WO2017086356A1 - ウシ血清組成物及びそのウシ血清組成物を添加剤として使用する細胞の培養方法 - Google Patents

ウシ血清組成物及びそのウシ血清組成物を添加剤として使用する細胞の培養方法 Download PDF

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    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Definitions

  • the present invention relates to a bovine serum composition and a cell culture method using the bovine serum composition as an additive.
  • bovine serum contains many humoral factors including growth factors and has become a standard for cell culture.
  • bovine spongiform encephalopathy BSE
  • fetal bovine serum is widely used in Oceania from countries other than BSE-producing countries, leading to higher prices. It is known that adult bovine serum not derived from fetus can be used for cell culture, but does not contain humoral factors including growth factors as fetal bovine serum.
  • platelet-rich plasma prepared by concentrating platelets to a high concentration is prepared from whole human blood that has been treated with anticoagulation by centrifugation, etc. It is reported to be useful for (Non-patent Document 1).
  • Platelet-rich plasma contains platelet-derived transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB), vascular endothelial growth factor (VEGF), epidermal growth factor (EGF), etc. Many are included, and these induce cell proliferation (Non-patent Document 2).
  • TGF- ⁇ platelet-derived transforming growth factor- ⁇
  • PDGF-BB platelet-derived growth factor-BB
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • blood cell components contained in whole blood include leukocytes in addition to platelets. It is known that leukocytes secrete platelet activating factor (PAF) in addition to interleukin, interferon and colony-stimulating factor, which activate platelets (Non-patent Document 4).
  • PAF platelet activating factor
  • Buffy coat is obtained from human whole blood that has undergone anticoagulation treatment by standing or simple centrifugation, and in the case of humans, the specific gravity is clearly different from plasma and red blood cells. Presents a white layer containing. Therefore, serum that is rich in various humoral factors including the above-mentioned growth factors, chemotaxis factors, and activation factors secreted by platelets and leukocytes, which mutually activate platelets and leukocytes contained in the buffy coat layer Is considered suitable for cell culture.
  • Non-patent Document 5 there is a report that administration of non-existing cells, for example intravenously, induces blood coagulation. Therefore, establishment of a cell culture method that hardly induces blood coagulation is important for realizing regenerative medicine.
  • Patent Document 1 describes a proliferation promoting agent that promotes the proliferation of mesenchymal stem cells containing a liquid component of coagulated cord blood.
  • an erythrocyte sedimentation agent is added to non-coagulated umbilical cord blood and separated into a fraction containing erythrocytes and a supernatant fraction, and then, with respect to the supernatant fraction, a precipitated fraction containing hematopoietic stem cells. And a liquid fraction containing platelets. Then, a glass bead is brought into contact with the liquid fraction containing platelets to produce a growth promoter. That is, the sediment fraction in which leukocytes including hematopoietic stem cells are present is not included in the growth promoter.
  • the present invention activates the interaction between white blood cells and platelets in the buffy coat over a certain period of time at a certain temperature, and recoagulates the blood component containing the obtained liquid component.
  • This invention is completely different from the invention described in Patent Document 1.
  • Patent Document 2 discloses a serum in which an adsorption member made of a glass material is introduced into plasma after separating platelet-rich plasma and formed components from blood containing an anticoagulant, and fibrinogen in the plasma is adsorbed and removed. The separation method is described.
  • a glass material is used as an adsorbing material for removing the fibrinogen in plasma by utilizing the fact that the fibrinogen adheres to the surface of the glass material.
  • the addition of a glass material further activates the interaction between white blood cells and platelets in the buffy coat, and the present invention is completely different from the invention described in Patent Document 2.
  • Patent Document 3 the collected human blood is centrifuged without an anticoagulant before clotting, 80% of the supernatant plasma is removed, and the remaining blood components including platelets are well suspended.
  • glass beads as a blood coagulation promoting material, platelets are activated and blood coagulated, and growth factors are released from the platelets to obtain concentrated serum.
  • Patent Document 4 an anticoagulant is added to the collected human blood, centrifuged, 80% of the supernatant plasma is removed, and the remaining blood components including platelets are well suspended to serve as a blood coagulation promoter.
  • an aqueous calcium chloride solution By adding an aqueous calcium chloride solution, platelets are activated and blood coagulated, and growth factors are released from the platelets to obtain concentrated serum.
  • bovine blood to which an anticoagulant is added includes a buffy coat and a fraction having a higher specific gravity than buffy coat (containing a leukocyte in the case of bovine). Is a serum component obtained by activating the interaction between white blood cells and platelets over a certain period of time at a certain temperature, and recoagulating the blood component containing the obtained liquid component. This is completely different from the inventions described in Patent Documents 3 and 4.
  • the present invention provides an unprecedented method for producing a bovine serum composition, specifically, an inexpensive bovine serum composition containing a number of factors that are beneficial to cell proliferation and factors that inhibit blood coagulation by cells. It aims at providing the manufacturing method of a thing.
  • the method for producing a bovine serum composition according to the present invention includes a step of anticoagulating bovine whole blood with an anticoagulant, and obtaining a buffy coat and a specific gravity fraction heavier than the buffy coat from the anticoagulated bovine whole blood. Including the humoral factor while secreting or releasing the humoral factor from the leukocyte and / or platelet by activating the process and the interaction between the acquired leukocyte and platelet over a certain time at a certain temperature. And a step of recoagulating the blood component with a recoagulant.
  • the bovine serum composition obtained by the method for producing a bovine serum composition according to the present invention is inexpensive and includes many cell growth factors. That is, according to the present invention, a serum composition having a growth promoting effect equivalent to or higher than that of fetal bovine serum can be produced from, for example, bovine whole blood. Since fetal bovine serum is obtained by slaughtering the fetus, a blood test that takes into account the window period (blank period during which no infection can be confirmed by the test) cannot be performed later for infectious diseases. If the infectious disease is 3 months, a blood test is performed 3 months after the production of the serum composition, and a highly safe serum composition can be obtained by completely denying the infection.
  • the bovine serum composition obtained by the present invention is cheaper and safer, has a cell growth ability equal to or higher than that of fetal bovine serum, and is less likely to induce blood coagulation by cells.
  • the bovine serum composition obtained by the present invention is extremely excellent as an additive for cell culture.
  • the bovine serum composition according to this embodiment is (i) Anticoagulation treatment step: anticoagulation treatment of bovine whole blood with an anticoagulant, (ii) white blood cell and platelet obtaining step: obtaining a buffy coat and a specific gravity fraction heavier than the buffy coat from the anticoagulated whole blood; (iii) Leukocyte and platelet activation / recoagulation treatment process: Activate the interaction between the acquired leukocyte and platelet by taking a certain amount of time at a certain temperature and adding a glass material and allowing it to stand as necessary. It contains a humoral factor secreted / released by leukocytes and / or platelets, and is obtained by recoagulating a blood component containing this humoral factor with a recoagulant.
  • Anticoagulation treatment step anticoagulation treatment of bovine whole blood with an anticoagulant
  • white blood cell and platelet obtaining step obtaining a buffy coat and a specific gravity fraction heavier than the buffy coat from the anticoagulated whole blood
  • Whole blood is derived from bovine, and any of adult, young, newborn or fetal bovine can be applied.
  • Whole blood can be collected in a blood collection bag or the like through a needle through a blood vessel and a tube.
  • Whole blood consists of blood cell components (red blood cells, white blood cells, platelets) and plasma, which is a liquid component. Plasma contains clotting components, whereas serum contains little or no clotting components.
  • An anticoagulation treatment using an anticoagulant is performed during or after collecting bovine whole blood. Since blood contains blood coagulation factors such as fibrinogen (blood coagulation factor I), prothrombin (blood coagulation factor II), blood coagulation factor V, and blood coagulation factor VIII, buffing from whole blood as described later. This is to prevent blood coagulation when obtaining the coat.
  • the anticoagulant is not particularly limited, and examples thereof include sodium citrate, citric acid, heparin and the like.
  • (ii) Leukocyte and platelet acquisition step Acquisition of leukocytes and platelets from anticoagulated bovine whole blood is performed, for example, by a centrifuge or a continuous centrifuge.
  • the buffy coat is a layer of white blood cells and platelets generated between the red blood cell layer and plasma when uncoagulated blood is centrifuged.
  • the specific gravity of red blood cells is lighter than that of humans, as will be described later, there are portions where the specific gravity of white blood cells and red blood cells overlap, and as a result, the buffy coat is an unclear layer because it contains less white blood cells. .
  • the specific gravity of bovine platelets is, for example, 1.032 to 1.058
  • the specific gravity of bovine leukocytes is, for example, 1.032 to 1.084
  • the specific gravity of bovine erythrocytes is, for example, 1.071 to 1.110.
  • the buffy coat located between the red blood cell layer and the plasma is a layer with a specific gravity of 1.032 to 1.071, but this layer has a higher specific gravity than the buffy coat, for example 1.071 to 1.084 because it contains less white blood cells.
  • the fraction is also acquired.
  • plasma rich in both white blood cells and platelets is prepared from anticoagulated bovine whole blood, for example, by using a centrifuge or a continuous centrifuge, excluding plasma and heavy red blood cells.
  • the conditions for the centrifugation are not particularly limited, and for example, the centrifugal acceleration can be 2900 to 11760 m / s 2 (300 to 1200 ⁇ g), the temperature is 4 to 37 ° C., and the time is 3 minutes or more.
  • the obtained plasma containing a large amount of leukocytes and platelets is allowed to stand at room temperature to 40 ° C. for a certain period of time to promote the interaction between leukocytes and platelets.
  • normal temperature is 10 ° C to 30 ° C.
  • the glass material or the like comes into contact, the interaction between leukocytes and platelets is further activated, and a large amount of humoral factor is secreted and released from the leukocytes and / or platelets.
  • the glass material is a glass having components composed of soda-lime glass, lead glass, borosilicate glass, or a mixture thereof.
  • the activation temperature and time conditions are preferably 37 ° C. for 1 hour or longer, but can be, for example, normal temperature to 40 ° C. for 5 minutes or longer, or 37 ° C. to 40 ° C. for 1 to 3 hours. In addition, it is possible to set the temperature between 38 ° C. and 40 ° C. for 1 to 3 hours. Also, during the activation time, a recoagulant is added and the next recoagulation treatment step is performed simultaneously. It is also possible.
  • the shape of the glass material to be input is not particularly limited, and for example, it can be a granular material, a sheet, a block, or the like.
  • the granular material is, for example, a glass bead shape, a marbled shape, an eyeball shape, a dice shape, a cylindrical shape, a prismatic shape, a hollow cylindrical shape, a donut shape, a teardrop shape, a plate shape, or an irregular shape such as a cullet. Is possible. Glass beads are preferred.
  • the particle size of the granular material is not particularly limited, and can be, for example, 1 to 20 mm, preferably 5 to 9 mm.
  • the liquid factor secreted / released by increasing the concentration by adding a glass material includes those derived from platelets, leukocytes, or both.
  • Platelet-derived humoral factors include, for example, TGF-beta1, Basic FGF, G-CSF, IFN-gamma, IL-10, IL-1RA, IL-1b, IL-4, IL-6, IL-8, TNF -alpha etc. are mentioned.
  • humoral factors derived from leukocytes include Eotaxin, IL-12 (p70), and the like.
  • humoral factors derived from both platelets and leukocytes include IL-5, IL-9, IP-10, MCP-1, and PDGF-BB.
  • the blood component containing the above-mentioned liquid factor is recoagulated with a recoagulant to obtain a serum component as a supernatant.
  • the recoagulant is not particularly limited and can be appropriately set according to the type of anticoagulant, and examples thereof include calcium chloride and protamine.
  • the recoagulant is preferably a calcium solution such as a calcium chloride solution, and when the anticoagulant is heparin, the recoagulant is preferably, for example, protamine.
  • the bovine serum composition obtained through the above steps contains a large number of cell growth factors, and a serum composition having excellent cell growth ability can be obtained. Furthermore, the obtained cells have higher safety because induction of blood coagulation is suppressed.
  • the cell culture method of the present invention promotes cell proliferation by culturing cells in a medium containing as an additive the bovine serum composition obtained by the method for producing a bovine serum composition according to the present invention, A step of suppressing the induction of blood coagulation.
  • the cells are not particularly limited, and are, for example, mesenchymal stem cells or mesenchymal cells derived from fetal appendages including bone marrow, adipose tissue, or amniotic membrane / umbilical cord.
  • the origin of the cell is not particularly limited, and examples thereof include humans and non-human mammals such as rodents, livestock, and primates excluding humans.
  • the medium in which the bovine serum composition is included as an additive is not particularly limited, and examples thereof include a medium that can be used for culturing mesenchymal stem cells.
  • a-Minimal essential medium examples include a medium (aMEM medium), Dulbecco's modified eagle medium medium (DMEM medium), and the like.
  • the concentration of the bovine serum composition in the medium is not particularly limited, and the concentration of the humoral factor included in the serum composition can be, for example, 0.01 to 20 v / v%.
  • the number of cells per 1 mL of the medium can be, for example, 1000 to 100,000.
  • the cell culture conditions are not particularly limited.
  • the temperature is 37 ° C.
  • the time is 2 to 10 days.
  • the medium is preferably replaced with a new medium every 1 to 5 days, for example.
  • the medium can be replaced by, for example, a method of replacing the medium every predetermined time, a method of supplying a new medium continuously or intermittently, etc. Can be given. In the latter case, it is preferable to discard a part of the old medium continuously or intermittently, for example, in accordance with the supply of a new medium.
  • Example 1 Using a centrifugal blood component separator (component collection system: CCS, manufactured by Hemonetics), leukocyte and platelet fractions of various concentrations are collected from anticoagulated blood, and after reactivation of leukocytes and platelets, recoagulation is performed. The serum composition was adjusted by, and the humoral factor was analyzed.
  • CCS centrifugal blood component separator
  • a blood circuit dedicated to the device (971J, manufactured by Hemonetics) is installed, and the anticoagulant ACD-A solution (sodium citrate hydrate 2.20%, citric acid hydrate 0.80%, glucose 2.20%,
  • the anticoagulated blood obtained by mixing Terumo Co., Ltd. and donor blood at a ratio of 1:10 is used to obtain various concentrations of white blood
  • the platelet fraction was collected in portions over time.
  • the obtained leukocyte / platelet fraction (buffy coat) was measured for leukocyte / platelet count with an automatic blood cell counter (LC-660, manufactured by Fukuda Denshi). The results are shown in Table 2.
  • TGF-beta1 concentration was sufficient even without glass, but an increase in concentration was observed when glass was used. Looking at the ratio to sample A, it was highly correlated with the platelet count data in Table 2, and it was speculated that TGF-beta1 in the serum composition was mostly derived from platelets. Comparing samples A and C, the platelet count and TGF-beta1 concentration were almost the same, strongly suggesting that TGF-beta1 is derived from platelets.
  • IL-12 (p70) concentration was sufficient even without glass, but an increase in concentration was observed when glass was used. Looking at the ratio to sample A, a high correlation was found with the data on the number of leukocytes in Table 2, and it was assumed that IL-12 (p70) in the serum composition was derived from a large amount of leukocytes. Comparing samples A and D, the white blood cell count and IL-12 (p70) concentration were almost the same, strongly suggesting that IL-12 (p70) is derived from white blood cells.
  • IL-1b concentration was found to increase significantly when glass was used. Looking at the ratio to sample A (with glass), a high correlation with the platelet count data in Table 2 was observed, and it was speculated that IL-1b in the serum composition was mostly derived from platelets. Comparing samples A and C, the platelet count and IL-1b concentration were almost the same, strongly suggesting that IL-1b is derived from platelets.
  • the IP-10 concentration was sufficient even without glass, but an increase in concentration was observed when glass was used. Looking at the ratio to sample A, it is difficult to recognize the correlation with the data on the white blood cell count and platelet count in Table 2. (1) In the absence of glass, the trend is closely related to the platelet count, but sample D has half the platelet count compared to A, but the IP-10 concentration is about 80%, (2) with glass In this case, the tendency is closely related to the white blood cell count, but when comparing samples B and C, the platelet count was the same, but a difference was observed in the IP-10 concentration. From these, it is highly possible that IP-10 is derived from both leukocytes and platelets. As the basis for the interaction due to the use of glass, sample B has a relatively high white blood cell count and the highest platelet count, but the IP-10 concentration is (1) below the average in the absence of glass, ( 2) When glass is present, the most common points can be pointed out.
  • the MCP-1 concentration was a sufficient concentration even without glass, but an increase in concentration was observed when glass was used. Looking at the ratio to sample A, it is difficult to recognize the correlation with the data on the white blood cell count and platelet count in Table 2.
  • sample B has a relatively high white blood cell count and the highest platelet count, but the MCP-1 concentration is (1) the lowest without glass ( 2) When glass is present, the most common points can be pointed out.
  • the MIP-1b concentration did not increase when glass was used. However, when looking at the ratio to sample A, there was a correlation with the leukocyte count data in Table 2, and it was speculated that MIP-1b in the serum composition was mostly derived from leukocytes. Comparing samples A and D, the white blood cell count and MIP-1b concentration were almost the same, suggesting that MIP-1b is derived from white blood cells.
  • the PDGF-BB concentration was sufficient even without glass, but an increase in concentration was observed when glass was used. Looking at the ratio to sample A, it is difficult to recognize the correlation with the data on the white blood cell count and platelet count in Table 2.
  • TNF-alpha concentration was found to increase significantly when glass was used. Looking at the ratio to sample A (with glass), a high correlation with the platelet count data in Table 2 was observed, suggesting that TNF-alpha in the serum composition is mostly derived from platelets. Comparing samples A and C, the platelet count and IL-8 concentration were almost the same, strongly suggesting that TNF-alpha is derived from platelets.
  • the VEGF concentration did not increase when glass was used. Looking at the ratio to sample A, it is difficult to recognize the correlation with the data on the white blood cell count and platelet count in Table 2. In the presence of glass, the trend is closely related to the white blood cell count, but when comparing samples A and D, for example, there was no correlation between platelet count and VEGF concentration, indicating that VEGF is derived from both white blood cells and platelets. There is no denying the possibility.
  • Example 2 Furthermore, studies were carried out for the purpose of optimizing temperature and time conditions in the mutual activation of the obtained leukocyte / platelet fraction.
  • Example 1 a blood circuit dedicated to the same device (971J, manufactured by Hemonetics) was attached, and the anticoagulant ACD-A solution (sodium citrate hydrate 2.20%, citrate hydrate 0.80%) , Glucose 2.20%, manufactured by Terumo Co., Ltd.) and blood of donor blood at a ratio of 1:10, anticoagulated blood was obtained by continuously centrifuging leukocytes and platelets using a centrifuge bowl equipped with the blood circuit. Fractions were collected. To the obtained leukocyte / platelet fraction, an aqueous calcium chloride solution was added so that the final addition concentration was 5 mM.
  • ACD-A solution sodium citrate hydrate 2.20%, citrate hydrate 0.80%
  • Glucose 2.20% manufactured by Terumo Co., Ltd.
  • the TGF-beta1 concentration was high at 20 ° C. to 40 ° C. with respect to the temperature, and the time was high at 1 hour or more. Based on the above, it was considered that the temperature and time conditions for the mutual activation of leukocyte and platelet fractions were from room temperature to 40 ° C. for 1 hour or more.
  • Example 3 Regarding the collection of leukocyte / platelet fractions from whole blood treated with anticoagulation, the difference by animal species was examined.
  • the anticoagulant ACD-A solution sodium citrate hydrate 2.20%, citric acid hydrate 0.80%, glucose 2.20%, manufactured by Terumo Corporation
  • human or bovine blood 1:10
  • a cooling centrifuge 5922 manufactured by Kubota Corporation
  • FIG. 2 the left is a cow and the right is a human.
  • bovines have a relatively low specific gravity of erythrocytes and erythrocytes do not settle easily, whereas humans have a high erythrocyte specific gravity and erythrocytes easily settle.
  • red blood cells are difficult to settle by standing or simple centrifugation, and as a result, a relatively lighter white blood cell / platelet fraction does not appear easily.
  • Example 4 Therefore, the specific gravity of each blood component in cattle was examined.
  • Percoll undiluted solution (1.130 g / ml, manufactured by GE Healthcare Biosciences Co., Ltd., 17-0891-01), 1.5M NaCl, and sterilized water are mixed in appropriate amounts, specific gravity 1.123, 1.110, 1.097, 1.084, 1.071, 1.058, 1.045 , 1.032, 1019, 1.006 isotonic Percoll solutions were prepared. 3 ml of these isotonic Percoll solutions were added to a 15 ml polypropylene tube (2325-015, manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.).
  • anticoagulant ACD-A solution sodium citrate hydrate 2.20%, citric acid hydrate 0.80%, glucose 2.20%, manufactured by Terumo Corporation
  • bovine blood 3 ml of the obtained anticoagulated blood was layered on a 15 ml polypropylene tube (2325-015, manufactured by AGC Techno Glass Co., Ltd.) to which isotonic Percoll solution was added. Centrifugation was performed at 400 ⁇ g and room temperature for 10 minutes (universal cooling centrifuge 5922, manufactured by Kubota Corporation), and the state was photographed. The results are shown in FIG.
  • bovine blood contains many red blood cells that are suspended in an isotonic Percoll solution having a specific gravity of 1.071 and lighter than a specific gravity of 1.071.
  • each tube (6 ml) was divided into an upper 3 ml and a lower 3 ml, and the blood cell components in each were measured with an automatic blood cell counter (IDEXX Laboratories Proteosite Dx). The results are shown in Table 28.
  • leukocyte / platelet fraction (so-called buffy coat) appears by a simple operation, but in the case of cattle, there are many parts where the specific gravity of leukocytes and erythrocytes overlaps. In operation, it became clear that it was difficult to separate all leukocytes.
  • Example 5 Therefore, we aimed to collect a stable leukocyte / platelet fraction from bovine whole blood and examined it using a continuous centrifuge.
  • a centrifugal blood component separator (CCS, manufactured by Hamonetics) is equipped with a dedicated blood circuit (971J, manufactured by Hamonetics), and the anticoagulant ACD-A solution (sodium citrate hydrate 2.20%, (Citrate hydrate 0.80%, glucose 2.20%, manufactured by Terumo Corporation) and bovine whole blood in a ratio of 1:10, using a centrifuge bowl equipped with the blood circuit Then, continuous centrifugation was performed, and a photograph of the white blood cell / platelet fraction that appeared was taken. The results are shown in FIG.
  • a buffy coat (white blood cell / platelet fraction) in which a white belt-like circle is drawn clearly exists between the red blood cells located outside the centrifuge bowl and the plasma located inside.
  • the amount of blood processed once is large (> 250 ml), so it seems that buffy coat appeared relatively easily even if there was a slight difference in specific gravity.
  • Sample 6 located in the buffy coat was proved to be a leukocyte + platelet fraction.
  • Sample 6 having a heavier specific gravity than the buffy coat had the most white blood cells.
  • it was confirmed that it is necessary to obtain a fraction including a fraction with a higher specific gravity than buffy coat ( leukocytes in bovines). It was.
  • Example 6 Therefore, with respect to bovine whole blood that had undergone anticoagulation treatment, a centrifugal blood component separation device (CCS, manufactured by Hamonetics) was used to collect leukocyte and platelet fractions, which were activated by adding glass beads, and then recoagulated.
  • a serum composition (hereinafter referred to as the present serum composition) was prepared, and the possibility as an additive for the purpose of cell culture was examined.
  • a blood circuit dedicated to the device (970E, manufactured by Hemonetics) is attached, and the anticoagulant titramine solution “Fuso” 4% (sodium citrate hydrate 4%, manufactured by Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.) and bovine
  • the anticoagulated blood obtained by mixing the blood at a ratio of 1:16 was collected from the white blood cell / platelet fraction by continuous centrifugation using a centrifuge bowl provided in the blood circuit.
  • Glass beads (1 per 50 ml of blood component: BZ-6, manufactured by ASONE) are added to the obtained leukocyte / platelet fraction, and an aqueous calcium chloride solution is added to a final addition concentration of 5 mM to 37 ° C. Left for more than 6 hours.
  • the mixture was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes, and the supernatant (serum composition) was collected and stored at ⁇ 20 degrees.
  • the serum composition was thawed and added to aMEM medium (Life Technologies, Inc., 41061) at a rate of 10% to obtain a cell culture medium.
  • the control was an aMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum (Moregate Biotech).
  • proliferation curves were prepared using commercially available human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Lonza, PT-2501) and human amnion-derived mesenchymal stem cells established by us.
  • the human amnion-derived mesenchymal stem cells were cultured in the following steps. That is, the amniotic membrane obtained by cesarean section was treated with collagenase and thermolysin for 30 minutes at 35 ° C., and the cells were collected by passing the enzyme-treated amniotic membrane through a mesh with a pore size of 100 ⁇ m. Cultured. The concentration of collagenase was 500 CDU / ml and the concentration of thermolysin was 400 PU / ml.
  • the serum composition has superior cell proliferation ability compared to fetal bovine serum usually used for cell culture in both bone marrow and amnion-derived mesenchymal stem cells. It turned out to be a thing.
  • Example 7 In addition, the effect of the serum composition on the cell diameter was examined. As in Example 6 above, using the aMEM medium supplemented with this serum composition at a rate of 10% (the control is the aMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum), we established human amnion-derived mesenchymal stem cells. Culture was performed and subcultured appropriately. The average cell diameter ( ⁇ m) was measured at each passage, and the difference between the two was examined. The results are shown in Table 31.
  • the human amnion-derived mesenchymal stem cells cultured with this serum composition always had a smaller cell diameter at each passage than the fetal bovine serum.
  • this serum composition was shown to have a higher cell proliferation ability than fetal bovine serum, and it was considered that the time until cell division was earlier.
  • Example 8 In intravenous administration of cell preparations using cultured mesenchymal stem cells, the promotion of blood coagulation by the administered cells often becomes a problem. Therefore, it was examined whether cells cultured with this serum composition induce blood coagulation.
  • human amnion-derived mesenchymal stem cells cultured in 10% serum composition-added aMEM medium were adjusted with physiological saline to 1 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the control was the same cells cultured in aMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum.
  • 40 ⁇ L of human plasma was added to 160 ⁇ L of these cell suspensions, and after incubation at 37 ° C. for 5 minutes, 100 ⁇ L of 20 ⁇ M CaCl 2 was added, and the clotting time was measured with an automatic blood coagulation measuring device (KC1 Delta, manufactured by Tcoag). .
  • the results are shown in Table 32.
  • the human amnion-derived mesenchymal stem cells cultured with this serum composition were found to be prone to induce blood coagulation with an increase in clotting time compared to fetal bovine serum.
  • Example 9 Therefore, an investigation was conducted for the purpose of searching for a factor in which cells cultured with this serum composition hardly induce blood coagulation.
  • TFPI tissue factor pathway inhibitor
  • the concentration of the stem cell (passage number 4) in the culture supernatant was measured using an ELISA kit (Human TFPI Quantikine ELISA Kit) (DTFP10, R & D systems).
  • the controls were the culture supernatant of the same cells cultured in 10% fetal bovine serum-added aMEM medium, and these media before cell culture. The results are shown in Table 33.
  • Human amnion-derived mesenchymal stem cells cultured with this serum composition secrete more TFPI than fetal bovine serum, indicating that they are difficult to induce blood clotting. .

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Abstract

細胞増殖に有益な因子を多数含む安価なウシ血清組成物の製造方法を提供する。ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、抗凝固処理された全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得する工程と、取得した白血球と血小板を一定の温度で一定以上時間をかけることで相互作用を促し活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、を有する。

Description

ウシ血清組成物及びそのウシ血清組成物を添加剤として使用する細胞の培養方法
　本発明は、ウシ血清組成物及びそのウシ血清組成物を添加剤として使用する細胞の培養方法に関する。
　細胞の培養増殖では、培地に対しウシ血清を添加すれば効果的であることが知られている。特にウシ胎児血清は増殖因子を含む多くの液性因子を含有しており、細胞培養のスタンダードとなっている。
　しかしながら、牛海綿状脳症(BSE)問題により、ウシ胎児血清はBSE発生国以外のオセアニア産が汎用されており、価格高騰に繋がっている。胎児由来ではない成獣ウシ血清も細胞培養に使用可能であるが、ウシ胎児血清ほど増殖因子を含む液性因子を含有しないことが知られている。
　一方、これまでに抗凝固処理を行ったヒト全血から遠心処理等により血小板を高濃度に濃縮した多血小板血漿（platelet rich plasma:PRP）を調整し、これを添加した培地は細胞の培養増殖に有用であることが報告されている（非特許文献１）。
　多血小板血漿には、血小板由来のトランスフォーミング増殖因子-β(TGF-β)、血小板由来成長因子-BB(PDGF-BB)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF)等が多く含まれており、これらが細胞増殖を誘導している（非特許文献２）。
　血小板は、上記増殖因子の他、血小板第４因子(platelet factor 4:PF4)と呼ばれる好中球や単球に対する走化因子を含有しており、白血球の活性化を誘導する（非特許文献３）。
　また、全血に含まれる血球成分には血小板以外にも白血球がある。白血球はインターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子の他、血小板活性化因子(PAF)を分泌し、これは血小板を活性化させることが知られている（非特許文献４）。
　バフィーコートは、抗凝固処理を行ったヒト全血から静置や簡単な遠心処理等により得られ、ヒトの場合、血漿や赤血球と明確に比重が異なることから、血小板や白血球両者を高濃度に含む白い層を呈する。そこで、バフィーコート層に含まれる血小板や白血球を相互に活性化させた、上記の血小板や白血球が分泌する増殖因子や走化因子、活性化因子等を含む各種液性因子を豊富に含有する血清は、細胞培養に相応しいと考えられる。
　しかしながら、ウシの場合、後述するようにヒトと比べ赤血球の比重が軽いことから、白血球と赤血球の比重が重なる部分があり、結果、バフィーコートは白血球の含有が少ないことから不明瞭な層となる。従って、白血球および血小板両者を採取するには、バフィーコートより比重が重い分画（＝ウシの場合、白血球を含有）も含め取得する必要性が、本願発明において明らかとなっている。
　近年、細胞の製剤化による、再生医療製品としての治療応用が期待されている。一方、普段存在しない細胞を、例えば静脈内に投与されることは血液の凝固を誘導するとの報告がある（非特許文献５）。そこで、血液凝固を誘導しにくい細胞の培養法の確立が、再生医療の実現化に重要である。
　特許文献１には、凝固臍帯血の液性成分を含む間葉系幹細胞の増殖を促進する増殖促進剤が記載されている。特許文献１では、まず非凝固臍帯血に赤血球沈降剤を添加して、赤血球を含む画分と上清画分とに分離し、次にその上清画分に関し、造血幹細胞を含む沈降画分と血小板を含む液体画分とに分離している。そしてその血小板を含む液体画分にガラスビーズを接触させて増殖促進剤を製造している。則ち、造血幹細胞を含む白血球が存在する沈降画分は、増殖促進剤に含まれない。一方で本願発明は、後述するように、バフィーコート中の白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定時間以上かけ活性化させ、得られた液性成分を含む血液成分を再凝固処理させて得られる血清成分であり、本願発明は特許文献１記載の発明と全く相違する。
　特許文献２には、抗凝固剤入りの血液から多血小板血漿、及び有形成分を分離した後の血漿に、ガラス材料からなる吸着部材を投入し、血漿内の繊維素原を吸着除去する血清の分離方法が記載されている。特許文献２では、繊維素原がガラス材料の表面に付着することを利用し、血漿内の繊維素原を除去する吸着材料としてガラス材料を使用している。本願発明は、後述するように、ガラス材料の添加は、バフィーコート中の白血球と血小板との相互作用を更に活性化させるものであり、本願発明は特許文献２記載の発明と全く相違する。
　特許文献３には、採取されたヒト血液を、凝固する前に抗凝固剤を入れずに遠心分離し、上清の血漿の８０％を除去し血小板を含む残りの血液成分をよく懸濁し、血液凝固促進材としてガラスビーズを添加することで、血小板を活性化し、血液凝固させるとともに、前記血小板から増殖因子を放出させ濃縮血清を得ている。
　また、特許文献４には、採取されたヒト血液に抗凝固剤を入れ遠心分離し、上清の血漿の８０％を除去し血小板を含む残りの血液成分をよく懸濁し、血液凝固促進材として塩化カルシウム水溶液を添加することで、血小板を活性化し、血液凝固させるとともに、前記血小板から増殖因子を放出させ濃縮血清を得ている。本願発明では、後述するように、抗凝固剤の添加されたウシ血液において、バフィーコートおよびバフィーコートよりも比重の重い分画（ウシの場合、白血球を含有）を含む比較的広範囲の比重分画を取得し、白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定時間以上かけ活性化させ、得られた液性成分を含む血液成分を再凝固処理させて得られる血清成分であり、本願発明は特許文献３および４記載の発明と全く相違する。
特開２０１１－１６０７９９号公報 特開２００６－１０４１０６号公報 特開２０１４－１１８３６２号公報 特開２０１４－１１７３４７号公報
Tissue Eng Part C Methods. 2009 Sep;15(3):431-5. Plast Reconstr Surg. 2004;114:1502-1508. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Jul;78(7):4584-7. Nature. 1974 Jun 7;249(457):581-2. Biochem Biophys Res Commun. 2013 Feb 8;431(2):203-9
　本発明は従来にないウシ血清組成物の製造方法を提供するものであって、具体的には、細胞増殖に有益な因子、及び細胞による血液凝固を抑制する因子を多数含む安価なウシ血清組成物の製造方法を提供することを目的とする。
　本発明にかかるウシ血清組成物の製造方法は、ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、抗凝固処理されたウシ全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得する工程と、取得した白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定以上時間をかけ活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、を有することを特徴とする。
　本発明にかかるウシ血清組成物の製造方法で得られるウシ血清組成物は、安価且つ細胞増殖因子を多数包含する。即ち、本発明によれば、例えばウシ全血から、ウシ胎児血清と同等以上の増殖促進作用を持つ血清組成物を製造できる。ウシ胎仔血清は胎仔の屠殺により血清を得ることから、感染症に関しウインドウピリオド（検査で感染が確認できない空白期間）を考慮に入れた血液検査が後からできないが、飼育ウシであれば例えばウインドウピリオドが３ヶ月の感染症であれば、血清組成物を製造した３ヶ月後に血液検査を行い、その感染症を完全に否定することで、安全性の高い血清組成物を得ることができる。そのため、本発明により得られるウシ血清組成物は、ウシ胎児血清と比較し、安価且つ安全、細胞増殖能は同等以上であり、また、細胞による血液凝固を誘導しにくい。本発明により得られるウシ血清組成物は細胞培養の添加剤として極めて優れている。
ヒトの各血液成分の比重を示す図である。 抗凝固処理されたウシ及びヒトの全血における、遠心分離の結果を示す図である。 抗凝固処理されたウシの各比重の全血における、遠心分離の結果を示す図である。 抗凝固処理されたウシの全血における、連続遠心分離の結果を示す図である。 ヒト骨髄由来間葉系幹細胞の細胞増殖曲線を示す図である。 ヒト羊膜由来間葉系幹細胞の細胞増殖曲線を示す図である。
　（血清組成物の製造方法）
　以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
　本実施形態にかかるウシ血清組成物は、
(i)抗凝固処理工程：抗凝固剤でウシ全血を抗凝固処理し、
(ii)白血球および血小板取得工程：抗凝固処理された全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得し、
(iii)白血球および血小板活性化・再凝固処理工程：取得した白血球と血小板との相互作用を一定の温度で一定以上時間をかけ、必要に応じガラス材料の添加及び静置により、活性化させることにより白血球及び／又は血小板により分泌・放出される液性因子を含有し、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤により再凝固処理する
ことにより得られる。以下、各工程について説明する。
　(i)抗凝固処理工程
　全血は、ウシ由来であり、成獣・幼若・新生児又は胎児ウシの何れも適用可能である。全血は血管に針を刺し、針からチューブを介して採血バッグ等に採取することが可能である。全血は、血球成分（赤血球、白血球、血小板）と液体成分である血漿とからなる。血漿は凝固成分を含むのに対し、血清は凝固成分をほとんど含まないか、含んだとしても少量の液体である。
　ウシ全血を採取時あるいは採取後に、抗凝固剤を用いた抗凝固処理を行う。血液内には、フィブリノーゲン（血液凝固I因子）、プロトロンビン（血液凝固II因子）、血液凝固V因子、血液凝固VIII因子等の血液凝固因子が含まれているため、後述するように全血からバフィーコートを取得する際に、血液の凝固を防止するためである。抗凝固剤は、特に限定されるものではなく、例えば、クエン酸ナトリウム、クエン酸、ヘパリン等が挙げられる。
　(ii)白血球および血小板取得工程
　抗凝固処理されたウシ全血からの白血球および血小板の取得は、例えば遠心機又は連続遠心機によりなされる。バフィーコートとは、凝固していない血液を遠心分離した際に、赤血球層と血漿との間に生じる白血球と血小板との層である。しかしながら、ウシの場合、後述するようにヒトと比べ赤血球の比重が軽いことから、白血球と赤血球の比重が重なる部分があり、結果、バフィーコートは白血球の含有が少ないことから不明瞭な層となる。従って、白血球および血小板両者を採取するには、バフィーコートより比重が重い分画（＝ウシの場合、白血球を含有）も含め取得する必要性が、本願発明において明らかとなっている。後述するように、ウシ血小板の比重は例えば1.032～1.058であり、ウシ白血球の比重は例えば1.032～1.084であり、ウシ赤血球の比重は例えば1.071～1.110である。そのためウシ全血の場合、赤血球層と血漿との間に位置するバフィーコートは比重1.032～1.071の層となるが、この層は白血球の含有が少ないためバフィーコートより比重が重い例えば1.071～1.084の分画も取得する。このようにして、抗凝固処理されたウシ全血から、例えば遠心機又は連続遠心機により、血漿および比重の重い赤血球を除いた、白血球と血小板双方を多く含む血漿が調整される。
　この調整は、ヒトであれば各血液成分の比重の明確な違いにより(下記表１及び図１参照)、長時間静置や簡便な遠心操作にて各血液成分が容易に分離し、赤血球と血漿の間に浮遊し、白血球と血小板を多く含むバフィーコートを容易に得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　一方、各血液成分の比重の差が乏しいウシの場合、ヒトと同様な操作では、白血球と血小板のみを採取することが難しい。例えばウシの場合、後述のように赤血球と白血球の比重の重なる部分が多く、これらを分離することが難しいが、より多くの血液を連続して遠心することができる連続遠心機を使用することで、各血液成分の比重の違いが僅かであっても、取得することが可能となる。
　遠心分離の条件は、特に限定されるものではなく、例えば、遠心加速度2900～11760ｍ／ｓ２（300～1200×ｇ）、温度4～37℃、時間3分以上とすることが可能である。
　(iii)白血球および血小板活性化・再凝固処理工程
　次に、取得した白血球及び血小板を多く含有する血漿を常温～40℃にて一定時間静置し、白血球と血小板との相互作用を促す。ここで常温とは10℃～30℃とする。この際、ガラス材料等が接触することにより、白血球と血小板との相互作用が更に活性化され、白血球及び／又は血小板から大量の液性因子が分泌・放出される。ガラス材料は、ソーダ石灰ガラス、鉛ガラス、ホウケイ酸ガラス、又はこれらの混合からなる成分を有するガラスである。
　白血球および血小板にガラス材料が接触するとは、(i)バフィーコートにガラス材料を投入すること、(ii)バフィーコートにガラス材料で形成されたガラス棒を投入して、そのガラス棒によってバフィーコートを攪拌すること、(iii)バフィーコートを、ガラス材料を材質として形成されたガラス材料容器中に投入すること、のいずれも包含する概念である。
　活性化の温度・時間条件は、37℃・1時間以上が望ましいが、例えば、常温～40度・5分以上とすることが可能であり、また37℃～40℃・1～３時間とすることが可能であり、更には38℃～40℃・１～３時間とすることが可能であるまた、活性化の時間中に再凝固剤を添加し、次の再凝固処理工程を同時に実施することも可能である。
　投入されるガラス材料の形状は、特に限定されるものでなく、例えば、粒状物、シート、ブロック等の形状とすることが可能である。粒状物は、例えば、ガラスビーズ状、ビー玉状、おはじき玉状、サイコロ状、円柱状、角柱状、中空円筒状、ドーナツ状、涙滴状、板状等の定形形状や、カレット等の不定形状とすることが可能である。好ましくはガラスビーズである。粒状物の粒径は、特に限定されるものでなく、例えば、１～２０ｍｍ、好ましくは５～９ｍｍとすることが可能である。
　ガラス材料を添加させることにより濃度増加して分泌・放出される液性因子は、血小板由来、白血球由来、又はこれらの双方由来のものが含まれる。血小板由来の液性因子は、例えば、TGF-beta1、Basic FGF、G-CSF、IFN-gamma、IL-10、IL-1RA、IL-1b、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-alpha等が挙げられる。白血球由来の液性因子は、例えば、Eotaxin、IL-12(p70)等が挙げられる。血小板及び白血球の双方由来の液性因子は、例えばIL-5、IL-9、IP-10、MCP-1、PDGF-BB等が挙げられる。
　同時に、上澄みである血清成分を取得するために、上述した液性因子を含む血液成分を再凝固剤により再凝固処理する。再凝固剤は、特に制限されるものではなく抗凝固剤の種類に応じて適宜設定することが可能であり、例えば、塩化カルシウム、プロタミン等が挙げられる。抗凝固剤がクエン酸の場合、再凝固剤は例えば塩化カルシウム液等のカルシウム液が好ましく、抗凝固剤がヘパリンの場合、再凝固剤は例えばプロタミン等が好ましい。
　上述の工程を経て得られたウシ血清組成物は細胞増殖因子を多数含有しており、優れた細胞増殖能を有する血清組成物を得ることができる。更に、得られた細胞は血液凝固の誘導が抑制されており、より安全性が高い。
　（細胞の培養方法）
　本発明の細胞の培養方法は、本発明にかかるウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として含む培地にて細胞を培養することにより、細胞の増殖を促進し、血液凝固の誘導を抑制する工程を含む。
　細胞は、特に限定されるものではなく、例えば骨髄、脂肪組織、又は羊膜・臍帯を含む胎児付属物を由来とする間葉系幹細胞又は間葉系細胞である。細胞の由来は、特に限定されるものでなく、例えば、ヒト、及び、げっ歯類、家畜類、ヒトを除く霊長類等の非ヒト哺乳類等が挙げられる。
　ウシ血清組成物が添加剤として包含される培地は、特に限定されるものでなく、例えば間葉系幹細胞の培養に使用可能な培地があげられ、具体的には、例えば、a-Minimal essential medium培地(aMEM培地）、Dulbecco’s modified eagle medium培地(DMEM培地)等が挙げられる。
　培地におけるウシ血清組成物の濃度は、特に限定されるものでなく、血清組成物に包含される液性因子の濃度が、例えば０．０１～２０ｖ／ｖ％とすることが可能である。培地１ｍＬあたりの細胞数は、例えば１０００～１０万個とすることが可能である。
　細胞の培養条件は、特に限定されるものではなく、例えば、温度は３７℃であり、時間は２～１０日である。また培地は、例えば１～５日ごとに新しい培地に取り換えることが好ましく、培地の取換え方法は、例えば所定時間ごとに培地交換する方法、新たな培地を連続的又は断続的に供給する方法等があげられる。後者の場合、例えば新たな培地の供給にあわせて、古い培地の一部を連続的又は断続的に廃棄することが好ましい。
　（実施例１）
　遠心型血液成分分離装置(コンポーネントコレクションシステム：CCS、ヘモネティクス製)を用い、抗凝固処理血液から様々な濃度の白血球・血小板分画を採取し、白血球・血小板を相互活性化後、再凝固処理により血清組成物を調整し、その液性因子を解析した。
　具体的には、同装置専用血液回路（971J、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と供血者血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心により得られる様々な濃度の白血球・血小板分画を経時的に分割して採取した。得られた白血球・血小板分画(バフィーコート)は、自動血球計数装置（LC-660、フクダ電子製）にて白血球・血小板数を測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　表２に示すように、1回の抗凝固処理血液から遠心型血液成分分離装置を用いることにより、様々な濃度の白血球・血小板分画を得ることができた。
　得られた白血球・血小板分画に対し、ガラスビース（血液成分50mlあたり1個：BZ-6、アズワン製）を加えたもの（ガラス有）、及び加えなかったもの（ガラス無）を用意し、更に最終添加濃度が10mMとなるように1M塩化カルシウム水溶液を加えて常温にて1時間以上静置した。凝固確認後、3000回転10分にて遠心し、上清（血清組成物）を回収し、－80℃にて保存した。同血清組成物を解凍し、TGF-beta1 ELISA kit(#88-8350-22、Affimetrix製)にてTGF-beta1濃度を測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　表３に示すように、TGF-beta1濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のTGF-beta1は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びTGF-beta1濃度共ほぼ同じ数字であり、TGF-beta1は血小板由来であることが強く示唆された。
　更に、血清組成物に関し、Bio-Plex Proヒトサイトカイン27-Plexアッセイ(#M50-0KCAF0Y、Bio-Rad製)を用い、網羅的サイトカイン解析（Basic FGF, Eotacin, G-CSF, GM-CSF, IFN-gamma, IL-10, IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-17, IL-1RA, IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-BB, RANTES, TNF-alpha, VEGF）を行った（内、GM-CSF, IL-15, IL-17, IL-2, MIP-1aは、ほぼ全てのサンプルが検出感度以下であったため、除外）。結果を表４～２５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　表４に示すように、Basic FGF濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のBasic FGFは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとC（ガラス有）を比較すると、血小板数及びBasic FGF濃度共ほぼ同じ数字であり、TGF-beta1は血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
　表５に示すように、Eotaxin濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球のデータと高い相関を認め、血清組成物中のEotaxinは白血球由来が多いことが推察された。サンプルBとC（ガラス有）を比較すると、白血球数及びEotaxin濃度共ほぼ同じ数字であり、Eotaxinは白血球由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　表６に示すように、G-CSF濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のG-CSFは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びG-CSF濃度共ほぼ同じ数字であり、G-CSFは血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　表７に示すように、IFN-gamma濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIFN-gammaは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIFN-gamma濃度共ほぼ同じ数字であり、IFN-gammaは血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　表８に示すように、IL-10濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-10は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-10濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-10は血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
　表９に示すように、IL-12(p70)濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-12(p70)は白血球由来が多いことが推察された。サンプルAとDを比較すると、白血球数及びIL-12(p70)濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-12(p70)は白血球由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
　表１０に示すように、IL-13濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAガラス有に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-13は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、白血球数及びIL-13濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-13は血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
　表１１に示すように、IL-1RA濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-1RAは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-1RA濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-1RAは血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　表１２に示すように、IL-1b濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-1bは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-1b濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-1bは血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
　表１３に示すように、IL-4濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-4は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-4濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-4は血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
　表１４に示すように、IL-5濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、ガラス有・無に関わらず、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。傾向としては血小板数と近い関係であるが、（１）ガラス無の場合、サンプルBは他のサンプルに比べ血小板数が多いにもかかわらず、IL-5濃度は低い。（２）ガラス有の場合、サンプルAとCを比較すると、血小板数はほぼ同じであるにも関わらず、IL-5濃度はサンプルCが最も高い。これらのことから、IL-5は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルCは、白血球数が多く、血小板数はサンプルA及びBと同等、であるのに、IL-5濃度は（１）ガラス無の場合、他と比べて少ない、（２）ガラス有の場合、他と比べて比較的多い点が指摘できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
　表１５に示すように、IL-6濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-6は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-6濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-6は血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
  
　表１６に示すように、IL-7濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。しかしながら、サンプルAに対する比率をみると、表２の血小板数のデータと相関を認め、血清組成物中のIL-7は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-7濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-7は血小板由来であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
  
　表１７に示すように、IL-8濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のIL-8は血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-8濃度共ほぼ同じ数字であり、IL-8は血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
  
　表１８に示すように、IL-9濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、ガラス有・無に関わらず、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、傾向としては白血球数と近い関係であるが、サンプルBはAと比べ血小板数が多いにもかかわらず、IL-9濃度は同等、（２）ガラス有の場合、血小板数に近い関係であるが、サンプルAとBを比較すると、血小板数はほぼ同じであるにも関わらず、IL-9濃度はサンプルBが一番高い。これらのことから、IL-9は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、IL-9濃度は（１）ガラス無の場合、少ないレベル、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
  
　表１９に示すように、IP-10濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、傾向としては血小板数と近い関係であるが、サンプルDはAと比較し血小板数は半分であるが、IP-10濃度は約8割、（２）ガラス有の場合、傾向としては白血球数と近い関係であるが、サンプルBとCを比較すると、血小板数は同等であるのに、IP-10濃度に違いを認めた。これらのことから、IP-10は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、IP-10濃度は（１）ガラス無の場合、平均以下、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
  
　表２０に示すように、MCP-1濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、サンプルDのMCP-1濃度が最も高く、白血球数・血小板数と相関がない。（２）ガラス有の場合、傾向としては血小板数と近い関係であるが、サンプルAとCを比較すると、血小板数は同じであるにも関わらず、MCP-1濃度は25％の違いがある。これらのことから、MCP-1は白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、MCP-1濃度は（１）ガラス無の場合、最も低い、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
  
　表２１に示すように、MIP-1b濃度は、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。しかしながら、サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数のデータと相関を認め、血清組成物中のMIP-1bは白血球由来が多いことが推察された。サンプルAとDを比較すると、白血球数及びMIP-1b濃度共ほぼ同じ数字であり、MIP-1bは白血球由来であることが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
  
　表２２に示すように、PDGF-BB濃度は、ガラス無においても十分な濃度であったが、ガラス使用で濃度増加を認めた。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。（１）ガラス無の場合、サンプルBのPDGF-BB濃度が最も低く、白血球数・血小板数と相関がない。（２）ガラス有の場合、傾向としては白血球数と近い関係であるが、サンプルAとDを比較すると、血小板数は半分にもかかわらず、PDGF-BB濃度は同等である。これらのことから、PDGF-BBは白血球及び血小板両者相互由来である可能性が高い。ガラス使用による相互作用由来である根拠として、サンプルBは、白血球数が比較的多く、血小板数は最も多い、であるのに、PDGF-BB濃度は（１）ガラス無の場合、最も低い、（２）ガラス有の場合、最も多い点が指摘できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
  
　表２３に示すように、RANTES濃度は、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めない。これらのことから、RANTESは白血球及び血小板両者相互由来である可能性が否定できない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
  
　表２４に示すように、TNF-alpha濃度は、ガラス使用で有意な濃度増加を認めた。サンプルA（ガラス有）に対する比率をみると、表２の血小板数のデータと高い相関を認め、血清組成物中のTNF-alphaは血小板由来が多いことが推察された。サンプルAとCを比較すると、血小板数及びIL-8濃度共ほぼ同じ数字であり、TNF-alphaは血小板由来であることが強く示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
  
　表２５に示すように、VEGF濃度は、ガラス使用で濃度増加を認めなかった。サンプルAに対する比率をみると、表２の白血球数・血小板数のデータとの相関を認めにくい。ガラス有において、傾向としては白血球数と近い関係であるが、例えばサンプルAとDを比較すると、血小板数とVEGF濃度に相関が認められず、このことは、VEGFは白血球及び血小板両者相互由来である可能性が否定できない。
　これらの結果をまとめると、表２６のようになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
  
　表２６のように、白血球及び血小板を含んだ血球成分において、ガラスビーズ添加により、白血球及び血小板両者の相互作用が増強され、多くの液性因子が分泌・放出されることが明らかとなった。
　（実施例２）
　更に、得られた白血球・血小板分画の相互活性化における温度・時間条件の至適化を目的とした検討を行った。
　具体的には、実施例１同様、同装置専用血液回路（971J、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と供血者血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心により白血球・血小板分画を採取した。得られた白血球・血小板分画に対し、最終添加濃度が5mMとなるように塩化カルシウム水溶液を添加し、(1)4℃、20℃、37℃、40℃、50℃の各条件にて5分間静置、(2)37℃の条件にて5分、1時間、6時間静置した。凝固確認後、3000回転10分にて遠心し、上清（血清組成物）を回収し、－80℃にて保存した。同血清組成物を解凍し、TGF-beta1 ELISA kit(#88-8350-22、Affimetrix製)にてTGF-beta1濃度を測定した。結果を表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
  
　表２７に示すように、TGF-beta1濃度は、温度に関しては20℃～40℃が高値であり、時間は1時間以上が高値であった。以上から、白血球・血小板分画の相互活性化に関する温度・時間条件は、常温～40℃・1時間以上であると考えられた。
　（実施例３）
　抗凝固処理された全血からの白血球・血小板分画採取に関し、動物種による違いを検討した。
　具体的には、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と、ヒトあるいはウシ血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液14mlを、15mlポリプロピレン製チューブ（2325-015, AGCテクノグラス株式会社製）に添加し、200×g、常温にて、20分遠心し（ユニバーサル冷却遠心機5922、久保田商事株式会社製）、状態を写真撮影した。結果を図２に示す。
　図２において左がウシ、右がヒトである。通常の遠心では、ウシは赤血球の比重が比較的軽いと判断され、赤血球が容易に沈降しないのに対し、ヒトは赤血球比重が重く、赤血球が容易に沈降している。則ち、ウシにおいて、静置あるいは簡便な遠心操作によって、赤血球は沈降しにくく、結果、それよりも比較的軽い白血球・血小板分画が容易には出現しないことが想定される。
　（実施例４）
　そこで、ウシにおける各血液成分の比重検討を行った。Percoll原液(1.130g/ml、GEヘルスケアバイオサイエンス株式会社製、17-0891-01)、1.5M NaCl、及び滅菌水を適量混合し、比重1.123, 1.110, 1.097, 1.084, 1.071, 1.058, 1.045, 1.032, 1019, 1.006の等張Percoll液を調整した。15mlポリプロピレン製チューブ（2325-015, AGCテクノグラス株式会社製）に、これら等張Percoll液を3ml添加した。抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）と、ウシ血液を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液3mlを、等張Percoll液を加えた15mlポリプロピレン製チューブ（2325-015, AGCテクノグラス株式会社製）に3ml重層した。400×g、常温にて、10分遠心し（ユニバーサル冷却遠心機5922、久保田商事株式会社製）、状態を写真撮影した。結果を図３に示す。
　上記の如く、ウシ血液には、比重1.071の等張Percoll液に浮遊する、比重1.071よりも軽い赤血球が多く存在することが分かった。
　更に、各チューブ（6ml）を、上部3ml・下部3mlに分割し、それぞれにおける血球成分を自動血球計算装置（IDEXX　Laboratories製 プロサイトDx）にて測定した。結果を表２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
  
　表２８の結果から、ウシの各血球成分の比重は、表２９のように示された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
  
　このように、図２の結果を踏まえた考察が正しいこと、則ち、ウシの場合、赤血球の比重が比較的軽いため、赤血球が静置あるいは簡便な遠心操作では、容易には赤血球が沈降しないことが明らかとなった。
　更に、ヒトの場合であれば、簡便な操作で白血球・血小板分画（いわゆるバフィーコート）が出現するが、ウシの場合、白血球と赤血球の比重が重なる部分が多いため、静置あるいは簡便な遠心操作では、すべての白血球を分離することが難しいことが明らかとなった。
　（実施例５）
　そこで、ウシ全血からの安定した白血球・血小板分画の採取を目指し、連続遠心機を用いた検討を行った。
　具体的には、遠心型血液成分分離装置(CCS、ヘモネティクス製)に専用血液回路（971J、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤ACD-A液（クエン酸ナトリウム水和物2.20%、クエン酸水和物0.80%、ブドウ糖2.20%、テルモ株式会社製）とウシ全血を１：１０の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心を行い、出現した白血球・血小板分画を写真撮影した。結果を図４に示す。
　図４に示されるように、遠心ボウルの外側に位置する赤血球と内側に位置する血漿の間に、白い帯状の円を描くバフィーコート（白血球・血小板分画）が明確に存在している。これは、連続遠心機を用いると、一度の処理血液量が多いため（＞250ml）、僅かな比重の差であったとしても比較的容易にバフィーコートが出現したものと思われる。
　そこで、出現したバフィーコート前後の分画を経時的に分割して採取し（サンプル１～８、各約5ml）、それぞれにおける血球成分を自動血球計算装置（IDEXX　Laboratories製 プロサイトDx）にて測定した。結果を表３０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
  
　バフィーコートに位置するサンプル６は、白血球＋血小板分画であることが証明された。また、バフィーコートより比重の重いサンプル６において、最も白血球が多いことが明らかとなった。結果、抗凝固処理されたウシ全血からのより多くの白血球・血小板を得るには、バフィーコートより比重が重い分画（＝ウシの場合、白血球を含有）も含め取得する必要性が確認された。
　（実施例６）
　そこで、抗凝固処理を行ったウシ全血に関し、遠心型血液成分分離装置(CCS、ヘモネティクス製)を用い、白血球・血小板分画を採取し、ガラスビース添加により活性化後、再凝固処理により血清組成物（以下本血清組成物）を調整し、細胞培養を目的とした添加剤としての可能性を検討した。
　具体的には、同装置専用血液回路（970E、ヘモネティクス製）を装着し、抗凝固剤チトラミン液「フソー」4％（クエン酸ナトリウム水和物4%、扶桑薬品工業株式会社製）とウシ血液を１：１６の割合で混合することに得られた抗凝固処理血液を、同血液回路に備える遠心ボウルを用い、連続遠心により白血球・血小板分画を採取した。得られた白血球・血小板分画に対し、ガラスビース（血液成分50mlあたり1個：BZ-6、アズワン製）を加え、更に最終添加濃度が5mMとなるように塩化カルシウム水溶液を加えて37℃にて6時間以上静置した。凝固確認後、3000回転10分にて遠心し、上清（血清組成物）を回収し、－20度にて保存した。本血清組成物を解凍し、aMEM培地（Life Technologies社製、41061）に10％の割合で添加し、細胞培養用培地とした。対照はウシ胎児血清（Moregate Biotech社製）を10％添加したaMEM培地とした。
　細胞培養用培地の評価として、市販ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（Lonza社製、PT-2501）、及び我々が樹立したヒト羊膜由来間葉系幹細胞を用い、増殖曲線を作成した。このヒト羊膜由来間葉系幹細胞は下記工程にて培養した。即ち、帝王切開により得られた羊膜を、コラゲナーゼとサーモリシンとにより35℃にて30分酵素処理を行い、その酵素処理した羊膜をポアサイズ100μｍのメッシュに通すことにより細胞を回収し、回収した細胞を培養した。コラゲナーゼの濃度は500CDU/mlであり、サーモリシンの濃度は400PU/mlであった。結果をそれぞれ図５及び図６に示す。図５及び図６のように、骨髄及び羊膜由来間葉系幹細胞いずれの培養においても、本血清組成物は、通常細胞培養に用いられるウシ胎児血清と比較し、細胞増殖能に優れた血清組成物であることが分かった。
　（実施例７）
　また、本血清組成物が細胞径に与える影響を検討した。上記実施例６と同様、本血清組成物を10％の割合で添加したaMEM培地（対照はウシ胎児血清を10％添加したaMEM培地）を用い、我々が樹立したヒト羊膜由来間葉系幹細胞の培養を行い、適宜継代培養した。継代ごとに平均細胞径(μm)を測定し、両者の差違を検討した。結果を表３１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
  
　本血清組成物にて培養を行ったヒト羊膜由来間葉系幹細胞は、ウシ胎児血清と比較し、細胞径が各継代において常に小さい細胞径であった。実施例６において、本血清組成物は、ウシ胎児血清と比較し細胞増殖能が高いことが示されており、細胞分裂までの時間が早いことが、その要因と考えられた。
　（実施例８）
　培養間葉系幹細胞を用いた細胞製剤の経静脈的投与において、しばしば投与細胞による血液凝固促進が問題になる。そこで、本血清組成物にて培養した細胞が血液凝固を誘導するかについて、検討を行った。実施例６・７同様、10%本血清組成物添加aMEM培地にて培養したヒト羊膜由来間葉系幹細胞を、1×105細胞/mlとなるように生理食塩水にて調整した。対照は10%ウシ胎児血清添加aMEM培地で培養した同細胞とした。これら細胞懸濁液160μLにヒト血漿40μLを添加し、37℃ 5分間インキュベーションの後、20μM CaCl2を100μL添加し、血液凝固自動測定装置（KC1 Delta、Tcoag社製）にて凝固時間を測定した。結果を表３２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
  
　本血清組成物にて培養を行ったヒト羊膜由来間葉系幹細胞は、ウシ胎児血清と比較し、凝固時間の延長を認め、血液凝固を誘導しにくい細胞であることが分かった。
　（実施例９）
　そこで、本血清組成物にて培養した細胞が血液凝固を誘導しにくい要因の探索を目的とした検討を行った。細胞が分泌し、細胞膜に結合している強力な凝固阻止因子である組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor：TFPI）に関し、10%本血清組成物添加aMEM培地にて培養したヒト羊膜由来間葉系幹細胞（継代数4）の培養上清における濃度測定を、ELISAキット（Human TFPI Quantikine ELISA Kit）（DTFP10、R&D systems社）を用いて行った。対照は10%ウシ胎児血清添加aMEM培地にて培養した同細胞の培養上清、及び細胞培養前のこれら培地とした。結果を表３３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
  
　本血清組成物にて培養を行ったヒト羊膜由来間葉系幹細胞は、ウシ胎児血清と比較し、TFPIをより多く分泌していることから、血液凝固を誘導しにくい細胞であることが分かった。
　血清組成物の製造に利用できる。

Claims (12)

  1. 　ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理する工程と、
    　抗凝固処理されたウシ全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得する工程と、
    　取得した白血球と血小板を一定の温度で一定以上時間をかけることで相互作用を促し活性化させることにより、白血球及び／又は血小板から液性因子を分泌又は放出させつつ、この液性因子を含む血液成分を再凝固剤で再凝固処理する工程と、
    を有することを特徴とするウシ血清組成物の製造方法。
  2. 　前記バフィーコートより重い比重分画は、1.071～1.084の比重分画であることを特徴とする、請求項１に記載のウシ血清組成物の製造方法。
  3. 　前記一定の温度は、常温～40℃、時間は5分以上の条件であることを特徴とする、請求項1又は２に記載のウシ血清組成物の製造方法。
  4. 　前記バフィーコートの更なる活性化に、ガラス材料を添加することを特徴とする、請求項１乃至３の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
  5. 　前記抗凝固剤は、クエン酸ナトリウム又はクエン酸であることを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
  6. 　前記再凝固剤は、塩化カルシウム溶液であることを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
  7. 　前記バフィーコートの取得は、遠心機又は連続遠心機によることを特徴とする請求項１乃至６の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
  8. 　前記液性因子は、TGF-beta1、Basic FGF、Eotaxin、G-CSF、IFN-gamma、IL-10、IL-12(p70)、IL-13、IL-1RA、IL-1b、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IP-10、MCP-1、PDGF-BB、TNF-alphaであることを特徴とする請求項１乃至７の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法。
  9. 　ウシ全血を抗凝固剤で抗凝固処理し、
    　抗凝固処理された全血からバフィーコート及びバフィーコートより重い比重分画を取得し、取得した白血球と血小板を常温～40℃の温度で5分以上時間をかけることで相互作用を促し活性化させることにより白血球及び／又は血小板により分泌・放出される液性因子を含み、再凝固剤により再凝固処理することにより得られるウシ血清組成物。
  10. 　請求項１乃至８の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として使用することにより、増殖性に優れた細胞を培養する方法。
  11. 　請求項１乃至８の何れか１項に記載のウシ血清組成物の製造方法で得られたウシ血清組成物を添加剤として使用することにより、組織因子経路インヒビターの発現を誘導し、血液凝固を誘導しにくい細胞を培養する方法。
  12. 　前記細胞は、骨髄、脂肪組織、又は羊膜・臍帯を含む胎児付属物を由来とする間葉系幹細胞又は間葉系細胞であることを特徴とする請求項１０又は１１に記載の細胞を培養する方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018159431A1 (ja) * 2017-03-03 2018-09-07 ロート製薬株式会社 間葉系幹細胞及び肝疾患治療剤
WO2019038803A1 (ja) * 2017-08-21 2019-02-28 Ａｏｆ株式会社 判定システム及び判定方法
WO2023047832A1 (ja) * 2021-09-27 2023-03-30 国立大学法人 東京大学 細胞培養用成分、細胞培養用培地、血清の製造方法、及び、細胞の製造方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105769909A (zh) * 2016-05-13 2016-07-20 云南舜喜再生医学工程有限公司 一种直接获得富含细胞因子血清的采血器及方法
CN116926001A (zh) * 2022-04-06 2023-10-24 上海我武干细胞科技有限公司 血清替代物及其制备方法与应用
CN118979010B (zh) * 2024-08-28 2025-05-23 广州蕊特生物科技有限公司 一种牛全血提取物冻干粉的制备方法

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11502435A (ja) * 1995-03-03 1999-03-02 クウォンティック バイオメディカル パートナーズ 血小板グルー創傷密封材
JP2001505906A (ja) * 1996-12-10 2001-05-08 ハダジット メディカル リサーチ サービシズ アンド ディベラップメント カンパニー リミテッド 細胞の分化を誘導する血清由来因子およびその医薬的使用
JP2005530768A (ja) * 2002-05-09 2005-10-13 メディジーンズ 血漿または血清を含有した創傷治療用医薬組成物
JP2008246200A (ja) * 2007-03-07 2008-10-16 Jms Co Ltd 血清調製方法及び血清調製装置
JP2009506992A (ja) * 2005-09-01 2009-02-19 ケンブリッジ・サイエンティフィク・ピーティーワイ・リミテッド 組織破壊治療及びその治療に使用するための組成物
JP2010531142A (ja) * 2007-06-22 2010-09-24 サークル バイオロジクス、 エルエルシー． 液体濃縮装置、オートロガスな濃縮体液、およびそれらの使用方法
JP2011160799A (ja) * 2010-01-15 2011-08-25 Jms Co Ltd 間葉系幹細胞の増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法
JP2013132240A (ja) * 2011-12-26 2013-07-08 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 細胞分離装置及び遠心分離方法
JP2013132241A (ja) * 2011-12-26 2013-07-08 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 細胞分離装置
JP2014117347A (ja) * 2012-12-13 2014-06-30 Jms Co Ltd 血清の調製方法及び血清
WO2014126931A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 Victor Steven Stable platelet- rich-plasma compositions and methods of use

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11502435A (ja) * 1995-03-03 1999-03-02 クウォンティック バイオメディカル パートナーズ 血小板グルー創傷密封材
JP2001505906A (ja) * 1996-12-10 2001-05-08 ハダジット メディカル リサーチ サービシズ アンド ディベラップメント カンパニー リミテッド 細胞の分化を誘導する血清由来因子およびその医薬的使用
JP2005530768A (ja) * 2002-05-09 2005-10-13 メディジーンズ 血漿または血清を含有した創傷治療用医薬組成物
JP2009506992A (ja) * 2005-09-01 2009-02-19 ケンブリッジ・サイエンティフィク・ピーティーワイ・リミテッド 組織破壊治療及びその治療に使用するための組成物
JP2008246200A (ja) * 2007-03-07 2008-10-16 Jms Co Ltd 血清調製方法及び血清調製装置
JP2010531142A (ja) * 2007-06-22 2010-09-24 サークル バイオロジクス、 エルエルシー． 液体濃縮装置、オートロガスな濃縮体液、およびそれらの使用方法
JP2011160799A (ja) * 2010-01-15 2011-08-25 Jms Co Ltd 間葉系幹細胞の増殖促進剤、それを用いた間葉系幹細胞の増殖促進方法および製造方法
JP2013132240A (ja) * 2011-12-26 2013-07-08 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 細胞分離装置及び遠心分離方法
JP2013132241A (ja) * 2011-12-26 2013-07-08 Otsuka Pharmaceut Factory Inc 細胞分離装置
JP2014117347A (ja) * 2012-12-13 2014-06-30 Jms Co Ltd 血清の調製方法及び血清
WO2014126931A1 (en) * 2013-02-15 2014-08-21 Victor Steven Stable platelet- rich-plasma compositions and methods of use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LOH Y.S.: "LYSATES PRODUCED FROM IRRADIATED AND EXPIRED BUFFY COAT-DERIVED PLATELETS STORED IN ADDITIVE SOLUTION SUPPORT CELL PROLIFERATION", VOX SANGUINIS, vol. 109, no. 1, June 2015 (2015-06-01), pages 198, XP055383589 *
See also references of EP3378935A4 *
SOUSA A.P.: "VALORIZATION OF OUTDATED BLOOD PRODUCTS FOR REGENERATIVE MEDICENE", VOX SANGUINIS, vol. 101, no. 1, pages 49, XP055383581 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018159431A1 (ja) * 2017-03-03 2018-09-07 ロート製薬株式会社 間葉系幹細胞及び肝疾患治療剤
US11253550B2 (en) 2017-03-03 2022-02-22 Rohto Pharmaceutical Co., Ltd. Method for treating fibrotic liver disease
WO2019038803A1 (ja) * 2017-08-21 2019-02-28 Ａｏｆ株式会社 判定システム及び判定方法
WO2023047832A1 (ja) * 2021-09-27 2023-03-30 国立大学法人 東京大学 細胞培養用成分、細胞培養用培地、血清の製造方法、及び、細胞の製造方法
JP2023047560A (ja) * 2021-09-27 2023-04-06 国立大学法人 東京大学 細胞培養用成分、細胞培養用培地、血清の製造方法、及び、細胞の製造方法

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