WO2017010382A1 - 筋強直性ジストロフィー治療薬 - Google Patents

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myd
myotonic dystrophy
acid
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雅之 中森
望月　秀樹
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Osaka University NUC
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for myotonic dystrophy.
  • Myotonic dystrophy (Myotonic dystrophy, hereinafter sometimes abbreviated as “MyD”) is the most common muscular disease in adults. MyD is an autosomal dominant multi-organ disorder that affects the eyeball, heart, endocrine system, and central nervous system as well as skeletal and smooth muscles. Symptoms include muscle atrophy, muscle weakness, myotonia (myotonia), cataract, insulin There are a wide variety of subjects such as resistance, hypogonadism, cardiac conduction system disorders, anterior buns, and intellectual impairment (Non-Patent Document 1).
  • MyD includes type I (MyD1) due to abnormal extension of the CTG repeat of the 3′UTR (3 ′ untranslated region) of the myotonin protein kinase (DMPK) gene (Non-Patent Documents 2-4), Zn finger protein 9 (ZNF9) There is type II (MyD2) due to abnormal extension of CCTG repeat sequence of gene intron 1 (Non-patent Document 5).
  • a specific splicing regulator binds to a transcript (mRNA) having a repetitively elongated repeat sequence, and as a result, a splicing abnormality is caused by a lack of a splicing regulator necessary for normal splicing.
  • Patent Document 1 discloses that 18 kinds of compounds such as gentian violet were able to suppress at least one splicing abnormality among genes in which splicing abnormality was observed in myotonic dystrophy. However, it is not disclosed that these compounds actually improved the symptoms of myotonic dystrophy. There is still no effective and safe treatment for myotonic dystrophy, and patients are currently receiving symptomatic treatment such as diet therapy according to various signs.
  • the present invention provides a therapeutic agent for MyD that is capable of improving MyD symptoms by suppressing splicing abnormalities that cause MyD and increasing normal splicing products, and that is highly safe and can be administered for a long period of time.
  • the task is to do.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • Myotonic dystrophy treatment comprising at least one compound selected from the group consisting of erythromycin, clarithromycin and azithromycin, a pharmaceutically acceptable salt, hydrate, or prodrug thereof as an active ingredient medicine.
  • the therapeutic agent for myotonic dystrophy according to [1] which improves myotonicity.
  • DMPK myotonin protein kinase
  • An effective amount of at least one compound selected from the group consisting of erythromycin, clarithromycin, and azithromycin, a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof is administered to a mammal
  • a method for treating myotonic dystrophy characterized by comprising: [5] At least one compound selected from the group consisting of erythromycin, clarithromycin and azithromycin, a pharmaceutically acceptable salt, solvate, or prodrug thereof for use in the treatment of myotonic dystrophy .
  • DMPK myotonin protein kinase
  • a splicing abnormality inhibitor comprising a salt, solvate, or prodrug thereof as an active ingredient.
  • the splicing abnormality inhibitor according to [6] which suppresses splicing abnormality of at least one gene selected from the group consisting of ATP2A1, CLCN1, INSR, DMD, MBNL1, and BIN1.
  • the present invention it is possible to provide a highly safe MyD therapeutic agent that can improve MyD symptoms and can be administered for a long period of time. Moreover, the present invention can provide a splicing abnormality inhibitor that remarkably suppresses splicing abnormality caused by abnormal extension of myotonin protein kinase (DMPK) gene.
  • DMPK myotonin protein kinase
  • FIG. It is a figure which shows the result of having examined the effect of erythromycin with respect to RNA aggregate formation in MyD model cell. It is a figure which shows the result of having examined the effect of erythromycin with respect to the splicing abnormality of Atp2a1 gene in a MyD model cell, (A) is the result of electrophoresis of RT-PCR product, (B) is the ratio of the normal type in RT-PCR product.
  • FIG. It is a figure which shows the result of having examined the effect with respect to the splicing abnormality of the skeletal muscle chloride channel (Clcn1) gene in the quadriceps quadriceps muscle after administering erythromycin intraperitoneally to MyD model mouse for 8 days.
  • Clcn1 skeletal muscle chloride channel
  • the present invention relates to a treatment for myotonic dystrophy comprising as an active ingredient at least one compound selected from the group consisting of erythromycin, clarithromycin and azithromycin, a pharmaceutically acceptable salt, a solvate, or a prodrug thereof.
  • erythromycin clarithromycin and azithromycin
  • a pharmaceutically acceptable salt a pharmaceutically acceptable salt, a solvate, or a prodrug thereof.
  • Erythromycin is a 14-membered macrolide antibiotic that exhibits strong antibacterial activity mainly against Gram-positive bacteria, and was isolated and extracted from the culture solution of Streptomyces erythreus in 1952 by McGuire et al. Erythromycin has the following chemical structure, and the chemical names are (2R, 3S, 4S, 5R, 6R, 8R, 10R, 11R, 12S, 13R) -5- (3, 4, 6-Trideoxy-3-dimethylamino- ⁇ -D-xylo-hexopyranosyloxy) -3- (2, 6-dideoxy-3-Cmethyl-3-O-methyl- ⁇ -L-ribo-hexopyranosyloxy) -6, 11, 12-trihydroxy-2, 4, 6 8, 10, 12-hexamethyl-9-oxopentadecan-13-olide.
  • Erythromycin is approved and sold as an ethical drug, and these erythromycins can be purchased and used in the present invention.
  • a salt such as erythromycin stearate or erythromycin lactobionate or a prodrug such as erythromycin ethyl succinate is used as an active ingredient, and these can be suitably used as the erythromycin of the present invention. it can.
  • Clarithromycin is a semi-synthetic macrolide antibiotic (6-O-methylerythromycin A) in which the 6-position hydroxyl group of the lactone ring of erythromycin is O-methylated. Due to its chemical structure, clarithromycin is more resistant to acid than erythromycin. It is said to be a stable substance.
  • Clarithromycin has the following chemical structure, and the chemical names are (2R, 3S, 4S, 5R, 6R, 8R, 10R, 11R, 12S, 13R) -5- (3, 4, 6 -Trideoxy-3- dimethylamino- ⁇ -D-xylo-hexopyranosyloxy) -3- (2, 6-dideoxy-3-C-methyl-3-O-methyl- ⁇ -L-ribo-hexopyranosyloxy) -11, 12-dihydroxy-6-methoxy -2, 4, 6, 8, 10, 12-hexamethyl-9-oxopentadecan-13-olide. Clarithromycin is approved and marketed as an ethical drug, and these clarithromycins can be purchased and used in the present invention.
  • Azithromycin is a 14-membered macrolide antibiotic derived from erythromycin.
  • Azithromycin has the following chemical structure, and the chemical names are (2R, 3S, 4S, 5R, 6R, 8R, 11R, 12R, 13S, 14R) -5- (3, 4, 6-Trideoxy-3-dimethylamino- ⁇ -D-xylo-hexopyranosyloxy) -3- (2,6-dideoxy-3-C-methyl-3-O-methyl- ⁇ -L-ribo-hexopyranosyloxy) -10-aza-6, 12, -13-trihydroxy -2, 4, 6, 8, 10, 11, 13-heptamethylhexadecan-14-olide dihydrate.
  • Azithromycin is approved and marketed as an ethical drug, and these azithromycins can be purchased and used in the present invention.
  • Azithromycin is preferably used as a hydrate.
  • Erythromycin, clarithromycin and azithromycin are orally administrable antibiotics and have already been used in clinical practice for many years, and thus safety for long-term administration has been established. Therefore, an inexpensive, tolerable and safe therapeutic agent can be provided for MyD patients.
  • the pharmaceutically acceptable salt is not particularly limited as long as it maintains the efficacy of the active ingredient and does not adversely affect the human body.
  • acetic acid, propionic acid, butyric acid, formic acid, trifluoroacetic acid Maleic acid, tartaric acid, citric acid, stearic acid, succinic acid, ethyl succinic acid, malonic acid, lactobionic acid, gluconic acid, glucoheptonic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, benzenesulfone Acid, p-toluenesulfonic acid (tosylic acid), lauryl sulfuric acid, malic acid, aspartic acid, glutamic acid, adipic acid, cysteine, N-acetylcysteine, hydrochloric acid, hydrobromic acid, phosphoric acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, hydrobro
  • a prodrug means a compound that is converted to erythromycin, clarithromycin, or azithromycin by a reaction with an enzyme, gastric acid or the like under physiological conditions in vivo. Examples thereof include esters that undergo hydrolysis in vivo to release these compounds.
  • the therapeutic agent of the present invention can effectively improve MyD symptoms.
  • MyD includes type I (MyD1) in which an abnormal extension of the CTG repeat sequence of the 3′UTR of the myotonin protein kinase (DMPK) gene is observed, and an abnormal extension of the CCTG repeat sequence of the Zn finger protein 9 (ZNF9) gene intron 1
  • MyD2 the recognized type II
  • the therapeutic targets of the therapeutic agent of the present invention include, but are not limited to, all diseases diagnosed as MyD.
  • it is type I (MyD1).
  • Symptoms improved by the therapeutic agent of the present invention are not particularly limited.
  • myotonia myotonia
  • muscle atrophy muscle weakness
  • cardiac lesion cardiac conduction disorder, myocardial disorder
  • central nervous system symptoms central nervous system symptoms (cognitive symptoms, personality changes)
  • Somnolence ocular symptoms
  • endocrine abnormalities glucose intolerance, hyperlipidemia
  • muscle tonicity muscle atrophy and muscle weakness
  • muscle tonicity myotonia
  • the therapeutic agent of the present invention can suppress splicing abnormality caused by abnormal growth of myotonin protein kinase (DMPK) gene.
  • Splicing abnormality means that splicing, which is a process of removing introns from mRNA precursors and ligating exons, is not performed normally, and abnormal splicing products are generated.
  • Suppressing splicing abnormalities means that the production of abnormal splicing products is partially or completely suppressed and the production of normal splicing products (normal mRNA) is increased.
  • genes in which splicing abnormality is caused by abnormal elongation of DMPK gene include the genes shown in Table 1 below (Nakamori M, et al: ANN NEUROL 2013; 74: 862-872).
  • the therapeutic agent of the present invention can be formulated by appropriately blending the above active ingredients with a pharmaceutically acceptable carrier and further additives.
  • oral preparations such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions; parenterals such as injections, infusions, suppositories, ointments, patches, etc. can do.
  • What is necessary is just to set suitably about the mixture ratio of a carrier or an additive based on the range normally employ
  • Carriers or additives that can be blended are not particularly limited.
  • various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption
  • Various additives such as an accelerator, a lubricant, a colorant, a corrigent, and a fragrance are included.
  • excipient examples include lactose, sucrose, D-mannitol, starch, crystalline cellulose, and light anhydrous silicic acid.
  • binder examples include crystalline cellulose, sucrose, D-mannitol, dextrin, hydroxypropylcellulose, Examples thereof include polymer compounds such as hydroxypropylmethylcellulose and polyvinylpyrrolidone.
  • lubricant examples include magnesium stearate, calcium stearate, talc, colloidal silica, and the like.
  • disintegrant examples include starch and carboxy. Examples include methylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, etc.
  • wetting agents include glycerin, butylene glycol, propylene glycol, Rubitoru, although triacetin and the like, but not limited to. If necessary, it may be coated with a coating agent (sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc.), or may be coated with two or more layers.
  • a coating agent sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate, etc.
  • the active ingredient is dissolved or dispersed in an aqueous base such as physiological saline or an oil base acceptable for injection, and injected for intravenous, intramuscular or subcutaneous administration. do it.
  • an aqueous base such as physiological saline or an oil base acceptable for injection
  • additives such as a buffer, a pH adjuster, a tonicity agent, a solubilizing agent, a suspending agent, and a stabilizer can be appropriately added.
  • examples of the aqueous base include infusion solutions such as physiological saline, water for injection, Ringer's solution, and the like.
  • examples of the oil base include propylene glycol, polyethylene glycol, sesame oil, soybean oil, corn oil, peanut oil, cottonseed oil, olive oil, propylene glycol fatty acid ester and the like.
  • examples of the buffer include phosphates, acetates, carbonates, citrates, borates, glutamates, epsilon aminocaproate, and buffer solutions such as Tris buffer.
  • pH adjusters include inorganic acids such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, and carbonic acid, organic acids such as acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, tartaric acid, and succinic acid, inorganic bases such as sodium hydroxide, and sodium citrate. And organic bases such as sodium tartrate.
  • tonicity agents include inorganic salts such as sodium chloride, sugar alcohols such as D-mannitol, sorbitol, and xylitol, and sugars such as fructose, glucose, glass tose, ribose, xylose, mannose, maltotriose, and maltotetraose.
  • Amino acids such as glycine and arginine.
  • solubilizers include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate, lecithin, and nonionic ions such as polysorbate 80.
  • Surfactant is mentioned.
  • the suspending agent include surfactants such as stearyltriethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, glyceryl monostearate, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylcellulose.
  • the stabilizer include albumin, globulin, gelatin, sorbitol, ethylene glycol, propylene glycol, ascorbic acid and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention can be applied to humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats). , Dogs, monkeys, etc.).
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is an amount effective for MyD treatment and has few side effects.
  • the daily dose of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably set according to the daily dose of commercially available erythromycin, clarithromycin or azithromycin.
  • the present invention provides an inhibitor of splicing abnormality caused by abnormal elongation of myotonin protein kinase (DMPK) gene.
  • the splicing abnormality inhibitor of the present invention is the same as the therapeutic agent of the present invention, and at least one compound selected from the group consisting of erythromycin, clarithromycin and azithromycin, a pharmaceutically acceptable salt, solvate thereof, or These prodrugs can be used as active ingredients.
  • genes whose splicing abnormality is suppressed by the splicing abnormality inhibitor of the present invention include the genes shown in Table 1 above. Among these, it is preferable to suppress splicing abnormalities such as ATP2A1, CLCN1, INSR, DMD, MBNL1, and BIN1, and it is preferable to suppress splicing abnormalities of ATP2A1 and CLCN1.
  • the present invention includes the following inventions.
  • a method of treating characteristic myotonic dystrophy At least one compound selected from the group consisting of erythromycin, clarithromycin and azithromycin, a pharmaceutically acceptable salt, solvate or prodrug thereof for use in the treatment of myotonic dystrophy.
  • erythromycin Use of at least one compound selected from the group consisting of erythromycin, clarithromycin and azithromycin, a pharmaceutically acceptable salt, a solvate, or a prodrug thereof for the manufacture of a therapeutic agent for myotonic dystrophy .
  • DMPK myotonin protein kinase
  • Example 1 Effect of erythromycin on RNA aggregate formation in MyD model cells
  • Erythromycin was allowed to act on MyD model cells, and the number of RNA aggregates was measured by the FISH (fluorescent in situ hybridization) method.
  • MyD model cell As a MyD cell model, a cell (C2C12-DMPK800R, Nucleic Acids Research, 2014, 42 (10), 6591-6602) in which a DMPK gene region containing 800 CTG repeats was introduced into C2C12 cells was used.
  • C2C12-DMPK800 was produced by the following procedure. That is, a plasmid (pLC16) containing a sequence in which 800 CTG is inserted into the 3 ′ untranslated region of the DMPK gene and a plasmid expressing PhiC31 integrase are both used as a mouse myoblast cell line C2C12 with Nucleofector (trade name, Lonza).
  • Erythromycin “Erythrosine (registered trademark) for intravenous injection 500 mg (erythromycin lactobionate for injection)” (Abbott) was used as erythromycin. It was dissolved in 10 ml of ultrapure water and diluted with physiological saline to 15 mg / ml.
  • RNA aggregates formed MyD model cells were cultured in a DMEM medium containing 10% FBS and penicillin / streptomycin under the conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • Erythromycin was added to the medium so as to be 0, 25, or 50 ⁇ M, and after 72 hours, it was fixed with 3% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature. After fixation, the plate was washed twice with PBS and then permeabilized with PBS containing 0.5% Triton X-100 for 5 minutes. Next, prehybridization treatment was carried out with 2 ⁇ SSC buffer containing 30% formamide for 10 minutes. Thereafter, hybridization was performed at 37 ° C.
  • RNA aggregates in the nucleus was measured with a fluorescence microscope (Keyence PZ-9000).
  • Example 2 Effect of erythromycin on splicing abnormality in MyD model cells. It was verified whether splicing abnormality in exon 22 of Atp2a1 gene was improved by allowing erythromycin to act on MyD model cells.
  • Example 1 ⁇ Experimental materials and methods> (1) MyD model cell The same MyD model cell (C2C12-DMPK800R) as in Example 1 was used. (2) Erythromycin The same erythromycin as in Example 1 was used. (3) Quantification of splicing product Erythromycin was added to the medium of MyD model cells so that it might become 0, 25, 50 micromol, and total RNA was extracted 72 hours later using RNeasy Mini Plus Kit (trade name, Qiagen). As a control, normal RNA was extracted in the same manner using normal C2C12 cells cultured in a medium not containing erythromycin. Subsequently, cDNA was prepared using SuperScript III First Strand System (Invitrogen).
  • Atp2a1 exon 22 RT primers were electrophoresed on a 2% agarose gel, stained with GelRed, and then the normal PCR product and the abnormal PCR product were each quantified with an image analyzer (Typhoon 9410, GE).
  • FIGS. 2 (A) and (B) The results are shown in FIGS. 2 (A) and (B).
  • (A) is the result of electrophoresis of the RT-PCR product
  • (B) is a graph showing the proportion of normal type in the RT-PCR product. From FIG. 2 (A), normal C2C12 cells accounted for many normal types, and MyD model cells cultured in a medium not containing erythromycin had a higher proportion of abnormal types than normal types. It was shown that the addition of erythromycin to the medium significantly increased the proportion of normal type in MyD model cells and improved splicing abnormalities to the same extent as normal C2C12 cells.
  • Example 3 Effect of intraperitoneal erythromycin administration in MyD model mice. Erythromycin was intraperitoneally administered to MyD model mice, and the effect on myotonic symptoms in quadriceps muscle and the splicing abnormality of skeletal muscle chloride channel (Clcn1) gene were verified.
  • HSA LR mice Animals used HSA LR mice (transferred from Dr. Charles Thornton (University of Rochester) and bred at the laboratory animal facility of Osaka University) were used as MyD model mice.
  • HSA LR mice are transgenic animals in which the hACTA gene (human gene constitutively expressed in muscle cells) 3′-side CTG repeats amplified 220 times are integrated into the genome, and CUG sequences are amplified in muscle cells. By expressing mRNA, symptoms of MyD appear (Science, 2000, 289 (5485), 1769-73).
  • wild type mice FVB / NJcl mice, purchased from CLEA Japan
  • Erythromycin “Erythrosine (registered trademark) for intravenous injection 500 mg (erythromycin lactobionate for injection)” (Abbott) was used as erythromycin. It was used by dissolving with physiological saline to 50 mg / ml.
  • (3) Grouping and administration schedule Three groups were provided: an erythromycin-administered MyD group, a physiological saline-administered MyD group, and a control (wild-type mouse) group (each group n 3 ( ⁇ 1, ⁇ 2)). The dose of erythromycin was 150 mg / kg, and was administered once a day for 8 consecutive days. Saline was administered to the MyD group administered physiological saline once a day for 8 consecutive days. None was administered to the control (wild type mouse) group.
  • Rv CACGGAACACAAAGGCACTG (SEQ ID NO: 4)
  • Fig. 4 shows the analysis results of muscle tonicity.
  • muscle tonicity was not detected in all three animals.
  • muscle tonicity of severity 3 was detected in all three animals.
  • erythromycin-administered MyD group one had a severity of 1 and the other two did not detect muscle tonicity. From these results, it was shown that splicing abnormality based on abnormal extension of CTG repeats was improved by erythromycin administration, and as a result, myotonic symptoms in MyD were improved.
  • Example 4 Effect of oral administration of high-dose erythromycin in MyD model mice
  • a high dose of erythromycin was orally administered to a MyD model mouse, and the effect on splicing abnormality of the skeletal muscle chloride channel (Clcn1) gene in quadriceps femoris was verified.
  • Clcn1 skeletal muscle chloride channel
  • Example 5 Effect of oral administration of normal dose erythromycin in MyD model mice.
  • a normal dose of erythromycin was orally administered to MyD model mice, and the effect on myotonic symptoms in the quadriceps muscle and the splicing abnormality of the skeletal muscle chloride channel (Clcn1) gene were verified.
  • Example 3 Animal used The same MyD model mouse (HSA LR mouse) and wild type mouse as in Example 3 were used.
  • Erythromycin As in Example 4, “erythrosine (registered trademark) dry syrup W20% (erythromycin ethyl succinate dry syrup)” (Abbott) was used as erythromycin after being dissolved in pure water to 100 mg / ml. .
  • (3) Grouping and administration schedule Three groups of erythromycin 50 mg / kg administration MyD group, physiological saline administration MyD group, and control (wild type mouse) group were provided (each group n 3). Administration was by gavage and was performed once a day for 21 consecutive days.
  • Fig. 7 shows the analysis results of muscle tonicity.
  • all 3 animals detected muscle tonicity of severity 3, but in the erythromycin 50 mg / kg-administered MyD group, 2 animals improved to severity 2 and 1 animal improved to severity 1.

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Abstract

本発明は、筋強直性ジストロフィーの原因であるスプライシング異常を抑制し、正常スプライシング産物を増加させることにより、筋強直性ジストロフィーの症状を改善することができると共に、安全性が高く、長期投与可能な筋強直性ジストロフィーの治療薬として、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その薬学的に許容される塩、水和物、またはそれらのプロドラッグを有効成分とする筋強直性ジストロフィー治療薬を提供する。

Description

筋強直性ジストロフィー治療薬
　本発明は筋強直性ジストロフィー治療薬に関するものである。
　筋強直性ジストロフィー（Ｍｙｏｔｏｎｉｃ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ、以下、「ＭｙＤ」と略記する場合がある。）は、成人で最も多い筋疾患である。ＭｙＤは、骨格筋、平滑筋とともに眼球、心臓、内分泌系、中枢神経系に影響する常染色体優性多臓器障害であり、その症状は、筋萎縮、筋力低下、筋強直（ミオトニア）、白内障、インスリン抵抗性、性腺機能低下、心伝導系障害、前部禿頭、知能障害等多岐にわたる（非特許文献１）。ＭｙＤにはミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲ（３’側非翻訳領域）のＣＴＧ繰り返し配列の異常伸長によるＩ型（ＭｙＤ１）（非特許文献２－４）と、Ｚｎフィンガー蛋白質９（ＺＮＦ９）遺伝子イントロン１のＣＣＴＧ繰り返し配列の異常伸長によるＩＩ型（ＭｙＤ２）（非特許文献５）がある。いずれも異常伸長した繰り返し配列を持つ転写産物（ｍＲＮＡ）に特定のスプライシング制御因子が結合し、結果として正常なスプライシングに必要なスプライシング制御因子が不足することによりスプライシング異常を惹起する。
　特許文献１には、ゲンチアナバイオレット等の１８種類の化合物が、筋強直性ジストロフィーにおいてスプライシング異常が認められる遺伝子のうち、少なくとも一つのスプライシング異常を抑制できたことが開示されている。しかしながら、これらの化合物が実際に筋強直性ジストロフィーの症状を改善したことは開示されていない。筋強直性ジストロフィーに対する有効かつ安全性の高い治療法は未だ存在せず、患者には各種徴候に応じた食事療法等の対症療法が施されているのが現状である。
国際公開第２０１１／００７８６６号
Harper, PS and Monckton, DG: Myotonic dystrophy. In Engel AG, Franzini-Armstrong C (eds) Myology, 3rd edn. McGraw-Hill, New York, 2: 1039-1076, 2004 Aslanidis C, et al: Cloning of the essential myotonic dystrophy region and mapping of the putative defect, Nature, 355: 548-551, 1992 Brook JD, et al: Molecular basis of myotonic dystrophy: expansion of a trinucleotide (CTG) repeat at the 3’ end of a transcript encoding a protein kinase family member, Cell, 68: 799-808, 1992 Buxton J, et al: Detection of an unstable fragment of DNA specific to individuals with myotonic dystrophy, Nature, 355, 547-548, 1992 Liquori CL, et al: Myotonic dystrophy type 2 caused by a CCTG expansion in intron 1 of ZNF9, Science, 293, 864-867, 2001
　本発明は、ＭｙＤの原因であるスプライシング異常を抑制し、正常スプライシング産物を増加させることにより、ＭｙＤの症状を改善することができると共に、安全性が高く、長期投与可能なＭｙＤの治療薬を提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その薬学的に許容される塩、水和物、またはそれらのプロドラッグを有効成分とする筋強直性ジストロフィー治療薬。
［２］筋強直を改善する前記［１］に記載の筋強直性ジストロフィー治療薬。
［３］ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常を抑制する前記［１］または［２］に記載の筋強直性ジストロフィー治療薬。
［４］哺乳動物に対して、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグの有効量を投与することを特徴とする筋強直性ジストロフィーの治療方法。
［５］筋強直性ジストロフィーの治療に用いるための、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグ。
［６］ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常の抑制剤であって、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを有効成分とするスプライシング異常抑制剤。
［７］ＡＴＰ２Ａ１、ＣＬＣＮ１、ＩＮＳＲ、ＤＭＤ、ＭＢＮＬ１およびＢＩＮ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のスプライシング異常を抑制する前記［６］に記載のスプライシング異常抑制剤。
　本発明により、ＭｙＤの症状を改善でき、かつ長期投与可能な安全性の高いＭｙＤ治療薬を提供することができる。また、本発明により、ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常を顕著に抑制するスプライシング異常抑制剤を提供することができる。
ＭｙＤモデル細胞におけるＲＮＡ凝集体形成に対するエリスロマイシンの効果を検討した結果を示す図である。 ＭｙＤモデル細胞におけるＡｔｐ２ａ１遺伝子のスプライシング異常に対するエリスロマイシンの効果を検討した結果を示す図であり、（Ａ）はＲＴ－ＰＣＲ産物の電気泳動の結果、（Ｂ）はＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を示す図である。 ＭｙＤモデルマウスにエリスロマイシンを８日間腹腔内投与し、投与後の大腿四頭筋における骨格筋クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果を検討した結果を示す図である。 ＭｙＤモデルマウスにエリスロマイシンを８日間腹腔内投与し、投与後の大腿四頭筋における筋強直（ミオトニア）を解析した結果を示す図である。 ＭｙＤモデルマウスに高用量エリスロマイシンを５日間経口投与し、投与後の大腿四頭筋における骨格筋クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果を検討した結果を示す図である。 ＭｙＤモデルマウスに通常用量エリスロマイシンを２１日間経口投与し、投与後の大腿四頭筋における骨格筋クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果を検討した結果を示す図である。 ＭｙＤモデルマウスに通常用量エリスロマイシンを２１日間経口投与し、投与後の大腿四頭筋における筋強直（ミオトニア）を解析した結果を示す図である。
　本発明は、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを有効成分とする筋強直性ジストロフィー治療薬を提供する。
　エリスロマイシンは、主としてグラム陽性菌に強い抗菌力を示す１４員環のマクロライド系抗生物質で、１９５２年ＭｃＧｕｉｒｅらによりＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｅｒｙｔｈｒｅｕｓの培養液から分離抽出された。エリスロマイシンは以下の化学構造を有し、化学名は (2R, 3S, 4S, 5R, 6R, 8R, 10R, 11R, 12S, 13R)-5-(3, 4, 6-Trideoxy-3-dimethylamino-β-D-xylo-hexopyranosyloxy)-3-(2, 6-dideoxy-3-Cmethyl-3-O-methyl-α-L-ribo-hexopyranosyloxy)-6, 11, 12-trihydroxy-2, 4, 6, 8, 10, 12-hexamethyl-9-oxopentadecan-13-olide である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　エリスロマイシンは医療用医薬品として承認され、販売されており、本発明においてこれらのエリスロマイシンを購入して使用することができる。市販のエリスロマイシン製剤では、エリスロマイシンステアリン酸塩、エリスロマイシンラクトビオン酸塩等の塩、エリスロマイシンエチルコハク酸エステル等のプロドラッグが有効成分として使用されており、これらを本発明のエリスロマイシンとして、好適に用いることができる。
　クラリスロマイシンは、エリスロマイシンのラクトン環の６位水酸基をＯ－メチル化した半合成マクロライド系抗生物質（６－Ｏ－メチルエリスロマイシンＡ）で、その化学構造上、エリスロマイシンに比べて酸に対して安定な物質といわれている。クラリスロマイシンは以下の化学構造を有し、化学名は (2R, 3S, 4S, 5R, 6R, 8R, 10R, 11R, 12S, 13R)-5-(3, 4, 6 -Trideoxy-3-dimethylamino-β-D-xylo-hexopyranosyloxy)-3-(2, 6-dideoxy-3-C-methyl-3-O-methyl-α-L-ribo-hexopyranosyloxy)-11, 12-dihydroxy-6-methoxy-2, 4, 6, 8, 10, 12-hexamethyl-9-oxopentadecan-13-olide である。クラリスロマイシンは医療用医薬品として承認され、販売されており、本発明においてこれらのクラリスロマイシンを購入して使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　アジスロマイシンは、エリスロマイシンから誘導された１４員環のマクロライド系抗生物質である。アジスロマイシンは以下の化学構造を有し、化学名は (2R, 3S, 4S, 5R, 6R, 8R, 11R, 12R, 13S, 14R)-5-(3, 4, 6-Trideoxy-3-dimethylamino-β-D-xylo-hexopyranosyloxy)-3-(2,6-dideoxy-3-C-methyl-3-O-methyl-α-L-ribo-hexopyranosyloxy)-10-aza-6, 12, 13-trihydroxy-2, 4, 6, 8, 10, 11, 13-heptamethylhexadecan-14-olide dihydrate である。アジスロマイシンは医療用医薬品として承認され、販売されており、本発明においてこれらのアジスロマイシンを購入して使用することができる。アジスロマイシンは水和物として使用されることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンは経口投与可能な抗生物質であり、既に長年にわたり臨床で使用されている薬剤であるので、長期間投与の安全性も確立されている。したがって、ＭｙＤ患者に対して、安価で、忍容性および安全性の高い治療薬を提供することができる。
　本発明において、薬学的に許容される塩は、活性成分の効能を維持し、かつ人体に対して悪影響を与えない限り特に限定されないが、例えば、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、ステアリン酸、コハク酸、エチルコハク酸、マロン酸、ラクトビオン酸、グルコン酸、グルコヘプトン酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２－ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸（トシル酸）、ラウリル硫酸、リンゴ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、アジピン酸、システイン、Ｎ－アセチルシステイン、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、ヨウ化水素酸、ニコチン酸、シュウ酸、ピクリン酸、チオシアン酸、ウンデカン酸、アクリル酸ポリマー、カルボキシビニルポリマー等の酸との塩、リチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の無機塩基との塩、モルホリン、ピペリジン等の有機アミンとの塩、アミノ酸との塩などを挙げることができる。
　本発明において、プロドラッグは、生体内における生理条件下で酵素や胃酸等による反応によりエリスロマイシン、クラリスロマイシンまたはアジスロマイシンに変換される化合物を意味する。例えば、生体内で加水分解を受けてこれらの化合物を遊離するエステル等が挙げられる。
　本発明の治療薬は、ＭｙＤの症状を有効に改善することができる。ＭｙＤにはミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子の３’ＵＴＲのＣＴＧ繰り返し配列の異常伸長が認められるＩ型（ＭｙＤ１）と、Ｚｎフィンガー蛋白質９（ＺＮＦ９）遺伝子イントロン１のＣＣＴＧ繰り返し配列の異常伸長が認められるＩＩ型（ＭｙＤ２）が知られているが、本発明の治療薬の治療対象は、ＭｙＤと診断される全ての疾患を含み、これらに限定されない。好ましくは、Ｉ型（ＭｙＤ１）である。
　本発明の治療薬により改善される症状は、特に限定されず、例えば筋強直（ミオトニア）、筋萎縮、筋力低下、心病変（心伝導障害、心筋障害）、中枢神経症状（認知症状、性格変化、傾眠）、眼症状（白内障、網膜変性症）、内分泌異常（耐糖能障害、高脂血症）などが挙げられる。好ましくは、筋強直（ミオトニア）、筋萎縮および筋力低下であり、より好ましくは筋強直（ミオトニア）である。
　本発明の治療薬は、ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常を抑制することができる。スプライシング異常とは、ｍＲＮＡ前躯体からイントロンを切り除きエクソンを連結させる過程であるスプライシングが正常に行われず、異常スプライシング産物が生成されることをいう。スプライシング異常を抑制するとは、異常スプライシング産物の生成を部分的または完全に抑制し、正常スプライシング産物（正常ｍＲＮＡ）の生成を増加させることをいう。
　ＤＭＰＫ遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常が生じる遺伝子としては、以下の表１に示した遺伝子が挙げられる（Nakamori M, et al: ANN NEUROL 2013; 74: 862-872）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　本発明の治療薬は、上記の有効成分に薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ－マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸が挙げられ、結合剤としては、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ－マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の高分子化合物等が挙げられ、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられ、崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられ、湿潤剤としては、例えば、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール、トリアセチン等が挙げられるが、これらに限られない。必要に応じて、コーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。
　注射剤の場合、有効成分を生理食塩水等の水性基剤または注射用に許容される油性基剤に溶解または分散させて、静脈内投与用、筋肉内投与用または皮下投与用の注射剤とすればよい。必要に応じて、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤等の添加剤を適宜加えることができる。
　注射剤の場合、水性基剤としては、例えば、生理食塩水、注射用水、リンゲル液等の輸液が挙げられる。油性基剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、オリーブ油、プロピレングリコール脂肪酸エステル等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、グルタミン酸塩、イプシロンアミノカプロン酸塩、トリス緩衝液等の緩衝液等が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、炭酸等の無機酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸等の有機酸、水酸化ナトリウム等の無機塩基、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム等の有機塩基が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム等の無機塩類、Ｄ－マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール、フルクトース、グルコース、ガラストース、リボース、キシロース、マンノース、マルトトリオース、マルトテトラオース等の糖類、グリシン、アルギニン等のアミノ酸が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、レシチンや、ポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤や、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、ソルビトール、エチレングルコール、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。
　本発明の治療薬の有効成分は、既に長年にわたり臨床で使用されているので、本発明の治療薬は、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、安全に投与することができる。
　本発明の医薬組成物の１日当たりの投与量は、ＭｙＤの治療に有効な量であって副作用の少ない量であれば特に限定されない。本発明の医薬組成物の１日当たりの投与量は、市販のエリスロマイシン、クラリスロマイシンまたはアジスロマイシンの１日当たりの投与量に準じて設定することが好ましい。
　本発明は、ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常の抑制剤を提供する。本発明のスプライシング異常抑制剤は、上記本発明の治療薬と同じく、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを有効成分とすることができる。
　本発明のスプライシング異常抑制剤により、スプライシング異常が抑制される遺伝子としては、前記表１に示した遺伝子が挙げられる。なかでも、ＡＴＰ２Ａ１、ＣＬＣＮ１、ＩＮＳＲ、ＤＭＤ、ＭＢＮＬ１およびＢＩＮ１等のスプライシング異常を抑制することが好ましく、ＡＴＰ２Ａ１およびＣＬＣＮ１のスプライシング異常を抑制することが好ましい。
　本発明には、以下の各発明が含まれる。
　哺乳動物に対して、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグの有効量を投与することを特徴とする筋強直性ジストロフィーの治療方法。
　筋強直性ジストロフィーの治療に用いるための、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグ。
　筋強直性ジストロフィー治療薬を製造するための、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグの使用。
　哺乳動物に対して、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグの有効量を投与することを特徴とするミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常の抑制方法。
　ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常の抑制に用いるための、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグ。
　ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常抑制剤を製造するための、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグの使用。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：ＭｙＤモデル細胞におけるＲＮＡ凝集体形成に対するエリスロマイシンの効果〕
　ＭｙＤモデル細胞にエリスロマイシンを作用させ、ＦＩＳＨ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）法にてＲＮＡ凝集体の数を測定した。
＜実験材料および方法＞
（１）ＭｙＤモデル細胞
　ＭｙＤ細胞モデルとして、Ｃ２Ｃ１２細胞に８００ＣＴＧリピートを含むＤＭＰＫ遺伝子領域を導入した細胞（Ｃ２Ｃ１２－ＤＭＰＫ８００Ｒ、Nucleic Acids Research, 2014, 42(10), 6591-6602）を使用した。Ｃ２Ｃ１２－ＤＭＰＫ８００は以下の手順で作製した。すなわち、ＤＭＰＫ遺伝子３’非翻訳領域に８００ＣＴＧを挿入した配列を含むプラスミド（ｐＬＣ１６）とＰｈｉＣ３１インテグラーゼを発現するするプラスミドとを、共にマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２にＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商品名、Ｌｏｎｚａ社）を用いてトランスフェクションした後、ピューロマイシンを添加した選択培地を用いて安定発現株を選択した。続いて、安定発現株にＣｒｅリコンビナーゼを発現するプラスミドをトランスフェクションし、ハイグロマイシンを添加した選択培地を用いて、８００ＣＵＧの転写が誘導されるクローンを選択した。
（２）エリスロマイシン
　エリスロマイシンとして「エリスロシン（登録商標）静注用５００ｍｇ（注射用エリスロマイシンラクトビオン酸塩）」（アボット）を使用した。超純水１０ｍｌで溶解し、生理食塩水で１５ｍｇ／ｍｌとなるように希釈して使用した。
（３）ＲＮＡ凝集体形成数の計測
　ＭｙＤモデル細胞は、１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。培地にエリスロマイシンを０、２５または５０μＭになるように添加し、７２時間後に３％パラホルムアルデヒドで１５分間室温にて固定した。固定後、ＰＢＳで２回洗浄した後に、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳで５分間透過処理した。次に３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで１０分間プレハイブリダイゼーション処理した。その後、３０％ホルムアミド、２μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、６６μｇ／ｍＬ ｙｅａｓｔ ｔＲＮＡ、２ｍＭバナジル複合体（ｖａｎａｄｙｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）、１ｎｇ／μＬ Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ＣＡＧ ｐｒｏｂｅ含有の２×ＳＳＣバッファーで３７℃、１時間ハイブリダイゼーション処理した。３０％ホルムアミド含有の２×ＳＳＣバッファーで４２℃、３０分間ポストハイブリダイゼーション処理した後に、１×ＳＳＣバッファーで１回洗浄し、その後にＰＢＳで２回洗浄した。Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（商品名、Vector Laboratories社）を用いて固定した後、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ ＰＺ－９０００）で核内のＲＮＡ凝集体の数を計測した。
＜結果＞
　結果を図１に示した。図１から明らかなように、エリスロマイシンを添加していない培地で培養したＭｙＤモデル細胞では、ＲＮＡ凝集体陽性細胞率が６０％を超えていたが、エリスロマイシンを培地に添加することにより、ＲＮＡ凝集体陽性細胞率は、用量依存的に有意に低下した。
〔実施例２：ＭｙＤモデル細胞におけるスプライシング異常に対するエリスロマイシンの効果〕
　ＭｙＤモデル細胞にエリスロマイシンを作用させ、Ａｔｐ２ａ１遺伝子のｅｘｏｎ ２２におけるスプライシング異常が改善するか否かを検証した。
＜実験材料および方法＞
（１）ＭｙＤモデル細胞
　実施例１と同じＭｙＤモデル細胞（Ｃ２Ｃ１２－ＤＭＰＫ８００Ｒ）を使用した。
（２）エリスロマイシン
　実施例１と同じエリスロマイシンを使用した。
（３）スプライシング産物の定量
　ＭｙＤモデル細胞の培地に、エリスロマイシンを０、２５、５０μＭとなるように添加し、７２時間後にＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｐｌｕｓ Ｋｉｔ（商品名、Ｑｉａｇｅｎ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。コントロールとして、エリスロマイシンを含有しない培地で培養した正常Ｃ２Ｃ１２細胞を用い、同様にｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。続いて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｍｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをＲＮａｓｅＨ処理した後、以下のＡｔｐ２ａ１ ｅｘｏｎ ２２ ＲＴプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄを用いて染色した後、イメージアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０、ＧＥ）で正常型のＰＣＲ産物と異常型のＰＣＲ産物をそれぞれ定量した。
Ａｔｐ２ａ１ ｅｘｏｎ ２２ ＲＴプライマー
Fw: GCTCATGGTCCTCAAGATCTCAC（配列番号１）
Rv: GGGTCAGTGCCTCAGCTTTG（配列番号２）
＜結果＞
　結果を図２（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＲＴ－ＰＣＲ産物の電気泳動の結果であり、（Ｂ）はＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を示すグラフである。図２（Ａ）から、正常Ｃ２Ｃ１２細胞では正常型が多数を占め、エリスロマイシンを含有しない培地で培養したＭｙＤモデル細胞では異常型の比率が正常型より多かった。エリスロマイシンを培地に添加することにより、ＭｙＤモデル細胞における正常型の比率が有意に増加し、正常Ｃ２Ｃ１２細胞と同程度まで、スプライシング異常が改善することが示された。
〔実施例３：ＭｙＤモデルマウスにおけるエリスロマイシン腹腔内投与の効果〕
　ＭｙＤモデルマウスにエリスロマイシンを腹腔内投与し、大腿四頭筋における筋強直症状に対する効果、および骨格筋クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果を検証した。
＜実験材料および方法＞
（１）使用動物
　ＭｙＤモデルマウスとしてＨＳＡＬＲマウス（Ｄｒ． Ｃｈａｒｌｅｓ Ｔｈｏｒｎｔｏｎ（University of Rochester）より譲渡され、大阪大学の実験動物施設で繁殖させたもの）を使用した。ＨＳＡＬＲマウスはｈＡＣＴＡ遺伝子（筋細胞で恒常的に発現するヒト遺伝子）３’側ＣＴＧ反復配列を２２０回に増幅したものをゲノム中に組み込んだトランスジェニック動物で、筋細胞でＣＵＧ配列が増幅したｍＲＮＡが発現することによって、ＭｙＤの症状が現れる（Science, 2000, 289(5485), 1769-73）。コントロールとして、野生型マウス（ＦＶＢ／ＮＪｃｌマウス、日本クレアより購入）を使用した。実験には、８週齢の雌雄マウスを用いた。
（２）エリスロマイシン
　エリスロマイシンとして「エリスロシン（登録商標）静注用５００ｍｇ（注射用エリスロマイシンラクトビオン酸塩）」（アボット）を使用した。生理食塩水で５０ｍｇ／ｍｌになるように溶解して使用した。
（３）群分け、投与スケジュール
　エリスロマイシン投与ＭｙＤ群、生理食塩水投与ＭｙＤ群、コントロール（野生型マウス）群の３群を設けた（各群ｎ＝３（♂１、♀２））。エリスロマイシンの投与量は１５０ｍｇ／ｋｇとし、一日一回８日間連続投与した。生理食塩水投与ＭｙＤ群には、生理食塩水を、一日一回８日間連続投与した。コントロール（野生型マウス）群には、何も投与しなかった。
（４）筋強直（ミオトニア）の測定
　最終投与の２４時間後に、麻酔下にてマウス大腿四頭筋の電気的筋強直現象を針筋電図で解析した。具体的には、マウス大腿四頭筋へ１０回以上針電極を刺入した時の電気的筋強直現象の発生頻度を次の４段階に分けて評価した。
　重症度０：電気的筋強直現象が全くみられない。
　重症度１：全体の５０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
　重症度２：全体の５０％以上、９０％未満に電気的筋強直現象がみられる。
　重症度３：電気的筋強直現象が９０％以上みられる。
（５）スプライシング産物の定量
　最終投与の２４時間後に、マウスから大腿四頭筋を採取した。ＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、ＭＲＣ）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ III Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｍｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを調製した。ｃＤＮＡをＲＮａｓｅＨ処理した後、以下のＣｌｃｎ１ ｅｘｏｎ ７ａ ＲＴプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動し、ＧｅｌＲｅｄを用いて染色した後、イメージアナライザー（Ｔｙｐｈｏｏｎ ９４１０、ＧＥ）で正常型のＰＣＲ産物と異常型のＰＣＲ産物をそれぞれ定量し、ＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を算出した。統計解析にはｔ－ｔｅｓｔを用いた。
Ｃｌｃｎ１ ｅｘｏｎ ７ａ ＲＴプライマー
Fw: TGAAGGAATACCTCACACTCAAGG（配列番号３）
Rv: CACGGAACACAAAGGCACTG（配列番号４）
＜結果＞
　スプライシング異常の評価結果を図３に示した。コントロール群（図中ＷＴ）では、９０％超のＲＴ－ＰＣＲ産物が正常型であったが、生理食塩水投与ＭｙＤ群（図中－）では、正常型の割合が約６０％に減少し、異常型ＲＴ－ＰＣＲ産物の割合が増加していることが示された。エリスロマイシン投与ＭｙＤ群では、正常型ＲＴ－ＰＣＲ産物の割合が有意に増加したことから、エリスロマイシン投与によりＣｌｃｎ１遺伝子のスプライシング異常が改善されることが明らかになった。
　筋強直の解析結果を図４に示した。コントロール群（図中ＷＴ）は３匹とも筋強直が検出されなかった。生理食塩水投与ＭｙＤ群（図中－）は３匹とも重症度３の筋強直が検出された。エリスロマイシン投与ＭｙＤ群は、１匹が重症度１、残りの２匹は筋強直が検出されなかった。これらの結果から、エリスロマイシン投与により、ＣＴＧ反復配列の異常伸長に基づくスプライシング異常が改善され、その結果ＭｙＤにおける筋強直症状が改善されることが示された。
〔実施例４：ＭｙＤモデルマウスにおける高用量エリスロマイシン経口投与の効果〕
　ＭｙＤモデルマウスに高用量のエリスロマイシンを経口投与し、大腿四頭筋における骨格筋クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果を検証した。
＜実験材料および方法＞
（１）使用動物
　実施例３と同じＭｙＤモデルマウス（ＨＳＡＬＲマウス）および野生型マウスを使用した。
（２）エリスロマイシン
　エリスロマイシンとして「エリスロシン（登録商標）ドライシロップＷ２０％（エリスロマイシンエチルコハク酸エステルドライシロップ）」（アボット）を使用した。純水で１００ｍｇ／ｍｌになるように溶解して使用した。
（３）群分け、投与スケジュール
　エリスロマイシン３００ｍｇ／ｋｇ投与ＭｙＤ群、エリスロマイシン６００ｍｇ／ｋｇ投与ＭｙＤ群、エリスロマイシン９００ｍｇ／ｋｇ投与ＭｙＤ群、生理食塩水投与ＭｙＤ群、コントロール（野生型マウス）群の５群を設けた（各群ｎ＝３）。投与は強制経口投与とし、一日一回５日間連続で行った。
（４）スプライシング産物の定量
　最終投与日にマウスから大腿四頭筋を採取し、実施例３と同じ方法でＲＴ－ＰＣＲを行い、正常型および異常型のスプライシング産物を定量し、ＲＴ－ＰＣＲ産物における正常型の割合を算出した。統計解析にはｔ－ｔｅｓｔを用いた。
＜結果＞
　結果を図５に示した。図５から明らかなように、高用量エリスロマイシンの経口投与により、Ｃｌｃｎ１遺伝子のスプライシング異常が、用量依存的に有意に改善されることが明らかになった。
〔実施例５：ＭｙＤモデルマウスにおける通常用量エリスロマイシン経口投与の効果〕
　ＭｙＤモデルマウスに通常用量のエリスロマイシンを経口投与し、大腿四頭筋における筋強直症状に対する効果、および骨格筋クロライドチャネル（Ｃｌｃｎ１）遺伝子のスプライシング異常に対する効果を検証した。
＜実験材料および方法＞
（１）使用動物
　実施例３と同じＭｙＤモデルマウス（ＨＳＡＬＲマウス）および野生型マウスを使用した。
（２）エリスロマイシン
　実施例４と同じく、エリスロマイシンとして「エリスロシン（登録商標）ドライシロップＷ２０％（エリスロマイシンエチルコハク酸エステルドライシロップ）」（アボット）を、純水で１００ｍｇ／ｍｌになるように溶解して使用した。
（３）群分け、投与スケジュール
　エリスロマイシン５０ｍｇ／ｋｇ投与ＭｙＤ群、生理食塩水投与ＭｙＤ群、コントロール（野生型マウス）群の３群を設けた（各群ｎ＝３）。投与は強制経口投与とし、一日一回２１日間連続で行った。
（４）筋強直（ミオトニア）の測定
　最終投与日に、麻酔下にてマウス大腿四頭筋の電気的筋強直現象を針筋電図で解析した。
（５）スプライシング産物の定量
　最終投与日にマウスから大腿四頭筋を採取し、実施例３と同じ方法でＲＴ－ＰＣＲを行い、正常型および異常型のスプライシング産物を定量した。統計解析にはｔ－ｔｅｓｔを用いた。
＜結果＞
　スプライシング異常の評価結果を図６に示した。図６から明らかなように、エリスロマイシン５０ｍｇ／ｋｇ投与ＭｙＤ群は生理食塩水投与ＭｙＤ群と比較して、正常型ＲＴ－ＰＣＲ産物の割合が有意に増加した。すなわち、通常用量（５０ｍｇ／ｋｇ）のエリスロマイシンを２１日間経口投与することにより、Ｃｌｃｎ１遺伝子のスプライシング異常が改善されることが明らかになった。
　筋強直の解析結果を図７に示した。生理食塩水投与ＭｙＤ群では３匹とも重症度３の筋強直が検出されたが、エリスロマイシン５０ｍｇ／ｋｇ投与ＭｙＤ群では２匹が重症度２に、１匹が重症度１に改善していた。これらの結果から、通常用量（５０ｍｇ／ｋｇ）のエリスロマイシンの２１日間経口投与により、ＣＴＧ反復配列の異常伸長に基づくスプライシング異常が改善され、その結果ＭｙＤにおける筋強直症状が改善されることが示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (7)

  1. 　エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その薬学的に許容される塩、水和物、またはそれらのプロドラッグを有効成分とする筋強直性ジストロフィー治療薬。
  2. 　筋強直を改善する請求項１に記載の筋強直性ジストロフィー治療薬。
  3. 　ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常を抑制する請求項１または２に記載の筋強直性ジストロフィー治療薬。
  4. 　哺乳動物に対して、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグの有効量を投与することを特徴とする筋強直性ジストロフィーの治療方法。
  5. 　筋強直性ジストロフィーの治療に用いるための、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグ。
  6. 　ミオトニンプロテインキナーゼ（ＤＭＰＫ）遺伝子異常伸長に起因するスプライシング異常の抑制剤であって、エリスロマイシン、クラリスロマイシンおよびアジスロマイシンからなる群より選ばれる少なくとも１種の化合物、その医薬上許容される塩、溶媒和物、またはそれらのプロドラッグを有効成分とするスプライシング異常抑制剤。
  7. 　ＡＴＰ２Ａ１、ＣＬＣＮ１、ＩＮＳＲ、ＤＭＤ、ＭＢＮＬ１およびＢＩＮ１からなる群より選ばれる少なくとも１つの遺伝子のスプライシング異常を抑制する請求項６に記載のスプライシング異常抑制剤。
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