WO2016201536A1 - Processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato de soja em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação e/ou aplicação enzimatica, composição assim obtido e uso - Google Patents

Processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato de soja em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação e/ou aplicação enzimatica, composição assim obtido e uso Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a process of biotransformation of water soluble soybean extract phenolic compounds into high yield, high yield bioactive isoflavones; composition thus obtained and use.
  • the present process has application in the biotechnology area, mainly for the food industry, as food ingredient, and industry of nutricosmetics and dietary supplements.
  • the main application of the present invention is the biotransformation of water soluble soybean extract (EHS) phenolic compounds to obtain product rich in bioactive compounds.
  • EHS water soluble soybean extract
  • the purpose is to increase the content of bioactive isoflavones (agiicones) and to produce equol in soybean extract through the application of starter cultures and probiotic lactic bacteria in the fermentation of EHS, allied to the action of crude tanase extract obtained from Paecilomyces variotti.
  • the present invention provides a composition in the form of a food ingredient which contains high bioavailable bioactive isoflavones and equol content.
  • US8765445B2 relates to a process employing Lactobacillus strains in the process for producing product for direct consumption, it is noted that this process is already in the commercial phase.
  • WO2012033150 relates to the production of equol by fermentation in complex fermentation medium with addition of daizein in kinda gaseous.
  • the process uses the Streptococcus strain. This document teaches that the use of hydrogen in fermentation increases equol production.
  • the process according to this document is suitable for industrial production, obtaining high yield of isoflavones.
  • US20120094336 describes the production of equol without racemic mixing by chemical synthesis. Describes synthesis by specific chemical catalysts for the production of the preferred type S isomer.
  • US201 10189134 describes the production of a fermented soy milk-based beverage, with the addition of live Lactobacillus to produce equol during the shelf life of the product.
  • the process according to the teachings of this document is already on an industrial scale. It is also noted that the addition of ascorbic acid to maintain production is described.
  • JP201 1083273 describes a process for producing soy isoflavones and equol by fermentation using Lactoccoccus isolated from the Japanese ekuoru product.
  • the process according to this document uses lactic acid bacteria (Lactococcus garviaes).
  • US2013231291 describes the production of isoflavone extract, equol and lunasil peptide by fermentation using isolated lactic acid bacteria. The process according to this document focuses on the use in cosmetics.
  • Patent document CN102021 130 describes the use of Clostridium bifermentans zx-7 for the production of equol by fermentation.
  • Patent document TW20071221 1 discloses the production of equol with a collection of intestinal flora microorganisms found in the human intestinal flora.
  • Patent document CN104031875 discloses the production of equol by genetically modified bacteria from Lactococcus.
  • the enzyme according to the present invention was extracted from GRAS fungus, which can be used in food.
  • the present invention has been the development of in vitro biotechnological processes capable of biotransforming isoflavones into their bioactive forms and increasing the water soluble soybean extract equol content by fermentation of this substrate by priming bacteria and probiotic lactic acid bacteria and application of the same.
  • tanase enzyme obtained from Paecilomyces variotti; composition thus obtained and use in the food industry as a food ingredient and in the nutricosmetics and dietary supplements industry.
  • Soy products are a way to include bioactive substances such as isoflavones in the diet, and water soluble soy extract (EHS) is a substrate that has been shown to have potential for the production of novel foods with healthy appeal.
  • EHS water soluble soy extract
  • the process was developed. described in this document. It was investigated the application of probiotic starter cultures and lactic acid bacteria in the fermentation of the EHS, allied to the action of the crude tanase enzyme extract obtained from the fungus Paecilomyces var ⁇ otti. In addition, the biotransformation of phenolic compounds and antioxidant activity of the obtained product was also evaluated.
  • Total phenol content was evaluated by Folin-Ciocalteau reagent-based methodology, antioxidant activity by in vitro ORAC and DPPH radical sequestration methods and specificity of semipurified tanase extract against commercial isfolavone standards as well as how changes in the phenolic profile of water soluble soybean extract were evaluated by HPLC-DAD. After the fermentative process and / or enzymatic treatment of soybean water soluble extract, there was a significant increase in the total phenolic content and antioxidant capacity, by both tested methods (ORAC and DPPH), when compared with the EHS control without reaction.
  • Figure 1 shows HPLC-DAD chromatograms of the reaction of the glycosylated isoflavone (A) daidzine and (B) genistin standards with Paecilomyces variotii tannase semipurified extract at 40 s C for 30 minutes.
  • Figure 2 shows HPLC-DAD chromatograms of (A) standard EHS, (B) fermented EHS, ⁇ C ⁇ fermented EHS reacted with 1.8 U tannase and (D) standard EHS reacted with 1.8 U tannase at 40 ° C for 30 minutes.
  • the present invention relates to the process of biotransforming phenolic compounds from soluble soybean extract to obtain equol rich product and bioactive isoflavones by fermentation with starter bacteria and probiotic lactic acid bacteria and application of the tanase enzyme; composition thus obtained and use.
  • the process can utilize biotransformation forms which comprise applying strains of starter bacteria and probiotic lactic acid bacteria and / or reacting with the Paecilomyces variotti tannase enzyme in soybean water soluble.
  • the process comprises the following steps:
  • Process 1 Fermentative Biotransformation: Starter Bacteria Streptococcus ssp. Thermophilus (YF-L81 1) and Lactobacillus delbruecki ssp. Bulgaricus (LB-340) and Lactic Acid Bacteria probiotic Bifidobacterium animales ssp. Laciis (Bb-12) and Lactobacillus acidophillus (LA-05);
  • ii Incubate the cultures with EHS obtained in (i) from 30 to S 40 C, preferably at 37 5 C for 10 to 24 hours, preferably 12 hours, under anaerobic conditions; iii. Inoculate in a solution obtained from (ii) with 1 to 5 U tanase, preferably 1.8 U tanase, per ml fermented EHS (ii);
  • EHS inoculum obtained in (I) with 1 to 5 U tanase, preferably 1.8 U tanase, per 1 ml EHS (I); ii. Incubate the solution (i) from 35 to 45 DEG C, preferably 40 Q C for 20 to 50 minutes, preferably 30 minutes; and
  • compositions obtained from the described process comprise the characteristics according to the type of biotransformation according to table 1 below and have application in the food industry, as a food ingredient, and the nutricosmetics and dietary supplements industry.
  • Water-soluble soy extract was prepared according to the methodology described by Mandarino and Carr ⁇ o-Panizzi (1999). We used soybeans (Glyc ⁇ ne max) from "Natu's” brand.
  • the enzyme tanase (E.C: 3.1.1.20), obtained from the microorganism Paecilomyces variotii, as described by Battestin and Macedo (2007a), was used in this study.
  • This process can be represented by the following steps:
  • the enzymatic activity measurement of the semipuritized tanase extract was performed according to the methodology proposed by Battestin & Macedo (2007b).
  • the substrate consisted of a 0.7% (w / v) tannic acid solution (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany) in acetate buffer (0.2 M, pH 5.5). To perform the reaction, the following steps were followed:
  • One unit of tanase activity was defined as the amount of hydrolyzed tannic acid per 1 mL enzyme per minute reaction.
  • Lyophilized commercial cultures (Christian Hansen Lab. Ind. And Com. Ltda.) Of starter cultures Streptococcus ssp. Thermophilus (YF-L811) and Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus (LB-340) and probiotic lactic acid bacteria Bifidobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) and Lactobacillus acidophillus (LA-05). All cultures were lyophilized reactivated individually in sterile water extract of soybeans 9 to 37 C for 12 hours under anaerobic conditions using an anaerobic jar.
  • Starter cultures were inoculated at a concentration of 1% (v / v) and probiotic lactic acid bacteria at a concentration of 5% (v / v), ensuring a minimum count of 10 6 - 10 7 log CFU / mL (Cruz et al ., 2013).
  • Fermented EHS samples were evaluated for chemical profile (total phenol content and HPLC) and antioxidant capacity (ORAC and DPPH).
  • Biotransformed EHS samples were evaluated for chemical profile (total phenol content and HPLC) and antioxidant capacity (ORAC and DPPH).
  • Unfermented EHS (1 mL) was inoculated with 1.8 U tanase at 40 ° C for 30 minutes. The hydrolysis process was stopped in an ice bath for 15 minutes. Biotransformed EHS samples were evaluated for chemical profile (total phenol content and HPLC) and antioxidant capacity (ORAC and DPPH).
  • the total phenolic content in the samples was determined with the Folin-Ciocalteu reagent (Contemporary Chemical Dynamics, Brazil) according to the method of Chandler and Doods (1983), with some modifications.
  • Total phenolic concentrations were determined by comparing the absorbance of the samples with a calibration curve using catechin as standard. Results were expressed in g catechin per ml sample.
  • Glycosidic isoflavones (daidzine and genistine), aglycones (daidzein and genistein) and equol were identified and quantified in all samples by HPLC-DAD.
  • the chromatographic conditions used were previously described by Park et al. (2001).
  • the equipment used was Dionex Ulitmate 3000 (Germany) equipped with a Atlantis® C18 column (Waters, 5 ⁇ , 4.6 x 150 mm) maintained at 30 C. 9 Detection was performed using a UV diode array detector / VIS (DAD-3000).
  • the mobile phases consisted of deionized water (solvent A) and methanol (solvent B).
  • the elution gradient was as follows: 20% B (0-15 min), 20-80% B (15-75min), 80-100% B (75-80min), 100-20% B (80-90 min) ) and 20% B (90-95 min) with a flow rate of 0.5 mL / min.
  • the sample injection volume was 20 ⁇ _ and all samples were analyzed in triplicate. The spectra were obtained between 190 and 480 nm and the chromatograms processed at 254 nm.
  • Isoflavonoids were individually identified by comparing their retention times and the spectrum of their patterns: daidzine, genistine, daidzein, genistein and equol. Individual quantification of isfolavonoids was performed by integrating peak areas using calibration curves that were established within the concentration range of 0.01 -1.0 mg / mL of the isoflavones and equol standards. Results were expressed as of each phenolic compound per mL of sample.
  • Biotransformed soybean extract polyphenols antioxidant activity
  • Oxygen radical absorption capacity (ORAC)
  • the determination of antioxidant capacity by the ORAC method was performed according to the methodology described by Macedo et al. (201 L), using fluorescein (FL) as a flag.
  • the automated ORAC test was performed on a Fluostar Optimal Microplate Reader (Fluostar Optima - Labtech BMG, Germany) with fluorescence filters for an excitation wavelength of 485 nm and emission of 520 nm. Measurements were performed on Costar® opaque black plates (Corning Costar Corporation, Cambridge, USA) with 96 wells.
  • ORAC values were defined as the difference between the area under the FL and blank decay curve (net AUC). Regression equations between net AUC and antioxidant concentration were calculated for all samples. A tanase control was performed as a regular sample, and the obtained ORAC value was subtracted from the samples treated with this enzyme. ORAC-FL values were expressed in pmol equivalent of Trolox / L soybean extract.
  • the antioxidant activity potential of fermented and unfermented water-soluble soybean extract was also assessed by stable free radical sequestration activity 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), as described by Macedo et al. (201 l).
  • DPPH stable free radical sequestration activity 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl
  • Results were expressed as arithmetic means and standard deviations. Statistical significance of differences between groups was analyzed by Tukey test. Differences were considered significant when p ⁇ 0.05.
  • Process 3 showed the largest increase in total phenolic content (101-847 Mg catechin / mL), an increase of about 8.4-fold after the reaction of EHS with the enzyme tanase.
  • Soybeans and soy-based products are nutritionally rich foods and have various phytochemicals (isoflavones, phytosterols, saponins, phenolic acids, phytic acid and trypsin inhibitors) that have functional, antioxidant and free radical scavenging properties ( Wardhani, Vázquez, and Pandiellaa, 2010). Soybean phenolic compounds have free radical scavenging activity (Shon et al., 2007), which may explain the correspondence between the increase in total phenolic content with antioxidant activity shown in table 2.
  • the results of the present invention indicate a trend towards increased total phenolic content after the three proposed bioprocesses. This trend was similar to that observed for antioxidant activity by both the ORAC and DPPH methods, supporting the results obtained by the microbial and enzymatic biotransformation of the EHS.
  • glycosidic isoflavones were the predominant forms in standard and fermented EHS.
  • concentrations of fermented EHS genistin and daidzine glycosides (process I) decreased by about 1, 6 and 2 times, respectively, and the daidzein and genistein algicones increased by 3.5 and 5 times, respectively, when compared with standard EHS. Therefore, these results suggest that glycosylated isoflavones were transformed into aglycone forms as a result of the fermentation process. According to Duenas et al. (2012), This may be due to the ⁇ -glycosidase activity inherent in the microorganisms used in the fermentation process.
  • glycosidic forms (daidzine and genistine) were not identified, showing that these forms were converted to their respective aglycone forms, as shown by a significant increase in levels. of daidzein and genistein after these bioprocesses.
  • Concentrations of the fermented EHS aglycone forms after process II increased significantly about 28-fold (25.6 - 717.2 mg / mL) for daidzein and 25-fold (10.2-251.4 mg). / mL) for genistein compared to standard EHS.
  • the aglycone forms increased significantly, compared to standard EHS, by 37-fold (25.6 - 944.5 mg / mL) for daidzein and 32-fold (10.2 - 321.6 mg / mL) for daidzein. the genistein.
  • Isoflavones aglycones have been reported to exhibit greater bioactive function than glycosidic forms (Cederroth, and Nef, 2009; Setchell, 1998). Therefore, aglycones are primarily responsible for the antioxidant activity of soy-based foods, although other soy components such as phenolic compounds may also contribute to antioxidant capacity to some extent (Cheng, Lin, and Liu, 201 1).
  • FIG. 1 shows the chromatograms obtained after 30 minutes of feed at 40 ° C, in which commercial standards of daidzine (A) and genistein (B) were reacted with P. variotti tannase semipurified extract. also retention times and absorption spectra of reaction products are shown.
  • Figure 2 shows the chromatographic profile of the general composition of standard EHS (A) and lactic acid bacteria fermented EHS (B) as well as fermented EHS (C) and unfermented EHS (D) polyphenols. treated with 1.8 U of semi-purified tannase extract.
  • A standard EHS
  • B lactic acid bacteria fermented EHS
  • C fermented EHS
  • D unfermented EHS
  • Isoflavone-rich soy protein isolate attenuates bone loss in the lumbar spine of perimenopausal women, American Journal of Clinical Nutrition, 72 (3), 844-852.

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Abstract

A presente invenção refere-se a um processo de biotransformação de compostos fenólicos de extrato hidrossolúvel de soja em isoflavonas bioativas e equol com alto rendimento e alta produção para aplicação na área biolecnológica, principalmente para a Indústria alimentícia. A Invenção foi capaz de biotransformar as formas glicosiladas (daidzina e genistina) das Isoflavonas em suas respectivas formas agllconas (daldzeína e genlsteína) através de fermentação do extrato hidrossolúvel de soja com culturas Iniciadoras e bactérias lácticas probióticas e/ou tratamento do referido extrato com a enzima tanase obtida de Paecilomyces variotti. Em uma de suas concretizações, a presente invenção resulta em um processo in vitro para a obtenção de equol bioativo, sem a presença de bactérias intestinais, utilizando apenas biotransformação enzimática.

Description

"PROCESSO DE BIOTRANSFORMAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS DO EXTRATO DE SOJA EM EQUOL E ISOFLAVONAS BIOATIVAS ATRAVÉS DE FERMENTAÇÃO E/OU APLICAÇÃO ENZIMÁTICA,
COMPOSIÇÃO ASSIM OBTIDO E USO"
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a um processo de biotransformação de compostos fenólicos de extrato hidrossolúvel de soja em isoflavonas bioativas e equol com alto rendimento e alta produção; composição assim obtido e uso.
[002] O presente processo tem aplicação na área biotecnológica, principalmente para a indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutrícosméticos e suplementos dietéticos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[003] A principal aplicação da presente invenção consiste na biotransformação de compostos fenólicos de extrato hidrossolúvel de soja (EHS) para obtenção de produto rico em compostos bioativos. O propósito é aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas (agiiconas) e produzir equol em extrato de soja através da aplicação de culturas iniciadoras e bactérias lácticas probióticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extrato bruto de tanase obtido a partir de Paecilomyces variotti.
[004] A presente invenção proporciona uma composição sob a forma de um ingrediente alimentício, o qual contém alto teor de isoflavonas bioativas e equol biodisponíveis.
[005] Outro possível uso é o da bioatividade do extrato hidrossolúvel de soja antes e após biotransformação com o extrato semipurificado de tanase de P. varíotii para modelos anti-inflamatórios e de quimioprevénção.
[006] Além disso, também é interessante a atuação do extrato semipurificado de tanase de P. varíotii em outras classes de flavonoides glicosilados em alimentos com grande quantidade de flavonoides na forma glisocilada.
[007] O documento de patente US8765445B2 refere-se a um processo empregando cepas de Lactobacillus no processo para produção de produto para consumo direto, ressaltando-se que este processo já se encontra em fase comerciai.
[008] O documento de patente WO2012033150 refere-se à produção de equol por fermentação em meio de fermentação complexo com adição de daizeina em meio gasoso. O processo usa a cepa de Streptococcus. Este documento ensina que o uso de hidrogénio na fermentação aumenta a produção de equol. O processo de acordo com este documento é adequado para produção industrial, obtendo-se alto rendimento de isoflavonas.
[009] O documento de patente US20120094336 descreve a produção de equol sem mistura racêmica, por síntese química. Descreve a síntese por catalisadores químicos específicos para produção do isômero preferencial de tipo S.
[0010] O documento de patente US201 10189134 descreve a produção de uma bebida fermentada à base de leite de soja, com adição de Lactobacillus vivos para produzir equol durante o tempo de prateleira (shelf life) do produto. O processo de acordo com os ensinamentos deste documento já se encontra em escala industrial. Destaca-se, ainda, que a adição de ácido ascórbico para a manutenção da produção é descrita.
[001 1] O documento de patente JP201 1083273 descreve um processo de produção de isoflavonas de soja e equol por fermentação utilizando Lactoccoccus isolados do produto japonês ekuoru. O processo de acordo com este documento se vale do uso de bactérias lácticas (Lactococcus garviaes).
[0012] O documento de patente US2013231291 descreve a produção de extrato de isoflavonas, equol e lunasil peptideo por fermentação utilizando bactérias lácticas isoladas. O processo de acordo com este documento tem como foco o uso em cosméticos.
[0013] O documento de patente CN102021 130 descreve o uso de Clostrídium bifermentans zx-7 para a produção de equol por fermentação.
[0014] O documento de patente TW20071221 1 revela a produção de equol com uma coleção de microorganismos da flora intestinal encontrados na flora intestinal humana.
[0015] O documento de patente CN104031875 traz a produção de equol por bactéria modificada geneticamente a partir de Lactococcus.
[0016] Ressalta-se que os processos descritos no estado da técnica são, em majoritariamente baseados em processos fermentativos, utilizando cepas de Lactobacillus (bactérias entéricas) diferentes, isoladas ou em grupos. Alguns dos documentos fazem a fermentação com os meios de cultivo sintéticos, adicionando o precursor de equol daizeina, outros formulam o meio de cultivo com leite de soja, estratégia também utilizada na presente invenção. [0017] Já a presente invenção se vale de processos distintos que são diferentes dos anteriormente descritos no estado da técnica. Um deles utiliza uma mistura de Lactobacillus (estratégia também utilizada no estado da técnica), com o diferencial de utilizar uma enzima isolada de fungo à tanase, um efeito técnico novo e inventivo.
[0018] Em um dos processos de acordo com a presente invenção utiliza-se somente um tratamento enzimático, outro efeito técnico novo e inventivo. Destaca-se que o preparado enzimático de acordo com a presente invenção (de fungo, outro efeito aspecto inovador) não é purificado e possui tanto enzimas conhecidas quanto ainda desconhecidas. Este é um processo novo, não tendo sido encontrado qualquer relato ou sugestão neste sentido no estado da técnica.
[0019] A enzima de acordo com a presente invenção foi extraída de fungo GRAS, que pode ser usado em alimentos.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0020] O presente invento consistiu no desenvolvimento de processos biotecnológicos in vitro capazes de biotransformar as isoflavonas em suas formas bioativas e aumentar o teor de equol em extrato hidrossolúvel de soja através da fermentação deste substrato por bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e aplicação da enzima tanase, obtida a partir de Paecilomyces variotti; composição assim obtido e uso na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.
[0021] Após os processos de biotransformação, obteve-se um ingrediente alimentar derivado de soja que apresentou grande teor de isoflavonas bioativas e equol, demonstrando, assim, que os processos biotecnológicos desenvolvidos consistiram em estratégias eficientes para melhorar o potencial bioativo do extrato de soja e demonstraram um potencial de aplicação do equol como agente nutracêutico para populações não produtoras deste isoflavonoide.
[0022] Produtos à base de soja são uma forma de incluir substâncias bioativas como as isoflavonas na dieta, sendo que o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) é um substrato que tem se apresentado com potencial para produção de novos alimentos com apelo saudável. Desse modo, com o propósito de aumentar o conteúdo de isoflavonas bioativas e avaliar a viabilidade de um processo biotecnológico para produção de equol in vitro, foi desenvolvido o processo descrito neste documento. Foi investigada a aplicação de culturas iniciadoras e bactérias lácticas probióticas na fermentação do EHS, aliado à ação do extraio bruto de enzima tanase obtido a partir do fungo Paecilomyces varíotti. Além disso, também foi avaliada a biotransformação dos compostos fenólicos e atividade antioxidante do produto obtido. O teor de fenóis totais foi avaliado por metodologia baseada na reação com o reagente de Folin-Ciocalteau, a atividade antioxidante pelos métodos in vitro ORAC e de sequestro de radicais DPPH e a especificidade do extrato semipurificado de tanase frente aos padrões comerciais de isfolavonas, bem como as alterações no perfil fenólico do extrato hídrossolúvel de soja foram avaliadas por CLAE-DAD. Após o processo fermentativo e/ou tratamento enzimático do extrato hídrossolúvel de soja, houve um significativo aumento no teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante, por ambos métodos testados (ORAC e DPPH), quando comparados com o controle de EHS sem reação. Além disso, foi verificada uma modificação no perfil polifenólico das amostras de EHS biotransformadas obtido por CLAE-DAD, resultando em um aumento na concentração das formas agliconas em relação às glicosiladas, bem como o aumento da concentração de equol após os processos de biotransformação propostos. Os resultados obtidos, indicam que o extrato de tanase de P. variotty foi capaz de biotransformar as formas glicosiladas (daidzina e genistina) das ísoflavonas em suas respectivas formas agliconas (daidzeína e genisteína). Pelo que se tem conhecimento, a hidrólise de isoflavonóides glicosilados por tanase, bem como a formação de equol, é um relato inédito na literatura demonstrando que é possível desenvolver um processo in vitro para a obtenção deste composto bioativo, sem a presença de bactérias intestinais, utilizando apenas uma biotransformação enzimática.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS.
A Figura 1 apresenta cromatogramas obtidos por HPLC-DAD da reação dos padrões de isoflavonas glicosiladas (A) daidzina e (B) genistina com extrato semipurificado de tanase de Paecilomyces variotii a 40s C por 30 minutos.
A Figura 2 apresenta cromatogramas obtidos por HPLC-DAD do (A) EHS padrão, (B) EHS fermentado, {C} EHS fermentado reagido com 1 ,8 U de tannase e (D) EHS padrão reagido com 1 ,8 U de tannase a 40° C por 30 minutos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0023] A presente invenção refere-se ao processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato solúvel de soja para obtenção de produto rico em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação com bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e aplicação da enzima tanase; composição assim obtido e uso. Para tanto, o processo pode utilizar formas biotransformação que compreendem na aplicação de cepas de bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e/ou reação com a enzima tanase de Paecilomyces variotti em hidrossolúvel de soja.
[0024] O processo compreende as etapas descritas a seguir:
A. Macerar os grãos de soja íntegros a temperatura ambiente em água destilada (grãos de soja água; 1 :3 p/v);
B. Descartar a agua utilizada para maceração;
C. Adicionar agua destilada;
D. Aquecer os grãos em água entre 90 a 1 10QC, preferencialmente a 100°C, (grãos de soja/água; 1 :2 p/v) por 3 a 10 minutos, preferencialmente 5 minutos;
E. Adicionar agua destilada
F. Triturar os grãos de soja com água destilada (grãos de soja/água; 1 :4 P/v);
G. Centrifugar a massa obtida entre 9000 a 10000 x g, preferencialmente 9630 x g, por 10 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos a temperatura ambiente (±255C);
H. Aquecer o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) até ebulição entre 96 9C e 1009C por 10 a 15 minutos, preferencialmente 0 minutos;
I. Esterilizar por aquecimento a temperatura de 121 °C, durante 15 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos;
a. Manter o extrato hidrossolúvel de soja estéril sob refrigeração a 4 a 12QC, por até 10 dias, ou congelar o extrato a -80QC até sua utilização;
J. Realizar os processos de biotransformação do extrato hidrossolúvel de soja que podem ser realizados por qualquer uma das seguintes formas:
Processo 1 - Biotransformação fermentativa: Bactéria iniciadoras Streptococcus ssp. Thermophilus (YF-L81 1 ) e Lactobacillus delbrueckíi ssp. Bulgaricus (LB-340) e bactérias ácido lácticas probióticas Bifidobacterium animales ssp. Laciis (Bb-12) e Lactobacillus acidophillus (LA-05);
i. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 a 15% (v/v), preferencialmente 5% (v/v), e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/mL no EHS obtido em (I); e
ii. Incubar a solução obtida em (i) entre 30 e 40eC, preferencialmente a 379C, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose;
Processo 2 - Biotransformação fermentativa seguida por enzimática
i. Inocularas culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 - 15% (v/v), preferencialmente a 5% (v/v), e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/mL no EHS obtido em (I);
ii. Incubar ao EHS com as culturas obtida em (i) entre 30 e 40SC, preferencialmente a 375C, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose; iii. Inocular em solução obtida em (ii) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por ml de EHS fermentado (ii);
iv. Incubar a solução de (iii) entre 35 a 45°C, preferencialmente 40gC, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e v. Incubar a solução de (iv) entre -2 a 2°C, preferencialmente 0QC (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente 15 minutos;
Processo 3 - Biotransformação enzimática
i. Inocular em EHS obtida em (I) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por 1 ml de EHS (I); ii. Incubar a solução em (i) entre entre 35 a 45°C, preferencialmente 40QC, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e
íii. Incubar a solução de (ii) entre -2 a 2°C, preferencialmente
09C (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente
15 minutos;
K. Manter o produto EHS com isoflavonas bioativas e equol congelado a - 809C.
[0025] As composições obtidas do processo descrito compreendem as características segundo o tipo de biotransformação conforme a tabela 1 abaixo e têm aplicação na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.
Tabela 1 : Composições obtida a partir do processo descrito
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Exemplificação
Preparo do extraio hidrossolúvel de soja
[0026] O extrato hidrossolúvel de soja foi preparado de acordo com metodologia descrita por Mandarino e Carrão-Panizzi (1999). Foram utilizados grãos de soja (Glycíne max) da marca "Natu's".
[0027] O processo pode ser representado pelas etapas a seguir:
1. Macerar os grãos de soja íntegros por 6 horas a temperatura ambiente em água destilada em água destilada (grãos de soja/água; 1 :3 p/v).
2. Descartar a agua utilizada para maceração 3. Ferver grãos em água (grãos de soja/água; 1 :2 p/v) por cinco minutos.
4. Triturar os grãos de soja com auxílio de liquidificador, com água destilada (grãos de soja/água; 1 :4 p/v) por 3 minutos.
5. Centrifugar a massa obtida a 9630 x g por 15 minutos a temperatura ambiente.
6. Aquecer o sobrenadante obtido, conhecido como extrato hidrossolúvel de soja, até ebulição por 10 minutos.
7. Distribuir o extrato de soja em frascos e esterilizar por aquecimento a 121 °C durante 15 minutos.
8. Manter o extrato hidrossolúvel de soja estéril sob refrigeração até sua utilização nas análises.
Obtenção de extrato semipuríficado de tanase
[0028] A enzima tanase (E.C: 3.1.1.20), obtida a partir do microorganismo Paecilomyces variotii, como descrito por Battestin e Macedo (2007a), foi utilizada neste estudo.
Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir:
a) Adicionar, em erlenmeyers de 250 ml_, 10 g de farelo de trigo (Natu's, Hortolândia, Brasil), 10 mL de água destilada e 10% de ácido tânico (p/p) (Tanal B, Prozyn BioSolution, São Paulo, Brasil)
b) Esterilizar o meio de cultura a 121 QC por 15 minutos.
c) Inocular 2,5 mL (5,0x107 esporos/mL) da suspensão de pré-inóculo em água destilada
d) Incubar o meio a 30-C por 120 horas.
e) Adicionar 80 mL de tampão acetato (20 mM, pH 5,0) ao meio.
f) Agitar o meto a 200 rpm por 1 hora.
g) Filtrar a solução final e centrifugar a 9630 x g por 30 minutos a 4QC (Centrífuga Beckman J2-2 , Beckman-Coulter, INC Fullerton, CA, USA). h) Adicionar, ao sobrenadante, sulfato de amónio (Ecibra, Santo Amaro, São Paulo, Brasil) em concentração final de 80% de saturação (561 g/L). i) Manter sob refrigeração por 12 horas a 49C.
j) Recolher o precipitado formado por centrifugação a (9630 x g por 30 minutos) e ressuspender o mesmo em água destilada
k) Dialisar por 48 horas em água destilada. 1) Congelar a -18°C e liofilizar, em liofilizador de bancada (Liotop L101 , Liobras Ind. Com. Serv. Liofilizadores Ltda., São Carlos, São Paulo, Brasil), durante 24 horas,
m) Manter o extrato semipuriíicado liofilizado a -18gC.
Determinação de atividade enzimática
[0029] A medida de atividade enzimática do extrato semipuriíicado de tanase foi realizada de acordo com metodologia proposta por Battestin & Macedo (2007b). O substrato consistiu em uma solução de ácido tânico (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) 0,7% (p/v) em tampão acetato (0,2 M, pH 5,5). Para a realização da reação foram seguidos os seguintes passos:
a) Adicionar 0,3 ml_ da solução de substrato a 0,5 ml de extrato de enzima. b) Incubar a 60°C durante 10 minutos.
c) Paralisar a reação pela adição de 3 mL de uma solução de albumina de soro bovino (BSA) a 1 ,0 mg/mL preparada em solução de cloreto de sódio 0,17 M em tampão acetato (0,2 M, pH 5,0).
d) Filtrar e centrifugar a solução a 10.070 x g por 15 min a 4°C.
e) Dissolver o precipitado a 3 mL em SDS-triethanolamina
f) Adicionar 1 ml do reagente FeCI3.
g) Manter em repouso por 15 minutos para a estabilização da cor.
h) Medir a absorbância a 530 nm (Mondai, Banerjee, Jana, & Pati, 2001 ). i) Calcular a atividade enzimática por Abs530 = Abscontrole-Absteste.
Uma unidade de atividade de tanase foi definida como a quantidade de ácido tânico hidrolisado por 1 mL de enzima por minuto de reação.
Biotransformação enzimática dos isoflavonoides
[0030] Os padrões comerciais de isoflavonoides genistina, daidzina, genisteína e daidzeína (Sigma-Aldrich, Steinheim, Alemanha) foram utilizados como substrato para hidrólise enzimática por tanase isolada a partir de Paecilomyces variotti (Battestin & Macedo, 2007a).
[0031 ] Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir:
a) Dissolver 1 mg dos padrões de isoflavonoidess em 1 mL de tampão fosfato (pH 7,4, 75 mM).
b) Incubar a solução com 0,18U de tanase, por 30 minutos a 49C em banho termostatizado (modelo B12D, Micronal, São Paulo, Brasil).
c) Paralisar o processo de hidrólise em banho de gelo por 15 minutos. d) Avaliar, por HPLC-DAD, os produtos finais dos padrões de isoflavonoides.
Processos de biotransformação do extrato hidrossolúvel de soja
Processo 1 - Biotransformação fermentativa
[0032] Foram utilizadas culturas comerciais liofilizadas (Christian Hansen Lab. Ind. e Com. Ltda) de culturas iniciadoras Streptococcus ssp. Thermophilus (YF- L811 ) e Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus (LB-340) e bactérias ácido lácticas probióticas Bifidobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) e Lactobacillus acidophillus (LA-05). Todas as culturas liofilizadas foram reativadas, individualmente, em extrato hidrossolúvel de soja estéril a 379C por 12 horas em condições de anaerobiose utilizando uma jarra de anaerobiose. As culturas iniciadoras foram inoculadas na concentração de 1 % (v/v) e as bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5% (v/v), garantindo uma contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL (Cruz et al., 2013).
[0033] A fermentação do extrato hidrossolúvel de soja fermentado foi conduzida de acordo com metodologia tradicional (Tamime e Robinson, 2007) de acordo com as seguintes etapas:
a) Inocular, assepticamente, o extrato hidrossolúvel de soja estéril com o conteúdo total de cada cultura bacteriana reativada.
b) Incubar o EHS inoculado a 37QC por 24 horas em condições de anaerobiose utilizando uma jarra de anaerobiose.
As amostras do EHS fermentado foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH).
Processo 2 - Biotransformação fermentativa seguida por enzimática
[0034] O EHS fermentado (1 mL), obtido no processo 1 , foi inoculado com 1 ,8 U de tanase, a 40eC por 30 minutos. O processo de hidrólise foi paralisado em banho de gelo por 15 minutos.
[0035] As amostras do EHS biotransformadas foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH).
Processo 3 - Biotransformação enzimática
[0036] O EHS não fermentado (1 mL) foi inoculado com 1 ,8 U de tanase, a 40-C por 30 minutos. O processo de hidrólise foi paralisado em banho de gelo por 15 minutos. [0037] As amostras do EHS biotransformados foram avaliadas quanto ao perfil químico (teor de fenóis totais e HPLC) e capacidade antioxidante (ORAC e DPPH).
Avaliação do perfil químico
Teor cie fenóiicos totais
[0038] O teor de fenóiicos totais nas amostras foi determinado com o reagente Folin-Ciocalteu (Dinâmica Química Contemporânea, Brasil) de acordo com o método de Chandler and Doods (1983), com algumas modificações.
[0039] Este processo pode ser representado pelas etapas a seguir:
a) Diluir uma alíquota de 1 ml_ das amostras, na proporção de 1 :5, com metanol 70%.
b) Adicionar 5 ml_ de água destilada, seguido por 0,5 ml_ de reagente de Folin-fenol Ciacalteu 1 M (Dinâmica Química Contemporânea, Brasil). c) Agitar as amostras.
d) Manter em repouso por 5 minutos.
e) Adicionar 1 ml_ de solução de carbonato de sódio 5% (m/v) ao meio reacional de cada amostra.
f) Agitadas e incubar as amostras no escuro a temperatura ambiente por 1 hora.
g) Agitar novamente as amostras.
h) Realizar leitura das absorbâncias a 725 nm em espectrofotômetro (modelo DU®640, Beckman CoulterTM, EUA).
As concentrações de fenóiicos totais foram determinadas por comparação de absorbância dasamostras com uma curva de calibração utilizando catequina como padrão. Os resultados foram expressos em g de catequina por mL de amostra.
Análise dos isoflavonoides por HPLC
[0040] As isoflavonas glicosídicas (daidzina e genistina), agliconas (daidzeína e genisteína) e equol foram identificados e quantificados em todas as amostras por HPLC-DAD.
[0041 ] A extração dos isoflavonoides das amostras do extraio de soja foi realizada de acordo com metodologia proposta por Aguiar (2003), com modificações de acordo com as seguintes etapas: a) Misturar 1 ml_ das amostras dos extratos de soja biotransformados com 5 mL de metanol 70% a 25QC, por 60 minutos, a 100 rpm.
b) Centrifugar a mistura por 10 minutos a 5790 x g.
c) Filtrar o sobrenadante através de uma membrana de 0,45 μιη, antes de ser injetado num HPLC de fase invertida.
[0042] As condições cromatográficas utilizadas foram previamente descritas por Park et al. (2001 ). Foi utilizado o equipamento Dionex Ulitmate 3000 (Alemanha) equipado com uma coluna C18 Atlantis® (Waters, 5 μιη, 4,6 x 150 mm) mantida a 309C. A detecção foi realizada utilizando um detector de arranjo de díodos UV/VIS (DAD-3000). As fases móveis consistiram em água deionizada (solvente A) e metanol (solvente B). O gradiente de eluição foi o seguinte: 20% B (0-15 min), 20-80% B (15-75min), 80-100% B (75-80min), 100-20% B (80-90 min) e 20% B (90-95 min) com vazão de 0.5 mL/min. O volume de injeçâo de amostra foi de 20 μΙ_ e todas as amostras foram analisadas em triplicata. Os espectros foram obtidos entre 190 e 480 nm e os cromatogramas processados a 254 nm.
[0043] Os isoflavonoides foram identificados individualmente por comparação dos seus tempos de retenção e o espectro dos seus padrões: daidzina, genistina, daidzeína, genisteína e equol. A quantificação individual dos isfolavonoides foi realizada por integração das áreas dos picos utilizando curvas de calibração que foram estabelecidas no intervalo de concentração de 0,01 -1 ,0 mg/mL dos padrões de isoflavonas e equol. Os resultados foram expressos em de cada composto fenólico por mL de amostra.
Atividade antioxidante dos polifenóis do extrato de soja biotransformado
Capacidade de absorção do radical oxigénio (ORAC)
[0044] A determinação da capacidade antioxidante pelo método do ORAC foi realizada conforme metodologia descrita por Macedo et al. (201 1 ), utilizando fluoresceína (FL) como sinalizador. O teste automatizado de ORAC foi realizado em leitor de microplacas Fluostar Óptima (Fluostar Óptima - Labtech BMG, Alemanha) com filtros de fluorescência para um comprimento de onda de excitação de 485 nm e de emissão de 520 nm. As medidas foram realizadas em placas pretas opacas Costar® (Corning Costar Corporation, Cambridge, EUA) com 96 poços.
Antes da reação várias etapas de preparo das soluções devem ser seguidas: a) Decompor, a 37°C, o AAPH (2,2'-azinobis(2-amidinopropano) dihidrocloreto) em tampão fosfato (75 mM, pH 7,4). Obs: tal fato ocorre devido à sensibilidade da FL ao pH.
b) Preparar diariamente a solução de FL (70 nM), em tampão de fosfato (PBS) (75 mM, pH 7,4).
c) Armazenar no escuro.
d) Preparar (diariamente) em PBS uma solução de Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8- tetrametilcromo-2-carboxylic acid) 75 μΜ (utilizada como padrão de referência).
e) Construir uma curva padrão de Trolox diluindo a solução de 1 ,5-1500 pmol/mL.
A reação foi realizada de acordo com as seguintes etapas:
a) Diluir 1 ml de cada amostra utilizando metanol 70% na proporção de 1 :5. b) Misturar, em cada poço, 120 pL de solução FL com 20 pL de amostra, branco (PBS) ou solução padrão (Trolox).
c) Adicionar 60 pL de AAPH (12 mM).
d) Realizar, em triplicata e a cada 6 minutos durante 87 minutos, a medida da fluorescência imediatamente após a adição do AAPH
[0045] Os valores de ORAC foram definidos como sendo a diferença entre a área sob a curva de decaimento de FL e do branco (net AUC). Equações de regressão entre net AUC e concentração de antioxidantes foram calculadas para todas as amostras. Um controle de tanase foi realizado como uma amostra regular, e o valor de ORAC obtido foi subtraído das amostras tratadas com esta enzima. Os valores de ORAC-FL foram expressos em pmol equivalente de Trolox/L de extrato de soja.
Sequestro dos radicais livres do DPPH
[0046] O potencial de atividade antioxidante do extrato hidrossolúvel de soja, fermentado e não fermentado, também foi avaliado pela atividade de sequestro do radical livre estável 1 ,1 -difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), como descrito por Macedo et ai. (201 1 ).
a) Preparar várias concentrações (0,01 -0,1 mg/mL em metanol 70% (v/v)) de amostras testadas.
b) Misturar 50 pL das amostras testes com 150 pL de DPPH 0,2 mM em metanol) em placas de 96 poços (BMG LABTECH 96, Alemanha), c) Realizar a leitura em um leitor de microplacas Fluostar Óptima (BMG Fluostar Óptima - Labtech, Alemanha) com filtros de absorção para um comprimento de onda de excitação de 520 nm.
[0047] O processo de decaimento da cor das amostras foi registado depois de 90 minutos de reação e comparado com um branco controle; para as amostras de cores e amostras tratadas com tanase, foi realizado um controlo adicional, que continha a solução de extrato (ou solução de tanase) e metanol puro, em vez de DPPH. As soluções foram preparadas e armazenadas no escuro. As medidas foram realizadas em triplicata e a atividade antioxidante foi calculada a partir da equação obtida por regressão linear determinada traçando a atividade antioxidante de soluções padrão de Trolox com concentrações conhecidas. A atividade antioxidante foi expressa em pmol equivalente de Trolox/L de extrato de soja.
Análises estatísticas
[0048] Os resultados foram expressos como médias aritméticas e desvios padrões. A significância estatística das diferenças entre os grupos foi analisada pelo teste de Tukey. As diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05.
Efeitos dos bioprocessos no teor de fenólicos totais e atividade antioxidante
[0049] Os efeitos da fermentação e/ou biotransformação enzimática no teor de fenólicos totais e atividade antioxidante do extrato hidrossolúvel de soja, medida pelos métodos do ORAC e DPPH, estão apresentados na Tabela 2. Diferenças significativas · (p <0,05) no teor de fenólicos totais, ORAC e DPPH foram encontradas em todos os bioprocessos.
Tabela 2. Teor de fenólicos totais e atividade antioxidante (ORAC e DPPH) das amostras do extrato hidrossolúvel de soja antes e após os processos de biotransformação.
Bioprocesso Amostras Fenólicos ORAC Equiv. DPPH Equiv.
Totais Equiv. Trolox (pmol/L) Trolox (pmol/L) Catequina
(pg /ml_)
Padrão EHS 101 a± 6 1 1584a ± 1022 821 a ± 14 1 EHS 254b ± 11 25987b ± 977 1729b ± 27 fermentado
II EHS soja 387c ± 9 31801° ± 858 4439c ± 39 fermentado
+ tanase
III EHS + 847d ± 7 45758d ± 937 6724d ± 36 tanase
*Os resultados apresentados são médias (n = 3) ± DP, e aqueles com letras diferentes na mesma coluna são significativamente diferentes, com p < 0,05.
[0050] Os resultados mostraram que houve um aumento significativo no teor de fenólicos totais para todas as amostras biotransformadas (p <0,05). Após o processo fermentativo com bactérias ácido láticas (processo 1 ), o teor de fenólicos totais do extrato hidrossolúvel de soja aumentou significativamente de 101 para 254 pg catequina/mL, um aumento de cerca de 2,5 vezes comparado com o padrão (EHS não biotransformado). No processo 2, quando analisado a reação do EHS fermentado com a enzima tanase, também foi observado um aumento significativo no teor de fenólicos totais em que o aumento foi cerca de 3,8 vezes (101-387 g catequina/mL), quando comparado com o padrão. O processo 3 mostrou o maior aumento em conteúdo de fenólicos totais (101 -847 Mg catequina/mL), aumento de cerca de 8,4 vezes após a reação do EHS com a enzima tanase. Estes resultados sugerem que o processo fermentativo e de biotransformação enzimática com tanase melhora a liberação de compostos fenólicos do extrato de soja. Além disso, os resultados parecem indicar um maior potencial catalítico da tanase obre os fenólicos do extrato de soja quando comparado à ação fermentativa das bactérias ácido lácticas.
[0051] A atividade antioxidante das amostras, antes e após os três processos de biotransformação do EHS, foi analisada pelos métodos do ORAC e DPPH, in vitro. Os resultados estão descritos na Tabela 2 e expressos em equivalentes de Trolox®. Os resultados demonstraram que houve um aumento significativo na atividade antioxidante das amostras biotransformadas em ambas as metodologias (p<0,05), correlacionando com os resultados encontrados para teor de fenóis totais.
[0052] Os resultados da tabela 2 indicam que o processo de fermentação do EHS (processo 1) resultou, no aumento significativo de cerca de 2,2 vezes na capacidade antioxidante pelo método ORAC e um aumento de aproximadamente 2,1 vezes pelo método de DPPH. A fermentação seguida pela biotransformação enzimática (processo 2) levou a um aumento na atividade antioxidante de 2,7 e 5,4 vezes pelos ensaios ORAC e DPPH, respectivamente. Do mesmo modo, na biotransformação do EHS catalisada apenas pela tanase (processo 3), houve um aumento significativo na atividade antioxidante de 4 e 8 vezes por ORAC e DPPH, respectivamente.
[0053] A soja e os produtos à base de soja são alimentos nutricionalmente ricos e possuem vários fitoquímicos (isoflavonas, fitoesteróis, saponinas, ácidos fenólicos, ácido fítico e inibidores de tripsina) que possuem propriedades funcionais, antioxidantes e de eliminação de radicais livres (Wardhani, Vázquez, e Pandiellaa, 2010). Os compostos fenólicos de soja apresentam atividade sequestradora de radicais livres (Shon et al., 2007), o que pode explicar a correspondência entre o aumento do teor de fenólicos totais com atividade antioxidante demonstrada na tabela 2.
[0054] Em resumo, os resultados da presente invenção indicam uma tendência do aumento do teor de fenólicos totais após os três bioprocessos propostos. Tal tendência foi semelhante à observada para a atividade antioxidante, tanto pelo método ORAC quanto pelo DPPH, apoiando os resultados obtidos pela biotransformação microbiana e enzimática do EHS.
Perfil das isoflavonas
[0055] A concentração de genistina, daidzina, genisteína, daidzeína e a formação de equol foram avaliadas, antes e após os três processos de biotransformação, utilizando HPLC-DAD (Tabela 3). As isoflavonas e equol foram separados e identificados de acordo com metodologia proposta por Aguiar (2003).
Tabela 3. Concentrações dos isômeros de isoflavonas e equol (Mg/mL) em extrato hidrossolúvel de soja antes (padrão) e após os processos de biotransformação.
Conteúdo de isoflavonoides (pg/mL)
Processo Amostras Glicosiladas Agliconas
s Daidzin Genistin I Daidzeín I Genisteín
a a a a Padrão EHS 313,0a ± 393,8a ± 25,6a ± 10,2a ± 0,08a
2,0 3,2 0,6 0,5 +
0,000 3
1 EHS 194,2b ± 202.5 ± 91 ,4b ± 52,3b ± 0,31 b fermentad 5,7 5,9 1 ,9 2,0 ±
0 0,000
8 li EHS n.d.* n.d. 717,2° ± 251 ,4C ± 0,63c fermentad 1 1 ,0 6,9 + o + tanase 0,014
2
III EHS + n.d. n.d. 944,5d ± 321 ,6d ± 0,82d tanase 0,9 0,8 +
0,010 4 n.d. = Não detectado abaixo do limite de detecção para esta metodologia e equipamentos. Os resultados são expressos como média ± desvio padrão (n = 3). A média na mesma coluna com letras diferentes são significativamente diferentes {p <0,05).
[0056] Os resultados demonstraram que todos os bioprocessos desenvolvidos foram capazes de aumentar significativamente o teor das formas agliconas (daidzeína e genisteína) e equol em extraio hidrossolúvel de soja. Devido à hidrólise da daidzina e genistina, o conteúdo das suas correspondentes formas agliconas, daidzeína e genisteína, em EHS aumentou após o processo fermentativo e enzimático (p <0,05).
[0057] Como demonstrado na tabela 3, as isoflavonas glicosídicas foram as formas predominantes no EHS padrão e fermentado. No entanto, as concentrações dos glicosídeos genistina e daidzina do EHS fermentado (processo I) diminuíram cerca de 1 ,6 e 2 vezes, respectivamente, e as algiconas daidzeína e a genisteína aumentaram cerca de 3,5 e 5 vezes, respectivamente, quando comparado com o EHS padrão. Portanto, estes resultados sugerem que as isoflavonas glicosiladas foram transformadas em formas agliconas como resultado do processo de fermentação. De acordo com Duenas et al., (2012), este fato pode ser devido à atividade de β-glicosidase inerente aos microrganismos utilizados no processo fermentativo.
[0058] Como pode ser observado na tabela 3, após os processos II e III, as formas glicosídicas (daidzina e genistina) não foram identificadas, mostrando que estas formas foram convertidas em suas respectivas formas agliconas, como mostrado por um aumento significativo nos níveis de daidzeína e genisteína após estes bioprocessos.
[0059] As concentrações das formas agliconas do EHS fermentado, após o processo II, aumentaram significativamente cerca de 28 vezes (25,6 - 717,2 mg/mL) para a daidzeína e 25 vezes (10,2- 251 ,4 mg/mL) para a genisteína, comparado com o EHS padrão. No processo ill as formas agliconas aumentaram significativamente, comparado com o EHS padrão, cerca de 37 vezes (25,6 - 944,5 mg/mL) para a daidzeína e 32 vezes (10,2 - 321 ,6 mg/mL) para a genisteína. Estes resultados indicam que a reação enzimática com tanasse (processo III) apresentou o maior aumento das formas bioativas das isoflavonas, o que também foi observado para os resultados do teor de fenólicos totais e capacidade antioxidante pelos métodos do ORAC e DPPH.
[0060] As isoflavonas agliconas foram reportadas por exibir maior função bioativa do que as formas glicosídicas (Cederroth, e Nef, 2009; Setchell, 1998). Portanto, as agliconas são as principais responsáveis pela atividade antioxidante de alimentos à base de soja, embora outros componentes da soja, tais como compostos fenólicos também possam contribuir para a capacidade antioxidante em certa medida (Cheng, Lin, e Liu, 201 1 ).
[0061 ] Portanto, a bioconversão das isoflavonas gicosiladas em suas formas agliconas após os três processos de biotransformação propostos, provou ser muito eficaz para aumentar a capacidade antioxidante das amostras pelos métodos testados, como foi demonstrado com os testes in vitro de atividade antioxidante (ORAC e DPPH).
[0062] A habilidade da enzima tanase em bíotransformar padrões comerciais de isoflavonas glicosídicas (daidzina e genistina) foi provada em ensaios realizados in vitro. A figura 1 apresenta os cromatogramas obtidos após de 30 minutos de ração, a 40° C, em que padrões comerciais de daidzina (A) e genisteína (B) foram reagidos com com extrato semipurif içado de tanase de P. variotti. Também são apresentados os tempos de retenção e os espectros de absorção dos produtos da reação.
[0063] Como mostrado na figura 1 , é possível constatar que a reação entre a tanase e os padrões de isfolavonas glicosiladas (daidzina e genistina), levou à formação das suas respectivas formas agliconas (A) dadizeína e (B) genisteína. Tal fato pode ser confirmado a partir da similaridade entre o tempo de retenção dos produtos das reações. Estes resultados provam que a tanase é capaz de atuar na hidrólise das ligações glicosídicas das isoflavonas.
[0064] Como mostrado na tabela 3, a concentração de equol após a fermentação do EHS com bactérias do ácido láctico (processo I) levou a um aumento significativo no teor de equol, cerca de 3,9 vezes. No processo II, o tratamento enzimático do EHS fermentado levou a um aumento significativo de cerca de cerca de 7,9 vezes deste composto bioativo, quando comparado ao EHS padrão. No processo III, após o tratamento enzimático do EHS bruto o aumento foi de cerca de 10 vezes. Estes resultados indicam que a tanase de P. variotiii apresentou maior ação hidrolítica das isoflavonas glicosiladas em relação ao processo de fermentação e também foi capaz de melhorar o conteúdo de equol em EHS.
[0065] A capacidade da tanase em biotransformar as isoflavonas glicosiladas e aumentar o conteúdo de equol no EHS pode ser confirmada pelos cromatogramas presentes na figura 2.
[0066] A figura 2 apresenta o perfil cromatográfico da composição geral dos polifenóis do EHS padrão (A) e do EHS fermentado por bactérias do ácido lácticas (B), bem como para o EHS fermentado (C) e EHS não fermentado (D) tratado com 1 ,8 U de extrato semi-purificado de tanase.
[0067] Na figura 2, é possível observar que ambos os processos de fermentação e tratamento enzimático foram capazes de aumentar significativamente o conteúdo de isoflavonas agliconas (daidzeína e genisteína). Além disso, estes bioprocessos levaram à formação de equol.
[0068] Os resultados da tabela 3 demonstraram que a tanase de P. variotti foi capaz de sintetizar o equol a um nível superior quando comparada às cepas microbianas utilizadas no processo de fermentação. Para o melhor do nosso conhecimento, estudos nessa área são raros e há pouca informação sobre a correlação entre a formação equol e uso de enzimas. [0069] Também pode-se observar que a ação desta enzima não se limitou a uma degiicosilação da isoflavonas (figura 1 ), a tanase também foi capaz de aumentar o teor de equol. Estes resultados fazem desta enzima uma opção interessante para aplicação em alimentos à base de soja, com uma composição rica em polifenóis em que a tanase pode agir de diferentes maneiras no processo de biotransformação.
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Claims

REIVINDICAÇÕES
1 . Processo de biotransformação enzimática de isoflavona caracterizado pelo fato de compreender a fermentação de um substrato composto de extrato hidrossolúvel de soja por bactérias iniciadoras e bactérias ácido lácticas probióticas e/ou de enzima tanase obtida a partir de Paecílomyces variottí.e as etapas:
A. Macerar os grãos de soja íntegros em água destilada a temperatura ambiente;
B. Descartar a agua utilizada para maceração;
C. Adicionar agua destilada;
D. Aquecer os grãos em água entre 90 a 1 10gC por 3 a 10 minutos;
E. Adicionar agua destilada;
F. Triturar os grãos de soja com água destilada;
G. Centrifugar a massa obtida entre 9000 a 10OOOg por 10 a 20 minutos, preferencialmente 15 minutos a temperatura ambiente;
H. Aquecer o extrato hidrossolúvel de soja (EHS) até ebulição por entre 10 a 15 minutos;
I. Esterilizar por aquecimento a temperatura de 121 °C por 15 a 20 minutos;
J. Realizar biotransformação; e
K. Manter o produto EHS com isoflavonas bioativas e equol conservado.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado peio fato de que as bactérias iniciadoras serem Streptococcus ssp. Thermophilus (YF-L81 1 ) e Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus (LB-340); e bactérias ácido lácticas probióticas serem Bifidobacterium animales ssp. Lactis (Bb-12) e Lactobacillus acidophillus.
3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (A) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de 1 :3.
4. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (D) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de :2 e as condições processuais serem 00°C por 5 minutos.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (F) a proporção de peso de grãos de soja e volume de agua ser de 1 :4.
6. Processo/de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (G) a centrifugação ocorrer a 9630 x g por 15 minutos a temperatura de 259C.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (H) a faixa preferencial de ebulição ser entre 96 e 100°C e tempo de 10 minutos.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 1 . caracterizado por na etapa (I) o tempo ser de 15 minutos.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (I) compreender opcionalmente uma subetapa de armazenamento (l.a) em condição estéril do EHS.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por na subetapa etapa (l.a) as condições de armazenamento de EHS ser de refrigeração entre 4 a 12SC ou congelamento a -80eC.
1 1 . Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (J) a biotrasnformação ser realizada por Biotransformação fermentativa, Biotransformação fermentativa seguida por enzimática ou Biotransformação enzimática.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pela Biotransformação fermentativa ocorrer da seguinte forma:
i. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 a 1 5% (v/v), preferencialmente 5% (v/v), e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/mL no EHS obtido na etapa
( ; e
ií. Incubar a solução obtida em (i) entre 30 e 409C, preferencialmente a 37QC, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pela Biotransformação fermentativa seguida por enzimática ocorrer da seguinte forma:
i. Inocular as culturas iniciadoras na concentração de 0,5 - 2% (v/v), preferencialmente 1 % (v/v), e de bactérias ácido lácticas probióticas na concentração de 5 - 15% (v/v), preferencialmente a 5% (v/v), e contagem mínima de 106 - 107 log UFC/mL e máxima de 1014 log UFC/mL no EHS obtido na etapa
(D; ii. Incubar ao EHS com as culturas obtida em (i) entre 30 e 40QC, preferencialmente a 37SC, por 10 a 24 horas, preferencialmente 12 horas, em condições de anaerobiose;
iii. Inocular em solução obtida em (ii) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por 1 ml de EHS fermentado (ii);
iv. Incubar a solução de (iii) entre 35 a 45oC, preferencialmente 40eC, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e
v. Incubar a solução de (iv) entre -2 a 2oC, preferencialmente 0QC (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente 15 minutos;
14. Processo, de acordo com a reivindicação 1 1 , caracterizado pela Biotransformação enzimática ocorrer da seguinte forma:
i. Inocular em EHS obtida em (I) com 1 a 5 U de tanase, preferencialmente 1 ,8 U de tanase, por 1 ml de EHS (I);
ii. Incubar a solução em (i) entre entre 35 a 45oC, preferencialmente 409C, por 20 a 50 minutos, preferencialmente 30 minutos; e
iii. Incubar a solução de (ii) entre -2 a 2oC, preferencialmente 0gC (em banho de gelo) por 10 a 30 min, preferencialmente 15 minutos;
15. Processo, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por na etapa (K) a conservação ocorrer preferencialmente por congelamento a -80°C.
16. Composição caracterizada por ser obtido de acordo o processo descrito nas reivindicações de 1 a 15 e compreender Daidzina na forma aglicona em concentração entre 90 e 946 Mg/mL, Genisteína na forma aglicona em concentração entre 50 e 323 Mg/mL e Equol em concentração entre 0,30 e 0,83 Mg/mL.
17. Uso da composição conforme definida na reivindicação 16 caracterizado por ter aplicação em alimentos à base de soja.
18. Uso da composição conforme definida na reivindicação 16 caracterizado por ser componente de produto nutracêutico.
19. Uso da composição conforme definida na reivindicação 16 caracterizado por ter aplicação na indústria alimentícia, como ingrediente alimentar, e indústria de nutricosméticos e suplementos dietéticos.
PCT/BR2016/000024 2015-06-18 2016-03-03 Processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato de soja em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação e/ou aplicação enzimatica, composição assim obtido e uso Ceased WO2016201536A1 (pt)

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PCT/BR2016/000024 Ceased WO2016201536A1 (pt) 2015-06-18 2016-03-03 Processo de biotransformação de compostos fenólicos do extrato de soja em equol e isoflavonas bioativas através de fermentação e/ou aplicação enzimatica, composição assim obtido e uso

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