TW201620911A - 銜接子關聯激酶１之抑制劑、包含其之組成物、及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本文揭示了一種銜接子關聯激酶1(AAK1)抑制劑，亦即3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯： □ 及其醫藥學上可接受的鹽類與固體形式。亦揭示了包含該化合物之組成物，以及將該化合物及包含該化合物之組成物用於治療、管理及/或預防由AAK1活性介導的疾病及病症的方法。

Description

銜接子關聯激酶1之抑制劑、包含其之組成物、及其使用方法

本發明係關於用作銜接子關聯激酶1(AAK1)之抑制劑的吡唑并[1,5-a]嘧啶基化合物，包含其之組成物，及其使用方法。

銜接子相關激酶1(AAK1)是絲胺酸/蘇胺酸激酶的Ark1/Prk1家族的一個成員。AAK1 mRNA以短末端與長末端的兩種剪接形式存在。該長末端形式佔主導並且在腦及心臟中高度表現(Henderson與Conner，《細胞分子生物學》(Mol.Biol.Cell.)，2007年，第18卷，第2698-2706頁)。AAK1在突觸體製備中富集並且與內噬結構共定位在所培養的細胞中。AAK1調節網格蛋白被膜的胞吞作用，此調節是在突觸小泡再循環及受體介導的胞吞作用中的重要過程。AAK1與AP2複合物相關聯，AP2複合物為異源四聚物，其將受體運送物結合到該網格蛋白被膜。網格蛋白結合到AAK1會促進AAK1 激酶之活性(Conner等人，《運輸》(Traffic)，2003年，第4卷，第885-890頁；Jackson等人，《細胞生物學雜誌》(J.Cell.Biol.)，2003年，第163卷，第231-236頁)。AAK1磷酸化AP-2的mu-2次單元，此磷酸化促進mu-2結合到運貨受體上的含酪胺酸的分揀模體(Ricotta等人，《細胞生物學雜誌》(J.Cell.Biol.)，2002年，第156卷，第791-795頁；Conner和Schmid，《細胞生物學雜誌》(J.Cell.Biol.)，2002年，第156卷，第921-929頁)。Mu2磷酸化作用不需要受體吸收，但是磷酸化作用會增強內化作用的效率(Motely等人，《細胞分子生物學》(Mol.Biol.Cell.)，2006年，第17卷，第5298-5308頁)。

AAK1已經被確認為PC12細胞中神經調節蛋白1(NRG1)/ErbB4傳訊的抑制劑。經由利用激酶抑制劑K252a(其抑制AAK1激酶之活性)的RNA干擾介導的基因靜默或治療產生的AAK1表現缺失會導致神經調節蛋白1(NRG1)誘導的軸突生長的增強。該等治療會導致ErbB4的表現增強以及ErbB4積聚在質膜中或質膜附近(Kuai等人，《化學與生物學》(Chemistry and Biology)，2011年，第18卷，第891-906頁)。NRG1與ErbB4是推定的精神分裂症易感基因(Buonanno，《腦研究通報》(Brain Res.Bull.)，2010年，第83卷，第122-131頁)。該兩種基因中的SNP已與多種精神分裂症內在表型相關聯(Greenwood等人，《美國精神病學雜誌》(Am.J.Psychiatry)，2011年，第168卷，第930-946頁)。神經調節蛋白1與ErbB4 KO小鼠模型已經顯示出精神 分裂症相關的形態變化與行為表型(Jaaro-Peled等人，《精神分裂症通報》(Schizophrenia Bulletin)，2010年，第36卷，第301-313頁；Wen等人，《美國國家科學院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，2010年，第107卷，第1211-1216頁)。此外，AAK1基因的內含子中單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)已經與帕金森氏症的發病年齡相關聯(Latourelle等人，《BMC醫學遺傳學》(BMC Med.Genet.)，2009年，第10卷，第98頁)。該等結果表明對AAK1活性的抑制可應用於精神分裂症、精神分裂症中之認知缺陷、帕金森氏症、雙極性障礙與阿茲海默症的治療。

本發明包括3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯： 及其醫藥學上可接受的鹽類與固態形式(例如，結晶形態)。本發明亦包括包含該化合物之醫藥組成物及劑型。

本發明的一個實施例包括在活體外及活體內兩種情況下抑制銜接子關聯激酶1(AAK1)的方法，該方法包括使AAK1與本發明的化合物接觸。

另一實施例包括治療及管理由AAK1活性介導的疾病及病症的方法。據信此類疾病及病症的實例包括阿茲海默 症、雙極性障礙、疼痛、帕金森氏症，以及精神分裂症(包括精神分裂症中的認知缺陷)。

本發明的一些態樣圖示在諸圖中。

第1圖圖示從使用AAK1純合的(-/-)基因敲除小鼠與其野生型(+/+)同胞仔的福馬林疼痛模型獲得的結果。該AAK1純合的(-/-)基因敲除小鼠與其野生型(+/+)同胞仔相比展現出急性疼痛反應與僵直性疼痛反應兩方面的顯著減少。

第2圖提供結晶態3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的X射線繞射譜。該繞射圖譜是使用PANalytical X’Pert PRO(Cu Kα輻射)、利用PIXcel Medipix2偵測器(40mA，45kV；0.0260°2θ步長)獲得的。

第3圖圖示針對相較於媒劑以1mpk、3mpk、10mpk與30mpk的劑量將3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯施用於雄性C57小鼠獲得的福馬林1期資料。

第4圖圖示針對相較於媒劑以1mpk、3mpk、10mpk與30mpk的劑量將該化合物施用於雄性C57小鼠獲得的福馬林2期資料。

第5圖提供在第4圖中圖示的資料的柱狀圖表示。

第6圖圖示在小鼠Chung測定中該化合物的劑量依賴效應。

本發明部分地基於以下發現：AAK1基因敲除小鼠表現出對疼痛的高度耐受。彼發現促進的研究最終導致對AAK1抑制劑、包含其之組成物，及其使用方法的發現。

定義

除非另有陳述，否則術語「本發明的化合物」、「本揭示案的化合物」及類似用語代表本文揭示的化合物。

除非另有陳述，否則術語「包括」具有與「包括，但不限於」相同的含義。類似地，術語「諸如」具有與「諸如，但不限於」相同的含義。

除非另有陳述，否則術語「管理」包括預防已經患過指定疾病或病症的患者復發該疾病或病症，及/或延長已經患過該疾病或病症的患者維持在症狀緩解狀態的時間。該術語包括調節該疾病或病症的閾值、發展及/或持續，或者改變患者對該疾病或病症的響應方式。

除非另有陳述，否則化合物的「治療有效量」是足以在疾病或病症的治療或管理中提供治療益處或者最小化與該疾病或病症有關的一或多個症狀的量。化合物的「治療有效量」意謂單獨地或者與其他療法結合的治療劑量，該治療劑量在疾病或病症的治療或管理中提供治療益處。術語「治療有效量」可包括改良整體療法、減少或者避免疾病或病症的症狀或病因，或者增強另一治療劑的療效的量。

除非另有陳述，否則術語「治療」設想當患者正承受指定疾病或病症的痛苦時發生的動作，該動作減輕該疾病 或病症的嚴重程度，或者延緩或減緩該疾病或病症的進展。

化合物

本發明包括3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯： 及其醫藥學上可接受的鹽類。

本發明進一步包括3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的結晶形態。在一個實施例中，一種結晶形態具有如用微差掃描熱量法所測定的約182.5℃的熔點。在此上下文中，術語「約」意謂±2.0攝氏度。

在一個實施例中，該化合物的結晶形態提供一X射線粉末繞射(XRPD)圖樣，該圖樣包含當使用Cu Kα輻射獲取時在約12.7、14.8、18.7、19.0、19.7及/或25.1度2θ的一或多個處出現的尖峰。在該上下文中，術語「約」意謂±0.2度2θ。如熟習此項技術者所熟知的，XRPD圖樣中尖峰的相對強度可取決於樣本是如何製備的以及資料是如何收集的。基於此考慮，在第2圖中提供此形式的XRPD圖樣的實例。

本發明的化合物可以可分離的、不同的穩定構型存在。由於繞不對稱單鍵之限制性旋轉(例如，由於位阻或環 應力)而導致的扭轉不對稱性可允許不同構形異構物之分離。本揭示案包括該等化合物及其混合物的每一構形異構物。

本發明包括本文揭示的化合物的同位素或同位素的同質異能素，其中化合物中的一或多個原子的同位素不同於天然存在或通常存在的那些同位素。作為一般實例及不限制地，氫的同位素包括氘及氚。碳的同位素包括¹³C及¹⁴C。本發明之同位素標記的化合物通常可以用熟習此項技術者已知的習知技術製備(例如，藉由使用合適的同位素標記反應物替代原本使用的未標記反應物)。此類化合物可具有各種潛在用途，例如作為測定生物活性時的標準物及反應物。在穩定同位素的情形中，此類化合物可具有有利地改進生物學、藥理學或藥物動力學性質的潛能。

本發明的化合物可作為醫藥學上可接受的鹽類存在。如本文所使用的術語「醫藥學上可接受的鹽類」代表本揭示案的該等化合物的鹽類或兩性離子形式，該等形式是可水溶性或油溶性的或者可分散的，該等形式在深思熟慮之醫療決定的範疇內，適合用於與患者的組織接觸，而不具有過度毒性、刺激性、過敏反應或者其他問題或併發症，與合理的益處/風險比率相應並且可有效用於其所欲目的。該等鹽類可以在該等化合物之最終分離及純化期間製備，或者分別藉由使合適的氮原子與合適的酸反應而製備。典型的酸加成鹽類包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、 樟腦磺酸鹽；二葡糖酸鹽、二氫溴酸鹽、二氫氯酸鹽、二氫碘酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘化物、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、三甲苯磺酸鹽、甲磺酸鹽、萘磺酸鹽、菸酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、磷酸鹽、麩胺酸鹽、重碳酸鹽、對甲苯磺酸鹽，以及十一烷酸鹽。可用於形成醫藥學上可接受的加成鹽類的酸的實例包括無機酸(諸如，鹽酸、氫溴酸、硫酸以及磷酸)及有機酸(諸如，草酸、順丁烯二酸、琥珀酸以及檸檬酸)。

鹼加成鹽類可以在化合物的最終分離及純化期間，藉由使羧基與合適的鹼(諸如，金屬陽離子的氫氧化物、碳酸鹽或重碳酸鹽)反應或者與氨或有機的第一胺、第二胺或第三胺反應來製備。醫藥學上可接受的鹽類之陽離子包括鋰、鈉、鉀、鈣、鎂及鋁，以及無毒性的季銨類陽離子，諸如銨、四甲銨、四乙銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基嗎福林、二環己胺、普魯卡因、二苄胺、N,N-二苄基苯乙胺，以及N,N’-二苄基乙二胺。其他可用於形成鹼加成鹽類之典型的有機胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶，以及哌嗪。

使用方法

本發明的一個實施例包括在活體外及活體內兩種情況下抑制銜接子關聯激酶1(AAK1)的方法，該方法包括使AAK1與本發明的化合物接觸。

另一實施例包括治療及管理由AAK1活性介導的疾病及病症的方法。由AAK1活性介導的疾病及病症是具有至少一個症狀且該症狀的嚴重程度或呈現受AAK1活性影響的疾病及病症。據信此類疾病及病症的實例包括阿茲海默症、雙極性障礙、疼痛、帕金森氏症，以及精神分裂症(包括精神分裂症中的認知缺陷)。特定方法包括向需要治療的患者(人類或者其他哺乳動物)投與治療或者預防有效量的本發明的化合物。

本發明的另一實施例包括一種治療或管理疾病或病症的方法，該方法包含向需要治療的患者投與治療或者預防有效量的本發明的化合物，其中該疾病或病症為阿茲海默症、雙極性障礙、疼痛、帕金森氏症，或者精神分裂症(包括精神分裂症中的認知缺陷)。疼痛的特定類型包括慢性疼痛、急性疼痛，以及神經性疼痛。神經性疼痛的特定類型包括纖維肌痛以及周邊神經病(例如，糖尿病性神經病變)。

當用於治療或管理疾病或病症時，本發明的化合物較佳地作為醫藥組合物的部分來投與，該醫藥組合物包括一或多種醫藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

醫藥組合物或調配物可以單位劑量形式提供，該醫藥組合物或調配物包含每單位劑量中預定量之活性成分。用 於預防及治療疾病的單一療法中本揭示案的化合物的典型劑量水平在約0.01與約250毫克/公斤(「mg/kg」)體重之間，較佳地在約0.05與約100mg/kg體重之間。通常，本揭示案的醫藥組成物將按每日約1到約5次給藥或者替代地作為連續輸注投與。此類給藥可以用作慢性或急性治療。可與載體材料組合以產生單一劑型之活性成分的量將取決於所治療的病症、該病症的嚴重程度、投藥時間、投藥途徑、所使用的化合物的排泄速率、治療持續期間，以及患者的年齡、性別、體重與病情而變化。較佳的單位劑量調配物是包含活性成分的如本文上述的日劑量或次劑量或者活性成分的合適分數的彼等調配物。可以實質上小於化合物的最佳劑量的小劑量開始治療。此後，劑量以小增量升高，直到在該等情形下達到最佳療效。一般而言，最期望以將一般地提供有效結果但不會引發任何不利或者有害的副作用的濃度水平來投與該化合物。

本發明的化合物可以與一或多種額外的治療或預防藥劑組合投與。例如，當用於疼痛治療時，可能的額外藥劑包括免疫抑制劑與消炎劑。

適用於本發明的方法與組合物的免疫抑制劑包括本領域中已知的彼等免疫抑制劑。實例包括胺喋呤、咪唑硫嘌呤、環孢菌素A、D-青黴胺、氯金酸鈉(gold salt)、羥氯奎、來氟米特、胺甲喋呤、米諾四環素、雷帕黴素、柳氮磺吡啶、他克莫司(FK506)，及其醫藥學上可接受的鹽類。特定免疫抑制劑是胺甲喋呤。

額外的實例包括抗TNF抗體，諸如阿達木單抗、賽妥珠單抗、依那西普，以及英利昔單抗。其他實例包括白介素-1受體阻滯劑，諸如阿那白滯素。其他實例包括抗B細胞(CD20)抗體，諸如利妥昔單抗。其他實例包括T細胞激活阻斷劑，諸如阿巴西普。

額外的實例包括肌苷酸脫氫酶抑制劑，諸如嗎替麥考酚酯(CellCept®)與黴酚酸(Myfortic®)。

適用於本發明的方法與組合物的抗炎藥物包括本領域中已知的彼等抗炎藥物。實例包括糖皮質素與非類固醇抗炎藥(NSAID)。

糖皮質激素的實例包括醛甾酮、倍氯米松、倍他米松、可體松、脫氧皮質甾酮、地塞米松、氟氫可體松、氫化可體松、甲基普賴蘇穠(methylprednisolone)、普賴蘇穠、普賴蘇、曲安縮松(triamcinolone)，及其醫藥學上可接受的鹽類。

NSAID的實例包括水楊酸鹽(例如，阿斯匹林，阿莫西林、貝諾酯、三水楊酸膽鹼鎂、二氟苯水楊酸、菲斯胺、水楊酸甲酯、水楊酸鎂、雙水楊酸酯，及其醫藥學上可接受的鹽類)、芳基鏈烷酸(例如，雙氯芬酸、醋氯芬酸、阿西美辛、溴酚酸、依託度酸、吲哚美辛、萘丁美酮、舒林酸、甲苯醯吡酸，及其醫藥學上可接受的鹽類)、芳基丙酸(例如，伊布洛芬、卡洛芬、芬布芬、非諾洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、洛索洛芬、萘普生、奧沙普嗪、噻洛芬酸、舒洛芬，及其醫藥學上可接受的鹽類)、芳基鄰胺苯甲酸(例如，甲 氯滅酸、甲滅酸，及其醫藥學上可接受的鹽類)、吡唑啶衍生物(例如，阿紮丙酮、安乃近、羥保泰松、苯基保泰松、磺吡酮，及其醫藥學上可接受的鹽類)、昔康(例如，氯諾昔康、美洛昔康、吡羅昔康、替諾昔康，及其醫藥學上可接受的鹽類)、COX-2抑制劑(例如，賽利克西、艾托考昔、盧米羅可、帕瑞考昔、羅非考昔、伐地考昔，及其醫藥學上可接受的鹽類)，以及磺醯替苯胺(例如，尼美舒利，及其醫藥學上可接受的鹽類)。

在疼痛(包括但不限於神經性疼痛與炎性疼痛)治療中使用的其他藥劑包括諸如以下藥劑：普瑞巴林、利多卡因、度洛西汀、加巴噴丁、醯胺咪嗪、辣椒素，以及其他5-羥色胺/降腎上腺素/多巴胺再吸收抑制劑，以及鴉片劑(諸如，奧施康定、嗎啡，以及可待因)。

在由已知疾病或病症(諸如糖尿病、傳染病(例如，帶狀皰疹或者HIV傳染病)，或者癌症)所引起的疼痛的治療中，本發明的化合物可以與針對原發疾病或病症的一或多種額外的治療或預防藥劑組合投與。例如，當用於治療糖尿病性神經病變時，本發明的化合物可以與一或多種抗糖尿病藥劑、抗高血糖藥劑、降血脂/降類脂藥劑、抗肥胖症藥劑、抗高血壓藥劑及食慾抑制劑組合給藥。抗糖尿病藥劑的實例包括雙胍(例如，二甲雙胍、苯乙雙胍)、葡萄糖苷酶抑制劑(例如，阿卡波糖、米格列醇)、胰島素(包括胰島素分泌促進劑及胰島素增敏劑)、美格替耐類(例如，瑞格列奈)、磺醯脲(例如，格列美脲、優降糖、格列齊特、氯磺丙脲， 以及格列甲嗪)、雙胍/優降糖組合(例如，複方鹽酸二甲酸胍(Glucovance))、噻唑啶二酮類(例如，曲格列酮、梵帝雅，以及吡格列酮)、PPAR-α促效劑、PPAR-γ促效劑、PPARα/γ雙重促效劑、肝醣磷酸化酶抑制劑、脂肪酸結合蛋白(aP2)的抑制劑、胰高血糖素樣多肽-1(glucagon-like peptide-1；GLP-1)或者GLP-1受體的其他促效劑、二肽基肽酶IV(DPP4)抑制劑，以及鈉-葡萄糖2型共轉運蛋白(SGLT2)抑制劑(例如，達格列淨、卡格列淨，以及LX-4211)。

醫藥組成物

醫藥製劑可經調適以藉由任何合適的路徑投藥，例如藉由口服(包括經頰或者舌下)路徑、直腸路徑、經鼻路徑、局部(包括經頰、舌下，或者經皮)路徑、陰道路徑，或者非經腸的(包括皮下的、皮內的、肌內的、關節內的、滑膜內的、胸骨內的、鞘內的、病灶內的、靜脈內的，或者皮內注射或者輸注)路徑。此類製劑可以藉由任何醫藥領域公知的方法製備，例如藉由使活性成分與載體或賦形劑相關聯。口服投藥或者藉由注射投藥是較佳的。

經調適用於口服投藥的醫藥製劑可呈現為離散單元，諸如膠囊劑或錠劑；粉劑或者顆粒劑；水性或者非水性液體中的液劑或混懸劑；可食用泡沫劑或發泡劑(whips)；或者水包油乳化液或油包水乳化液。

例如，對於錠劑或膠囊劑形式的口服投藥，有效的藥物成分可以與口服的、無毒的、醫藥學上可接受的惰性載體(諸如，乙醇、甘油、水等等)組合。粉劑是藉由將化合 物粉碎至合適的細粒度以及將經粉粹的化合物與經類似粉粹的醫藥載體(諸如，可食用糖類(例如，澱粉或者甘露醇))混合而製備的。亦可存在調味劑、防腐劑、分散劑，以及著色劑。

膠囊劑是藉由如上所述地製備粉末混合物並且將該粉末混合物裝填到成型的明膠鞘殼中而製備的。在裝填操作之前，可將諸如矽膠、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或者固態聚乙二醇之類的助流劑與潤滑劑添加至該粉末混合物中。亦可添加諸如瓊脂、碳酸鈣或者碳酸鈉之類的崩解劑或增溶劑以改良當吞下膠囊劑膠囊劑時藥物的有效性。

此外，當期望或者必需時，亦可將合適的黏合劑、潤滑劑、崩解劑併入該混合物中。合適的黏合劑包括澱粉、明膠、天然糖類(諸如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味劑、天然的與合成的樹膠(諸如，阿拉伯膠、黃膠或者海藻酸鈉)、羧甲基纖維素、聚乙二醇等等。在該等劑型中使用的潤滑劑包括油酸鈉、氯化鈉等等。崩解劑包括但不限於澱粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等等。錠劑是例如藉由製備粉末混合物、造粒或者預壓片、添加潤滑劑與崩解劑，以及擠壓而成錠劑而製備的。粉末混合物是藉由混合經適當粉碎的化合物與如上所述的稀釋劑或鹼，以及視需要與黏合劑(諸如，羧甲基纖維素、海藻酸鹽、凝膠化，或者聚乙烯吡咯啶酮)、緩溶劑(諸如石蠟)、再吸收促進劑(諸如，季鹽)及/或吸收劑(諸如，膨潤土、高嶺土，或者磷酸二鈣)而製備的。該粉末混合物可以藉由用黏合劑(諸如，糖漿、澱粉 糊、阿拉伯膠漿，或者纖維素材料或聚合物材料的溶液)潤濕，以及穿過篩子沖壓而造粒。作為造粒的替代，該粉末混合物可以移動穿過壓片機，以及所得產物被不完美地成型成預壓片，隨後破碎成顆粒劑。該等顆粒劑可以藉由添加硬脂酸、硬脂酸鹽硬脂酸鹽、滑石或者礦物油而經潤滑，以防止黏著至錠成型模具。該經潤滑的混合物隨後被壓縮成錠劑。本揭示案的化合物亦可與易流動的惰性載體組合，以及被直接壓縮成錠劑而不經歷造粒或預壓片步驟。可以提供透明的或者不透明的防護性包衣，該防護性包衣由蟲膠封閉包衣、糖類或聚合物材料包衣，以及蠟拋光包衣組成。可將著色劑添加至該等包衣中以區分不同的單位劑量。

可以單位劑量形式製備口服液(諸如，液劑、糖漿以及酏劑)，以便使給定量包含預定量的化合物。可以藉由將該化合物溶解於適當調味的水溶液中來製備糖漿，而酏劑是經由使用無毒的媒劑製備的。亦可添加增溶劑與乳化劑(諸如，乙氧化異硬脂酸基醇與山梨醇聚氧乙烯醚)、防腐劑、調味助劑(諸如，薄荷油或者天然甜味料，或者糖精或其他的人工甜味劑)等等。

當合適時，可以微囊密封用於口服給藥的劑量單位制劑。該製劑亦可製備成例如藉由將顆粒材料包衣或者包埋在聚合物、蠟等等中而延長或者減緩釋放。

本發明的化合物可以脂質體遞送系統的形式投與，該脂質體遞送系統形式為諸如小單層囊泡、大單層囊泡，以 及多層囊泡。脂質體可以用各種磷脂(諸如，膽固醇、十八胺或者磷脂醯膽鹼)形成。

本發明的化合物亦可藉由使用單株抗體作為個別載體來遞送，化合物分子耦合至該等個別載體。該等化合物亦可與作為靶向藥物載體的可溶性聚合物耦合。此類聚合物可包括聚乙烯吡咯啶酮、哌喃共聚物、聚羥丙基甲基丙烯醯胺苯酚、聚羥基乙基天冬醯胺酚，或者用棕櫚醯殘基取代的聚氧化乙烯聚賴胺酸。此外，該等化合物可以耦合至一類可用於實現藥物控釋的可生物降解聚合物，該等聚合物為例如聚乳酸、聚ε-己內酯、聚羥丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫哌喃、聚氰基丙烯酸酯，以及水凝膠的交聯的或兩親性嵌段共聚物。

經調適用於經皮投藥的醫藥製劑可作為個別的貼劑存在，該等貼劑意欲與受者的表皮層密切接觸一持續很久的時段。例如，活性成分可以藉由離子電滲從貼劑釋放出來，如在《藥學研究》(Pharmaceutical Research)，1986年，第3(6)卷，第318頁中所一般描述的。

經調適用於局部投藥的醫藥製劑可配製為軟膏、乳膏、混懸劑、洗劑、粉劑、液劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣霧劑，或者油劑。

經調適用於直腸投藥的醫藥製劑可作為栓劑或者作為灌腸劑存在。

經調適用於其中載體是固體的經鼻投藥的醫藥製劑包括一粗粉，該粗粉具有例如在20至500微米範圍中的粒 徑，該醫藥製劑以吸鼻粉所用的方式投與，亦即藉由從緊挨鼻部放置的粉劑容器經由鼻部通道快速吸入。其中製劑載體是液體，用於作為鼻噴入法或者滴鼻劑投藥的合適製劑包括活性成分的水溶液或油溶液。

經調適用於藉由吸入法投藥的醫藥製劑包括細粒粉塵或霧，該等粉塵或霧可用各種類型定量的、劑量加壓的噴霧器、霧化器或者吹藥器產生。

經調適用於陰道投藥的醫藥製劑可以提供作為陰道栓劑、棉塞、乳膏、凝膠劑、糊劑、泡沫或噴塗製劑。

經調適用於非經腸投藥的醫藥製劑包括水性的及非水性的無菌注射溶液，該等溶液可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑，以及使得該製劑與預期受者的血液等滲的溶質；以及水性的及非水性的無菌混懸劑，該等混懸劑可包含助懸劑及稠化劑。該等製劑可以單位劑量或多劑量容器提供，例如密封的安瓿及小瓶，並且可以在凍乾(低壓凍乾)的條件下儲存，僅需在使用之前立刻添加無菌的液體載劑(例如，注射用水)。臨時調配的注射溶液及混懸劑可以用無菌的粉劑、顆粒劑及錠劑製備。

應理解的是，除了上文特別敍述的成分之外，考慮到所討論的製劑類型，該等製劑亦可包含在本領域習用的其他藥劑，例如適用於口服投藥的彼等製劑可包含調味劑。

實例

AAK1基因敲除小鼠

用於打斷AAK1基因的小鼠純合品系(-/-)是藉由兩種方法製備的：基因捕獲及同源重組。

基因捕獲是一種隨機插入突變方法，該方法使用編碼報道基因或可選擇標記基因之一個DNA片段作為突變劑。基因誘捕載體已設計為整合到內含子或基因中，以允許細胞剪接設備將載體編碼的外顯子剪接到細胞mRNA之方式。通常，基因誘捕載體含有可選擇標記序列，該標記序列在強剪接受體序列之後，但是不在啟動子之後。因此，當此類載體整合到基因中時，細胞剪接設備從所捕獲的基因中剪接外顯子到該可選擇標記序列的5'末端。通常，此類可選擇標記基因僅可在編碼該基因的載體已整合到內含子中時得以表現。隨後藉由選擇可在選擇性培養中存活的細胞來辨識最終的基因捕獲事件。

胚胎幹細胞(來自起源的鼠科品系A129的Lex-1細胞)是藉由涉及以下之一過程突變：將基因工程載體序列的至少一部分插入到目的基因中，該等突變的胚胎幹細胞被顯微注射到胚胞中，該等胚胞隨後被引入假妊娠的雌性宿主體內並使用成熟的方法攜帶至足月。參見，例如「突變小鼠」(Mouse Mutagenesis)，1998年，Zambrowicz等人編著，Lexicon出版社，伍德蘭茲(The Woodlands,TX)。所得的嵌合體動物隨後繁殖以產生能夠種系遞送等位基因的後代，該等位基因包含目的基因中的工程突變。

AAK1基因敲除小鼠亦藉由同源重組獲得。在此情況下，鼠科AAK1基因的第二編碼外顯子(參見GenBank登錄號NM_177762)是藉由本領域公知的方法去除的。參見例如，美國專利第5,487,992號、第5,627,059號，以及第5,789,215號。

用於AAK1基因打斷的小鼠純合品系(-/-)是與用於AAK1基因打斷的小鼠雜合品系(+/-)以及野生型(+/+)同胞仔一起研究的。在此分析期間，小鼠經受使用醫療診斷程序的整合套件進行的醫療檢查，該醫療診斷程序經設計用於評估哺乳動物受試者體內主要器官系統之功能。純合的(-/-)「基因敲除」小鼠是與其雜合的(+/-)以及野生型(+/+)同胞仔一起研究的。AAK1基因的打斷是藉由南方點墨分析法(Southern analysis)確認的。藉由RT-PCR偵測AAK1的鼠科同源物在鼠腦；脊髓；眼睛；胸腺；脾；肺；腎；肝；骨骼肌；骨；胃，小腸以及結腸；心臟；脂肪；哮喘肺；LPS肝；血液；帶紋化心臟；主動脈樹；前列腺；以及乳腺(5週大的處女，成熟的處女，12DPC，分娩後3天(乳酸鹽)，斷奶後3天(早復舊)，以及斷奶後7天(晚復舊))中的表現。

AAK1純合品系(-/-)及其野生型(+/+)同胞仔是使用在以下實例5.5.6中描述的福馬林爪試驗測試的，以便評估它們的急性和慢性疼痛反應。

如第1圖所示，1期及2期資料是使用純合品系(-/-)雌性小鼠(n=16)、野生型雌性小鼠(n=15)、純合品系(-/-) 雄性小鼠(n=9)以及野生型雄性小鼠(n=18)獲得的。在所有小組以及兩個時期中，相較於其野生型(+/+)同胞仔，AAK1純合的(-/-)小鼠展現出顯著更少被記錄的爪畏縮。

3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的合成

A部分.3-溴代-5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶。將N-溴代丁二醯亞胺(38.3g，215mmol)添加到5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶(30g，195mmol)在乙腈(600mL)中的混合物中。在室溫下攪拌該混合物1小時。濾出固態產物以及用1N NaOH與水洗滌。真空濃縮乙腈濾液與所有的洗滌液，以及在1N NaOH中懸浮。過濾固態產物以及用水洗滌。將此產物與先前的固體組合，以及乾燥隔夜，從而獲得44.2g的3-溴代-5-氯代-吡唑并[1,5-a]嘧啶。LRMS(ESI)m/z 232/234[(M+H)]⁺，C₆H₃BrClN₃的分析計算值：232.47。LCMS(M+1，溴圖譜)=233。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ：6.82(d,1H)，8.15(寬S,1H)，8.58(d,1H)。

B部分.3-溴代-5-(哌嗪-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶。將三乙胺(43g，0.43mol)添加到3-溴代-5-氯吡唑并(1,5-a)嘧啶(25g，0.107mol)在1,4-二噁烷(500ml)中的溶液中，接著添加哌嗪(28g，0.322mol)。在90℃攪拌該反應混合 物4小時。在反應完成之後，用乙酸乙酯稀釋該混合物以及用水洗滌。用乙酸乙酯反萃取水層。該合併有機層經由硫酸鈉乾燥，以及蒸發以獲得35g的粗製3-溴代-5-(哌嗪-1-基)吡唑并(1,5-a)嘧啶。該產物可以用甲醇再結晶，但是一般不經進一步純化地使用。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ 2.74-2.81(m,4H)，3.55-3.69(m,4H)，6.75(d,J=7.83Hz,1H)，7.94(s,1H)，8.62(d,J=7.83Hz,1H)。¹³C NMR(100MHz,DMSO-d ₆)ppm 41.25，42.16，77.73，97.78，136.77，144.01，144.18，155.53。LRMS(ESI)m/z 282.0/284.0[(M+H)]⁺，C₁₀H₁₂BrN₅的分析計算值：282.14。

C部分.3-(2-甲氧基吡啶-3-基)-5-(哌嗪-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶。將3-溴代-5-(哌嗪-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(3.00g，10.64mmol)、(2-甲氧基吡啶-3-基)硼酸(2.44g，15.96mmol)及雙(二叔丁基(4-二甲胺基苯基)膦)二氯鈀(II)(0.23g，0.32mmol)稱量加入200mL的圓底燒瓶中。隨後添加60mL的二噁烷，接著添加30mL的水，以及隨後添加三乙胺(7.40mL，53.19mmol)。在反應完成1.5小時之後，將所得混合物加熱至85℃。隨後濃縮該混合物以在旋轉蒸發儀上乾燥。在水中懸浮固體殘留物，以及使用HCl將pH調節至約2。用EtOAc實行三次萃取以移除雜質。隨後使用NaOH將pH調節至約8。在冰浴中冷卻該混懸液約1小時，以增強所需產物的沉澱。過濾及乾燥固體以獲取淺黃色固體狀的2.74g(83%)的目標化合物。¹H NMR(400MHz，甲醇-d ₄)δ ppm 2.92-3.07(m,4 H)，3.72-3.84(m,4 H)，4.08(s,3 H)，6.73(d, J=8.03Hz,1 H)，7.04(dd,J=7.53,5.02Hz,1 H)，7.95(dd,J=4.89,1.88Hz,1 H)，8.46(d,J=8.03Hz,1 H)，8.53(s,1 H)，8.89(dd,J=7.53,1.76Hz,1 H)。LRMS(ESI)m/z 311.1[(M+H)]⁺，C₁₆H₁₈N₆O的分析計算值：310.4。

D部分.3-甲基氧雜環丁-3-基(4-硝基苯)碳酸酯。將在500mL的圓底燒瓶中溶於200mL的THF的3-氧雜環丁酮(7.00 7.00g，97.22mol)經由氮氣冷卻至-20℃，同時進行攪拌。隨後，在15分鐘的時段中緩慢添加34.0mL(105.08mmol)的溴化甲基鎂(3M醚液劑)(該反應變得稠密，以及有點難以攪拌)。移除冷水浴，以及該反應允許攪拌及加溫至室溫。在2.5小時之後，反應冷卻至0℃，以及藉由緩慢添加100mL的飽和水溶液來淬滅。添加NH₄Cl以及之後添加幾滴1N HCl以調節pH至約6。用200mL份額的DCM萃取兩次。經由MgSO₄乾燥該合併有機層。過濾以及在旋轉蒸發儀上不加熱地濃縮。獲得包含81%的所需產物以及19%的THF的6.19g的油，該含量是基於質子NMR分析獲得的。反應的預計收率是(5.14公克)60%。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ 1.58(s,3H)，4.49(d,J=7.28Hz,2H)，4.63(d,J=6.53Hz,2H)。

將溶於40mL DCM中的4.32g的3-甲基-氧雜環丁-3-醇(在THF中佔81% w/w，39.77mmol)冷卻至至0℃。添加吡啶，接著在10分鐘的時段內小批量地添加4-硝基苯氯甲酸酯。溶液變得混濁，以及移除冰浴，並且允許在室溫下於氮氣的存在下繼續攪拌。在1小時之後，獲得清澈的淺黃色溶液。用水對反應淬火，以及用DCM萃取兩次。用鹽水浸 洗該合併有機層，以及經由MgSO₄乾燥，以及濃縮。使用小體積的DCM將該層上樣至330層析柱，並且僅使用DCM作為溶劑來使該層在ISCO上經歷分離，從而獲得6.2g(61%)的所需產物。¹H NMR(400MHz，氯仿-d)δ 1.86(s,3H)，4.57(d,J=8.03Hz,2H)，4.90(d,J=7.53Hz,2H)，7.41(d,J=6.51Hz,2H)，8.31(d,J=6.42Hz,2H)。

E部分.3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯。將DIEA(2.24mL，12.9mmol)添加至甲氧基-吡啶-3-基)-5-哌嗪-1-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(1g，3.22mmol)與3-甲基氧雜環丁-3-基(4-硝基苯)碳酸酯(979mg，3.87mmol)在乙腈中的混合物中。在室溫度下攪拌該混合物6小時。用50mL的1N NaOH稀釋該反應混合物以及過濾。用1N NaOH、水及庚烷洗滌固體。從二噁烷：水再結晶產物，以及隨後用乙腈再結晶以提供950mg的3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯。¹H NMR(700MHz,DMSO-d₆)δ 1.67(s,3H)，3.52(br.s.,2H)，3.58(br.s.,2H)，3.80(br.s.,4H)，4.01(s,3H)，4.43(d,J=7.06Hz,2H)，4.67(d,J=7.06Hz,2H)，6.84(d,J=7.82Hz,1H)，7.09(dd,J=7.34,4.86Hz,1H)，7.99(d,J=3.43Hz,1H)，8.52(s,1H)，8.77(d,J=7.82Hz,1H)，8.82(d,J=7.91Hz,1H)。LRMS(ESI)m/z 425[(M+H)]⁺，C₂₁H₂₄N₆O₄的分析計算值：424.46。

P81過濾板測定

以不同濃度稀釋化合物，並且使用Mutiprobe(PerkinElmer公司)及Biomek FX(Beckman Coulter公司)將該化合物添加至Labcyte LDV板(labcyte，產品目錄LP-0200)中，以便使最高的化合物濃度在96μM處。隨後使用ECHO 550液體處理器(Labcyte)將化合物推送(pinged)(每孔75nL)到Greiner 384孔反應板(Greiner，#_781076)中。隨後將總共12μl的反應緩衝液(包含Tween Tween與DTT的IMAP緩衝液，購自Molecular Devices)添加至層析柱1及13的每一孔中以用作陰性對照，以及將12μl的2X AAK1(0.2nM的全長人類蛋白，NCBI NCBI NCBI登錄號NP_055726.2)添加至剩餘孔中。隨後在室溫(RT)下用化合物預孵育酶10分鐘。反應是在Minitrak(PerkinElmer)添加包含2X Mu2(0.2μM，全長人蛋白)、2x冷ATP(2μM)以及1.3μCi的熱³³P-ATP的12μl的底物混合物時開始的。在室溫下進行反應一小時。同時，微孔384孔P81過濾板(微孔，產品目錄#_MZPHN0W10)位於板墊圈(Zoom ZW，購自Titertek)上，並且用50μl的1%磷酸預潤濕。隨後在將24μl的2%磷酸添加到每一孔中時激酶反應停止，以及隨後使用Minitrak將40μl的溶液從每一孔轉移到預預潤濕的微孔384孔P81過濾板中。在室溫下於P81板中孵育反應混合物10分鐘，接著用100μl/孔的1%磷酸、使用Zoom洗濾器洗滌五遍。密封每一過濾板的底部，接著添加20μl的Microscint 40至每 一孔中，用Flashplate蓋密封的密封該等板的頂部，以及隨後等待一小時後在TopCount(PerkinElmer)上讀數。

基於HEK281細胞的測定

在包含DMEM(Gibco，產品目錄#_11965)、10% FBS(SAFC Biosciences，產品目錄#_12103C)、1X GPS(麩胺醯胺、青黴素與鏈黴素)的培養基中培養HEK293F細胞。在第一天，將細胞接種在10cm皿盤上，以便細胞在轉染時的匯合度是約80%。在轉染時10cm皿盤中有大約1200萬個細胞。在第二天，用48ug的DNA與144ul的Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，產品目錄11668-019)轉染每一皿盤。DNA由包含3μg的AAK1/HA/pIRES(全長人類，NCBI登錄號NP_055726.2)、45μg的Flag Flag/AP2MI/pcDNA(全長人類)以及1.5ml的OPTI-MEM的混合物(每10cm皿盤)構成。Lipofectamine 2000由包含144μl的Lipofectamine 2000與1.5ml的OPTI-MEM的混合物(每10cm皿盤)組成。每一混合物被轉移到個別的15ml管中並在室溫下孵育5分鐘，以及隨後該兩個混合物組合並在室溫下孵育20分鐘。隨後從每一10cm平皿中吸出生長培養基，且用10ml的DMEM+10% FBS(不含GPS)更換。最終，將3ml的DNA/Lipofectamine混合物添加到每一10cm皿盤中並輕緩地混合，接著將平皿在37℃與5% CO₂的條件下孵育隔夜。

在第三天，用100% DMSO稀釋化合物以獲得1000X的最終濃度，接著進行3倍連續稀釋，從而總共測試5種濃度。每10cm皿盤測試四種濃度的化合物。隨後將一微升的每 一化合物稀釋液吸移到深孔的96孔平皿中，接著添加500μl的DMEM+0.5% FBS到每一孔中以獲得2X最終濃度的每一化合物。藉由簡易吸移(此刻HEK293細胞非常容易從平皿脫落)將細胞重懸浮在10cm皿盤中，以及隨後將細胞重懸液轉移到50ml的錐管中，並且藉由以1000rpm離心5分鐘來沉澱。隨後在每10cm皿盤中用2.75ml的DMEM+0.5% FBS重懸浮細胞沉澱，以及將100μl的細胞懸液轉移到96孔TC平皿的每一孔中。最終，將用DMEM+0.5% FBS稀釋的100μl 2X化合物添加到含有細胞懸液的各孔中，以獲得1X最終濃度。隨後將平皿在37℃與5% CO2的條件下孵育3小時，接著從每一孔轉移細胞懸液到12升管的PCR條帶中。將PCR條帶在吸頭架中以1000rpm旋轉5分鐘從而沉澱細胞，以及隨後藉由在不干擾細胞沉澱的情況下吸移來移除培養基。

為了準備西方墨點分析法，將細胞沉澱在40ul 1X LDS-PAGE樣本緩衝液(Invitrogen公司，產品目錄#_NP0008)+2X Halt磷酸酶與蛋白酶抑制劑混合物(Thermo Scientific，產品目錄#_1861284)中重懸浮，接著用功率設置為5的微探針超聲波儀對每一細胞懸液進行超聲波處理8-10秒。將五微升的10X NuPage樣本還原劑(含有50mM DTT)添加至每一樣本中，接著在PCR儀上於70℃加熱變性10分鐘。將總共10μl每樣本上樣到4-20% Tris-Glycine Criterion 26孔凝膠(Biorad公司，產品目錄#_345-0034)的每一泳道中以用於磷酸化-mu2墨跡，以及將10μl每樣本上樣到4-12% Bis-Tris(+MES緩衝液)NuPAGE 26孔凝膠(Invitrogen公司，產品 目錄#_WG1403BX10)的每一泳道中以用於mu2墨跡。用於對照，將2ng的磷酸化-mu2或者20ng的mu2/Flag蛋白上樣到每一凝膠的最後一孔中。在SDS-PAGE之後，使用iBlot將每一凝膠上的樣本轉印到PVDF膜上，以及在TBST+5%牛奶中封閉該膜，接著用TBST洗滌3次達5-10分鐘。在TBST+5% BSA中用兔抗磷酸化-mu2(1：5000；由New England Peptide公司生產的並且在Lexicon公司親合純化的兔多株抗體)探針偵測Criterion凝膠，而NuPAGE凝膠是在TBST+5%牛奶中用小鼠抗Flag(1：500；Sigma公司，產品目錄#_F1804)進行探針偵測的，以及該等初級抗體是於4℃在搖床上孵育隔夜的。

在第四天，用TBST洗滌西方墨點3次達5-10分鐘，在TBST+5%牛奶中用抗兔-HRP(1：2000；BioRad公司，產品目錄#_170-6515)或抗小鼠-HRP(1：2000；Biorad公司，產品目錄#_170-6516)在室溫下探針偵測1小時，用TBST洗滌3次達10分鐘，並且在Versadoc上用ECL反應物(GE Healthcare公司，產品目錄#_RPN2132)顯影。最後，用照相機每30秒照相一次，共照相10分鐘，以及將最好的影像保存用於無飽和信號的每一墨跡(當信號飽和時，電泳帶將以紅色突出顯示)。執行對每一電泳條帶的定量分析以獲取密度值。藉由先正規化到總的Mu2表現水準接著與0%及100%的對照作比較來計算每一樣本的抑制百分比。隨後使用Excel擬合軟體計算IC₅₀值。

活體外資料

使用如上所述方法來獲得3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯的活體外資料。在該P81測定中，量測的化合物濃度是0.9nM。在基於HEK281細胞的測定中，量測的化合物濃度是4.7nM。

福馬林測定

用自動化傷害感受分析儀(Automatic Nociception Analyzers)(購自聖地亞哥加州大學Ozaki實驗室)測試小鼠的傷害感受。在測試開始前30分鐘用超效黏合劑將金屬箍配置成環繞每一小鼠的左後肢爪。在30分鐘繢化週期之後，將20μl的5%福馬林皮下注入左後肢爪的背側面。將小鼠個別地安置在筒形腔室中45分鐘。藉由用蒸餾水稀釋福馬林(20%的福馬林溶液(Formalde-fresh 20%)，Fisher Scientific公司，新澤西州費爾勞恩市)來製備新鮮的5%福馬林溶液在福馬林注射前30分鐘投與所研究的化合物。電腦軟體經由電磁場記錄每分鐘的畏縮次數，第I期總畏縮次數(急性期=前8分鐘)，以及第II期總畏縮次數(慢性期在20-40分鐘之間)。參見Yaksh TL、Ozaki G、McCumber D、Rathbun M、Svensson C、Malkmus S、Yaksh MC.，「An automated flinch detecting system for use in the formalin nociceptive bioassay.(用於福馬林傷害感受生物測定的自動化畏縮偵測系統)」，《應用生理學雜誌》(J Appl Physiol.)，2001年，第90卷，第2386-402頁。

第3圖圖示針對相較於媒劑，以1mpk、3mpk、10mpk與30mpk的劑量將3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯施用於雄性C57小鼠獲得的福馬林1期資料。

第4圖圖示針對相較於媒劑以1mpk、3mpk、10mpk與30mpk的劑量將該化合物施用於雄性C57小鼠獲得的福馬林2期資料，其中所提供的統計資料是單因素方差分析(one-way ANOVA)P<0.01劑量效應，事後Dunnett檢驗：對比媒劑*P<0.05，**P<0.01。該化合物的顯著效果可從第5圖中提供的資料的柱狀圖中輕易地顯而易見。

小鼠Chung測定

在Chung測定中研究化合物3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯。參見Chaplan SR、Bach FW、Pogrel JW、Chung JM、Yaksh TL.，「Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw(大鼠爪觸覺異常痛敏的定量評定)」，《神經科學方法雜誌》(J Neurosci Methods),1994年，第53卷，第55-63頁；Chung JM、Kim HK、Chung K.，「Segmental spinal nerve ligation model of neuropathic pain(神經性疼痛的部分脊神經結紮模型)」，《分子醫學方法》(Methods Mol Med.)，2004年，第99卷，第35-45頁。

在藉由習用的Chung協定進行脊神經結紮時，野生型雜種(C57BL/6J-Tyr^c-Brd×129S5/SvEvBrd)雄性小鼠在5-7週齡之間。脊神經結紮是根據具改進的、由Kim和Chung設 計的方法執行的。簡言之，用異氟烷(在1ml/min的氧氣流速中含2%)麻醉小鼠。使用骼脊的水平線作為切割中點，在脊中線左側1mm處切割出皮膚切口(1cm)。在骼脊的中間鈍性地分離椎旁肌，以便暴露L4的尾側邊緣與L6的頭側邊緣之間的橫突(或者，具有僅五個LV的小鼠的骶髂關節)。該方法促進了脊神經L4、L5及/或L6的識別。在使用雜種小鼠的初次試驗中，藉由使用骶髂關節作為界標定位L6來確定脊神經L5與L6的推定位置，如先前在大鼠與小鼠SNL模型中所描述的一般。在使用C57小鼠的化合物測試試驗中，與骼脊有關的最後二個腰椎橫突的位置被用於區分具有五個LV的小鼠與具有六個LV的小鼠。藉由使用該等骨骼界標，在大多數情況中可以精確地辨識小鼠擁有的LV數量。L4與L5脊神經識別不僅是根據L4與L5脊神經相對於橫突的相應位置，還根據對該等神經的大體觀察來進行：在外科手術領域中L3與L4脊神經僅彼此接合，而L5保持為單獨的。剩下的L4及/或L5脊神經被分離並且用7-0絲縫線緊密地結紮。為了結紮L4，將L4從L3分離，以及使用玻璃鉤來在L4下方牽引縫線穿出。L5的結紮是藉由用一對精細鑷將縫線穿過L5下方並且用另一對精細鑷牽引該縫線從另一側穿出而執行的。在非常稀少的情況中，當L3與L4在L5橫突下方匯合時，在L5橫突的頭側邊緣的近端水平處進行L4結紮。因此不存在切除橫突的需要。在假手術組動物中，外科手術方法與如上所述的方法相同，區別在於不結紮脊神經。在對第四群組小鼠執行的脊神經橫切中，L4或者L5脊神經是使用精細的 顯微手術剪在與結紮一般位於的相同水平面處打斷的。在確認止血之後，使用5-0薇喬縫線(vicryl suture)對骶棘肌以及使用創緣夾對皮膚進行切口雙層閉合。在手術之後立即向小鼠注射鹽水(1ml)與丁丙諾啡(0.05-0.1mg/kg小鼠)，以及在手術後大約12與24小時再次注射丁丙諾啡(總共3劑量)以減輕手術引起的疼痛。使用加溫墊與加熱燈來在整個手術期間維持動物的正常體溫。在操作後小鼠被個別地安置並監控，直至小鼠從麻醉徹底恢復。

Von Frey觸覺異常痛敏是藉由在如由Chaplan等人描述的上下法中測試對一組von Frey纖維絲(大致對應於0.04、0.07、0.16、0.4、1與2公克的力而編號為2.44、2.83、3.22、3.61、4.08與4.31，Stoelting公司，伊利諾伊州伍德戴爾市)的後爪縮回反應(縮回、畏縮、舔)來評定的。基準von Frey測試是在手術之前進行的，並且在手術之後取決於試驗設計每隔一週重複一次，持續3至6週。對於von Frey測試，小鼠被安置在具有¼”絲網底板的透明聚對苯二甲酸乙二酯圓筒(高度10”/直徑4.25”)中以允許實驗員向小鼠的趾表面施加von Frey纖維絲。兩隻爪子皆做測試。所施加的第一von Frey纖維絲是3.61。若沒有引起反應，則提供下一更強力的纖維絲。若存在反應，則提供下一較弱的纖維絲。總共存在六種形式的von Frey纖維絲(若動物不對最強的纖維4.31響應，則測試結束)。使用上下法計算每一爪子的50%縮爪閾值。在基準測試期間任意爪表現出小於2的50%縮爪 閾值的小鼠被從手術中排除，並且進一步評定。Von Frey測試實驗員始終是對手術與治療的性質不瞭解的。

為了減少研究中的自發活動，在手術前基準測試的前一天使小鼠適應試驗箱60分鐘，以及在施用化合物的von Frey測試之前使小鼠適應該試驗箱30分鐘。在實驗過程中一直開啟試驗室中的白雜訊。

如第6圖所示，化合物3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯在Chung測定中表現出劑量依賴性的、非常顯著的效應。整體而言，RM ANOVA中P<0.0001；事後Dunnett測定：對比媒劑**P<0.01，***P<0.001。

所有在此引用的出版物(例如，專利及專利申請案)以其全部內容併入本文。

Claims (10)

1. 一種化合物，該化合物為3-甲基氧雜環丁-3-基-4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸酯： 或其醫藥學上可接受的一鹽類。
2. 如請求項1所述之化合物，其中該化合物為結晶。
3. 如請求項2所述之化合物，其中該化合物具有約182.5℃的熔點。
4. 如請求項2所述之結晶化合物，其中該化合物具有一X射線粉末繞射圖樣，其中尖峰在約12.7、14.8、18.7、19.0、19.7及/或25.1度2 θ處。
5. 一種抑制銜接子關聯激酶1(AAK1)活性的方法，該方法包括以下步驟：使AAK1與如請求項1-4中任一項所述之化合物接觸。
6. 一種醫藥組成物，該醫藥組成物包括如請求項1-4中任一項所述之化合物與一醫藥學上可接受的賦形劑或稀釋劑。
7. 一種治療或管理由AAK1活性介導的一疾病或病症的方法，該方法包括以下步驟：向一需要治療的一患者投與一治療有效量的如請求項1-4中任一項所述之化合物或如請求項6所述之醫藥組成物。
8. 如請求項7所述之方法，其中該疾病或病症是阿茲海默症、雙極性障礙、疼痛、帕金森氏症或精神分裂症。
9. 如請求項8所述之方法，其中該疼痛是神經性疼痛。
10. 如請求項9所述之方法，其中該神經性疼痛是纖維肌痛或周邊神經病(例如，糖尿病性神經病變)。