WO2016199856A1 - ３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法 - Google Patents

３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法 Download PDF

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河村　健司
正照 伊藤
山田　勝成
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    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing 3-hydroxyadipic acid using microorganisms.
  • 3-Hydroxyadipic acid (IUPAC name: 3-hydroxyhexanedioic acid) is a dicarboxylic acid having 6 carbon atoms and a molecular weight of 162.14. 3-Hydroxyadipic acid can be used as a polyester by polymerizing with a polyhydric alcohol and as a raw material for polyamide by polymerizing with a polyvalent amine. Further, by adding ammonia to the terminal of 3-hydroxyadipic acid to make lactam, it can be used alone as a raw material for polyamide.
  • a report related to a method for producing 3-hydroxyadipic acid using microorganisms includes adipic acid in the process of producing adipic acid by a non-naturally occurring microorganism using succinyl-CoA and acetyl-CoA as starting materials.
  • 3-oxoadipate (3-oxoadipate) can be reduced by an enzymatic reaction (3-oxoadipate reductase) as an intermediate in the biosynthetic pathway to produce 3-hydroxyadipate
  • Patent Literature 3-oxoadipate
  • FIG. 3 It has also been reported that n-decane is metabolized by Pseudomonas X2 to produce a very small amount of 3-hydroxyadipic acid ( ⁇ -hydroxyadipic acid) (Non-patent Document 1).
  • Patent Document 1 in a microorganism artificially improved so that adipic acid can be produced, 3-oxoadipic acid (3-oxoadipate) is reduced by an enzymatic reaction as an intermediate of adipic acid to be produced. While there is a description that -hydroxyadipate (3-hydroxyadipate) can be produced, on the other hand, the direct reduction reaction by 3-oxoadipate reductase from 3-oxoadipate to 3-hydroxyadipate Evidence has not been confirmed, and it has not been verified whether 3-hydroxyadipic acid can actually be produced using the metabolic pathway of microorganisms.
  • 3-oxoadipate reductase since an enzyme called 3-oxoadipate reductase is not well known to those skilled in the art, 3-hydroxyadipate cannot be produced using succinyl-CoA and acetyl-CoA as starting materials according to the description in Patent Document 1. It was.
  • Non-Patent Document 1 reports that Pseudomonas X2 produces 3-hydroxyadipic acid, its productivity is only slightly detectable by NMR, and a method for producing 3-hydroxyadipic acid That is not to say.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing 3-hydroxyadipic acid using a metabolic pathway of microorganisms.
  • the present inventor has found that microorganisms capable of producing 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways exist in nature, and the following present invention includes the following. Reached.
  • the present invention provides the following (1) to (19).
  • a method for producing 3-hydroxyadipic acid comprising a step of culturing at least one microorganism having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid selected from the group consisting of a microorganism belonging to the genus Shimwellia, a microorganism belonging to the genus Aerobacter and a microorganism belonging to the genus Rhizobium .
  • the microorganism is at least one selected from the group consisting of a microorganism belonging to the genus Cupriavidus, a microorganism belonging to the genus Acinetobacter, a microorganism belonging to the genus Delftia, a microorganism belonging to the genus Shimwellia, a microorganism belonging to the genus Escherichia and a microorganism belonging to the genus Pseudomonas.
  • the Escherichia microorganism is Escherichia fergusonii or Escherichia coli.
  • the microorganism belonging to the genus Psuedomonas is Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans or Pseudomonas chlororaphis subsp.
  • the medium for culturing the microorganism contains at least one carbon source selected from the group consisting of sugars, succinic acid, 2-oxoglutaric acid and glycerol.
  • the method according to item. (19) The microorganism is cultured in a medium containing at least one inducer selected from the group consisting of ferulic acid, p-coumaric acid, benzoic acid, cis, cis-muconic acid, protocatechuic acid, and catechol.
  • 3-hydroxyadipic acid can be obtained by utilizing the metabolic pathway of microorganisms.
  • the method for producing 3-hydroxyadipic acid of the present invention is characterized by including a step of culturing a microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid. More specifically, the method is characterized in that 3-hydroxyadipic acid is produced by culturing a microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid by utilizing the metabolic pathway of the microorganism.
  • the microorganism having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid used in the method of the present invention is selected from the following microorganisms. ⁇ Cupriavidus genus microorganisms ⁇ Acinetobacter genus microorganisms ⁇ Delfia genus microorganisms ⁇ Shimwellia genus microorganisms ⁇ Escherichia genus microorganisms ⁇ Aerobacter genus microorganisms ⁇ Alcaligenes genus microorganisms Genus microorganisms, Rhizobium genus microorganisms, Streptomyces genus microorganisms.
  • microorganisms belonging to the genus Cupriavidus having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Cupriavidus metallidurans, Cupriavidus necator, Cupriavidus oxalateticus. It is not clear about the mechanism by which Capriavidus microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways, but Capriavidus genus decomposes hydrocarbons derived from petroleum products such as benzene, toluene and xylene ( JP-A-2007-252285) and may be known to have metal resistance (Antonie van Leeuwenhoek, 2009, 96, 2, 115-139). Capriavidus microorganisms are generally used for substance production. It has a complicated metabolic pathway different from that of the microorganism to be used, and it is estimated that 3-hydroxyadipic acid is produced based on the metabolic pathway.
  • microorganisms belonging to the genus Acinetobacter having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Acinetobacter baylyi and Acinetobacter radioresisten. Although the mechanism by which Acinetobacter microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, Acinetobacter genus decomposes mineral oils such as benzene, fuel oil, and lubricating oil and is used for environmental purification. (See JP2013-123418), and like the Capriavidus, microorganisms belonging to the genus Acinetobacter have complicated metabolic pathways different from those commonly used for substance production. Therefore, it is estimated that 3-hydroxyadipic acid is produced based on the metabolic pathway.
  • Delftia microorganisms having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Delftia acidovorans.
  • the mechanism by which Delftia microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, but Delftia is used for environmental purification by decomposing mineral oils such as benzene, fuel oil, and lubricating oil.
  • metal resistance may be known (Journal of Water Resource and Protection, 2012, 4, 4, 207-216), as well as Capriavidus and Acinetobacter,
  • the Delftia genus microorganism also has a complicated metabolic pathway different from that generally used for substance production, and it is presumed that 3-hydroxyadipic acid is produced based on the metabolic pathway.
  • Shimella brattae As a specific example of a Shimella genus microorganism having an ability to produce 3-hydroxyadipic acid, there is Shimella brattae.
  • the mechanism by which the microorganisms of the genus Shimwellia can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, the genus Shimwellia may also live in places with high radioactive radon concentrations (Radiation Protection and Environment, 2014, 37, 21, 21-24), Capriavidus genus, Acinetobacter genus, Delftia genus, Shimwellia genus microorganisms have a special metabolic pathway different from microorganisms generally used for substance production, It is estimated that 3-hydroxyadipic acid is produced based on the metabolic pathway.
  • Escherichia microorganisms capable of producing 3-hydroxyadipic acid include Escherichia fergusonii and Escherichia coli.
  • the mechanism by which Escherichia microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, but Escherichia is known to have hydrocarbon resolution and heavy metal resistance (Bioresource Technology). , 2011, 102, 19, 9291-9295), Capriavidus genus, Acinetobacter genus, Delftia genus, and Shimwellia genus, Escherichia genus microorganisms are also commonly used for substance production (for example, Corynebacterium genus microorganisms). It is estimated that 3-hydroxyadipic acid is produced based on this metabolic pathway.
  • microorganisms belonging to the genus Psuedomonas having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Pseudomonas chlororaphis, Pseudomonas putida, Pseudomonas azotoformans, Pseudomonas chlororaphis. Aureofaciens.
  • the genus Psuedomonas is an aromatic hydrocarbon solvent, a petroleum hydrocarbon solvent, an ester solvent, an alcohol solvent.
  • microorganisms of the genus Psuedomonas are also used for substance production, as well as the genera Capriavidus, Acinetobacter, Delftia, Shimwellia, and Escherichia. It has a complicated metabolic pathway different from commonly used microorganisms (for example, Corynebacterium microorganisms), and it is estimated that 3-hydroxyadipic acid is produced based on the metabolic pathway.
  • Aerobacter cloacae Specific examples of microorganisms belonging to the genus Aerobacter having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Aerobacter cloacae. Although the mechanism by which Aerobacter microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, Aerobacter genus is a kind of pesticide, DDT (1,1,1-trichloro-2-bis (p -Chlorophenyl) and ethan) may be known (see New Zealand Journal of Agricultural Research, Volume 40, Issue 2, 1997), which is different from the microorganisms commonly used in substance production. It has a metabolic pathway, and it is estimated that 3-hydroxyadipic acid is produced based on the metabolic pathway.
  • DDT 1,1,1-trichloro-2-bis (p -Chlorophenyl) and ethan
  • Alcaligenes having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Alcaligenes faecalis. Although the mechanism by which Alcaligenes microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, Alcaligenes genus may be used for purification of wastewater containing phenolic compounds (Japanese Patent Laid-Open No. 2016- 41392), it has a complicated metabolic pathway different from microorganisms generally used for substance production, and it is presumed that 3-hydroxyadipic acid is produced based on this metabolic pathway.
  • Bacillus microorganisms having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Bacillus badius, Bacillus magnesium, and Bacillus roseus.
  • the mechanism by which Bacillus microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, but Bacillus may be used in wastewater treatment systems that biologically treat wastewater with activated sludge ( JP-A-2006-305455) has a complicated metabolic pathway different from microorganisms generally used for substance production, and it is estimated that 3-hydroxyadipic acid is produced based on the metabolic pathway.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacterium having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Brevibacterium iodinum.
  • the mechanism by which microorganisms of the genus Brevibacterium can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, it is known that the genus Brevibacterium is degrading Ochratoxin A, a kind of toxin produced by mold. In some cases (see J. Agric. Food Chem., 2011, 59 (19), pp 10755-10760), it has a complicated metabolic pathway different from microorganisms generally used for substance production, and the metabolism It is presumed to produce 3-hydroxyadipic acid based on the route.
  • microorganisms belonging to the genus Corynebacterium having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium acetoglutamicum, and Corynebacterium ammoniagenes, and Corynebacterium.
  • Corynebacterium microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways.
  • Corynebacterium has the ability to degrade polycyclic aromatic hydrocarbons. Yes (Prevalence of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) degrading bacteria in contaminated tropical soil in Lagos, Nigeria:.
  • Hafnia microorganisms having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Hafnia alvei. Although the mechanism by which Hafnia spp. Microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, it is known that Hafnia spp. Is resistant to chromic acid in wastewater and decomposes. (See J. bio-sci. 17: 71-76, 2009), which has a complicated metabolic pathway different from microorganisms generally used for substance production, and 3-hydroxyadipine based on this metabolic pathway It is presumed to produce an acid.
  • Nocardioides microorganisms having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid include Nocardioides albus.
  • the mechanism by which the microorganisms of the genus Nocardioides can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, but the genus Nocardioides is known to decompose petroleum (Isolation and Identification of Petroleum- Degradable Bacterial Strain and Its Oil-Degradation Characteristics, see Journal of Microbiology, 2012-05), which has a complex metabolic pathway that is different from microorganisms commonly used for substance production and is based on the hydroxy pathway It is presumed to produce adipic acid.
  • Rhizobium radiobacter As a specific example of a microorganism belonging to the genus Rhizobium having the ability to produce 3-hydroxyadipic acid, there is Rhizobium radiobacter. Although the mechanism by which Rhizobium microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, Rhizobium genus may be known to degrade methyl violet, a kind of dye ( Journal of Basic Microbiology, Volume 49, Issue Supplement S1, September 2009 Pages S36-S42), which has a complex metabolic pathway that is different from microorganisms commonly used for substance production, and is based on the 3-hydroxy pathway It is presumed to produce adipic acid.
  • Streptomyces genus microorganisms capable of producing 3-hydroxyadipic acid include Streptomyces vinaceus, Streptomyces karnakensis, and Streptomyces olivacaceus.
  • the mechanism by which Streptomyces microorganisms can produce 3-hydroxyadipic acid using metabolic pathways is not clear, but Streptomycins is known to produce various antibiotics (Tetrahedron Volume 39 , Issue 15, 1983, Pages 2555-1562), has a complicated metabolic pathway different from microorganisms generally used for substance production, and can produce 3-hydroxyadipic acid based on the metabolic pathway Presumed.
  • the microorganisms are all known as microorganisms existing in nature, and can be isolated from the natural environment such as soil. It can also be purchased from a microorganism dispensing organization such as ATCC.
  • the microorganism may be a gene that has been recombined according to a known technique, or may be a gene that has been mutated by artificial mutation means.
  • Confirmation that the microorganism has the ability to produce 3-hydroxyadipic acid can be obtained by analyzing the supernatant of the culture solution with an appropriate analytical method such as high performance liquid chromatography (HPLC), high performance liquid chromatograph mass spectrometer (LC / MS). , 3-hydroxyadipine contained in the culture supernatant using a high performance liquid chromatography tandem mass spectrometer (LC-MS / MS), gas chromatography (GC), gas chromatograph mass spectrometer (GC / MS), etc. This can be confirmed by detecting the acid.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • LC / MS high performance liquid chromatograph mass spectrometer
  • a microorganism capable of producing 1.0 mg / L or more of 3-hydroxyadipic acid in a culture supernatant obtained by culturing for 20 hours to 48 hours is used as a microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid. It is preferable to use as.
  • each microorganism described above is cultured under conditions where 3-hydroxyadipic acid is produced.
  • the microorganism is cultured in a medium suitable for the microorganism to be used, for example, a medium containing a carbon source that can be metabolized by a normal microorganism, preferably a liquid medium.
  • a medium suitable for the microorganism to be used for example, a medium containing a carbon source that can be metabolized by a normal microorganism, preferably a liquid medium.
  • “metabolism” in the present invention means that a certain chemical substance taken from outside the cell or produced from another chemical substance in the cell is converted into another chemical substance by an enzymatic reaction. Point to.
  • the medium preferably contains a carbon source that can be assimilated by the microorganisms to be cultured.
  • a medium containing a nitrogen source that can be metabolized (preferably assimilated), an inorganic salt, and if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins is used. Any of a natural medium and a synthetic medium can be used as long as the nutrient source is contained.
  • saccharides can be preferably used.
  • the microorganism can be preferably used as long as the microorganism can be used for growth as a single carbon source.
  • preferable carbon sources include monosaccharides such as glucose, sucrose, fructose, galactose, mannose, xylose, and arabinose, disaccharides to which these monosaccharides are bound, polysaccharides, starch saccharified solutions containing these saccharides, Molasses, cellulose-containing biomass saccharified solution, acetic acid, succinic acid, lactic acid, fumaric acid, citric acid, propionic acid, malic acid, malonic acid, adipic acid, 2-oxoglutaric acid, pyruvic acid and other organic acids, methanol, ethanol And monohydric alcohols such as propanol, polyhydric alcohols such as glycerin, ethylene glycol, and propanedi
  • the carbon sources listed above may be used alone or in combination. Specifically, among these carbon sources, the microorganism efficiently metabolizes one or more selected from the group consisting of saccharides, succinic acid, 2-oxoglutaric acid, and glycerol to efficiently produce 3-hydroxyadipic acid. Can be manufactured.
  • the concentration of the saccharide in the medium is not particularly limited and can be appropriately set according to the type of microorganism to be cultured, the type of saccharide, etc., but is usually about 5 g / L to 300 g / L.
  • Examples of the assimilable nitrogen source used for culturing the microorganism include, for example, ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salts, urea, nitrates, and other organic nitrogen sources used as ancillary substances such as oil cakes and soybean hydrolysate. Casein degradation products, other amino acids, vitamins, corn steep liquor, yeast or yeast extract, meat extract, peptides such as peptone, various fermented cells and hydrolysates thereof, and the like are used.
  • the concentration of the nitrogen source in the medium is not particularly limited and can be appropriately set according to the type of microorganism to be cultured, the type of nitrogen source, etc., but is usually about 0.1 g / L to 50 g / L. .
  • inorganic salts used for culturing the microorganism for example, phosphates, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts and the like can be appropriately added and used.
  • the culture conditions of the microorganisms for producing 3-hydroxyadipic acid include the medium of the component composition, the culture temperature, the stirring speed, the pH, the aeration amount, the inoculation amount, etc., the type of production bacteria used and the external conditions, etc. Depending on the setting, it can be adjusted or selected as appropriate. When there is foaming in liquid culture, an antifoaming agent such as mineral oil, silicone oil and surfactant can be appropriately added to the medium.
  • an antifoaming agent such as mineral oil, silicone oil and surfactant can be appropriately added to the medium.
  • 3-Hydroxyadipic acid can be produced by culturing with the above microorganisms under the culture medium and culture conditions shown above, but in a state where the metabolic pathway necessary for producing 3-hydroxyadipic acid is activated. By culturing the microorganism, 3-hydroxyadipic acid can be more efficiently produced.
  • the method for activating the metabolic pathway is not particularly limited.
  • 3-hydroxyadipic acid is produced by culturing the microorganism in a medium containing a substance that activates the metabolic pathway (hereinafter also referred to as an inducer).
  • a method for inducing expression of an enzyme gene (s) in a metabolic pathway a method for modifying a coding region of the enzyme gene (s) and / or a functional region around the enzyme gene (s) by gene modification technology, an enzyme gene (s) Methods of increasing the copy number of the product, and disrupting the enzyme gene function in the biosynthetic pathway of by-products, etc., but the enzyme gene in the metabolic pathway for producing 3-hydroxyadipic acid by an inducer ( The method of inducing the expression of group) is preferred.
  • the inducer is not particularly limited as long as it is a substance that activates a metabolic pathway necessary for the production of 3-hydroxyadipic acid.
  • it is usually a compound having fewer carbon atoms using 3-oxoadipyl-CoA as an intermediate.
  • An aromatic compound or an aliphatic compound having 6 or more carbon atoms, preferably 6 or more and 30 or less carbon atoms, can be used.
  • a dicarboxylic acid having 6 or more carbon atoms, preferably 6 or more and 30 or less carbon atoms can be used.
  • Examples of such compounds can be known using databases such as KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes), specifically, adipic acid, benzoic acid, cis, cis-muconic acid, terephthalic acid. , Protocatechuic acid, catechol, vanillin, coumaric acid, ferulic acid and the like, and preferred examples include adipic acid, ferulic acid, and p-coumaric acid.
  • the above inducers may be used alone or in combination of two or more according to the microorganism used for the production of 3-hydroxyadipic acid.
  • the inducer may be contained in a medium used for culture (pre-culture) for growing the microorganism as a pre-stage of 3-hydroxyadipic acid production, or a medium used for 3-hydroxyadipic acid production. May be included.
  • the concentration of the inducer (if multiple inducers are included, the total concentration thereof) is not particularly limited, and the type of microorganism or induction Although it is appropriately set according to the kind of the substance, it is usually 1 mg / L to 10 g / L, preferably 5 mg / L to 1 g / L.
  • the produced 3-hydroxyadipic acid can be recovered after the 3-hydroxyadipic acid is produced in the microorganism culture to a recoverable amount.
  • the recovery for example, isolation of the produced 3-hydroxyadipic acid should be performed according to a general method for stopping the culture when the accumulated amount has increased moderately and collecting the fermentation product from the culture. Can do. Specifically, after separating the cells by centrifugation, filtration, etc., 3-hydroxyadipic acid is isolated from the culture by column chromatography, ion exchange chromatography, activated carbon treatment, crystallization, membrane separation, distillation, etc. Can be separated.
  • the culture is concentrated by using a reverse osmosis membrane or an evaporator to remove water to increase the concentration of 3-hydroxyadipic acid, followed by cooling crystallization or adiabatic crystallization.
  • Example 1 3-Hydroxyadipic acid production test microorganism culture using succinic acid 3-Hydroxyadipic acid of the microorganisms shown in Table 1 (both microorganisms were purchased from a microbial distribution agency and the purchaser is listed in the name of the strain) The production ability of was investigated.
  • Each platinum microbe is inoculated into 5 mL of a medium consisting of tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, adipic acid 0.5 g / L, pH 7, and 30 ° C. until fully suspended. And cultured with shaking (preculture).
  • the concentration of 3-hydroxyadipic acid accumulated in the culture supernatant was as shown in Table 1, and it was confirmed that all the microorganisms had the ability to produce 3-hydroxyadipic acid.
  • Example 2 Example of Production of 3-Hydroxyadipic Acid
  • Cupriavidus metallidrans NBRC101272 which was confirmed to be a microorganism capable of producing 3-hydroxyadipic acid in Example 1, was inoculated in a platinum loop in 5 mL of LB medium. The suspension was cultured at 30 ° C. until suspended (pre-culture). 2 mL of the culture solution was added to 100 mL of a medium consisting of tryptone 10 g / L, yeast extract 5 g / L, sodium chloride 5 g / L, adipic acid 0.5 g / L, pH 7, and shaken at 30 ° C. until fully suspended. Cultured (preculture).
  • Example 2 After washing the precultured solution with 200 mL of 0.9% sodium chloride three times in the same manner as in Example 1, the cells were suspended in 10 mL of 0.9% sodium chloride. 10 mL of the suspension was added to 100 mL of the main culture medium using succinic acid as a carbon source in the same manner as in Example 1, and cultured with shaking at 30 ° C. for 20 hours (main culture). The supernatant obtained by centrifuging cells from the main culture was analyzed by LC-MS / MS in the same manner as in Example 1. As a result, the concentration of 3-hydroxyadipic acid accumulated in the culture supernatant was 18 mg / L. there were.
  • the supernatant of the main culture was concentrated under reduced pressure to obtain 11 mL of a concentrated solution having a 3-hydroxyadipic acid concentration of 160 mg / L.
  • This concentrated solution was injected into HPLC connected with a preparative device, and a fraction having an elution time corresponding to a sample of 3-hydroxyadipic acid was collected. This operation was repeated 10 times to obtain a 3-hydroxyadipic acid aqueous solution from which impurities in the culture medium were removed.
  • the preparative HPLC used for collecting 3-hydroxyadipic acid was performed under the following conditions.
  • Example 2 Culture without Addition of Carbon Source
  • the microorganisms shown in Table 1 were cultured under the same conditions as in Example 1 except that a medium having a composition not containing succinic acid was used, and quantitative analysis of 3-hydroxyadipic acid was performed. As a result, 3-hydroxyadipic acid was not detected in the culture supernatant. From this result, it was confirmed that the 3-hydroxyadipic acid quantified in Example 1 was produced as a result of succinic acid being metabolized by microorganisms.
  • Example 3 3-Hydroxyadipic acid production test using various microorganisms
  • the microorganisms shown in Table 3 were used as inducers.
  • Pre-culture and fungus under the same conditions as in Example 1 except that ferulic acid, p-coumaric acid, benzoic acid, cis, cis-muconic acid, protocatechuic acid and catechol were added to the culture medium to 2.5 mM each.
  • Body washing was performed. 0.5 mL of the suspension after washing was added to 5 mL of a medium having the composition shown below, and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours.
  • Table 3 shows the results of quantitative analysis of 3-hydroxyadipic acid accumulated in the culture supernatant. From these results, it was confirmed that all the microorganisms have the ability to produce 3-hydroxyadipic acid.
  • Example 4 3-Hydroxyadipic acid production test with no inducer added Pre-culture under the same conditions as in Example 3 except that the inducer used in Example 3 was not added to the microorganisms shown in Table 4 The cells were washed. 0.5 mL of the suspension after washing was added to 5 mL of a medium having the composition shown below, and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours.
  • Table 4 shows the results of quantitative analysis of 3-hydroxyadipic acid in the culture supernatant. From these results, it was confirmed that the microorganisms shown in Table 4 have the ability to produce 3-hydroxyadipic acid even when precultured without adding an inducer.
  • Example 5 3-Hydroxyadipic acid production test using p-coumaric acid or ferulic acid as inducer From among substances added to the preculture medium as inducer in Example 3 for the microorganisms shown in Table 5 Pre-culture and cell washing were performed under the same conditions as in Example 4 except that p-coumaric acid or ferulic acid was added to a concentration of 0.5 mM. 0.5 mL of the suspension after washing was added to 5 mL of a medium having the composition shown below, and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours. Table 5 shows the results of quantitative analysis of 3-hydroxyadipic acid in the culture supernatant. From these results, it was found that even when only p-coumaric acid or ferulic acid was added to the preculture medium as an inducer, the production amount of 3-hydroxyadipic acid was improved as compared with the case where it was not added. .
  • 3-hydroxyadipic acid can be produced using microorganisms.
  • the obtained 3-hydroxyadipic acid can be used as various polymer raw materials.

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Abstract

微生物の代謝経路を利用した、３－ヒドロキシアジピン酸の新規な製造方法が開示されている。３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物、Ｈａｆｎｉａ属微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物およびＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物からなる群から選択される、３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する少なくとも１種類の微生物を培養する工程を含む。

Description

３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法
　本発明は、微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法に関する。
　３－ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ）は、炭素数６、分子量１６２．１４のジカルボン酸である。３－ヒドロキシアジピン酸は多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、３－ヒドロキシアジピン酸の末端にアンモニアを付加してラクタム化することで、単独でもポリアミドの原料になり得る。
　微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法に関連する報告としては、スクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡを出発原料とした天然には存在しない微生物によるアジピン酸を製造する方法の過程で、アジピン酸生合成経路の中間体として３－オキソアジピン酸（３－オキソアジペート）が酵素反応によって還元され（３－オキソアジピン酸レダクターゼ）、３－ヒドロキシアジピン酸が生成しうるとの報告がある（特許文献１、図３）。また、ｎ－デカンがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｘ２により代謝され、極微量の３－ヒドロキシアジピン酸（β－ヒドロキシアジピン酸）が生成されることが報告されている（非特許文献１）。
国際公開第２００９／１５１７２８号
Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．　１９６７　１０４，９８７－９９０
　特許文献１には、アジピン酸を製造できるように人為的に改良した微生物において、製造対象であるアジピン酸の中間体として３－オキソアジピン酸（３－オキソアジペート）が酵素反応によって還元され、３－ヒドロキシアジピン酸（３－ヒドロキシアジペート）が生成しうることについての記載はあるが、一方で、３－オキソアジピン酸から３－ヒドロキシアジピン酸への３－オキソアジピン酸レダクターゼによる還元反応の直接的証拠は確認されておらず、また、実際に微生物の代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸が製造できるかどうかの検証はなされていない。さらに、当業者にとって３－オキソアジピン酸レダクターゼなる酵素は周知のものではないため、特許文献１の記載に従ってスクシニル－ＣｏＡとアセチル－ＣｏＡを出発原料として３－ヒドロキシアジピン酸を製造することはできなかった。
　また、非特許文献１にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　Ｘ２によって３－ヒドロキシアジピン酸が生成することの報告はあるものの、その生産性はＮＭＲによってわずかに検出できる程度のものであり、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法であるとは言えるものではない。
　このように、実際のところ微生物の代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造する方法は存在していなかった。そこで本発明では、微生物の代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造する方法を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造することができる微生物が自然界に存在することを見出し、以下の本発明に到達した。
　すなわち本発明は、次の（１）～（１９）を提供する。
（１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物、Ｈａｆｎｉａ属微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物およびＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物からなる群から選択される、３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する少なくとも１種類の微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
（２）前記微生物が、　Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物からなる群から選択される少なくとも１種類である（１）記載の方法。
（３）前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ又はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉである、（１）又は（２）記載の方法。
（４）前記Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓである、（１）又は（２）記載の方法。
（５）前記Ｈａｆｎｉａ属微生物が、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉである、（１）記載の方法。
（６）前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ又はＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、（１）記載の方法。
（７）前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ又はＢａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓである、（１）記載の方法。
（８）前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ又はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓである、（１）記載の方法。
（９）前記Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ又はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓである、（１）又は（２）記載の方法。
（１０）前記Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ又はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓである、（１）又は（２）記載の方法。
（１１）前記Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物が、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓである、（１）又は（２）記載の方法。
（１２）前記Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物が、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓである、（１）記載の方法。
（１３）前記Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍである、（１）記載の方法。
（１４）前記Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物が、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓである、（１）又は（２）記載の方法。
（１５）前記Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物が、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅである、（１）又は（２）記載の方法。
（１６）前記Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物が、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅである、（１）記載の方法。
（１７）前記Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物が、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒである、（１）記載の方法。
（１８）前記微生物を培養する培地が、糖類、コハク酸、２－オキソグルタル酸およびグリセロールからなる群から、選択される少なくとも１種の炭素源を含む、（１）～（１７）のいずれか１項に記載の方法。
（１９）前記微生物を、フェルラ酸、ｐ－クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールからなる群から選択される少なくとも１種の誘導物質を含む培地で培養する、（１）～（１８）のいずれか１項に記載の方法。
　本発明により、微生物の代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を得ることができる。
　本発明の３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法は、３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する微生物を培養する工程を含むことを特徴とする。より詳しくは、３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する微生物を培養することによって、該微生物の代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造することを特徴とする。
　本発明の方法で用いられる３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する微生物としては、以下の微生物から選択される。
・Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物
・Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物
・Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物
・Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物
・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物
・Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物
・Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物
・Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物
・Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物
・Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物
・Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物
・Ｈａｆｎｉａ属微生物
・Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物
・Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物
・Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物の具体例としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ，Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ，Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓが挙げられる。Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについては明らかではないが、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属はベンゼン、トルエン、キシレン等の石油製品由来の炭化水素類を分解することや（特開２００７－２５２２８５号公報参照）、金属耐性を有することが知られていることもあり（Ａｎｔｏｎｉｅ　ｖａｎ　Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ，２００９，９６，２，１１５－１３９）、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物は、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物の具体例としては、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓが挙げられる。Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造し得るメカニズムについても明らかではないが、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属はベンゼンや燃料油、潤滑油などの鉱物油類を分解し環境浄化に用いられることが知られていることもあり（特開２０１３－１２３４１８号公報参照）、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属と同様、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物も、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＤｅｌｆｔｉａ属微生物の具体例としては、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓが挙げられる。Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｄｅｌｆｔｉａ属はベンゼンや燃料油、潤滑油などの鉱物油類を分解し環境浄化に用いられることや（特開２０１３－１２３４１８号公報参照）、金属耐性が知られていることもあり（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２０１２，４，４，２０７－２１６）、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属やＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属と同様、Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物も、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物の具体例としては、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅが挙げられる。Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属は放射性ラドン濃度の高い場所でも生息していることもあり（Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，２０１４，３７，１，２１－２４参照）、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属と同様、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物も、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった特殊な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物の具体例としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉが挙げられる。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属は炭化水素分解能や重金属耐性を有することが知られていることもあり（Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０２，１９，９２９１－９２９５参照）、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属と同様、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物も、物質生産に一般的に利用される微生物（例えば、コリネバクテリウム属微生物）とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物の具体例としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓが挙げられる。Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属は芳香族炭化水素系溶剤、石油系炭化水素系溶剤、エステル系溶剤、アルコール系溶剤などを分解することが知られていることもあり（特開２０１０－１３０９５０号公報参照）、Ｃａｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属と同様、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物も、物質生産に一般的に利用される微生物（例えば、コリネバクテリウム属微生物）とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物の具体例としては、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅが挙げられる。Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属は農薬の一種であるＤＤＴ（１，１，１－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏ－２－ｂｉｓ　（ｐ－ｃｈｒｏｌｏｐｈｅｎｙｌ）　ｅｔｈａｎｅ）を分解することが知られていることもあり（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｖｏｌｕｍｅ　４０，　Ｉｓｓｕｅ２，　１９９７参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
２
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物の具体例としては、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓが挙げられる。Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属はフェノール類化合物含有排水の浄化に利用されていることもあり（特開２０１６－４１３９２参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＢａｃｉｌｌｕｓ属微生物の具体例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓが挙げられる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属は廃水を活性汚泥で生物処理する廃水処理システムに利用されていることもあり（特開２００６－３０５４５５参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍが挙げられる。Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属はカビが産生する毒素の一種であるＯｃｈｒａｔｏｘｉｎ　Ａを分解することが知られていることもあり（Ｊ．　Ａｇｒｉｃ．　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ．，　２０１１，　５９　（１９），　ｐｐ　１０７５５-１０７６０参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍが挙げられる。Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属は多環芳香族炭化水素を分解する能力を有することが知られていることもあり（Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ　ａｒｏｍａｔｉｃ　ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ　（ＰＡＨｓ）　ｄｅｇｒａｄｉｎｇ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　ｔｒｏｐｉｃａｌ　ｓｏｉｌ　ｉｎ　Ｌａｇｏｓ，　Ｎｉｇｅｒｉａ：　ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｉｎ　ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．，　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　２０１０　Ｖｏｌ．　４　Ｎｏ．　６　ｐｐ．　ｕｎｐａｇｉｎａｔｅｄ参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＨａｆｎｉａ属微生物の具体例としては、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉが挙げられる。Ｈａｆｎｉａ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｈａｆｎｉａ属は廃水に含まれるクロム酸に耐性を持ち、分解することが知られていることもあり（Ｊ．　ｂｉｏ－ｓｃｉ．　１７：　７１－７６，　２００９参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物の具体例としては、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓが挙げられる。Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属は石油を分解することが知られていることもあり（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｅｔｒｏｌｅｕｍ－Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｓｔｒａｉｎ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｏｉｌ－Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　，　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２０１２－０５参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物の具体例としては、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒが挙げられる。Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属は染料の一種であるｍｅｔｈｙｌ　ｖｉｏｌｅｔを分解することが知られていることもあり（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｖｏｌｕｍｅ　４９，　Ｉｓｓｕｅ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｓ１　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２００９　Ｐａｇｅｓ　Ｓ３６-Ｓ４２参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。
　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物の具体例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓが挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物が代謝経路を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造しうるメカニズムについても明らかではないが、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属は多様な抗生物質を生成することが知られていることもあり（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｖｏｌｕｍｅ　３９，　Ｉｓｓｕｅ　１５，　１９８３，　Ｐａｇｅｓ　２５５１-２５６２参照）、物質生産に一般的に利用される微生物とは異なった複雑な代謝経路を有し、該代謝経路に基づき３－ヒドロキシアジピン酸を生成することが推定される。　前記微生物は、いずれも自然界に存在する微生物として公知のものであり、土壌等の自然環境から単離することができる。また、ＡＴＣＣ等の微生物分与機関から購入することもできる。
　前記微生物は、３－ヒドロキシアジピン酸を生産する限り、公知の手法にしたがって遺伝子を組換えたものであってもよく、また、人為的変異手段により遺伝子を変異させたものであってもよい。
　前記微生物が３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有することの確認は、培養液の上清を適当な分析手法、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）、高速液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析計（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）などを用いて培養液上清に含まれる３－ヒドロキシアジピン酸を検出することで確認することができる。そして本発明では、２０時間から４８時間培養して得られる培養液上清中に１．０ｍｇ／Ｌ以上の３－ヒドロキシアジピン酸を生産できる微生物を、３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する微生物として使用することが好ましい。
　本発明の方法では、上記した各微生物を、３－ヒドロキシアジピン酸が生産される条件下で培養する。本発明では、前記微生物を、用いる微生物に好適な培地、例えば、通常の微生物が代謝し得る炭素源を含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。ここで、本発明における「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、又は細胞内で別の化学物質より生じたある化学物質が、酵素反応により別の化学物質へと変換されることを指す。培養により微生物を増殖させる場合には、培養する微生物が同化し得る炭素源を培地が含むことが好ましい。
　使用される微生物が代謝しうる炭素源の他には、代謝（好ましくは同化）し得る窒素源と、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。
　前記微生物が代謝しうる炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。また、糖以外にも、前記微生物が単一炭素源として生育に利用可能なものであれば好ましく用いることができる。好ましい炭素源の具体例としては、グルコース、シュクロース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合した二糖類や、多糖類、これら糖類を含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液、更には酢酸、コハク酸、乳酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸、アジピン酸、２－オキソグルタル酸、ピルビン酸等の有機酸、メタノール、エタノール、プロパノールなどの一価アルコール類、およびグリセリン、エチレングリコール、プロパンジオールなどの多価アルコール類、炭化水素、脂肪酸、油脂などが挙げられる。上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよい。具体的には、前記微生物は、これら炭素源の中でも糖類、コハク酸、２－オキソグルタル酸、グリセロールからなる群より選択される１種又は２種以上を代謝することで効率よく３－ヒドロキシアジピン酸を製造することができる。培地中の糖類の濃度は、特に限定されず、培養する微生物の種類や糖類の種類等に応じて適宜設定することができるが、通常、５ｇ／Ｌ～３００ｇ／Ｌ程度である。
　前記微生物の培養に用いる同化し得る窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母又は酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用される。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されず、培養する微生物の種類や窒素源の種類等に応じて適宜設定することができるが、通常、０．１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ程度である。
　前記微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
　３－ヒドロキシアジピン酸を製造するための前記微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、使用する生産菌の種類および外部条件などに応じて、適宜調節又は選択して設定することができる。液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。これらの培養条件は、各微生物について公知であり、下記実施例にも具体的に記載されている。
　上記に示した培地および培養条件で、前記微生物を用いた培養により３－ヒドロキシアジピン酸を製造することができるが、３－ヒドロキシアジピン酸を製造するために必要な代謝経路を活性化した状態で前記微生物を培養することで、より効率的に３－ヒドロキシアジピン酸を製造することができる。前記代謝経路を活性化する方法は特に限定されないが、例えば、代謝経路を活性化する物質（以下、誘導物質ともいう。）を含む培地で前記微生物を培養することで３－ヒドロキシアジピン酸を製造するための代謝経路中の酵素遺伝子（群）の発現を誘導する方法、遺伝子改変技術により酵素遺伝子（群）のコーディング領域および／又はその周辺の機能性領域を改変する方法、酵素遺伝子（群）のコピー数を増加させる方法、副生成物の生合成経路中の酵素遺伝子機能を破壊する方法などが挙げられるが、誘導物質により３－ヒドロキシアジピン酸を製造するための代謝経路中の酵素遺伝子（群）の発現を誘導する方法が好ましい。
　誘導物質としては、３－ヒドロキシアジピン酸の製造に必要な代謝経路が活性化される物質であれば特に限定されないが、例えば、通常３－オキソアジピル－ＣｏＡを中間体としてより炭素数の少ない化合物へと代謝される、芳香族化合物又は炭素数６以上、好ましくは、炭素数６以上、３０以下の脂肪族化合物を用いることができる。炭素数６以上の脂肪族化合物として好ましくは、炭素数６以上、好ましくは炭素数６以上、３０以下のジカルボン酸を用いることができる。このような化合物の例は、例えばＫＥＧＧ（Ｋｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ）などのデータベースを用いて知ることができるが、具体的には、アジピン酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、テレフタル酸、プロトカテク酸、カテコール、バニリン、クマル酸、フェルラ酸などが挙げられ、好ましい例としては、アジピン酸、フェルラ酸、ｐ－クマル酸が挙げられる。
　上記の誘導物質は３－ヒドロキシアジピン酸製造に用いる前記微生物に応じて単独で使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、上記誘導物質は３－ヒドロキシアジピン酸製造の前段階として前記微生物を増殖させるために行う培養（前培養）に用いる培地に含まれていてもよいし、３－ヒドロキシアジピン酸製造に用いる培地に含まれていてもよい。１種又は２種以上の誘導物質が培地中に含まれる場合、誘導物質の濃度（複数の誘導物質が含まれる場合には、それらの合計濃度）は、特に限定されず、微生物の種類や誘導物質の種類等に応じて適宜設定されるが、通常、１ｍｇ／Ｌ～１０ｇ／Ｌ、好ましくは、５ｍｇ／Ｌ～１ｇ／Ｌである。
　前記微生物の培養物中に、３－ヒドロキシアジピン酸が回収可能な量まで生産された後、生産された３－ヒドロキシアジピン酸を回収することができる。生産された３－ヒドロキシアジピン酸の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、３－ヒドロキシアジピン酸を培養物から単離することができる。より具体的には、好ましい回収方法として、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して３－ヒドロキシアジピン酸の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－ヒドロキシアジピン酸の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより３－ヒドロキシアジピン酸および／または３－ヒドロキシアジピン酸の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して３－ヒドロキシアジピン酸エステルとした後、蒸留操作により３－ヒドロキシアジピン酸エステルを回収後、加水分解により３－ヒドロキシアジピン酸を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１　　３－ヒドロキシアジピン酸の調製
　後述の実施例の分析に用いた３－ヒドロキシアジピン酸は化学合成により準備した。
　まず、コハク酸モノメチルエステル１３．２ｇ（０．１ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）に超脱水テトラヒドロフラン１．５Ｌ（和光純薬株式会社製）を加え、攪拌しながらカルボニルジイミダゾール１６．２ｇ（０．１ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）を添加し、窒素雰囲気下１時間室温で攪拌した。この懸濁液にマロン酸モノメチルエステルカリウム塩１５．６ｇ（０．１ｍｏｌ）および塩化マグネシウム９．５ｇ（０．１ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下１時間室温で攪拌した後、４０℃で１２時間攪拌した。反応終了後、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸を０．０５Ｌ加え、酢酸エチルにより抽出し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：５）で分離精製することで、純粋な３－オキソヘキサンジカルボン酸ジメチルエステル１３．１ｇを得た。収率７０％。
　得られた３－オキソヘキサンジカルボン酸ジメチルエステル１０ｇ（０．０５ｍｏｌ）にメタノール０．１Ｌ（国産化学株式会社製）を加え、攪拌しながら５ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液０．０２Ｌを添加し、室温で２時間攪拌した。反応終了後、５ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨ１に調整し、次いで、水素化ホウ素ナトリウム２．０ｇ（０．０５ｍｏｌ）（和光純薬株式会社製）を添加し、室温で２時間攪拌した。反応終了後、ロータリーエバポレーターで濃縮後、水で再結晶することで、純粋な３－ヒドロキシアジピン酸７．２ｇを得た。収率９５％。
　３－ヒドロキシアジピン酸の１Ｈ－ＮＭＲスペクトル：
１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）：δ１．７０（ｍ、１Ｈ）、δ１．８３（ｍ、１Ｈ）、δ２．４２（ｍ、４Ｈ）、δ４．０１（ｍ、１Ｈ）。
実施例１　　コハク酸を用いた３－ヒドロキシアジピン酸生産試験
微生物培養
　表１に示した微生物（いずれの微生物も微生物分与機関より購入。購入先は株名に記載。）の３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を調べた。トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アジピン酸０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ７からなる培地５ｍＬに、それぞれの微生物を一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。その培養液に１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムを加え、菌体を遠心分離したのち上清を完全に取り除くことで菌体を洗浄する操作を３回行ったのち、菌体を１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液０．５ｍＬを、コハク酸を炭素源とする以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で２０時間振とう培養した（本培養）。本培養液より菌体を遠心分離した上清を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した。
本培養の培地組成：
コハク酸２０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム２ｇ／Ｌ
リン酸カリウム１００ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．１２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン５．４ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．６６ｍｇ／Ｌ
酵母エキス０．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析
　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析は以下の条件で行った。
・ＨＰＬＣ：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：ＤＡＤ（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ　ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ　ネガティブモード。
　培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸の濃度は表１のとおりで、いずれの微生物も３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有することを確認することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例２　　３－ヒドロキシアジピン酸の製造例
　実施例１で３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する微生物であることが確認できたＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ　ＮＢＲＣ１０１２７２を、ＬＢ培地５ｍＬに一白金耳植菌し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前々培養）。前々培養液２ｍＬをトリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、アジピン酸０．５ｇ／Ｌ、ｐＨ７からなる培地１００ｍＬに添加し、十分懸濁するまで３０℃で振とう培養した（前培養）。前培養液を２００ｍＬの０．９％塩化ナトリウムで実施例１と同様に３回洗浄したのち、菌体を１０ｍＬの０．９％塩化ナトリウムに懸濁した。懸濁液１０ｍＬを実施例１と同様のコハク酸を炭素源とする本培養の培地１００ｍＬに添加し、３０℃で２０時間振とう培養した（本培養）。本培養液より菌体を遠心分離した上清を、実施例１と同様にＬＣ－ＭＳ／ＭＳにて分析した結果、培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸の濃度は１８ｍｇ／Ｌであった。
　次に本培養の上清を減圧濃縮し、３－ヒドロキシアジピン酸の濃度が１６０ｍｇ／Ｌの濃縮液を１１ｍＬ得た。この濃縮液を、分取装置を連結したＨＰＬＣに注入し、３－ヒドロキシアジピン酸の標品と一致する溶出時間の画分を採取した。この作業を１０回繰り返し、培養液中の不純物が除去された３－ヒドロキシアジピン酸水溶液を得た。なお、３－ヒドロキシアジピン酸の採取に用いた分取ＨＰＬＣは以下の条件にて行った。
ＨＰＬＣ：ＳＨＩＭＡＤＺＵ　２０Ａ（株式会社島津製作所製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ　ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ２５０ｍｍ、内径１０ｍｍ、粒径４μｍ
移動相：５ｍＭ　ギ酸水溶液／アセトニトリル＝９８／２
流速：４ｍＬ／分
注入量：１ｍＬ
カラム温度：４５℃
検出器：ＵＶ－ＶＩＳ（２１０ｎｍ）
分取装置：ＦＣ２０４（Ｇｉｌｓｏｎ社製）。
　続いて３－ヒドロキシアジピン酸水溶液を減圧濃縮し、１．４ｍｇの結晶を得た。結晶を１Ｈ－ＮＭＲで分析した結果、得られた結晶が３－ヒドロキシアジピン酸であることを確認できた。
比較例１　　３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有さない微生物
　表２に示した微生物の３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を確認するべく、実施例１と同様の条件で微生物培養し、３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析をした結果、培養上清中に３－ヒドロキシアジピン酸は検出されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
比較例２　　炭素源を添加しない培養
　表１に示した微生物を、コハク酸を含まない組成の培地を用いた他は実施例１と同様の条件で培養し、３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析をした結果、培養上清中に３－ヒドロキシアジピン酸は検出されなかった。本結果より、実施例１で定量できた３－ヒドロキシアジピン酸はコハク酸が微生物により代謝された結果生成したものであることを確認できた。
実施例３　　様々な微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸生産試験
　表３に示した微生物（いずれも微生物分与機関より購入。購入先は株名に記載。）を対象に、誘導物質として、前培養培地にフェルラ酸、ｐ－クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールをそれぞれ２．５ｍＭとなるように添加した以外は実施例１と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
グリセロール１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
　培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析を行った結果をそれぞれ表３に示す。これらの結果から、いずれの微生物も３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有することを確認することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003







Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　実施例４　　誘導物質を添加しない３－ヒドロキシアジピン酸生産試験
　表４に示した微生物を対象に、実施例３で用いた誘導物質を添加しなかった以外は実施例３と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。
コハク酸１０ｇ／Ｌ
グルコース１０ｇ／Ｌ
硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ
リン酸カリウム５０ｍＭ
硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ
硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ
硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ
塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ
塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ
Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ
酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ
ｐＨ６．５。
培養上清中の３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析をした結果をそれぞれ表４に示す。
これらの結果から、表４に示した微生物は誘導物質を添加せずに前培養を行った場合でも３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有することを確認することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例５　　ｐ－クマル酸又はフェルラ酸を誘導物質として用いた３－ヒドロキシアジピン酸生産試験
　表５に示した微生物を対象に、実施例３で誘導物質として前培養培地に添加した物質の中から、ｐ－クマル酸又はフェルラ酸をそれぞれ０．５ｍＭとなるように添加した以外は実施例４と同様の条件で前培養および菌体洗浄を行った。洗浄後の懸濁液０．５ｍＬを以下に示した組成の培地５ｍＬに添加し、３０℃で４８時間振とう培養した。培養上清中の３－ヒドロキシアジピン酸の定量分析をした結果をそれぞれ表５に示す。これらの結果から、ｐ－クマル酸又はフェルラ酸のみを誘導物質として前培養培地に添加した場合でも、添加しなかった場合と比べて、３－ヒドロキシアジピン酸の生産量が向上することがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本発明によれば、微生物を利用して３－ヒドロキシアジピン酸を製造することができる。得られた３－ヒドロキシアジピン酸は各種ポリマー原料として利用することができる。

Claims (19)

  1. 　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物、Ｈａｆｎｉａ属微生物、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物、Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物およびＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物からなる群から選択される、３－ヒドロキシアジピン酸の生産能を有する少なくとも１種類の微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸の製造方法。
  2. 　前記微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物、Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属微生物からなる群から選択される少なくとも１種である請求項１記載の方法。
  3. 　前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉである、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属微生物が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓである、請求項１又は２記載の方法。
  5. 　前記Ｈａｆｎｉａ属微生物が、Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉである、請求項１記載の方法。
  6. 　前記Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍである、請求項１記載の方法。
  7. 　前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ属微生物が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍａｇａｔｅｒｉｕｍまたはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｒｏｓｅｕｓである、請求項１記載の方法。
  8. 　前記Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属微生物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅｕｓである、請求項１記載の方法。
  9. 　前記Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属微生物が、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒまたはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｏｘａｌａｔｉｃｕｓである、請求項１又は２記載の方法。
  10. 　前記Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属微生物が、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｂａｙｌｙｉまたはＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓである、請求項１又は２記載の方法。
  11. 　前記Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属微生物が、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｅｃａｌｉｓである、請求項１又は２記載の方法。
  12. 　前記Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属微生物が、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ　ａｌｂｕｓである、請求項１記載の方法。
  13. 　前記Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属微生物が、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｎｕｍである、請求項１記載の方法。
  14. 　前記Ｄｅｌｆｔｉａ属微生物が、Ｄｅｌｆｔｉａ　ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓである、請求項１又は２記載の方法。
  15. 　前記Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属微生物が、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ　ｂｌａｔｔａｅである、請求項１又は２記載の方法。
  16. 　前記Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属微生物が、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅである、請求項１記載の方法。
  17. 　前記Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属微生物が、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒである、請求項１記載の方法。
  18. 　前記微生物を培養する培地が、糖類、コハク酸、２－オキソグルタル酸およびグリセロールからなる群から、選択される少なくとも１種の炭素源を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　前記微生物を、フェルラ酸、ｐ－クマル酸、安息香酸、ｃｉｓ，ｃｉｓ－ムコン酸、プロトカテク酸およびカテコールからなる群から選択される少なくとも１種の誘導物質を含む培地で培養する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
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