through hole 42d penetrating therethrough.
  • the mounting portion 42 a is formed in a shaft shape and is mounted through the side wall 44 of the culture tank 41.
  • the connection part 42b is provided at one end of the mounting part 42b.
  • the connection part 42b is arrange
  • the engaging portion 42c is provided at the other end of the mounting portion 42b.
  • the engaging part 42 c is arranged in the culture space 45 of the culture tank 41 with a gap from the side wall 44.
  • FIG. 4 is a front view of the engaging portion 42c viewed in the axial direction.
  • 5 is a cross-sectional view taken along line AA in FIG.
  • the engaging portion 42 c is spaced from the outer peripheral surface of the mounting portion 42 a by a second cylinder portion 42 e that is arranged coaxially with a gap in the circumferential direction of the mounting portion 42 a.
  • a plurality of arranged rib portions 42f are examples of rib portions 42f.
  • the rib portion 42f connects the outer peripheral surface of the mounting portion 42a and the inner peripheral surface of the second cylindrical portion 42e.
  • Four rib portions 42f are provided at intervals of 90 degrees.
  • a gap 42g surrounded by the mounting portion 42a, the second cylindrical portion 42e, and the rib portion 42f penetrates the engaging portion 42c in the axial direction.
  • a plurality of pairs (six pairs in FIG. 3) of the connectors 42 are attached to positions where the through holes 42d are coaxial with each of the opposing side walls 44.
  • the three pairs of connectors 42 are arranged along the first direction, and the other three pairs of connectors 42 are arranged along a second direction orthogonal to the first direction in the horizontal direction.
  • a lyophilic process for the extracellular matrix component 11 for example, O 2 plasma treatment can be adopted.
  • the wire 43 is a linear member used to form the perfusion channel 13.
  • the wire 43 is supported so as to be attached to and detached from a connector 42 that is coaxially mounted on the opposite side wall 44.
  • the wire 43 is inserted (supported) into the through-hole 42d of the connector 42 and can be suspended in a region where the dermal tissue layer 10 of the culture space 45 is disposed.
  • the wire 43 is formed of, for example, a polyamide resin.
  • a method for manufacturing an artificial skin tissue (artificial three-dimensional tissue) 1 is a method for manufacturing an artificial skin tissue 1 in which an epidermis layer 20 is formed on a dermis tissue layer 10 and extends in a first direction (predetermined direction).
  • a culture vessel 41 having a culture space 45 surrounded by a side wall 44, and a wire (linear member, flow path forming member) 43 penetrating the culture space 45 in a predetermined direction through the opposite side wall 44.
  • the perfusion device (artificial three-dimensional tissue perfusion device, device) 40 provided is prepared, and the dermal cells 12 in the extracellular matrix component 11 are cultured in the culture space 45 to form the dermal tissue layer 10 through which the wire 43 penetrates.
  • the extracellular matrix component 11 is engaged with the engaging portions 42c provided on the opposing side walls 44 to suppress contraction in a predetermined direction, and the dermis tissue layer 10 is suppressed. Forming.
  • the perfusion device 40 is prepared by attaching the connector 42 so that the through hole 42 d is coaxial with the opposing side wall 44 of the culture tank 41 and attaching the bottom plate 47 to the bottom wall 46. Thus, the opening 46a is closed. The wire 43 is inserted into the through-hole 42 d that is coaxial, and the wire 43 is suspended in the culture space 45.
  • the lyophilic treatment is performed on at least an area of the connector 42 exposed to the culture space 45.
  • the lyophilic treatment may be performed on the connector 42 before being mounted on the culture tank 41 or may be performed on the connector 42 mounted on the side wall 44.
  • the surface of the culture tank 41 facing the culture space 45 is coated with a sealing material.
  • a sealing material a material that does not adversely affect the extracellular matrix component 11, dermal cells 12, and epidermal cells 21, for example, polyparaxylylene (hereinafter referred to as parylene) is formed by a film forming method such as vapor deposition.
  • the film thickness of the sealing material is preferably 1/100 to 1/10 with respect to the gap of the mounting portion and the gap of the mounting portion.
  • the film thickness of the sealing material is preferably 1/50 to 1/10, more preferably 1/50 to 1/20 with respect to the gap of the mounting portion and the gap of the mounting portion.
  • the sealing material is formed with a film thickness (1/25) of 2 ⁇ m with respect to a gap of about 50 ⁇ m.
  • the dermal tissue layer 10 is formed.
  • a mixture of the extracellular matrix component 11 and the dermis cells 12 is poured into the culture space 45 of the culture tank 41.
  • the mixture is poured in an amount that makes the wire 43 soaked in height.
  • collagen is used as the extracellular matrix component 11.
  • the mixture of the extracellular matrix component 11 and the dermal cells 12 is poured into the culture tank 41, the mixture is cultured (incubated) under predetermined conditions.
  • the culture condition is such that the density of the dermis tissue layer 10 is equivalent to that of human dermis.
  • the culture conditions were performed at a temperature of 37 ° C. for 2 days (48 hours).
  • the extracellular matrix component 11 contracts by culturing. Since the extracellular matrix component 11 is engaged with the engaging portion 42c, the shrinkage in the stacking direction is not restricted, but the shrinkage in the first direction and the second direction is restricted. More specifically, as shown in FIG. 5, the extracellular matrix component 11 is engaged with the second cylindrical portion 42e and the rib portion 42f of the engaging portion 42c from the side opposite to the center of the culture space 45. Therefore, the second cylinder part 42e and the rib part 42f serve as a barrier and the contraction toward the center side is suppressed.
  • the extracellular matrix component 11 is crimped
  • the engaging portion 42c is lyophilicized with respect to the extracellular matrix component 11, the extracellular matrix component 11 is in close contact with the engaging portion 42c with a greater adhesion force in the first direction. And the resistance force with respect to the shrinkage
  • the stacking direction is contracted, the contraction in the first direction and the second direction is suppressed, and the interior is connected to the wire 43.
  • a dermal tissue layer 10 is formed.
  • epidermis cells 21 are seeded on the dermis tissue layer 10.
  • the epidermal cells 21 are cultured while the medium M is perfused from the pump 60 through the pipe 61 and the through-hole 42d to the perfusion channel 13.
  • the epidermal cells 21 are cultured by gas-liquid culture in which the medium M in the perfusion channel 13 is diffused through the dermis tissue layer 10 while exposing the epidermal cells 21 to gas.
  • the epidermis cells 21 can be induced to differentiate to form the epidermis layer 20.
  • the culture conditions for forming the skin layer 20 were 9 days at a temperature of 37 ° C.
  • the medium M perfused into the perfusion channel 13 through one connector 42 is discharged into the inner space of the culture dish 50 through the other connector 42 and the pipe 63.
  • a part of the medium M diffused from the perfusion channel 13 to the dermis tissue layer 10 is discharged into the internal space of the culture dish 50 through the opening 46 a and the groove 46 c of the culture tank 41.
  • the medium M discharged to the culture dish 50 is collected via the pipe 62.
  • the supply amount of the culture medium M from the pump 60 and the recovery amount of the culture medium M through the pipe 62 are such that the lower side of the dermis tissue layer 10 is immersed in the culture medium M when the epidermal layer 20 is cultured, and the epidermal cells 21 become air.
  • the liquid level of the medium M in the culture dish 50 is set so as to be exposed.
  • the present invention relates to a method for evaluating skin irritation of a drug using the artificial skin tissue 1 of the present invention.
  • the drug in the present invention includes drugs such as pharmaceuticals, cosmetics and quasi drugs. 1
  • the evaluation method of the present invention for example, the drug can be evaluated in an environment close to the actual skin as compared with the conventional method.
  • the evaluation method of the present invention is extremely useful, for example, in the evaluation of the dynamics of drugs of various molecular weights in the creation (screening) of new drugs, and in the development of cosmetics and quasi drugs.
  • the evaluation method of the present invention can be performed, for example, by bringing a drug into contact with the artificial skin tissue and measuring a response to a stimulus due to the contact of the drug.
  • the response can be measured, for example, by measuring transcutaneous electrical resistance.
  • medical agent means the substance used as evaluation object, for example, an inorganic compound, an organic compound, etc. are mentioned.
  • FIG. 13 is a diagram showing the artificial skin tissue 1 manufactured by the above-described manufacturing method. As shown in this figure, the artificial skin tissue 1 in which the contraction in the first direction and the second direction was suppressed by the connector 42 was obtained.
  • FIG. 14 is a diagram showing a result of manufacturing the artificial skin tissue 1 by perfusing the culture medium M in the perfusion channel 13.
  • FIG. 15 is a diagram showing a result of manufacturing the artificial skin tissue 1 without providing the perfusion channel 13.
  • the medium M was perfused in the perfusion channel 13
  • the dermis tissue layer 10 and the epidermis layer 20 could be formed.
  • the perfusion flow When the path 13 was not provided, the skin layer 20 could not be formed.
  • FIG. 16 is a diagram in which droplets are applied to the surface of the epidermis layer 20 after culturing the epidermis layer 20 for one day.
  • FIG. 17 is a view in which droplets are applied to the surface of the epidermis layer 20 after nine days of culturing of the epidermis layer 20.
  • the droplet applied to the surface of the epidermal layer 20 greatly wets and spreads when one day has elapsed after the start of the culture, but as shown in FIG. 17, nine days have passed since the start of the culture. In the case the wet spread became small. That is, it is considered that the surface of the epidermis layer 20 that has passed nine days after the start of culture has increased liquid repellency and the keratinization of the stratum corneum has progressed.
  • FIG. 18 is a view showing the artificial skin tissue 1 which is cut in the vertical direction when nine days have elapsed after the start of culturing of the epidermis layer 20. As shown in FIG. 18, it was confirmed that the perfusion channel 13 was retained even when nine days passed after the start of the culture.
  • FIG. 19 is a diagram observing the movement of bubbles in the perfusion channel 13 in the artificial skin tissue 1 that has passed nine days after the start of culture. As shown in FIG. 19, it was confirmed that bubbles flow with time, and it was confirmed that the function of the perfusion channel 13 was maintained.
  • FIG. 20 shows the sealing success rate with respect to the thickness of the sealing material and the extracellular matrix component 11 leaking from the gap in the attachment portion of the bottom plate 47 with respect to the gap in the attachment portion of the connector 42 and the gap in the attachment portion of the bottom plate 47. It is a figure which shows an average amount. As shown in FIG. 20, when the gap is 50 ⁇ m, by setting the thickness of parylene as the sealing material to 2 ⁇ m that is 1/25 of the gap, a high sealing rate and a low average leakage amount can be achieved. did it.
  • the perfusion channel 13 penetrating the inside of the dermis tissue layer 10 is provided, sufficient nutrient supply is possible even when the epidermis layer 20 is formed. Therefore, in this embodiment, the high quality artificial skin tissue 1 with a high engraftment rate at the time of transplantation can be obtained. In the present embodiment, it is possible to easily form the perfusion channel 13 by an operation of removing the wire 43, and it is possible to reduce the cost and labor involved in manufacturing the artificial skin tissue 1.
  • the perfusion channel 13 can be held more stably even when culturing is performed for a long period of time.
  • the dermis tissue layer 10 is formed while suppressing contraction in the first direction and the second direction, even if the contraction is large as in the case of culturing the dermis cells 12 in the extracellular matrix component 11, the perfusion is performed.
  • the channel 13 it is possible to stably manufacture the high-quality artificial skin tissue 1.
  • the lyophilic treatment is performed on the engaging portion 42c of the connector portion 42, the adhesion of the extracellular matrix component 11 to the engaging portion 42c can be greatly increased, while suppressing shrinkage.
  • the dermis tissue layer 10 can be formed in a more stable state.
  • the bottom plate 47 capable of closing the opening 46a at the bottom of the culture tank 41 is attachable / detachable, the contaminated used medium M that accumulates at the bottom of the culture tank 41 when the epidermis layer 20 is cultured. Can be easily discharged to the culture dish 50.
  • FIGS. 1 to 20 a second embodiment of the perfusion device 40A will be described with reference to FIGS.
  • the same reference numerals are given to the same components as those of the first embodiment shown in FIGS. 1 to 20, and the description thereof is omitted or simplified.
  • the planar artificial skin tissue 1 is manufactured is illustrated in the first embodiment, the second embodiment will be described using an example in which the artificial skin tissue 1 having a curved cross-sectional shape is manufactured.
  • FIG. 21 is a schematic perspective view of a perfusion device 40A in which a biological model F is provided in a culture tank 41.
  • the fabric model F is a model imitating a finger.
  • FIG. 22 is a cross-sectional view taken along a vertical plane including the length direction (predetermined direction, first direction) of the biological model F.
  • 23 to 27 are cross-sectional views taken along a plane orthogonal to the length direction of the biological model F.
  • the biological model F is provided so as to be exposed to the culture space 45 from the bottom wall 46 of the culture tank 41 with the dorsal surface as a curved surface portion 70.
  • the joint between the bottom wall 46 of the culture tank 41 and the biological model F is sealed with the above-described parylene.
  • the wire 43 is suspended so that the fingertip side is lowered according to the inclination of the curved surface portion 70 with respect to the first direction.
  • a plurality of wires 43 (five wires in FIG. 23) are provided at intervals in the circumferential direction of the biological model F.
  • the distance between each wire 43 and the biological model F is set to a distance at which the thickness of the dermis tissue layer 10 formed between the wire 43 and the biological model F can secure a predetermined value.
  • the number of the wires 43 is appropriately determined according to the width (length in the circumferential direction) of the skin layer 20.
  • FIGS. 22 and 23 Although not shown in FIGS. 22 and 23, five pairs of connectors 42 (10 in total) are provided on the side wall 44 in accordance with the number of wires 43.
  • the culture tank 41 of this embodiment is not provided with the bottom plate 47.
  • Other configurations are the same as those of the perfusion device 40 of the first embodiment.
  • the mixture of the extracellular matrix component 11 and the dermal cells 12 When the mixture of the extracellular matrix component 11 and the dermal cells 12 is poured into the culture tank 41, the mixture is cultured under predetermined conditions. The cultured mixture of the extracellular matrix component 11 and the dermis cells 12 is restrained from contracting in the direction in which the wire 43 is suspended and contracts in the other direction. Therefore, as shown in FIG. A dermal tissue layer 10 having a shape along the line is formed.
  • a plurality (five in this embodiment) of perfusion channels 13 are formed in the dermis tissue layer 10 as shown in FIG.
  • a vascular layer 15 is formed by injecting (seeding) vascular cells 14 onto the surface of the dermis tissue layer 10 facing the perfusion channel 13 and culturing for a certain period of time.
  • epidermal cells 21 are seeded on the dermis tissue layer 10.
  • the epidermal cells 21 are gas-liquid cultured while the medium M is perfused through the perfusion channel 13.
  • the epidermal cells 21 can be induced to differentiate to form the epidermal layer 20.
  • the artificial skin tissue 1 having a curved shape in which the dermis tissue layer 10 and the epidermis layer 20 are along the curved surface portion 70 is obtained.
  • the high quality of the shape along the curved surface portion 70 of the biological model F is obtained.
  • the artificial skin tissue 1 can be easily manufactured. Therefore, in the present embodiment, by preparing and using the biological model F of the desired site, the high-quality artificial skin tissue 1 having the desired site shape can be easily obtained.
  • the finger skin tissue is exemplified as the artificial skin tissue 1.
  • the present invention can also be applied when artificially manufacturing the skin tissue of another part. is there.
  • the handle O 2 plasma treatment as lyophilic engaging section 42c is not limited to this, it may take the other lyophilic treatment.
  • an adhesive for skin may be used instead of the lyophilic treatment.
  • a skin adhesive it is preferable to select a material that does not adversely affect the extracellular matrix component 11 and the dermal cells 12.
  • the structure which uses the wire 43 which is a linear member as a flow-path formation member for forming the perfusion flow path 13 produces with a gel material or a polymer other than the wire 43, for example.
  • a configuration using 3 fibers with or without cells may be used.
  • the perfusion channel 13 is not limited to a linear configuration.
  • planar flow path forming member for example, a mesh material can be used.
  • the configuration in which the perfusion channel 13 is used to perfuse the medium for culturing the epidermis cells 21 to form the epidermis layer 20 is not limited to this configuration.
  • a configuration may be used in which a drug is applied to the tissue surface (for example, the epidermis layer 20) and the perfusion channel 13 is used to evaluate the uptake of the drug into the perfusion channel 13. Further, the drug is mixed into the medium flowing through the perfusion channel 13, and the perfusion channel 13 is used to evaluate the diffusion of the drug from the perfusion channel 13 to the dermal tissue layer 10 or the epidermis layer 20. There may be.
  • the perfusion channel 13 When the perfusion channel 13 is used in such a configuration, it is not necessary to form the perfusion channel 13 before the formation of the epidermis layer 20, and the procedure for forming the perfusion channel 13 after the formation of the epidermis layer 20 is performed. There may be. In addition, when the evaluation target is, for example, only the dermis tissue layer 10, it is not necessary to form the epidermis layer 20.
  • the artificial skin tissue 1 is exemplified as the artificial three-dimensional tissue, but is not limited to this.
  • the artificial three-dimensional tissue may be, for example, a muscle tissue using skeletal muscle cells or cardiomyocytes instead of the fibroblasts described above. Furthermore, it may be a liver tissue using hepatocytes, a pancreatic tissue using pancreatic cells, or a nerve tissue using neural cells.
  • the extracellular matrix used in the above embodiment does not necessarily exist, and may be a collection of only various cells.
  • a high-quality artificial three-dimensional tissue and a manufacturing method thereof, an artificial three-dimensional tissue perfusion device, and a drug evaluation method using the artificial three-dimensional tissue can be provided.
  • this invention is useful in fields, such as cosmetics, a pharmaceutical, a pharmaceutical, etc., for example.
  • SYMBOLS 1 Artificial skin tissue (artificial three-dimensional tissue), 10 ... Dermal tissue layer, 11 ... Extracellular matrix component, 12 ... Dermal cell (fibroblast), 13 ... Perfusion channel, 14 ... Vascular cell, 15 ... Tube Cavity layer, 20 ... epidermis layer, 21 ... epidermis cells, 40, 40A ... perfusion device (artificial 3D tissue perfusion device), 41 ... culture tank, 42 ... connector (support part), 42a ... mounting part (cylinder part), 42c ... engaging portion, 42e ... second cylinder, 42f ... rib portion, 43 ... wire (linear member, flow path forming member), 44 ... side wall, 45 ... culture space, 46 ... bottom wall (bottom), 70 ... Curved surface part, F ... Living body model, M ... Medium

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Abstract

　この人工三次元組織製造方法は、所定方向に延びる人工三次元組織を製造する。側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する側壁を貫いて培養空間に所定方向に沿って懸架された流路形成部材とを備えたデバイスを準備することと、培養空間で細胞を培養して、流路形成部材が貫く人工三次元組織を形成することと、人工三次元組織から流路形成部材を抜去して人工三次元組織を貫通する灌流流路を形成することと、を含む。

Description

人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法
　本発明は、人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法に関する。
　本願は、２０１４年９月２３日に出願された米国特許仮出願６２／０５４，０６６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　化粧品や薬品の試験、皮膚移植、ロボットへの搭載等に人工三次元組織の一つである人工皮膚組織は広く用いられている。特許文献１には、細胞外マトリックス成分を含む被膜で細胞の表面が被覆された被覆細胞を培養し、被覆細胞が積層された真皮組織層を形成すること、および真皮組織層上に表皮細胞を配置して表皮層を形成して人工皮膚モデルを製造する技術が開示されている。
特開２０１２－２０５５１６号公報
　人工皮膚組織の構築には、気液界面における培養が必須であるが、特許文献１に記載された培養は、表皮層とは最も離れた位置に配置されたメンブレンフィルタを介して培地が供給されるため、養分供給の効率が十分とはいえず、例えば、生体移植時の生着率が低い低品質の人工皮膚組織が製造される可能性がある。
　本発明は上記問題に鑑みてなされたものであり、高品質の人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供することを目的とする。
　本発明の第１の態様に従えば、所定方向に延びる人工三次元組織の製造方法であって、側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間に前記所定方向に沿って懸架された流路形成部材とを備えたデバイスを準備することと、前記培養空間で細胞を培養して、前記流路形成部材が貫く前記人工三次元組織を形成することと、前記人工三次元組織から前記流路形成部材を抜去して前記人工三次元組織を貫通する灌流流路を形成することと、を含むことを特徴とする人工三次元組織の製造方法が提供される。
　本発明の第２の態様に従えば、本発明の第１の態様の製造方法で人工三次元組織を製造することと、薬剤を前記人工三次元組織に接触させることと、前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を測定することと、を含むことを特徴とする人工三次元組織を用いた薬剤評価方法が提供される。
　本発明の第３の態様に従えば、所定方向に延びる人工三次元組織に灌流が行われる人工三次元組織灌流デバイスであって、側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間における前記人工三次元組織を配置する領域に前記所定方向に沿って懸架される流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する支持部とを備えることを特徴とする人工三次元組織灌流デバイスが提供される。
　本発明の第４の態様に従えば、所定方向に延びる人工三次元組織であって、内部を貫通し前記所定方向に延びる灌流流路を有することを特徴とする人工三次元組織が提供される。
　本発明によれば、高品質の人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供することことができる。
本発明の実施の形態に係る人工皮膚組織１を模式的に示した斜視断面図である。 人工皮膚組織製造システム３０の概略的な構成図である。 灌流デバイス４０の第１実施形態の外観斜視図である。 係合部４２ｃを軸方向で視た正面図である。 図４におけるＡ－Ａ線視断面図である。 人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 製造された人工皮膚組織１を示す図である。 灌流流路１３に培地Ｍを灌流させて人工皮膚組織１を製造した結果を示す図である。 灌流流路１３を設けることなく人工皮膚組織１を製造した結果を示す図である。 表皮層２０の表面に液滴を塗布した図である。 表皮層２０の表面に液滴を塗布した図である。 鉛直方向に断面した人工皮膚組織１を示す図である。 灌流流路１３を気泡が移動する様子を観察した図である。 シール材の厚さに対するシール成功率、および底板４７の取付部の隙間から漏れる細胞外マトリックス成分１１の平均量を示す図である。 第２実施形態の灌流デバイス４０Ａの概略的な斜視図である。 生体モデルＦの長さ方向を含む鉛直面で断面した図である。 第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。 第２実施形態に係る人工皮膚組織１の製造手順を示す図である。
　以下、本発明の人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法の実施の形態を、図１ないし図２７を参照して説明する。
　本実施形態では、人工三次元組織として人工皮膚組織を製造する例を用いて説明する。
　なお、以下の実施の実施形態は、本発明の一態様を示すものであり、この発明を限定するものではなく、本発明の技術的思想の範囲内で任意に変更可能である。また、以下の図面においては、各構成をわかりやすくするために、実際の構造と各構造における縮尺や数等を異ならせている。
（人工皮膚組織）
　まず、本発明に係る人工皮膚組織について、図１を参照して説明する。
　図１は、人工三次元組織である人工皮膚組織１を模式的に示した斜視断面図である。
　人工皮膚組織１は、真皮組織層１０と表皮層２０とを含む。人工皮膚組織１は、真皮組織層１０と表皮層２０とが積層された方向（図１における上下方向、以下、積層方向と称する）と直交する平面に沿った所定方向（図１における左右方向、以下、第１方向と称する）に延びて形成されている。
　表皮層２０は、真皮組織層１０上に表皮細胞２１を播種して培養することにより形成されたものである。表皮細胞２１としては、例えば、表皮角化細胞が使用できる。
　表皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来表皮細胞が好ましい。ヒト由来表皮細胞としては、表皮角化細胞、表皮メラノサイトが挙げられ、表皮角化細胞が好ましい。表皮角化細胞としては、正常ヒト表皮角化細胞（Normal Human Epidermal Keratinocytes：NHEK） が挙げられる。表皮メラノサイトとしては、正常ヒト表皮メラノサイト（Normal Human Epidermal Melanocytes：NHEM）が挙げられる。
　真皮組織層１０は、細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞１２を培養することにより形成されたものである。細胞外マトリックス成分１１としては、特に限定されないが、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型など）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、ゼラチン、寒天、アガロース、フィブリン、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカンなどを例示することができる。真皮細胞１２としては、例えば、線維芽細胞を用いることができる。
　線維芽細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来線維芽細胞が好ましい。ヒト由来線維芽細胞としては、ヒト皮膚線維芽細胞（Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF）、ヒト肺線維芽細胞：Human Pulmonary Fibroblasts (HPF)、ヒト心臓線維芽細胞：Human Cardiac Fibroblasts (HCF)、ヒト大動脈外膜線維芽細胞：Human Aortic Adventitial Fibroblasts (HAoAF)、ヒト子宮線維芽細胞：Human Uterine Fibroblasts (HUF)、ヒト絨毛間葉系線維芽細胞：Human Villous Mesenchymal Fibroblasts (HVMF)等が挙げられ、ヒト皮膚線維芽細胞（NHDF）が好ましい。
　真皮組織層１０は、真皮組織層１０の内部を貫通し第１方向のに延びる灌流流路１３を有している。灌流流路１３は、表皮細胞２１を培養する際に培地（詳細は後述）が灌流する流路である。灌流流路１３の表面には、血管系細胞１４を用いて形成された管腔層１５が設けられている。血管系細胞１４としては、例えば、内皮細胞を用いることができる。
　血管系細胞としては、血管上皮細胞、血管内皮細胞等が挙げられ、血管内皮細胞が好ましい。血管内皮細胞としては、ヒト、マウス、ラット等、哺乳動物由来の細胞が挙げられ、ヒト由来血管内皮細胞が好ましい。ヒト由来血管内皮細胞としては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVEC）、 ヒト臍帯動脈内皮細胞（Human Umbilical Artery Endothelial Cells：HUAEC） 、ヒト冠状動脈内皮細胞（Human Coronary Artery Endothelial Cells：HCAEC）、 ヒト伏在静脈内皮細胞（Human Saphenous Vein Endothelial Cells：HSaVEC）、 ヒト肺動脈内皮細胞（Human Pulmonary Artery Endothelial Cells：HPAEC）、 ヒト大動脈内皮細胞（Human Aortic Endothelial Cells：HAoEC）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（Human Dermal Microvascular Endothelial Cells：HDMEC）、 ヒト皮膚血管内皮細胞（Human Dermal Blood Endothelial Cells：HDBEC）、 ヒト皮膚リンパ管内皮細胞（Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells：HDLEC）、 ヒト肺微小血管内皮細胞（Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells：HPMEC）、 ヒト心臓微小血管内皮細胞（Human Cardiac Microvascular Endothelial Cells：HCMEC）、 ヒト膀胱微小血管内皮細胞（Human Bladder Microvascular Endothelial Cells：HBdMEC）、 ヒト子宮微小血管内皮細胞（Human Uterine Microvascular Endothelial Cells：HUtMEC）等が挙げられ、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）が好ましい。
（人工皮膚組織製造装置）
　次に、上記の人工皮膚組織１を製造する人工皮膚組織製造装置について、図２乃至図５を参照して説明する。
　図２は、人工皮膚組織製造装置３０の概略的な構成図である。
　人工皮膚組織製造装置３０は、灌流デバイス（人工三次元組織灌流デバイス）４０、培養皿５０およびポンプ６０を備えている。培養皿５０は、内部空間に灌流デバイス４０が載置される。ポンプ６０は、配管６１を介して灌流デバイス４０に培地を供給する。ポンプ６０は、灌流デバイス４０を介して培養皿５０内に排出された培地Ｍを、配管６２を介して回収する。
（灌流デバイス４０の第１実施形態）
　図３は、灌流デバイス４０の第１実施形態の外観斜視図である。
　灌流デバイス４０は、培養槽４１、コネクタ（支持部）４２およびワイヤー（線状部材、流路形成部材）４３を備えている。培養槽４１は、側壁４４に囲まれた上部が開口する培養空間４５と、底壁（底部）４６に設けられた底板４７を備えている。側壁４４は、平面視で矩形状に設けられている。底壁４６は、鉛直方向に貫通する開口部４６ａと、底面４６ｂに設けられた溝部４６ｃとを有している。溝部４６ｃは、第１方向に延在して設けられ両端部において培養皿５０の内部空間に開口している。底板４７は、培養槽４１に取り付けおよび取り外し自在である。底板４７は、培養槽４１の底壁４６に取り付けられたときに開口部４６ａを閉塞する。
　コネクタ４２は、装着部（筒部）４２ａ、接続部４２ｂ、係合部４２ｃおよび内部を貫通する貫通孔４２ｄを有している。装着部４２ａは軸状に形成され培養槽４１の側壁４４を貫通して装着されている。接続部４２ｂは、装着部４２ｂの一端に設けられている。接続部４２ｂは、培養槽４１の外側に配置され配管６１または配管６３（後述）に接続可能である。
　係合部４２ｃは、装着部４２ｂの他端に設けられている。係合部４２ｃは、培養槽４１の培養空間４５に側壁４４と隙間をあけて配置されている。図４は、係合部４２ｃを軸方向で視た正面図である。図５は、図４におけるＡ－Ａ線視断面図である。図４および図５に示すように、係合部４２ｃは、装着部４２ａの外周面と隙間をあけて同軸で配置された第２筒部４２ｅと、装着部４２ａの周方向に間隔をあけて配置された複数のリブ部４２ｆとを備えている。リブ部４２ｆは、装着部４２ａの外周面と第２筒部４２ｅの内周面とを接続する。リブ部４２ｆは、９０度間隔で４つ設けられている。装着部４２ａ、第２筒部４２ｅおよびリブ部４２ｆで囲まれた隙間４２ｇは、係合部４２ｃを軸方向に貫通している。
　コネクタ４２は、対向する側壁４４のそれぞれに貫通孔４２ｄが同軸となる位置に複数対（図３では６対）装着される。３対のコネクタ４２は、第１方向に沿って配置され、他の３対のコネクタ４２は、第１方向とで水平方向で直交する第２方向に沿って配置されている。コネクタ４２のうち、少なくとも培養空間４５に露出する領域には、細胞外マトリックス成分１１に対する親液化処理が施されている。親液化処理としては、例えば、Ｏ２プラズマ処理を採用できる。
　ワイヤー４３は、灌流流路１３を形成するために用いられる線状部材である。ワイヤー４３は、対向する側壁４４に同軸で装着されたコネクタ４２に取り付けおよび取り外し自在に支持される。ワイヤー４３は、コネクタ４２の貫通孔４２ｄに挿通（支持）されて培養空間４５の真皮組織層１０を配置する領域に懸架可能である。ワイヤー４３は、例えば、ポリアミド樹脂で形成されている。
（人工皮膚組織１の製造方法）
　次に、人工皮膚組織１の製造方法について、図６乃至図２０を参照して説明する。
　本発明に係る人工皮膚組織（人工三次元組織）１の製造方法は、真皮組織層１０上に表皮層２０が形成され第１方向（所定方向）に延びる人工皮膚組織１の製造方法であって、側壁４４に囲まれた培養空間４５を有する培養槽４１と、対向する側壁４４を貫いて培養空間４５に所定方向に沿って懸架されたワイヤー（線状部材、流路形成部材）４３とを備えた灌流デバイス（人工三次元組織灌流デバイス、デバイス）４０を準備することと、培養空間４５で細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞１２を培養して、ワイヤー４３が貫く真皮組織層１０を形成することと、真皮組織層１０からワイヤー４３を抜去して真皮組織層１０を貫通する灌流流路１３を形成することと、真皮組織層１０上に表皮細胞２１を配置し灌流流路１３に培地Ｍを灌流させながら、表皮層２０を形成することと、を含む。また、本発明に係る人工皮膚組織１の製造方法は、対向する側壁４４にそれぞれ設けた係合部４２ｃに細胞外マトリックス成分１１を係合させて所定方向への収縮を抑えながら真皮組織層１０を形成することを含む。
　以下、人工皮膚組織１の製造方法について詳細に説明する。
　図６乃至図２０においては、適宜、灌流デバイス４０のみを図示し、培養皿５０、ポンプ６０等の図示を省略している。
（灌流デバイス４０の準備）
　灌流デバイス４０の準備としては、図６に示すように、上記の培養槽４１の対向する側壁４４に貫通孔４２ｄが同軸となるようにコネクタ４２を装着するとともに、底壁４６に底板４７を取り付けて開口部４６ａを閉塞する。同軸となっている貫通孔４２ｄにワイヤー４３を挿通し、培養空間４５にワイヤー４３を懸架させる。
　コネクタ４２のうち、少なくとも培養空間４５に露出する領域に親液化処理を施す。親液化処理は、培養槽４１に装着する前にコネクタ４２に実施してもよいし、側壁４４に装着したコネクタ４２に対して実施してもよい。
　側壁４４へのコネクタ４２の装着部の隙間、および底壁４６への底板４７の取付部の隙間をシールするために、シール材で培養空間４５に臨む培養槽４１の表面を被膜する。シール材としては、細胞外マトリックス成分１１、真皮細胞１２、表皮細胞２１に悪影響を与えない材料、一例として、ポリパラキシリレン（以下、パリレンと称する）が蒸着等の成膜方法により成膜される。シール材の膜厚としては、上記装着部の隙間および取付部の隙間に対して１／１００～１／１０であることが好ましい。また、シール材の膜厚は、上記装着部の隙間および取付部の隙間に対して１／５０～１／１０であることが好ましく、１／５０～１／２０であることがより好ましい。本実施形態では、約５０μｍの隙間に対して２μｍの膜厚（１／２５）でシール材を成膜した。
（真皮組織層１０の形成）
　灌流デバイス４０の準備が完了すると、真皮組織層１０を形成する。
　真皮組織層１０の形成は、まず、図７に示すように、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物を培養槽４１の培養空間４５に注ぎ込む。混合物は、ワイヤー４３が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。本実施形態では、細胞外マトリックス成分１１としてコラーゲンが用いられている。
　細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物が培養槽４１に注ぎ込まれると、混合物を所定条件で培養（インキュベーション）する。培養条件としては、真皮組織層１０の密度がヒトの真皮相当となる条件で行う。培養条件は、一例として、３７℃の温度下で２日間（４８時間）行った。
　培養によって細胞外マトリックス成分１１は収縮する。細胞外マトリックス成分１１は、係合部４２ｃに係合しているため、積層方向の収縮は拘束されないが、第１方向および第２方向の収縮は拘束される。より詳細には、図５に示されるように、細胞外マトリックス成分１１は、培養空間４５の中心とは逆側から係合部４２ｃの第２筒部４２ｅ、リブ部４２ｆに係合しているため、第２筒部４２ｅ、リブ部４２ｆが障壁となって中心側への収縮が抑制される。また、細胞外マトリックス成分１１は、積層方向への収縮により、第２筒部４２ｅの外周面、装着部４２ａの先端側の外周面に圧着されることになる。従って、細胞外マトリックス成分１１と係合部４２ｃとの間の摩擦力が大きくなり、第１方向および第２方向への収縮に対する抵抗力が大きくなる。特に、本実施形態では、係合部４２ｃが細胞外マトリックス成分１１に対する親液化処理が施されているため、細胞外マトリックス成分１１は、より大きな密着力で係合部４２ｃに密着し第１方向および第２方向への収縮に対する抵抗力が大きくなる。
　細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物の培養が完了することにより、図８に示すように、積層方向が収縮し、第１方向および第２方向の収縮が抑制され、内部をワイヤー４３が貫く真皮組織層１０が形成される。
（灌流流路１３および管腔層１５の形成）
　次に、コネクタ４２に支持されているワイヤー４３を抜去する。これにより、図９に示すように、真皮組織層１０には、第１方向に延びる空洞である灌流流路１３が形成される。このとき、真皮組織層１０は、両端部において係合部４２ｃに係合しているため、ワイヤー４３の抜去時にコネクタ４２から脱離することなく安定してコネクタ４２に支持される。
　次に、図１０に示すように、コネクタ４２の貫通孔４２ｄを介して、灌流流路１３に臨む真皮組織層１０の表面に血管系細胞１４を注入（播種）し一定時間培養することにより、管腔層１５を形成する。これにより、灌流流路１３は、管腔層１５に囲まれた状態となる。
（表皮層２０の形成）
　次に、表皮層２０を形成するための準備を行う。
　図１１に示すように、培養槽４１の底壁４６から底板４７を取り外すとともに、図２に示したように、培養槽４１を培養皿５０の内部に載置する。次いで、第１方向の一方側のコネクタ４２の接続部４２ｂに配管６１を接続し、第１方向の他方側のコネクタ４２の接続部４２ｂに配管６３を接続する。各側の接続部４２ｂに接続する配管６１または配管６３については３つのコネクタ４２全てに接続してもよいし、一部のみに接続してもよい。
　表皮層２０を形成するための準備が完了すると、真皮組織層１０上に表皮細胞２１を播種する。表皮細胞２１が播種されると、ポンプ６０から配管６１および貫通孔４２ｄを介して培地Ｍを灌流流路１３に灌流させながら表皮細胞２１を培養する。表皮細胞２１の培養は、表皮細胞２１を気体に曝しながら、灌流流路１３の培地Ｍを真皮組織層１０を介して拡散させる気液培養を行う。これにより、表皮細胞２１が分化誘導されて表皮層２０を形成することができる。表皮層２０を形成する際の培養条件は、一例として、３７℃の温度下で９日間行った。
　一方のコネクタ４２を介して灌流流路１３に灌流された培地Ｍは、他方のコネクタ４２および配管６３を介して培養皿５０の内部空間に排出される。また、灌流流路１３から真皮組織層１０に拡散した培地Ｍの一部は、培養槽４１の開口部４６ａおよび溝部４６ｃを介して培養皿５０の内部空間に排出される。培養皿５０に排出された培地Ｍは、配管６２を介して回収される。ポンプ６０からの培地Ｍの供給量と、配管６２を介しての培地Ｍの回収量とは、表皮層２０の培養時に真皮組織層１０の下側が培地Ｍに浸漬され、表皮細胞２１が空気に曝されるように培養皿５０内の培地Ｍの液位が保たれる値に設定される。
（評価方法）
　本発明は、さらにその他の態様として、本発明の人工皮膚組織１を用いた薬剤の皮膚に対する刺激性を評価する方法に関する。本発明における薬剤とは、医薬品等の薬物、化粧品や医薬部外品等を含む。１本発明の評価方法によれば、例えば、従来の方法と比較して実際の皮膚に近い環境で薬剤の評価を行うことができる。また、本発明の評価方法は、例えば、新薬の創出（スクリーニング）等における各種分子量の薬物の動態評価、化粧品や医薬部外品等の開発における評価において極めて有用である。
  本発明の評価方法は、例えば、薬剤を前記人工皮膚組織と接触させること、及び、薬剤の接触による刺激に対する応答を測定することにより行うことができる。応答の測定は、例えば、経皮電気抵抗を測定すること等によって行うことができる。薬剤は、評価対象となる物質のことをいい、例えば、無機化合物及有機化合物等が挙げられる。
［実施例］
　図１３は、上述の製造方法により製造された人工皮膚組織１を示す図である。この図に示されるように、コネクタ４２によって第１方向および第２方向の収縮が抑制された状態の人工皮膚組織１が得られた。
　図１４は、灌流流路１３に培地Ｍを灌流させて人工皮膚組織１を製造した結果を示す図である。図１５は、灌流流路１３を設けることなく人工皮膚組織１を製造した結果を示す図である。図１４に示されるように、灌流流路１３に培地Ｍを灌流させた場合には、真皮組織層１０および表皮層２０を形成することができたが、図１５に示されるように、灌流流路１３を設けない場合には、表皮層２０を形成することができなかった。
　図１６は、表皮層２０の培養を一日実施した後に、表皮層２０の表面に液滴を塗布した図である。図１７は、表皮層２０の培養を九日実施した後に、表皮層２０の表面に液滴を塗布した図である。図１６に示されるように、表皮層２０の表面に塗布した液滴は、培養開始後一日経過した場合は大きく濡れ拡がったが、図１７に示されるように、培養開始後九日経過した場合は濡れ拡がりが小さくなった。すなわち、培養開始後九日経過した表皮層２０の表面は、撥液性が大きくなり角質層の角化が進行したと考えられる。
　図１８は、表皮層２０の培養開始後九日経過したときの鉛直方向に断面した人工皮膚組織１を示す図である。図１８に示されるように、培養開始後九日経過した場合でも灌流流路１３が保持されていることを確認することができた。図１９は、培養開始後九日経過した人工皮膚組織１において灌流流路１３を気泡が移動する様子を観察した図である。図１９に示されるように、気泡が時間経過に伴って流動することが確認でき、灌流流路１３の機能が保持されていることを確認できた。
　図２０は、コネクタ４２の装着部の隙間、および底板４７の取付部の隙間のシールに関して、シール材の厚さに対するシール成功率、および底板４７の取付部の隙間から漏れる細胞外マトリックス成分１１の平均量を示す図である。図２０に示されるように、隙間が５０μｍの場合、隙間の１／２５である２μｍにシール材であるパリレンの厚さを設定することにより、高いシール率および低い平均漏れ量を達成することができた。
　以上説明したように、本実施形態では、真皮組織層１０の内部を貫通する灌流流路１３が設けられているため、表皮層２０を形成する際にも十分な養分補給が可能である。そのため、本実施形態では、生体移植時の生着率が高い高品質の人工皮膚組織１を得ることができる。本実施形態では、ワイヤー４３を抜去するという操作で容易に灌流流路１３を形成することが可能であり、人工皮膚組織１の製造に係るコスト手間を低減することができる。
　本実施形態では、灌流流路１３を臨む面に管腔層１５が設けられているため、長期間に亘る培養を行う際にもより安定した灌流流路１３を保持することが可能となる。本実施形態では、第１方向および第２方向の収縮を抑えながら真皮組織層１０を形成するため、細胞外マトリックス成分１１中の真皮細胞１２を培養する場合のように収縮が大きい場合でも、灌流流路１３を保持することで、高品質の人工皮膚組織１を安定して製造することが可能である。本実施形態では、コネクタ部４２の係合部４２ｃに親液化処理を施しているため、係合部４２ｃへの細胞外マトリックス成分１１の密着性を大幅に高めることができ、収縮を抑えながらの真皮組織層１０の形成をより安定した状態で実施することができる。本実施形態では、培養槽４１の底部の開口部４６ａを閉塞可能な底板４７を取り付け・取り外し自在としているため、表皮層２０の培養時には、培養槽４１の底部に溜まる汚濁した使用済みの培地Ｍを容易に培養皿５０に排出することが可能である。
（灌流デバイス４０Ａの第２実施形態）
　続いて、灌流デバイス４０Ａの第２実施形態について、図２１乃至図２７を参照して説明する。
　これらの図において、図１乃至図２０に示す第１実施形態の構成要素と同一の要素については同一符号を付し、その説明を省略または簡略化する。
　第１実施形態では平面状の人工皮膚組織１を製造する場合を例示したが、第２実施形態では、断面形状が曲面の人工皮膚組織１を製造する例を用いて説明する。
　図２１は、培養槽４１に生体モデルＦが設けられた灌流デバイス４０Ａの概略的な斜視図である。生地モデルＦは、指を模したモデルである。図２２は、生体モデルＦの長さ方向（所定方向、第１方向）を含む鉛直面で断面した図である。図２３～図２７は、生体モデルＦの長さ方向と直交する面で断面した図である。
　図２２および図２３に示されるように、生体モデルＦは、背側の表面を曲面部７０として培養槽４１の底壁４６から培養空間４５に露出して設けられている。培養槽４１の底壁４６と生体モデルＦとの接合部は、上述したパリレンによってシールされている。ワイヤー４３は、第１方向に関する曲面部７０の傾斜に応じて、指先側が低くなるように懸架されている。図２３に示されるように、ワイヤー４３は、生体モデルＦの周方向に間隔をあけて複数（図２３では５本）設けられている。各ワイヤー４３と生体モデルＦとの距離は、ワイヤー４３と生体モデルＦとの間に形成される真皮組織層１０の厚さが所定値を確保できる距離に設定されている。なお、ワイヤー４３の本数は、表皮層２０の幅（周方向の長さ）に応じて適宜決定される。
　なお、図２２および図２３では図示を省略しているが、ワイヤー４３の数に応じてコネクタ４２は、側壁４４に５対（合計１０本）設けられている。本実施形態の培養槽４１には、底板４７が設けられていない。
　他の構成は、上記第１実施形態の灌流デバイス４０と同様である。
　（人工皮膚組織１の製造方法）
　続いて、上記の灌流デバイス４０Ａを用いて人工皮膚組織１を製造する方法について説明する。ここでは、灌流デバイス４０Ａの準備は完了しているものとして説明する。
　まず、真皮組織層１０を形成するために、図２３に示すように、細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物を培養槽４１の培養空間４５に注ぎ込む。混合物は、ワイヤー４３が浸漬される高さとなる量で注ぎ込まれる。
　細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物が培養槽４１に注ぎ込まれると、混合物を所定条件で培養する。培養された細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物は、ワイヤー４３が懸架された方向の収縮が抑えられ、他の方向については収縮するため、図２４に示されるように、曲面部７０に沿った形状の真皮組織層１０が形成される。
　次に、ワイヤー４３を抜去することにより、図２５に示されるように、真皮組織層１０に複数（本実施形態では５つ）の灌流流路１３が形成される。続いて、灌流流路１３に臨む真皮組織層１０の表面に血管系細胞１４を注入（播種）し一定時間培養することにより、管腔層１５を形成する。
　次に、真皮組織層１０上に表皮細胞２１を播種する。表皮細胞２１が播種されると、培地Ｍを灌流流路１３に灌流させながら表皮細胞２１を気液培養する。これにより、図２７に示されるように、表皮細胞２１が分化誘導されて表皮層２０を形成することができる。本実施形態では、真皮組織層１０および表皮層２０が曲面部７０に沿った曲面形状の人工皮膚組織１が得られる。
　このように、本実施形態では、上記第１実施形態の灌流デバイス４０を用いた場合と同様の作用・効果が得られることに加えて、生体モデルＦの曲面部７０に沿った形状の高品質の人工皮膚組織１を容易に製造することができる。従って、本実施形態では、所望部位の生体モデルＦを用意して用いることにより、所望部位の形状の高品質の人工皮膚組織１を容易に得ることができる。
　以上、本発明の好ましい実施の形態について詳述したが、本発明はかかる特定の実施の形態に限定されるものではなく、特許請求の範囲内に記載された本発明の要旨の範囲内において、種々の変形・変更が可能である。
　例えば、上記実施形態では、人工皮膚組織１として指の皮膚組織を例示して説明したが、上述したように、他の部位の皮膚組織を人工的に製造する際にも本発明を適用可能である。
　また、上記実施形態では、係合部４２ｃの親液化処理としてＯ２プラズマ処理を処理を例示したが、これに限定されるものではなく、他の親液化処理を採ってもよい。係合部４２ｃへの細胞外マトリックス成分１１と真皮細胞１２との混合物の密着性を高める方法として、親液化処理ではなく、例えば皮膚用の接着剤を用いてもよい。皮膚用の接着剤を用いる場合には、細胞外マトリックス成分１１および真皮細胞１２に悪影響が及ばない材料のものを選択することが好ましい。
　また、上記実施形態では、灌流流路１３を形成するための流路形成部材として線状部材であるワイヤー４３を用いる構成を例示したが、ワイヤー４３の他に、例えば、ゲル材またはポリマーで作製した細胞付きあるいは細胞入り３のファイバーを用いる構成であってもよい。この構成を採って、例えば、細胞として血管系細胞１４を含む流路形成部材を用いることにより、血管系細胞１４を注入する工程を別途設ける必要がなくなり、製造効率を向上させることが可能となる。灌流流路１３としては、線状である構成に限られない。例えば、面状部材を流路形成部材として用いることにより、面状の灌流流路を形成することも可能である。この場合、灌流させる培地の流量を多くすることが可能となり、養分供給効率を高めることで一層高品質の人工皮膚組織を製造することができる。面状の流路形成部材としては、例えば、メッシュ材を用いることができる。
　上記実施形態では、表皮細胞２１を培養して表皮層２０を形成するための培地を灌流させるために灌流流路１３を用いる構成を例示したが、この構成に限定されるものではない。例えば、組織表面（例えば表皮層２０）に薬剤を塗布し、当該薬剤の灌流流路１３への取り込みを評価するために灌流流路１３を用いる等の構成であってもよい。また、灌流流路１３を流れる培地中に薬剤を混入させ、当該薬剤が灌流流路１３から真皮組織層１０または表皮層２０への拡散を評価するために灌流流路１３を用いる等の構成であってもよい。このような構成で灌流流路１３を用いる場合には、表皮層２０を形成する前に灌流流路１３を形成する必要はなく、表皮層２０を形成した後に灌流流路１３を形成する手順であっててもよい。また、評価対象を、例えば、真皮組織層１０のみとする場合には、表皮層２０を形成する必要もなくなる。
　また、上記実施形態では、人工三次元組織として人工皮膚組織１を例示したが、これに限定されるものではない。人工三次元組織としては、例えば、上述した線維芽細胞の代わりに、骨格筋細胞または心筋細胞を用いた筋組織であってもよい。さらに、肝細胞を用いた肝臓組織、膵臓系細胞を用いた膵臓組織、神経系細胞を用いた神経組織であってもよい。このような組織に本発明を適用する場合には、上記実施形態で用いた細胞外マトリクスは必ずしも存在していなくてもよく、各種細胞のみを集積したものであってもよい。
　本発明によれば、高品質の人工三次元組織とその製造方法、人工三次元組織灌流デバイス、人工三次元組織を用いた薬剤評価方法を提供できる。このため、本発明は、例えば、化粧品、医薬、製薬等の分野において有用である。
　１…人工皮膚組織（人工三次元組織）、　１０…真皮組織層、　１１…細胞外マトリックス成分、　１２…真皮細胞（線維芽細胞）、　１３…灌流流路、　１４…血管系細胞、　１５…管腔層、　２０…表皮層、　２１…表皮細胞、　４０、４０Ａ…灌流デバイス（人工三次元組織灌流デバイス）、　４１…培養槽、　４２…コネクタ（支持部）、　４２ａ…装着部（筒部）、　４２ｃ…係合部、　４２ｅ…第２筒、　４２ｆ…リブ部、　４３…ワイヤー（線状部材、流路形成部材）、　４４…側壁、　４５…培養空間、　４６…底壁（底部）、　７０…曲面部、　Ｆ…生体モデル、　Ｍ…培地

Claims (19)

  1. 　所定方向に延びる人工三次元組織の製造方法であって、
    　側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、対向する前記側壁を貫いて前記培養空間に前記所定方向に沿って懸架された流路形成部材とを備えたデバイスを準備することと、
    　前記培養空間で細胞を培養して、前記流路形成部材が貫く前記人工三次元組織を形成することと、
    　前記人工三次元組織から前記流路形成部材を抜去して前記人工三次元組織を貫通する灌流流路を形成することと、
    　を含むことを特徴とする人工三次元組織の製造方法。
  2. 　前記対向する側壁にそれぞれ設けた係合部に前記人工三次元組織の一部を係合させて前記所定方向への収縮を抑えながら前記人工三次元組織を形成することを特徴とする請求項１記載の人工三次元組織の製造方法。
  3. 　前記係合部は、前記所定方向に延び前記流路形成部材が挿通される筒部の外周面および前記側壁と隙間をあけて配置された第２筒部と、前記筒部の周方向に間隔をあけて配置され前記筒部の外周面と前記第２筒部の内周面とを接続する複数のリブ部とを有することを特徴とする請求項２記載の人工三次元組織の製造方法。
  4. 　前記培養槽の底部に、前記所定方向に延びる曲面部を設け、
    　前記人工三次元組織を前記曲面部上に形成することを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
  5. 　前記曲面部は、生体モデルの一部であることを特徴とする請求項４記載の人工三次元組織の製造方法。
  6. 　前記灌流流路の表面に血管系細胞を培養して管腔層を形成することを含むことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
  7. 　前記培養槽の底部に設けた開口部を開放して前記培養槽を培養皿に載置することと、
    　前記灌流流路を灌流し前記開口部を介して前記培養皿に溜まった培地を回収することとを含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
  8. 　前記人工三次元組織を形成することは、細胞外マトリックス成分中の真皮細胞を培養して、前記流路形成部材が貫く真皮組織層を形成することと、
    　前記真皮組織層から前記流路形成部材を抜去して前記真皮組織層を貫通する灌流流路を形成することと、
    　前記真皮組織層上に表皮細胞を配置し前記表皮層を形成することと、
    　を含むことを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の人工三次元組織の製造方法。
  9. 　前記灌流流路に培地を灌流させながら前記表皮層を培養することを特徴とする請求項８記載の人工三次元組織の製造方法。
  10. 　請求項１から９のいずれか一項に記載の製造方法で人工三次元組織を製造することと、
    　薬剤を前記人工三次元組織に接触させることと、
    　前記薬剤の接触による刺激に対する前記人工三次元組織の応答を測定することと、
    　を含むことを特徴とする人工三次元組織を用いた薬剤評価方法。
  11. 　所定方向に延びる人工三次元組織に灌流が行われる人工三次元組織灌流デバイスであって、
    　側壁に囲まれた培養空間を有する培養槽と、
    　対向する前記側壁を貫いて前記培養空間における前記人工三次元組織を配置する領域に前記所定方向に沿って懸架される流路形成部材を取り付けおよび取り外し自在に支持する支持部とを備えることを特徴とする人工三次元組織灌流デバイス。
  12. 　前記対向する側壁のそれぞれに、前記人工三次元組織に係合して前記人工三次元組織の前記所定方向への収縮を抑える係合部が設けられることを特徴とする請求項１１記載の人工三次元組織灌流デバイス。
  13. 　前記係合部は、前記所定方向に延び前記流路形成部材が挿通される筒部の外周面および前記側壁と隙間をあけて配置された第２筒部と、前記筒部の周方向に間隔をあけて配置され前記筒部の外周面と前記第２筒部の内周面とを接続する複数のリブ部とを有することを特徴とする請求項１２記載の人工三次元組織灌流デバイス。
  14. 　前記培養槽の底部に、前記所定方向に延びる曲面部が設けられ、
    　前記人工三次元組織は前記曲面部上に配置されることを特徴とする請求項１１から１３のいずれか一項に記載の人工三次元組織灌流デバイス。
  15. 　前記曲面部は、生体モデルの一部であることを特徴とする請求項１４記載の人工三次元組織灌流デバイス。
  16. 　所定方向に延びる人工三次元組織であって、
    　内部を貫通し前記所定方向に延びる灌流流路を有することを特徴とする人工三次元組織。
  17. 　細胞外マトリックス成分および真皮細胞を含む真皮組織層と、
    　表皮細胞を含み前記真皮組織層上に形成された表皮組織層とを含み、
    　前記灌流流路は、前記真皮組織層の内部を貫通し前記所定方向に延びることを特徴とする請求項１６記載の人工三次元組織。
  18. 　前記灌流流路の表面に血管系細胞を用いて形成された管腔層を備えることを特徴とする請求項１６または１７記載の人工三次元組織。
  19. 　前記所定方向と直交する断面が曲面形状であることを特徴とする請求項１６から１８のいずれか一項に記載の人工三次元組織。
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