WO2016060111A1 - γδＴ細胞の製造方法および医薬 - Google Patents

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cell
γδt
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嘉久 山野
研一郎 清野
真人 武藤
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Hokkaido University NUC
St Marianna University School of Medicine
Medinet Co Ltd
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Hokkaido University NUC
St Marianna University School of Medicine
Medinet Co Ltd
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    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing ⁇ T cells and a medicament containing ⁇ T cells.
  • HTLV Human T-cell leukemia virus
  • HTLV-1, 2, Four types 3 and 4 human T-cell leukemia virus type 1 to type 4
  • STLV simian T-lymotropic virus
  • the virus that has entered the host human T-cell is converted from RNA into cDNA in the cytoplasm using the released reverse transcriptase, and after translocation into the nucleus, the cDNA is integrated into the host genomic DNA (this condition is Called viruses).
  • Infected T cells do not necessarily die, and in addition to infecting T cells from T cells, viral proliferation is also seen due to the proliferation of infected T cells. Since HTLV is very inefficiently infected with free virus particles, viral infection mainly requires cell-to-cell contact between infected and uninfected cells. Currently, there are about 1 million or more people infected with HTLV-1 in Japan and more than 20 million people worldwide.
  • HTLV-1 associated myelopathy (hereinafter referred to as “HAM”) (onset rate: about 0.3%).
  • ATL adult T-cell leukemia
  • HTLV-1 infection causes HTLV-1-related uveitis and is also reported to be related to pulmonary lesions, joint lesions, myositis, Sjogren's syndrome, chronic renal failure, or dermatitis (non-patent literature). 3).
  • Immune cell therapy is a treatment method in which immune cells grown and activated outside the patient's body are administered to the patient, and the immune cells are attacked by cancer cells. Immune cell therapy has the advantage that it has few side effects compared with the three major therapies of conventional surgical treatment, radiotherapy, and chemotherapy.
  • ⁇ T cells are cells responsible for innate immunity and are known to have cytotoxic activity against cancer cells.
  • ⁇ T cell therapy is a treatment method in which ⁇ T cells derived from a patient are expanded and activated outside the body, and then the prepared ⁇ T cells are returned to the body of the patient.
  • ⁇ T cells are proliferated and activated using peripheral blood mononuclear cells (hereinafter referred to as “PBMCs”) obtained from the peripheral blood of a patient as a cell source.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • ⁇ T cells are present only in about 1 to 5% in peripheral blood, bisphosphonate and interleukin-2 (as a culture method for collecting a small amount of peripheral blood from a patient and preparing a sufficient number of ⁇ T cells for treatment.
  • IL-2 Interleukin-2
  • HTLV-1 infected person suffers from a cancer or infection other than ATL, it is considered that immune cell therapy is performed to treat the cancer or infection.
  • immune cell therapy is performed to treat the cancer or infection.
  • the conventional method for culturing immune cells there is a risk that HTLV-1 infection will spread in the culture vessel. If the cell population containing HTLV-1-infected cells prepared in this way is returned to the patient (HTLV-1-infected person), the number of HTLV-1-infected cells in the patient's body may increase. For these reasons, immune cell therapy such as ⁇ T cell therapy could not be performed on HTLV-1 infected individuals.
  • HAM and ATL can be treated or prevented.
  • immune cell therapy that reduces the number of HTLV-1 infected cells has not yet been established.
  • Patent Document 2 for the purpose of performing ⁇ T cell therapy for HTLV-1 infected patients, CD4 positive cells which are hosts of HTLV-1 are removed from PBMCs, and the obtained CD4 negative cells are treated with IL-2 and bisphosphonate.
  • a method of culturing in the presence of (zoledronic acid) is disclosed. This method has succeeded in reducing the proportion of viruses contained in a cell population containing ⁇ T cells obtained after culturing, as compared with conventional culturing methods.
  • infected cells other than CD4 positive cells in PBMCs were proliferated by stimulation with IL-2, and the amount of virus per cell was increased.
  • Such examples were detected in both patient and carrier samples, and such patients and carriers could not be predicted from other clinical data. Therefore, such patients and carriers collect blood to obtain PBMCs, and even if the above method is used, the cell population containing ⁇ T cells returned to the body contains many cells infected with HTLV-1. Therefore, we had to give up giving ⁇ T cell immunotherapy.
  • immune cell therapy is expected to treat HTLV-1 infected patients with HTLV-1 virus and cancer, but PBMCs obtained by the method disclosed in Patent Document 2 are sufficient. There was a need to establish a method for culturing ⁇ T cells with cytotoxic activity for use in immune cell therapy for patients and carriers for whom no virus reduction was identified.
  • the present invention has been made in view of such points, and even when PBMCs derived from an HTLV-1 infected person as described above are used as a cell source, the HTLV-1 infected cell is hardly contained, and It is an object of the present invention to provide a method for producing ⁇ T cells, which can obtain a cell population containing a large amount of ⁇ T cells.
  • the present invention also provides a medicament for immunotherapy or immunoprevention for cancer or infectious diseases, which contains a cell population containing almost no HTLV-1-infected cells and containing a large amount of ⁇ T cells. The purpose is to do.
  • CD4 + cells CD4 positive cells expressing surface antigen CD4
  • CD8 + cells CD8 positive cells expressing surface antigen CD8
  • the HTLV is cultured after removing the cells expressing the ⁇ type T cell receptor ( ⁇ TCR) (hereinafter referred to as “ ⁇ T cells”) after removing the “CD8 + cells”).
  • ⁇ T cells ⁇ type T cell receptor
  • the first of the present invention relates to the following method for producing ⁇ T cells.
  • (1) a step of preparing peripheral blood mononuclear cells, and 1) cells expressing a surface marker of either CD4 or CD8, or 2) expressing a surface marker of ⁇ TCR from the peripheral blood mononuclear cells. And culturing the cell population from which the cell expressing the surface marker has been removed in the presence of bisphosphonate and interleukin-2.
  • NK cells (2) The method for producing ⁇ T cells and / or NK cells according to (1), wherein the surface markers are CD4 and CD8, (3) The method for producing ⁇ T cells and / or NK cells according to (1), wherein the peripheral blood mononuclear cells are obtained from peripheral blood of an HTLV-1 infected person, (4) The concentration of the bisphosphonate in the cell suspension is in the range of 0.05 to 100 ⁇ M, and the concentration of the interleukin-2 in the cell suspension is in the range of 50 to 2000 U / mL.
  • the bisphosphonate is pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid, or a salt thereof, or a hydrate thereof. Or the manufacturing method of NK cell.
  • (6) a step of preparing peripheral blood mononuclear cells, and 1) cells expressing either CD4 or CD8 surface markers, or 2) expressing ⁇ TCR surface markers from the peripheral blood mononuclear cells. And culturing the peripheral blood mononuclear cells from which the surface marker-expressing cells have been removed in the presence of bisphosphonate and interleukin-2.
  • a medicament for treating or preventing cancer or an infectious disease comprising ⁇ T cells and / or NK cells produced by a method for producing ⁇ T cells, (7)
  • the medicament according to (6), wherein the surface markers are CD4 and CD8, (8)
  • the pharmaceutical according to (6), wherein the peripheral blood mononuclear cells are obtained from the peripheral blood of a person infected with HTLV-1.
  • the medicament according to (8) which is a medicament for treating or preventing HTLV-1-related myelopathy or adult T-cell leukemia.
  • a cell population containing almost no HTLV-1-infected cells and containing a large amount of ⁇ T cells can be obtained.
  • the obtained ⁇ T cells are expected to have toxic activity against HTLV-1-infected cells in addition to toxic activity against cancer and infectious disease cells. Therefore, according to the production method of the present invention, a cell population containing a large amount of ⁇ T cells containing almost no HTLV-1-infected cells can be obtained from a blood sample derived from an HTLV-1-infected person.
  • ⁇ T cells obtained by the production method of the present invention are used to treat cancer, infectious diseases, or HTLV-1-related diseases caused by HTLV-1-infected cells (HTLV-1-related myelopathy or adult T cell leukemia). Etc.) can be produced.
  • FIG. 1 is a graph showing the amount of provirus contained in PBMCs before culturing and the amount of provirus contained in the cell population after culturing in PBMCs derived from HTLV-1 infected individuals.
  • FIG. 2 is a graph showing the proliferation rate of ⁇ T cells when PBMCs derived from HTLV-1 infected individuals were cultured by the conventional method, CD4 + removal method, and the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method). is there.
  • FIG. 3 is a diagram showing the amount of provirus contained in the cell population before and after culture when PBMCs derived from an HTLV-1 infected person were cultured by the CD4 + removal method.
  • FIG. 1 is a graph showing the amount of provirus contained in PBMCs before culturing and the amount of provirus contained in the cell population after culturing in PBMCs derived from HTLV-1 infected individuals.
  • FIG. 2 is a graph showing the proliferation rate of ⁇ T cells
  • FIG. 4 is a diagram showing the amount of provirus contained in the cell population before and after the culture when PBMCs derived from an HTLV-1 infected person were cultured by the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method).
  • FIG. 5 shows the amount of provirus contained in the cell population before and after culture when PBMC derived from an HTLV-1 infected person was cultured by the conventional method, the CD4 + removal method, and the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method).
  • FIG. FIG. 6 is a diagram showing the virus magnification after PBMCs derived from HTLV-1 infected individuals were cultured by the conventional method, the CD4 + removal method, and the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method).
  • FIG. 7 is a diagram showing the magnification of viruses after cultivating PBMCs derived from HTLV-1 infected individuals by the CD4 + removal method and the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method). The virus magnification was calculated assuming that the amount of provirus contained at the time of collection was 1.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of provirus contained in a cell population before and after the culture when PBMC derived from an HTLV-1 infected person is cultured by the conventional method, the CD4 + removal method, and the method of the present invention ( ⁇ T cell removal method). It is.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of provirus contained in a cell population before and after the culture when PBMC derived from an HTLV-1 infected person is cultured by the conventional method, the CD4 + removal method, and the method of the present invention ( ⁇ T cell removal method). It is.
  • FIG. 8 is a graph showing the amount of provirus contained in a cell population before and after the culture when
  • FIG. 9 is a diagram showing the magnification of the virus after cultivating PBMCs derived from a person infected with HTLV-1 by the CD4 + removal method and the method of the present invention ( ⁇ T cell removal method). The virus magnification was calculated assuming that the amount of provirus contained at the time of collection was 1.
  • FIG. 10 is a diagram showing the cytotoxic activity of ⁇ T cells obtained by culturing PBMCs derived from ATL patients by the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method) against ATL patient-derived cell lines.
  • FIG. 10 is a diagram showing the cytotoxic activity of ⁇ T cells obtained by culturing PBMCs derived from ATL patients by the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method) against ATL patient-derived cell lines.
  • FIG. 11 is a diagram showing the cytotoxic activity of ⁇ T cells obtained by culturing PBMCs derived from HAM patients by the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method) against ATL patient-derived cell lines.
  • FIG. 12 shows a Daudi cell line in the presence (Rituximab +) or absence (Rituximab ⁇ ) of ⁇ T cells obtained by culturing PBMCs derived from HAM patients by the method of the present invention (CD4 + CD8 + elimination method). It is a figure which shows the cytotoxic activity with respect to.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of analyzing CD16 expression of ⁇ T cells obtained by culturing PBMCs derived from HAM patients by the method of the present invention (CD4 + CD8 + removal method).
  • Method for producing ⁇ T cells comprises 1) a first step of preparing PBMCs, 2) a second step of removing cells expressing a predetermined surface marker from the PBMCs, and 3) the remaining A third step of culturing PBMCs in the presence of bisphosphonate and IL-2.
  • the method for producing ⁇ T cells of the present invention is characterized in that in the second step, cells expressing a predetermined surface marker are removed from PBMCs.
  • PBMCs PBMCs
  • PBMCs serving as a cell source of ⁇ T cells are prepared.
  • peripheral blood mononuclear cells refers to a cell population containing lymphocytes (natural killer cells, natural killer T cells, ⁇ T cells, ⁇ T cells, etc.), monocytes and the like isolated from peripheral blood. means.
  • the method for preparing PBMCs is not particularly limited.
  • PBMCs can be obtained by subjecting peripheral blood obtained by blood collection to density gradient centrifugation.
  • the amount of blood collected at one time may be appropriately set according to the patient undergoing ⁇ T cell therapy, and is, for example, about 45 to 75 mL.
  • cells expressing a surface marker of either CD4 or CD8 or cells expressing a surface marker of ⁇ TCR are removed from the PBMCs prepared in the first step.
  • CD4, CD8, and ⁇ TCR are surface markers known to be expressed in cells targeted by HTLV-1. Therefore, by removing cells expressing these surface markers, almost all HTLV-1-infected cells in PBMCs can be removed even if HTLV-1-infected cells are included in PBMCs. Yes (see examples).
  • the method for removing cells expressing the surface marker from PBMCs is not particularly limited, and may be appropriately selected from known methods. Examples of the method for removing cells expressing the surface marker from PBMCs include magnetic cell separation, flow cytometry, and the like.
  • the PBMCs after removing the cells expressing the predetermined surface marker in the second step are suspended in a culture solution (medium), and the resulting cell suspension is bisphosphonate and IL-2. And ⁇ T cells are cultured.
  • a culture solution medium
  • bisphosphonate and IL-2 are cultured.
  • ⁇ T cells can be selectively proliferated and activated to prepare a cell population containing activated ⁇ T cells with high purity (Patent Document 1). reference).
  • the kind of culture medium (medium) in which PBMCs are suspended is not particularly limited as long as ⁇ T cells can be grown.
  • Examples of such culture media include AIM-V medium, RPMI-1640 medium, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), and Iskov medium.
  • Serum may be added to these culture solutions as necessary. Examples of added serum include fetal calf serum (FCS), AB serum, and autologous plasma.
  • the bisphosphonate is not particularly limited and refers to a compound having a P—C—P skeleton.
  • Examples of the bisphosphonate used in the present invention include compounds represented by the following general formula [Chemical Formula 1], salts thereof, and hydrates thereof.
  • R is a hydrogen atom or a lower alkyl group
  • R 1 and R 2 are each independently a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, an amino group, a thiol group, or a substituted group.
  • Selected from the group consisting of an aryl group which may be substituted, an alkyl group which may be substituted, a lower alkylamino group, an aralkyl group, a cycloalkyl group and a heterocyclic group, and R 1 and R 2 are ones of the same cyclic structure. A part may be formed.
  • Examples of the substituent in R 1 and R 2 include a halogen atom, a lower alkyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an amino group, an alkoxy group, an aryl group, an arylthio group, an aryloxy group, an alkylthio group, a cycloalkyl group, Selected from the group consisting of heterocyclic groups and the like.
  • examples of the halogen atom include a fluoro atom, a chloro atom, and a bromine atom
  • examples of the alkyl group include a direct group such as a methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, pentyl, heptyl, octyl, and pentadecanyl group.
  • Examples of the aralkyl group include an aryl-lower alkyl group and the like;
  • Examples of the cycloalkyl group include a C 1 -C 10 cycloalkyl group such as cyclooctyl and adamantyl; and examples of the heterocyclic group include pyridyl, furyl, Pyrrolidinyl, imidazolyl, quinolyl, isoquinolyl group and the like are shown respectively.
  • the bisphosphonate is preferably pharmaceutically acceptable, and has a bone resorption inhibitory action and is generally used as a therapeutic agent for osteoporosis.
  • examples include pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid, risedronic acid, ibandronic acid, incadronic acid and their salts, and hydrates thereof. These are aminobisphosphonates having a nitrogen atom, and pamidronic acid, alendronic acid, zoledronic acid and their salts, and their hydrates are particularly preferred.
  • bisphosphonate bone metabolism-improving drugs include, for example, disodium pamidronate pentahydrate (AREDIA (registered trademark); Novartis Pharma Co., Ltd.), zoledronic acid hydrate (ZOMETA (registered trademark); Novartis Pharma) Etc.).
  • AREDIA registered trademark
  • ZOMETA registered trademark
  • Novartis Pharma Novartis Pharma
  • the concentration of bisphosphonate added during the cultivation of PBMCs is preferably in the range of 0.05 to 100 ⁇ M, and more preferably in the range of 0.1 to 30 ⁇ M. More specifically, when pamidronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof, alendronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof is added as a bisphosphonate, the concentration of bisphosphonate is within a range of 1 to 30 ⁇ M. preferable. When zoledronic acid or a salt thereof or a hydrate thereof is added as the bisphosphonate, the concentration of bisphosphonate is preferably within the range of 0.1 to 10 ⁇ M.
  • the concentration of IL-2 added during cultivation of PBMCs is preferably in the range of 50 to 2000 U / mL, and more preferably in the range of 400 to 1000 U / mL.
  • the culture conditions for PBMCs are not particularly limited as long as ⁇ T cells can be grown and activated.
  • the culture may be performed for about 7 to 14 days in the presence of 34 to 38 ° C (preferably 37 ° C) and 2 to 10% (preferably 5%) CO 2 .
  • a culture solution is appropriately added according to the number of cells to be cultured.
  • IL-2 is appropriately added so as to be 50 to 2000 U / mL, more preferably 400 to 1000 U / mL, in accordance with the increase of the culture medium amount.
  • a cell population containing a large amount of ⁇ T cells can be obtained.
  • the obtained cell population can be used as cells to be administered to a patient in ⁇ T cell therapy as described later.
  • the method for producing ⁇ T cells of the present invention since HTLV-1-infected cells are removed in the second step, even if HTLV-1-infected cells are contained in the PBMCs prepared in the first step, Don't be. Therefore, the method for producing ⁇ T cells of the present invention can be used for PBMCs derived from HTLV-1-infected persons. By using the method for producing ⁇ T cells of the present invention, it is possible to produce a cell population containing a large amount of ⁇ T cells after reducing the amount of virus after culturing from PBMCs derived from peripheral blood of HTLV-1 infected patients. .
  • ⁇ T cells immune cells having cytotoxic activity such as natural killer cells (NK cells) are stimulated / proliferated alone or together with ⁇ T cells. It is also possible. NK cells do not express T cell specific markers (TCR, CD3, CD4, CD8) and B cell specific markers (Ig, CD19, CD20) and proliferate upon stimulation with IL-2. Therefore, the cells can be stimulated and proliferated simultaneously with the ⁇ T cells without being affected by the cell removal by the microbeads according to the present invention. Therefore, the ⁇ T cell according to the present invention may include NK cells.
  • NK cells When only NK cells are isolated, CD4 + cells and CD8 + cells can be removed or ⁇ T cells can be removed, and then both can be separated and purified by a known method.
  • NK cells can be isolated by removing cells expressing ⁇ TCR by magnetic cell separation, flow cytometry, etc., using ⁇ TCR, which is a ⁇ T cell specific marker.
  • the medicament of the present invention is a medicament for treating / preventing cancer or infectious diseases, etc., comprising ⁇ T cells produced by the production method of the present invention described above.
  • the medicament of the present invention is, for example, an injection (cell suspension) in which ⁇ T cells produced by the production method of the present invention are suspended in a liquid (eg, physiological saline) that can be used as a pharmaceutical product.
  • a liquid eg, physiological saline
  • This injection may be injected intravenously, intradermally, subcutaneously, etc., may be directly injected into a lesion, or may be administered systemically as an infusion.
  • the medicament of the present invention contains ⁇ T cells produced by the production method of the present invention as an essential component, but may contain other components as optional components.
  • cytokines such as IL-2 and IL-12 may be added.
  • interferon or the like when using the medicament of the present invention as a therapeutic or prophylactic agent for viral infection, interferon or the like may be added.
  • cells having cytotoxic activity such as other NK cells may be included.
  • the number of ⁇ T cells contained in the medicament of the present invention can be appropriately set according to the administration method, the type of disease, the patient's symptoms, and the like. Usually, it may be set to be 10 8 to 10 12 / person (preferably 10 9 / person).
  • the method for producing the medicament of the present invention is not particularly limited.
  • the medicament of the present invention can be obtained by 1) collecting ⁇ T cells obtained by the method for producing ⁇ T cells of the present invention by centrifugation or the like; 2) washing the collected ⁇ T cells with a washing solution (for example, physiological saline or PBS). 3) The washed ⁇ T cells are collected by centrifugation or the like; 4) The collected ⁇ T cells are suspended in a liquid that can be used as a pharmaceutical (for example, physiological saline).
  • the production method of the present invention can produce a large amount of ⁇ T cells from PBMCs derived from the peripheral blood of HTLV-1 infected patients with a reduced viral load compared to the originally contained viral load. . Therefore, there is a possibility that the pharmaceutical containing ⁇ T cells produced by the production method of the present invention may increase the number of HTLV-1 infected cells originally present in the infected body even when administered to an HTLV-1 infected person. Low. Therefore, the medicament of the present invention can be used as a medicament for performing ⁇ T cell therapy for HTLV-1 infected persons.
  • ⁇ T cells have cytotoxic activity against HTLV-1 infected cells (including leukemia cells of ATL patients). This was first discovered by the present inventors. As described above, it is expected that HAM and ATL can be treated and prevented if the number of HTLV-1-infected cells in the body of an HTLV-1 infected person can be reduced. Therefore, the medicament of the present invention can be used as a medicament for treating / preventing HAM and ATL.
  • the washed PBMCs were suspended in a lymphocyte culture medium (ALyS203; Cell Science Laboratory Co., Ltd.) to prepare a cell suspension.
  • the obtained cell suspension was dispensed into 24-well microplates at 2 ⁇ 10 6 PBMCs / well.
  • IL-2 Immunotech
  • ZOMETA registered trademark
  • autologous plasma were added to each well.
  • the final concentration of each component is IL-2: 1000 U / mL, zoledronic acid hydrate: 5 ⁇ M, autologous plasma: 10%.
  • the microplate was transferred into a CO 2 incubator (temperature: 37 ° C., CO 2 concentration: 5%, humidity: supersaturated), and PBMCs were cultured for 14 days. During the culture period, every time cells became confluent, medium supplemented with IL-2 was added. In addition, autologous plasma was appropriately added so that the plasma concentration in the medium did not fall below 1%.
  • the anti-CD45 antibody uses an ECD-labeled anti-human CD45 antibody (Beckman Coulter, Inc.)
  • the anti-CD3 antibody uses a PC5-labeled anti-human CD3 antibody (Beckman Coulter, Inc.)
  • the anti-TCR V ⁇ 9 antibody uses FITC.
  • a labeled anti-human TCR V ⁇ 9 antibody was used.
  • the cell population to be measured (cells of day 0 or day 14) was suspended in a lysis buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 1% SDS). Proteinase K (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added to the obtained cell suspension so that the final concentration is 150 ⁇ g / mL, shaken overnight at 55 ° C., and then extracted with genomic DNA using phenol chloroform. did.
  • Real-time PCR was performed using the TaqMan probe-primer set (SEQ ID NOs: 1-6) for the pX region of HTLV-1 and human ⁇ -actin.
  • a standard curve was prepared using standard samples to calculate the amount of HTLV-1 pX region and human ⁇ -actin, and from these values, the amount of HTLV-1 provirus per 100 cells was calculated.
  • ⁇ T cells are cultured by the method of the present invention (a method of removing CD4 + cells and CD8 + cells from PBMCs).
  • the cell population from which CD4 + cells were removed and the cell population from which CD4 + cells and CD8 + cells were removed were cultured for 14 days in the same manner as in the above comparative example. Since the number and ratio of ⁇ T cells contained in PBMCs differ depending on the subject, the increase rate of ⁇ T cells before and after the culture was compared. The results are shown in FIG. A method of removing the CD4 + cells, it was found that there was no change to the rate of increase ⁇ T cells in the method for removing CD4 + cells and CD8 + cells.
  • the amount of provirus after culturing could be reduced compared to before culturing.
  • some donors may increase the amount of provirus.
  • the average value of the proportion of provirus is calculated, the average value of the proportion of virus before culture (day 0) is 4.18 copies / 100.
  • the average value of the provirus after culturing (day 14) was 5.67 copies / 100 cells.
  • a method of removing only the CD4 + cells is a diagram showing by extracting a method of removing CD4 + cells and CD8 + cells.
  • the target virus increase rate is 1 or less, 4 cases out of 13 cases achieved the target in the method of removing only CD4 + cells, whereas the method of removing CD4 + cells and CD8 + cells Then all 11 cases achieved the target value.
  • the target virus increase rate was 1 or less, the conventional ⁇ T cell culture method could not achieve the target value in two cases. Although the method of removing only CD4 + cells and the method of removing ⁇ T cells achieved the target values in all three cases, it was confirmed that the method of removing ⁇ T cells reduced the virus to below the detection limit.
  • the method of the present invention (a method for removing CD4 + cells and CD8 + cells or a method for removing ⁇ T cells) is more effective than the amount of virus originally contained from PBMCs derived from peripheral blood of HTLV-1 infected patients.
  • the method for culturing a large amount of ⁇ T cells without reducing the amount of virus and affecting the proliferation ability of ⁇ T cells is more stable than the method of removing CD4 + cells. Since the medicament containing ⁇ T cells produced by the production method of the present invention is less likely to increase the number of HTLV-1-infected cells originally present in the infected body even when administered to an HTLV-1 infected person. It can be used for ⁇ T cell therapy for HTLV-1 infected patients.
  • ⁇ T cell cytotoxic activity obtained by the culture method of the present invention was confirmed.
  • Blood was collected from ATL patients or HAM patients, peripheral blood mononuclear cells were isolated, and ⁇ T cells were obtained by the method of the present invention.
  • the obtained ⁇ T cells (Effect cell) were mixed with an ATL patient-derived cell line (KK1, KOB: Target cell) so that the E / T (Effect cell / Target cell) ratio was 1, 5 or 25, and both were mixed for 2 hours. Cultured. Two hours later, cytotoxic activity was measured using Terascan (Minervatec).
  • FIG. 10 shows the cytotoxic activity of ⁇ T cells cultured from PBMCs derived from ATL patients. It has been clarified that ⁇ T cells derived from ATL patients exhibit cytotoxic activity against KK1 and KOB.
  • FIG. 11 shows the cytotoxic activity of ⁇ T cells cultured from PBMCs derived from HAM patients. It has been clarified that ⁇ T cells derived from HAM patients show cytotoxic activity against KK1 and KOB.
  • ⁇ T cells obtained by the method of the present invention have antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC).
  • ADCC antibody-dependent cytotoxic activity
  • the obtained ⁇ T cells were mixed with a malignant lymphoid-derived Daudi cell line (CD20 positive human lymphoma cell line) so as to have an E / T ratio of 1, 5 or 25, and rituximab (anti-human CD20 human / mouse chimeric antibody) ) (Rituxan (registered trademark), Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.) was added and co-cultured for 2 hours. Two hours later, cytotoxic activity was measured using Terascan (Minervatec).
  • a malignant lymphoid-derived Daudi cell line CD20 positive human lymphoma cell line
  • rituximab anti-human CD20 human / mouse chimeric antibody
  • ⁇ T cells obtained by the culture method of the present invention are expected to damage HTLV-1-infected cells and cancer cells present in the patient when administered into the patient.
  • the production method of the present invention is useful, for example, as a method for producing ⁇ T cells when ⁇ T cell therapy is performed on an HTLV-1 infected person.
  • the medicament of the present invention is useful as a medicament containing ⁇ T cells for the treatment of cancer, infectious diseases or HTLV-1-related diseases, for example, for HTLV-1-infected persons, HAM patients and ATL patients. .
  • antibody-dependent cytotoxic activity it can also be used in combination with existing antibody drugs.
  • an HTLV-1-infected person suffers from rituximab when suffering from CD20 positive B-cell non-Hodgkin lymphoma, trastuzumab when suffering from Her2 positive cancer, and metastatic colorectal cancer If this is the case, combination with cetuximab, etc. is expected to improve the therapeutic effect. Furthermore, for CCR4-positive ATL patients, the therapeutic effect is expected to be improved by combining with mogamulizumab.

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Abstract

ＨＴＬＶ（ヒトＴ細胞白血病ウィルス）感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる、γδＴ細胞の製造方法を提供することを目的とする。 γδＴ細胞を増殖させる前に、細胞源となるＰＢＭＣｓからＣＤ４を発現するＣＤ４陽性細胞（以下、「ＣＤ４＋細胞」と記す）とＣＤ８を発現するＣＤ８陽性細胞（以下、「ＣＤ８＋細胞」と記す）を除去した後、又はαβ型Ｔ細胞受容体（αβＴＣＲ）を発現する細胞（以下、「αβＴ細胞」と記す）を除去した後に培養を行うことで、ＨＴＬＶ－１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得られる。

Description

γδＴ細胞の製造方法および医薬
　本発明は、γδＴ細胞の製造方法およびγδＴ細胞を含有する医薬に関する。
ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ｈｕｍａｎ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ；以下「ＨＴＬＶ」と略記する）はレトロウィルスに属し、現在までの所、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型～４型（以下ＨＴＬＶ－１、２、３、及び４）の４種類が確認されている。類縁ウイルスにｓｉｍｉａｎ　Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ　ｖｉｒｕｓ（＝ＳＴＬＶ）がある。このうち、ＨＴＬＶ－Ｉは主としてＣＤ４陽性細胞に感染し、ＨＴＬＶ－２は主としてＣＤ８陽性細胞に感染することが知られている（非特許文献１、２参照）。宿主であるヒトのＴ細胞内に侵入したウイルスは、放出した逆転写酵素を用いて細胞質内でＲＮＡからｃＤＮＡとなり、核内に移行した後、ｃＤＮＡは宿主ゲノムＤＮＡへインテグレーションする（この状態をプロウイルスという）。感染Ｔ細胞は必ずしも死滅するわけではなく、Ｔ細胞からＴ細胞へ感染するほかに、感染したＴ細胞の増殖によるウイルス増殖もみられる。ＨＴＬＶは、フリーのウイルス粒子による感染の効率が非常に悪いので、ウイルスの感染には、主として感染細胞と非感染細胞の細胞間接触が必要である。
　現在、ＨＴＬＶ－１の感染者は、日本に約１００万人以上存在し、世界に２０００万人以上存在する。感染者の一部は、ＨＴＬＶ－１関連脊髄症（ＨＴＬＶ－１　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ；以下「ＨＡＭ」と記す）を発病する（発病率：約０．３％）。また、感染者の別の一部は、成人Ｔ細胞白血病（ａｄｕｌｔ　Ｔ－ｃｅｌｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａ；以下「ＡＴＬ」と記す）を発病する（発病率：約５％）。さらにＨＴＬＶ－１の感染はＨＴＬＶ－１関連ぶどう膜炎を引き起こし、肺病変、関節病変、筋炎、シェーグレン症候群、慢性腎不全、または皮膚炎などにも関係することが報告されている（非特許文献３）。
　ＨＡＭおよびＡＴＬなどの上記疾患は、体内のＨＴＬＶ－１感染細胞の数が増加すると発病しやすくなることが知られている。したがって、ＨＴＬＶ－１感染者（キャリア）の体内のＨＴＬＶ－１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬの発病を予防できると期待される。同様に、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者の体内のＨＴＬＶ－１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療できると期待される。しかしながら、現在のところ、ＨＡＭおよびＡＴＬに対する有効な予防法および治療法は確立されておらず、一刻も早い予防法および治療法の開発が切望されていた。
　一方、近年、がんに対する治療法として免疫細胞治療が注目されている。免疫細胞治療とは、患者の体外で増殖および活性化させた免疫細胞を患者に投与し、その免疫細胞にがん細胞を攻撃させる治療法である。免疫細胞治療は、従来の外科治療、放射線治療、化学治療の三大療法に比べて副作用がほとんどないという利点を有している。
　免疫細胞治療には様々な種類の治療法があるが、その一つとしてγδＴ細胞療法がある。γδＴ細胞は、自然免疫を担う細胞であり、がん細胞に対して細胞傷害活性を有することが知られている。γδＴ細胞療法は、患者由来のγδＴ細胞を体外で増殖および活性化させた後、調製されたγδＴ細胞を患者の体内に戻す治療法である。
　γδＴ細胞療法では、患者の末梢血から得られた末梢血単核球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ　ｃｅｌｌｓ；以下「ＰＢＭＣｓ」と記す）を細胞源として、γδＴ細胞を増殖および活性化させる。γδＴ細胞は、末梢血中に１～５％程度しか存在しないが、患者から少量の末梢血を採取し、治療に十分な数のγδＴ細胞を調製する培養方法として、ビスホスホネートおよびインターロイキン－２（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－２；以下「ＩＬ－２」と記す）を培養液に添加する方法等が提案されている（例えば、特許文献１参照）。これらの方法によって、がん患者を対象としたγδＴ細胞療法の実施が可能となった。
　ＨＴＬＶ－１感染者が、ＡＴＬ以外のがんまたは感染症に罹患した場合、がんまたは感染症を治療するために免疫細胞治療を実施することが考えられる。しかしながら、従来の免疫細胞の培養方法では、培養容器内においてＨＴＬＶ－１の感染が拡大してしまうおそれがある。このようにして調製されたＨＴＬＶ－１感染細胞を含む細胞集団を患者（ＨＴＬＶ－１感染者）に戻すと、患者の体内のＨＴＬＶ－１感染細胞の数が増加してしまうおそれがある。以上のことから、ＨＴＬＶ－１感染者に対しては、γδＴ細胞療法などの免疫細胞治療を実施することができなかった。
　また、前述の通り、ＨＴＬＶ－１感染者の体内のＨＴＬＶ－１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療または予防することができると期待される。ＨＴＬＶ－１感染細胞の数を減少させる手法としては、上述の免疫細胞治療を実施することが考えられる。しかしながら、ＨＴＬＶ－１感染細胞の数を減少させる免疫細胞治療は、まだ確立されていない。
　特許文献２には、ＨＴＬＶ－１感染者にγδＴ細胞療法を実施すること目的として、ＰＢＭＣｓからＨＴＬＶ－１の宿主であるＣＤ４陽性細胞を除去し、得られたＣＤ４陰性細胞をＩＬ－２及びビスホスホネート（ゾレドロン酸）の存在下で培養する方法を開示している。当該方法により、従来の培養方法と比較して、培養後に得られるγδＴ細胞を含む細胞集団に含まれるウイルスの割合を減らすことに成功している。
国際公開第２００６／００６７２０号パンフレット 特開２０１２－０９０５７４
Ｄｏｕｅｉｒｉ　ｅｔ　ａｌ．　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ　２０１２，　９：６４ Ｉｊｉｃｈｉ　Ｓ　ｅｔ　ａｌ．　Ｊ．　Ｅｘｐ．　Ｍｅｄ．１９９２；１７６：２９３－２９６ ＨＴＬＶ－１キャリア　指導の手引き　厚生労働省研究班「本邦におけるＨＴＬＶ－１感染及び関連疾患の実態調査と総合対策」
　ＨＴＬＶ－１感染者の末梢血を採取し、リンパ球等を培養し、がんの治療等を目的として、体内に戻す場合、投与する細胞懸濁液中に、採取時の末梢血に含まれていたウイルス量以上のウイルスが含まれていると、患者体内のウイルス量を増加させることになり、患者の体調等に影響する可能性がある。特許文献２に開示されている方法により得られた細胞集団は、一定の患者及びキャリアにおいて、ウイルスの割合は減少していた。しかしながら、臨床例を増やしていくうちに、上記方法によっても、ウイルスの割合は減少せず、かえって増加する例が発見された。これはＰＢＭＣｓの中のＣＤ４陽性細胞以外の感染細胞がＩＬ－２による刺激によって増殖され、細胞当たりのウイルス量が増加していると考えられた。このような例は患者及びキャリアのサンプルの両方で検出され、他の臨床データから、このような患者及びキャリアを予測することが出来なかった。従って、このような患者及びキャリアはＰＢＭＣｓを得るために採血を行って、たとえ上記方法を用いたとしても、体内に戻すγδＴ細胞を含む細胞集団中にＨＴＬＶ－１に感染した細胞が多く含まれているため、γδＴ細胞免疫療法をすることを断念せざるを得なかった。
　上述の通り、ＨＴＬＶ－１感染者に対してＨＴＬＶ－１ウイルスによる疾病や、がんに対する治療として免疫細胞治療が期待されるものの、特許文献２に開示されている方法で得られるＰＢＭＣｓでは十分なウイルスの減少が確認できない患者及びキャリアのための免疫細胞治療に使用する、細胞傷害活性を有するγδＴ細胞の培養方法を確立する必要があった。
　本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、上記のようなＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源として用いた場合であっても、ＨＴＬＶ－１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる、γδＴ細胞の製造方法を提供することを目的とする。
　また、本発明は、ＨＴＬＶ－１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を含有する、がんまたは感染症などを対象とする免疫療法または免疫予防するための医薬を提供することを目的とする。
　また、本発明は、ＨＴＬＶ－１の感染に関連するＨＡＭおよびＡＴＬその他疾患・症状を治療または予防するための医薬を提供することを目的とする。
　本発明者は、γδＴ細胞を増殖させる前に、細胞源となるＰＢＭＣｓから表面抗原ＣＤ４を発現するＣＤ４陽性細胞（以下、「ＣＤ４＋細胞」と記す）と表面抗原ＣＤ８を発現するＣＤ８陽性細胞（以下、「ＣＤ８＋細胞」と記す）を除去した後、又はαβ型Ｔ細胞受容体（αβＴＣＲ）を発現する細胞（以下、「αβＴ細胞」と記す）を除去した後に培養を行うことで、ＨＴＬＶ－１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得られることを見出した。また、本発明者は、当該培養方法により得られたγδＴ細胞がＨＴＬＶ－１感染細胞（白血病細胞を含む）に対して細胞傷害活性を有することも見出した。本発明者は、これらの知見を基にしてさらに検討を加えて本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の第１は、以下のγδＴ細胞の製造方法に関する。
（１）末梢血単核球を準備するステップと、前記末梢血単核球から、１）ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかの表面マーカーを発現している細胞、又は２）αβＴＣＲの表面マーカーを発現している細胞、のいずれか１つを除去するステップと、前記表面マーカーを発現している細胞を除去した細胞集団をビスホスホネートおよびインターロイキン－２の存在下で培養するステップと、を含む、γδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法、
（２）前記表面マーカーは、ＣＤ４およびＣＤ８である、（１）に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法、
（３）前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ－１の感染者の末梢血から得られたものである、（１）に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法、
（４）前記細胞懸濁液中における前記ビスホスホネートの濃度は、０．０５～１００μＭの範囲内であり、前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン－２の濃度は、５０～２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、（１）に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法、
（５）前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、（１）に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法。
（６）末梢血単核球を準備するステップと、前記末梢血単核球から、１）ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかの表面マーカーを発現している細胞、又は２）αβＴＣＲの表面マーカーを発現している細胞、のいずれか１つを除去するステップと、前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン－２の存在下で培養するステップと、を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含有する、がんまたは感染症を治療または予防するための医薬、
（７）前記表面マーカーは、ＣＤ４およびＣＤ８である、（６）に記載の医薬、
（８）前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ－１の感染者の末梢血から得られたものである、（６）に記載の医薬、
（９）ＨＴＬＶ－１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病を治療または予防するための医薬である、（８）に記載の医薬。
　本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓを用いた場合であっても、ＨＴＬＶ－１感染細胞をほとんど含まず、かつγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られたγδＴ細胞は、がんや感染症細胞に対する傷害活性を有する他、ＨＴＬＶ－１感染細胞に対する傷害活性も期待される。したがって、本発明の製造方法によれば、ＨＴＬＶ－１感染者に由来する血液試料から、ＨＴＬＶ－１感染細胞をほとんど含まないγδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。また、本発明の製造方法によって得られたγδＴ細胞を用いて、がん、感染症、又はＨＴＬＶ－１感染細胞が原因となるＨＴＬＶ－１関連疾患（ＨＴＬＶ－１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病等）を治療・予防するための医薬を製造することができる。
図１は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓにおいて、培養前のＰＢＭＣｓに含まれるプロウイルス量と培養後の細胞集団に含まれるプロウイルス量を示す図である。 図２は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓを、従来法、ＣＤ４＋除去法、本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養を行った際の、γδＴ細胞の増殖率を示す図である。 図３は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓを、ＣＤ４＋除去法により培養した場合の、培養前後の細胞集団に含まれるプロウイルス量を示す図である。 図４は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓを、本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養した場合の、培養前後の細胞集団に含まれるプロウイルス量を示す図である。 図５は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣを従来法、ＣＤ４＋除去法、本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養した場合の、培養前後の細胞集団に含まれるプロウイルス量を示す図である。 図６は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓについて、従来法、ＣＤ４＋除去法、本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養した後のウイルスの倍率を示す図である。ウイルスの倍率は採取時に含まれていたプロウイルス量を１として算出した。 図７は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓについて、ＣＤ４＋除去法、本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養した後のウイルスの倍率を示す図である。ウイルスの倍率は採取時に含まれていたプロウイルス量を１として算出した。 図８は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣを従来法、ＣＤ４＋除去法、本発明方法（αβＴ細胞除去法）により培養した場合の、培養前後の細胞集団に含まれるプロウイルス量を示す図である。 図９は、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓについて、ＣＤ４＋除去法、本発明方法（αβＴ細胞除去法）により培養した後のウイルスの倍率を示す図である。ウイルスの倍率は採取時に含まれていたプロウイルス量を１として算出した。 図１０は、ＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣｓを本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養して得られたγδＴ細胞の、ＡＴＬ患者由来細胞株に対する細胞傷害活性を示す図である。 図１１は、ＨＡＭ患者由来のＰＢＭＣｓを本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養して得られたγδＴ細胞の、ＡＴＬ患者由来細胞株に対する細胞傷害活性を示す図である。 図１２は、ＨＡＭ患者由来のＰＢＭＣｓを本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養して得られたγδＴ細胞の、リツキシマブ存在下（Rituximab+）又は非存在下（Rituximab-）におけるＤａｕｄｉ細胞株に対する細胞傷害活性を示す図である。 図１３は、ＨＡＭ患者由来のＰＢＭＣｓを本発明方法（ＣＤ４＋ＣＤ８＋除去法）により培養して得られたγδＴ細胞の、ＣＤ１６発現を解析した結果を示す図である。
＜１．γδＴ細胞の製造方法＞
　本発明のγδＴ細胞の製造方法は、１）ＰＢＭＣｓを準備する第１のステップと、２）前記ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去する第２のステップと、３）残余のＰＢＭＣｓをビスホスホネートおよびＩＬ－２の存在下で培養する第３のステップとを含む。
　本発明のγδＴ細胞の製造方法は、第２のステップにおいて、ＰＢＭＣｓから所定の表面マーカーを発現している細胞を除去することを一つの特徴とする。以下、各ステップについて説明する。
　第１のステップでは、γδＴ細胞の細胞源となるＰＢＭＣｓを準備する。ここで「末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）」とは、末梢血から分離された、リンパ球（ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴ細胞、γδＴ細胞など）、単球などを含む細胞集団を意味する。ＰＢＭＣｓを準備する方法は、特に限定されない。たとえば、採血により得られた末梢血を密度勾配遠心することで、ＰＢＭＣｓを得ることができる。１回の採血量は、γδＴ細胞療法を行う患者に応じて適宜設定すればよいが、例えば４５～７５ｍＬ程度である。
　また、多量の細胞を確保する必要がある場合には、成分採血装置を用いて単核球成分を採取することにより、直接ＰＢＭＣｓを取得することが可能である。
　第２のステップでは、第１のステップで準備したＰＢＭＣｓから、ＣＤ４又はＣＤ８のいずれかの表面マーカーを発現している細胞又はαβＴＣＲの表面マーカーを発現している細胞を除去する。
　ＣＤ４、ＣＤ８、αβＴＣＲは、ＨＴＬＶ－１の標的となる細胞に発現することが知られている表面マーカーである。したがって、これらの表面マーカーを発現している細胞を除去することで、仮にＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ－１感染細胞が含まれていたとしても、ＰＢＭＣｓ中のＨＴＬＶ－１感染細胞をほとんどすべて除去することができる（実施例参照）。
　ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法は、特に限定されず、公知の方法から適宜選択すればよい。ＰＢＭＣｓから上記表面マーカーを発現している細胞を除去する方法の例には、磁気細胞分離法、フローサイトメトリーなどが含まれる。
　第３のステップでは、第２のステップにおいて所定の表面マーカーを発現している細胞を除去した後のＰＢＭＣｓを培養液（培地）に懸濁し、得られた細胞懸濁液にビスホスホネートおよびＩＬ－２を添加して、γδＴ細胞を培養する。ＰＢＭＣｓをビスホスホネートおよびＩＬ－２の存在下で培養することにより、γδＴ細胞を選択的に増殖および活性化させて、活性化γδＴ細胞を高純度に含む細胞集団を調製することができる（特許文献１参照）。
　ＰＢＭＣｓを懸濁させる培養液（培地）の種類は、γδＴ細胞を増殖させることができれば特に限定されない。そのような培養液の例には、ＡＩＭ－Ｖ培地、ＲＰＭＩ－１６４０培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ培地が含まれる。これらの培養液には、必要に応じて血清を添加してもよい。添加される血清の例には、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ＡＢ血清、自己血漿が含まれる。
　本発明において、ビスホスホネートとは、特に制限されず、Ｐ－Ｃ－Ｐの骨格を有する化合物をいう。本発明に用いるビスホスホネートは、例えば、下記一般式［化１］で表わされる化合物、その塩、及びそれらの水和物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記［化１］中、Ｒは、水素原子又は低級アルキル基であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、置換されていてもよいアリール基、置換されていてもよいアルキル基、低級アルキルアミノ基、アルアルキル基、シクロアルキル基及び複素環式基からなる群から選択され、またＲ１とＲ２は同じ環状構造の一部を形成してもよい。
　上記Ｒ１とＲ２における置換基としては、例えば、ハロゲン原子、低級アルキル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミノ基、アルコキシ基、アリール基、アリールチオ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、シクロアルキル基、複素環式基等からなる群から選択される。
　本明細書において、ハロゲン原子としては、例えば、フルオロ原子、クロロ原子、臭素原子等；アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチル、ヘプチル、オクチル、ペンタデカニル基等の直鎖又は分枝鎖Ｃ１－Ｃ３０アルキル基等；低級アルキル基としては、例えば、直鎖又は分枝鎖Ｃ１－Ｃ１０アルキル基等；アリール基としては、例えば、フェニル、ナフチル基等；アルアルキル基としては、例えば、アリール－低級アルキル基等；シクロアルキル基としては、例えば、シクロオクチル、アダマンチル等のＣ１－Ｃ１０シクロアルキル基等；複素環式基としては、ピリジル、フリル、ピロリジニル、イミダゾリル、キノリル、イソキノリル基等をそれぞれ示す。
　また、本発明において、ビスホスホネートは、薬学的に許容されるものが好ましく、骨吸収抑制作用を有し、一般的に骨粗鬆症治療薬として使用されているものがあげられる。その例として、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が含まれる。これらは、窒素原子を有するアミノビスホスホネートであり、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸およびこれらの塩、ならびにこれらの水和物が特に好ましい。市販されているビスホスホネート系骨代謝改善薬としては、例えば、パミドロン酸二ナトリウム五水和物（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）、ゾレドロン酸水和物（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）などが挙げられる。
　ＰＢＭＣｓの培養時に添加するビスホスホネートの濃度は、０．０５～１００μＭの範囲内が好ましく、０．１～３０μＭの範囲内がより好ましい。より具体的には、ビスホスホネートとしてパミドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物、アレンドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、１～３０μＭの範囲内が好ましい。また、ビスホスホネートとしてゾレドロン酸もしくはその塩またはこれらの水和物を添加する場合は、ビスホスホネートの濃度は、０．１～１０μＭの範囲内が好ましい。
　ＰＢＭＣｓの培養時に添加するＩＬ－２の濃度は、５０～２０００Ｕ／ｍＬの範囲内が好ましく、４００～１０００Ｕ／ｍＬの範囲内がより好ましい。
　ＰＢＭＣｓの培養条件は、γδＴ細胞を増殖および活性化させることができれば特に限定されない。通常は、３４～３８℃（好ましくは３７℃）かつ２～１０％（好ましくは５％）ＣＯ２存在下で、７～１４日程度培養すればよい。この際、培養する細胞数に応じて、培養液を適宜追加する。更に、培養液量の増加に合わせて、ＩＬ－２を５０～２０００Ｕ／ｍＬ、より好ましくは４００～１０００Ｕ／ｍＬとなるように適宜追加する。
　以上の手順により、γδＴ細胞を大量に含む細胞集団を得ることができる。得られた細
胞集団は、後述するようにγδＴ細胞療法において患者に投与する細胞として利用することができる。
　本発明のγδＴ細胞の製造方法では、第２のステップにおいてＨＴＬＶ－１感染細胞を除去することから、第１のステップにおいて準備するＰＢＭＣｓ中にＨＴＬＶ－１感染細胞が含まれていても特に問題とならない。したがって、本発明のγδＴ細胞の製造方法は、ＨＴＬＶ－１感染者に由来するＰＢＭＣｓに対して使用することができる。本発明のγδＴ細胞の製造方法を用いれば、ＨＴＬＶ－１感染者の末梢血由来のＰＢＭＣｓから培養後のウイルス量を減少させた上で、大量のγδＴ細胞を含む細胞集団を製造することができる。
　さらに上記第２のステップにおいてＨＴＬＶ－１感染細胞を除去後、γδＴ細胞だけでなくナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの細胞傷害活性を有する免疫細胞を、単独で又はγδＴ細胞などと共に刺激・増殖させることも可能である。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞特異的マーカー（ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８）及びＢ細胞特異的マーカー（Ｉｇ、ＣＤ１９、ＣＤ２０）を発現しておらず、ＩＬ－２の刺激によって増殖する。従って本願発明に係るマイクロビーズによる細胞除去の影響を受けずに、γδＴ細胞と同時に刺激・増殖することができる。従って、本願発明に係るγδＴ細胞はＮＫ細胞を含んでいてよい。ＮＫ細胞のみを単離する場合は、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を除去、あるいはαβＴ細胞除去した後、既知の方法で両者を分離精製することが可能である。例えば、γδＴ細胞特異的マーカーであるγδＴＣＲなどを利用して、磁気細胞分離法、フローサイトメトリーなどによりγδＴＣＲを発現する細胞を除去することでＮＫ細胞を単離することができる。
＜２．γδＴ細胞を含む医薬＞
　本発明の医薬は、上述の本発明の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含む、がん又は感染症等を治療・予防するための医薬である。
　本発明の医薬は、例えば、本発明の製造方法により製造されたγδＴ細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させた注射剤（細胞懸濁液）である。この注射剤は、静脈内や皮内、皮下などに注射されてもよいし、病変部に直接注入されてもよいし、点滴として全身投与されてもよい。
　本発明の医薬は、必須成分として本発明の製造方法により製造されたγδＴ細胞を含むが、任意成分としてその他の成分を含んでいてもよい。たとえば、本発明の医薬をがんの治療または予防剤として使用する場合は、ＩＬ－２やＩＬ－１２などのサイトカインを添加してもよい。また、本発明の医薬をウイルス感染症の治療または予防剤として使用する場合は、インターフェロンなどを添加してもよい。さらに、別のＮＫ細胞などの細胞傷害活性を有する細胞を含んでいてもよい。
　本発明の医薬に含まれるγδＴ細胞の数は、投与方法や疾患の種類、患者の症状などに応じて適宜設定されうる。通常は、１０８～１０１２個／人（好ましくは１０９個／人）となるように設定すればよい。
　本発明の医薬の製造方法は、特に限定されない。たとえば、本発明の医薬は、１）本発明のγδＴ細胞の製造方法により得られたγδＴ細胞を遠心分離などにより回収し；２）回収したγδT細胞を洗浄液（例えば、生理食塩水やＰＢＳなど）で洗浄し；３）洗浄したγδＴ細胞を遠心分離などにより回収し；４）回収したγδＴ細胞を医薬品として利用可能な液体（例えば、生理食塩水）に懸濁させることで製造されうる。
　前述の通り、本発明の製造方法は、ＨＴＬＶ－１感染者の末梢血由来のＰＢＭＣｓから、もともと含まれていたウイルス量よりもウイルス量を減少させ、かつ大量のγδＴ細胞を製造することができる。よって、本発明の製造方法によって製造されたγδＴ細胞を含む医薬は、ＨＴＬＶ－１感染者に投与しても、もともと感染者体内に存在していたＨＴＬＶ－１感染細胞の数を増加させるおそれは低い。したがって、本発明の医薬は、ＨＴＬＶ－１感染者に対してγδＴ細胞療法を実施するための医薬として利用されうる。
　また、後述する実施例に示されるように、γδＴ細胞は、ＨＴＬＶ－１感染細胞（ＡＴＬ患者の白血病細胞を含む）に対する細胞傷害活性を有する。このことは、本発明者らによって初めて見出されたことである。前述の通り、ＨＴＬＶ－１感染者の体内のＨＴＬＶ－１感染細胞の数を減少させることができれば、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療・予防することができると期待される。したがって、本発明の医薬は、ＨＡＭおよびＡＴＬを治療・予防するための医薬として利用されうる。
　以下、本発明について実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
＜１．従来の方法によるγδＴ細胞の培養＞
　はじめに、比較例として、従来の方法（ＰＢＭＣｓから特定の細胞を除去しないで培養する方法）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
　（１）γδＴ細胞の培養
　抗凝固剤としてヘパリンを使用して、ＨＴＬＶ－１感染者から新鮮血を採取した。得られた血液を遠心分離して、血球成分と血漿成分に分離した。血漿成分は、５６℃で６０分間非働化した後、－８０℃で一旦凍結させた。凍結した血漿を再度溶解させた後、遠心分離して上清を得た。得られた上清は、細胞培養時に自己血漿として用いた。一方、血球成分は、ＰＢＳ（－）で希釈した後、リンパ球分離溶液（ＬＳＭ；コスモ・バイオ株式会社）を用いてＰＢＭＣｓを分離した。分離したＰＢＭＣｓは、ＰＢＳ（－）で洗浄した。
　洗浄したＰＢＭＣｓをリンパ球培養用培地（ＡＬｙＳ２０３；株式会社細胞科学研究所）に懸濁して細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液を２×１０６ＰＢＭＣｓ／ウェルとなるように２４ウェルマイクロプレートに分注した。次いで、各ウェルに、ＩＬ－２（イムノテック社）、ゾレドロン酸水和物（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標）；ノバルティスファーマ株式会社）および自己血漿を添加した。各成分の終濃度は、ＩＬ－２：１０００Ｕ／ｍＬ、ゾレドロン酸水和物：５μＭ、自己血漿：１０％である。
　マイクロプレートをＣＯ２インキュベータ（温度：３７℃、ＣＯ２濃度：５％、湿度：過飽和）内に移し、ＰＢＭＣｓを１４日間培養した。培養期間中、細胞がコンフルエントになるたびに、ＩＬ－２を添加した培地を加えた。また、培地中の血漿濃度が１％を下回らないように、適宜自己血漿を加えた。
　（２）フローサイトメトリー
　培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）の細胞に含まれるγδＴ細胞の割合を、フローサイトメトリーを用いて測定した。今回の実験では、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＴＣＲＶγ９＋の細胞をγδＴ細胞と判定した。
　フローサイトメーターはＦＣ５００（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、解析ソフトはＣＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。また、抗ＣＤ４５抗体はＥＣＤ標識抗ヒトＣＤ４５抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＣＤ３抗体はＰＣ５標識抗ヒトＣＤ３抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用し、抗ＴＣＲ　Ｖγ９抗体はＦＩＴＣ標識抗ヒトＴＣＲ　Ｖγ９抗体（ベックマン・コールター株式会社）を使用した。
　（３）ＨＴＬＶ－１のプロウイルス量の測定
　培養前の細胞（ｄａｙ０）および培養後の細胞（ｄａｙ１４）中に含まれる、１００細胞あたりのＨＴＬＶ－１のプロウイルス量をリアルタイムＰＣＲ法により測定した。
　測定対象の細胞集団（ｄａｙ０またはｄａｙ１４の細胞）を溶解バッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ）に懸濁した。得られた細胞懸濁液にプロテイナーゼＫ（和光純薬工業株式会社）を終濃度が１５０μｇ／ｍＬとなるように添加し、５５℃で一晩振盪した後、フェノールクロロホルムを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ＨＴＬＶ－１のｐＸ領域およびヒトβ－アクチンに対するＴａｑＭａｎプローブ－プライマーセット（配列番号１～６）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行った。標準検体を用いて検量線を作成してＨＴＬＶ－１のｐＸ領域およびヒトβ－アクチンの量を算出し、これらの値から１００細胞あたりのＨＴＬＶ－１のプロウイルス量を算出した。
　図１は、培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）の細胞集団に含まれる、１００細胞あたりのＨＴＬＶ－１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝１３）。このグラフに示されるように、培養前（ｄａｙ０）の細胞集団に含まれる平均ウイルス量は１４．６０コピー／１００細胞であったのに対し、培養後（ｄａｙ１４）の細胞集団に含まれる平均ウイルス量は２５．３９コピー／１００細胞であった。
＜２．本発明の方法によるγδＴ細胞の培養＞
　次に、実施例として、本発明の方法（ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を除去する方法）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
　（１）γδＴ細胞の培養
　上記比較例と同様の手順で、ＨＴＬＶ－１感染者の新鮮血から自己血漿およびＰＢＭＣｓを得た。次いで、得られたＰＢＭＣｓから磁気細胞分離法によりＣＤ４＋細胞を除去した細胞集団、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を除去した細胞集団を調製した。具体的には、ＰＢＭＣｓを抗ＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）及び／又は抗ＣＤ８マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）と反応させた後、反応物をＭＡＣＳシステムの分離カラム（ミルテニーバイオテク社）に通して、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去、またはＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞の両方を除去した細胞集団を得た。
　ＣＤ４＋細胞を除去した細胞集団と、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を除去した細胞集団を上記比較例と同様の手順で１４日間培養した。被験者によってＰＢＭＣｓに含まれるγδＴ細胞数や割合が異なるため、培養前後のγδＴ細胞の増加率を比較した。結果を図２に示す。ＣＤ４＋細胞を除去する方法と、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を除去する方法とでγδＴ細胞の増加率に変わりがないことが確認された。
　（２）ＨＴＬＶ－１のプロウイルス量の測定
　ＣＤ４＋細胞を除去した細胞集団、ＣＤ４＋細胞およびＣＤ８＋細胞を除去した細胞集団の培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）について、上記比較例と同様の手順で、１００細胞あたりのＨＴＬＶ－１のプロウイルス量（感染率）を測定した。
　図３は、培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）の細胞集団について、１００細胞あたりのＨＴＬＶ－１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝１３）。ＣＤ４＋細胞のみを除去した場合、培養前に比較して、培養後のプロウイルス量を減らすことができた。しかし、一部のドナーでは、プロウイルス量が増加してしまう例もあり、プロウイルスの割合の平均値を算出すると、培養前（ｄａｙ０）のウイルスの割合の平均値は４．１８コピー／１００細胞であったのに対し、培養後（ｄａｙ１４）のプロウイルスの割合の平均値は５．６７コピー／１００細胞であった。
　図４は、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方を除去して培養を行った場合のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝１１）。培養試験を行ったすべてのドナーでウイルス量が減少していた。ウイルスの割合の平均値を算出すると、培養前（ｄａｙ０）のウイルスの割合の平均値は１．５１コピー／１００細胞であったのに対し、培養後（ｄａｙ１４）のウイルスの割合の平均値は０．３２コピー／１００細胞であった。培養前と比較して、培養後のウイルスの割合を減らすことができた。
　これまでのデータをまとめて図５に示す。ＣＤ４＋細胞を除去する方法であっても、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方を除去する方法であっても、培養後の細胞集団に含まれるプロウイルスの割合が減少することが確認された。
　これまでの結果をもとに、採血時に含まれていたプロウイルス量を１としたときの、培養後（ｄａｙ１４）の細胞集団に含まれるウイルスの増加率を算出した。
　結果を図６に示す。ウイルスの増加率は、従来のγδＴ細胞の培養方法では７１．４倍、ＣＤ４＋細胞のみを除去する方法では３．１倍、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を除去する方法では０．１倍であった。ＣＤ４＋細胞のみを除去する方法では、ウイルスの割合は減少しているが、ウイルスの量で比較すると採血時よりも増加していることが明らかとなった。一方で、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を除去する方法には、ウイルスの割合だけでなく、ウイルスの量についても採血時よりも減少していることが明らかとなった。
　図７は、図６のデータから、ＣＤ４＋細胞のみを除去する方法と、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を除去する方法を抽出して示した図である。目標とするウイルス増加率を１以下とすると、ＣＤ４＋細胞のみを除去する方法では目標を達成した例が１３例中４例であったのに対し、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を除去する方法では１１例すべてが目標値を達成した。
　次に、実施例として、本発明の方法（ＰＢＭＣｓからαβＴ細胞を除去する方法）によりγδＴ細胞を培養した例を示す。
　（１）γδＴ細胞の培養
　上記比較例と同様の手順で、ＨＴＬＶ－１感染者の新鮮血から自己血漿およびＰＢＭＣｓを得た。次いで、得られたＰＢＭＣｓから磁気細胞分離法によりＣＤ４＋細胞を除去した細胞集団、αβＴ細胞を除去した細胞集団を調製した。具体的には、ＰＢＭＣｓを抗ＣＤ４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）又はＰＥ標識抗αβＴ抗体（ミルテニーバイオテク社）および抗ＰＥマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）と反応させた後、反応物をＭＡＣＳシステムの分離カラム（ミルテニーバイオテク社）に通して、ＰＢＭＣｓからＣＤ４＋細胞を除去、またはαβＴ細胞を除去した細胞集団を得た。
　（２）ＨＴＬＶ－１のプロウイルス量の測定
　ＣＤ４＋細胞を除去した細胞集団、αβＴ細胞を除去した細胞集団の培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）について、上記比較例と同様の手順で、１００細胞あたりのＨＴＬＶ－１のプロウイルス量を測定した。
　図８は、培養前（ｄａｙ０）および培養後（ｄａｙ１４）の細胞集団について、１００細胞あたりのＨＴＬＶ－１のプロウイルス量を示すグラフである（ｎ＝３）。ＣＤ４＋細胞を除去する方法であっても、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方を除去する方法であっても、従来法に比較して、培養後の細胞集団に含まれるウイルスの割合が減少することが確認された。
　上記の結果をもとに、採血時に含まれていた細胞当りのウイルス量を１としたときの、培養後（ｄａｙ１４）の細胞集団に含まれるウイルスの増加率を算出した。
　結果を図９に示す。目標とするウイルス増加率を１以下とすると、従来のγδＴ細胞の培養方法では、２例が目標値を達成できなかった。ＣＤ４＋細胞のみを除去する方法、αβＴ細胞を除去する方法は３例とも目標値を達成したが、αβＴ細胞を除去する方法では、ウイルスを検出限界以下にまで減らすことが確認された。
　この結果から、ＨＴＬＶ－１感染者由来のＰＢＭＣｓを細胞源とする場合であっても、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ４＋細胞とＣＤ８＋細胞の両方、αβＴ細胞を除去した後に培養すると、ＨＴＬＶ－１感染細胞の増殖を抑制できることが明らかとなった。特に、本発明の方法（ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞を除去する方法又はαβＴ細胞を除去する方法）は、ＨＴＬＶ－１感染者の末梢血由来のＰＢＭＣｓから、もともと含まれていたウイルス量よりもウイルス量を減少させ、γδＴ細胞の増殖能に影響を与えず、大量のγδＴ細胞が得られる培養方法として、ＣＤ４＋細胞を除去する方法よりも安定した方法であることが示された。本発明の製造方法によって製造されたγδＴ細胞を含む医薬は、ＨＴＬＶ－１感染者に投与しても、もともと感染者体内に存在していたＨＴＬＶ－１感染細胞の数を増加させるおそれは低いため、ＨＴＬＶ－１感染者に対するγδＴ細胞療法に用いることができる。
（３）γδＴ細胞の傷害活性
　本発明の培養方法によって得られたγδＴ細胞の細胞傷害活性を確認した。
　ＡＴＬ患者又はＨＡＭ患者から血液を採取し、末梢血単核球を分離し、本発明の方法によりγδＴ細胞を取得した。
　得られたγδＴ細胞（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ）をＡＴＬ患者由来細胞株（ＫＫ１、ＫＯＢ：Ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ）とＥ／Ｔ（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｃｅｌｌ／Ｔａｒｇｅｔ　ｃｅｌｌ）比１、５又は２５となるように混合し、２時間共培養した。２時間後、テラスキャン（ミネルヴァテック）を用いて、細胞傷害活性を測定した。
　結果を図１０及び１１に示す。図１０に、ＡＴＬ患者由来のＰＢＭＣｓから培養したγδＴ細胞の細胞傷害活性を示した。ＡＴＬ患者由来のγδＴ細胞は、ＫＫ１、ＫＯＢに対して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
　図１１に、ＨＡＭ患者由来のＰＢＭＣｓから培養したγδＴ細胞の細胞傷害活性を示した。ＨＡＭ患者由来のγδＴ細胞は、ＫＫ１、ＫＯＢに対して、細胞傷害活性を示すことが明らかとなった。
　本発明の方法で得られるγδＴ細胞が抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を有するかを確認するため、以下の実験を行った。
　ＨＡＭ患者から血液を採取し、末梢血単核球を分離し、本発明の方法によりγδＴ細胞を取得した。
　得られたγδＴ細胞を、悪性リンパ種由来のＤａｕｄｉ細胞株（ＣＤ２０陽性ヒトリンパ腫細胞株）とＥ／Ｔ比１、５又は２５となるように混合し、リツキシマブ（抗ヒトＣＤ２０ヒト・マウスキメラ抗体）（リツキサン（登録商標）、中外製薬）を添加して２時間共培養した。２時間後、テラスキャン（ミネルヴァテック）を用いて、細胞傷害活性を測定した。
　結果を図１２に示す。ＨＡＭ患者由来のＰＢＭＣｓから培養したγδＴ細胞は、リツキシマブを添加しない場合と比較して、リツキシマブを添加した場合に、Ｄａｕｄｉ細胞株に対して、高い細胞傷害活性を示した。図１３に示すように、当該γδＴ細胞にＣＤ１６が発現していることも確認された。これらの結果から、通常のγδＴ細胞と同様に、本発明によって得られたγδＴ細胞もＡＤＣＣを有することが明らかとなった。
　本実施例により、本発明の培養方法により得られたγδＴ細胞は患者体内に投与された際に、患者体内に存在するＨＴＬＶ－１感染細胞やがん細胞を傷害することが期待される。
　本発明の製造方法は、例えば、ＨＴＬＶ－１の感染者に対してγδＴ細胞療法を実施する際のγδＴ細胞の製造方法として有用である。また、本発明の医薬は、例えばＨＴＬＶ－１感染者、ＨＡＭ患者およびＡＴＬ患者に対して、がん、感染症又はＨＴＬＶ－１関連疾患の治療を目的としたγδＴ細胞を含む医薬として有用である。さらに抗体依存性細胞傷害活性を利用して、既存の抗体医薬と併用して用いることも可能である。例えば、ＨＴＬＶ－１感染者が、ＣＤ２０陽性Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫に罹患している場合にはリツキシマブと、Ｈｅｒ２陽性がんに罹患している場合にはトラスツズマブと、転移性大腸がんに罹患している場合にはセツキシマブと、等と組み合わせることにより治療効果の向上が見込まれる。さらに、ＣＣＲ４陽性ＡＴＬ患者に対してはモガムリズマブと組み合わせることにより治療効果の向上が見込まれる。

Claims (9)

  1. 　末梢血単核球を準備するステップと、
    　前記末梢血単核球から、１）ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかの表面マーカーを発現している細胞、又は２）αβＴＣＲの表面マーカーを発現している細胞、のいずれか１つを除去するステップと、
    　前記表面マーカーを発現している細胞を除去した細胞集団をビスホスホネートおよびインターロイキン－２の存在下で培養するステップと、
    　を含む、γδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法。
  2. 　前記表面マーカーは、ＣＤ４およびＣＤ８である、請求項１に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法。
  3. 　前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ－１の感染者の末梢血から得られたものである、請求項１に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法。
  4. 　前記細胞懸濁液中における前記ビスホスホネートの濃度は、０．０５～１００μＭの範囲内であり、
    　前記細胞懸濁液中における前記インターロイキン－２の濃度は、５０～２０００Ｕ／ｍＬの範囲内である、
    　請求項１に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法。
  5. 　前記ビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、もしくはこれらの塩、またはこれらの水和物である、請求項１に記載のγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の製造方法。
  6. 　末梢血単核球を準備するステップと、
    　前記末梢血単核球から、１）ＣＤ４またはＣＤ８のいずれかの表面マーカーを発現している細胞、又は２）αβＴＣＲの表面マーカーを発現している細胞、のいずれか１つを除去するステップと、
    　前記表面マーカーを発現している細胞を除去した末梢血単核球をビスホスホネートおよびインターロイキン－２の存在下で培養するステップと、
    　を含むγδＴ細胞の製造方法により製造されたγδＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含有する、
    　がんまたは感染症を治療または予防するための医薬。
  7. 　前記表面マーカーは、ＣＤ４およびＣＤ８である、請求項６に記載の医薬。
  8. 　前記末梢血単核球は、ＨＴＬＶ－１の感染者の末梢血から得られたものである、請求項６に記載の医薬。
  9. 　ＨＴＬＶ－１関連脊髄症または成人Ｔ細胞白血病を治療または予防するための医薬である、請求項８に記載の医薬。
     
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