WO2016085208A1 - Sfrp5 유래의 펩타이드 단편 및 이를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 - Google Patents

Sfrp5 유래의 펩타이드 단편 및 이를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to peptide fragments derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5) and a cosmetic composition for inhibiting skin whitening and / or skin pigmentation using the same as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a reagent for research or analysis for inhibiting Wnt signaling comprising the peptide fragment.
  • Melanin is a dark brown pigment present in the eyes, skin, and hair, and absorbs a certain amount of ultraviolet light from the body to block the penetration of ultraviolet rays to protect the body or to maintain the body temperature.
  • the skin color may turn brown due to excessive secretion of melanin to prevent skin penetration when exposed to excessive ultraviolet rays.
  • the production of melanin is known to be made by a combination of hormones and melanogenesis enzymes, including tyrosinase.
  • Malignant melanoma is a tumor produced by malignant alteration of melanocytes that produce melanin pigment. It is known that tumors that can occur when melanocytes are present in any part of the body, or are most frequent in the skin, and have high malignancy among the tumors that can occur on the skin. Although the incidence is less common in the East than in the West, the incidence of melanoma is increasing every year. The frequency is increasing from the twenties, and rapidly increases in the over forties. Genetic factors and UV exposure are considered to be important causes of malignant melanoma.
  • Wnt is a cell signaling molecule secreted by various cells of the human body, and is mainly involved in three types of pathways (Canonical Wnt pathway, Non-canonical planar cell polarity pathway, and Non-canonical Wnt / Calcium pathway). Known as a signaling material. Under normal cell conditions, Wnt is not involved in signaling because it is associated with Wnt antagonists such as Wnt inhibitory factor (WIF), but it binds to the receptor Frizzled in specific situations where Wnt antagonists such as WIF are not expressed. Generate signaling.
  • WIF Wnt inhibitory factor
  • Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), known as Wnt antagonist like WIF, is a secreted protein that contains homology with the Wnt-binding site of Frizzled and regulates the binding between Wnt and Frizzled protein.
  • Wnt binds to Frizzled, a receptor in melanocytes, it activates ⁇ -catenin, enhancing the expression of MITF that regulates melanin biosynthesis. Therefore, controlling the Wnt signaling pathway may inhibit the expression of MITF and reduce pigmentation.
  • the present inventors designed peptide fragments derived from Sfrp5 and evaluated their activity as peptide fragments that bind Wnt to inhibit the binding between Wnt and Frizzled. Surprisingly, it was found that certain peptide fragments derived from Sfrp5 have the activity of inhibiting melanogenesis and skin pigmentation in skin cells by inhibiting the Wnt signaling pathway.
  • an object of the present invention is to provide a specific peptide fragment derived from the Sfrp5.
  • an object of the present invention is to provide a cosmetic composition for inhibiting skin whitening and / or skin pigmentation comprising a specific peptide fragment derived from the Sfrp5 as an active ingredient.
  • a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), a peptide fragment selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 is provided.
  • a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), comprising as an active ingredient a peptide fragment selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-9
  • a cosmetic composition is provided.
  • the cosmetic composition according to the present invention is a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), comprising a peptide fragment selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 9 as an active ingredient It may be a cosmetic composition for inhibiting skin pigmentation.
  • the skin pigmentation may be pigmentation induced by ultraviolet stimulation.
  • a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), comprising: a peptide fragment selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 for Wnt signaling inhibition Reagents for research or analysis are provided.
  • a specific peptide fragment derived from Sfrp5 that is, a peptide consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 inhibits melanin production of melanocytes, thereby inhibiting skin whitening and / or skin pigmentation. It was found that Therefore, the peptide fragment may be usefully applied to a cosmetic composition for skin whitening, particularly a cosmetic composition for inhibiting skin pigmentation. In addition, the peptide fragment may be usefully used as a reagent for research and analysis in the biological and / or medical field as a Wnt signaling inhibitor.
  • 1a to 1c show the results of evaluating the effect of the peptides according to the invention on binding between MITF or CREB and ⁇ -catenin in mouse melanoma cell lines.
  • Figure 2 shows the results of evaluating the inhibitory activity of the peptide fragment according to the present invention for the expression and activation of substances associated with the Wnt signaling pathway in human melanocytes.
  • Figure 3 shows the results of evaluating the inhibitory activity of the peptide fragment according to the present invention on melanin formation in mouse melanoma cell line.
  • Figure 5 shows the results of evaluating the effect of the peptide fragment according to the invention on the expression of melanin synthase in human melanocytes.
  • Figure 6 shows the results of evaluating the effect of the peptide fragment according to the invention on the gene expression of melanin synthase in mouse melanoma cell line.
  • the present invention provides a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), which is selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-9.
  • the present invention is a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), comprising a peptide fragment selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 9 as an active ingredient, a cosmetic composition for skin whitening to provide.
  • the peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), that is, the peptide consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 9 has an activity of inhibiting skin pigmentation of the epidermis by inhibiting melanogenesis of melanocytes. Turned out. Therefore, the peptide fragment may be usefully applied to a cosmetic composition for skin whitening, particularly a cosmetic composition for inhibiting skin pigmentation.
  • the cosmetic composition according to the present invention is a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), comprising a peptide fragment selected from the group consisting of peptides consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 9 as an active ingredient It may be a cosmetic composition for inhibiting skin pigmentation.
  • skin pigmentation refers to excessive pigment accumulation of keratinocytes of the epidermis caused by intrinsic and external factors, and preferably includes pigmentation induced by ultraviolet stimulation.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in various forms according to a conventional cosmetic preparation method.
  • the cosmetic composition may be prepared in the form of a cosmetic product containing the peptide fragment, lotion, cream, lotion, and the like, which may be diluted with conventional cleansing liquids, astringent liquids, and moisturizing liquids.
  • the cosmetic composition may include conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and flavorings commonly used in the field of cosmetic compositions.
  • the content of the peptide fragment may be contained in an amount effective to achieve skin whitening or skin pigmentation inhibiting effect, for example, in an amount of 0.001 to 10% by weight based on the total weight of the composition, preferably May be contained in an amount of about 0.01 to 1 wt%.
  • the present invention is also a peptide fragment derived from Sfrp5 (Secreted frizzled protein 5), a reagent for research or analysis for inhibiting Wnt signaling comprising a peptide fragment selected from the group consisting of peptides consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1-9
  • the reagent according to the present invention can be usefully used as a reagent for research and analysis in various research fields, for example, biology and / or medicine.
  • the reagent for research and analysis may be in the form of the peptide fragment as it is or dissolved / dispersed in a suitable carrier (eg, phosphate buffered saline (PBS)).
  • PBS phosphate buffered saline
  • Peptide fragments of SEQ ID NO: 1 to 9 were synthesized by the FMOC solid-phase method using an automated synthesizer (PeptrEx-R48, Peptron, Daejeon, Korea).
  • the synthesized peptide fragment was purified and analyzed by reverse-phase HPLC (Reverse-phase HPLC) using a C18 analytical RP column (Shiseido capcell pak) (Prominence LC-20AB, Shimadzu, Japan) and mass spectrometer (HP 1100). Series LC / MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA).
  • Peptide fragments of SEQ ID NO: 1 to 9 were dissolved in phosphate buffered saline (PBS), respectively, to prepare a concentration of 1 M.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Test Example 1 Mouse Melanoma Cell Line At B16F1 CREB or With MITF ⁇ - Catenin Evaluation of the Effect of Peptide Fragments of the Invention on Binding
  • the test was performed by purchasing a DUOLINK II in situ kit from Olink Bioscience, Sweden.
  • mice melanoma cell lines B16F1 cells (Korea Cell Line Bank, Seoul) were dispensed in 1 ml of DMEM medium in each well of a 12 well glass plated 24-well plate, and then placed in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. It was stabilized by time incubation. After treatment with ⁇ -MSH (Sigma Co, MO, USA), a hormone that promotes melanin production, and peptide fragments (0.1 ⁇ M and 1 ⁇ M) of the present invention, the cells were incubated for 24 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator. 4% paraformaldehyde was then fixed.
  • ⁇ -MSH Sigma Co, MO, USA
  • a drop of blocking solution was dropped onto the cells on 12 mm glass and incubated at 37 ° C. for 30 minutes.
  • Anti-CREB polyclonal antibodies (Santa Cruz Co., CA, USA) and anti- ⁇ - to measure the degree of interaction between cyclic AMP response element-binding (CREB) and ⁇ -catenin, which are increased by activation of the Wnt receptor Catenin Mouse monoclonal antibodies (Santa Cruz Co., CA, USA) were treated with cells at 37 ° C. After 30 minutes, treated with PLA probe solution and incubated at 37 °C for 1 hour, then treated with ligation solution, incubated for 30 minutes, then treated with amplification solution and incubated for 100 minutes.
  • FIGS. 1A and 1B After the cells treated as described above were washed with washing buffer, the number of red dots was measured using confocal microscopy, and the results are shown in FIGS. 1A and 1B.
  • ⁇ -MSH represents a group treated with only ⁇ -MSH without peptide treatment.
  • the binding of CREB and ⁇ -catenin was significantly reduced by the peptides of SEQ ID NOS: 1-8. Therefore, the peptide fragment according to the present invention effectively inhibits the Wnt signaling pathway by inhibiting the activation of ⁇ -catenin in melanocytes.
  • the peptide fragment according to the present invention effectively inhibits the formation of melanin by inhibiting the binding of MITF and ⁇ -catenin in melanocytes.
  • ⁇ -MSH (Sigma Co, MO, USA), a hormone that promotes melanin production, was treated with concentrations of peptide fragments (peptide of SEQ ID NO: 8) of the present invention, and cultured for 48 hours, and then proteins were extracted.
  • the obtained extract was subjected to anti- ⁇ -catenin antibody (Santa Cruz Co., CA, USA) and anti-pGSK-3 ⁇ -catenin by Western blotting analysis using antibody (Cell Signaling Technology, MA, USA)
  • the change in expression level and phosphorylation of GSK-3 was measured, and the results are shown in FIG. 2.
  • peptide fragment of the present invention inhibits the activity of tyrosinase.
  • 5 ⁇ 10 4 B16F10 cells (Korea Cell Line Bank, Seoul) were dispensed into 1 ml of DMEM medium in each well of a 24-well plate, and then stabilized by incubating for 24 hours in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
  • ⁇ -MSH Sigma Co, MO, USA
  • a hormone that promotes melanin production was treated with concentrations with the peptide of SEQ ID NO: 8, and cultured for 72 hours, and then the protein was extracted.
  • melanin activity was increased in the control group treated with ⁇ -MSH, while melanin activity was decreased in a concentration-dependent manner in the test group treated with ⁇ -MSH and the peptide of SEQ ID NO. .
  • the peptide fragment according to the present invention has a function of inhibiting the activity of tyrosinase.
  • the effect of the peptide fragment of the present invention on the protein expression of melanin synthase in human epidermal melanocytes was evaluated using Western blotting.
  • 1.5 ⁇ 10 5 human epidermal melanocytes (Cascade Biologics, # C-0245C; Portland, OR, USA) were dispensed in 2 ml of DMEM medium followed by 37 ° C., 5% CO 2. It was stabilized by incubation for 24 hours in an incubator.
  • ⁇ -MSH (Sigma Co, MO, USA), a hormone that promotes melanin production, was treated with concentrations of peptide fragments (peptide of SEQ ID NO: 8) of the present invention, and the proteins were extracted after 24 hours of incubation.
  • Anti-MITF (ABcam, Ma, USA) antibody, anti-tyrosinase antibody (Santa Cruz Co., CA, USA), anti-TRP-1 antibody (Santa Cruz Co., CA, USA)
  • Western blotting analysis using anti-TRP-2 antibody was performed to measure the changes of MITF, tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 expression levels. The results are shown in FIG.
  • the expression of MITF, tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 was reduced in a concentration-dependent manner by the peptide of SEQ ID NO: 8. Therefore, the peptide fragment according to the present invention can be confirmed to inhibit the synthesis of MITF, tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 in human epidermal melanocytes.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • ROTOR Q GENE ROTOR Q GENE instrument
  • Primers for the polymerase reaction is shown in Table 2.
  • the polymerase reaction solution was prepared by mixing 10 ⁇ l TOPreal qRT-PCR2X premix (Engineics, Daejeon, Korea), 2 ⁇ l primer (10 pmol) and 7 ⁇ l DW in 1 ⁇ l cDNA.
  • the polymerase reaction was first performed at 94 ° C. for 10 minutes, and the second time was repeated 40 times under conditions of 10 seconds at 94 ° C., 30 seconds at 58 ° C., and 1 minute at 72 ° C.
  • RT-PCR was performed as described above, and the results of measuring the expression of MITF, tyrosinase, TRP-1 and TRP-2 genes are shown in FIG. 6.

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Abstract

본 발명은 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편, 즉 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편 및 이를 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 및/또는 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 펩타이드 단편은 멜라닌세포에서 멜라닌의 생성을 억제함으로써 피부색소의 침착을 억제하는 활성을 갖는다. 또한, 본 발명은 상기 펩타이드 단편을 포함하는 Wnt 신호전달 억제를 위한 연구 또는 분석용 시약을 제공한다.

Description

SFRP5 유래의 펩타이드 단편 및 이를 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물
본 발명은 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)로부터 유래된 펩타이드 단편(peptide fragments) 및 이를 유효성분으로 하는 피부 미백용 및/또는 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 펩타이드 단편을 포함하는 Wnt 신호전달 억제를 위한 연구 또는 분석용 시약에 관한 것이다.
멜라닌(melanin)은 흑갈색 색소로서 눈이나 피부, 체모에 존재하며 신체에서 일정량 이상의 자외선을 흡수하는 방식으로 자외선의 침투를 차단해 신체를 보호해 주거나, 체온을 유지해 주는 긍정적인 역할을 수행한다. 그러나 자외선에 과다하게 노출될 경우 피부 침투를 방지하기 위한 멜라닌의 과다분비로 인하여 피부색이 갈색으로 변하기도 한다. 멜라닌의 생성은 타이로시네이즈(tyrosinase)를 비롯한 멜라닌 생성 효소와 호르몬이 복합 작용하여 이루어지는 것으로 알려져 있다.
악성흑색종(melanoma)은 멜라닌 색소를 만들어 내는 멜라닌세포(melanocyte)가 악성 전환(malignant alteration)됨으로써 만들어진 종양이다. 신체 어느 부위든 상관없이 멜라닌세포가 존재하면 발생할 수 있는 종양이나, 피부에서 그 발생빈도가 가장 높으며 피부에 발생할 수 있는 종양 중에서 악성도(malignancy)가 높은 것으로 알려져 있다. 동양권에서는 서양에 비해 그 발생 빈도가 낮기는 하나 해마다 흑색종의 발생 빈도는 높아지고 있으며, 20대부터 그 빈도가 증가하여 40대 이상에는 급격히 증가하는 양상을 보인다. 악성흑색종의 발생원인으로는 유전적 요인과 자외선 노출이 중요한 원인으로 생각되고 있다.
한편, Wnt는 인체의 여러 세포에서 분비하는 신호전달물질(cell signaling molecule)로서, 크게 세 종류의 경로(Canonical Wnt pathway, Non-canonical planar cell polarity pathway, Non-canonical Wnt/Calcium pathway)에 관여하는 신호전달물질로 알려져 있다. 정상적인 세포의 상태에서 Wnt는 WIF(Wnt inhibitory factor)와 같은 Wnt 길항인자와 결합되어 있기 때문에 신호전달에 관여하지 못하지만, WIF와 같은 Wnt 길항인자가 발현되지 못하는 특이적인 상황에서 수용체인 Frizzled와 결합하여 신호전달을 발생시킨다. WIF와 같이 Wnt 길항인자로 알려진 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)는 분비형 단백질로서, Frizzled의 Wnt-결합부위와 상동성(homology)을 가진 부위를 포함하고 있어 Wnt와 Frizzled 단백질간의 결합을 조절한다. Wnt가 멜라닌세포에서 수용체인 Frizzled와 결합하면 β-카테닌(β-catenin)을 활성화하여, 멜라닌 생합성을 조절하는 MITF의 발현을 증진시킨다. 따라서, Wnt 신호전달경로를 제어하면 MITF의 발현을 억제하여 색소침착을 감소시킬 수 있다.
본 발명자들은 Wnt와 결합하여 Wnt와 Frizzled간의 결합을 억제하는 펩타이드 단편으로서, Sfrp5로부터 유래된 다양한 펩타이드 단편(peptide fragments)을 설계하여 그 활성을 평가하였다. 놀랍게도 Sfrp5로부터 유래된 특정 펩타이드 단편이 Wnt 신호전달경로를 억제함으로써, 피부세포에서 멜라닌 생성과 피부색소의 침착을 억제하는 활성을 갖는다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 상기 Sfrp5로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 Sfrp5로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 및/또는 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 Sfrp5로부터 유래된 특정 펩타이드 단편을 포함하는 Wnt 신호전달 억제를 위한 연구 또는 분석용 시약을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따라, Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물일 수 있다. 상기 피부 색소 침착이 자외선 자극에 의해 유도된 색소 침착일 수 있다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 포함하는 Wnt 신호전달 억제를 위한 연구 또는 분석용 시약이 제공된다.
본 발명에 따라 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)로부터 유래된 특정 펩타이드 단편, 즉 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 멜라닌세포의 멜라닌 생성을 억제함으로써, 피부 미백 및/또는 피부 색소 침착 억제 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 상기 펩타이드 단편은 피부 미백용 화장료 조성물, 특히 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드 단편은 Wnt 신호전달 억제제로서 생물학 및/또는 의학 분야에서 연구·분석용 시약으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 생쥐 흑색종 세포주에서 MITF 또는 CREB와 β-카테닌간의 결합에 대한, 본 발명에 따른 펩타이드의 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 2는 사람 멜라닌세포에서 Wnt 신호전달 경로와 관련된 물질의 발현 및 활성화에 대한, 본 발명에 따른 펩타이드 단편의 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 3는 생쥐 흑색종 세포주에서 멜라닌 형성에 대한, 본 발명에 따른 펩타이드 단편의 억제 활성을 평가한 결과를 나타낸다.
도 4는 생쥐 흑색종 세포주에서 타이로시네이즈 활성에 대한, 본 발명에 따른 펩타이드 단편의 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 5는 사람 멜라닌세포에서 멜라닌 합성효소들의 발현에 대한, 본 발명에 따른 펩타이드 단편의 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
도 6은 생쥐 흑색종 세포주에서 멜라닌 합성효소들의 유전자 발현에 대한, 본 발명에 따른 펩타이드 단편의 영향을 평가한 결과를 나타낸다.
본 발명은 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 제공한다. 또한, 본 발명은 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편, 즉 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드가 멜라닌세포의 멜라닌생성을 억제함으로써 표피의 피부색소 침착을 억제하는 활성을 갖는다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 상기 펩타이드 단편은 피부 미백용 화장료 조성물, 특히 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물일 수 있다. 상기 "피부 색소 침착"이라 함은 내재적 및 외부요인에 의해 발생하는 표피의 각질세포의 과다한 색소축적을 말하며, 바람직하게는 자외선 자극에 의해 유도된 색소 침착을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 펩타이드 단편을 함유하는 향장 제품, 화장수, 크림, 로오숀 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석하여 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 펩타이드 단편의 함량은 피부 미백 또는 피부 색소 침착 억제 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면 조성물 총 중량에 대하여 0.001 ∼ 10 중량%의 함량으로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01 ∼ 1 중량%의 함량으로 함유될 수 있다.
본 발명은 또한 Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 포함하는 Wnt 신호전달 억제를 위한 연구 또는 분석용 시약을 제공한다. 본 발명에 따른 시약은 다양한 연구분야, 예를 들어 생물학 및/또는 의학 분야에서 연구·분석용 시약으로서 유용하게 사용될 수 있다. 상기 연구·분석용 시약은 상기 펩타이드 단편을 그대로 포함하거나 혹은 적절한 담체[예를 들어, 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)]에 용해/분산시킨 형태일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 시험예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 시험예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명이 이들 실시예 및 시험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드 단편의 합성
서열번호 1 내지 9의 펩타이드 단편은 자동화합성기(PeptrEx-R48, 펩트론사, 대전, 대한민국)를 이용하여 FMOC 고체-상 방법(FMOC solid-phase method)으로 합성하였다. 합성된 펩타이드 단편은 C18 분석용 RP 컬럼(Shiseido capcell pak)을 사용한 역상 고속액체크로마토그래피(reverse-phase HPLC) (Prominence LC-20AB, Shimadzu사, 일본)로 정제 및 분석하였으며, 질량분석기(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard사, Roseville, 미국)를 이용하여 동정하였다.
펩타이드 명칭 서열번호 아미노산 서열
SE215A 서열번호 1 Lys-Ile-Gly-Ala-Gln-Lys
SE215B 서열번호 2 Lys-Ile-Gly-Ala
SE215C 서열번호 3 Ile-Gly-Ala-Gln
SE215D 서열번호 4 Gly-Ala-Gln-Lys
SE215E 서열번호 5 Lys-Ile-Gly
SE215F 서열번호 6 Ile-Gly-Ala
SE215G 서열번호 7 Gly-Ala-Gln
SE215H 서열번호 8 Ala-Gln-Lys
SE215I 서열번호 9 Cys-Glu-Ala-Val
실시예 2. 펩타이드 단편을 포함하는 조성물의 제조
서열번호 1 내지 9의 펩타이드 단편을 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 각각 용해시켜, 1 M의 농도가 되도록 제조하였다. 얻어진 단백질 용액을 하기 시험예에서 사용하였다.
시험예 1. 생쥐 흑색종 세포주 B16F1에서의 CREB 또는 MITF와 β- 카테닌의 결합에 본 발명의 펩타이드 단편이 미치는 영향 평가
Wnt 신호전달 경로에서 핵심적인 역할을 하는 β-카테닌(β-catenin)의 활성화에 대한 본 발명의 펩타이드 단편의 영향을 in situ proximity ligation assay 을 이용하여 평가하였다. 상기 시험은 스웨덴 오링크 바이오사이언스(Olink Bioscience, Sweden)로부터 DUOLINK II in situ kit를 구입하여 수행하였다.
12mm glass가 깔린 24 웰 플레이트의 각 웰에 5×104 개의 생쥐 흑색종 세포주 B16F1 세포(한국세포주은행, 서울)를 1 ml의 DMEM 배지에 분주한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하여 안정화시켰다. 멜라닌 생성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma Co, MO, USA)와 본 발명의 펩타이드 단편(0.1 μM과 1 μM)을 함께 처리한 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양한 다음 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 한 방울의 blocking solution을 12mm glass상의 세포에 떨어뜨리고, 37℃에서 30분간 인큐베이션하였다. Wnt 수용체의 활성화에 의해 증가하는 CREB(cyclic AMP response element-binding)와 β-카테닌 간의 상호작용 정도를 측정하기 위해 항-CREB 다클론항체(Santa Cruz Co., CA, USA)와 항-β-카테닌 생쥐단일클론항체(Santa Cruz Co., CA, USA)를 37℃에서 세포에 처리하였다. 30분 후, PLA probe solution으로 처리하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션 한 후, ligation solution으로 처리하고 30분간 인큐베이션한 다음, amplification solution으로 처리하고 100분간 인큐베이션 하였다. 상기와 같이 처리된 세포를 washing buffer로 세척한 후, 공초점 현미경(confocal microscopy)를 이용하여 붉은 점의 수를 측정하였으며, 그 결과는 도 1a 및 도 1b와 같다. 도 1a 및 도 1b에서 대조군(control)은 아무 처리를 하지 않은 군을 나타내고, α-MSH은 펩타이드 처리없이 α-MSH만을 처리한 군을 나타낸다.
도 1a와 도 1b로부터 확인할 수 있는 바와 같이, CREB와 β-카테닌의 결합은 서열번호 1 내지 8의 펩타이드에 의하여 현저하게 감소하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드 단편은 멜라닌세포에서 β-카테닌의 활성화를 억제함으로써 Wnt 신호전달경로를 효과적으로 억제한다.
또한, 상기와 유사한 방법으로 MITF와 β-카테닌의 결합에 대한 서열번호 5, 8 및 9의 펩타이드의 억제효과를 조사한 결과, 이들 펩타이드의 처리에 의하여 MITF와 β-카테닌의 결합이 현저하게 감소하였다(도 1c 참조). 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드 단편은 멜라닌세포에서 MITF와 β-카테닌의 결합을 억제함으로써 멜라닌의 형성을 효과적으로 억제한다.
시험예 2. 사람 표피멜라닌세포에서의 β- 카테닌의 발현과 GSK -3의 인산화에 본 발명의 펩타이드 단편이 미치는 영향 평가
Wnt 신호전달경로의 활성화에서 주요한 역할을 하는 β-카테닌의 발현과 GSK-3의 인산화에 대한 본 발명의 펩타이드 단편의 영향을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 평가하였다. 6-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 1.5×105 개의 사람 표피멜라닌세포(Cascade Biologics, #C-0245C; Portland, OR, USA)를 2 ml의 DMEM 배지에 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하여 안정화시켰다. 멜라닌 생성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma Co, MO, USA)를 본 발명의 펩타이드 단편(서열번호 8의 펩타이드)과 함께 농도별로 처리하고, 48시간 배양한 후 단백질을 추출하였다. 얻어진 추출물을 대상으로 항-β-카테닌 항체(Santa Cruz Co., CA, USA)와 항-pGSK-3 항체(Cell SignalingTechnology, MA, USA)를 이용한 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 β-카테닌 발현량과 GSK-3의 인산화의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 2와 같다. 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, β-카테닌 발현량과 GSK-3의 인산화는 서열번호 8의 펩타이드에 의하여 농도의존적으로 감소하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드 단편은 멜라닌세포에서 Wnt 신호전달경로를 억제함을 확인할 수 있다.
시험예 3. 생쥐 흑색종세포주 B16F10에서 멜라닌 형성 억제 시험
6-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 1.5 x 105 개의 B16F10 세포(한국세포주은행, 서울)를 2 ml의 DMEM 배지에 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양한 후, 100 nM α-MSH(Sigma Co, MO, USA)와 최종농도가 0.1, 1, 및 10 μM이 되도록 서열번호 8의 펩타이드 용액을 첨가하였다. 양성 대조군으로는 100 nM α-MSH과 알부틴(0.01%)을 각각 첨가한 군을 사용하였다. 이 후 24시간 추가 배양한 후 배양액을 사진 촬영하여 멜라닌 형성의 정도를 비교하였다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 서열번호 8의 펩타이드를 처리한 경우, 배양액의 색조가 펩타이드의 처리 농도에 따라 갈색이 감소되어 양성대조군과 유사한 색조를 나타내었다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드 단편이 멜라닌세포에서 α-MSH의 자극에 의한 멜라닌 색소의 생성을 억제한다는 것을 나타낸다.
시험예 4. 생쥐 흑색종세포주 B16F10에서 타이로시네이즈 활성 억제 시험
본 발명의 펩타이드 단편이 타이로시네이즈의 활성을 억제하는지를 평가하였다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 5×104 개의 B16F10 세포(한국세포주은행, 서울)를 1 ml의 DMEM 배지에 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하여 안정화시켰다. 멜라닌 생성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma Co, MO, USA)를 서열번호 8의 펩타이드와 함께 농도별로 처리하고, 72시간 배양한 후 단백질을 추출하였다. 얻어진 추출물을 96-웰 플레이트의 각 웰에 30 g씩 넣고, 37℃에서 2시간 동안 100 L의 L-디히드록시페닐알라닌(L-dihydroxyphenylalanine, L-DOPA) 용액을 처리하였다. 양성 대조군으로는 100 nM α-MSH과 알부틴(0.01%)을 각각 첨가한 군을 사용하였다. 2시간 후 색 변화를 촬영하고, 마이크로 리더기 490 nM에서 타이로시네이즈 활성을 측정하였다.
도 4에서 알 수 있는 바와 같이, α-MSH을 처리한 대조군에서는 멜라닌의 활성이 증가된 반면에, α-MSH와 서열번호 8의 펩타이드를 동시에 처리한 시험군에서는 농도의존적으로 멜라닌 활성이 감소하였다. 이는 본 발명에 따른 펩타이드 단편이 타이로시네이즈의 활성을 억제하는 기능을 가짐을 나타낸다.
시험예 5. 사람표피멜라닌세포에서 멜라닌 합성효소들의 단백질발현 억제 시험
사람표피멜라닌세포에서 멜라닌 합성효소들의 단백질 발현에 대한 본 발명의 펩타이드 단편의 영향을 웨스턴 블롯팅을 이용하여 평가하였다. 6-웰 마이크로플레이트의 각 웰에 1.5×105 개의 사람표피멜라닌세포(Cascade Biologics, #C-0245C; Portland, OR, USA)를 2 ml의 DMEM 배지에 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하여 안정화시켰다. 멜라닌 생성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma Co, MO, USA)를 본 발명의 펩타이드 단편(서열번호 8의 펩타이드)과 함께 농도별로 처리하고, 24시간 배양한 후 단백질을 추출하였다. 얻어진 추출물을 대상으로 항-MITF(ABcam, Ma, USA)항체, 항-타이로시네이즈 항체(Santa Cruz Co., CA, USA), 항-TRP-1 항체(Santa Cruz Co., CA, USA)와 항-TRP-2 항체(Santa Cruz Co., CA, USA) 를 이용한 웨스턴 블롯팅 분석을 실시하여 MITF, 타이로시네이즈, TRP-1와 TRP-2 발현량의 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 5와 같다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, MITF, 타이로시네이즈, TRP-1와 TRP-2의 발현량은 서열번호 8의 펩타이드에 의하여 농도의존적으로 감소하였다. 따라서, 본 발명에 따른 펩타이드 단편은 사람표피멜라닌세포에서 MITF, 타이로시네이즈, TRP-1와 TRP-2의 합성을 억제함을 확인할 수 있다.
시험예 6. 사람표피멜라닌세포에서 멜라닌 합성효소들의 유전자발현 억제 시험
본 발명의 펩타이드 단편이 멜라닌 합성효소들의 유전자 발현을 억제하는지를 평가하였다. 6-웰 플레이트의 각 웰에 1.5×105 개의 사람 표피멜라닌세포를 2 ml의 DMEM 배지에 분주한 후 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하여 안정화시켰다. 멜라닌 생성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma Co, MO, USA)를 서열번호 8의 펩타이드와 함께 농도별로 처리하고, 72시간 배양하였다. 배양물로부터 총 RNA를 추출하고, cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Reverse Transcription Master premix (엘피스바이오텍, 대전, 한국)를 사용하여 합성하였다. 합성된 cDNA를 주형으로 ROTOR Q GENE 기기를 이용하여 역전사 중합효소반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하였다. 중합효소반응을 위한 프라이머는 하기 표 2와 같다. 중합효소반응액은 1 μl cDNA에 10 μl TOPreal qRT-PCR2X premix(엔지노믹스, 대전, 한국), 2 μl 프라이머(10 pmol)와 7 μl D.W.를 혼합하여 준비하였다. 중합효소반응은 첫 번째로 94℃에서 10분 동안 반응시키고, 두 번째로 94℃에서 10초, 58℃에서 30초, 72℃에서 1분간 반응시키는 조건으로 40회를 반복하여 수행하였다.
서열번호 프라이머 서열
MITF 10 정방향 CTCGAGCTCATGGACTTTCC
11 역방향 CCAGTTCCGAGGTTGTTGTT
타이로시네이즈 12 정방향 ATCCAGAAGCTGACAGG
13 역방향 TTTGAGAGGCATCCGCTA
TRP-1 14 정방향 AGCAGTAGTTGGCGCTTTGT
15 역방향 TCAACCAGGTGGTTTTGTGA
TRP-2 16 정방향 TGCCACAACATGGATGAACT
17 역방향 TTGTGCCCACCAAACAGTAA
GAPDH 18 정방향 GCAAATTCCATGGCACCGT
19 역방향 CCAAAATCAAGTGGGGCGA
상기와 같이 RT-PCR을 수행하여 MITF, 타이로시네이즈, TRP-1 및 TRP-2 유전자의 발현을 측정한 결과는 도 6과 같다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, α-MSH을 처리한 대조군에서는 MITF, 타이로시네이즈(TYR), TRP-1, TRP-2 유전자 발현이 증가되는 반면에, α-MSH와 본 발명의 펩타이드 단편(서열번호 8의 펩타이드)을 농도별로 동시에 처리한 시험군에서는 농도의존적으로 MITF, 타이로시네이즈, TRP-1, TRP-2 유전자 발현이 감소되었다. 이는 본 발명의 펩타이드 단편이 MITF, 타이로시네이즈, TRP-1와 TRP-2 유전자의 발현을 억제함을 보여준다.

Claims (5)

  1. Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편.
  2. Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
  3. Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 유효성분으로 포함하는, 피부 색소 침착 억제용 화장료 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 피부 색소 침착이 자외선 자극에 의해 유도된 색소 침착인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  5. Sfrp5(Secreted frizzled protein 5)에서 유래한 펩타이드 단편으로서, 서열번호 1 내지 9의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 펩타이드 단편을 포함하는 Wnt 신호전달 억제를 위한 연구 또는 분석용 시약.
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