WO2017010080A1 - 高品質なｉＰＳ細胞の製造方法 - Google Patents

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WO2017010080A1
WO2017010080A1 PCT/JP2016/003282 JP2016003282W WO2017010080A1 WO 2017010080 A1 WO2017010080 A1 WO 2017010080A1 JP 2016003282 W JP2016003282 W JP 2016003282W WO 2017010080 A1 WO2017010080 A1 WO 2017010080A1
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cell
ips
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恵一 福田
晃 國富
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Heartseed Inc
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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to an iPS cell quality improving agent, a method for producing iPS cells, an iPS cell produced by such a production method, and a composition for producing iPS cells.
  • iPS (induced pluripotent cells) cells are produced from somatic cells by introducing Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc. (Non-patent document 1, Patent document 1). This can be achieved by reprogramming the parental cell transcriptional network and epigenetic signature.
  • iPS cells offer various benefits for basic research, pharmaceutical innovation, and regenerative medicine. However, it is still a serious problem that the generated iPS cell population is of heterogeneous quality compared to embryonic stem cell (ES cell) population.
  • ES cells variation in properties from cell to cell is small, and almost any cell can be differentiated into a target cell, whereas iPS cells have large variation in properties from cell to cell. There were often cells that could not be differentiated into cells. It is important for basic research and clinical purposes that all iPS cells show consistent and high quality.
  • Patent Document 2 when a predetermined amount of Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, c-Myc gene and Sox2 gene is introduced into somatic cells a predetermined number of times, the production efficiency and stability of iPS cells can be improved. The effect is described.
  • the Oct3 / 4 gene or its gene product, the Sox2 gene or its gene product, the Klf4 gene or its gene product, and the c-Myc gene or its gene product, the Prdm14 gene or its gene product By introducing the Esrrb gene or its gene product and the Sall4a gene or its gene product into somatic cells, it is possible to produce artificial pluripotent stem cells (iPS cells) excellent in quality in an efficient manner in a short period of time. Is described.
  • Patent Document 4 in addition to Oct3 / 4 gene or its gene product, Sox2 gene or its gene product, Klf4 gene or its gene product and c-Myc gene or its gene product, Jarid2 mutant gene or its gene product It is described that an artificial pluripotent stem cell (iPS cell) excellent in quality can be produced efficiently and in a short period of time by introducing into a somatic cell. However, there was still room for improvement in the quality of iPS cells. Therefore, development of a method for producing iPS cells with higher quality and less variation in quality has been demanded.
  • iPS cell artificial pluripotent stem cell
  • the linker histone H1 family binds to the linker DNA and generates a higher order chromatin structure in order to control gene expression.
  • the members of the linker histone H1 family include histones H1a, H1b, H1c, H1d, H1e, H1foo, H1x, H1.0, H1t, H1T2, and HILS1.
  • Most members of the linker histone family consist of somatic linker histones that condense chromatin. Therefore, such a structure generally suppresses the overall gene transcription activity (Non-Patent Documents 2 and 3).
  • An object of the present invention is to provide an iPS cell quality improving agent, a method for producing iPS cells, an iPS cell produced by such a production method, and a composition for producing iPS cells.
  • the present inventors have introduced not only a nuclear reprogramming substance but also a nuclear reprogramming substance in a method for producing iPS cells by introducing a nuclear reprogramming substance into a somatic cell. It has been found that introduction of the “H1foo gene or gene product thereof” into somatic cells can produce iPS cells with higher quality and less quality variation, and the present invention has been completed. It was surprising to those skilled in the art that by using “H1foo gene or gene product thereof” in combination with a nuclear reprogramming substance, iPS cells with higher quality and fewer variations in quality could be produced.
  • the present invention (1) an iPS cell quality improving agent characterized by comprising an H1foo gene or a gene product thereof, (2) The iPS cell quality improving agent according to (1) above, which comprises an expression vector containing an H1foo gene.
  • the present invention also provides: (3) (a) a nuclear reprogramming substance, and (b) a method for producing iPS cells, comprising the step of introducing the H1foo gene or gene product thereof into a somatic cell, (4) Nuclear reprogramming substances are derived from Oct gene family genes, Sox gene family genes, Klf gene family genes, Myc gene family genes, Lin gene family genes, and Nanog genes, and their gene products.
  • the method for producing iPS cells according to (3) above comprising at least one selected from the group consisting of: (5)
  • the nuclear reprogramming substance comprises the Oct3 / 4 gene or gene product thereof, the Sox2 gene or gene product thereof, the Klf4 gene or gene product thereof, and the L-Myc gene or gene product thereof.
  • the method for producing iPS cells according to any one of 1) is provided.
  • the present invention provides (8) iPS cells produced by the iPS cell production method according to any one of (1) to (7) above, (9) Provided is a composition for producing iPS cells, comprising (a) a nuclear reprogramming substance, and (b) an H1foo gene or a gene product thereof.
  • the present invention can provide an iPS cell quality improving agent, a method for producing iPS cells, an iPS cell produced by such a production method, and a composition for producing iPS cells. According to the present invention, iPS cells with higher quality and less quality variation can be produced.
  • FIG. 1 a It is the image by the microscope of the tail fibroblast (henceforth a "mouse fibroblast") of the C57BL / 6J mouse which expressed exogenous (mouse) H1foo.
  • the “BF”, “DAPI”, “H1foo”, and “MERGE” images in FIG. 1 a are obtained by superimposing a phase difference image, a DAPI fluorescence stained image, an H1foo fluorescence stained image, and an image obtained by superimposing the three types of images, respectively. Show.
  • the left and right images in FIG. 1b show two-dimensional and 2.5-dimensional images with H1foo fluorescence staining, respectively.
  • FIG. 1c show electron microscope images of control cells (mouse fibroblasts) and mouse fibroblasts expressing exogenous H1foo, respectively.
  • FIG. 2a shows three types of nuclear reprogramming substances (mouse Oct3 / 4, Sox2 and Klf4 genes [OSK gene]), OSK gene and linker histone H1 gene (OSK + H1c gene), or OSK gene and H1foo gene (OSK + H1foo gene). It is a figure which shows the result of having introduce
  • FIG. 2 b shows three types of pluripotency markers (Oct3 / Oc) in iPS cells (hereinafter referred to as “OSK-iPS cells” and “OSK + H1foo-iPS cells”) produced by introducing the OSK gene or OSK + H1foo gene, respectively. 4, Nanog, and SSEA1) are analysis results of the expression.
  • FIG. 2c is a diagram showing the results of analyzing the expression of endogenous H1foo on days 1 to 5 after introduction of the OSK gene, or OSK gene, and c-Myc gene (OSKM gene).
  • “MEF + H1foo” in FIG. 2c shows the result of analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEF) introduced with the H1foo gene.
  • FIG. 4a is a diagram showing the results of comparison of whole gene transcriptome profiles between OSK + H1foo-iPS cells and ES cells.
  • FIG. 4b is a diagram showing the results of comparison of whole gene transcriptome profiles between OSK + H1foo-iPS cells and OSK-iPS cells. It is a figure which shows the result of having analyzed the DNA methylation level of IG-DMR (FIG.
  • FIG. 5a Gtl2-DMR (FIG. 5b) of an OSK-iPS cell and an OSK + H1foo-iPS cell.
  • ES and “MEF” in the figure indicate the results of analyzing ES cells and MEF cells, respectively. It is a figure which shows the result of having analyzed the form of the embryoid body (EB) formed from the OSK-iPS cell and the OSK + H1foo-iPS cell. It is a figure which shows the result of having analyzed the ratio of the apoptotic cell of EB formed from the OSK-iPS cell and the OSK + H1foo-iPS cell.
  • EB embryoid body
  • FIG. 11 shows the results of quantitative RT-PCR analysis of the SRF gene (FIG. 11a) and the ACTG2 gene (FIG. 11b) in the iPS cells produced as described above. Numerical values 1 to 4 on the horizontal axis of the graph represent clone numbers.
  • the iPS cell production method of the present invention comprises (a) a nuclear reprogramming substance, and (b) a step of introducing an H1foo gene or gene product thereof into a somatic cell (hereinafter also simply referred to as “introduction step”). And may include other steps as necessary.
  • the introduction step is a step of introducing at least (a) a nuclear reprogramming substance and (b) an H1foo gene or a gene product thereof into a somatic cell.
  • a gene product means mRNA (messenger RNA) transcribed from a gene and / or a protein translated from the mRNA.
  • said H1foo gene means the polynucleotide which codes H1foo protein.
  • the H1foo gene or its gene product can be used as an agent for improving the quality of iPS cells.
  • the vector containing the H1foo gene described later can also be used as an agent for improving the quality of iPS cells.
  • H1foo gene There is no restriction
  • the sequence information of the H1foo gene can be obtained from a known database.
  • GenBank can obtain accession numbers BC047943 (human), AY158091 (human), and BC137916 (mouse).
  • the nucleotide sequence of the human H1foo gene (BC047943) is shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence of the human H1foo protein (protein encoded by the H1foo gene of BC047943) is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the nucleotide sequence of the human H1foo gene (AY158091) is represented by SEQ ID NO: 59, and the amino acid sequence of the human H1foo protein (protein encoded by the H1foo gene of AY158091) is represented by SEQ ID NO: 60.
  • the nucleotide sequence of the mouse H1foo gene (BC137916) is represented by SEQ ID NO: 3, and the amino acid sequence of the mouse H1foo protein (protein encoded by the BC137916 H1foo gene) is represented by SEQ ID NO: 4.
  • the nucleotide sequence of the H1foo gene and the mRNA nucleotide sequence thereof may be the same as the wild-type H1foo gene nucleotide sequence and the mRNA nucleotide sequence, or may contain mutations.
  • the nucleotide sequence containing such a mutation includes: “a nucleotide sequence of a wild-type H1foo gene (for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 59 or 3) or a nucleotide sequence of mRNA thereof, preferably 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 nucleotides have been deleted, substituted, inserted, or added.
  • a nucleotide sequence of a wild-type H1foo gene for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 59 or 3
  • a nucleotide sequence of mRNA thereof preferably 1 to 30, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3 nucleotides have been deleted, substituted, inserted, or added.
  • nucleotide sequence of the nucleotide sequence of the wild-type H1foo gene (for example, SEQ ID NO: 1 or 59 or 3 in the nucleotide sequence encoding the protein having H1foo activity)
  • Nucleotide sequence represented by or a nucleotide sequence of mRNA thereof A nucleotide sequence having a sequence identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and further preferably 98% or more.
  • nucleotide sequence encoding a protein having H1foo activity for example, SEQ ID NO: 1 or 59 or 3 in the nucleotide sequence encoding the protein having H1foo activity
  • the amino acid sequence of the H1foo protein may be the same as the amino acid sequence of the wild-type H1foo protein (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 60 or 4), or may contain a mutation.
  • the protein containing such a mutation include: “1-30, preferably 1-20, more preferably in the amino acid sequence of the wild-type H1foo protein (for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 60 or 4).
  • protein having H1foo activity refers to a high-quality iPS cell when introduced into a somatic cell together with a nuclear reprogramming substance as compared with a case where only the nuclear reprogramming substance is introduced into a somatic cell. Is a protein that can be produced in a larger amount.
  • nuclear reprogramming substance means that a somatic cell can be induced into an iPS cell by introducing the substance alone or a combination of the substance and another substance into the somatic cell.
  • a nuclear reprogramming substance if it is a substance (group) capable of inducing iPS cells from somatic cells, such as a gene (including a form incorporated in an expression vector) or a gene product thereof, a low molecular weight compound, etc. Any substance may be used.
  • a gene that is a nuclear reprogramming substance means a polynucleotide that encodes a protein that is a nuclear reprogramming substance.
  • the nuclear reprogramming substance is a gene or gene product thereof, Oct gene family gene, Sox gene family gene, Klf gene family gene, Myc gene family gene, Lin gene family gene, Nanog gene, and At least one selected from the group consisting of the gene products (WO2007 / 69666; Patent No. 5696282; Science, 2007, 318: 1917-1920), among which two or more selected from such a group 3 or more are more preferable, and 2 to 4 ranges selected from such a group are preferable, and 3 or 4 is more preferable. Specific examples of these family genes and combinations thereof are listed below. In the following, only the name of a gene is described, but the case of using the gene product is also included.
  • A one nuclear reprogramming substance consisting of genes of the Oct gene family;
  • B a combination of two nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family and Sox gene family;
  • C a combination of two kinds of nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family and Klf gene family;
  • D a combination of two nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family and Nanog genes;
  • E a combination of three nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family, the Sox gene family, and the Klf gene family;
  • F A combination of three kinds of nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family, Klf gene family and Myc gene family.
  • (G) a combination of four nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family, Sox gene family, Klf gene family and Myc gene family; and (h) Oct gene family of genes, Sox gene A combination of four nuclear reprogramming substances consisting of a family gene, a Lin gene family gene, and a Nanog gene; Alternatively, it may be a combination in which another nuclear reprogramming substance (gene or gene product thereof) is further added to any one of the nuclear reprogramming substances (a) to (h) or a combination thereof.
  • a ′ a combination of nuclear reprogramming substances including one nuclear reprogramming substance consisting of genes of the Oct gene family
  • B ′ a combination of nuclear reprogramming substances including two nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family and Sox gene family
  • C ′ a combination of nuclear reprogramming substances including two kinds of nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family and Klf gene family
  • D ′ a combination of nuclear reprogramming substances including two nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family and Nanog genes
  • E ′ a combination of nuclear reprogramming substances including three kinds of nuclear reprogramming substances consisting of genes of Oct gene family, Sox gene family, and Klf gene family
  • F ′ A combination of nuclear reprogramming substances including three kinds of nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family, Klf gene family and Myc gene family.
  • G ′ a combination of nuclear reprogramming substances including four nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family, Sox gene family, Klf gene family and Myc gene family
  • h ′ A combination of nuclear reprogramming substances including four nuclear reprogramming substances consisting of genes of the Oct gene family, Sox gene family, Lin gene family, and Nanog gene;
  • Oct3 / 4 gene, Klf4 gene, c-Myc gene (2) Oct3 / 4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene (where Sox2 gene can be replaced by Sox1 gene, Sox3 gene, Sox15 gene, Sox17 gene or Sox18 gene.
  • Sox2 gene can be replaced by Sox1 gene, Sox3 gene, Sox15 gene, Sox17 gene or Sox18 gene.
  • the Klf1 gene, the Klf2 gene, or the Klf5 gene can be replaced.
  • the c-Myc gene can be replaced with the T58A (active mutant) gene, the N-Myc gene, and the L-Myc gene).
  • Oct gene family member genes eg, Oct1A, Oct6, etc.
  • Sox2 gene or the Sox1 gene, the Sox3 gene, the Sox15 gene, the Sox17 gene, the Sox18 gene
  • Sox7 gene a member gene of another Lin gene family
  • Lin28b gene a member gene of another Lin gene family
  • nuclear reprogramming substances selected from the group consisting of Fbx15 gene, ERas gene, ECAT15-2 gene, Tcl1 gene, and ⁇ -catenin gene may be combined.
  • ECAT1 gene Esg1 gene, Dnmt3L gene, ECAT8 gene, Gdf3 gene, Mybl2 gene, ECAT15-1 gene, Fthl17 gene, Sall4 gene, Rex1 gene, UTF1 gene, Stella gene, Stat3 gene, and Grb2 gene
  • One or more kinds of nuclear reprogramming substances selected from the group can also be combined. These combinations are specifically described in WO2007 / 69666.
  • Preferred nuclear reprogramming substances are selected from the group consisting of Oct3 / 4 gene, Sox2 gene, Klf4 gene, c-Myc gene (or L-Myc gene), Lin28 gene, Nanog gene, and their gene products. At least one, preferably two or more, more preferably three or more are examples of preferable nuclear reprogramming materials.
  • Particularly preferred nuclear reprogramming substance combinations include (1) Oct3 / 4 gene or gene product thereof, Sox2 gene or gene product thereof, and Klf4 gene or gene product thereof, (2) Oct3 / 4 gene or gene product thereof, Sox2 gene or gene product thereof, Klf4 gene or gene product thereof, and c-Myc gene or gene product thereof, (3) Oct3 / 4 gene or gene product thereof, Sox2 gene or gene product thereof, Klf4 gene or gene product thereof, And L-Myc gene or gene product thereof, among them, Oct3 / 4 gene or gene product thereof, Sox2 gene or gene product thereof, and combination of Klf4 gene or gene product thereof, Oct3 / 4 gene or Gene product, Sox2 inheritance
  • the gene product, the Klf4 gene or the gene product thereof, and the combination of the L-Myc gene or the gene product thereof can be preferably exemplified.
  • the combination of the Oct3 / 4 gene, the Sox2 gene, and the Klf4 gene, or the Oct3 / 4 More preferred examples include a combination of a gene, a Sox2 gene, a Klf4 gene, and an L-Myc gene.
  • the c-Myc gene or its gene product may be used as one of the nuclear reprogramming substances used in the present invention, but it is preferable not to use the c-Myc gene or its gene product. This is because c-Myc has been reported to reduce the proportion of Nanog-GFP positive colonies and increase the carcinogenicity of cells (Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature biotechnology 26, 101-106 (2008)).
  • the origin of the gene is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • human, mouse, rat, cow, sheep, horse, Any mammal such as monkeys can be mentioned.
  • Mouse and human cDNA sequence information of each of the above nuclear reprogramming substances can be obtained by referring to GenBank accession numbers described in WO2007 / 069666. Note that the Nanog gene is described as “ECAT4” in the publication. Moreover, the mouse
  • the cDNA sequence of the human Oct3 / 4 gene is shown in SEQ ID NO: 47
  • the amino acid sequence of the human Oct3 / 4 protein is shown in SEQ ID NO: 48
  • the cDNA sequence of the human Sox2 gene is shown in SEQ ID NO: 49
  • the human The amino acid sequence of the Sox2 protein is shown in SEQ ID NO: 50
  • the cDNA sequence of the human Klf4 gene is shown in SEQ ID NO: 51
  • the amino acid sequence of the human Klf4 protein is shown in SEQ ID NO: 52
  • the cDNA sequence of the human L-Myc gene is The amino acid sequence of human L-Myc protein is shown in SEQ ID NO: 53.
  • nucleotide sequence in the case where the nuclear reprogramming substance is each of the above genes or mRNA thereof is not particularly limited as long as the effect of the present invention is not impaired, and the portion of each nucleotide sequence of each of the above genes that is translated into a protein It may be only, and other parts may be included.
  • nucleotide sequence of each gene and the nucleotide sequence of the mRNA may be the same as the nucleotide sequence of the wild-type gene and the nucleotide sequence of the mRNA, or may contain a mutation.
  • nucleotide sequences containing such mutations include: “1-30 nucleotides, preferably 1-20, more preferably 1-15, and even more preferably in the nucleotide sequence of each of the above wild-type genes or the nucleotide sequence thereof.
  • the nuclear reprogramming substance is a protein encoded by each of the above genes (that is, a protein translated from mRNA transcribed from each of the above genes), the amino acid sequence thereof is encoded by each of the wild type each of the above genes. It may be the same as the protein or may contain a mutation. Examples of the protein containing such a mutation include: “1-30 amino acids, preferably 1-20, more preferably 1-15, and even more preferably 1-10 in the amino acid sequence of the protein encoded by each wild-type gene.
  • sequence identity with the amino acid sequence of the protein encoded by each gene of the type is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, More preferred is a protein having an amino acid sequence of 98% or more and having a nuclear reprogramming action.
  • somatic cells There is no restriction
  • the mature somatic cells include mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, adipose tissue-derived stromal cells, adipose tissue-derived stromal stem cells, neural stem cells, sperm stem cells, and other tissue stem cells (somatic stem cells); tissue precursors Cells; already differentiated cells such as fibroblasts, epithelial cells, lymphocytes, muscle cells, and the like.
  • the biological species from which the somatic cells are derived is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include any mammals such as humans, mice, rats, cows, sheep, horses and monkeys. It is done. Moreover, the biological species from which the somatic cell is derived and the biological species from which the gene to be introduced into the somatic cell is not necessarily the same, but are preferably the same.
  • the individual from which the somatic cells are collected is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the individual itself from the viewpoint of rejection Alternatively, other individuals having the same or substantially the same type of MHC are preferred.
  • the type of MHC is substantially the same as that when the cells obtained by inducing differentiation from the somatic cell-derived iPS cells are transplanted into an individual by using an immunosuppressant or the like. It means that the type of MHC matches to the extent that it can be worn.
  • the somatic cells may be recombinant so as to facilitate selection of iPS cells.
  • the recombinant cell include a recombinant cell in which at least one of a reporter gene and a drug resistance gene is incorporated into a gene locus that is specifically highly expressed in a pluripotent cell.
  • the gene that is specifically highly expressed in the pluripotent cells include Fbx15 gene, Nanog gene, Oct3 / 4 gene, and the like.
  • the reporter gene include green fluorescent protein (GFP) gene, luciferase gene, ⁇ -galactosidase gene and the like.
  • the drug resistance gene include blasticidin gene, hygromycin gene, puromycin resistance gene, neomycin resistance gene and the like.
  • the somatic cell culture conditions are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a culture temperature of about 37 ° C. and a CO 2 concentration of about 2% to 5%.
  • the medium used for culturing the somatic cells is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, minimal essential medium (MEM) containing 5% to 20% by mass of serum, Dulbecco's modification Examples thereof include a medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, and F12 medium.
  • the method for introducing (a) nuclear reprogramming substance and (b) H1foo gene or gene product thereof into a somatic cell is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the method to use, the method using mRNA, the method using a recombinant protein, etc. are mentioned.
  • the nuclear reprogramming substance is preferably introduced into somatic cells in the form of genes or in the form of mRNA of the genes rather than introduced into somatic cells in the form of proteins. More preferably, it is introduced into a somatic cell in the form of a gene.
  • Such a gene may be DNA, RNA, or DNA / RNA chimera, but is preferably DNA from the viewpoint of stability.
  • the gene may be double-stranded or single-stranded, but preferably is double-stranded.
  • Preferred examples of the nuclear reprogramming substance include cDNA of each of the above genes. Among them, double-stranded cDNA of each of the above genes is preferably exemplified.
  • the “H1foo gene or gene product thereof” is expressed in the form of a gene or in the form of mRNA of the gene rather than being introduced into a somatic cell in the form of a protein. It is preferable to introduce it into a cell, and it is more preferable to introduce it into a somatic cell in the form of a gene.
  • the H1foo gene may be DNA, RNA, or a DNA / RNA chimera, but is preferably DNA from the viewpoint of stability.
  • the H1foo gene may be double-stranded or single-stranded, but preferably is double-stranded.
  • Preferred embodiments of the “H1foo gene or gene product thereof” include H1foo gene cDNA. Among them, a double-stranded cDNA of H1foo gene is preferred.
  • Expression vector When a nuclear reprogramming substance is introduced into a somatic cell in the form of a gene or when an H1foo gene is introduced into a somatic cell, the nuclear reprogramming is performed with an appropriate expression vector containing a promoter that can function in the host somatic cell.
  • An expression vector incorporating a substance or the H1foo gene can be preferably used.
  • the expression vector for incorporating the nuclear reprogramming substance and the H1foo gene is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include episomal vectors, artificial chromosome vectors, plasmid vectors, and viral vectors. It is done.
  • promoters used in the above expression vectors include SR ⁇ promoter, SV40 early promoter, retrovirus LTR, CMV (cytomegalovirus) promoter, RSV (rous sarcoma virus) promoter, HSV-TK (herpes simplex virus thymidine kinase). ) Promoter, EF1 ⁇ promoter, metallothionein promoter, heat shock promoter and the like.
  • an enhancer of human CMV IE gene may be used together with a promoter.
  • CAG promoter including cytomegalovirus enhancer, chicken ⁇ -actin promoter and poly A signal site of ⁇ -globin gene
  • CAG promoter including cytomegalovirus enhancer, chicken ⁇ -actin promoter and poly A signal site of ⁇ -globin gene
  • the above expression vector may contain an enhancer, a poly A addition signal, a marker gene, a replication origin, a gene encoding a protein that binds to the replication origin and controls replication, if desired.
  • the above marker gene refers to a gene that enables selection and selection of cells by introducing the marker gene into cells.
  • Specific examples of the marker gene include a drug resistance gene, a fluorescent protein gene, a luminescent enzyme gene, and a chromogenic enzyme gene. These may be used individually by 1 type and may use 2 or more types together.
  • the drug resistance gene examples include a neomycin resistance gene, a tetracycline resistance gene, a kanamycin resistance gene, a zeocin resistance gene, and a hygromycin resistance gene.
  • Specific examples of the fluorescent protein gene include a green fluorescent protein (GFP) gene, a yellow fluorescent protein (YFP) gene, and a red fluorescent protein (RFP) gene.
  • Specific examples of the luminescent enzyme gene include a luciferase gene.
  • the chromogenic enzyme gene include ⁇ -galactosidase gene, ⁇ -glucuronidase gene, alkaline phosphatase gene, and the like.
  • the above episomal vector is a vector capable of autonomous replication outside the chromosome. Specific means using an episomal vector is disclosed in Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009).
  • an episomal vector in which loxP sequences are arranged in the same direction on the 5 'and 3' sides of vector elements necessary for episomal vector replication may be used.
  • Episomal vectors can autonomously replicate outside the chromosome, so they can provide stable expression in host cells even if they are not integrated into the genome. However, once iPS cells are established, the vectors are quickly removed. It is desirable.
  • the autonomous replication ability of the episomal vector can be lost. Can be removed from iPS cells at an early stage.
  • Examples of the episomal vector used in the present invention include a vector containing a sequence necessary for autonomous replication derived from EBV, SV40 or the like as a vector element.
  • vector elements necessary for autonomous replication include a replication origin and a gene that encodes a protein that binds to the replication origin and regulates replication.
  • the replication origin oriP And EBNA-1 gene and SV40 includes the replication origin ori and the SV40LT gene.
  • examples of the artificial chromosome vector include a YAC (Yeast Artificial Chromosome) vector, a BAC (Bacterial Artificial Chromosome) vector, a PAC (P1-derived Artificial Chromosome) vector, and the like.
  • the plasmid vector is not particularly limited as long as it is a plasmid vector that can be expressed in the introduced somatic cell.
  • somatic cell is a mammal, pA1-11, pXT1, pRc / CMV, pRc / RSV And plasmid vectors for expression of animal cells such as pcDNAI / Neo.
  • viral vectors examples include retrovirus (including lentivirus) vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors, herpes virus vectors, vaccinia virus vectors, pox virus vectors, polio virus vectors, silbis virus vectors, Examples include a rhabdovirus vector, a paramyxovirus vector, and an orthomyxovirus vector.
  • the method for introducing the above expression vector into the above somatic cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • lipofection method, microinjection method, DEAE dextran method, gene gun method, electro Examples thereof include a poration method and a calcium phosphate method.
  • viral particles obtained using a packaging cell may be used.
  • a packaging cell is a cell into which a gene encoding a structural protein of a virus has been introduced, and when a recombinant virus vector incorporating the target gene is introduced into the cell, recombinant virus particles incorporating the target gene are produced.
  • the packaging cell is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose.
  • packaging cells based on human kidney-derived HEK293 cells or mouse fibroblast-derived NIH3T3 cells PLAT-E cells designed to express virus-derived envelope glycoproteins
  • PLAT-A cells designed to express envelope glycoproteins derived from Amphotropic virus, designed to express envelope glycoproteins derived from vesicular stomatitis virus PLAT-GP cells that have been used.
  • PLAT-A cells and PLAT-GP cells are preferable from the viewpoint of host orientation when a recombinant viral vector is introduced into human somatic cells.
  • the method for introducing the viral vector into the packaging cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose.
  • Examples thereof include a lipofection method, an electroporation method, and a calcium phosphate method.
  • a lipofection method an electroporation method
  • a calcium phosphate method an electroporation method
  • the polybrene method is mentioned.
  • one gene When introducing a nuclear reprogramming substance or H1foo gene into a somatic cell using the above expression vector, one gene may be incorporated into one expression vector, or two or more genes may be incorporated. By incorporating two or more genes into one vector, the two or more genes can be expressed simultaneously (hereinafter sometimes referred to as “co-expression”). Further, all nuclear reprogramming substances to be introduced into somatic cells and the H1foo gene may be incorporated into one expression vector.
  • the method for incorporating two or more genes into one vector is not particularly limited and may be appropriately selected according to the purpose. However, it is preferable to incorporate the two or more genes through a linking sequence. .
  • sequence According to the objective, it can select suitably, For example, the gene sequence which codes 2A peptide derived from foot-and-mouth disease virus (Picornaviridae Aphthovirus), IRES (internal ribosome entry sites), etc. are mentioned. .
  • a nuclear reprogramming substance and (b) a gene product of the H1foo gene may be introduced into somatic cells in the form of mRNA.
  • mRNA messenger RNA
  • a well-known method can be selected suitably and can be used.
  • a commercially available RNA transfection reagent such as Lipofectamine (registered trademark) MessengerMAX (manufactured by Life Technologies) can be used.
  • a nuclear reprogramming substance and (b) a gene product of the H1foo gene may be introduced into a somatic cell in the form of a protein.
  • transducing this protein into the said somatic cell A well-known method can be selected suitably and can be used. Examples of such a method include a method using a protein introduction reagent, a method using a protein introduction domain (PTD) fusion protein, and a microinjection method.
  • PTD protein introduction domain
  • Protein introduction reagents include cationic lipid-based BioPOTER (registered trademark) Protein Delivery Reagent (Gene Therapy Systmes) and Pro-Ject TM Protein Transfection Reagent (PIERCE), lipid-based Profect-1 Targeting TM Systems), Penetratin Peptide (Q biogene) and Chariot Kit (Active Motif) based on membrane-permeable peptides, GenomONE (Ishihara Sangyo) using HVJ envelope (inactivated Sendai virus) Etc. are commercially available.
  • the introduction can be carried out according to the protocol attached to these reagents, but the general procedure is as follows.
  • (A) Nuclear reprogramming substance” or “(b) gene product of H1foo gene”, which is a protein form, is diluted in an appropriate solvent (for example, a buffer solution such as PBS or HEPES), and an introduction reagent is added to room temperature. Incubate for 5 to 15 minutes to form a complex, which can be added to cells exchanged in serum-free medium and incubated at 37 ° C. for 1 to several hours. Thereafter, the medium can be removed and replaced with a serum-containing medium.
  • an appropriate solvent for example, a buffer solution such as PBS or HEPES
  • Such a PTD is produced by recombinant expression of a fusion protein expression vector incorporating the cDNA of the “(a) nuclear reprogramming substance” or “(b) gene product of the H1foo gene” and the PTD sequence, and the fusion protein is recovered. And can be used for introduction.
  • a fusion protein can be introduced in the same manner as described above except that no protein introduction reagent is added.
  • the microinjection method described above is a method in which a protein solution is put into a glass needle having a tip diameter of about 1 ⁇ m and puncture is introduced into the cell, and the protein can be reliably introduced into the cell.
  • CPP cell-penetrating peptide
  • the number of introductions of “(a) nuclear reprogramming substance” and “(b) H1foo gene or gene product thereof” into a somatic cell may be 1 or 2 It may be more than once.
  • the introduction time is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose. All of the “(a) nuclear reprogramming substance” and “(b) H1foo gene or its gene product” to be introduced are simultaneously generated. May be introduced at a different time.
  • the “H1foo gene or gene product thereof” may be an embodiment using only the gene, an embodiment using only the gene product, or an embodiment using both the gene and the gene product. May be.
  • the nuclear reprogramming substance is a gene or a gene product thereof
  • an embodiment using only the gene may be used
  • an embodiment using only the gene product may be used, or both the gene and the gene product may be used.
  • An aspect may be sufficient.
  • the nuclear reprogramming substance is a gene or a gene product thereof and two or more kinds of “genes or gene products thereof” are used in combination
  • the gene product is used for a certain gene and the other genes are An embodiment using a gene may also be used.
  • the amount of H1foo gene or its gene product introduced into somatic cells is (a) a nuclear reprogramming substance, and (b) when H1foo gene or its gene product is introduced into a somatic cell, it is of higher quality and quality. There is no particular limitation as long as iPS cells with less variation can be produced.
  • the nuclear reprogramming substance is a gene or a gene product thereof
  • the amount of the gene or gene product introduced into a somatic cell is not particularly limited as long as the somatic cell nucleus can be reinitialized. All genes or their gene products may be introduced in equal amounts or in different amounts.
  • the Oct3 / 4 gene is introduced in a large amount, for example, about 3 times the amount of the Sox2 gene, the Klf4 gene, or the c-Myc gene (PNAS 106 (31): 12759-12764 (2009), J. Biol. Chem. 287 (43): 36273-36282 (2012)).
  • the contact of the low molecular weight compound with a somatic cell is performed by dissolving the low molecular weight compound in an aqueous or non-aqueous solvent at an appropriate concentration.
  • a medium suitable for culturing somatic cells for example, a minimum essential medium (MEM) containing about 5 to 20% fetal calf serum, Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), RPMI 1640 medium, 199 medium, F12 medium, etc.
  • MEM minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • RPMI 1640 medium 199 medium
  • F12 medium F12 medium
  • the low-molecular compound solution is added so that the concentration of the low-molecular compound is sufficient to cause nuclear reprogramming in somatic cells and no cytotoxicity is observed, and the cells are cultured for a certain period of time.
  • the concentration of the low molecular weight compound as the nuclear reprogramming substance varies depending on the type of the low molecular weight compound used, but can be appropriately selected within the range of about 0.1 nM to about 100 nM.
  • the contact period is not particularly limited as long as it is a time sufficient for the nuclear reprogramming of the
  • the iPS cell production method of the present invention includes (a) a nuclear reprogramming substance and (b) a step of introducing an H1foo gene or a gene product thereof into a somatic cell (“introduction step”). Depending on the, further steps may be included. The other steps are not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • the nuclear reprogramming substance and (b) the H1foo gene or Examples include a step of culturing a somatic cell into which the gene product has been introduced (hereinafter also simply referred to as “introduced cell”) (hereinafter also simply referred to as “introduced cell culture step”).
  • the introduced cell culturing step is a step of culturing a somatic cell into which (a) the nuclear reprogramming substance and (b) the H1foo gene or its gene product have been introduced.
  • the culture conditions for the introduced cells are not particularly limited, and examples thereof include conditions suitable for ES cell culture. Examples of such conditions include a culture temperature of about 37 ° C. and a CO 2 concentration of about 2% to 5%.
  • transduced cell According to the objective, it can select suitably.
  • LIF Leukemia Inhibitory Factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • SCF stem cell factor
  • the cells are cultured as feeder cells in the presence of mouse embryo-derived fibroblasts (MEF) that have been treated with radiation or antibiotics to stop cell division.
  • MEF mouse embryo-derived fibroblasts
  • STO cells STO cells are usually used, but SNL cells (McMahon, AP & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)) and the like are frequently used for induction of iPS cells.
  • Co-culture with feeder cells may be started before the introduction of (a) nuclear reprogramming substance and (b) H1foo gene or gene product thereof, or at the time of or after the introduction (for example, 1 It may start from (after 10 days).
  • the period of the introduced cell culturing step is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the purpose.
  • iPS Cell The iPS cell of the present invention produced by the above-described iPS cell production method has pluripotency and self-renewal ability.
  • the term “pluripotency” means that all three germ layers can be differentiated.
  • the self-replicating ability means the ability to proliferate while maintaining an undifferentiated state.
  • the method for confirming whether or not the cells produced by the above-described iPS cell production method are iPS cells is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the purpose.
  • a somatic cell a reporter gene at a gene locus that is specifically highly expressed in differentiated pluripotent cells (for example, Fbx15, Nanog, Oct3 / 4, etc., preferably Nanog or Oct3 / 4), and
  • a recombinant cell incorporating at least one of the drug resistance gene it can be confirmed using the above reporter gene or drug resistance gene.
  • a green fluorescent protein (GFP) gene for example, a method of confirming GFP positive cells with a flow cytometer can be mentioned.
  • a puromycin resistance gene it can be confirmed by administering puromycin to the cells.
  • high-quality iPS cells refers to iPS cells with higher quality than iPS cells produced by the same method except that the H1foo gene or gene product thereof is not introduced into somatic cells.
  • iPS cells with little quality variation means iPS cells with less quality variation than iPS cells produced by the same method except that the H1foo gene or its gene product is not introduced into somatic cells. Means a cell. These qualities may be one type or two or more types. Specific examples of “high-quality iPS cells” or “iPS cells with little variation in quality” include iPS cells having one or more characteristics selected from the following (a) to (q): .
  • iPS cells prepared by the same method except that the H1foo gene or its gene product is not introduced into a somatic cell (preferably, “OSK-iPS cell” or “OSKL-iPS cell” in Examples described later)
  • iPS cells in which the number of embryoid bodies formed when cultured for 5 days by the method of [Embryoid body (EB) formation] described later is improved by 5% or more, preferably 10% or more.
  • somatic cells preferably “OSK-iPS cells” or “OSKL-iPS cells” in Examples described later
  • the variation ( ⁇ 2 ) in the size ( ⁇ m 2 ) of the embryoid body when cultured for 5 days by the method of “embryoid body (EB) formation” described later is 25% or more, preferably 40%.
  • the variation ( ⁇ 2 ) in the size ( ⁇ m 2 ) of the embryoid body when cultured for 5 days by the method of “embryoid body (EB) formation” described below is 10000 ( ⁇ m 2 ) or less, preferably 8000 ( iPS cells that are [mu] m ⁇ 2 >) or less.
  • the ratio of viable cells (annexin V ( ⁇ ) / PI ( ⁇ ) cells) measured by the method of [Apoptosis assay] described later was improved 1.1 times or more, preferably 1.2 times or more.
  • iPS cells iPS cells having a ratio of viable cells (annexin V ( ⁇ ) / PI ( ⁇ ) cells) of 68% or more, preferably 73% or more, measured by the method of [Apoptosis assay] described later.
  • the ratio of apoptotic cells is 0. IPS cells reduced to 75-fold or less, preferably 0.67-fold or less.
  • the ratio of apoptotic cells (total of annexin V (+) / PI ( ⁇ ) cells and annexin V (+) / PI (+) cells) measured by the method of [Apoptosis assay] described later is 30% or less, IPS cells that are preferably 25% or less.
  • IPS cells that are 0.65 times or more, preferably 0.73 times or more.
  • K an iPS cell produced by the same method except that the H1foo gene or its gene product is not introduced into a somatic cell (preferably, “OSK-iPS cell” or “OSKL-iPS cell” in Examples described later) IPS cells with higher chimera-forming ability.
  • L iPS cells prepared by the same method except that the H1foo gene or gene product thereof is not introduced into somatic cells (preferably “OSK-iPS cells” or “OSKL-iPS cells” in Examples described later) In comparison, iPS cells with a higher ability to move to the gonads.
  • the expression level of the SRF gene (known as a chromosomal abnormality marker whose expression level decreases when it has a chromosomal abnormality) measured by the method described in the section of [Quantitative RT-PCR analysis] described later IPS cells improved by 1.1 times, preferably 1.2 times.
  • N an iPS cell prepared by the same method except that the H1foo gene or its gene product is not introduced into a somatic cell (preferably, “OSKL-iPS cell” or “OSK-iPS cell” in Examples described later)
  • the expression level of the ACTG2 gene (known as a chromosomal abnormality marker whose expression level decreases when it has a chromosomal abnormality), measured by the method described in [Quantitative RT-PCR analysis] described later IPS cells improved by 1.2 times, preferably 1.5 times.
  • the variation in expression level ( ⁇ 2 ) of Oct3 / 4 gene (undifferentiated marker of stem cells) measured by the method described in the item of “Quantitative RT-PCR analysis” described later is 10% or more, preferably IPS cells reduced by 20% or more.
  • P an iPS cell produced by the same method (preferably “OSKL-iPS cell” or “OSK-iPS cell” in Examples described later) except that the H1foo gene or its gene product is not introduced into somatic cells.
  • iPS cells in which the number of viable cells measured by the method described in the item “Comparison of cell viability in the early stage of differentiation induction” described later is improved 1.2 times, preferably 1.5 times.
  • an iPS cell produced by the same method except that the H1foo gene or its gene product is not introduced into a somatic cell preferably, “OSKL-iPS cell” or “OSK-iPS cell” in Examples described later
  • the variation in the expression level of Oct3 / 4 gene was measured by the method described in the item of Comparative differentiation inducing early undifferentiated markers residual amount of iPS cells] described later (undifferentiated marker for stem cells) (sigma 2 IPS cells reduced by 10% or more, preferably 20% or more.
  • the biological species from which the above iPS cells are derived is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
  • any mammal such as human, mouse, rat, cow, sheep, horse, monkey, etc. Can be mentioned.
  • the iPS cell quality improving agent of the present invention includes at least the H1foo gene or a gene product thereof, and may further include other components as necessary.
  • the H1foo gene or gene product thereof is the same as that described in the above-described method for producing iPS cells. Further, the H1foo gene or its gene product may contain the same mutation as described in the above iPS cell production method.
  • what was integrated in said expression vector containing the promoter which can function by the somatic cell used as a host as a H1foo gene may be used.
  • composition for iPS cell production of the present invention comprises (a) a nuclear reprogramming substance, and (b) an H1foo gene or a gene product thereof, and may further comprise other components as necessary. .
  • the (a) nuclear reprogramming substance and (b) the H1foo gene or gene product thereof are the same as those described in the above-described iPS cell production method.
  • the H1foo gene or its gene product, the gene that is a nuclear reprogramming substance or its gene product may contain the same mutations as described in the above-mentioned iPS cell production method.
  • Preferred forms of the nuclear reprogramming substance in the composition for producing iPS cells include a form in which a gene is incorporated into a vector, a form of synthetic mRNA, a form of a protein (preferably a recombinant protein), and the like.
  • a vector the thing similar to what was described by the manufacturing method of said iPS cell is mentioned.
  • Said synthetic mRNA and said protein (preferably recombinant protein) can be manufactured by a well-known method.
  • composition for producing iPS cells may be one in which the above (a) nuclear reprogramming substance and the above (b) H1foo gene or gene product thereof are divided into individual containers, What was put together in one container may be sufficient, and what was put together in the container for every arbitrary number may be sufficient.
  • the amount of the above-mentioned (a) nuclear reprogramming substance and (b) the H1foo gene or gene product thereof in the composition for producing iPS cells is not particularly limited, and all nuclear reprogramming substances, H1foo The gene or its gene product may be equal or different.
  • the above composition for producing iPS cells may contain a gene other than the above (a) nuclear reprogramming substance, the above (b) H1foo gene or its gene product, or a gene product thereof.
  • a packaging cell may be included. Examples of the genes or gene products other than the genes or gene products thereof and the packaging cells include those described in the method for producing iPS cells.
  • a method for improving the quality of iPS cells comprising the step of introducing the H1foo gene or gene product thereof into a somatic cell”; “Use of the H1foo gene or its gene product in the production of an iPS cell quality improving agent”, “Use of (a) nuclear reprogramming substance and (b) H1foo gene or gene product thereof in the production of a composition for producing iPS cells” Is also included.
  • the step of introducing the H1foo gene or its gene product into the somatic cell in the above-mentioned “method for improving the quality of iPS cells” is the same as the introducing step in the method for producing iPS cells of the present invention. By including such a step, the quality of iPS cells can be improved and high-quality iPS cells can be obtained.
  • H1foo cDNA and H1cDNA (Teranishi, T., et al. Rapid replacement of somatic linker histones with the oocyte-specific linker histone H1foo in nuclear transfer. Developmental Biology 266, 76-86 (2004).) It was inserted into BamH1-Sal1 site and EcoR1-Sal1 site, and it was confirmed by DNA sequencing that H1foo cDNA and H1cDNA were inserted.
  • mice iPS cells and cell culture method 1) The production of mouse iPS cells is described in literature (Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols 2, 3081-3089 (2007)). Was performed according to the protocol described in. However, in this test, the H1foo gene was also used in addition to the genes described in the literature.
  • a pMXs retroviral vector containing the mouse Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and H1foo genes nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3: BC137916
  • mouse fibroblasts or Nanog-GFP-IRES-puro transgenic mice
  • Nanog-GFP-IRES-puro transgenic mice Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-317 (2007)
  • IPS cells were produced from “blast cells”.
  • the DsRed gene was used instead of the H1foo gene.
  • the experimental mice were managed in accordance with the Keio University animal and DNA experiment guidelines.
  • Mouse ES cells (B6J-23 UTR ) (Tanimoto, Y., et al. Embryonic stem cells derived from C57BL / 6J and C57BL / 6N mice. Comparative medicine 58, 347-352 (2008)) Obtained from the Resource Center and used in accordance with the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology guidelines on the distribution and use of human ES cells.
  • Mouse iPS and ES cell lines are 20% KnockOut Serum Replacement (Gibco), 1 mM GlutaMAX (Gibco), 1 mM non-essential amino acid (Sigma-Aldrich), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 50U In a DMEM (Sigma-Aldrich) culture medium (hereinafter referred to as “iPS cell culture medium”) containing penicillin, 50 mg / ml sputomycin (Gibco), and mouse leukemia inhibitory factor (LIF), Cultured and maintained on mouse embryonic fibroblasts (iMEF feeder cells) irradiated with X-rays derived from type ICR mice. The mouse iPS cell culture medium was changed every 2 to 3 days, and the cells were passaged every 2 to 3 days using 0.5 mM trypsin-EDTA (Gibco).
  • EB formation of iPS cells was performed by seeding 5 ⁇ 10 4 iPS cells collected using 1 mg / ml collagenase IV on a 100 mm low adhesion plate (manufactured by AGC), 20% FBS (manufactured by Gibco), Minimum essential containing 2 mM GlutaMAX (Gibco), 0.1 mM non-essential amino acid (Sigma-Aldrich), 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 50 U / ml penicillin, and 50 mg / ml streptomycin (Gibco) This was carried out by culturing for 5 days in the presence of Medium Alpha Medium (Gibco) (hereinafter referred to as “EB-forming culture medium”). The culture medium for EB formation was changed every 2 to 3 days. In addition, ES cells were used as a control.
  • EB-forming culture medium Medium Alpha Medium
  • mice manufactured by Claire Japan
  • ketamine 50 mg / kg
  • xylazine 10 mg / kg
  • chlorpromazine 1.25 mg / kg
  • mice were sacrificed by cervical dislocation, and tissue sections injected with iPS cells were fixed in 10% paraformaldehyde (PFA) overnight, embedded in paraffin, and then treated with hematoxylin. Confirmed by eosin (HE) staining.
  • PFA paraformaldehyde
  • HE eosin stain
  • the anesthesia treatment of the mouse was appropriately performed by monitoring the mouse heart rate, muscle relaxation, and sensory reflex response (that is, no response to tail pinch).
  • IPS cells and fibroblasts seeded on a glass bottom dish were washed once with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde (manufactured by Muto Chemical) at 4 ° C. for 15 minutes.
  • Fixed cells were permeabilized with 0.5% Triton X-100 in PBS for 10 minutes at room temperature.
  • ImmunoBlock DS Pharma Biomedical
  • four types of primary antibodies anti-Oct3 / 4 antibody [Oct3 / 4 antibody sc-8629, Santa Cruz Biotechnology)], anti-Nanog antibody [RCAB0001P Reprocell], anti-SSEA1 antibody [sc-21702; Santa Cruz Biotechnology], and anti-H1foo antibody [HPA037992; Sigma-Aldrich]
  • ImmunoBlock DS Pharma Secondary antibodies (anti-rabbit IgG antibody and anti-mouse IgG or IgM antibody conjugated with Alexa Fluor 488 or Alexa Fluor 568 [Life Technologies]) corresponding to each primary antibody Incubate for 60 minutes at room temperature and with 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; Life Technologies) After staining the cell nucleus, equipped with a color charge coupled device camera (BZ-9000; manufactured by Keyence), an optical microscope (IX71; manufactured by
  • RNA samples were isolated using TRIZOL reagent (Life Technologies) according to the instructions attached to the product. The concentration and purity of the RNA sample were measured with an ND-1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific), and cDNA was prepared using ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo). Quantitative PCR (QT-PCR) was performed with a 7500 real-time PCR system (Life Technologies) using SYBR Premix ExTaq (Takara Bio). The amount of mRNA was normalized by the amount of GAPDH mRNA. The nucleotide sequence of the primer set used for quantitative PCR is shown in Table 1 below.
  • IPS cells on the first day after culturing in the culture medium for EB formation were trypsinized and suspended in annexin A5 binding buffer (Takara Bio Inc.), and then annexin according to the instructions attached to the product.
  • -A5-FITC and propidium iodide (PI) (manufactured by BD) stained early and late apoptotic cells, respectively.
  • the cells were filtered through a 70 mm pore nylon membrane, the cells stained with FACS Aria3 (BD) flow cytometry were analyzed using CellQuest software (BD), and FlowJo software (Tree Star) was used. The percentage of apoptotic cells was measured.
  • genomic DNA was analyzed from cell samples using the SV genomic DNA purification kit (Promega). Was isolated and purified. Using the EZ DNA methylation gold kit (manufactured by ZYMO RESEARCH), the purified genomic DNA is converted from unmethylated cytosine (C) to uracil (U) according to the instructions attached to the product, and input DNA for bisulfite PCR Was prepared. Using this input DNA, primer set, and TaKaRa EpiTaq HS (TaKaRa), PCR reaction conditions (one cycle of denaturation treatment at 98 ° C.
  • Bisulfite PCR was performed under 40 cycles of 60 seconds of amplification treatment; and 1 cycle of final extension treatment at 72 ° C. for 5 minutes.
  • the nucleotide sequence of the primer set used for bisulfite PCR is shown in Table 2 below.
  • the PCR product was purified, TA-cloned into a pGEM-T vector (Promega), and sequenced.
  • IG-DMR intergenic methylation variable region
  • Gtl2-DMR Gtl2 methylation variable region
  • pyrosequence was performed using PyroMark Q24 (manufactured by QIAGEN) according to the instructions attached to the product. The nucleotide sequence of the primer set used for the pyrosequence is shown in Table 3 below.
  • ES cells and iPS cells Two-cell embryos were harvested from ICR (CD-1®) female mice that were superovulated and spontaneously mated, and then cultured to the blastocyst stage. ES cells and iPS cells were dissociated with 0.25% trypsin immediately before co-culture aggregation, and 15-20 cells were aggregated with 8-cell stage blastomeres from which the transparent membrane was removed. A blastocyst stage chimeric embryo was introduced into the uterine horn of a 2.5 dpc (days of post-coitus) ICR pseudopregnant mouse.
  • Total RNA was isolated from iPS cells and ES cells, cyanine-labeled antisense RNA was amplified using Quick Amp Labeling Kit (Agilent Technologies), and the whole mouse genome oligo microarray (Agilent Technologies) was amplified using a gene expression hybridization kit. And analyzed using an Agilent microarray scanner. Data was analyzed with GeneSpring GX12.0 software (Agilent Technologies).
  • H1foo gene (OSK + H1foo gene) is introduced into a somatic cell using a retrovirus vector, and ALP (Alkaline phosphatase) staining using TRACP & 20ALP double- stain Kit (Takara Bio) on the 20th day The number of colonies that were ALP positive and composed of ES-like cells was measured.
  • ALP is known as a stem cell marker.
  • the OSK + H1foo gene was introduced into Nanog-GFP-expressing fibroblasts, and the quality of iPS cells (FIG. 3a) produced using the GFP signal as an indicator was examined.
  • Nanog-GFP positive cells are known as high quality stem cell markers.
  • the H1foo gene is introduced into the Nanog-GFP-expressing fibroblasts in addition to the OSK gene, the number of colonies of Nanog-GFP-positive ES-like cells (iPS cells) is about compared to the case where the OSK gene is introduced. An 8-fold increase was shown (FIG. 3b).
  • the ratio of Nanog-GFP positive ES-like cells (iPS cells) in the produced iPS cell population was as high as 90% or more (FIG. 3c).
  • OSK gene and c-Myc gene OSKM gene
  • H1foo gene OSKM + H1foo gene
  • the OSK + H1foo gene is introduced into the Nanog-GFP-expressing fibroblasts in addition to the OSKM gene
  • the OSK + H1foo gene is introduced.
  • the number of Nanog-GFP positive colonies per se was large (FIG. 3b), but the proportion of Nanog-GFP positive cells in the produced iPS cell population was low (FIG. 3c).
  • OSK + H1foo-iPS cells The properties of OSK + H1foo-iPS cells were analyzed in detail. According to the method described in the above [Quantitative RT-PCR analysis], the expression of four pluripotency markers (Oct3 / 4, Sox2, Rex1, and Sall4) was analyzed. As a result, OSK + H1foo-iPS cells -Similar to iPS cells, it was shown to express the pluripotency markers (Table 4). In addition, the expression of foreign genes including the H1foo gene was suppressed (Table 5). Further, when the cell proliferation rate was analyzed, the proliferation level of OSK + H1foo-iPS cells was the same as that of OSK-iPS cells.
  • Table 4 shows five types of pluripotency in ES cells (ES), OSK-iPS cell 3 clones (OSK-iPS1-3), OSK + H1foo-iPS cell 3 clones (OSKH-iPS1-3), and MEF cells (MEF). It is a table
  • surface which shows the result of having analyzed the expression of the sex marker (Nanog, Oct3 / 4, Sox2, Rex1, and Sall4).
  • the expression level of each pluripotency marker is shown as a relative value when the result of ES cells is 1.
  • Table 5 shows ES cells (ES), OSKH gene-introduced MEF cells (MEF + OSKH), OSK-iPS cell 3 clones (OSK-iPS1-3), OSK + H1foo-iPS cell 3 clones (OSKH-iPS1-3), and MEF cells. It is a table
  • surface which shows the result of having analyzed the expression of three types of foreign proteins (Oct3 / 4, Sox2, and H1foo) in (MEF). The expression level of each pluripotency marker is shown as a relative value when the result of the OSKH gene-introduced MEF cell is 1.
  • OSK + H1foo-iPS cells like ES cells and OSK-iPS cells, have two types of pluripotency marker (Oct3 / 4 and Nanog) gene promoter regions, IG-DMR, and Gtl2-DMR DNA. It was demethylated ( Figures 5a and b).
  • OSK-iPS cells variations in demethylation levels were observed among clones (cell groups), whereas in OSK + H1foo-iPS cells, the degree of such variations was low (FIGS. 5a and b).
  • EBs derived from OSK + H1foo-iPS cells In the case of inducing differentiation from iPS cells to various cells, usually, EB is first formed, and then differentiation is further induced by a differentiation induction method specific to various cells. Since the number of EBs formed and the uniformity of the EB size are thought to affect the subsequent differentiation induction efficiency, iPS cells that are uniform in size and capable of forming a large number of EBs are considered desirable. It was. Therefore, the EB formation ability of OSK + H1foo-iPS cells was analyzed.
  • the ratio of viable cells (annexin V ( ⁇ ) / PI ( ⁇ ) cells) in EBs derived from OSK + H1foo-iPS cells was improved by about 1.2 times compared to EBs derived from OSK-iPS cells.
  • EBs derived from OSK + H1foo-iPS cells are apoptotic cells (total of annexin V (+) / PI ( ⁇ ) cells and annexin V (+) / PI (+) cells) compared to EBs derived from OSK-iPS cells. The ratio decreased to about 0.65 times.
  • OSK + H1foo-iPS cell differentiation pluripotency The differentiation pluripotency of OSK + H1foo-iPS cells was analyzed. According to the method described in the above item [Co-aggregation method of ES cells and iPS cells], a chimeric mouse is prepared using two clones (OSKH1 and 3) having normal chromosome number among OSK + H1foo-iPS cells. did. As a control, chimera mice were prepared according to the same method using two clones (OSK1 and 2) having normal chromosome numbers among OSK-iPS cells.
  • Germline transmission potential also known as gonadal transfer potential
  • pluripotent stem cells such as ES cells and iPS cells can differentiate into germ cells, and the next generation of genes derived from pluripotent stem cells via chimeras Ability that can be communicated to.
  • This germline transmission potential is one of the most stringent characteristics of being a pluripotent stem cell, and is one of the characteristics indicating that the pluripotent stem cell is of high quality.
  • IVF in vitro fertilization
  • OSKH1, OSKH3-1, OSKH3-2, and OSKH3-3) were 2 types of OSK-iPS cell-derived chimeric mice (OSK2-1 and OSK2-2). It showed higher fertility (Fig. 10a) and gave birth to many colored hair pups (Fig. 10b and c). No phenotypic abnormality was observed in such pups. The above results indicate that OSK + H1foo-iPS cells have high pluripotency.
  • Human iPS cells are produced in the literature (Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K., Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus, Nature Protocols 7, 718-728, 2012).
  • Sendai virus vectors containing human Oct3 / 4, Sox2, Klf4, L-Myc and H1foo genes nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 BC047943
  • iPS cells from human peripheral blood lymphocytes or human dermal fibroblasts ( OSKL + H1foo-iPS cells).
  • OSKL + H1foo-iPS cells As a control, iPS cells (OSKL-iPS cells) were produced using the Azami-Green gene instead of the H1foo gene. This experiment was conducted in accordance with Keio University guidelines for genetic modification experiments.
  • human iPS cell culture solution The culture medium of human iPS cells was changed every 2 days, and the cells were passaged every 5-7 days using StemPro®Accutase (Gibco).
  • Such quantitative RT-PCR analysis was performed using 4 clones of OSKL + H1foo-iPS cells and 4 clones of OSKL-iPS cells (control) according to the method described in the above [Quantitative RT-PCR analysis].
  • the results of quantitative RT-PCR analysis for the SRF gene are shown in FIG. 11a, and the results of quantitative RT-PCR analysis for the ACTG2 gene are shown in FIG. 11b.
  • the OSKL + H1foo-iPS cell group showed significantly higher expression levels than the OSKL-iPS cell group (control) for both the SRF gene and the ACTG2 gene. From this result, it was shown that when the H1foo gene was used in addition to the nuclear reprogramming substance, chromosomal abnormalities that could occur during the iPS cell establishment process were suppressed, and a higher-quality iPS cell population could be produced.
  • FIG. 13 shows the results of calculating the number of sex cells for 4 clones of OSKL + H1foo-iPS cells and 4 clones of OSKL-iPS cells (control).
  • the OSKL + H1foo-iPS cell group has a significantly larger number of viable cells after differentiation induction and has higher adaptability to the differentiation induction environment than the OSKL-iPS cell group (control).
  • a trend was observed. From this result, in addition to the nuclear reprogramming substance, when using the H1foo gene, a higher-quality iPS cell population with a higher number of viable cells after differentiation induction and higher adaptability to the differentiation induction environment can be obtained. It was shown that it can be produced.
  • differentiation induction culture solution [DMEM F12 HAM (Sigma Aldrich) + FBS (Gibco) ) + GlutaMAX (manufactured by Gibco) + PenStrep (manufactured by Gibco) +2 mercaptoethanol (manufactured by Sigma Aldrich)]
  • DMEM F12 HAM Sigma Aldrich
  • FBS Gibco
  • GlutaMAX manufactured by Gibco
  • PenStrep manufactured by Gibco
  • 2 mercaptoethanol manufactured by Sigma Aldrich
  • iPS cells prepared using the H1foo gene when cultured in a differentiation-inducing medium, rapidly lose the expression of undifferentiated markers and have little variation in their disappearance. It has been shown. Thus, it was shown that the use of the H1foo gene in addition to the nuclear reprogramming substance can produce an iPS cell population with less quality variation.
  • the present invention can provide an iPS cell quality improving agent, a method for producing iPS cells, an iPS cell produced by such a production method, and a composition for producing iPS cells. According to the present invention, iPS cells with higher quality and less quality variation can be produced.

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Abstract

本発明は、ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、かかる製造方法により製造されるｉＰＳ細胞、及び、ｉＰＳ細胞製造用組成物を提供することを目的とする。本発明のｉＰＳ細胞の製造方法は、（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程を含むことを特徴とする。核初期化物質だけでなく、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入することにより、品質の高いｉＰＳ細胞をより多く製造することができる。

Description

高品質なｉＰＳ細胞の製造方法
　本発明は、ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、かかる製造方法により製造されるｉＰＳ細胞、及び、ｉＰＳ細胞製造用組成物に関する。
　ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞（「人工多能性幹細胞」又は「誘導多能性幹細胞」とも呼ばれる。）は、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃを導入することによって、体細胞から産生することができる（非特許文献１、特許文献１）。これは、親体細胞の転写ネットワーク及びエピジェネティックシグネチャー（epigenetic signature）をリプログラミングすることによって達成できる。ｉＰＳ細胞は、基礎研究、医薬の革新、及び再生医療にさまざまな利益をもたらす。しかし、生成したｉＰＳ細胞の細胞群が、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）の細胞群と比較して不均一な品質（heterogeneous quality）であることは、依然として深刻な問題である。例えば、ＥＳ細胞の場合、細胞毎の性質のばらつきが小さく、おおむねどの細胞も目的とする細胞へ分化させることができるのに対し、ｉＰＳ細胞は、細胞毎の性質のばらつきが大きく、目的とする細胞へ分化させることができない細胞がしばしばあった。いずれのｉＰＳ細胞もばらつきなく高品質を示すことは、基礎研究及び臨床目的のために重要である。
　ｉＰＳ細胞の細胞群の品質が不均一であるという問題を解決するために、多くの試みがなされてきた。例えば特許文献２には、所定量のＯｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子及びＳｏｘ２の遺伝子を、体細胞に所定回数導入すると、ｉＰＳ細胞の製造効率及び安定性を向上させることができる旨が記載されている。また、特許文献３には、Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物に加えて、Ｐｒｄｍ１４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｅｓｒｒｂ遺伝子乃至その遺伝子産物、及びＳａｌｌ４ａ遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入することにより、品質面に優れた人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を効率良く、短期間で製造することができる旨が記載されている。さらに特許文献４には、Ｏｃｔ３／４遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子乃至その遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子乃至その遺伝子産物及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子乃至その遺伝子産物に加えて、Ｊａｒｉｄ２変異体遺伝子乃至その遺伝子産物を体細胞に導入することにより、品質面に優れた人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を効率良く、短期間で製造することができる旨が記載されている。しかし、ｉＰＳ細胞の品質にはまだ改善の余地があった。そこで、より高品質でしかも品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞の製造方法の開発が求められていた。
　なお、リンカーヒストンＨ１ファミリーは、リンカーＤＮＡに結合し、遺伝子発現を制御するために、高次クロマチン構造を生じさせる。リンカーヒストンＨ１ファミリーのメンバーには、ヒストンＨ１ａ、Ｈ１ｂ、Ｈ１ｃ、Ｈ１ｄ、Ｈ１ｅ、Ｈ１ｆｏｏ、Ｈ１ｘ、Ｈ１．０、Ｈ１ｔ、Ｈ１Ｔ２、ＨＩＬＳ１が含まれている。リンカーヒストンファミリーの大部分のメンバーは、クロマチンを凝縮する体細胞リンカーヒストンからなる。したがって、かかる構造は、一般的に全体的な遺伝子転写活性を抑制する（非特許文献２、３）。
特許第４１８３７４２号公報 特開２０１１－００４６７４号公報 特開２０１４－２１７３４４号公報 特開２０１４－２１７３４５号公報
Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell126, 663-676 (2006) Steinbach, O.C., Wolffe, A.P. & Rupp, R.A. Somatic linker histones cause loss of mesodermal competence in Xenopus. Nature 389, 395-399 (1997) Hebbar, P.B. & Archer, T.K. Altered histone H1 stoichiometryand an absence of nucleosome positioning on transfected DNA. The Journal of biological chemistry 283, 4595-4601 (2008)
　本発明の課題は、ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、かかる製造方法により製造されるｉＰＳ細胞、及び、ｉＰＳ細胞製造用組成物を提供することにある。
　本発明者らは、ｉＰＳ細胞の品質を改善すべく、鋭意検討を行った結果、核初期化物質を体細胞に導入してｉＰＳ細胞を製造する方法において、核初期化物質だけでなく、「Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物」を体細胞に導入すると、より高品質でしかも品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞を製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。「Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物」を核初期化物質と併用することによって、より高品質でしかも品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞を製造できたことは、当業者にとって意外であった。
　すなわち、本発明は、
（１）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞の品質改善剤や、
（２）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を含む発現ベクターを含むことを特徴とする上記（１）に記載のｉＰＳ細胞の品質改善剤を提供する。
　また、本発明は、
（３）（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞の製造方法や、
（４）核初期化物質が、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子、並びに、それらの遺伝子産物からなる群から選択される少なくとも１つを含む上記（３）に記載のｉＰＳ細胞の製造方法や、
（５）核初期化物質が、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ遺伝子ファミリー遺伝子又はその遺伝子産物からなる上記（３）又は（４）に記載のｉＰＳ細胞の製造方法や、
（６）核初期化物質が、Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物からなる上記（３）～（５）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法や、
（７）核初期化物質が、Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物からなる上記（３）～（５）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法を提供する。
　さらに、本発明は、
（８）上記（１）～（７）のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法により製造されるｉＰＳ細胞や、
（９）（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞製造用組成物を提供する。
　本発明は、ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、かかる製造方法により製造されるｉＰＳ細胞、及び、ｉＰＳ細胞製造用組成物を提供することができる。本発明によれば、より高品質で、しかも品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞を製造することができる。
外来性（マウス）Ｈ１ｆｏｏを発現させたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの尾部線維芽細胞（以下、単に「マウス線維芽細胞」という）の顕微鏡による画像である。図１ａの「ＢＦ」、「ＤＡＰＩ」、「Ｈ１ｆｏｏ」、及び「ＭＥＲＧＥ」画像は、それぞれ、位相差画像、ＤＡＰＩ蛍光染色画像、Ｈ１ｆｏｏ蛍光染色画像、及び前記３種の画像を重ね合わせた画像を示す。図１ｂの左右の画像は、それぞれＨ１ｆｏｏ蛍光染色２次元及び２．５次元画像を示す。図１ｃの左右の画像は、それぞれコントロール細胞（マウス線維芽細胞）及び外来性Ｈ１ｆｏｏを発現させたマウス線維芽細胞の電子顕微鏡画像を示す。 図２ａは、３種類の核初期化物質（マウスＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４遺伝子［ＯＳＫ遺伝子］）、ＯＳＫ遺伝子及びリンカーヒストンＨ１遺伝子（ＯＳＫ＋Ｈ１ｃ遺伝子）、又はＯＳＫ遺伝子及びＨ１ｆｏｏ遺伝子（ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子）をマウス線維芽細胞へ導入し、ＡＬＰ陽性ＥＳ様細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー形成効率を解析した結果を示す図である。図２ｂは、ＯＳＫ遺伝子、又はＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を導入して産生されたｉＰＳ細胞（以下、それぞれ「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」及び「ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞」という）における、３種類の多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及びＳＳＥＡ１）の発現を解析した結果を示す図である。図２ｃは、ＯＳＫ遺伝子、又はＯＳＫ遺伝子、及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子（ＯＳＫＭ遺伝子）を導入後１～５日目における内在性Ｈ１ｆｏｏの発現を解析した結果を示す図である。図２ｃ中の「ＭＥＦ＋Ｈ１ｆｏｏ」は、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を導入したマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）を解析した結果を示す。 ＯＳＫＭ遺伝子、ＯＳＫＭ遺伝子及びＨ１ｆｏｏ遺伝子（ＯＳＫＭ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子）、ＯＳＫ遺伝子、又はＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子をＮａｎｏｇ－ＧＦＰ発現線維芽細胞に導入し、Ｎａｎｏｇ－ＧＦＰ陽性ＥＳ様細胞（ｉＰＳ細胞）の割合を解析した結果を示す図である。 図４ａは、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞とＥＳ細胞の間で、全遺伝子トランスクリプトームプロファイルを比較した結果を示す図である。図４ｂは、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞とＯＳＫ－ｉＰＳ細胞の間で、全遺伝子トランスクリプトームプロファイルを比較した結果を示す図である。 ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞及びＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞のＩＧ－ＤＭＲ（図５ａ）、及びＧｔｌ２－ＤＭＲ（図５ｂ）のＤＮＡメチル化レベルを解析した結果を示す図である。図中の「ＥＳ」及び「ＭＥＦ」は、それぞれＥＳ細胞及びＭＥＦ細胞を解析した結果を示す。 ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞及びＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞から形成させた胚様体（ＥＢ）の形態を解析した結果を示す図である。 ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞及びＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞から形成させたＥＢのアポトーシス細胞の割合を解析した結果を示す図である。 ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞及びＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞から形成させたＥＢにおける細胞増殖マーカー２種（Ｋｉ６７及びＰＣＮＡ）の発現を解析した結果を示す図である。 ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞及びＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞のキメラ形成能を解析した結果を示す図である。 ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞及びＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のキメラマウスの生殖系列移行能を解析した結果を示す図である。 ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－ＭｙｃおよびＨ１ｆｏｏ遺伝子を導入して産生したｉＰＳ細胞）、及び、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびＬ－Ｍｙｃ遺伝子を導入して産生したｉＰＳ細胞）において、ＳＲＦ遺伝子（図１１ａ）やＡＣＴＧ２遺伝子（図１１ｂ）について定量ＲＴ－ＰＣＲ解析を行った結果を示す図である。グラフ横軸の１～４の数値は、クローン番号を表す。 ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞、及び、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞において、Ｏｃｔ３／４遺伝子について定量ＲＴ－ＰＣＲ解析を行った結果を示す図である。グラフ横軸の１～４の数値は、クローン番号を表す。 ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞、及び、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞を分化誘導培養して５日間の時点での細胞生存数を示す図である。グラフ横軸の１～４の数値は、クローン番号を表す。 ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞、及び、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞を分化誘導培養して５日間の時点で、Ｏｃｔ３／４遺伝子について定量ＲＴ－ＰＣＲ解析を行った結果を示す図である。グラフ横軸の１～４の数値は、クローン番号を表す。
１．ｉＰＳ細胞の製造方法
　本発明のｉＰＳ細胞の製造方法は、（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程（以下、単に「導入工程」とも表示する。）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含み得る。
＜導入工程＞
　上記導入工程は、少なくとも、（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程である。核初期化物質だけでなく、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入することにより、品質の高いｉＰＳ細胞をより多く製造することができる。本明細書において、遺伝子産物とは、遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、及び／又は、該ｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質を意味する。また、上記のＨ１ｆｏｏ遺伝子とは、Ｈ１ｆｏｏタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。なお、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物は、ｉＰＳ細胞の品質改善剤として使用することができる。また、後述するＨ１ｆｏｏ遺伝子を含むベクターもまた、ｉＰＳ細胞の品質改善剤として使用することができる。
（Ｈ１ｆｏｏ遺伝子）
　上記Ｈ１ｆｏｏ遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの任意の哺乳動物が挙げられる。上記Ｈ１ｆｏｏ遺伝子の配列情報は、公知のデータベースから得ることができ、例えば、GenBankでは、アクセッション番号BC047943（ヒト）、AY158091（ヒト）、BC137916（マウス）で入手することができる。ヒトのＨ１ｆｏｏ遺伝子（BC047943）のヌクレオチド配列を配列番号１に表し、ヒトのＨ１ｆｏｏタンパク質（BC047943のＨ１ｆｏｏ遺伝子がコードするタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号２に表す。ヒトのＨ１ｆｏｏ遺伝子（AY158091）のヌクレオチド配列を配列番号５９に表し、ヒトのＨ１ｆｏｏタンパク質（AY158091のＨ１ｆｏｏ遺伝子がコードするタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号６０に表す。また、マウスのＨ１ｆｏｏ遺伝子（BC137916）のヌクレオチド配列を配列番号３に表し、マウスのＨ１ｆｏｏタンパク質（BC137916のＨ１ｆｏｏ遺伝子がコードするタンパク質）のアミノ酸配列を配列番号４に表す。
　上記Ｈ１ｆｏｏ遺伝子のヌクレオチド配列や、そのｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、野生型のＨ１ｆｏｏ遺伝子のヌクレオチド配列や、そのｍＲＮＡのヌクレオチド配列と同一であってもよいし、変異を含んでいてもよい。かかる変異を含むヌクレオチド配列としては、「野生型のＨ１ｆｏｏ遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１又は５９又は３に表されるヌクレオチド配列）又はそのｍＲＮＡのヌクレオチド配列において、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列であって、Ｈ１ｆｏｏ活性を有するタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列」や、「タンパク質に翻訳される部分のヌクレオチド配列において、野生型のＨ１ｆｏｏ遺伝子のヌクレオチド配列（例えば、配列番号１又は５９又は３に表されるヌクレオチド配列）又はそのｍＲＮＡのヌクレオチド配列との配列同一性が、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であるヌクレオチド配列であって、Ｈ１ｆｏｏ活性を有するタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列」などが挙げられる。
　上記Ｈ１ｆｏｏタンパク質のアミノ酸配列は、野生型のＨ１ｆｏｏタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２又は６０又は４に表されるアミノ酸配列）と同一であってもよいし、変異を含んでいてもよい。かかる変異を含むタンパク質としては、「野生型のＨ１ｆｏｏタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２又は６０又は４に表されるアミノ酸配列）において、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｈ１ｆｏｏ活性を有するタンパク質」や、「野生型のＨ１ｆｏｏタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号２又は６０又は４に表されるアミノ酸配列）との配列同一性が、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｈ１ｆｏｏ活性を有するタンパク質」が挙げられる。本明細書において「Ｈ１ｆｏｏ活性を有するタンパク質」とは、核初期化物質と共に体細胞に導入した場合に、該核初期化物質のみを体細胞に導入した場合と比較して、品質の高いｉＰＳ細胞をより多く製造することができるタンパク質を意味する。
（核初期化物質）
　本明細書において「核初期化物質」とは、その物質単独、又はその物質と他の物質との組み合わせを体細胞の細胞内に導入することにより、体細胞をｉＰＳ細胞に誘導することができる物質（群）を意味する。かかる核初期化物質としては、体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することができる物質（群）であれば、遺伝子（発現ベクターに組み込まれた形態を含む）又はその遺伝子産物、あるいは低分子化合物等のいかなる物質であってもよい。核初期化物質である遺伝子とは、核初期化物質であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味する。核初期化物質が遺伝子又はその遺伝子産物の場合、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子、並びに、それらの遺伝子産物からなる群から選択される少なくとも１つを挙げることができ（ＷＯ２００７／６９６６６；特許第５６９６２８２号; Science, 2007, 318:1917-1920）、中でも、かかる群から選択される２つ以上が好ましく、３つ以上がより好ましく挙げられ、また、かかる群から選択される２～４つの範囲内が好ましく、３つ又は４つがより好ましく挙げられる。これらのファミリーの遺伝子及びその組み合わせの具体例を以下に列挙する。なお、以下においては遺伝子の名称のみを記載するが、その遺伝子産物を用いる場合も含まれる。
（ａ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる１種の核初期化物質；
（ｂ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＳｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる２種の核初期化物質の組み合わせ；
（ｃ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＫｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる２種の核初期化物質の組み合わせ；
（ｄ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＮａｎｏｇ遺伝子からなる２種の核初期化物質の組み合わせ；
（ｅ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＫｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる３種の核初期化物質の組み合わせ；
（ｆ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＭｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる３種の核初期化物質の組み合わせ。
（ｇ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＭｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる４種の核初期化物質の組み合わせ；並びに
（ｈ）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子からなる４種の核初期化物質の組み合わせ；
あるいは、上記（ａ）～（ｈ）のいずれかの核初期化物質又はその組み合わせに、さらに他の核初期化物質（遺伝子又はその遺伝子産物）を追加した組み合わせであってもよい。具体的に記載すると、
（ａ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる１種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ；
（ｂ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＳｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる２種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ；
（ｃ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＫｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる２種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ；
（ｄ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＮａｎｏｇ遺伝子からなる２種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ；
（ｅ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＫｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる３種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ；
（ｆ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＭｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる３種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ。
（ｇ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子及びＭｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子からなる４種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ；並びに
（ｈ’）Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子からなる４種の核初期化物質を含む核初期化物質の組み合わせ；
　より具体的には、以下の組み合わせが例示されるが、これらに限定されない。
（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子；
（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（ここで、Ｓｏｘ２遺伝子はＳｏｘ１遺伝子、Ｓｏｘ３遺伝子、Ｓｏｘ１５遺伝子、Ｓｏｘ１７遺伝子又はＳｏｘ１８遺伝子で置換可能である。また、Ｋｌｆ４遺伝子はＫｌｆ１遺伝子、Ｋｌｆ２遺伝子又はＫｌｆ５遺伝子で置換可能である。さらに、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子は、Ｔ５８Ａ（活性型変異体）遺伝子、Ｎ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｌ－Ｍｙｃ遺伝子で置換可能である。）；
（３）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｆｂｘ１５遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｅｒａｓ遺伝子、ＥＣＡＴ１５－２遺伝子、ＴｃｌＩ遺伝子、β－ｃａｔｅｎｉｎ（活性型変異体Ｓ３３Ｙ）；
（４）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０　Ｌａｒｇｅ　Ｔ　ａｎｔｉｇｅｎ（以下、ＳＶ４０ＬＴ）遺伝子；
（５）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＨＰＶ１６　Ｅ６遺伝子；
（６）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＨＰＶ１６　Ｅ７遺伝子；
（７）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＨＰＶ６　Ｅ６遺伝子、ＨＰＶ１６　Ｅ７遺伝子；
（８）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、Ｂｍｉｌ遺伝子；
（上記（１）～（８）の組み合わせについては、ＷＯ２００７／０６９６６６を参照（但し、上記（２）の組み合わせにおいて、Ｓｏｘ２遺伝子からＳｏｘ１８遺伝子への置換、Ｋｌｆ４遺伝子からＫｌｆ１遺伝子若しくはＫｌｆ５遺伝子への置換については、Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）。「Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子」の組み合わせについては、Cell, 126, 663-676 (2006)、Cell, 131, 861-872 (2007) 等も参照。「Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ２（又はＫｌｆ５）遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子」の組み合わせについては、Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) も参照。「Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子」の組み合わせについては、Nature, 451, 141-146 (2008)も参照。）
（９）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子（Nature Biotechnology, 26, 101-106 (2008)を参照）；
（１０）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子（Science, 318, 1917-1920 (2007)を参照）；
（１１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)を参照）；
（１２）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子（Cell Research (2008) 600-603を参照）；
（１３）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子（Stem Cells, 26, 1998-2005 (2008)も参照）；
（１４）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子（Nature 454:646-650 (2008)、Cell Stem Cell, 2:525-528(2008))を参照）；
（１５）Ｏｃｔ３／４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（Nature 454:646-650 (2008)を参照）；
（１６）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子（Nature, 451, 141-146 (2008), WO2008/118820を参照）；
（１７）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子（WO2008/118820を参照）；
（１８）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子（WO2008/118820を参照）；
（１９）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｅｓｒｒｂ遺伝子（ここで、Ｅｓｓｒｒｂ遺伝子はＥｓｒｒｇ遺伝子で置換可能である。Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照）；
（２０）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｅｓｒｒｂ遺伝子（Nat. Cell Biol., 11, 197-203 (2009) を参照）；
（２１）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、Ｌ－Ｍｙｃ遺伝子；
（２２）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子；
（２３）Ｏｃｔ３／４遺伝子；
（２４）Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｌｉｎ２８遺伝子、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子（Science, 324: 797-801 (2009)を参照）；
　上記（１）～（２４）の組み合わせにおいて、Ｏｃｔ３／４遺伝子に代えて、他のＯｃｔ遺伝子ファミリーのメンバー遺伝子（例えばＯｃｔ１Ａ、Ｏｃｔ６など）を用いることもできる。また、Ｓｏｘ２遺伝子（又はＳｏｘ１遺伝子、Ｓｏｘ３遺伝子、Ｓｏｘ１５遺伝子、Ｓｏｘ１７遺伝子、Ｓｏｘ１８遺伝子）に代えて、他のＳｏｘ遺伝子ファミリーのメンバー遺伝子（例えばＳｏｘ７遺伝子など）を用いることもできる。さらにＬｉｎ２８遺伝子に代えて、他のＬｉｎ遺伝子ファミリーのメンバー遺伝子（例えばＬｉｎ２８ｂ遺伝子など）を用いることもできる。
　また、上記（１）～（２４）のいずれかの組み合わせそのものではないが、上記（１）～（２４）のいずれかにおける構成要素をすべて含み、且つ任意の他の物質（好ましくは他の核初期化物質）をさらに含む組み合わせも、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。また、核初期化の対象となる体細胞が上記（１）～（２４）の組み合わせのいずれかにおける構成要素の一部を、核初期化のために十分なレベルで内在的に発現している条件下にあっては、当該構成要素を除いた残りの構成要素のみの組み合わせもまた、本発明における「核初期化物質」の範疇に含まれ得る。
　さらにまた、上記の核初期化物質に加えて、Ｆｂｘ１５遺伝子、ＥＲａｓ遺伝子、ＥＣＡＴ１５－２遺伝子、Ｔｃｌ１遺伝子、及びβ－ｃａｔｅｎｉｎ遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の核初期化物質を組み合わせてもよく、及び／又はＥＣＡＴ１遺伝子、Ｅｓｇ１遺伝子、Ｄｎｍｔ３Ｌ遺伝子、ＥＣＡＴ８遺伝子、Ｇｄｆ３遺伝子、Ｍｙｂｌ２遺伝子、ＥＣＡＴ１５－１遺伝子、Ｆｔｈｌ１７遺伝子、Ｓａｌｌ４遺伝子、Ｒｅｘ１遺伝子、ＵＴＦ１遺伝子、Ｓｔｅｌｌａ遺伝子、Ｓｔａｔ３遺伝子、及びＧｒｂ２遺伝子からなる群から選ばれる１種以上の核初期化物質を組み合わせることもできる。これらの組み合わせについてはＷＯ２００７／６９６６６に具体的に説明されている。
　好ましい核初期化物質としては、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子（又はＬ－Ｍｙｃ遺伝子）、Ｌｉｎ２８遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子、並びに、それらの遺伝子産物からなる群から選択される少なくとも１つ、好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ以上が、好ましい核初期化物質の例として挙げられる。特に好ましい核初期化物質の組み合わせとしては、（１）Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、（２）Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物、（３）Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物を挙げることができ、中でも、Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物の組み合わせや、Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物の組み合せを好ましく挙げることができ、中でも、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、及びＫｌｆ４遺伝子の組み合わせや、Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子の組み合わせをより好ましく挙げることができる。
　本発明に用いる核初期化物質の１つとして、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物を用いてもよいが、ｃ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物を用いないことが好ましい。ｃ－Ｍｙｃは、Ｎａｎｏｇ－ＧＦＰ陽性コロニーの割合を低減し、細胞の発がん性を増加することが報告されているからである（Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nature biotechnology 26, 101-106 (2008)）。
　核初期化物質が遺伝子又はその遺伝子産物の場合、かかる遺伝子の由来としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの任意の哺乳動物が挙げられる。
　上記の各核初期化物質のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列情報は、ＷＯ２００７／０６９６６６に記載のGenBank accession numbersを参照することにより取得することができる。なお、Ｎａｎｏｇ遺伝子は当該公報中では「ＥＣＡＴ４」との名称で記載されている。また、上記の各核初期化物質のうち、特に好ましい３つの遺伝子（Ｏｃｔ３／４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子）のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列情報を、以下に改めて記載する。
遺伝子名 マウス     ヒト
Oct3/4   NM_013633  NM_002701
Sox2     NM_011443  NM_003106
Klf4     NM_010637  NM_004235
L-Myc    NM_008506  NM_001033081
　なお、ヒトのＯｃｔ３／４遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号４７に示し、ヒトのＯｃｔ３／４タンパク質のアミノ酸配列を配列番号４８に示し、ヒトのＳｏｘ２遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号４９に示し、ヒトのＳｏｘ２タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５０に示し、ヒトのＫｌｆ４遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号５１に示し、ヒトのＫｌｆ４タンパク質のアミノ酸配列を配列番号５２に示し、ヒトのＬ－Ｍｙｃ遺伝子のｃＤＮＡ配列を配列番号５３に示し、ヒトのＬ－Ｍｙｃタンパク質のアミノ酸配列を配列番号５４に示す。
　また、上記の各核初期化物質のうち、ＷＯ２００７／０６９６６６にGenBank accession numbersが記載されていない遺伝子のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列情報を以下に記載する。
遺伝子名 マウス       ヒト
Lin28    NM_145833     NM_024674
Lin28b   NM_001031772  NM_001004317
Esrrb    NM_011934     NM_004452
Esrrg    NM_011935     NM_001438
　当業者は、上記の各核初期化物質のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列情報に基づき、これらの核初期化物質のｃＤＮＡを容易に単離することができる。
　核初期化物質が上記各遺伝子又はそのｍＲＮＡである場合のそれらのヌクレオチド配列は、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、上記各遺伝子の各ヌクレオチド配列のうち、タンパク質に翻訳される部分のみであってもよいし、それ以外の部分を含んでいてもよい。また、上記各遺伝子のヌクレオチド配列や、そのｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、野生型の上記各遺伝子のヌクレオチド配列や、そのｍＲＮＡのヌクレオチド配列と同一であってもよいし、変異を含んでいてもよい。かかる変異を含むヌクレオチド配列としては、「野生型の上記各遺伝子のヌクレオチド配列又はそのｍＲＮＡのヌクレオチド配列において、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のヌクレオチドが欠失、置換、挿入、又は付加されたヌクレオチド配列であって、かつ、前記遺伝子の遺伝子産物の核初期化作用を有するタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列」や、「タンパク質に翻訳される部分のヌクレオチド配列において、野生型の上記各遺伝子のヌクレオチド配列又はそのｍＲＮＡのヌクレオチド配列との配列同一性が、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であるヌクレオチド配列であって、かつ、前記遺伝子の遺伝子産物の核初期化作用を有するタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列」などが挙げられる。
　核初期化物質が、上記各遺伝子によりコードされるタンパク質（すなわち、上記各遺伝子から転写されるｍＲＮＡから翻訳されるタンパク質）である場合のそれらのアミノ酸配列は、野生型の上記各遺伝子によりコードされるタンパク質と同一であってもよいし、変異を含んでいてもよい。かかる変異を含むタンパク質としては、「野生型の上記各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列において、１～３０個、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１５個、さらに好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、核初期化作用を有するタンパク質」や、「野生型の上記各遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列との配列同一性が、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、核初期化作用を有するタンパク質」が挙げられる。
（体細胞）
　上記体細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、胎児期の体細胞、成熟した体細胞などが挙げられる。上記成熟した体細胞の具体例としては、間葉系幹細胞、造血幹細胞、脂肪組織由来間質細胞、脂肪組織由来間質幹細胞、神経幹細胞、精子幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）；組織前駆細胞；線維芽細胞、上皮細胞、リンパ球、筋肉細胞等の既に分化した細胞；などが挙げられる。
　上記体細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの任意の哺乳動物が挙げられる。また、上記体細胞が由来する生物種と、該体細胞に導入する遺伝子が由来する生物種は同じでなくてもよいが、同じであることが好ましい。
　上記体細胞を採取する個体としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、得られるｉＰＳ細胞を再生医療用途に用いる場合には、拒絶反応の観点から、個体自身、又はＭＨＣの型が同一若しくは実質的に同一の他個体が好ましい。ここで、上記ＭＨＣの型が実質的に同一とは、免疫抑制剤などの使用により、上記体細胞由来のｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた細胞を個体に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にＭＨＣの型が一致していることをいう。
　上記体細胞は、ｉＰＳ細胞の選択を容易にするために、組み換えたものであってもよい。上記組換え体細胞の具体例としては、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子の遺伝子座に、レポーター遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子の少なくともいずれかを組み込んだ組換え体細胞が挙げられる。上記分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子としては、例えば、Ｆｂｘ１５遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｏｃｔ３／４遺伝子、などが挙げられる。上記レポーター遺伝子としては、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、β－ガラクトシダーゼ遺伝子などが挙げられる。上記薬剤耐性遺伝子としては、ブラストシジン遺伝子、ハイグロマイシン遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
　上記体細胞の培養条件としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％～５％などが挙げられる。上記体細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、５質量％～２０質量％の血清を含む、最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地などが挙げられる。
（（ａ）核初期化物質及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を、体細胞へ導入する方法）
　（ａ）核初期化物質や、（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を、体細胞へ導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、発現ベクターを用いる方法、ｍＲＮＡを用いる方法、組換えタンパク質を用いる方法、などが挙げられる。体細胞への導入の容易さを考慮すると、核初期化物質は、タンパク質の形態で体細胞へ導入するよりも、遺伝子の形態や、該遺伝子のｍＲＮＡの形態で体細胞へ導入する方が好ましく、遺伝子の形態で体細胞へ導入することがより好ましい。かかる遺伝子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、安定性の観点から、ＤＮＡであることが好ましい。また、該遺伝子は二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、二本鎖であることが好ましい。好ましい核初期化物質としては、上記各遺伝子のｃＤＮＡが挙げられ、中でも、上記各遺伝子の二本鎖のｃＤＮＡが好ましく挙げられる。
　同様に、体細胞への導入の容易さを考慮すると、「Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物」は、タンパク質の形態で体細胞へ導入するよりも、遺伝子の形態や、該遺伝子のｍＲＮＡの形態で体細胞へ導入する方が好ましく、遺伝子の形態で体細胞へ導入することがより好ましい。かかるＨ１ｆｏｏ遺伝子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、安定性の観点から、ＤＮＡであることが好ましい。また、該Ｈ１ｆｏｏ遺伝子は二本鎖であっても一本鎖であってもよいが、二本鎖であることが好ましい。「Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物」の好ましい態様としては、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子のｃＤＮＡが挙げられ、中でも、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子の二本鎖のｃＤＮＡが好ましく挙げられる。
（発現ベクター）
　核初期化物質を遺伝子の形態で体細胞へ導入する場合や、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を体細胞へ導入する場合には、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む適当な発現ベクターに、核初期化物質やＨ１ｆｏｏ遺伝子を組み込んだ発現ベクターを好適に用いることができる。核初期化物質やＨ１ｆｏｏ遺伝子を組み込むための発現ベクターとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、エピソーマルベクター、人工染色体ベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどが挙げられる。
　上記の発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、レトロウイルスのＬＴＲ、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーター、ＥＦ１αプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。一例としては、ＣＡＧプロモーター（サイトメガロウイルスエンハンサーとニワトリβ－アクチンプロモーターとβ－グロビン遺伝子のポリＡシグナル部位を含む）を用いることができる。
　上記の発現ベクターは、プロモーターの他に、所望によりエンハンサー、ポリＡ付加シグナル、マーカー遺伝子、複製開始点、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子などを含有していてもよい。上記のマーカー遺伝子とは、該マーカー遺伝子を細胞に導入することにより、細胞の選別や選択を可能とするような遺伝子をいう。上記のマーカー遺伝子の具体例としては、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、発光酵素遺伝子、発色酵素遺伝子などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。上記の薬剤耐性遺伝子の具体例としては、ネオマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。上記の蛍光タンパク質遺伝子の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）遺伝子、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子などが挙げられる。上記の発光酵素遺伝子の具体例としては、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。上記の発色酵素遺伝子の具体例としては、βガラクトシターゼ遺伝子、βグルクロニダーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子などが挙げられる。
　上記のエピソーマルベクターは、染色体外で自律複製可能なベクターである。エピソーマルベクターを用いる具体的手段は、Yu et al., Science, 324, 797-801 (2009) に開示されている。本発明の特に好ましい一実施態様においては、エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素の５’側および３’側にｌｏｘＰ配列を同方向に配置したエピソーマルベクターが使用され得る。エピソーマルベクターは染色体外で自律複製可能なため、ゲノムに組み込まれなくとも宿主細胞内での安定な発現を提供し得るが、いったんｉＰＳ細胞が樹立された後は、当該ベクターは速やかに除かれることが望ましい。エピソーマルベクターの複製に必要なベクター要素を２つのｌｏｘＰ配列で挟み、これにＣｒｅリコンビナーゼを作用させて当該ベクター要素を切り出すことにより、エピソーマルベクターの自律複製能を喪失させることができ、該ベクターを早期にｉＰＳ細胞から脱落させることができる。
　本発明に用いられるエピソーマルベクターとしては、例えば、ＥＢＶ、ＳＶ４０等に由来する自律複製に必要な配列をベクター要素として含むベクターが挙げられる。自律複製に必要なベクター要素としては、具体的には、複製開始点と、複製開始点に結合して複製を制御するタンパク質をコードする遺伝子であり、例えば、ＥＢＶにあっては複製開始点ｏｒｉＰとＥＢＮＡ－１遺伝子、ＳＶ４０にあっては複製開始点ｏｒｉとＳＶ４０ＬＴ遺伝子が挙げられる。
　また、上記人工染色体ベクターとしては、ＹＡＣ（Yeast artificial chromosome）ベクター、ＢＡＣ（Bacterial artificial chromosome）ベクター、ＰＡＣ（P1-derived artificial chromosome）ベクターなどが挙げられる。
　また上記のプラスミドベクターとしては、導入する体細胞内で発現し得るプラスミドベクターである限り特に制限はなく、体細胞が哺乳動物である場合は、ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ等の、動物細胞発現用プラスミドベクターが挙げられる。
　上記ウイルスベクターとしては、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）ベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、シルビスウイルスベクター、ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、オルソミクソウイルスベクターなどが挙げられる。
　上記の発現ベクターを上記の体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、遺伝子銃法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。
　なお、体細胞に導入する発現ベクターとして、ウイルスベクターを用いる場合には、パッケージング細胞を用いて得られたウイルス粒子を用いてもよい。かかるパッケージング細胞は、ウイルスの構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞であり、該細胞に目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルスベクターを導入すると、該目的遺伝子を組み込んだ組換えウイルス粒子を産生する。上記のパッケージング細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞やマウス繊維芽細胞由来のＮＩＨ３Ｔ３細胞をベースとしたパッケージング細胞、Ecotropic virus由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ－Ｅ細胞、Amphotropic virus由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ－Ａ細胞、水疱性口内炎ウイルス由来エンベロープ糖タンパク質を発現するよう設計されているＰＬＡＴ－ＧＰ細胞などが挙げられる。これらの中でも、ヒト体細胞に対して組換えウイルスベクターを導入する場合にはＰＬＡＴ－Ａ細胞、ＰＬＡＴ－ＧＰ細胞が、宿主指向性の点で、好ましい。上記のパッケージング細胞へのウイルスベクターの導入方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、リポフェクション法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法などが挙げられる。得られたウイルス粒子を体細胞へ感染させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリブレン法が挙げられる。
　上記の発現ベクターを用いて、核初期化物質や、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を体細胞に導入する場合、１つの発現ベクターに１つの遺伝子を組み込んでもよいし、２つ以上の遺伝子を組み込んでもよい。１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込むことにより、該２つ以上の遺伝子を同時に発現（以下、「共発現」と称することがある）させることができる。また、体細胞へ導入するすべての核初期化物質及びＨ１ｆｏｏ遺伝子を１つの発現ベクターに組み込んでもよい。
　上記の１つのベクターに２つ以上の遺伝子を組み込む方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、上記の２つ以上の遺伝子を、連結配列を通じて組み込むことが好ましい。かかる連結配列としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、口蹄疫ウイルス（Picornaviridae Aphthovirus）由来２Ａペプチドをコードする遺伝子配列、ＩＲＥＳ（internal ribosome entry sites）などが挙げられる。
　本発明のｉＰＳ細胞の製造方法においては、（ａ）核初期化物質及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子の遺伝子産物を、ｍＲＮＡの形態で体細胞へ導入してもよい。上記のｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を上記の体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。例えば、Lipofectamine（登録商標）MessengerMAX（Life Technologies社製）などの、市販のＲＮＡトランスフェクション試薬などを用いることができる。
　また、本発明のｉＰＳ細胞の製造方法においては、（ａ）核初期化物質及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子の遺伝子産物を、タンパク質の形態で体細胞へ導入してもよい。かかるタンパク質を前記体細胞に導入する方法としては、特に制限はなく、公知の方法を適宜選択して用いることができる。そのような方法としては、例えば、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）融合タンパク質を用いる方法、マイクロインジェクション法などが挙げられる。タンパク質導入試薬としては、カチオン性脂質をベースとしたBioPOTER（登録商標）Protein Delivery Reagent（Gene Therapy Systmes社製）及びPro-JectTM Protein Transfection Reagent（PIERCE社製）、脂質をベースとしたProfect-1（Targeting Systems社製）、膜透過性ペプチドをベースとしたPenetratin Peptide（Q biogene社製）及びChariot Kit（Active Motif社製）、HVJエンベロープ（不活化センダイウイルス）を利用したGenomONE（石原産業社製）等が市販されている。導入はこれらの試薬に添付のプロトコルに従って行うことができるが、一般的な手順は以下の通りである。タンパク質の形態である「（ａ）核初期化物質」や「（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子の遺伝子産物」を適当な溶媒（例えば、ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳ等の緩衝液）に希釈し、導入試薬を加えて室温で５～１５分間程度インキュベートして複合体を形成させ、これを無血清培地に交換した細胞に添加して３７℃で１時間～数時間インキュベートすることができる。その後培地を除去して血清含有培地に交換することができる。
　上記のＰＴＤとしては、ショウジョウバエ由来のＡｎｔＰ、ＨＩＶ由来のＴＡＴ、ＨＳＶ由来のＶＰ２２等のタンパク質の細胞通過ドメインを用いたものが開発されている。かかるＰＴＤは、「（ａ）核初期化物質」や「（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子の遺伝子産物」のｃＤＮＡとＰＴＤ配列とを組み込んだ融合タンパク質発現ベクターを作製して組換え発現させ、融合タンパク質を回収して導入に用いることができる。かかる融合タンパク質の導入は、タンパク質導入試薬を添加しない以外は上記と同様にして行うことができる。
　上記のマイクロインジェクション法としては、先端径１μｍ程度のガラス針にタンパク質溶液を入れ、細胞に穿刺導入する方法であり、確実に細胞内にタンパク質を導入することができる。以前より、マウスおよびヒトにおいて、タンパク質の形態の核初期化物質をポリアルギニンやＴＡＴ等のＣＰＰ（cell penetrating peptide）と共に導入してｉＰＳ細胞を樹立する方法が開発されており、これらの手法を用いることもできる（Cell Stem Cell, 4:381-384 (2009)）。
　本発明のｉＰＳ細胞の製造方法において、「（ａ）核初期化物質」及び「（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物」の体細胞への導入回数は、１回であってもよいし、２回以上であってもよい。その導入時期としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、導入する「（ａ）核初期化物質」及び「（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物」の全てを同時期に導入してもよいし、一部又は全てを異なる時期に導入してもよい。上記の「Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物」は、遺伝子のみを用いる態様であってもよいし、その遺伝子産物のみを用いる態様であってもよいし、遺伝子とその遺伝子産物の両方を用いる態様であってもよい。上記の核初期化物質が遺伝子又はその遺伝子産物の場合、遺伝子のみを用いる態様であってもよいし、その遺伝子産物のみを用いる態様であってもよいし、遺伝子とその遺伝子産物の両方を用いる態様であってもよい。また、上記の核初期化物質が遺伝子又はその遺伝子産物であって、かつ、２種類以上の「遺伝子又はその遺伝子産物」を併用する場合、ある遺伝子については遺伝子産物を用い、他の遺伝子については遺伝子を用いる態様であってもよい。
　Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物の体細胞への導入量としては、（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入した場合に、より高品質でしかも品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞を製造し得る限り特に制限されない。また、上記の核初期化物質が遺伝子又はその遺伝子産物の場合、上記の遺伝子又はその遺伝子産物の体細胞への導入量としては、かかる体細胞の核を初期化し得る限り特に制限されず、用いる全ての遺伝子又はその遺伝子産物を等量ずつ導入してもよいし、異なる量で導入してもよい。遺伝子又はその遺伝子産物として、遺伝子を用いる場合の例としては、Ｏｃｔ３／４遺伝子がＳｏｘ２遺伝子、Ｋｌｆ４遺伝子、又はｃ－Ｍｙｃ遺伝子に対して多量、例えば約３倍量、導入するのが（PNAS 106(31):12759-12764 (2009)、J.Biol.Chem.287(43): 36273-36282 (2012)）好ましい。
　本発明のｉＰＳ細胞の製造方法において用いる核初期化物質が低分子化合物である場合、かかる低分子化合物の体細胞への接触は、その低分子化合物を適当な濃度で水性もしくは非水性溶媒に溶解し、体細胞の培養に適した培地（例えば、約５～２０％の胎仔ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｆ１２培地など）中に、その低分子化合物の濃度が体細胞において核初期化が起こるのに十分で且つ細胞毒性がみられない範囲となるようにその低分子化合物溶液を添加して、細胞を一定期間培養することにより実施することができる。核初期化物質である低分子化合物の濃度は用いるその低分子化合物の種類によって異なるが、約０．１ｎＭ～約１００ｎＭの範囲で適宜選択することができる。接触期間は細胞の核初期化が達成されるのに十分な時間であれば特に制限はないが、通常は陽性コロニーが出現するまで培地に共存させておけばよい。
＜その他の工程＞
　前述したように、本発明のｉＰＳ細胞の製造方法は、（ａ）核初期化物質及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程（「導入工程」）を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の工程を含み得る。上記のその他の工程としては、本発明の効果を損なわない限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、上記の（ａ）核初期化物質及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された体細胞（以下、単に「導入細胞」とも表示する。）を培養する工程（以下、単に「導入細胞培養工程」とも表示する。）などが挙げられる。
（導入細胞培養工程）
　上記の導入細胞培養工程は、上記の（ａ）核初期化物質及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物が導入された体細胞を培養する工程である。上記の導入細胞の培養条件としては、特に制限はなく、例えばＥＳ細胞の培養に適した条件を挙げることができる。かかる条件として例えば、培養温度は約３７℃、ＣＯ２濃度は約２％～５％などが挙げられる。また、上記の導入細胞の培養に用いる培地としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。マウス細胞の場合、通常の培地に分化抑制因子としてLeukemia Inhibitory Factor（ＬＩＦ）を添加して培養を行う。一方、ヒト細胞の場合には、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および／または幹細胞因子（ＳＣＦ）を添加することが望ましい。また通常、細胞は、フィーダー細胞として、放射線や抗生物質で処理して細胞分裂を停止させたマウス胎仔由来の線維芽細胞（ＭＥＦ）の共存下で培養される。ＭＥＦとしては、通常ＳＴＯ細胞等がよく使われるが、ｉＰＳ細胞の誘導には、ＳＮＬ細胞（McMahon, A. P. & Bradley, A. Cell 62, 1073-1085 (1990)）等がよく使われている。フィーダー細胞との共培養は、（ａ）核初期化物質及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物の導入より前から開始してもよいし、該導入時から、あるいは該導入より後（例えば１～１０日後）から開始してもよい。
　上記の導入細胞培養工程の期間としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
２．ｉＰＳ細胞
　上記のｉＰＳ細胞の製造方法により製造される本発明のｉＰＳ細胞は、分化多能性及び自己複製能を有する。前記分化多能性とは、三胚葉系列すべてに分化できることを意味する。また、前記自己複製能とは、未分化状態を保持したまま増殖できる能力を意味する。
　上記のｉＰＳ細胞の製造方法により製造された細胞がｉＰＳ細胞であるか否かを確認する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。例えば、上記の体細胞として、分化多能性細胞において特異的に高発現する遺伝子（例えば、Ｆｂｘ１５、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４など、好ましくはＮａｎｏｇ又はＯｃｔ３／４）の遺伝子座に、レポーター遺伝子、及び薬剤耐性遺伝子の少なくともいずれかを組み込んだ組換え体細胞を用いた場合には、上記のレポーター遺伝子や薬剤耐性遺伝子を利用して確認することができる。具体的には、上記のレポーター遺伝子として、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を用いた場合には、例えば、フローサイトメーターによりＧＦＰ陽性の細胞を確認する方法が挙げられる、また、上記の薬剤耐性遺伝子として、ピューロマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、細胞にピューロマイシンを投与することにより確認することができる。
　本願明細書において「品質の高いｉＰＳ細胞」とは、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞よりも、品質の高いｉＰＳ細胞を意味する。また、本明細書において「品質のばらつきが少ないｉＰＳ細胞」とは、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞よりも、品質のばらつきが少ないｉＰＳ細胞を意味する。これらの品質としては、１種であっても２種以上であってもよい。「品質の高いｉＰＳ細胞」又は「品質のばらつきが少ないｉＰＳ細胞」の具体例として、以下の（ａ）～（ｑ）から選択される１種又は２種以上の特性を有するｉＰＳ細胞が挙げられる。
（ａ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［胚様体（ＥＢ）形成］の方法で５日間培養したときの胚様体形成数が割合として５％以上、好ましくは１０％以上向上したｉＰＳ細胞。
（ｂ）後述の［胚様体（ＥＢ）形成］の方法で５日間培養したときの胚様体形成数が７８個以上、好ましくは８０個以上であるｉＰＳ細胞。
（ｃ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［胚様体（ＥＢ）形成］の方法で５日間培養したときの胚様体のサイズ（μｍ２）のばらつき（σ２）が割合として２５％以上、好ましくは４０％以上低下したｉＰＳ細胞。
（ｄ）後述の［胚様体（ＥＢ）形成］の方法で５日間培養したときの胚様体のサイズ（μｍ２）のばらつき（σ２）が１００００（μｍ２）以下、好ましくは８０００（μｍ２）以下であるｉＰＳ細胞。
（ｅ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［アポトーシスアッセイ］の方法で測定した生細胞（アネキシンＶ（－）／ＰＩ（－）細胞）の割合が、１．１倍以上、好ましくは１．２倍以上に向上したｉＰＳ細胞。
（ｆ）後述の［アポトーシスアッセイ］の方法で測定した生細胞（アネキシンＶ（－）／ＰＩ（－）細胞）の割合が６８％以上、好ましくは７３％以上であるｉＰＳ細胞。
（ｇ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［アポトーシスアッセイ］の方法で測定したアポトーシス細胞（アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）細胞とアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）細胞の合計）の割合が、０．７５倍以下、好ましくは０．６７倍以下に低下したｉＰＳ細胞。
（ｈ）後述の［アポトーシスアッセイ］の方法で測定したアポトーシス細胞（アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）細胞とアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）細胞の合計）の割合が３０％以下、好ましくは２５％以下であるｉＰＳ細胞。
（ｉ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法で測定したＫｉ６７遺伝子又はＰＣＮＡ遺伝子（両遺伝子は細胞増殖マーカーとして知られている）の発現量が１．７倍、好ましくは２．２倍に向上したｉＰＳ細胞。
（ｊ）後述の［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法で測定したＫｉ６７遺伝子又はＰＣＮＡ遺伝子（両遺伝子は細胞増殖マーカーとして知られている）の発現量が、ＥＳ細胞と比較して、０．６５倍以上、好ましくは０．７３倍以上であるｉＰＳ細胞。
（ｋ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、キメラ形成能が高いｉＰＳ細胞。
（ｌ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、性腺移行能が高いｉＰＳ細胞。
（ｍ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法で測定したＳＲＦ遺伝子（ＳＲＦ遺伝子は染色体異常を有すると発現量が低下する染色体異常マーカーとして知られている）の発現量が１．１倍、好ましくは１．２倍に向上したｉＰＳ細胞。
（ｎ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法で測定したＡＣＴＧ２遺伝子（ＡＣＴＧ２遺伝子は染色体異常を有すると発現量が低下する染色体異常マーカーとして知られている）の発現量が１．２倍、好ましくは１．５倍に向上したｉＰＳ細胞。
（ｏ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法で測定したＯｃｔ３／４遺伝子（幹細胞の未分化マーカー）の発現量のばらつき（σ２）が割合として１０％以上、好ましくは２０％以上低下したｉＰＳ細胞。
（ｐ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［分化誘導初期における細胞生存率の比較］の項目に記載の方法で測定した生存細胞数が、１．２倍、好ましくは１．５倍に向上したｉＰＳ細胞。
（ｑ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入しないこと以外は、同じ方法で作製したｉＰＳ細胞（好ましくは、後述の実施例における「ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞」又は「ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞」）と比較して、後述の［ｉＰＳ細胞の分化誘導初期の未分化マーカー残存量の比較］の項目に記載の方法で測定したＯｃｔ３／４遺伝子（幹細胞の未分化マーカー）の発現量のばらつき（σ２）が割合として１０％以上、好ましくは２０％以上低下したｉＰＳ細胞。
　上記のｉＰＳ細胞が由来する生物種としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ウマ、サルなどの任意の哺乳動物が挙げられる。
３．ｉＰＳ細胞の品質改善剤
　本発明のｉＰＳ細胞の品質改善剤は、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含み得る。Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物は、上記のｉＰＳ細胞の製造方法で記載したものと同様である。また、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物は、上記のｉＰＳ細胞の製造方法で記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。また、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子として、宿主となる体細胞で機能し得るプロモーターを含む上記の発現ベクターに組み込まれたものを用いてもよい。
４．ｉＰＳ細胞製造用組成物
　本発明のｉＰＳ細胞製造用組成物は、（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を少なくとも含み、必要に応じて更にその他の構成を含み得る。
＜（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物＞
　上記の（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物は、上記のｉＰＳ細胞の製造方法で記載したものと同様である。また、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物や、核初期化物質である遺伝子又はその遺伝子産物は、上記のｉＰＳ細胞の製造方法で記載したものと同様の変異が含まれていてもよい。
　上記のｉＰＳ細胞製造用組成物における核初期化物質の好ましい形態として、遺伝子がベクターに組み込まれている形態、合成ｍＲＮＡの形態、タンパク質（好ましくは組換えタンパク質）の形態などが挙げられる。上記のベクターとしては、上記のｉＰＳ細胞の製造方法で記載したものと同様のものが挙げられる。上記の合成ｍＲＮＡ、上記のタンパク質（好ましくは組換えタンパク質）は、公知の方法により製造することができる。
　上記のｉＰＳ細胞製造用組成物は、上記の（ａ）核初期化物質や、上記の（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物が、個別の容器に分けられているものであってもよいし、１つの容器にまとめられているものであってもよいし、任意の数ごとに容器にまとめられているものであってもよい。
　上記のｉＰＳ細胞製造用組成物における上記の（ａ）核初期化物質や、上記の（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物の量としては、特に制限はなく、全ての核初期化物質や、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を等量としてもよいし、異なる量としてもよい。
　上記のｉＰＳ細胞製造用組成物は、上記の（ａ）核初期化物質や、上記の（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物の他に、それら以外の遺伝子又はその遺伝子産物などを含んでいてもよく、また、前記ウイルスベクターを用いる場合には、例えば、パッケージング細胞を含んでいてもよい。前記各遺伝子乃至その遺伝子産物以外の遺伝子乃至その遺伝子産物、前記パッケージング細胞としては、前記ｉＰＳ細胞の製造方法で記載したものと同様のものが挙げられる。
　本発明には、他の態様として、
「Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程を含むことを特徴とする、ｉＰＳ細胞の品質の改善方法」や、
「ｉＰＳ細胞の品質改善剤の製造における、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物の使用」や、
「ｉＰＳ細胞製造用組成物の製造における、（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物の使用」
も含まれる。
　上記の「ｉＰＳ細胞の品質の改善方法」における、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程は、本発明のｉＰＳ細胞の製造方法における導入工程と同じである。かかる工程を含むことにより、ｉＰＳ細胞の品質を改善して、高品質のｉＰＳ細胞を得ることができる。
　以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下の全ての実験は、慶應義塾大学の動物及びＤＮＡ実験指針にしたがって行い、慶應義塾大学の倫理委員会によって承認され、アメリカ国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針に準拠している。
１．材料と方法
［プラスミドの構築］
　Ｈ１ｆｏｏｃＤＮＡ及びＨ１ｃｃＤＮＡ（Teranishi, T., et al. Rapid replacement of somatic linker histones with the oocyte-specific linker histone H1foo in nuclear transfer. Developmental Biology 266, 76-86 (2004).）を、それぞれｐＭＸｓプラスミドの制限酵素BamH1－Sal1部位、及びにEcoR1－Sal1部位に挿入し、ＤＮＡシークエンシングによりＨ１ｆｏｏｃＤＮＡ及びＨ１ｃｃＤＮＡが挿入されたことを確認した。
［マウスｉＰＳ細胞の産生と細胞培養法］
１）マウスｉＰＳ細胞の産生は、文献（Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols 2, 3081-3089 (2007)）に記載されたプロトコールにしたがって行った。ただし、本試験では、前記文献に記載の遺伝子に加えて、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子も用いた。すなわち、マウスのＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びＨ１ｆｏｏ遺伝子（配列番号３のヌクレオチド配列：BC137916）を含むｐＭＸｓレトロウイルスベクターを用いて、マウス線維芽細胞、又はＮａｎｏｇ－ＧＦＰ－ＩＲＥＳ－puroトランスジェニックマウス（Okita, K., Ichisaka, T. & Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 448, 313-317 (2007)）の尾部線維芽細胞（以下、単に「Ｎａｎｏｇ－ＧＦＰ発現線維芽細胞」という）からｉＰＳ細胞を産生した。なお、コントロールとして、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子に代えてＤｓＲｅｄ遺伝子を用いた。また、実験マウスの管理は、慶應義塾大学の動物及びＤＮＡ実験指針にしたがって行った。
２）マウスＥＳ細胞（Ｂ６Ｊ－２３ＵＴＲ）（Tanimoto, Y., et al. Embryonic stem cells derived from C57BL/6J and C57BL/6N mice. Comparative medicine 58, 347-352 (2008)）は、筑波大学動物資源センターから入手し、文部科学省のヒトＥＳ細胞の分配及び使用に関する指針にしたがって使用した。
３）マウスｉＰＳ及びＥＳ細胞株は、２０％ KnockOut Serum Replacement（Gibco社製）、１ｍＭ GlutaMAX (Gibco社製)、１ｍＭ 非必須アミノ酸（Sigma-Aldrich社製）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、５０Ｕ ペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌ スプレプトマイシン（Gibco社製）、及びマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含有するＤＭＥＭ（Sigma-Aldrich社製）培養液（以下、「ｉＰＳ細胞培養液」という）中で、野生型ＩＣＲマウス由来のＸ線照射したマウス胎児線維芽細胞（ｉＭＥＦフィーダー細胞）上で培養・維持した。なお、マウスｉＰＳ細胞培養液は２～３日毎に交換し、細胞は２～３日毎に０．５ｍＭトリプシン－ＥＤＴＡ（Gibco社製）を用いて継代した。
［胚様体（ＥＢ）形成］
　ｉＰＳ細胞のＥＢ形成は、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼIVを用いて採取した５×１０４個のｉＰＳ細胞を、１００ｍｍの低接着プレート（ＡＧＣ社製）に播種し、２０％ ＦＢＳ（Gibco社製）、２ｍＭ GlutaMAX（Gibco社製）、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸（Sigma-Aldrich社製）、０．１ｍＭ ２－メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び５０ｍｇ／ｍｌ ストレプトマイシン（Gibco社製）を含有するMinimum Essential Medium Alpha Medium（Gibco社製）（以下、「ＥＢ形成用培養液」という）存在下で５日間培養することにより行った。ＥＢ形成用培養液は、２～３日毎に交換した。なお、コントロールとして、ＥＳ細胞を用いた。
［テラトーマ形成］
　ｉＰＳ細胞のテラトーマ形成能は、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）、キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）及びクロルプロマジン（１．２５ｍｇ／ｋｇ）の混合物を用いて麻酔処理したＳＣＩＤマウス（日本クレア社製）の精巣に、ｉＰＳ細胞を注入し、約８週間後、マウスを頚椎脱臼により犠牲にし、ｉＰＳ細胞を注入した組織切片を１０％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に一晩固定し、パラフィンに包埋した後、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色法により確認した。なお、マウスの麻酔処理は、マウスの心拍数、筋肉弛緩及び感覚反射反応（すなわち、テールピンチに対して無反応）をモニターすることによって適切に行った。
［免疫組織化学染色法］
　ガラスボトムディッシュ（ＡＧＣ社製）上に播種したｉＰＳ細胞及び線維芽細胞を、ＰＢＳで一回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（武藤化学社製）で４℃、１５分固定処理を行った。固定処理した細胞をＰＢＳ中０．５％トリトンＸ－１００で１０分間、室温で透過処理した。その後、ImmunoBlock（ＤＳファーマバイオメディカル社製）で２０分間ブロッキング処理し、４種類の一次抗体（抗Ｏｃｔ３／４抗体［Oct3/4抗体sc-8629、Santa Cruz Biotechnology社製］、抗Ｎａｎｏｇ抗体［ＲＣＡＢ０００１Ｐ；リプロセル社製］、抗ＳＳＥＡ１抗体［sc-21702；Santa Cruz Biotechnology社製］、及び抗Ｈ１ｆｏｏ抗体［ＨＰＡ０３７９９２； Sigma-Aldrich社製］）存在下で、室温で６０分インキュベートし、ImmunoBlock（ＤＳファーマバイオメディカル社製）で洗浄し、各々の一次抗体に対応する二次抗体（Alexa Fluor 488又はAlexa Fluor 568［Life Technologies社製］とコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧ抗体と抗マウスＩｇＧ又はＩｇＭ抗体）と室温で６０分インキュベートし、６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ； Life Technologies社製）で細胞核を染色した後、カラー電荷結合素子カメラ（ＢＺ－９０００；キーエンス社製）、光学顕微鏡（ＩＸ７１；Olympus社製）及びレーザー共焦点顕微鏡（ＬＳＭ　５１０　ＭＥＴＡ；Carl Zeiss, Jena社製）を備えた蛍光レーザー顕微鏡を用いて蛍光観察を行った。
［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］
　全ＲＮＡ試料は、ＴＲＩＺＯＬ試薬（Life Technologies社製）を用い、製品添付の説明書にしたがって単離した。ＲＮＡ試料の濃度及び純度は、ＮＤ－１０００分光測光器（Thermo Fisher Scientific社製）で測定し、ｃＤＮＡの調製は、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（東洋紡社製）を用いて行った。定量ＰＣＲ（ＱＴ－ＰＣＲ）は、SYBR Premix ExTaq（タカラバイオ社製）を用い７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Life Technologies社製）により行った。ｍＲＮＡの量は、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量により標準化した。なお、定量ＰＣＲに用いたプライマーセットのヌクレオチド配列は、以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
［アポトーシスアッセイ］
　ＥＢ形成用培養液での培養を開始してから１日目のｉＰＳ細胞をトリプシン処理し、アネキシンＡ５結合緩衝液（タカラバイオ社製）に懸濁した後、製品添付の説明書にしたがって、アネキシン－Ａ５－ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（ＢＤ社製）により、それぞれアポトーシス初期細胞及びアポトーシス後期細胞を染色した。細胞を７０ｍｍ孔ナイロン膜でろ過し、CellQuestソフトウェア（ＢＤ社製）を用いてFACS Aria3（ＢＤ社製）フローサイトメトリーにより蛍光染色した細胞を解析し、FlowJoソフトウェア（Tree Star社製）を用いてアポトーシス細胞の割合を測定した。
［ＤＮＡメチル化解析］
　Ｏｃｔ３／４及びＮａｎｏｇ遺伝子のプロモーター領域におけるＤＮＡメチル化レベルを、バイサルファイトシーケンス（Bisulfite Sequence）法を用いて解析するために、細胞試料からＳＶゲノムＤＮＡ精製キット（Promega社製）を用いてゲノムＤＮＡを単離・精製した。精製したゲノムＤＮＡを、ＥＺ ＤＮＡメチル化ゴールドキット（ZYMO RESEARCH社製）を用い、製品添付の説明書にしたがって非メチル化シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換し、バイサルファイトＰＣＲ用インプットＤＮＡを調製した。かかるインプットＤＮＡ、プライマーセット、及びTaKaRa EpiTaq HS（TaKaRa社製）を用い、ＰＣＲ反応条件（９８℃で１０分間の変性処理を１サイクル；９５℃で２０秒間、５５℃で３０秒間、及び７２℃で６０秒間の増幅処理を４０サイクル；並びに７２℃で５分間の最終伸長処理を１サイクル）下でバイサルファイトＰＣＲを行った。なお、バイサルファイトＰＣＲに用いたプライマーセットのヌクレオチド配列は、以下の表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＰＣＲ産物は、精製後ｐＧＥＭ－Ｔベクター（Promega社製）にＴＡ－クローニングし、シーケンシングを行った。また、Ｄｌｋ１及びＤｌｋ２遺伝子の間に位置する遺伝子間メチル化可変領域（differentially methylated region；ＤＭＲ）（ＩＧ－ＤＭＲ）と、Ｇｔｌ２メチル化可変領域（Ｇｔｌ２－ＤＭＲ）のメチル化状態を解析するために、上記のとおりゲノムＤＮＡを精製し、バイサルファイトＰＣＲ用インプットＤＮＡを調製した後、PyroMark Q24（QIAGEN社製）を用い、製品添付の説明書にしたがってパイロシーケンス（Pyrosequence）を行った。なお、パイロシーケンスに用いたプライマーセットのヌクレオチド配列は、以下の表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
［ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の共培養凝集法］
　２細胞期の胚を、過剰排卵し自然交尾したＩＣＲ（ＣＤ－１（登録商標））メスマウスから回収し、その後、胚盤胞期まで培養した。ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞は、共培養凝集の直前に０．２５％トリプシンで解離し、１５～２０個の細胞を、透明膜を除去した８細胞期の割球と凝集させた。胚盤胞期のキメラ胚を２．５ｄｐｃ（days of post-coitus）のＩＣＲ偽妊娠マウスの子宮角に導入した。
［全遺伝子発現解析］
　ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞から全ＲＮＡを単離し、シアニン標識アンチセンスＲＮＡをQuick Amp Labeling Kit（Agilent Technologies社製）を用いて増幅し、遺伝子発現ハイブリダイゼーションキットで、全マウスゲノムオリゴマイクロアレイ（Agilent Technologies社製）上にハイブリダイズし、アジレントマイクロアレイスキャナーを使用して解析した。データは、GeneSpring GX12.0 ソフトウェア（Agilent Technologies社製）で解析した。
［統計解析］
　図のエラーバー付きの棒グラフの値は、平均±標準偏差（ＳＭＥ）として示す。データは、StatView J-4.5 ソフトウェアを用いて解析した。２つのグループ間の比較は、Student’s t-testで行った。グループ間の比較は、ボンフェローニ事後検定（Bonferroni's post hoc test）でone-way ANOVAで行った。図中の「＊」及び「＊＊」は、有意性（それぞれＰ＜０．０５及びＰ＜０．０１）があることを示す。
２．結果
［外来性Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を用いたｉＰＳ細胞の産生］
　Ｈ１ｆｏｏの体細胞リプログラミングに対する効果について調べた。
　まず、上記［免疫組織化学染色法］の項目に記載の方法を行い、外来性Ｈ１ｆｏｏは細胞核にのみ発現すること（図１ａ）や、その多くが核周辺に局在すること（図１ｂ）を確認した。なお、外来性Ｈ１ｆｏｏの発現により、細胞核の膨張や、核膜内側の電子密度の高い領域（ヘテロクロマチン）の減少は観察されなかった（図１ｃ）。
　次に、上記［マウスｉＰＳ細胞の産生と細胞培養法］の項目に記載の方法にしたがって、マウス線維芽細胞に３種類の核初期化物質（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＫｌｆ４遺伝子［ＯＳＫ遺伝子］）に加え、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子（ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子）を、レトロウイルスベクターを用いて体細胞へ導入し、２０日目にTRACP & ALP double- stain Kit（タカラバイオ社製）を用いてＡＬＰ（Alkaline phosphatase）染色を行い、ＡＬＰ陽性でかつ、ＥＳ様細胞からなるコロニー数を測定した。ＡＬＰは幹細胞マーカーとして知られている。なお、コントロールとして、ＯＳＫ遺伝子のみを導入した実験や、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子のＨ１ｆｏｏに代えてリンカーヒストンＨ１遺伝子（ＯＳＫ＋Ｈ１ｃ遺伝子）を導入した実験も行った。その結果、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子をマウス線維芽細胞へ導入すると、ＯＳＫ遺伝子やＯＳＫ＋Ｈ１ｃ遺伝子を導入した場合と比べ、ＡＬＰ陽性ＥＳ様細胞（ｉＰＳ細胞）コロニー数は顕著に増加することが示された（図２ａ）。
　また、上記［免疫組織化学染色法］の項目に記載の方法にしたがって、３種類の多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、及びＳＳＥＡ１）の発現を解析したところ、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞は、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞と同様に、上記多能性マーカーを発現することが示された（図２ｂ）。一方、内在性Ｈ１ｆｏｏは、ｉＰＳ細胞への誘導過程や、産生されたｉＰＳ細胞において、発現は認められなかった（図２ｂ、ｃ）。
　また、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子をＮａｎｏｇ－ＧＦＰ発現線維芽細胞に導入し、ＧＦＰのシグナルを指標として産生されたｉＰＳ細胞（図３ａ）の品質を調べた。なお、Ｎａｎｏｇ－ＧＦＰ陽性細胞は、高品質な幹細胞のマーカーとして知られている。興味深いことに、ＯＳＫ遺伝子に加え、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子をＮａｎｏｇ－ＧＦＰ発現線維芽細胞へ導入した場合は、ＯＳＫ遺伝子を導入した場合と比べ、Ｎａｎｏｇ－ＧＦＰ陽性ＥＳ様細胞（ｉＰＳ細胞）のコロニー数が約８倍に増加することが示された（図３ｂ）。さらに、産生されたｉＰＳ細胞集団におけるＮａｎｏｇ－ＧＦＰ陽性ＥＳ様細胞（ｉＰＳ細胞）の割合は、９０％以上と高かった（図３ｃ）。一方、ＯＳＫ遺伝子及びｃ－Ｍｙｃ遺伝子（ＯＳＫＭ遺伝子）を導入した場合や、ＯＳＫＭ遺伝子に加え、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子（ＯＳＫＭ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子）をＮａｎｏｇ－ＧＦＰ発現線維芽細胞へ導入した場合は、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を導入した場合と比べ、Ｎａｎｏｇ－ＧＦＰ陽性コロニー数自体は多かったものの（図３ｂ）、産生されたｉＰＳ細胞集団におけるＮａｎｏｇ－ＧＦＰ陽性細胞の割合は低いことが示された（図３ｃ）。これらの結果は、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を体細胞へ導入した場合は、従来技術であるＯＳＫ遺伝子を導入した場合や、ＯＳＫＭ遺伝子を導入した場合と比べ、高品質なｉＰＳ細胞集団を産生できることを示している。
［ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞の性質］
　ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞の性質について詳細に解析を行った。上記［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがって、４種類の多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、及びＳａｌｌ４）の発現を解析したところ、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞は、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞と同様に、上記多能性マーカーを発現することが示された（表４）。なお、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を含む外来性遺伝子の発現は抑制されていた（表５）。また、細胞増殖率についても解析したところ、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞の増殖レベルはＯＳＫ－ｉＰＳ細胞と同レベルであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４は、ＥＳ細胞（ＥＳ）、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞３クローン（ＯＳＫ－ｉＰＳ１～３）、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞３クローン（ＯＳＫＨ－ｉＰＳ１～３）、及びＭＥＦ細胞（ＭＥＦ）における５種類の多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｒｅｘ１、及びＳａｌｌ４）の発現を解析した結果を示す表である。なお、各多能性マーカーの発現量は、ＥＳ細胞の結果を１としたときの相対値として示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５は、ＥＳ細胞（ＥＳ）、ＯＳＫＨ遺伝子導入ＭＥＦ細胞（ＭＥＦ＋ＯＳＫＨ）、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞３クローン（ＯＳＫ－ｉＰＳ１～３）、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞３クローン（ＯＳＫＨ－ｉＰＳ１～３）、及びＭＥＦ細胞（ＭＥＦ）における３種類の外来性タンパク質（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、及びＨ１ｆｏｏ）の発現を解析した結果を示す表である。なお、各多能性マーカーの発現量は、ＯＳＫＨ遺伝子導入ＭＥＦ細胞の結果を１としたときの相対値として示す。
　また、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞と、ＥＳ細胞又はＯＳＫ－ｉＰＳ細胞の間で、全遺伝子トランスクリプトームプロファイルを比較した（図４ａ及びｂ）。その結果、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞における遺伝子発現パターンと、ＥＳ細胞やＯＳＫ－ｉＰＳ細胞における遺伝子発現パターンは非常によく類似している（０．９９の相関関数［Ｒ２］）ことが示された。
　また、上記［ＤＮＡメチル化解析］の項目に記載の方法にしたがって、ゲノムＤＮＡのメチル化解析を行った。その結果、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞やＯＳＫ－ｉＰＳ細胞と同様に、２種類の多能性マーカー（Ｏｃｔ３／４及びＮａｎｏｇ）遺伝子のプロモーター領域、ＩＧ－ＤＭＲ、及びＧｔｌ２－ＤＭＲのＤＮＡが脱メチル化されていた（図５ａ及びｂ）。なお、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞ではクローン（細胞群）間で脱メチル化レベルにばらつきが認められたのに対して、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞ではそのようなばらつきの程度は低かった（図５ａ及びｂ）。
［ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢの性質］
　ｉＰＳ細胞から各種細胞へ分化誘導する場合、通常は、まずＥＢを形成させ、その後各種細胞に特異的な分化誘導法によりさらに分化誘導することが行われている。形成されるＥＢの数やＥＢサイズの均一性は、その後の分化誘導効率に影響を及ぼすと考えられているため、サイズが均一でかつ数の多いＥＢを形成できるｉＰＳ細胞が望ましいと考えられていた。そこで、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞のＥＢ形成能について解析した。
　上記［胚様体（ＥＢ）形成］の項目に記載の方法にしたがってＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞からＥＢを形成させたところ、かかるＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢは、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢと比べ、ＥＢの数が多く（割合として約１２％向上）、及び、ＥＢのサイズ（μｍ２）が大きく（図６ａ～ｃ）、また、ＥＢのサイズ（μｍ２）のばらつき（σ２）が少なかった（割合として約５０％低下）（図６ｄ及びｅ）。
　また、上記［アポトーシスアッセイ］の項目に記載の方法にしたがってアポトーシス細胞の割合を解析したところ、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢは、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢと比べ、アポトーシス初期細胞（アネキシンＶ陽性（＋）／ＰＩ陰性（－）細胞）や、アポトーシス後期細胞（アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）細胞及びアネキシンＶ（－）／ＰＩ（＋）細胞）の割合が少なく、生細胞（アネキシンＶ（－）／ＰＩ（－）細胞）の割合が高いことが示された（図７ａ及びｂ）。ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢは、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢと比べ、生細胞（アネキシンＶ（－）／ＰＩ（－）細胞）の割合が約１．２倍に向上した。また、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢは、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢと比べ、アポトーシス細胞（アネキシンＶ（＋）／ＰＩ（－）細胞とアネキシンＶ（＋）／ＰＩ（＋）細胞の合計）の割合が、約０．６５倍に低下した。
　さらに、ＥＢ形成用培養液での培養を開始してから２日目のｉＰＳ細胞について、上記［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがって２種類の細胞増殖マーカー（Ｋｉ６７及びＰＣＮＡ）の発現を解析したところ、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢは、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞由来のＥＢと比べ、上記細胞増殖マーカーの発現量が高い（約２．４～２．６倍に向上した）ことが示された（図８ａ及びｂ）。
　以上の結果は、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞を用いてＥＢ形成させた場合は、ＯＳＫを用いてＥＢ形成させた場合と比べ、サイズが比較的均一で数が多く、かつ死細胞の割合の少ないＥＢ（高品質なＥＢ）を産生できることを示している。
［ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞の分化多能性］
　ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞の分化多能性について解析を行った。上記［ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞の共培養凝集法］の項目に記載の方法にしたがって、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞のうち、染色体数が正常な２種のクローン（ＯＳＫＨ１及び３）を用いてキメラマウスを作製した。また、コントロールとして、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞のうち、染色体数が正常な２種のクローン（ＯＳＫ１及び２）を用いて、同様の方法にしたがってキメラマウスを作製した。なお、本実験で用いたｉＰＳ細胞やＥＳ細胞は、黒色マウスの体細胞から作製したため、ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞のキメラ形成能が高いほど、より黒色のマウスがより高い割合で作製されることとなる。キメラマウスの作製試験の結果、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞の２種のクローン（ＯＳＫＨ１及び３）は、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞の２種のクローン（ＯＳＫ１及び２）と同等かより高いキメラ形成能を有することが示された（図９ａ及びｂ）。特に、ＯＳＫＨ３は、ＥＳ細胞と同レベルのキメラ形成能を有することが示された（図９ａ及びｂ）。
　生殖系列移行能（Germline transmission potential、性腺移行能ともいう）とは、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞が生殖細胞に分化でき、キメラを介して多能性幹細胞由来の遺伝子を次世代に伝えることができる能力をいう。この生殖系列移行能（Germline transmission potential）は、多能性幹細胞であることの最も厳格な特徴の１つであり、多能性幹細胞が高品質であることを示す特徴の１つである。そこで、体外受精（ＩＶＦ）により１００％キメラマウス由来の生殖系列移行能を調べた。その結果、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞由来のキメラマウス４種（ＯＳＫＨ１、ＯＳＫＨ３－１、ＯＳＫＨ３－２、及びＯＳＫＨ３－３）は、ＯＳＫ－ｉＰＳ細胞由来のキメラマウス２種（ＯＳＫ２－１及びＯＳＫ２－２）よりも高い生殖能力を示すとともに（図１０ａ）、有色の毛の仔を多く出産した（図１０ｂ及びｃ）。なお、かかる仔において表現型の異常は認められなかった。
　以上の結果は、ＯＳＫ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞は、高い分化多能性を有することを示している。
３．方法
［ヒトｉＰＳ細胞の産生と細胞培養法］
　ヒトｉＰＳ細胞の産生は、文献（Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K., Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus, Nature Protocols 7, 718-728, 2012）に記載されたプロトコールにしたがって行った。ヒトのＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｌ－Ｍｙｃ及びＨ１ｆｏｏ遺伝子（配列番号１のヌクレオチド配列：BC047943）を含むセンダイウイルスベクターを用いて、ヒト末梢血リンパ球又はヒト皮膚線維芽細胞からｉＰＳ細胞（ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞）を産生した。なお、コントロールとして、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子に代えてAzami-Green遺伝子を用いてｉＰＳ細胞（ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞）を産生した。また、本実験は慶應義塾大学の遺伝子組み換え実験指針にしたがって行った。
　ヒトｉＰＳ細胞株は、StemFit AK02N（味の素社製）培養液（以下、「ヒトｉＰＳ細胞培養液」という）中で、iMatrix-511（ニッピ社製）でコーティングした培養皿上で培養・維持した。なお、ヒトｉＰＳ細胞の培養液は２日毎に交換し、細胞は５～７日毎にStemPro Accutase（Gibco社製）を用いて継代した。
４．結果
［ｉＰＳ細胞の染色体異常を反映する遺伝子の発現量の比較］
　上記［ヒトｉＰＳ細胞の産生と細胞培養法］の項目に記載の方法にしたがって樹立したヒトｉＰＳ細胞のゲノム不安定性の比較検討を行うため、染色体異常を有すると発現量が低下するＳＲＦ遺伝子、ＡＣＴＧ２遺伝子(Lamm, N., Kerem, B., Genomic Instability in Human Pluripotent Stem Cells Arises from Replicative Stress and Chromosome Condensation Defects Cell Stem Cell 18(2): 253-261. 2016)について、その発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲ解析により比較検討した。かかる定量ＲＴ－ＰＣＲ解析は、４クローンのＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞、及び、４クローンのＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞（コントロール）を用い、上記［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがって行った。ＳＲＦ遺伝子に関する定量ＲＴ－ＰＣＲ解析の結果を図１１ａに示し、ＡＣＴＧ２遺伝子に関する定量ＲＴ－ＰＣＲ解析の結果を図１１ｂに示す。
　図１１のａ及びｂの結果から分かるように、ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞群は、ＳＲＦ遺伝子およびＡＣＴＧ２遺伝子いずれについても、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞群（コントロール）よりも有意に高い発現量を示した。この結果から、核初期化物質に加えて、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を用いると、ｉＰＳ細胞樹立過程で生じうる染色体異常が抑制され、より高品質なｉＰＳ細胞集団を産生できることが示された。
［ｉＰＳ細胞の未分化マーカーの発現量の比較］
　上記［ヒトｉＰＳ細胞の産生と細胞培養法］の項目に記載の方法にしたがって樹立したｉＰＳ細胞が、安定した未分化状態を維持しているかを調べるために、Ｏｃｔ３／４遺伝子（幹細胞の未分化マーカー）の発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲ解析により比較検討した。かかる定量ＲＴ－ＰＣＲ解析は、４クローンのＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞、及び、４クローンのＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞（コントロール）を用い、上記［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがって行った。かかる定量ＲＴ－ＰＣＲ解析の結果を図１２に示す。
　図１２の結果から分かるように、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞群（コントロール）と比較して、ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞群は、Ｏｃｔ３／４遺伝子（幹細胞の未分化マーカー）の発現量のクローン間のばらつきが有意に少なかった。この結果から、核初期化物質に加えて、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を用いると、より安定した未分化状態が維持され、品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞集団を産生できることが示された。
［分化誘導初期における細胞生存率の比較］
　上記［ヒトｉＰＳ細胞の産生と細胞培養法］の項目に記載の方法にしたがって樹立したヒトｉＰＳ細胞の分化誘導初期における細胞生存数を比較検討するため，一定の細胞数（1×10６cells/well）を播種した後に、ｉＰＳ細胞培養液からRPMI-1640 (Sigma Aldrich社製)＋B27 Supplement（Gibco社製）培養液へと交換し、翌日細胞を回収しトリパンブルー溶液を用いて生存細胞数を算出し比較した。かかる性細胞数の算出を、４クローンのＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞、及び、４クローンのＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞（コントロール）について行った結果を図１３に示す。
　図１３の結果からわかるように、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞群（コントロール）と比較して、ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞群は分化誘導後の生存細胞数が有意に多く、分化誘導環境下への適応力が高い傾向が認められた。この結果から、核初期化物質に加えて、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を用いると、分化誘導後の生存細胞数がより多く、分化誘導環境下への適応力がより高いという、より高品質なｉＰＳ細胞集団を産生できることが示された。
［ｉＰＳ細胞の分化誘導初期の未分化マーカー残存量の比較］
　上記［ヒトｉＰＳ細胞の産生と細胞培養法］の項目に記載の方法にしたがって樹立したヒトｉＰＳ細胞の分化誘導初期におけるＯｃｔ３／４遺伝子（幹細胞の未分化マーカー）の残存量の比較を行った。具体的には、一定の細胞数（1×10６cells/well）を各ウェルに播種した後に、ｉＰＳ細胞培養液から分化誘導培養液［DMEM F12 HAM（Sigma Aldrich社製）＋ＦＢＳ（Gibco社製)＋GlutaMAX(Gibco社製)＋PenStrep(Gibco社製)＋２メルカプトエタノール(Sigma Aldrich社製)］へと交換し、培養液交換後５日目に細胞を回収し、未分化マーカーであるＯｃｔ３／４遺伝子の発現量を定量ＲＴ－ＰＣＲ解析を用いて比較した。かかる定量ＲＴ－ＰＣＲ解析は、４クローンのＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞、及び、４クローンのＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞（コントロール）を用い、上記［定量ＲＴ－ＰＣＲ解析］の項目に記載の方法にしたがって行った。かかる定量ＲＴ－ＰＣＲ解析の結果を図１４に示す。
　図１４の結果から分かるように、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ細胞群（コントロール）においては、分化誘導培養液で５日間培養したにもかかわらず、未分化マーカー（Ｏｃｔ３／４）が高度に残存しているクローン（ＯＳＫＬ－ｉＰＳ ２や、ＯＳＫＬ－ｉＰＳ ４）が複数存在したのに対し、ＯＳＫＬ＋Ｈ１ｆｏｏ－ｉＰＳ細胞群においては、いずれのクローンでも未分化マーカーの発現は低く、しかも、クローン間における未分化マーカーの発現のばらつきは有意に少なかった。これらの結果から、核初期化物質に加えて、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を用いて作製したｉＰＳ細胞は、分化誘導培養液で培養すると、未分化マーカーの発現が速やかに消失し、その消失についてばらつきが少ないことが示された。よって、核初期化物質に加えて、Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を用いると、品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞集団を産生できることが示された。
　本発明は、ｉＰＳ細胞の品質改善剤、ｉＰＳ細胞の製造方法、かかる製造方法により製造されるｉＰＳ細胞、及び、ｉＰＳ細胞製造用組成物を提供することができる。本発明によれば、より高品質で、しかも品質のばらつきがより少ないｉＰＳ細胞を製造することができる。

Claims (9)

  1. 　Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞の品質改善剤。
  2. 　Ｈ１ｆｏｏ遺伝子を含む発現ベクターを含むことを特徴とする請求項１に記載のｉＰＳ細胞の品質改善剤。
  3. 　（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を体細胞に導入する工程を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞の製造方法。
  4. 　核初期化物質が、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｋｌｆ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子ファミリーの遺伝子、Ｌｉｎ遺伝子ファミリーの遺伝子、及びＮａｎｏｇ遺伝子、並びに、それらの遺伝子産物からなる群から選択される少なくとも１つを含む請求項３に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
  5. 　核初期化物質が、Ｏｃｔ遺伝子ファミリーの遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ遺伝子ファミリーの遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ遺伝子ファミリー遺伝子又はその遺伝子産物からなる請求項３又は４に記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
  6. 　核初期化物質が、Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、及びＫｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物からなる請求項３～５のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
  7. 核初期化物質が、Ｏｃｔ３／４遺伝子又はその遺伝子産物、Ｓｏｘ２遺伝子又はその遺伝子産物、Ｋｌｆ４遺伝子又はその遺伝子産物、及びＬ－Ｍｙｃ遺伝子又はその遺伝子産物からなる請求項３～５のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法。
  8. 　請求項１～７のいずれかに記載のｉＰＳ細胞の製造方法により製造されるｉＰＳ細胞。
  9. 　（ａ）核初期化物質、及び（ｂ）Ｈ１ｆｏｏ遺伝子又はその遺伝子産物を含むことを特徴とするｉＰＳ細胞製造用組成物。
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